CN103497993A - 轻度骨关节炎生物标志物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新生物标志物的鉴定和选择以及新生物标志物组合的鉴定和选择，与未患骨关节炎的个体相比，所述新生物标志物和新生物标志物组合在患轻度骨关节炎的个体中差异表达。与本发明生物标志物的产物特异性和/或选择性杂交的多核苷酸和蛋白质也包括在本发明的范围内，还包括用于诊断轻度骨关节炎的含有所述多核苷酸和蛋白质的试剂盒。本发明还包括多核苷酸和蛋白质用于监测个体中疾病消退和监测治疗方案的效力的用途，所述多核苷酸和蛋白质与本发明生物标志物的产物特异性和/或选择性杂交。本发明还提供了本发明生物标志物的产物用于鉴定骨关节炎中新治疗靶标的方法。

Description

轻度骨关节炎生物标志物及其用途

本申请是申请号为200680011050.3的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/US2006/003926的中国国家阶段申请。

1.技术领域

本发明涉及新轻度OA生物标志物的鉴定和选择以及新生物标志物组合的鉴定和选择，与未患骨关节炎的个体相比，所述新生物标志物和新生物标志物组合在患轻度骨关节炎的个体中差异表达。测量本发明生物标志物和组合生物标志物产物的表达在OA疾病早期患者的诊断中展示出特别的优点。应该理解，为了测量本发明生物标志物的产物，与本发明生物标志物的产物特异性和/或选择性杂交/结合的多核苷酸和蛋白质也包括在本发明的范围内，还包括含有所述多核苷酸和蛋白质、用于诊断个体患有轻度骨关节炎(OA，osteoarthritis)的试剂盒。本发明还提供在鉴定结合本发明生物标志物基因和/或调节其活性的化合物中使用本发明生物标志物产物的方法。通过这些方法鉴定的化合物可用于开发研究骨关节炎和骨关节炎进程的分析技术。此外，通过这些方法鉴定的化合物还可用作开发预防和治疗组合物的先导化合物，所述组合物用于预防、治疗、控制和/或改善骨关节炎或其症状。

2.背景技术

骨关节炎(OA)是关节软骨随时间逐渐退化的慢性疾病，所述关节软骨覆盖在骨末端，形成关节的关节面。据信有许多因素使患者易患骨关节炎，包括遗传易感性、肥胖症、意外或运动创伤、手术、药物和重体力需求。骨关节炎被认为是从关节软骨的损伤开始的。最普遍的两种对关节的损伤是运动相关损伤和长期“反复使用”关节损伤。最经常受骨关节炎影响的关节是膝、髋和手。在多数情况下，由于膝和髋必要的承重功能，这些关节中的骨关节炎比手骨关节炎更易导致残疾。随着软骨退化的发展，关节中和关节周围的其他组织(包括骨、肌肉、韧带、半月板和滑膜)中发生次级变化。软骨组织初级衰竭和其他组织次级损伤的净效应是患者发生疼痛、肿胀、虚弱和患病关节丧失机能。这些症状经常发展到具有严重影响的程度，即，使患者丧失劳动力和/或生活质量的后果。

关节软骨主要由软骨细胞、II型胶原、蛋白聚糖和水组成。关节软骨没有血或神经分布，软骨细胞是该组织中仅有的细胞类型。软骨细胞负责制造形成软骨基质的II型胶原和蛋白聚糖。其后该基质又具有允许用水使基质饱和的物理化学特性。这种结构-功能关系的净效应是关节软骨具有特殊的耐磨特征，并且关节软骨面之间发生几乎无摩擦的移动。在未患骨关节炎时，关节软骨经常在甚至高需求的身体条件下提供终生的无痛承重和无限制的关节移动。

与所有的活组织一样，关节软骨持续地经历更新过程，其中去除(分解代谢活性)“老”细胞和基质组分并产生(合成代谢活性)“新”细胞和分子。相对于多数组织，关节软骨的合成代谢/分解代谢周转率较低。成熟软骨结构完整性的长期维持依赖于基质合成和降解之间适当的平衡。软骨细胞通过应答于来自其环境中的化学和机械刺激维持基质平衡。软骨细胞对这些刺激合适并有效的应答是软骨动态平衡所必需的。通过合成代谢活性不足或分解代谢活性过剩破坏动态平衡可引起软骨降解和骨关节炎(Adams等，1995，Nature377Suppl：3-174)。多数受到损伤和分解代谢活性提高的组织能够启动增强的合成代谢应答，允许组织复原。不幸的是，关节软骨应答于软骨基质损伤或消耗而上调其合成代谢活性以及提高合成蛋白聚糖和II型胶原的能力非常有限。

目前没有已知的医学治疗能逆转这种软骨损伤的效应。所有目前的骨关节炎疗法都是针对治疗其症状。此外，由于骨关节炎隐匿式发生并且发展缓慢，因此骨关节炎经常在疾病发展的晚期才得到鉴定，而不是潜在治疗可能更有效的疾病发展早期。因此预防、改变或治疗骨关节炎疾病过程中的进一步发展严重依赖于鉴定疾病的早期诊断标志物，从而允许早期干涉。

“轻度骨关节炎”目前非常难于诊断。医师主要依赖患者的病史和身体检查来进行骨关节炎的诊断，X光不显示特定关节的早期改变。目前没有公认的生化标志物可用于证实轻度骨关节炎的诊断。症状如发作性关节痛是早期骨关节炎的普遍表现。在发作时关节疼痛，疼痛可持续几天至几周并自发缓解。然而这些症状经常不与软骨损伤的病理阶段良好相关。“轻度”骨关节炎更可靠的度量可通过测定关节损伤的程度来获得，然而目前没有测量相对非侵袭性的关节衰退的方法。

3.发明内容

本发明涉及新轻度OA生物标志物的鉴定和选择、新轻度OA生物标志物组合的鉴定和选择以及选择新生物标志物组合的方法，与未患OA的个体相比，所述新轻度OA生物标志物和新轻度OA生物标志物组合在患轻度骨关节炎的个体中差异表达。测量本发明生物标志物或生物标志物组合的产物的表达在诊断个体为患轻度OA中展示出特定的优势。应该理解，为了测量本发明生物标志物产物的表达，与本发明生物标志物及其衍生物的产物特异性和/或选择性杂交/结合的多核苷酸和蛋白质也包括在本发明的范围内，还包括用于诊断个体为患有轻度OA的含有所述多核苷酸和蛋白质的试剂盒。本发明还包括与本发明生物标志物的产物特异性和/或选择性杂交的多核苷酸和蛋白质用于监测个体中疾病发展和监测治疗方案的效力的用途。本发明还提供鉴定在骨关节炎新治疗靶标的鉴定中使用本发明生物标志物的产物的方法。本发明还提供在与本发明基因结合和/或调节其活性的化合物的鉴定中使用本发明生物标志物产物的方法。通过这些方法鉴定的化合物可用于开发研究骨关节炎和骨关节炎发展的测定技术。此外，通过这些方法鉴定的化合物可在本发明预防和治疗组合物的开发中用作先导化合物，所述组合物用于预防、治疗、控制和/或改善骨关节炎或其症状。

本发明包括含有至少两种分离多核苷酸的组合物，其中每种分离的多核苷酸与生物标志物选择性杂交，所述生物标志物选自表1或表4列出的生物标志物，并且其中组合物允许测量至少两种所述生物标志物的表达水平。

分离的多核苷酸可以是单链或双链RNA或DNA。

本发明还包括含有至少两种分离的多核苷酸的组合物，其中每种分离的多核苷酸与生物标志物的RNA产物和/或RNA产物的互补多核苷酸序列选择性杂交，所述生物标志物选自表1或表4列出的生物标志物，并且其中组合物允许测量至少两种所述生物标志物的RNA表达水平。

本发明的特征还在于包含两种或更多分离多核苷酸集合的组合物，其中每种分离的多核苷酸与表3或表5中列出的RNA序列和/或该RNA序列的互补多核苷酸序列选择性杂交。

本发明还包括包含至少两种表6和/或表8中列出的生物标志物特异性引物的组合物。本发明还包括包含至少两种表8中列出的多核苷酸探针的组合物。

本发明还包括包含两种或更多分离蛋白质集合的组合物，其中每种分离的蛋白质与生物标志物的蛋白质产物选择性结合，所述生物标志物选自表1或表4中列出的生物标志物，并且其中所述组合物用于测量至少两种所述生物标志物的表达水平。表7中列出了本发明范围内的分离蛋白质的实例。

分离的蛋白质可以是配体，其中所述配体包括抗体及其片段。单克隆抗体和多克隆抗体均在本发明范围内。

包含至少两种抗体的组合物也涵盖在本发明的范围内，其中每种抗体与生物标志物的蛋白质产物选择性结合，所述生物标志物选自表1或表4中列出的生物标志物，并且其中所述组合物允许测量至少两种所述生物标志物的表达水平。表7列出了本发明包括的抗体实例。

抗体可包括单克隆抗体和多克隆抗体。

本发明还涉及诊断或检测个体中轻度OA的方法，其包括：测定来自个体的血样中一种或多种生物标志物(包括表1和/或表4中列出的生物标志物)的RNA产物水平；将来自所述个体的血样中RNA产物的水平与对照中相同RNA产物的水平进行比较，其中相同RNA产物在个体与对照之间的差异表达指示个体中的轻度OA。血样可以是全血、一滴全血或裂解血。

所述方法还可包括从血样中分离RNA的步骤。

测定所述RNA产物水平的步骤可以使用定量RT-PCR(QRT-PCR)进行，任选地包括将与所述一种或多种RNA产物或其互补物杂交的引物与该RNA产物或其互补物杂交的步骤。引物的长度可以在约4-40个、优选8-35个、优选10-30个核苷酸之间，并且更优选引物的长度为15-25个核苷酸。此外，通过将第一组分离多核苷酸(对应于一种或多种RNA转录物)与包含第二组分离多核苷酸的阵列杂交来进行测定每种RNA产物水平的步骤。第一个多核苷酸群任选地包括RNA、DNA、cDNA、PCR产物或EST。阵列上的第二组分离多核苷酸可包括对应于表1和/或表4中一种或多种生物标志物的多核苷酸。

在另一实施方案中，可以通过将所述分离RNA与包含多种分离多核苷酸的阵列杂交来进行测定RNA产物水平的步骤。阵列可任选地包括多种分离的多核苷酸，包括RNA、DNA、cDNA、PCR产物或EST。阵列上的第二组分离多核苷酸可包括对应于表1和/或表4中一种或多种生物标志物的多核苷酸。

在一个实施方案中，对照来自未患轻度OA的个体。

本发明还包括用于诊断或检测轻度OA的试剂盒，其包括任一种上述组合物和使用说明书。

本发明还包括用于诊断或检测轻度OA的试剂盒，其包括至少两组生物标志物特异性引物，其中每组生物标志物特异性引物与选自表1和/或表4的独特生物标志物产生双链DNA互补性；其中所述组的每种第一引物含有与所述生物标志物之一互补的RNA、cDNA或EST选择性杂交而产生延伸产物，所述组的每一所述第二引物能与所述延伸产物选择性杂交。该试剂盒还可包括具有逆转录酶活性的酶、具有热稳定DNA聚合酶活性的酶或标记手段。

本发明还涉及诊断或检测个体中轻度OA的方法，其包括：测定来自个体的血样中一种或多种生物标志物的蛋白质产物水平，所述生物标志物选自表1和/或表4中列出的生物标志物；将来自所述个体的血样中蛋白质产物的水平与对照中相同蛋白质产物的水平进行比较，其中相同蛋白质产物在个体与对照之间的差异表达指示个体中的轻度OA。蛋白质产物的水平可以使用抗体或其片段进行检测，包括表7中列出的抗体。抗体可包括单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明还包括包含至少两种分离多核苷酸的组合物，其中每种分离多核苷酸与表1、表2和/或表4中所示的生物标志物选择性杂交，并且其中组合物允许测量至少两种生物标志物的表达水平，至少一种所述生物标志物选自表1或表4。

本发明还包括包含至少两种分离多核苷酸的组合物，其中每种分离的多核苷酸与生物标志物的RNA产物和/或RNA产物的互补多核苷酸序列选择性杂交，所述生物标志物选自表1、表2或表4列出的生物标志物，其中组合物允许测量至少两种生物标志物的RNA表达水平，并且其中至少一种所述生物标志物选自表1或表4。

本发明还包括包含至少两种抗体的组合物，其中每种抗体与生物标志物的蛋白质产物选择性杂交，所述生物标志物选自表1、表2或表4列出的生物标志物，其中组合物允许测量至少两种生物标志物的表达水平，并且其中至少一种所述生物标志物选自表1或表4。

本发明还涉及包含含有两种或更多分离多核苷酸集合的组合物，其中每种分离多核苷酸与选自表1或表4所列生物标志物的生物标志物选择性杂交。该组合物允许测量至少两种生物标志物的表达水平，其中生物标志物能使用ROC曲线分析测定确定个体是否患有轻度OA。优选地，ROC曲线下面积大于0.5，优选大于约0.6、0.7、0.8或大于约0.9。

本发明还涉及检测个体是否患有轻度OA的方法，包括测定来自患者的血样中一种或多种生物标志物(包括表1、表2和/或表4列出的生物标志物)的RNA产物或蛋白质产物的水平；进行ROC曲线分析和测量ROC曲线下面积，其中如果ROC曲线下面积大于约0.5、优选大于约0.6、0.7、0.8或优选大于约0.9，则结论为在个体中检测到轻度OA。

本发明提供了待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状能力的化合物的鉴定方法。该方法包括以下步骤：使一种或多种本发明生物标志物的蛋白质产物或其片段或者一种或多种本发明生物标志物的RNA产物或其片段与测试化合物接触；检测该测试化合物与蛋白质产物或RNA产物结合的能力，从而如果化合物与蛋白质产物或RNA产物结合，则将该化合物鉴定为待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎能力的化合物。

本发明还提供了待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状能力的化合物的鉴定方法。该方法包括以下步骤：使表达一种或多种本发明生物标志物的蛋白质或RNA产物的细胞与测试化合物接触；在孵育期后，使用上文所述的任何组合物测定接触测试化合物的细胞中存在的蛋白质或RNA产物的量；与未接触测试化合物的相应对照细胞中存在的蛋白质或RNA产物的量进行比较，从而如果蛋白质或RNA产物的量相对于对照中的量发生改变，则将该化合物鉴定为待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎能力的化合物。

本发明还提供了待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状能力的化合物的鉴定方法。该方法包括以下步骤：使无细胞提取物(如软骨细胞提取物)与核酸序列和测试化合物接触，所述核酸序列编码一种或多种本发明生物标志物的蛋白质或RNA产物；测定无细胞提取物中存在的蛋白质或RNA产物的量；与未接触测试化合物的相应对照中存在的蛋白质或RNA产物的量进行比较，从而如果蛋白质或RNA产物的量相对于对照中的量发生改变，则将该化合物鉴定为待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎能力的化合物。

3.1定义

对于以下书面描述中使用的特定术语，提供以下定义。

本文使用的术语“3’末端”指mRNA的至多后1000个核苷酸或1/3的mRNA末端，其中3’末端核苷酸为与多聚A尾(如果存在)相邻的编码区或非翻译区末端核苷酸。即，mRNA的3’末端不包括多聚A尾(如果存在)。基因的“3’区”指位于基因3’末端中的多核苷酸(双链或单链)，包括但不限于3’非翻译区(如果存在)和基因的3’蛋白质编码区。3’区的长度不小于8个核苷酸，长度不大于1000个核苷酸。3’区的其他可能长度包括但不限于10、20、25、50、100、200、400和500个核苷酸。

本文使用的术语“5’末端”指mRNA的至多前1000个核苷酸或1/3的mRNA末端(其中mRNA的全长不包括多聚A尾)，从mRNA的第一个核苷酸开始。基因的“5’区”指位于基因5’末端中的多核苷酸(双链或单链)，包括但不限于5’非翻译区(如果存在)和基因的5’蛋白质编码区。5’区的长度不小于8个核苷酸，长度不大于1000个核苷酸。5’区的其他可能长度包括但不限于10、20、25、50、100、200、400和500个核苷酸。

本文使用的术语“扩增”指由模板核酸产生一种或多种核酸序列的一个或多个拷贝的过程，优选通过聚合酶链式反应的方法(Mullis和Faloona，1987，Methods Enzymol.155：335)。“聚合酶链式反应”或“PCR”指用于扩增一种或多种模板序列的体外方法。PCR反应包括重复串联的温度循环，一般在50-100μl的体积中进行。反应混合物包含dNTP(四种脱氧核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP中的每一种)、引物、缓冲液、DNA聚合酶和核酸模板。PCR反应包括提供至少一个多核苷酸引物组，其中第一种引物含有待扩增的核酸模板序列一条链中区域的互补序列，并引发互补DNA链的合成，第二种引物含有待扩增的特定靶核酸序列另一链中区域的互补序列，并引发互补DNA链的合成；使用核酸聚合酶作为模板依赖性聚合剂在允许以下PCR循环步骤的条件下扩增核酸模板序列：(i)使扩增所需引物与模板序列中含有的靶核酸序列退火，(ii)延伸引物，其中核酸聚合酶合成引物延伸产物，以及任选的变性步骤。“多核苷酸引物组”或“PCR引物组”可包含2种、3种、4种或更多种引物。在一个实施方案中，使用外-DNA聚合酶在PCR反应中扩增核酸模板。其他扩增方法包括但不限于连接酶链式反应(LCR)、基于多核苷酸特异性的扩增(NSBA)或任何本领域已知的核酸扩增方法。

本文使用的术语多肽的“氨基端”区指由位于基因5’末端内的多核苷酸序列(双链或单链)编码的多肽序列，包括但不限于基因的5’蛋白质编码区。本文使用的术语“氨基端”区指由多肽的第一个氨基酸开始、最多为多肽的前300个氨基酸或1/3的多肽氨基末端。多肽的“氨基端”区长度不小于3个氨基酸，长度不大于350个氨基酸。多肽“氨基端”区的其他可能长度包括但不限于5、10、20、25、50、100和200个氨基酸。

本文在蛋白质类物质(如蛋白质、多肽、肽和抗体)的上下文中使用的术语“类似物”指这样的蛋白质类物质：其与第二种蛋白质类物质具有相似或相同的功能，但不一定包含与所述第二种蛋白质类物质相似或相同的氨基酸序列或具有与第二种蛋白质类物质相似或相同的结构。具有相似的氨基酸序列的蛋白质类物质指满足以下至少一项的第二种蛋白质类物质：(a)具有与第二种蛋白质类物质的氨基酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％一致性的氨基酸序列的蛋白质类物质；(b)由核苷酸序列编码的蛋白质类物质，所述核苷酸序列在严谨条件下与编码第二种蛋白质类物质的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氢基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基或至少150个连续氨基酸残基的核苷酸序列杂交；和(c)由核苷酸序列编码的蛋白质类物质，所述核苷酸序列与编码第二种蛋白质类物质的核苷酸序列有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％一致性。与第二种蛋白质类物质结构相似的蛋白质类物质指具有与第二种蛋白质类物质相似的二级、三级或四级结构的蛋白质类物质。蛋白质类物质的结构可以通过本领域技术人员公知的方法测定，包括但不限于肽测序、X线晶体衍射、核磁共振、圆二色性和晶体电子显微术。

为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列之间的百分比一致性，以最佳比较的目的比对序列(例如为了与一个氨基酸或核酸序列最佳比对，可以在另一氨基酸或核酸序列中引入缺口)。接着比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的位置被第二个序列中相应位置上的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置上是相同的。两序列之间的百分比一致性是序列间共享的相同位置数的函数(即％一致性＝相同的重叠位置数/位置总数乘以100％)。在一个实施方案中，两个序列的长度相同。

也可以使用数学算法实现两序列间百分比一致性的测定。用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性实例为Karlin和Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5877改良的Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：2264-2268的算法。这样的算法整合在Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403的NBLAST和XBLAST程序中。可以使用NBLAST核苷酸程序的参数组(如评分＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST核苷酸程序的参数组(如评分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以使用Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402所述的Gapped BLAST。或者，可以使用PSI-BLAST进行迭代搜索，其检测分子间的远缘关系(Id.)。使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-BLAST程序时，可使用各个程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见如NCBI网址)。用于序列比较的另一优选非限制性实例为Myers和Miller，1988，CABIOS4：11-17的算法。这样的算法整合在ALIGN程序(2.0版)中，后者是GCG序列比对软件包的一部分。使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAMI20的权重残基表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分。可以允许或不允许缺口地使用与上述类似的技术测定两序列之间的百分比一致性。在百分比一致性的计算中一般仅计数准确匹配。

在非蛋白质类类似物的上下文中，本文使用的术语“类似物”指具有与第一种有机或无机分子相似或相同的功能并在结构上与第一种有机或无机分子相似的另一种有机或无机分子。

本文使用的术语“生物标志物”指在患轻度OA个体和未患轻度OA的个体之间差异表达的基因。

本文使用的术语“生物标志物特异性引物”指引发合成本发明生物标志物RNA产物部分的互补DNA的引物。例如，引物可包括第一种引物(它是能与本发明生物标志物区域的互补RNA、cDNA或EST选择性杂交以产生延伸产物的序列)和能与延伸产物选择性杂交的第二种引物，它们用于产生与本发明生物标志物区域互补的双链DNA。本发明包括用于测量本发明生物标志物RNA产物表达的引物。表8提供了引物的代表性种类。

本文使用的术语“生物标志物特异性探针”指能与本发明生物标志物序列或其互补RNA、cDNA或EST选择性杂交的核酸探针。例如，探针可以附在阵列(包括微阵列)上，或者探针可以与生物标志物特异性引物联合使用，以允许进行定量实时RT-PCR(例如TaqMan

或Molecular Beacon

探针)。表8提供了可用于本发明的TaqMan

探针以及相应引物的代表种类。生物标志物特异性探针能与生物标志物序列或其互补物序列的一部分(例如至少约8个连续核酸残基)、最多为(且包括)生物标志物的完整序列选择性杂交。例如生物标志物特异性探针能与生物标志物或其互补物的至少约8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100或更多、最多为(且包括)完整序列选择性杂交。

本文使用的术语“数据”或“生物标志物数据”通常指反映血样中可见的生物标志物产物丰度的数据。

本文使用的术语“患者样品”指来自患者的生物学样品，可以在其中检测轻度OA的生物标志物。患者样品包括但不限于血、血清、唾液、尿、滑液、组织等样品。优选地，患者样品为血样。

本文使用的术语“血核酸样品”指得自血的核酸，可包括得自全血、离心裂解血、无血清全血或分级血(包括外周血白细胞(PBL)或本文所述的其他血级分)的核酸。全血指未分级血，例如一滴血，其中一滴血包括5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl的体积。离心裂解血或“裂解血”指如本文所述与裂解缓冲液混合并离心的全血(见实施例2)。无血清血指如本文所述通过离心去除了血清或血浆的全血(见实施例2)。优选地，血核酸样品为全血或离心裂解血，并且为总RNA、mRNA或者为对应于mRNA的核酸，例如从所述血中分离的cANA。血核酸样品还可包括得自总RNA、mRNA或cDNA的PCR产物。

本文使用的术语多肽的“羧基端”区指由位于基因3’末端内的多核苷酸序列(双链或单链)编码的多肽序列，包括但不限于基因的3’蛋白质编码区。本文使用的术语“羧基端”区指从多肽的最后一个氨基酸开始最多为多肽的300个氨基酸或1/3的多肽羧基末端。“3’末端”不包括多聚A尾(如果存在)。

多肽的“羧基端”区长度不小于3个氨基酸，长度不大于350个氨基酸。多肽“羧基端”区的其他可能长度包括但不限于5、10、20、25、50、100和200个氨基酸。

本文使用的术语“软骨核酸样品”指来自软骨的核酸。优选地，软骨核酸样品为总RNA、mRNA或者为对应于RNA的核酸，例如cDNA。软骨核酸样品还可包括得自总RNA、mRNA或cDNA的PCR产物。

本文使用的术语“本发明生物标志物组合”指表1或表4公开的任何一种或多种生物标志物以及表1和/或表2公开的任何两种或更多生物标志物的任何组合，只要所述组合中至少一种生物标志物来自表1。术语“本发明生物标志物组合”指表4和/或表2公开的任何两种或更多生物标志物的任何组合，只要所述组合中至少一种生物标志物来自表4。术语“本发明生物标志物组合”指表1和表4和/或表2公开的任何两种或更多生物标志物的任何组合，只要所述组合中至少一种生物标志物来自表1或表4。

本文使用的术语“化合物”和“物质”可互换使用。

本文使用的“基本由......组成”指用于诊断轻度骨关节炎的生物标志物基因的最大数目。在一个实施方案中，用于诊断轻度骨关节炎的生物标志物基本由表1和/或表4的生物标志物中最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、150种中至少任一项或最多全部组成。在另一实施方案中，用于诊断轻度骨关节炎的生物标志物基本由表1和/或表4的生物标志物中最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150种中至少任一项与申请号10/915,680中公开并在表2中公开的生物标志物中最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、15、20、30、40、50种中至少任一项或最多全部的组合组成。在一个实施方案中，用于诊断轻度骨关节炎的生物标志物基本由表4的生物标志物中最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30种中至少任一项或最多全部组成。

在诊断轻度骨关节炎的上下文中，本文使用的术语“对照”或“对照样品”指使用除本发明生物标志物以外的手段从确定未患骨关节炎(即“正常对照”)或确定患轻度骨关节炎(即“轻度OA对照”)的个体或个体组中分离的一种或多种样品。术语对照或对照样品还可指数据的汇编，所述数据来自分类为未患骨关节炎(即“正常对照”)或患轻度骨关节炎(即“轻度OA对照”)的一个或多个个体的样品。在筛选预防或治疗剂的上下文中，本文使用的术语“对照”指用于测定或方法的标准品或参照，可以对其比较其他条件。

在蛋白质类物质(如蛋白质、多肽、肽和抗体)的上下文中，本文使用的术语“衍生物”指蛋白质类物质，其包含已通过引入一个或多个氨基酸残基的替换、缺失和/或添加进行了改变的氨基酸序列。本文使用的术语“衍生物”还指经修饰的蛋白质类物质，例如通过在该蛋白质类物质上共价附加任何类型的分子进行修饰。例如(但不仅限于)抗体可以通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白质水解切割、与细胞配体或其他蛋白质连接等进行修饰。蛋白质类物质的衍生物可以使用本领域技术人员公知的技术通过化学修饰产生，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，蛋白质类物质的衍生物可含有一种或多种非经典氨基酸。蛋白质类物质的衍生物具有与其衍生自的蛋白质类物质相似或相同的功能。

本文使用的术语“分类器”用于描述数学模型由其区分两种或更多表型性状(如患或未患轻度OA的个体)的输出。

在非蛋白质类物质的上下文中，本文使用的术语“衍生物”指基于一种有机或无机分子结构形成的另一种有机或无机分子。有机分子的衍生物包括但不限于经修饰的分子，例如通过添加或缺失羟基、甲基、乙基、羧基或胺基进行修饰。有机分子还可以酯化、烷基化和/或磷酸化。

根据本发明的一个方面，本文使用的术语“诊断轻度OA”或“轻度OA诊断”指确定个体是否患有轻度OA的方法。在一个具体实施方案中，“诊断轻度OA”或“轻度OA诊断”指在两种选择之间进行确定，即个体患轻度OA或个体未患轻度OA。在另一具体实施方案中，“诊断”指在三种选择之间进行确定，个体患轻度OA、个体未患轻度OA或者不能以充分的确定度确定个体患轻度OA还是未患轻度OA。本领域技术人员会理解，在该上下文中，“充分的确定度”取决于诊断的灵敏度和特异性。更具体地，充分的确定度包括高于50％的灵敏度和域特异性、高于60％的灵敏度和/或特异性、高于70％的灵敏度和/或特异性、高于80％的灵敏度和/或特异性、高于90％的灵敏度和/或特异性和100％的灵敏度和/或特异性。

本文使用的术语“差异表达”指一种或多种本发明生物标志物的RNA和/或蛋白质产物表达水平的差异，其以RNA或蛋白质的量或水平衡量。对于RNA，它可包括第一种样品中生物标志物的mRNA和/或一种或多种mRNA剪接变体的表达水平与第二种样品中相同的一种或多种本发明生物标志物以RNA(包括mRNA和/或一种或多种mRNA剪接变体)量或水平衡量的表达水平之间的差异。“差异表达的”或“差异表达”还可包括与本发明生物标志物的蛋白质(包括一种或多种蛋白质变体)表达量或水平相比，测量样品或样品群中本发明生物标志物编码的蛋白质或一种或多种蛋白质变体。可以如本文所述和本领域技术人员的理解测定差异表达。术语“差异表达的”或“表达水平的改变”指样品中以RNA量和/或蛋白质量衡量的生物标志物给定产物可测量表达水平与第二种样品中生物标志物给定产物的可测量表达水平相比的提高或降低。所述第一种样品与第二种样品不一定来自不同的患者，而是可以为在不同时间点取自同一患者的样品。术语“差异表达的”或“表达水平的改变”还可以指样品群中给定生物标志物可测量表达水平与第二个样品群中生物标志物的可测量表达水平相比的提高或降低。涉及单个样品时，本文使用的术语“差异表达的”可使用所述样品中给定生物标志物表达水平与对照样品中给定生物标志物平均表达水平的比例来衡量，其中比例不等于1.0。差异表达的还可用于包括使用表达水平比或使用p值将样品的一个群与样品的另一个群进行比较，或者将单个样品与样品群进行比较。使用p值时，当p值低于0.1、低于0.05、低于0.01、低于0.005、低于0.001等时，将核酸转录物(包括hnRNA和mRNA)鉴定为在第一种和第二种群中差异表达。基于基因产物表达水平的比例测定差异表达时，如果第一个样品中其RNA或蛋白质产物表达水平与第二个样品中相比高于或低于1.0，则RNA或蛋白质基因产物差异表达。例如，基因RNA或蛋白质产物的比例高于1(例如1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20)或比例低于1(例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1.0.05)将指示差异表达。在本发明的另一实施方案中，如果核酸群中第一种转录物的平均表达水平与第二个群的平均表达水平相比比例高于或低于1.0，则核酸转录物(包括hnRNA和mRNA)差异表达。例如，比例高于1(例如1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20)或比例低于1(例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1.0.05)将指示差异表达。在本发明的另一实施方案中，如果第一种样品中其表达水平与第二个群的平均值相比高于或低于1.0，包括比例高于1(例如1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20)或比例低于1(例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1.0.05)，则核酸转录物(包括hnRNA和mRNA)差异表达。“提高的差异表达”指相对于标准品如第二个群中的平均表达水平为1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍或更高。“降低的差异表达”指相对于标准品如第二个群中的平均表达水平低于1.0倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍或更低。

本文使用的术语“药物效力”指药物的有效性。“药物效力”一般通过已经接受或正在接受药物治疗的患者的临床反应来衡量。如果实现了期望的临床结果(例如像本说明书中所述降低了骨关节炎的症状或防止了骨关节炎的发展)，则认为药物具有高效力水平。可以使用吸收的药物量来预测患者的反应。一般的规则为随着药物剂量的提高可见患者中更高的效果，直至达到最高的期望效果。如果在达到最高点之后施用更多药物，则副作用一般会提高。

本文使用的术语“有效量”指足以降低或改善骨关节炎或其一种或多种症状的发展、严重性和/或持续时间、骨关节炎或其一种或多种症状的复发或发生、防止骨关节炎或其一种或多种症状的进展或者增强或改善其他治疗的预防或治疗效果的化合物的量。

在蛋白质类物质的上下文中，本文使用的术语“片段”指肽或多肽，其包含多肽或蛋白质的氨基酸序列中至少5个连续氨基酸残基，至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，蛋白质或多肽的片段保留该蛋白质或多肽的至少一种功能。在另一实施方案中，蛋白质或多肽的片段保留该蛋白质或多肽的至少一种、两种、三种、四种或五种功能。优选地，抗体的片段保留与抗原免疫特异性结合的能力。

本文使用的术语“融合蛋白”指包含第一种蛋白质或多肽或其片段、其功能性片段、其类似物或其衍生物的氨基酸序列和异源蛋白质、多肽或肽(即与第一种蛋白质或其片段、类似物或其衍生物不同的第二种蛋白质或多肽或其片段、类似物或衍生物)的氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，融合蛋白包含与异源蛋白质、多肽或肽融合的预防或治疗剂。根据该实施方案，所述异源蛋白质、多肽或肽是或不是另一种类型的预防或治疗剂均可。

本文使用的术语“基因表达模式”、“基因表达谱”和“核酸阵列表达谱”可互换使用，包含与非OA个体或正常个体相比，多种靶核酸序列与轻度OA个体阵列上多种核酸探针杂交的杂交模式。“基因表达模式”、“基因表达谱”和“核酸阵列表达谱”还可指对应于两种或更多本发明生物标志物的RNA和/或蛋白质丰度水平的模式，其通过本领域已知用于测量所述RNA和/或蛋白质水平的方法测定。例如，所述模式可以是模式的数学呈现，如数学等式、矢量等。

本文使用的术语“与......杂交”和“杂交”指与互补核酸的序列特异性非共价结合相互作用，例如靶核酸序列与阵列上核酸成员之间的相互作用。

本文使用的术语“免疫球蛋白”指基本由免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽组成的蛋白质或其抗原结合片段。公认的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因以及众多的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白“轻链”(约25Kd或214个氨基酸)在NH2-端(约110个氨基酸)由可变区基因编码，在COOH-端由κ和λ恒定区基因编码。类似地，全长免疫球蛋白“重链”(约50Kd或446个氨基酸)由可变区基因(约116个氨基酸)和其他上述恒定区基因之一(如γ)编码(编码约330个氨基酸)。

涉及治疗时，本文使用的术语“组合”指使用一种以上的治疗(如一种以上的预防剂和/或治疗剂)。术语“组合”的使用不限制对受试者施用治疗(如预防和/或治疗剂)的顺序。可以在对受试者施用第二种治疗(如第二种预防或治疗剂)之前(如之前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时、或之后(如之后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用第一种治疗(如第一种预防或治疗剂)。

涉及表达模式时，本文使用的“疾病或病症的指示”表示这样的表达模式：所述表达模式可诊断疾病或病症(如存在轻度OA)或者指示有轻度OA风险，使得该表达模式在患所述疾病或病症的患者中比在无该疾病或病症的患者中显著更频繁地发现(使用置信水平设置为最低70％、75％、80％、85％、90％、95％等的常规统计学方法测定)。优选地，作为疾病指示的表达模式可见于至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多患该疾病的患者，并可见于10％以下、8％以下、5％以下、2.5％以下或1％以下未患该疾病的患者。“疾病指示”还表示这样的表达模式：所述表达模式可诊断疾病，从而与无该疾病个体的对照表达模式相比，用患病个体的对照表达模式可以对该表达模式更适当地进行分类，其中使用本领域技术人员了解的用于分类预测的统计学算法，参阅如以商业提供的程序，如Silicon Genetics提供的程序(如GeneSpring^TM)。

本文使用的术语基因的“内部编码区”指位于本文定义的基因5’区与3’区之间的多核苷酸(双链或单链)。“内部编码区”的长度不小于8个核苷酸，长度可达1000个核苷酸或更长。“内部编码区”的其他可能长度包括但不限于10、20、25、50、100、200、400和500个核苷酸。5’、3’和内部区是不重叠的，可以(但不必须)是连续的，可以(但不必须)加在一起成为相应基因的全长。

本文使用的术语多肽的“内部多肽区”指位于本文定义的多肽氨基端区与羧基端区之间的多肽序列。多肽的“内部多肽区”长度不小于3个氨基酸，长度可达350个氨基酸或更长。多肽“内部多肽区”的其他可能长度包括但不限于5、10、20、25、50、100和200个氨基酸。

多肽的氨基端、羧基端和内部多肽区是不重叠的，可以(但不必须)是连续的，可以(但不必须)加在一起成为相应多肽的全长。

涉及核酸使用时，本文使用的术语“分离的”或“纯化的”指天然存在的序列已从其正常的细胞(如染色体)环境中移出或在非天然环境中合成(如人工合成的)。因此，“分离的”或“纯化的”序列可以在无细胞溶液中或置于不同的细胞环境中。术语“纯化的”不暗示该序列仅存在核苷酸，而是其基本不含(约90-95％纯度)与其天然共存的非核酸物质，由此区别于分离的染色体。

在蛋白质类物质(如肽、多肽、蛋白质或抗体)的上下文中，本文使用的术语“分离的”和“纯化的”指这样的蛋白质类物质：其基本不含细胞物质，在一些实施方案中基本不含来自其来源细胞或组织源的异源蛋白质类物质(如污染蛋白)，或者在化学合成时基本不含化学前体或其他化学品。“基本不含细胞物质”一语包括蛋白质类物质的制备物，其中所述蛋白质类物质与其分离或重组产生的细胞中的细胞组分分开。因此基本不含细胞物质的蛋白质类物质包括含有低于约30％、20％、10％或5％(以干重计)异源蛋白质类物质(如蛋白质、多肽、肽或抗体，也称为“污染蛋白”)的蛋白质类物质制备物。所述蛋白质类物质重组产生时，还优选基本不含培养基，即培养基占低于约20％、10％或5％的蛋白质制备物体积。所述蛋白质类物质通过化学合成产生时优选基本不含化学前体或其他化学品，即其与该蛋白质类物质的合成中涉及的化学前体或其他化学品分开。因此，这些蛋白质类物质制备物含有低于约30％、20％、10％、5％(以干重计)的化学前体或除目的蛋白质类物质以外的化合物。本文公开的蛋白质类物质优选为分离的。

本文使用的术语“表达水平”指通过本领域技术人员已知和本文所述的方法测定的给定核酸或蛋白质的可测量。涉及本发明生物标志物对应的RNA、hnRNA、mRNA或mRNA剪接变体时，表达水平可以通过杂交或更多定量测量来测定，例如包括使用SYBR

绿、TaqMan和分子信标技术的定量实时RT PCR。

本文使用的术语“配体”是与本发明生物标志物基因之一编码的多肽特异性结合的分子。配体可以是核酸(RNA或DNA)、多肽、肽或化合物。本发明的配体可以是肽配体，如分支肽、线性肽或环肽。在一个优选的实施方案中，多肽配体为抗体。抗体可以是人抗体、嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体、单克隆抗体或其抗原结合片段或者多克隆抗体。抗体可以是完整的免疫球蛋白，如IgA、IgG、IgE、IgD、IgM或其亚型。抗体可以与功能性部分(如具有生物或化学功能的化合物)缀合，所述功能性部分可以是另一种不同的多肽、治疗药物、细胞毒剂、可检测部分或固相支持物。本发明的多肽配体(如抗体多肽)以高亲和力和特异性与生物标志物之一编码的多肽相互作用。例如，多肽配体以至少10⁷M^-1、优选至少10⁸M^-1、10⁹M^-1或10¹⁰M^-1的亲和常数与生物标志物之一编码的多肽相互作用。

本文使用的术语“大多数”指代表组合全部成员的50％以上(如51％、60％、70％、80％、90％或最高100％)的数字。涉及阵列时，术语“大多数”指稳定结合在阵列固相衬底上的全部核酸成员的50％以上(如51％、60％、70％、80％、90％或最高100％)。

本文使用的术语“控制”指受试者由治疗(如预防或治疗剂)产生的有益效果，所述效果不引起骨关节炎的治愈。在某些实施方案中，对受试者施用一种或多种治疗以“控制”骨关节炎，从而防止骨关节炎的发展或恶化。

本文使用的术语“mRNA完整性”指提取自软骨样品或血样的mRNA提取物的质量。使用本领域熟知的方法如RNA琼脂糖凝胶电泳(如Ausubel等，John Weley&Sons，Inc.，1997，Current Protocols inMolecular Biology)进行检查时，具有良好完整性的mRNA提取物不显示降解。优选地，mRNA样品具有良好的完整性(如mRNA的10％以下、优选5％以下、更优选1％以下发生降解)，以真实代表由其中提取的软骨或血样品中的基因表达水平。

本文使用的术语“无反应”和“耐受”描述用目前可用的骨关节炎疗法(如预防或治疗剂)进行治疗的患者，所述疗法在临床上不足以缓解其一种或多种相关症状。通常，这些患者承受严重的持续活动的疾病，需要额外的疗法以改善其骨关节炎相关症状。

本文使用的“正常”指未显示任何OA症状(包括关节痛)并且未诊断为关节损伤或OA的个体或个体组。优选地，所述正常个体未使用影响OA的药物，并且未诊断为患有任何其他疾病。更优选地，正常个体具有与测试样本相比相似的性别、年龄和体重指标(BMI)。根据本发明，“正常”还指分离自正常个体的样品，包括分离自正常个体的总RNA或mRNA。取自正常个体的样品可包括分离自软骨组织的RNA，其中RNA分离自完整软骨或一块软骨，所述软骨分离自组织移除时未诊断为OA并且未显示任何OA症状的个体。在本发明的一个实施方案中，在死后14小时分离“正常”软骨样品并确认所提取mRNA样品的完整性。取自正常个体的样品还可包括分离自血样的RNA，其中血来自在分离血时未诊断为OA并且未显示任何OA症状的个体。

本文使用的“核酸”可与术语“多核苷酸”互换使用，通常指任何多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，可以是未修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA或其任何组合。“核酸”包括但不限于单链和双链核酸。本文使用的术语“核酸”还包括如上文所述含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA。因此，为了稳定性或其他原因修饰了骨架的DNA或RNA为“核酸”。本文使用的术语“核酸”包括核酸的这些化学、酶或代谢修饰的形式以及病毒和细胞(包括如简单细胞和复杂细胞)DNA和RNA特征的化学形式。“核酸”或“核酸序列”还可包括单链或双链RNA或DNA的区域或其任何组合，并可包括本发明一些实施方案的表达序列标签(EST)。EST是通过逆转录mRNA区以产生cDNA而产生的基因的一部分表达序列(即序列的“标签”)。

本文定义的“核酸阵列”指附加在支持物上的多种独特核酸(或“核酸成员”)，其中每种核酸成员附加在支持物上独特的预选区域内。在一个实施方案中，附加在支持物表面的核酸成员为DNA。在一个优选的实施方案中，附加在支持物表面的核酸成员为cDNA或寡核苷酸。在另一优选的实施方案中，附加在支持物表面的核酸成员为通过聚合酶链式反应(PCR)合成的cDNA。本文使用的术语“核酸”可与术语“多核苷酸”互换使用。在另一优选的实施方案中，“核酸阵列”指用于Southern和/或Northern印迹技术的附加在硝酸纤维素或其他膜上的多种独特核酸。

本文使用的“核酸探针”包括能通过一组非共价结合相互作用(包括互补碱基配对相互作用)与阵列上核酸成员的互补序列结合的核酸。本文使用的核酸探针可包含天然(即A、G、C或T)或修饰碱基(7-脱氮鸟苷、肌苷等)。此外，核酸探针中的碱基可以通过磷酸二酯键以外的键结合，只要它不干扰杂交(即该核酸探针仍在标准严谨或选择性杂交条件下与其互补序列特异性结合)。因此，核酸探针可以为肽核酸，其中组成碱基通过肽键而不是磷酸二酯键结合。

本文使用的“核酸靶标”或“核酸成员”定义为能与阵列结合的核酸。核酸靶标可以是对应于基因或其部分的分离核酸序列，或者核酸靶标可以是分离自样品的总RNA或mRNA。优选地，核酸靶标或核酸标志物来自人软骨、血或滑液提取物。更优选地，核酸靶标为单链或双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体，其来自人软骨、血或滑液总RNA提取物，优选来自mRNA提取物。

在一个实施方案中，与阵列结合的“靶”序列的常规核酸阵列可代表完整的人基因组，如Affymetrix芯片，并且常规阵列应用由两种或更多生物标志物特异性探针组成或包含两种或更多生物标志物特异性探针的分离的生物标志物，所述探针对应于表1、表4和/或表2所述基因，只要至少一种生物标志物特异性探针来自表1或表4。

在另一实施方案中，与阵列结合的序列可以是对应于本发明生物标志物的分离寡核苷酸、cDNA、EST或PCR产物，对阵列应用细胞总RNA。

本文使用的术语“寡核苷酸”定义为包含两个或更多脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸(优选三个以上)的分子。其准确的大小取决于许多因素，所述因素又取决于寡核苷酸最终的功能和用途。寡核苷酸的长度可以从约8至约1000个核苷酸。尽管本发明可使用8至100个核苷酸的寡核苷酸，但优选的寡核苷酸范围为长度从约8至约15个碱基、长度从约8至约20个碱基、长度从约8至约25个碱基、长度从约8至约30个碱基、长度从约8至约40个碱基或长度从约8至约50个碱基。

本文使用的“骨关节炎”指关节炎的特定形式，特别是关节软骨随时间逐渐退化的慢性疾病，所述关节软骨覆盖在形成关节面的骨末端上。

本文使用的术语“轻度骨关节炎(OA)”指个体中OA的特定进展或程度，或者根据Marshall评分***(Marshall W.，1996，TheJournal of Rheumatology，23：582-584，引入为参考)定义的特定的OA病理学水平。根据该方法，基于特定表面上存在的最严重损伤对6个关节面(髌骨、股骨滑车、股骨内侧踝、胫骨内侧坪、股骨外侧踝和胫骨外侧坪)中的每一个给予软骨分级。轻度OA的命名指示了对每个关节面应用以反映该面的软骨严重性级别的分数的总分。例如，如果股骨内侧踝最严重的软骨损伤为为I级损伤，则给予1的分值。接着由6个关节面分数的总和产生患者的总分。基于总分将每名患者分入4个OA组中：“轻度”(早期)定义为Marshall分数1-6，“中度”定义为Marshall分数7-12，“显著”定义为Marshall分数13-18，“重度”定义为Marshall分数高于18。

本文使用的术语“可药用盐”包括但不限于使用本发明方法鉴定的化合物中可存在的酸性或碱性基团的盐。碱性性质的化合物能与多种无机和有机酸形成多种盐。可用于制备这些碱性化合物的可药用酸加成盐的酸为形成无毒酸加成盐的酸，所述无毒酸加成盐即含有可药用阴离子的盐，包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、乙酸盐、草酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、glucaronate、糖二酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸(即1，1’-亚甲基-二(2-羟基-3-萘甲酸))盐。除上述酸以外，包含氨基部分的化合物还可与多种氨基酸形成可药用盐。酸性性质的化合物能与多种可药用阳离子形成碱盐。这些盐的实例包括碱金属或碱土金属，特别是钙、镁、钠、锂、锌、钾和铁盐。

本文使用的“多核苷酸”包括长度大于8个核苷酸的双链DNA、单链DNA和双链或单链RNA。

本文使用的“由生物标志物编码的多肽序列”或“生物标志物的蛋白质产物”指本文定义的生物标志物蛋白质编码区翻译后获得的氨基酸序列。每种本发明生物标志物的mRNA核苷酸序列通过其RNA登录号(见表3或表5)识别，相应的多肽序列通过蛋白质登录号(见表3和表5)识别。

在使用蛋白质或蛋白质片段免疫宿主动物时，蛋白质的多个区域均可诱发产生与蛋白质的给定区域或三维结构特异性结合的抗体，这些区域或结构称为表位或抗原决定簇。本文使用的“抗原片段”指含有一个或多个表位的多肽部分。表位可以是线性的，基本包含来自抗原的线性序列，或者可以是构象的，包含在遗传上被其他序列隔开、但在结构上在多肽配体的结合位点聚一起的序列。“抗原片段”的长度可以最大为5000、1000、500、400、300、200、100、50、25、20、10或5个氨基酸中的任一种。

本文使用的“预选区域”、“预定区域”或“独特位置”指衬底上的局部区域，所述区域用于或意图用于放置核酸，在本文中也可称为“选定区域”或简单地称为“区域”。预选区域可以是任何方便的性状，如环形、矩形、椭圆形、楔形等。在一些实施方案中，预选区域小于约1cm²，更优选小于1mm²，更优选小于0.5mm²，并且在一些实施方案中小于0.1mm²。“预选区域”、“预定区域”或“独特区域”中的核酸成员是这样的核酸：其身份(如序列)可通过其在区域中的位置或独特位置确定。

本文使用的“预防”指由施用一种或多种根据本发明方法鉴定的化合物或施用这些化合物与其他治疗的组合而预防轻度骨关节炎或其一种或多种症状的发生、复发或产生。

本文使用的术语“引物”指存在于纯化的限制性消化物中或合成产生的寡核苷酸，置于诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下时，即存在核苷酸和诱导剂(如DNA聚合酶)以及适当的温度和pH时，所述寡核苷酸能作为合成的起始点。引物可以为单链或双链，并且必须具有足够的长度，以在诱导剂存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度会取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用的方法。例如，就诊断应用而言，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物一般含有15-25或更多的核苷酸，尽管也可以含有更少的核苷酸。引物合适长度的确定中涉及的因素为本领域普通技术人员所公知。一般而言，根据本领域熟知的标准方法设计和选择本发明的引物，参阅Dieffenbach，C.W.，Lowe，T.M.J.，Dveksler，G.S.(1995)GeneralConcepts for PCR Primer Design.《PCR Primer，A LaboratoryManual》(Dieffenbach，CW和Dveksler，G.S.编辑)Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York，133-155；Innis，M.A.和Gelfand，D.H.(1990)Optimization of PCRs.《PCR protocols，A Guide toMethods and Applications》(Innis，M.A.，Gelfand，D.H.，Sninsky，J.J.和White，TJ.编辑)Academic Press，San Diego，3-12；Sharrocks，A.D.(1994)The design of primers for PCR.《PCR Technology，CurrentInnovations》(Griffin，H.G.和Griffin，A.M，编辑)CRC Press，London，5-11。

本文使用的术语“探针”表示寡核苷酸及其类似物，指通过与靶序列核苷酸碱基的氢键相互作用识别多核苷酸靶序列的一系列化学物质。探针或靶序列可以为单链或双链RNA、单链或双链DNA或者DNA与RNA碱基的组合。探针的长度至少为8个核苷酸并小于完整基因的长度。探针的长度可以为10、20、30、50、75、100、150、200、250、400、500并多至2000个核苷酸。探针可包含修饰的寡核苷酸，从而含有可通过荧光、化学发光等进行检测的标签。探针还可经修饰以同时具有检测标签和猝灭分子，例如Taqman

和MolecularBeacon

探针。

寡核苷酸及其类似物可以为RNA或DNA或者RNA或DNA的类似物，通常称为反义寡聚物或反义寡核苷酸。这些RNA或DNA类似物包括但不限于2-′O-烷基糖修饰、甲基膦酸、硫代磷酸、二硫代磷酸、formacetal、3′-thioformacetal、砜、氨基磺酸和硝基氧骨架修饰和碱基部分进行了修饰的类似物。此外，寡聚物的类似物可以为这样的聚合物：其中糖部分经修饰或用其他适当部分进行了替换，产生包括但不限于吗啉代类似物和肽核酸(PNA)类似物的聚合物(Egholm等《Peptide Nucleic Acids(PNA)～Oligonucleotide Analogues with anAchiral Peptide Backbone》，(1992))。

探针还可以是任何寡核苷酸类似物类型与天然DNA或RNA在一起或组合的混合物。同时，寡核苷酸及其类似物可以单独使用或与一种或多种其他寡核苷酸或其类似物组合使用。

本文使用的术语“预防剂”指可用于预防骨关节炎的任何化合物。在某些实施方案中，术语“预防剂”指在本文所述筛选测定中鉴定的化合物。在其他某些实施方案中，术语“预防剂”指除本文所述筛选测定中鉴定的化合物以外的物质，其已知可用于、已经用于或目前正用于预防或阻碍骨关节炎或其一种或多种症状的发病、发生和/或发展。

本文使用的术语“预防有效量”指足以引起预防骨关节炎或其一种或多种症状的发生、复发或发病的治疗(如预防剂)量。

本文使用的术语“蛋白质”、“多肽”和“蛋白质类物质”可互换使用，指通过肽键连接在一起的氨基酸链，任选地可包含天然或非天然氨基酸。任选地，蛋白质或多肽可包含除氨基酸以外的其他分子。所述链可以为任何长度。在一个具体实施方案中，蛋白质由通过肽键连接在一起的少于200个、少于175个、少于150个、少于125个、少于100个、少于50个、少于45个、少于40个、少于35个、少于30个、少于25个、少于20个、少于15个、少于10个或少于5个氨基酸组成。在另一实施方案中，蛋白质由通过肽键连接在一起的至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个或更多氨基酸组成。

本文使用的“多种”或“一组”指多于2，例如3或更多、10或更多、100或更多、1000或更多或10000或更多。

在本发明生物标志物RNA产物的上下文中，本文使用的术语“RNA部分”和“其部分”指RNA转录物，其包含本发明生物标志物RNA产物的至少6个、至少9个、至少15个、至少18个、至少21个、至少24个、至少30个、至少60个、至少90个、至少99、至少108个、或更多的核苷酸。

本文使用的术语“本发明生物标志物的产物”指本发明生物标志物相应基因表达的RNA和/或蛋白质。“本发明生物标志物的RNA产物”包括一种或多种产物，可包括核不均一RNA(“hnRNA”)、mRNA和mRNA的全部或一些剪接变体，其表达量度可根据本文公开的教导作为生物标志物使用。“本发明生物标志物的蛋白质产物”包括生物标志物的一种或多种产物，可包括蛋白质、蛋白质变体和任何经转录后修饰的蛋白质。

本文使用的术语“选择性扩增的”或“选择性扩增”指从模板核酸中选择性产生特定靶核酸序列的一个或多个拷贝的方法。选择性扩增与总体扩增相比较，后者可作为方法与例如随机引物和寡聚T引物组合使用，以扩增核酸序列群(如mRNA)。选择性扩增优选通过聚合酶链式反应进行(Mullis和Faloona，1987，Methods Enzymol.155：335)。

在本发明包括的蛋白质上下文中，本文使用的术语“选择性结合”指肽、蛋白质、多肽和抗体中任何两种的特异性相互作用，其中与任何其他肽、蛋白质、多肽和抗体相比，该相互作用优先在所述肽、蛋白质、多肽和抗体的任何两种中发生。例如，当两种分子为蛋白质时，第一种分子上的结构识别并结合第二个分子上的结构而不是其他蛋白质。本文使用的术语“选择性结合”指分子与其特异性结合伴侣结合的亲和力比与非特异性分子的结合至少高2倍，优选亲和力至少高10倍、20倍、50倍、100倍或更高。

在本发明上下文中，本文使用的“选择性杂交”指本发明包括的多核苷酸与本发明生物标志物的RNA及其互补物或蛋白质产物之间发生的杂交，其中相对于目标基因组中其他基因的RNA产物，所述多核苷酸与本发明生物标志物的RNA产物优先杂交。在一个优选的实施方案中，“选择性杂交”的多核苷酸为选择性高于70％、高于80％、高于90％并最优选为100％的多核苷酸(即发生与其他RNA种类的交叉杂交优选低于30％、低于20％、低于10％)。本领域技术人员应该理解，可以考虑长度和组成来确定与本发明生物标志物的RNA产物“选择性杂交”的多核苷酸。

本文使用的“特异性杂交”指基本互补(在至少为14至25个核苷酸的一段上至少约65％互补，优选至少约75％互补，更优选至少约90％互补)的两核酸序列之间发生的杂交。参阅引入本文为参考的Kanehisa，M.，1984，Nucleic acids Res.，12：203。因此，预计某种程度的错配是可以容忍的。这些错配很小，例如为单核苷酸、双核苷酸或三核苷酸。或者，错配区可以包括环，其定义为其中四个或更多核苷酸的连续串中存在错配的区域。许多因素影响两核酸杂交(例如阵列上的核酸成员与靶核酸序列的杂交)的效率和选择性。这些因素包括核酸成员的长度、核苷酸序列和/或组成、杂交温度、缓冲液组成和需要核酸成员杂交的区域中的位阻。在核酸长度和核酸与靶序列退火的效率和准确度之间均存在正相关。具体地，较长序列具有比较短序列更高的熔链温度(T_M)，在给定的靶序列内也更不可能重复，从而使非特异杂交最小。杂交温度与核酸成员退火效率的变化相反。类似地，杂交混合物中存在的有机溶剂(如甲酰胺)的浓度与退火效率的变化相反，而杂交混合物中盐浓度的提高可促进退火。在严谨退火条件下，较长的核酸比较短的核酸更高效地发生杂交，较短的核酸在更宽容的条件下是充分的。

本文使用的术语“特异性杂交”指两分子(如配体与蛋白质或肽或者抗体与蛋白质或肽)的相互作用，其中所述相互作用取决于各自分子上特定结构的存在。例如，当两分子为蛋白质分子时，第一个分子上的结构识别并结合第二个分子上的结构，而不是蛋白质总体。本文使用的术语“特异性结合”指分子与其特异性结合伴侣结合的亲和力比与非特异性分子的结合高至少10倍、20倍、50倍、100倍或更高。

本文使用的术语“标准严谨条件”和“严谨条件”指仅在序列间存在至少95％、优选至少97％一致性时才发生杂交，其中一致性区包含至少10个核苷酸。在一个实施方案中，序列在42℃孵育过夜后在严谨条件下杂交，接着进行严谨洗涤(0.2×SSC，65℃)。可以通过改变温度、pH、离子强度、二价阳离子浓度、洗涤体积和持续时间来改变洗涤的严谨程度。例如，可以通过在低于探针熔链温度的不同温度进行杂交来改变杂交的严谨度。探针的熔链温度可使用下式计算：

对于长度为14至70个核苷酸之间的寡核苷酸探针，可以使用下式计算以摄氏温度计量的熔链温度(Tm)：Tm＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(G+C分数)-(600/N)，其中N为寡核苷酸的长度。

例如，可以在约1M Na⁺浓度的杂交缓冲液中以5℃的增量从68℃至42℃降低杂交温度。杂交后，可以在杂交温度下用2×SSC、0.5％SDS洗涤滤膜。50℃以上的这些条件认为是“中等严谨”条件，50℃以下是“低严谨”条件。“中等严谨”条件的具体实例为在55℃进行上述杂交。“低严谨”杂交条件的具体实例为在45℃进行上述杂交。

如果在含有甲酰胺的溶液中进行杂交，则可使用以下方程计算退火核酸链的熔链温度：Tm＝81.5+16.6(log[Na⁺])+0.41(G+C分数)-(0.63％甲酰胺)-(600/N)，其中N为探针长度。

例如，可以在42℃下在含有甲酰胺的缓冲液(如6×SSC)中进行杂交。在这种情况下，可以以5％的增量从50％至0％降低杂交缓冲液中的甲酰胺浓度，以鉴定与探针的同源性水平逐渐下降的克隆。杂交后，可以在50℃用6×SSC、0.5％SDS洗涤滤膜。当杂交液包含25％以上的甲酰胺时，认为杂交条件是“中等严谨”条件，当杂交液包含25％以下的甲酰胺时为“低严谨”条件。“中等严谨”杂交条件的具体实例为在30％甲酰胺中进行上述杂交。“低严谨”杂交条件的具体实例为在10％甲酰胺中进行上述杂交。当条件包括如45℃在6× SSC中杂交、其后在65℃在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤时，认为杂 交条件是“高严谨”。

本文使用的术语“受试者”、“患者”和“个体”可互换使用，指动物(如哺乳动物、鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类和昆虫)。在一个具体的实施方案中，受试者为哺乳动物(如非人哺乳动物和人)。在另一实施方案中，受试者为宠物(如狗、猫、豚鼠、猴和禽类)、农场动物(如马、牛、猪、山羊和鸡)或实验室动物(如小鼠和大鼠)。在另一实施方案中，受试者为灵长类(如黑猩猩和人)。在另一实施方案中，受试者为人。

本文使用的术语“协同”指使用本文所述方法鉴定的化合物与其他治疗(如试剂)的组合，所述组合比该治疗的加和作用更有效。优选地，这些其他治疗已经用于或目前用于预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状。治疗(如预防或治疗剂)组合的协同效应允许对患骨关节炎的受试者使用以较低剂量的一种或多种治疗和/或较低给药频率的所述治疗。使用较低剂量的治疗(如预防或治疗剂)和/或较低频率地施用所述治疗的能力降低了与对受试者施用所述物质相关的毒性，而不降低所述治疗预防、治疗、控制或改善骨关节炎的效力。此外，协同效应可引起治疗(如物质)在预防、治疗、控制或改善骨关节炎中效力的提高。最后，治疗(如预防或治疗剂)组合的协同效应可避免或降低与单独使用任一治疗相关的不良或不期望的副作用。

本文使用的“滑液”指每个关节周围的“滑液囊”中分泌的流体。滑液用于保护关节、润滑关节并为关节软骨提供营养。可根据本发明使用的滑液含有细胞，可以根据本文所述领域熟知的方法从所述细胞中分离RNA。

本文使用的术语“治疗剂”指可用于治疗、控制或改善骨关节炎或其一种或多种症状的任何化合物。在一种具体的实施方案中，术语“治疗剂”指提高或降低多核苷酸序列表达的化合物，所述多核苷酸序列如本文定义在来自轻度骨关节炎的细胞中相对于来自正常个体的软骨细胞差异表达。本发明的治疗剂还指提高或降低软骨细胞合成代谢活性的化合物。本发明提供这样的“治疗剂”，其在对患者施用后，1)预防骨关节炎的发病；2)降低、延缓或消除骨关节炎症状如疼痛、肿胀、虚弱和丧失患病关节的功能性能力；3)降低、延缓或消除软骨退化和/或增强软骨细胞代谢活性和细胞***速率；和/或4)将患者的一种或多种疾病指示性核酸的一种或多种表达谱恢复为更接近正常个体的表达谱。在某些实施方案中，术语“治疗剂”指本文所述筛选测定中鉴定的化合物。在其他实施方案中，术语“治疗剂”指本文所述筛选测定中所鉴定化合物以外的物质，其已知可用于或已经用于或目前正用于治疗、控制或改善骨关节炎或其一种或多种症状。

本文使用的术语“治疗有效量”指足以引起骨关节炎或其一种或多种症状的改善、预防骨关节炎发生、导致骨关节炎消退或者增强或改善另一治疗(如治疗剂)的疗效的治疗(如治疗剂)量。在一种具体的实施方案中，治疗有效量指降低关节痛或关节肿胀的治疗(如治疗剂)量。优选地，相对于对照如磷酸盐缓冲液(“PBS”)，治疗(如治疗剂)的治疗有效量降低关节肿胀至少5％，优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。

本文使用的术语“治疗”指由施用按照本发明方法鉴定的一种或多种化合物或按照本发明鉴定的一种或多种化合物与其他治疗的组合引起的骨关节炎或其一种或多种症状的发展、严重性和/或持续时间的降低或改善。

在本发明上下文中，本文使用的术语“表达水平的上调”或“增加”指对应于所表达基因的序列，其中序列量的测量证明，与从正常个体或从通过骨关节炎分期确定与骨关节炎不同的已鉴定疾病状态的个体中分离的软骨或血中的同一基因相比，所述基因在从患骨关节炎或通过骨关节炎分期确定的骨关节炎已鉴定疾病状态的个体中分离的软骨或血中的表达水平增加。根据本发明，“表达水平的增加”为例如通过本发明方法杂交强度测量的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更高的表达增加，例如20％、30％、40％、or50％、60％、70％、80％、90％或更高或者高于1倍，最高为2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100-倍或更高。例如，上调序列包括与分离自正常个体的软骨相比，在分离自特征为患轻度、中度、显著或重度OA的个体的软骨或血中表达水平增加的序列。上调序列还可包括与其他骨关节炎阶段相比，在分离自特征为患某个骨关节炎阶段的个体的软骨或血中表达水平增加的序列(如显著OA比重度OA)。

4.图表说明

附图说明

图1描述了表4中所列基因所有可能的比例组合的分析结果，其中用于诊断轻度OA的ROC高于0.6。显示的是ROC面积、灵敏度(假设特异性设置为50％阈值)和特异性(假设灵敏度设置为50％阈值)的图形描述。其他细节描述于实施例8。

参考本说明书实施例部分之后包括的表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7和表8以及图1可以更好地理解本发明的目的和特征。

表1为显示一个实施方案中的本发明基因、特别是基于其LocusLink ID标识基因的表格。

表2为显示申请号10/915,680所公开的生物标志物的具体实施方案的表格。

表3为显示一个实施方案中对应于表1标识的生物标志物的RNA产物以及每种RNA产物的核酸参考登录号和蛋白质参考登录号的表格。

表4为显示一个实施方案中本发明生物标志物的选择集的表格，所述生物标志物各自独立地指示轻度OA并可组合使用作为轻度OA的指示。表4通过基因ID(以前的Locus Link ID)标识每种生物标志物，并包括基因符号、备选基因符号和基因描述作为生物标志物的标识符。此外，还显示了实施例9中进一步描述的特定p值和倍数变化。

表5为显示一个实施方案中对应于表4生物标志物的RNA和蛋白质变体的代表性实例的表格。

表6为显示一个实施方案中引物的选择集的表格，所述引物用于在选定的表4中列出的RNA种类上进行的定量实时RT-PCR。

表7为显示一个实施方案中对表4生物标志物的蛋白质产物具有特异性的商品抗体的表格。

表8提供了一个实施方案中引物和

探针代表性种类的表格，所述引物和

探针用于测量表4列出的生物标志物的RNA产物。

5.发明详述

具体实施方式

本发明的实施部分使用分子生物学、微生物学和重组DNA技术的常规技术，所述技术在本领域技术人员的能力之内。这些技术在文献中有完整的解释。参阅如Sambrook，Fritsch&Maniatis，1989，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》，第二版；《Oligonucleotide Synthesis》(MJ.Gait编辑，1984)；《Nucleic Acid Hybridization》(B.D.Harnes&SJ.Higgins编辑，1984)；《A Practical Guide t0Molecular Cloning》(B.Perbal，1984)；和《Methods in Enzymology》丛书(Academic Press，Inc.)；《Short Protocols In Molecular Biology》，(Ausubel等编辑，1995)。本文中上文和下文提到的所有专利、专利申请和公开均以其整体引入本文为参考。

本文公开的发明鉴定了生物标志物和生物标志物组合，其用于诊断轻度和/或用于区分轻度OA和非OA。为了使用这些生物标志物，本发明教导了这些生物标志物产物的鉴定，其中包括RNA产物和蛋白质产物。本发明还公开了与本发明生物标志物的RNA产物特异性和/或选择性杂交的寡核苷酸、cDNA、DNA、RNA、PCR产物、合成DNA、合成RNA及其片段或其他天然存在的修饰核苷酸的组合。本发明还公开了与本发明生物标志物的蛋白质产物特异性和/或选择性杂交的蛋白质、肽、抗体、配体及其片段，包括抗原结合片段。可以使用寡核苷酸进行本发明生物标志物和生物标志物组合的RNA产物的表达测量，所述寡核苷酸对本发明生物标志物的RNA产物具有特异性和/或选择性，以定量RNA产物的表达。在本发明的一个具体实施方案中，对RNA产物具有特异性和/或选择性的多核苷酸为探针或引物。在一个实施方案中，这些多核苷酸的形式为能够与已制造阵列杂交的核酸探针。在另一实施方案中，可以使用商品阵列测量RNA产物的表达，本发明教导了分析哪个基因组合。在另一实施方案中，使用如Green或

或分子信标技术，在比如定量实时RT PCR等技术中以探针和引物的形式使用对本发明生物标志物的RNA产物具有特异性和/或选择性的多核苷酸，其中所使用的多核苷酸以正向引物、反向引物、TaqMan标记探针或分子信标标记探针的形式使用。在一个具体的实施方案中，可以将测量本发明RNA产物的表达水平所产生的结果输入本发明的模型，所述模型用于鉴定生物标志物的组合，以确定模型定义的诊断。在一个优选的实施方案中，使用相同的方法产生用于产生数学模型的表达数据，所述模型用于诊断受试个体。

本发明还包括本文公开以及本领域技术人员已知的蛋白质或多肽用于测量本发明生物标志物的蛋白质产物的用途。接着可以使用本领域技术人员公知的技术(如Western印迹、免疫沉淀、蛋白质微阵列分析等技术)测量对应于本发明生物标志物的蛋白质产物的水平。本领域技术人员会理解，测量本发明生物标志物蛋白质产物的表达水平需要与对应于每种本发明生物标志物的一种或多种蛋白质产物特异性或选择性结合的蛋白质。接着可以将代表本发明生物标志物的蛋白质产物表达水平的数据输入模型，产生所述模型以鉴定组合，从而确定该模型定义的诊断。在一个优选的实施方案中，使用相同的方法产生用于产生数学模型的表达数据，所述模型用于诊断测试个体。

5.1用于本发明的样品

除非本文中另外指明，得自任何受试者的任何组织样品(如软骨、滑液或血样)或细胞样品(如软骨细胞或血细胞样品)均可以根据本发明方法使用。可以从中获得这些样品并根据本发明方法使用这些样品的受试者实例包括但不限于无症状受试者、表现或显示1、2、3、4种或更多骨关节炎症状的受试者、临床诊断为患有骨关节炎的受试者、易患骨关节炎的受试者(如有骨关节炎家族史的受试者、有骨关节炎遗传易感性的受试者以及生活方式使其易感骨关节炎或提高患骨关节炎可能性的受试者)、怀疑患有骨关节炎的受试者、正接受骨关节炎治疗的受试者、患有骨关节炎和至少一种其它疾病的受试者(如具有2、3、4、5种或更多疾病的受试者)、非接受骨关节炎治疗的受试者、开业医生(如医师)确定为健康或无骨关节炎的受试者(即正常)、已治愈骨关节炎的受试者、正在控制其骨关节炎的受试者和未诊断为骨关节炎的受试者。在一个具体的实施方案中，可获得样品并使用的受试者患手、足、脊柱、膝、髋和/或腕骨关节炎。

在另一实施方案中，可获得样品并使用的受试者患轻度OA。在另一些实施方案中，可获得样品的受试者为测试个体，所述测试个体是否患有骨关节炎未知和/或该测试个体患何阶段的骨关节炎未知。

为了将患者按疾病状态分类，可以使用基于软骨的评分***，其中使关节镜操作者的主观判断最小化。定义本文所述疾病状态的评分***实例为引入本文作为参考的Marshall，1996，The Journal ofRheumatology23：582-584中的***。根据该方法，基于特定表面上存在的最严重损伤对6个关节面(髌骨、股骨滑车、股骨内侧踝、胫骨内侧坪、股骨外侧踝和胫骨外侧坪)中的每一个给予软骨分级。接着应用评分***，其中每个关节面获得反映该面软骨严重性分级的骨关节炎严重性数值，如表9所述。

例如，如果股骨内侧踝最严重的软骨损伤为为I级损伤，则给予1的分值。接着由6个关节面分数的总和产生患者的总分。基于总分将每名患者分入4个OA组中：“轻度”(早期)定义为Marshall分数1-6，“中度”定义为Marshall分数7-12，“显著”定义为Marshall分数13-18，“重度”定义为Marshall分数高于18。

在某些实施方案中，得自受试者的样品为软骨样品(包括来自软骨的细胞样品)。在另一实施方案中，得自受试者的样品为滑液样品(包括来自滑液的细胞样品)。在另一实施方案中，得自受试者的样品为血样(包括来自血的细胞样品)。

5.1.1软骨

在一个方面中，根据本领域已知并描述于下文的方法从生存的正常个体或死后14小时以内的软骨组织获得软骨样品。使用任何已知方法获得来自成人的正常关节软骨。在一个具体的实施方案中，软骨得自接受关节镜术或全膝置换术的个体，样品在液氮中保存待用。由于伦理考虑，通常不能从活供体中广泛采样真实的正常软骨。因此，优选地，在14小时的死后窗口中在停止对采样关节灌注后从死亡供体获得正常软骨样品，以使窗口过后观察到的RNA降解最小。在另一些实施方案中，“正常”组织在死后14小时内获得，例如少于或等于死后13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1小时。优选地，正常软骨在死后12小时以内获得。

在另一方面中，软骨得自诊断为轻度骨关节炎的受试者。使用任何已知技术获得来自骨关节炎个体的人关节样品。优选地，将关节样品保存在液氮中待用。在一个具体实施方案中，分离至少0.05g软骨样品，以获得2μg总RNA提取物。在另一实施方案中，分离至少0.025g软骨样品，以获得1μg总RNA提取物。可根据本发明使用的软骨样品为足以检测一种或多种本发明核酸序列或氨基酸序列的量。

在根据本发明方法使用前，任选地(但优选)将收集的软骨保存在低温如4℃下。在一些实施方案中，在第一时间根据本发明方法使用软骨样品的一部分，而将一个或多个剩余的样品部分保存一段时间以备后用。该段时间可以是1小时或更长、1天或更长、1周或更长、1个月或更长、1年或更长或不确定。就长期保存而言，可以使用本领域熟知的保存方法，例如在冷冻温度(如低于-60℃)保存。在一些实施方案中，作为保存软骨的补充或替代，将分离的核酸或蛋白质保存一段时间(如1小时或更长、1天或更长、1周或更长、1个月或更长、1年或更长或不确定)以备后用。

在本发明的一些实施方案中，使用本领域已知的技术分离软骨中存在的软骨细胞，并根据本发明方法使用。软骨细胞可得自患轻度OA、未患轻度OA的受试者或测试受试者。在用于本发明方法前，可以通过标准技术冷冻软骨细胞。

5.1.2滑液

在一个方面中，使用本领域熟知的方法从受试者获得滑液样品。例如，可以进行关节穿刺。在关节穿刺中，使用无菌针从关节中移出滑液。可以使用关节穿刺从膝、肘、腕、指、髋、脊柱或任何其他关节收集滑液。在一个具体的实施方案中，滑液收集自患骨关节炎或怀疑患骨关节炎的关节。滑液可得自患轻度OA、未患OA的受试者或得自测试受试者。

可根据本发明使用的滑液样品为足以检测一种或多种本发明核酸序列或氨基酸序列的量。在一个具体实施方案中，可根据本发明使用的滑液样品的量范围从0.1ml至20ml、0.1ml至15mi、0.1ml至10ml、0.1ml至5ml、0.1至2ml、0.5ml至20ml、0.5ml至15ml、0.5ml至10ml、0.5ml至5ml或0.5ml至2ml。在另一实施方案中，根据本发明使用的滑液样品为0.1ml或更多、0.5ml或更多、1ml或更多、2ml或更多、3ml或更多、4ml或更多、5ml或更多、6ml或更多、7ml或更多、8ml或更多、9ml或更多、10ml或更多、11ml或更多、12ml或更多、13ml或更多、14ml或更多、15ml或更多、16ml或更多、17ml或更多、18ml或更多、19ml或更多、或20ml或更多。

在根据本发明方法使用前，任选地(但优选)将收集的滑液保存在低温如4℃下。在一些实施方案中，在第一时间根据本发明方法使用滑液样品的一部分，而将一个或多个剩余的样品部分保存一段时间以备后用。该段时间可以是1小时或更长、1天或更长、1周或更长、1个月或更长、1年或更长或不确定。就长期保存而言，可以使用本领域熟知的保存方法，例如在冷冻温度(如低于-60℃)保存。在一些实施方案中，作为保存滑液的补充或替代，将分离的核酸或蛋白质保存一段时间(如1小时或更长、1天或更长、1周或更长、1个月或更长、1年或更长或不确定)以备后用。

在本发明的一些实施方案中，使用本领域已知的方法分离滑液中存在的细胞，并根据本发明方法使用。通常在滑液中可见以下细胞：淋巴细胞(B和T淋巴细胞)、单核细胞、嗜中性粒细胞、滑膜细胞和巨噬细胞。在来自病理状态(如骨关节炎)的患者的滑液中还可见以下细胞：软骨细胞、成骨细胞和破骨细胞。可以根据本发明的方法分离并使用这些细胞。在一个具体实施方案中，从滑液样品中分离淋巴细胞(B和T淋巴细胞)并根据本发明方法使用。在另一实施方案中，从滑液样品中分离单核细胞或嗜中性粒细胞并根据本发明方法使用。在用于本发明方法前，可以通过标准技术冷冻分离自滑液的细胞。

5.1.3血

在本发明的一个方面中，根据本领域熟知的方法从受试者中获得血样。血样可得自患轻度OA、未患OA的受试者或得自测试个体，所述测试个体是否患有骨关节炎未知和/或该测试个体患何阶段的骨关节炎未知。在一些实施方案中，对受试者皮肤进行简单针刺而收集血滴。在这些实施方案中，由针刺收集的血滴即为全部所需。可以使用本领域技术人员已知的技术(特别是已知的采血方法)从受试者的任何身体部位(如指、手、腕、臂、腿、足、踝、胃和颈)取血。在一个具体的实施方案中，从受试者获得静脉血并根据本发明方法使用。在另一实施方案中，获得动脉血并根据本发明方法使用。静脉血的组成根据其服务的身体部分的代谢需求而变化。相反，动脉血的组成在整个身体中恒定。常规血测试一般使用静脉血。

静脉血可得自贵要静脉、头静脉或中脉。动脉血可得自桡动脉、肱动脉或股动脉。可以使用真空管、注射器或蝶形针取血。通常清洁针刺部位、在针刺部位上方约3-4英寸处应用止血带、将针以约15-45度角***，并且如果使用真空管，则在针穿透静脉壁后立即将管推入持针器。完成采血后，移去针并保持针刺部位的压力。通常在收集血的管或瓶中有肝素或其他类型的抗凝血剂，以防止血凝固。收集动脉血时，可以在收集前施用麻醉剂。

采血量将取决于采血部位、本发明方法需要的量和受试者的舒适度而变化。然而，本发明一个实施方案的优点是实施本发明方法所需要的血量可以很小，使得不需要通过更具侵入性的方法获得样品。例如，在一些实施方案中，全部所需仅为一滴血。这滴血例如可以从简单针刺获得。在一些实施方案中，收集足以检测表1列出的1、2、3、4、5、10或更多种基因表达的任意血量。这样，在一些实施方案中，采血量是1μl或更少、0.5μl或更少、0.1μl或更少或0.01μl或更少。然而，本发明不仅限于这些实施方案。在一些实施方案中有更多的血可供使用，并且在一些实施方案中，可以使用更多的血来实施本发明的方法。这样，在多个具体的实施方案中，从受试者收集0.001ml、0.005ml、0.01ml、0.05ml、0.1ml、0.15ml、0.2ml、0.25ml、0.5ml、0.75ml、1ml、1.5ml、2ml、3ml、4ml、5ml、10ml、15ml或更多血。在另一实施方案中，从受试者收集0.001ml-15ml、0.01ml-10ml、0.1ml-10ml、0.1ml-5ml、1ml-5ml血。

在本发明的一些实施方案中，将血保存在K3/EDTA管中。在另一实施方案中，可以使用含有例如美国专利No.6,617,170(引入本文为参考)公开的稳定剂的血保存管。在另一实施方案中，可使用Qiagen/BD公司PreAnalytiX提供的PAXgeneTM血RNA***收集血。在另一实施方案中，可以使用Applied Biosystems提供的TempusTM血RNA收集管。TempusTM收集管提供用于收集全血的含RNA稳定剂的密闭真空塑料管。

在根据本发明方法使用前，任选地(但优选)将收集的血保存在低温如4℃下。在一些实施方案中，在第一时间根据本发明方法使用血样品的一部分，而将一个或多个剩余的样品部分保存一段时间以备后用。该段时间可以是1小时或更长、1天或更长、1周或更长、1个月或更长、1年或更长或不确定。就长期保存而言，可以使用本领域熟知的保存方法，例如在冷冻温度(如低于-60℃)保存。在一些实施方案中，作为保存血的补充或替代，将分离的核酸或蛋白质保存一段时间以备后用。这些分子标志物的保存可以为1小时或更长、1天或更长、1周或更长、1个月或更长、1年或更长或不确定。

在一个方面中，根据本领域熟知的采血方法从正常个体或者从诊断为患骨关节炎或怀疑患骨关节炎的个体取全血。全血包括可直接使用的血，并包括已经根据本领域熟知的方法(例如优选在300-800×g温和离心5-10分钟)除去血清或血浆并且已经从剩余血样中分离了RNA或mRNA的血。在一个具体的实施方案中，将得自受试者的全血(即未分级血)与裂解缓冲液(如裂解缓冲液(1L)：0.6g EDTA；1.0gKHCO₂，8.2g NH₄Cl，用NaOH调整至到pH7.4)混合，离心样品并保留细胞沉淀，根据本领域熟知的方法提取RNA或mRNA(“裂解血”)(参阅如Sambrook等)。优选使用全血，因为它避免了昂贵耗时的分离血中细胞类型的步骤(Kimoto，1998，Mol.Gen.Genet258：233-239；Chelly J等，1989，Proc.Nat.Acad.Sci.USA86：2617-2621；Chelly J等，1988，Nature333：858-860)。

在本发明的一些实施方案中，将收集自受试者的全血进行分级(即分离成组分)。在本发明的一个具体实施方案中，使用本领域已知技术从收集自受试者的全血分离血细胞。例如，可以对收集自受试者的血进行Ficoll-Hypaque(Pharmacia)梯度离心。这种离心将红细胞(血红细胞)与各种类型的有核细胞和血浆分离开。具体地，Ficoll-Hypaque梯度离心可用于分离外周血白细胞(PBL)，它们可根据本发明方法使用。

用于示例而非限制性地，可以如下获得巨噬细胞。通过用注射器取血其后进行Ficoll-Hypaque梯度离心从受试者的外周血分离单个核细胞。用受试者自身的血清或用AB+人血清预包被组织培养皿并在37℃孵育1小时。吸走未贴壁细胞。向培养皿中存留的贴壁细胞中加入含1mM EDTA的冷(4℃)磷酸盐缓冲液，将培养皿置于室温15分钟。收获细胞，用RPMI缓冲液洗涤，并重悬于RPMI缓冲液。可以通过在37℃下与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)一起孵育来获得数量更多的巨噬细胞。可以通过将亲合化合物缀合到这些分子来标记针对巨噬细胞特异性表面标志物(如Mac-1)的抗体，以便于检测和分离巨噬细胞。可以使用的亲合化合物包括但不限于生物素、光生物素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)或藻红蛋白(PE)或本领域已知的其它化合物。然后使用本领域已知技术将保留标记抗体的细胞与不结合这种抗体的细胞分离开，例如但不仅限于各种细胞分选法、亲合层析和淘选(panning)。

可以用荧光激活细胞分选仪(FACS)分选血细胞。荧光激活细胞分选(FACS)是已知的基于颗粒物的荧光特性分离颗粒物包括细胞的方法。参阅如Kamarch，1987，Methods Enzymol151：150-165。单个颗粒上的荧光部分的激光激发产生小电荷，这允许从混合物中电磁分离正电和负电颗粒。用荧光物质如FITC或藻红蛋白标记抗体或配体，所述抗体或配体用于检测特定血细胞的细胞表面上存在的血细胞抗原决定簇。将细胞与荧光标记的抗体或配体充分孵育一段时间，使得标记抗体或配体与细胞结合。通过细胞分选仪处理细胞，使目的细胞与其它细胞分离开。可将FACS分选的颗粒直接存放在微孔板的单个孔中以便于分离。

在本发明的一些实施方案中，也可以使用磁珠分离血细胞。例如，可以用磁激活细胞分选(MACS)技术分选血细胞，这是一种基于颗粒结合磁珠(0.5-100m直径)的能力分离颗粒的方法。可以对磁性微球进行多种有用的修饰，包括共价添加特异性识别细胞-固相表面分子或半抗原的抗体。然后施加磁场，以物理操作选定的磁珠。在一个具体实施方案中，针对血细胞表面标志物的抗体与磁珠偶联。然后将磁珠与血细胞培养物混合以使之结合。再将细胞通过磁场以分离具有目的血细胞表面标志物的细胞。然后可以分离这些细胞。

在一些实施方案中，可以用抗体包被培养皿表面，并用称为淘选的方法分离血细胞。可以使用对特定血细胞具有特异性的抗体包被不同的皿。首先将细胞加入包被目的血细胞特异性抗体的培养皿中。彻底漂洗后，保持结合在皿上的细胞将是表达目的血细胞标志物的细胞。细胞表面抗原决定簇或标志物的实例包括但不限于T淋巴细胞和自然杀伤细胞的CD2、T淋巴细胞的CD3、白细胞的CD11a、T淋巴细胞的CD28、B淋巴细胞的CD19、B淋巴细胞的CD20、B淋巴细胞的CD21、B淋巴细胞的CD22、B淋巴细胞的CD23、白细胞的CD29、单核细胞的CD14、血小板的CD41、血小板的CD61、粒细胞的CD66、粒细胞的CD67和单核细胞与巨噬细胞的CD68。

全血可以分离成如白细胞、血小板、红细胞等细胞类型，这些细胞类型可根据本发明方法使用。可以使用标准技术将白细胞进一步分离为粒细胞和无粒细胞，这些细胞可根据本发明方法使用。可以使用标准技术将粒细胞分离为如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的细胞类型，这些细胞可根据本发明方法使用。可以使用标准技术将无粒细胞分离为淋巴细胞(如T淋巴细胞和B淋巴细胞)和单核细胞，这些细胞可根据本发明方法使用。可以使用标准技术将T淋巴细胞和B淋巴细胞分离开，并将辅助性T细胞和细胞毒性T细胞分离开，这些细胞可根据本发明方法使用。在用于本发明方法之前，可以使用标准技术冷冻分离的血细胞(如白细胞)。

可根据本发明使用的血样应为足以检测本发明的一种或多种核酸或氨基酸序列的量。在一个具体实施方案中，可根据本发明使用的血样量为1μl-100ml，优选10μl-50ml，更优选10μl-25ml，最优选10μl-1ml。

5.1.4RNA的制备

在本发明的一个方面中，从个体分离RNA以测量本发明生物标志物的RNA产物。RNA分离自本文所述的软骨样品。样品可来自单个患者，或者可以是来自多个患者的混合。

在另一方面中，直接从本文所述患骨关节炎的人的滑液分离RNA。样品可来自单个患者，或者可以是来自多个患者的混合。

在另一方面中，直接从本文所述患骨关节炎的人的血样分离RNA。样品可来自单个患者，或者可以是来自多个患者的混合。

根据本领域熟知的方法从软骨样品中提取总RNA。在一个实施方案中，根据以下方法在软骨组织中纯化RNA。在从个体或受试者中取出目的组织后，将组织在液氮中速冻以防止RNA降解。加入一定体积的组织胍溶液后，在tissuemizer中以2或3次10秒的脉冲研磨组织样品。为制备组织胍溶液(1L)，将590.8g异硫氰酸胍溶于约400ml DEPC处理的水中。加入25ml2M Tris-Cl，pH7.5(0.05M终浓度)和20ml Na₂EDTA(0.01M终浓度)，将溶液搅拌过夜，体积调整为950ml并加入50ml2-ME。

将匀浆组织样品在12℃以12,000×g离心10分钟。在0.1倍体积20％十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)存在下以65℃孵育所得上清液2分钟，在9ml5.7M CsCl(0.1g CsCl/ml)溶液上分层，22℃以113,000×g离心过夜进行分离。仔细地移除上清液后，将管倒置控干。将管底(含有RNA沉淀)置于50ml塑料管中并在3ml组织重悬缓冲液(5mM EDTA、0.5％(体积/体积)十二烷基肌氨酸钠、5％(体积/体积)2-ME)存在下以4℃孵育过夜(或更久)，以使RNA沉淀完全重悬。其后连续用25∶24∶1的酚/氯仿/异戊醇和之后24∶1的氯仿/异戊醇抽提所得RNA溶液，加入3M乙酸钠、pH5.2和2.5倍体积的100％乙醇进行沉淀，重悬于DEPC水(Chirgwin等，1979，Biochemistry，18：5294)。

或者根据以下的一步式方案从软骨组织中提取RNA。通过以每100mg组织1ml变性液(4M硫代硫酸胍、25mM柠檬酸钠、pH7.0、0.1M2-ME、0.5％(重量/体积)N-十二烷基肌氨酸)在玻璃特氟龙匀浆器中进行匀浆来制备目的组织。将匀浆转移至5ml聚丙烯管之后，连续加入0.1ml2M乙酸钠、pH4的1ml水饱和酚和0.2ml49：1的氯仿/异戊醇。在加入每种组分后均混合样品，并在加入所有组分后在0-4℃孵育15分钟。4℃以10,000×g离心20分钟分离样品，加入1ml100％异丙醇进行沉淀，在-20℃孵育30分钟并在4℃以10,000×g离心10分钟进行沉淀。将得到的RNA沉淀溶于0.3ml变性液，转移至微量离心管，在-20℃加入0.3ml100％异丙醇沉淀30分钟并在4℃以10,000×g离心10分钟。在70％乙醇中洗涤沉淀、干燥并重悬于100-200μlDEPC处理的水或DEPC处理的0.5％SDS(Chomczynski和Sacchi，1987，Anal.Biochem.，162：156)。

优选地，在液氮中将软骨样品磨成细粉并使用

试剂(GIBCO/BRL)提取总RNA。

或者使用以下方案从血中分离RNA。按3份裂解缓冲液比1份血的比例向血样中加入裂解缓冲液(裂解缓冲液(1L)：0.6g EDTA；1.0g KHCO₂，8.2g NH4Cl，用NaOH调整至pH7.4)。将样品混合并在冰上放置5-10分钟至透明。在4℃以1000rpm将裂解样品离心10分钟，吸出上清液。将沉淀重悬于5mL裂解缓冲液，并在4℃以1000rpm再离心10分钟。按每10ml起始血样约6ml

(GIBCO/BRL)的比例用

匀浆沉淀的细胞并充分振荡。样品在室温放置5分钟。用1.2ml氯仿/1ml提取RNA。样品在4℃以12,000×g离心5分钟并收集上层。按0.5ml/1ml

的比例向上层中加入异丙醇。样品在-20℃放置过夜或在-20℃放置1小时。根据熟知的方法沉淀RNA，晾干RNA沉淀，并将沉淀重悬于DEPC处理的ddH₂O中。也可以将RNA样品保存于75％乙醇中，这样的样品在室温下稳定以供运输。

或者使用上文的

试剂(GIBCO/BRL)从滑液中分离RNA。

可以通过260/280nm吸光度和琼脂糖凝胶电泳随后在紫外光下检查来评价RNA的纯度和完整性。

5.2本发明的生物标志物

在一个实施方案中，本发明提供生物标志物和生物标志物组合，其中所述生物标志物产物的表达水平的量值可指示轻度骨关节炎的存在。在另一实施方案中，本发明提供了生物标志物和生物标志物组合，其中测量所述生物标志物产物的表达水平可用于诊断个体患有轻度OA还是未患OA。

表1提供本发明生物标志物的基因名称和相关locus link ID的列表，其中单独或组合测量所述生物标志物的表达水平可用于诊断个体为患有轻度骨关节炎，或确定个体是否患骨关节炎。本领域技术人员会理解，locus link ID可用于确定对应于本发明生物标志物的所有RNA转录物和所有蛋白质的序列。

表2提供了申请号10/915,680中公开的生物标志物，所述生物标志物可以如本文的教导与表1公开的一种或多种生物标志物组合使用，以诊断轻度OA或区分轻度OA和非OA。

表3具体显示了表1列出的生物标志物RNA产物的相应参考登录号以及生物标志物蛋白质产物的相应参考登录号。因此本发明包括出于任一上述目的，使用本领域技术人员公知和本文概述的方法测量这些生物标志物和生物标志物组合的表达的用途。

表4提供了对应于本发明生物标志物选集的基因名和相关locuslink ID(基因ID)，其中单独或组合测量所述生物标志物的表达水平可用于诊断个体患有轻度骨关节炎还是未患骨关节炎。本领域技术人员会理解，locus link ID可用于确定对应于本发明生物标志物的所有RNA转录物和所有蛋白质产物的序列。

表5具体公开了表1列出的生物标志物RNA产物的相应参考登录号以及生物标志物蛋白质产物的相应参考登录号。因此本发明包括出于任一上述目的，使用本领域技术人员公知和本文概述的方法测量这些生物标志物和生物标志物组合的表达的用途。

5.3生物标志物组合

生物标志物组合

在一个实施方案中，本发明生物标志物的组合包括表1列出的生物标志物中多至2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、100种的任何数目或全部生物标志物的任何组合。在另一实施方案中，本发明生物标志物的组合包括表2列出的生物标志物中任一种或多至1、2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、100种的任何数目或全部生物标志物与表1列出的生物标志物中任一种或多至1、2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、100种的任何数目或全部生物标志物的组合，其产物表达的测量可用于诊断个体患有轻度骨关节炎还是未患骨关节炎。在另一实施方案中，本发明生物标志物的组合包括表3列出的RNA和/或蛋白质产物中多至2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、100种的任何数目或全部的任何组合。在另一实施方案中，本发明生物标志物的组合包括表2列出的生物标志物中任一种或多至1、2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、100种的任何数目或全部与表3列出的RNA和/或蛋白质产物中多至1、2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、100种的任何数目或全部的任何组合。其产物表达的测量可用于诊断个体患有轻度骨关节炎还是未患骨关节炎。在一个实施方案中，本发明生物标志物的组合包括表4列出的生物标志物中多至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31种的任何数目或全部的任何组合。在另一实施方案中，本发明生物标志物的组合包括表2列出的生物标志物中任一种或多至1、2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、100种的任何数目或全部与表4列出的生物标志物中任一种或任何数目或全部的任何组合。

例如，n个基因的亚组m的可能组合的数目描述于Feller，Introto Probability Theory，第三版，第1卷，1968，J.Wiley编辑，使用以下通式：

m！/(n)！(m-n)！

在一个实施方案中，当n为2，m为19时，则有：

19！＝19×18×17×16×15×14×13×12×11×10×9×8×7×6×5×4×3×2×1

2！(19-2)！  (2×1)(19×18×17×16×15×14×13×12×11×10×9×8×7×6×5×4×3×2×1)＝1.21610¹⁷＝171

7.1110 ¹⁴

种独特的双基因组合。测定这些双基因组合中每种基因的表达均可以独立地用于确定患者是否有骨关节炎。在m为19、n为3的另一实施方案中，有19！/3！(10-3)！种独特的三基因组合。这些独特的三基因组合中每一种均可独立地用作确定患者是否患有骨关节炎的模型。

5.4特别有用的生物标志物组合

尽管表1和表4中列出的生物标志物的所有组合均可用于诊断轻度OA，来自表2的选定生物标志物与来自表1和/或表4的至少一种或多种生物标志物的生物标志物组合也是如此，本发明还提供了选择和评估在诊断轻度OA中特别有用的生物标志物组合的方法。

为了鉴定有用的生物标志物组合，使用本发明的数学模型产生一种或多种分类器，每种分类器使用代表特定生物标志物组合中每种生物标志物的数据将用于输入模型的训练群中患轻度骨关节炎的个体(第一种表型亚组)与未患骨关节炎的个体(第二个表型亚组)分开。

接着可以如5.9节概述的那样通过测定分类器正确判断5.5节中所述训练群中每一个体的能力对产生的分类器进行评估或评分。还通过测定分类器正确判断“评分群”中一个或多个个体的能力对产生的分类器进行评估或评分。评分群与下文5.5节中所述训练群相似，但评分群由未用于产生分类器的一个或多个个体组成。这样，评分群由已诊断为患轻度骨关节炎的个体(第一种表型亚组)和未患骨关节炎的个体(第二个表型亚组)组成。在一个实施方案中，除了未用于训练群的一个或多个成员以外，评分群还包括训练群的成员。在一些实施方案中，训练群成员中5％或更少、10％或更少、20％或更少、30％或更少、50％或更少或90％或更少与评分群共用。

本领域技术人员会理解，这使得人们可以预测分类器正确表征表型特征未知的个体的能力。

输入数学模型的数据可以是代表受评估的生物标志物组合中每种生物标志物产物表达水平的任何数据。在本发明的一个实施方案中，评估了表1中生物标志物的每种可能的组合。在本发明的另一实施方案中，评估了表1中最高为2、3、4、5、10、20、30、等种中任一种的每种可能的组合。在本发明的另一实施方案中，基于个体p值对表1中的生物标志物进行分级，其中p值为每种生物标志物区分患轻度OA成员和未患OA成员的能力的指示，接着评估前40、30、20或10种分级的生物标志物。在本发明的另一实施方案中，评估了表1和表2中可见的生物标志物的每种可能的组合，并选择包括至少一种表1列出的生物标志物的生物标志物组合。在本发明的另一实施方案中，评估了表1和表2中可见的2、3、4、5、10、20、30、等种生物标志物的每种可能的组合，并选择其中包括至少一种表1列出的生物标志物的组合。在本发明的另一实施方案中，基于个体p值对表1和表2中的生物标志物进行分级，其中p值为每种生物标志物区分患轻度OA成员和未患OA成员的能力的指示，接着评估了前40、30、20或10种分级的生物标志物，并选择其中包括至少一种表1列出的生物标志物的组合。在本发明的另一实施方案中，评估了表4中生物标志物的每种可能的组合。在本发明的另一实施方案中，评估了表4中最高为2、3、4、5、10、20、30、等种中任一种的每种可能的组合。在本发明的另一实施方案中，基于个体p值对表4中的生物标志物进行分级，其中p值为每种生物标志物区分患轻度OA成员和未患OA成员的能力的指示，接着评估前40、30、20或10种分级的生物标志物。在本发明的另一实施方案中，评估了表4和表2中可见的生物标志物的每种可能的组合，并选择包括至少一种表4列出的生物标志物的生物标志物组合。在本发明的另一实施方案中，评估了表4和表2中可见的2、3、4、5、10、20、30、等种生物标志物的每种可能的组合，并选择其中包括至少一种表4列出的生物标志物的组合。在本发明的另一实施方案中，基于个体p值对表4和表2中的生物标志物进行分级，其中p值为每种生物标志物区分患轻度OA成员和未患OA成员的能力的指示，接着评估了前40、30、20或10种分级的生物标志物，并选择其中包括至少一种表4列出的生物标志物的组合。在本发明的一个实施方案中，使用的数学模型选自以下：回归模型、逻辑回归模型、神经网络、聚类模型、主成分分析、最近相邻分类器分析、线性判别分析、二次判别分析、支持向量机、决策树、遗传算法、使用bagging的分类器优化、使用boosting的分类器优化、使用随机子空间法的分类器优化、投影寻踪和加权投票。

得到的分类器可用于诊断未知或测试个体，以确定所述测试个体是否患轻度OA。在一个实施方案中，数学模型(如逻辑回归)产生的一个或多个分类器得到的诊断为两种结果(患或未患轻度OA)之一。在本发明的另一实施方案中，答案可以为不可确定的答案。需要指出的是，每种分类器均使用生物标志物的组合，并且使用代表每种生物标志物表达水平的数据产生该分类器。因此，例如当使用的数学模型为逻辑回归时，得到的分类器使用代表组合的10种基因中每一种的表达水平的含权重因子数据。在一个实施方案中，分类器本身可如上文所述用于诊断。然而在另一实施方案中，鉴定的组合(如所述10种基因)可以独立于鉴定所述基因的分类器使用。例如，可以监测所述10种基因产生的图谱以评估测试个体，其中将测试个体的图谱与来自患轻度OA的个体的10基因图谱以及未患OA的个体中的10基因图谱进行比较。

5.5输入数学模型以鉴定诊断轻度骨关节炎的生物标志物组合的数据

例如，为了鉴定用于诊断个体患轻度骨关节炎还是未患骨关节炎的生物标志物，使用反映表1、表2和/或表4生物标志物的一种或多种mRNA产物表达水平的数据，所述数据来自患轻度骨关节炎的个体群和未患骨关节炎的另一个体群(“训练群”)。为了将训练群划分进规定的表型亚组这一目的，可以使用任何OA诊断方法。在优选的实施方案中使用本文所述的Marshall评分法。

在另一实施方案中，为了鉴定用于诊断个体患轻度骨关节炎还是未患骨关节炎的生物标志物组合，使用反映如表3指出的表1中生物标志物的一种或多种mRNA产物表达水平的数据，所述数据来自训练群中的个体。在另一实施方案中，为了鉴定用于诊断个体患轻度骨关节炎还是未患骨关节炎的生物标志物组合，使用反映如表5指出的表4中生物标志物的一种或多种mRNA产物表达水平的数据，所述数据来自训练群中的个体。

在另一实施方案中，使用反映表1、表2和/或表4中生物标志物的一种或多种蛋白质产物表达水平的数据，所述数据来自训练群中的个体。表1和表4中生物标志物的蛋白质产物的种类分别在表3和表5中指出。

5.6训练群

在一些实施方案中，参照或训练群包括10-30个之间的受试者。在另一实施方案中，训练群含有30-50个之间的受试者。在另一些实施方案中，参照群包括2个或更多个群，其中每个群含有50-100个之间、100-500个、500-1000个之间或超过1000个受试者。

例如，为了鉴定用于诊断个体患轻度骨关节炎还是未患骨关节炎的生物标志物，使用反映表1(如表3所示)和/或表4(如表5所示)中生物标志物的一种或多种mRNA产物表达水平的数据，所示数据来自由第一种表型亚组(患轻度骨关节炎的个体)和第二个表型亚组(未患骨关节炎的个体)组成的训练群。在一些实施方案中，还使用反映表2中生物标志物的一种或多种mRNA产物表达水平的数据。在一个实施方案中，训练群的每个表型亚组中其他表型性状(包括年龄、性别、体重指标、同病状态、医药治疗等)的分布相同或相似。例如，第一和第二个表型亚组中个体年龄的分布相同或相似。在一个优选的实施方案中，除了患或未患OA以外，训练集中使用的两个群的表型特征相似。

在另一实施方案中，为了鉴定用于诊断个体患轻度骨关节炎还是未患骨关节炎的生物标志物组合，使用反映表1(包括表3所示)和/或表4(包括表5所示)中生物标志物(任选地与表2中一种或多种多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或全部生物标志物一起)的一种或多种mRNA产物表达水平的数据。

在另一实施方案中，为了鉴定用于诊断个体患轻度骨关节炎还是未患骨关节炎的生物标志物，使用反映表1(包括表3所示)和/或表4(包括表5所示)中任何数目或全部生物标志物的任何数目或全部mRNA产物表达水平的数据，所述mRNA产物在得自患轻度骨关节炎个体的群、和未患骨关节炎个体的第二群的血中表达。

5.7回归模型

在一些实施方案中，将待测试生物标志物每种组合的表达数据用于回归模型，优选逻辑回归模型。这些回归模型会为测试的每种可能的生物标志物组合确定方程，每个方程提供与反映模型展示的每种个体生物标志物表达水平数据相乘的系数。

一般而言，目标多重回归方程可以写作：

Ｙ＝α+β₁X₁+β₂X₂+…+β_kX_k+ε

其中从属变量Y为存在(Y为正数时)或不存在(Y为负数时)第一种表型性状(如患轻度骨关节炎)。该模型说明从属变量Y依赖于k个解释变量(代表来自训练群中第一和第二表型亚组受试者的k个选定基因在目的组织中的基因产物水平的测定值)，加上涉及多种不明确的忽略因素的误差项。在上述模型中，参数β₁表示保持其它解释变量为常数的条件下，第一解释变量X₁对从属变量Y的影响。相似地，参数β₂表示保持其它解释变量为常数的条件下，解释变量X₂对Y的影响

逻辑回归模型是线性回归的非线性转换。逻辑回归模型被称为“对数单位”(1ogit)模型，可以表达为：

ln[p/(1-p)]＝α+β₁X₁+β₂X₂+…+β_kX_k+ε或

$[p/(1-p)]={\exp }^{\mathrm{\α}}{\exp }^{{\mathrm{\β}}_1{X}_1}{\exp }^{{\mathrm{\β}}_2{X}_2}\×\·\·\·\×{\exp }^{{\mathrm{\β}}_k{X}_k}{\exp }^{\mathrm{\ϵ}}$

其中，

Ln为自然对数logexp，其中exp＝2.71828...，

p为事件Y发生的概率，p(Y＝1)，

p/(1-p)为“比值比”(odds ratio)，

ln[p/(1-p)]是比值比的对数，或“对数单位”，并且

模型的所有其它分量与上述的一般回归方程相同。本领域技术人员会理解，α和ε项可以合并(fold)为同一常数。事实上，在一个优选的实施方案中，使用单个项代表α和ε。“逻辑”分布是S形分布函数。对数单位分布将估计概率(p)限制在0和1之间。

在本发明的一些实施方案中，逻辑回归模型用最大可能性估计(MLE)拟合。换言之，系数(如α，β1，β2，...)由最大可能性确定。可能性是条件概率(如P(Y|X)，给定X时Y的概率)。可能性函数(L)衡量观察到相同数据集中发生的从属变量值(Y1，Y2，...，Yn)特定集的概率。它写作从属变量乘积的概率：

L＝Prob(Y₁*Y₂***Y_n)

可能性函数越大，在样品中观察到Ys的概率越高。MLE涉及发现使可能性函数(LL＜0)的对数尽可能大或者可能性函数的对数的-2倍(-2LL)尽可能小的这些系数(α，β1，β2，...)。在MLE中，进行参数α，β1，β2，...的一些初始估计。然后计算给定这些参数估计时的数据可能性。改善参数估计，重新计算数据可能性。重复这一过程，直至参数估计不再有大改变(例如概率的改变小于0.01或0.001)。逻辑回归和拟合逻辑回归模型的实例可见于整体引入本文的Hastie，TheElements of Statistical Learning，Springer，New York，2001，pp.95-100。

5.8神经网络

在另一实施方案中，测定的每种本发明生物标志物的表达可用于训练神经网络。神经网络是两阶段回归或分类模型。神经网络具有分层结构，其中包括输入单元层(和偏置)，它经权重层与输出单元层连接。就回归而言，输出单元层通常仅包括一个输出单元。然而，神经网络可以无缝式处理多重定量应答。这样，神经网络可用于鉴定区分两个以上群体的生物标志物。在一个具体实施例中，可以用表1(包括表3)所示生物标志物产物的表达数据训练神经网络，以与未患骨关节炎的个体相比而鉴定轻度骨关节炎特异性生物标志物组合。结果，经训练的神经网络可用于直接鉴定生物标志物组合，所述组合用于诊断轻度骨关节炎。在一些实施方案中，使用含有十个神经元的单隐藏层(十个隐藏单元)的后向传播神经网络(例如见Abdi，1994，“A neuralnetwork primer”，J.Biol System.2，247-283)，它们可见于EasyNN-Plus4.0g版软件包(Neural Planner Software Inc.)。

神经网络描述于整体引入本文的Duda等，2001，《PatternClassification》，第二版，John Wiley&Sons，New York；和Hastie等，2001，The Elements0f Statistical Learning，Springer-Verlag，NewYork。

5.9其他数学模型

上述模式分类和统计技术仅为可用于构建轻度OA分类模型的模型类型的实例，例如整体引入本文为参考的Duda和Hart，《PatternClassification and Scene Analysis》，1973，John Wiley&Sons，Inc.，New York中211-256页描述的聚类分析、主成分分析(参阅引入本文为参考的Jolliffe，1986，《Principal Component Analysis》，Springer，New York)；最近相邻分类符分析(参阅如Duda，《PatternClassification》，第二版，2001，John Wiley & Sons，Inc；和Hastie，2001，《The Elements of Statistical Learning》，Springer，New York)；

线性判别分析(参阅如Duda，《Pattern Classification》，第二版，2001，John Wiley & Sons，Inc；和Hastie，2001，《The Elements of StatisticalLearning》，Springer，New York；Venables & Ripley，1997，《ModernApplied Statistics with s-plus》，Springer,New York)；支持向量机(参阅如Cristianini和Shawe-Taylor，2000，《An Introduction to SupportVector Machines》，Cambridge University Press，Cambridge，Boser等，1992，″A training algorithm for optimal margin classifiers，《Proceedings of the5^th Annual A CM Workshop on ComputationalLearning Theory》，ACM Press，Pittsburgh，PA，142-152页；Vapnik，1998，《Statistical Learning Theory》，Wiley，New York，引入本文为参考)。

5.10分类器的评估

一旦使用数学模型计算了一个或多个分类器之后，就可以对分类器进行评估，以确定哪些分类器对于所需目的是有效的。例如，就其将训练群中每一个体正确表征为患轻度OA或未患OA的能力对每种分类器进行评估或评分。例如，可以使用以下一种或多种方法评价分类器：交叉验证、留一交叉验证(leave one out cross validation)、n-倍交叉验证、用标准统计学方法和公开的刀切法分析。本文使用的评估分类器的方法称为“评分”。在一些实施方案中，使用训练群进行评分。在另一些实施方案中，使用本文所述的“评分群”进行评分。在一个实施方案中，除了未用于训练群的一个或多个成员以外，评分群还包括训练群中的成员。在一个实施方案中，除了未用于训练群的一个或多个成员以外，评分群还包括训练群的成员。在一些实施方案中，训练群成员中5％或更少、10％或更少、20％或更少、30％或更少、50％或更少或90％或更少与评分群共用。

在一些实施方案中，使用百分比校正预测统计对每个分类器评分。“百分比校正预测”统计假定若预测的p大于或等于0.5，则期望事件会发生，否则不发生。通过给这些概率指定0和1，可以与训练群中样品的值进行比较，以确定训练群中正确采样的百分比。

在一个实施方案中，用于评价分类器正确表征训练群体每一个体的能力的方法是评价分类器的灵敏度(TPF、真正分数)和1-特异性(TNF，真负分数)的方法。例如，在一个优选实施方案中，使用接受器工作特性(receiver operating characteristic)(“ROC”)。ROC提供评价所生成方程的诊断结果灵敏度和特异性的若干参数。例如，在一个特别优选的实施方案中，ROC面积(曲线下面积)用于评价方程。在一个优选实施方案中，优选大于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9的ROC面积。1.0的完美ROC面积分数表示分类器具有100％灵敏度和100％特异性

本领域技术人员会理解，曲线下面积将ROC曲线中含有的二维信息转换为一维信息。在另一些实施方案中，直接使用来自ROC曲线二维形状的信息。例如，ROC曲线还提供关于分类器灵敏度和特异性的信息。在一些实施方案中，基于灵敏度或特异性选择分类器。这可以是重要的评分指示。例如，在将个体误诊为患病比将个体误诊为正常更安全的情况下，具有高特异性(即更少的假阴性)的诊断分类器可能是很重要的。因此，在一些实施方案中，可以设置灵敏度或特异性的截止值，并基于剩余的变量对分类器进行分级或评分。在一些实施方案中，使用产生数据的任何已知方法对每个分类器产生ROC曲线。在一些实施方案中，使用微阵列产生数据。在一些实施方案中，使用定量RT-PCR产生数据。

在一些实施方案中，分类器为加权的逻辑回归模型，其特征为多类别对数单位模型。例如，在一些实施方案中，分类器甄别两个不同的性状组。在另一些实施方案中，分类器甄别两个以上的不同性状组。对数单位模型包括多类别对数单位模型，其描述于Agresti，《AnIntroduction to Categorical Data Analysis》，John Wiley & Sons，Inc.，1996，New York，第7、8章，其引入本文为参考。表10展示了用于基于对数学模型应用的表达数据形成ROC曲线的数据，所述数学模型使用以下的对数单位：

ln[p/(1-p)]＝α+β₁X₁+β₂X₂+ε.

表10：使用数据组44的对数单位ln[p/(1-p)]＝α+β₁X₁+β₂X，+ε的值

图10中每行对应于评分群中不同的样本。左侧栏代表采样的分类器的对数单位结果。表10中的样本通过左侧栏中列出的对数单位进行分级。右侧栏中说明了回归方程考虑的性状是否存在。表10可用于计算ROC曲线，其中认为表10中的每一行为截止阈值，以计算ROC曲线数据点。接着可以计算ROC曲线下的面积以评估分类器的预期品质。

5.11本发明生物标志物的产物

本领域技术人员会理解，鉴定在轻度OA与非OA之间差异表达的一种或多种生物标志物组合使得可以使用反映所鉴定组合中生物标志物(基因)产物表达的数据对测试个体进行轻度OA诊断。

每种本发明生物标志物的产物包括RNA和蛋白质。本发明生物标志物的RNA产物为本发明生物标志物的转录产物，包括hnRNA、mRNA和一种或多种mRNA剪接变体的群体。为了实施本发明，测量本发明生物标志物一种或多种RNA产物群可用于诊断目的。更具体地，本文包括测量在轻度OA和非OA之间差异表达的生物标志物RNA产物群。

在本发明的一个实施方案中，测量的本发明生物标志物RNA产物为RNA产物群，包括hnRNA、mRNA和所有的mRNA剪接变体。在另一实施方案中，测量的本发明生物标志物RNA产物为mRNA群。在本发明的另一实施方案中，测量的本发明生物标志物RNA产物为mRNA群，其在血或在软骨细胞或滑液中表达。在本发明的另一实施方案中，测量的本发明生物标志物RNA产物为一种或多种mRNA的剪接变体群。在本发明的另一实施方案中，测量的本发明生物标志物RNA产物为一种或多种mRNA的剪接变体群，其在血或在软骨细胞或滑液中表达。在本发明的另一实施方案中，本发明生物标志物的RNA产物为表3和表5中列出的RNA产物。

本发明生物标志物的蛋白质产物也包括在本发明范围内，包括本发明生物标志物产生的完整蛋白质产物群。本领域技术人员会理解，本发明生物标志物产生的完整蛋白质产物群包括蛋白质、剪接mRNA变体产生的蛋白质变体和翻译后修饰的蛋白质。在一个实施方案中，本发明生物标志物的蛋白质产物为对应于表1和表4中标识的locuslink(基因ID)的所有蛋白质。在本发明的另一实施方案中，测量的本发明生物标志物的蛋白质产物为在血中表达的对应于表1和表4中标识的locus link(基因ID)的蛋白质。在本发明的另一实施方案中，测量的本发明生物标志物的蛋白质产物为表3和表5中列出的产物。为了实施本发明，测量本发明生物标志物一种或多种蛋白质产物群可用于诊断目的。更具体地，测量在轻度OA和非OA之间差异表达的生物标志物蛋白质产物群可用于诊断目的，并包括在本文中。

在本发明的另一实施方案中，测量的本发明生物标志物的蛋白质产物为翻译自本发明生物标志物的RNA产物的蛋白质产物群。在另一实施方案中，本发明生物标志物的蛋白质产物为在血和/或软骨细胞和/或滑液中表达的蛋白质产物。在本发明的另一实施方案中，任何一种或多种本发明生物标志物的蛋白质产物为翻译自任何一种或多种mRNA剪接变体的任何一种或多种蛋白质产物。在本发明的另一实施方案中，本发明生物标志物的蛋白质产物为翻译自任何一种或多种mRNA剪接变体的任何一种或多种蛋白质产物，所述mRNA剪接变体在血和/或软骨细胞和/或滑液中表达。

5.12所鉴定的组合用于诊断轻度OA的用途

如本文所述，使用对应于测试生物标志物组合中每种生物标志物表达水平的数据应用数学模型(如逻辑回归等)产生了分类器。分类器是将代表测试生物标志物组合中每种生物标志物的数据转换为个体患轻度OA或未患OA的诊断决定的数学函数。可以使用本文所述的方法，通过提供输入分类器的测试个体的数据而产生诊断决定来对分类器评分，以确定分类器正确判断(即诊断)测试群和/或评分群中个体患轻度OA还是未患OA的能力。例如，在使用逻辑回归开发分类器时，该分类器取下式：

Y＝α+β₁X₁+β₂X₂+…+β_kX_k+ε

其中方程中X1、X2…Xk表示测量值，其代表用于产生分类器的组合中k种选定生物标志物在目标组织中基因产物的水平。因此，为了诊断测试个体，将方程中每种生物标志物的测量值输入，Y值决定了所述测试个体的诊断。

鉴定出的组合还可独立于分类器使用。例如，如果选择使用三种生物标志物的分类器(如ROC曲线下面积分数为0.9，显示高灵敏度和高特异性)，则可以测量测试个体中所述三种生物标志物中每一种的产物丰度，并将三种生物标志物中每一种的丰度与来自患轻度OA对照群的一个或多个个体和/或来自未患OA个体对照群的一个或多个个体进行比较，从而确定测试个体的表达模式与患轻度OA的对照更相似，还是与未患OA的对照更相似。在一个优选的实施方案中，可以使用产生的分类器以诊断个体，例如通过测量输入分类器的测试个体中鉴定的本发明生物标志物RNA和/或蛋白质产物的表达水平。在一个实施方案中，可以使用相同的方法产生用于产生数学模型的表达数据，所述数学模型用于诊断测试个体。

5.13鉴定出的组合用于监测OA消退的用途

本发明教导了鉴定有用的生物标志物组合以及这些组合用于诊断个体具有轻度OA还是不具有OA的目的的分类器的能力。本领域技术人员会理解，诊断轻度OA和非OA的组合与分类器也可用于确定个体(例如应答于治疗)就其OA严重性而言是否有发展或消退。例如，可以在治疗前使用一种或多种鉴定出的组合诊断个体为患轻度OA。在治疗之后，可以再次测试个体，以确定所述个体是否仍患轻度OA。在个体不再被鉴定为治疗前的阶段的情况下，这本质上提示了治疗是有效的。此外，治疗可能引起OA阶段的消退，从而该个体现在将诊断为未患OA。这样，也可以使用所鉴定出的一种或多种特异性诊断OA阶段的组合，以监测OA应答于治疗的消退。

5.14用于测量本发明生物标志物产物的多核苷酸

作为测量本发明生物标志物RNA产物表达的手段，可以使用本领域技术人员会理解的以下一种或多种与一种或多种方法的组合，以测量本发明样品中的RNA表达：与一种或多种本发明生物标志物的RNA产物特异性杂交的寡核苷酸、cDNA、DNA、RNA、PCR产物、合成DNA、合成RNA或其他天然存在的修饰核苷酸的组合。在另一具体实施方案中，使用与一种或多种本发明生物标志物的RNA产物选择性杂交的寡核苷酸、cDNA、DNA、RNA、PCR产物、合成DNA、合成RNA或其他天然存在的修饰核苷酸寡核苷酸的组合。在一个优选的实施方案中，使用与一种或多种本发明生物标志物的RNA产物选择性且特异性杂交的寡核苷酸、cDNA、DNA、RNA、PCR产物、合成DNA、合成RNA或其他天然存在的修饰核苷酸寡核苷酸的组合。

5.15测量本发明生物标志物RNA产物的技术

阵列杂交

在本发明的一个实施方案中，用于测量本发明RNA产物的多核苷酸可以用作与支持物稳定结合的核酸成员，以包含根据本发明一个方面的阵列。核酸成员的长度范围可以从8至1000个核苷酸，并可以进行选择以对本发明生物标志物的RNA产物具有特异性。在一个实施方案中，这些成员对本发明生物标志物的RNA产物具有特异性和/或选择性。在另一实施方案中，这些成员对本发明生物标志物的mRNA产物具有特异性和/或选择性。在另一实施方案中，这些成员对本发明生物标志物mRNA产物的所有变体具有特异性和/或选择性。在另一实施方案中，这些成员对本发明生物标志物mRNA产物的一种或多种变体具有特异性和/或选择性。所述核酸成员可以为单链或双链和/或可以为寡核苷酸或扩增自cDNA的PCR片段。寡核苷酸的长度优选为约20-30个核苷酸。EST的长度优选为100-600个核苷酸。本领域技术人员会理解，可以使用本发明生物标志物的部分表达区作为阵列上的探针。更具体地，可以使用与本发明基因互补的多核苷酸和/或来源于本发明基因的cDNA或EST。在本发明的一些实施方案中，可以将能与本发明生物标志物RNA产物特异性和/或选择性杂交的多核苷酸点样在阵列上用于本发明。就基于寡核苷酸的阵列而言，可用作探针的对应于目的基因的寡核苷酸的选择为本领域所熟知。更具体地，重要的是选择允许与靶核酸杂交的区域。诸如寡核苷酸的Tm、GC百分比含量、二级结构程度和核酸长度的因素均为重要的因素。参阅如美国专利No.6,551,784。在一个实施方案中，所述阵列由长度为10-1000个核苷酸之间的序列组成，所述序列能与表1和/或表4公开的每种本发明生物标志物的一种或多种产物杂交，包括表3和/或表5指出的具体转录物。

与本发明阵列杂交并进行分析的靶核酸样品优选来自人软骨、血或滑液。该方法的限制因素在于用作靶核酸样品的RNA可用量。优选地，获得至少1微克总RNA用于本发明。更少的RNA量可以与PCR和针对mRNA亚类型的引物(如多聚T寡核苷酸)组合使用。

核酸阵列的构建

在所述方法中，与支持物的表面稳定结合的核酸成员阵列与包含靶核酸的样品在足以产生互补核酸成员/靶复合物杂交模式的杂交条件下接触，其中，阵列中独特位置上的一个或多个互补核酸成员特异性地与靶核酸杂交。参考核酸成员在阵列上的位置可以确定杂交的靶核酸身份。

可以使用已确立的技术如聚合酶链式反应(PCR)和逆转录(RT)产生核酸成员。这些方法与本领域目前已知的方法相似(参阅如《PCR Strategies》，Michael A.Innis(编辑)等(1995)和《PCR：Introduction to Biotechniques Series》，C.R.Newton，A.Graham(1997))。使用本领域熟知的技术(如柱纯化或醇沉淀)纯化扩增的核酸。当核酸经分离而基本不含引物以及合成目的核酸中产生的不完全产物时，认为核酸是纯化的。优选地，纯化的核酸优选还基本不含可能阻碍或掩盖分子的特异性结合活性的污染物。

根据本发明的一个方面，阵列以超过20种不同核酸/cm²的密度包含附着在支持物表面上的多种核酸，其中每种核酸附着在支持物表面上不相同的预选区域内(如微阵列)。阵列上每种结合的样品包含身份已知、通常序列已知的核酸组合物，如下文更详细的描述。任何可以想到的衬底均可用于本发明。

在一个实施方案中，附着在支持物表面的核酸为DNA。在一个优选实施方案中，附着在支持物表面的核酸为cDNA或RNA。在另一优选实施方案中，附着在支持物表面的核酸为通过聚合酶链式反应(PCR)合成的cDNA。优选地，本发明阵列中核酸成员的长度为至少10、25或50个核苷酸。在一个实施方案中，核酸成员的长度为至少150个核苷酸。优选地，核酸成员的长度小于1000个核苷酸。更优选核酸成员的长度小于500个核苷酸。

在本发明的阵列中，核酸组合物与支持物表面稳定结合，其中支持物可以是柔性或刚性固体支持物。“稳定结合”指每个核酸成员在杂交和洗涤条件下维持在相对于固相支持物的独特位置上。这样，样品共价或非共价地与支持物表面稳定结合。非共价结合的实例包括非特异性吸附、基于静电相互作用(如离子对相互作用)的结合、疏水相互作用、氢键相互作用、通过共价附着在支持物表面的特异性结合对成员而特异性结合等。共价结合的实例包括核酸与刚性支持物表面上的官能团(如-OH)形成的共价键，其中官能团可以是天然存在的或作为引入连接基团的成员而存在，如下文更详细的描述。

每种组合物中存在的核酸量将足以在使用阵列进行的测定中提供靶核酸序列的充分杂交和检测。一般而言，与阵列的固相支持物稳定结合的每种核酸成员的量为至少约0.001ng，优选至少约0.02ng，更优选至少约0.05ng，其中所述量可以高达1000ng或更高，但通常不超过约20ng。优选将对应于单个基因的多个样品点样到阵列上，以保证统计学显著的结果。当在包含大致圆形的点中将核酸成员“点样”到固体支持物上时，“点”的直径一般约10至5,000μm，通常约20至2,000μm，更通常约100-200μm。

阵列上可以存在对照核酸成员，包括含有与基因组DNA、管家基因、载体序列、植物核酸序列、阴性和阳性对照基因等相对应的寡核苷酸或核酸的核酸成员。对照核酸成员是校准或对照基因，其功能不是显示特定的“关键”目的基因是否表达，而是提供其它有用的信息，如表达的背景或基础水平。

将其它对照核酸点样在阵列上并用作靶表达对照核酸和错配对照核酸，以监测与样品中探针所针对的靶标以外其它核酸的非特异性结合或交叉杂交。因此，错配探针指示杂交是否为特异性。例如，如果存在靶标，则完全匹配的探针应该相应地比错配探针更亮。此外，如果存在全部对照错配，则错配探针用于检测突变。

衬底

本发明的阵列包含衬底，所述衬底足以在使用阵列的测定条件下(特别是在高通量处理条件下)为其上存在的结合核酸提供物理支持和结构。

衬底可以是生物的、非生物的、有机的、无机的或其任何组合，以颗粒、链、沉淀物、凝胶、薄板(sheet)、管、球、珠、容器、毛细管、垫、片、膜、板、载玻片、芯片等存在。衬底可以为任何方便的形状，如圆盘、方形、球形、圆形等。衬底优选是平的或二维的，但可以采取多种备选面构型。衬底可以是聚合Langmuir Blodgett膜、功能化玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO₂、SIN₄、改性硅或多种凝胶或聚合物中的任一种，所述聚合物如聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯或其组合。通过阅读本文的公开内容，其它衬底材料对于本领域技术人员将是显而易见的。

在一个优选的实施方案中，衬底为平玻璃或单晶硅。根据一些实施方案，使用熟知的技术蚀刻衬底表面以提供期望的表面特征。例如，通过形成沟、v型槽、台地结构等可以将合成区更紧密地置于入射光的焦点内，具有反射“镜”结构以使收集自荧光源的光最大化等。

衬底表面通常(尽管并不总是)由与衬底相同的材料组成。作为替代，表面可以由多种材料中的任一种组成，例如聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或硅基材料、碳、金属、无机玻璃、膜或上述衬底材料中的任一种。在一些实施方案中，表面可提供牢固附着在衬底表面上的受束缚结合成员的用途。表面优选含有反应基团，所述反应基团为羧基、氨基、羟基等。最优选表面在光学上是透明的，并且具有表面Si--OH功能性，例如见于二氧化硅表面。

能够理解，尽管接头分子不是本发明的必需元件，但衬底表面优选具有接头分子层。接头分子优选足够长，以允许衬底上的本发明核酸与其它核酸分子杂交并与暴露于衬底的分子自由发生相互作用。

衬底经常为硅或玻璃表面、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、带电膜如尼龙66或硝酸纤维素或其组合。在一个优选的实施方案中，支持物为玻璃。优选衬底的至少一个表面是基本平的。支持物表面优选含有反应基团，包括但不限于羧基、氨基、羟基、巯基等。在一个实施方案中，表面在光学上是透明的。在一个优选实施方案中，衬底是聚赖氨酸包被的载玻片或γ-氨基丙基硅烷包被的Corning Microarray Technology-GAPS或CMT-GAP2包被的载玻片。

可以附着核酸成员的任何支持物均可用于本发明。合适的支持物材料的实例包括但不限于硅酸盐如玻璃和硅胶、纤维素和硝酸纤维素纸、尼龙、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、乳胶、橡胶和氟碳树脂如TEFLON^TM。

支持材料可以各种形状使用，包括但不限于载玻片和珠。载玻片提供若干功能优势，因此是优选的支持物形式。由于其表面是平的，因此使用载玻片使探针和杂交试剂最少。载玻片还使试剂的靶向应用成为可能，并且易于保持在恒定温度、易于洗涤并且便于直接观察固定在支持物上的RNA和/或DNA。使用载玻片也有利于除去固定在支持物上的RNA和/或DNA。

选作支持物的具体材料不是本发明的关键，只要其提供所述功能。正常情况下，制造或使用本发明的人将基于成本经济性和可用性、最终产品的预期应用需求和整体制造工艺的需要而选择最佳的市售材料。

点样方法

在一个方面中，本发明提供将阵列中包含的每种核酸成员点样在支持物上的阵列。

优选按以下进行点样。与扩增相同的96孔管中将cDNA克隆的PCR产物(～40μl)以4μl(1/10体积)3M乙酸钠(pH5.2)和100μl(2.5倍体积)乙醇沉淀，并在-20℃保存过夜，所述cDNA克隆来自骨关节炎、胎儿或正常软骨的cDNA文库。然后在4℃以3,300rpm将其离心1小时。所得沉淀用50μl冰冷的70％乙醇洗涤，接着再离心30分钟。其后晾干沉淀并完全重悬于20μl3×SSC或50％二甲基亚砜(DMSO)中过夜。然后用机器人GMS417或427阵列仪(Affymetrix，Ca)将样品单次或一式二份点样在载玻片上。

微阵列上点的边界可以用钻石刻刀作标记(因为在后处理以后斑点不可见)。将载片悬于温的无颗粒ddH₂O皿中约1分钟(点将轻微溶胀但不会互相接触)以再水化阵列，在70-80℃的倒置加热块上快速干燥3秒。然后在杂交之前将核酸紫外交联到载玻片上(Stratagene，Stratalinker，65mJ-设置显示为“650”，表示650×100μJ)或者在80℃烘2-4小时。将阵列置于片架上。准备空片室并充入以下溶液：溶于189ml1-甲基-2-吡咯烷酮中的3.0g琥珀酸酐(Aldrich)(迅速加入试剂很关键)；最后一片琥珀酸酐溶解以后立即混入21.0ml0.2M硼酸钠并将溶液倒入片室内。迅速且均匀地将片架置入片室并剧烈地来回摇动几秒，确保载玻片不离开溶液，然后在定轨摇床上混合15-20分钟。然后将片架轻轻置入95℃ddH2O中2分钟，随后投入95％乙醇中5次。将过量乙醇滴到纸巾上，晾干载片。室温下将阵列保存在片盒中待用。

可以使用多种方法将本发明的核酸成员附着在衬底上(称为“点样”的过程)。例如，使用如教导聚合物附着法的U.S.专利No.5,807,522中的技术，所述专利引入本文为参考。

或者，可以使用本领域已知的接触印刷技术进行点样。

微阵列的用途

本发明的核酸阵列可用于高通量技术，所述高通量技术能测定包含一种或多种靶核酸序列的样品中的大量核酸。本发明的阵列可用于多种应用，包括基因表达分析、骨关节炎的诊断和骨关节炎的预后、监测患者对治疗的反应、药物筛选等。

所述阵列还可用于药物发现和研究的大规模表达筛选，如特定活性剂对本发明基因表达模式的影响，其中这些信息用于揭示药物效力和毒性、环境监测、疾病研究等。

可以使用这些序列中至少一种、更优选其组合来产生阵列，作为诊断轻度骨关节炎的手段或用于监测疗效的目的。

标准样品的选择是本领域技术人员完全了解的，可包括与分离自一个或多个正常个体的RNA互补的样品，其中正常个体为未患骨关节炎的个体。对于监测疗效或鉴定阶段特异性骨关节炎(包括轻度OA)的情况，本领域技术人员会理解，对照将包括来自患多种程度骨关节炎的人和/或对治疗有反应的人的样品。标准样品还将包括与分离自软骨细胞或血、滑液的RNA互补的样品。

靶标的制备

用于本发明阵列的靶标优选来自人软骨、血或滑液。

靶核酸能够通过一种或多种类型的化学键(通常通过互补碱基配对、通常通过氢键的形成)与序列互补的核酸探针或核酸成员结合。

本文使用的“来自mRNA转录物的核酸”或“对应于mRNA的核酸”指在其合成中最终使用mRNA转录物或其子序列作为模板的核酸。因此，由mRNA逆转录的cDNA、由该cDNA转录的RNA、由该cDNA扩增的DNA、由该扩增DNA转录的RNA等都来自或对应于所述mRNA转录物，并且检测到这些衍生或对应的产物可以指示样品中初始转录物的存在和/或与其丰度成比例。因此，合适的核酸样品包括但不限于基因的mRNA转录物、从该mRNA逆转录的cDNA、从该cDNA转录的cRNA、从基因扩增的DNA、从扩增DNA转录的RNA等。本文使用的核酸靶优选来自软骨、血或滑液。核酸可以为单链或双链的DNA、RNA或DNA-RNA杂合体，它们使用本领域已知方法如逆转录或PCR从人软骨、血或滑液mRNA提取物合成。

在最简单的实施方案中，这种核酸靶包含分离自软骨、血或滑液样品的总mRNA或对应于mRNA的核酸样品(如cDNA)。在另一实施方案中，使用例如酸性胍-酚-氯仿提取法从给定样品分离总mRNA，并用oligo dT柱层析或用(dT)n磁珠分离polyA+mRNA(参阅如Sambrook等，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(第二版)，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)，或《CurrentProtocols in Molecular Biology》，F.Ausubel等编辑GreenePublishing and Wiley-Interscience，New York(1987))。在一个优选的实施方案中，用

试剂(GIBCO/BRL，Invitrogen LifeTechnologies，目录号15596)提取总RNA。用260/280nm吸光度和琼脂糖凝胶电泳随后紫外光检查评价RNA纯度和完整性。

在一些实施方案中，期望在杂交之前扩增靶核酸样品，例如使用滑液时。本领域技术人员会了解，无论使用何种扩增方法，如果期望定量结果，则必须小心使用维持或控制所扩增核酸相对频率的方法。“定量”扩增的方法为本领域技术人员所熟知。例如定量PCR涉及用相同引物同时共扩增已知量的对照序列。这提供了可用于校准PCR反应的内标。高密度阵列因而可以包括对内标具有特异性的引物，以定量所扩增核酸。《PCR Protocols，A Guide to Methods andApplications》，Innis等，Academic Press，Inc.N.Y.，(1990)中提供了定量PCR的详细操作。

其它合适的扩增方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)(Innis等，《PCR Protocols.A Guide to Methods and Application》.Academic Press，Inc.San Diego，(1990))、连接酶链式反应(LCR)(见Wu和Wallace，1989，Genomics，4：560；Landegren等，1988，Science，241：1077和Barringer等，1990，Gene，89：117)、转录扩增(Kwoh等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：1173)和自持续序列复制(Guatelli等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：1874)。

在一个特别优选的实施方案中，使用逆转录酶和引物逆转录靶核酸样品mRNA，以提供单链DNA模板，所述引物由oligo dT与编码噬菌体T7启动子的序列组成。第二条DNA链用DNA聚合酶聚合。合成双链cDNA以后，加入T7RNA聚合酶，从cDNA模板转录RNA。从每种单个cDNA模板的连续转录循环得到经扩增的RNA。体外转录的方法为本领域技术人员所熟知(参阅如Sambrook，同上)，这种具体的方法详细描述于Van Gelder等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：1663-1667，其证明根据这种方法的体外扩增保持了各种RNA转录物的相对频率。此外，Eberwine等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：3010-3014提供了使用经体外转录的两轮扩增以实现超过起始材料10⁶倍扩增的操作，从而即使生物样品有限时也允许进行表达监测。

标记靶标或核酸探针

可以标记靶标或探针。

本发明可以使用附着或整合在分子中的任何可分析检测的标记物。可分析检测的标记物指可以分析检测和定量的任何分子、基团或原子。

适用于本发明的检测标记包括可以通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光或化学手段检测的任何组分。可用于本发明的标记包括用经标记的链霉抗生物素蛋白缀合物染色的生物素、磁珠(如Dynabeads^TM)、荧光染料(如荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记物(如³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它常用于ELISA的酶)和发色标记如胶体金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。教导这些标记物用途的专利包括美国专利No.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241，均以其整体引入本文为参考。

检测这些标记的手段为本领域技术人员所熟知。因此，例如，可以用照相胶片或闪烁计数器检测放射性标记，可以用检测发射光的光检测器检测荧光标记物。酶标记通常通过向酶提供底物并检测酶作用于底物而生成的反应产物来进行检测，发色标记通过简单地观察有色标记来检测。

可以通过任何本领域技术人员熟知的大量手段掺入标记。然而，在一个优选实施方案中，在核酸样品制备的扩增步骤中同时掺入标记物。因此，例如，使用标记引物或标记核苷酸的聚合酶链式反应(PCR)将提供标记的扩增产物。在一个优选实施方案中，使用标记核苷酸(如荧光素标记的UTP和/或CTP)的上述转录扩增将标记物掺入转录的核酸中。

或者，可以将标记直接加入起始核酸样品(如mRNA、polyAmRNA、cDNA等)或在完成扩增以后加入扩增产物中。将标记连接到核酸上的手段为本领域技术人员所熟知，包括如缺口平移或通过激酶处理核酸、其后附着(连接)核酸接头、将样品核酸连接到标记(如荧光团)上进行末端标记(如用标记RNA)。

在一个优选实施方案中，通过花青染料如Cy-3/Cy-5dUTP、Cy-3/Cy-5dCTP(Amersham Pharmacia)或alexa染料(Khan，等，1998，Cancer Res.58：5009-5013)进行荧光修饰。

在一个优选实施方案中，使用产生不同检测信号的不同荧光染料标记用于比较的两种靶核酸样品，例如，由正常软骨产生的靶标用Cy5标记，由轻度骨关节炎软骨产生的靶标用Cy3标记。不同标记的靶样品同时杂交到同一微阵列上。在一个优选实施方案中，使用本领域熟知的方法纯化标记靶标，例如通过乙醇纯化或柱纯化。

在一个优选实施方案中，核酸样品将包括一种或多种对照分子，它们与微阵列上的对照探针杂交以使阵列产生的信号标准化。优选地，标记的标准化靶标是与上述点样到微阵列上的对照寡核苷酸完全互补的核酸序列。杂交以后得自标准化对照的信号提供杂交条件、标记强度、“读出”效率以及可能使完全杂交信号在阵列之间变化的其它因素的变异的对照。在一个优选的实施方案中，将阵列中所有其它探针读出的信号(如荧光强度)除以从对照探针读出的信号(如荧光强度)，从而使测定标准化。

对优选的标准化核酸样品进行选择，以反映样品中存在的其它核酸样品的平均长度，然而，也可以对其进行选择以覆盖一个长度范围。也可以对标准化对照进行选择，以反映阵列中其它探针的(平均)碱基组成，然而在一个优选实施方案中，仅使用一种或少数几种标准化探针，并且对其进行选择以使其良好杂交(即没有二级结构并且不自杂交)并且不与阵列上的任何靶分子匹配。

标准化探针位于阵列中任意位置，或者阵列上的多个位置以对杂交效率的空间变异进行对照。在一个优选实施方案中，标准化对照位于阵列的角落或边缘以及中间。

杂交条件

核酸杂交涉及在一定条件下提供变性的探针或靶核酸成员以及靶核酸，在所述条件下探针或靶核酸成员及其互补靶标能通过互补碱基配对形成稳定的杂交双链体。接着洗去未形成杂交双链体的核酸，留下待检测的已杂交核酸，所述检测通常通过检测附着的检测标记进行。普遍公认，增加温度或降低含核酸的缓冲液中的盐浓度可以使核酸变性。在低严谨条件(如低温和/或高盐)下，甚至在退火序列不完全互补时也将形成杂交双链体(如DNA：DNA、DNA：RNA或RNA：RNA)。因此在较低严谨度下杂交特异性降低。相反，在较高严谨度(如较高温度或较低盐)时成功的杂交要求较少错配。

本发明提供的杂交条件包括Dig杂交混合物(Boehringer)或基于甲酰胺的杂交溶液，例如Ausubel等，同上和Sambrook等，同上所述。

优化杂交条件的方法为本领域技术人员所熟知(参阅如《Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology》，第24卷：Hybridization With Nucleic acid Probes，P.Tijssen等，Elsevier，N.Y.，(1993))。

杂交后，方便地通过洗涤从支持物表面除去未杂交标记或未标记核酸，从而在衬底表面上产生靶核酸的杂交模式。多种洗涤液均为本领域技术人员已知，并且可以使用。标记的已杂交寡核苷酸和/或核酸所得到的杂交模式可以用多种方式观察或检测，基于测试核酸的特定标记物选择具体的检测方式，其中代表性检测手段包括闪烁计数、放射自显影、荧光测定、量热测定、发光测定等。

图像获取和数据分析

在杂交和如上述的任何洗涤步骤和/或后续处理之后检测得到的杂交模式。检测或观察杂交模式时，标记物的强度或信号值将不仅进行检测，而且进行定量，这意味着将测量每个杂交点的信号并与对应于已知量末端标记靶核酸所发出信号的单位值进行比较，以获得杂交模式中与阵列上特定点杂交的每种末端标记靶标的拷贝数的计数或绝对值。

从与阵列杂交所收集数据的分析方法为本领域所熟知。例如，当杂交检测涉及荧光标记时，数据分析可以包括下列步骤：确定荧光强度作为收集数据的衬底(substrate)位置的函数；去除异常值，即偏离预定统计分布的数据；由剩余数据计算测试核酸的相对结合亲和力。以图像显示所得数据，其中每个区域中的强度根据结合的寡核苷酸和/或核酸与测试核酸之间的结合亲和力而变化。

使用以下检测方案同时分析待比较的两种软骨样品，其中每种样品用不同的荧光染料标记。

针对第一种荧光颜色扫描微阵列的每个元素。每个阵列元素处的荧光强度与样品中该基因的表达水平成比例。

对第二种荧光标记重复扫描操作。两种荧光强度的比例提供两种组织样品中相对基因表达水平的高精度的定量测定。

在一个优选实施方案中，由惯用的共聚焦显微镜获取的图像确定固化核酸序列的荧光强度，所述显微镜装备激光激发源和适用于Cy3和Cy5荧光的干涉滤光器。在分辨率225μm²/像素和65,536灰阶下对每种荧光分别进行扫描。进行图像分割以识别杂交区域，标准化两个荧光图像之间的强度，并计算每个靶标经标准化的平均荧光值，如文献所述(Khan等，1998，Cancer Res.58：5009-5013.Chen，等，1997，Biomed.Optics2：364-374)。图像之间的标准化用于调整两种不同荧光的不同标记和检测效率。这通过将点在阵列上的一组内对照基因的信号强度比平衡为1的值而实现。

在另一个优选实施方案中，在Cy3和Cy5通道中扫描阵列并保存为独立的16位TIFF图像。引入图像并使用软件进行分析，所述软件包括网格处理，以从阵列上每个点获取杂交强度数据。收集每个点的荧光强度和减去背景后的杂交强度，并计算测量的Cy5/Cy3平均强度比。使用线性回归方法进行标准化并假设测量的Cy5/Cy3强度的散点图的斜率应为1。计算比率的平均值并用于重新衡量数据并调整斜率为1。不等于1的表达比率用作差异基因表达的标志。

在一个特别优选的实施方案中，当期望定量样品中一种或多种核酸序列的转录水平(及相应表达)时，核酸样品中基因的mRNA转录物的浓度或来源于mRNA转录物的核酸的浓度与该基因的转录水平(及相应表达水平)成比例。相似地，优选杂交信号强度与杂交核酸的量成比例。尽管优选相对严谨的比例(如转录速率加倍导致样品核酸库中mRNA转录物加倍和杂交信号加倍)，技术人员会了解，比例可以更宽松甚至是非线性的，但仍然提供有意义的结果。因此，例如，样品mRNA浓度的5倍差异导致杂交强度的3-到6-倍差异的分析对于多数目的是足够的。需要更精确定量时，使用适当对照以校正本文所述的样品制备和杂交中引入的变异。此外，根据本领域技术人员熟知的方法使用“标准”mRNA样品的连续稀释准备标准曲线。当然，如果需要简单地检测转录物的存在与否，则不需要精细的对照或校正。

例如，如果阵列上核酸成员在杂交以后未被标记，这表示包含该核酸成员的基因任一样品中均不表达。如果核酸成员具有单色标记，这表示标记基因仅在一种样品中表达。组成阵列的核酸成员被双色标记表示该基因在两种样品中都表达。甚至检测到每个细胞仅表达一个的基因(1/100,000灵敏度)。待比较的两种样品中表达强度的差异指示差异表达，两种样品的强度比不等于1.0，优选小于0.7或大于1.2，更优选小于0.5或大于1.5。

RT-PCR

在本发明的一个方面中，可以通过使用逆转录(RT)与聚合酶链式反应(PCR)组合从样品中扩增该生物标志物的RNA产物来测定本发明生物标志物RNA产物的表达水平。根据本发明的一个实施方案，如本领域技术人员所知，RT可以是定量的。

使用来自样品的总RNA或mRNA作为模板，使用对本发明生物标志物的转录部分具有特异性的引物启动逆转录。将RNA逆转录为cDNA的方法是熟知的，描述于Sambrook等，1989，同上。可以使用本领域熟知的标准方法利用商业软件(如Primer Designer1.0，Scientific Software等)进行引物设计。

包括在本发明中的用于设计和选择引物的方案的一个实施方案描述了引物设计中涉及的原则和步骤，所述引物用于使用SYBR-Green测定进行的实时PCR。优选地，该方案使用国家生物技术信息中心(NCBI)的搜索引擎并使用PrimerQuest引物设计软件。PrimerQuest是Integrated DNA Technologies，Inc.(IDT)开发的基于网页的软件。该软件基于Whitehead Institute for Biomedical Research开发的Primer3。

设计引物的优选指导包括在本发明中，它们是产物或扩增子的长度优选为100-150个碱基；最佳Tm优选为60℃，也可以接受58-62℃的优选范围；以及最优选的GC含量为50％，也可以接受45-55％的优选范围。优选避免每种引物3’末端与其本身或其他引物互补的三碱基串，以减少“引物-引物”的形成。还优选避免引物序列内以及引物对之间的互补序列。优选地，避免3’末端连续3个或更多的G或C以及多于3个碱基的单碱基重复。优选避免富含G/C和A/T区域分布的不平衡，并且优选引物的3’末端为G或C。优选引物的3’末端不为T，因为3’末端为T的引物对错配更为宽容。优选避免错配，特别是是3’末端；优选在3’末端放置至少7个独特碱基。优选避免基因组扩增，这样就优选应使任一种引物跨越内含子。优选地，应将引物设计为使引物的一半或至少7个核苷酸与一个外显子的3’末端杂交，剩余部分与相邻外显子的5’末端杂交。

可以使用引物软件程序辅助设计和选择本发明包括的引物，例如在以下网址链接提供的“Primer Quest软件”：biotools.idtdna.com/primerquest/。

在搜索和更新来自人类基因组数据库的序列信息以用于生物标志物引物设计时，可以使用以下网址链接：1)NCBI LocusLink主页：www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/，2)系综人类基因组浏览器：www.ensembl.org/Homo_sapiens，其中优选使用适当的生物标志物信息如基因或序列描述、登录号或序列ID、基因名、RefSeq#和/或UniGene#。

一旦获得用于产生引物的正确靶DNA序列之后，优选由目的基因的LocusLink链接或由系综基因浏览器标出外显子-内含子边界。优化引物设计的优选手段是使用PrimerQuest软件中的BASIC、STANDARD和ADVACE三个选项。

首先优选使用PrimerQuest软件的BASIC功能，在序列信息下，将引物名输入[Name]框，并将靶序列剪切复制到[Sequence]框，选择使用实时PCR的参数设置设计PCR引物。在标准序列设计中，优选选择50作为返回的引物组数目，以及选择人作为错误引发文库使用。优选在标准引物设计的高级功能中输入以下选择：最佳引物大小：20(nt)、最佳引物Tm：60(℃)、最佳引物GC％：50(％)、产物大小范围：100-150。此外，在标准功能中，优选可调整以下选项：引物选择、靶标、排除区、纳入区和起始密码子位置。

一旦输入并选择了所需参数，Primer Quest开始搜索可能的引物选择，产生潜在的正向和反向引物的详细描述，包括实际序列、其起始位置、长度、Tm、GC％、产物大小罚分值和预计二级结构的手段——mFold。以下两个标准是最有用的：优选ΔG应该高于-3.0kcal.mol^-1，优选TM应该低于50℃并且不高于55℃。点图更难于解释一些，不过一般而言优选不选择产生在点图中产生长对角线黑点的引物，因为这最可能形成发夹。

优选地，引物应该对靶序列是独特的，并且不与假基因匹配，这可以通过使用[BLAST]检查引物的特异性来确认。优选地，可以使用IDT BioTools提供的Oligo Analyzer3.0检查形成自身二聚体和异源二聚体的可能性。优选地，可以使用IDT BioTools或Primer3提供的信息和指导选择最佳的可能引物对用于本发明生物标志物的研究。在生物标志物研究中优选仅使用产生与预期产物大小匹配的单扩增子的引物，这通过熔链曲线分析和琼脂糖凝胶电泳分离来确定。

以下相关参考文献均引入本文为参考：Dieffenbach，C.W.，Lowe，T.M.J.，Dveksler，G.S.(1995)General Concepts for PCR PrimerDesign.《PCR Primer，A Laboratory Manual》(Dieffenbach，CW和Dveksler，G.S.编辑)Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，133-155，Innis，M.A.和Gelfand，D.H.(1990)Optimization of PCRs.《PCR protocols，A Guide to Methods and Applications》(Innis，M.A.，Gelfand，D.H.，Sninsky，J.J.和White，TJ.编辑)Academic Press，SanDiego，3-12，Sharrocks，A.D.(1994)The design of primers for PCR.《PCR Technology，Current Innovations》(Griffin，H.G.和Griffin，A.M编辑)CRC Press，London，5-11。

其后将逆转录产物用作PCR的模板。

PCR提供了特定核酸序列的快速扩增方法，其中通过使用多个循环的由热稳定DNA依赖性DNA聚合酶催化的DNA复制来扩增目的靶序列。PCR需要存在待扩增的核酸、待扩增序列两侧的两种单链寡核苷酸引物、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲液和盐。

PCR方法为本领域所熟知。如引入本文为参考的Mullis和Faloona，1987，Methods Enzymol.，155：335中所述进行PCR。使用模板DNA(至少1fg；更有效的为1-1000ng)和至少25pmol寡核苷酸引物进行PCR。典型的反应混合物包括：2μlDNA、25pmol寡核苷酸引物、2.5μl 10H PCR缓冲液1(Perkin-Elmer，Foster City，CA)、0.4μl 1.25μM dNTP、0.15μl(或2.5单位)Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer，Foster City，CA)，补充去离子水至总体积25μl。覆盖矿物油并用可编程热循环仪进行PCR。

根据实际需要的严谨度调整PCR循环中每个步骤的长度和温度以及循环数。退火温度和时间均通过引物预期与模板退火的效率和可接受的错配程度确定。优化引物退火条件严谨度的能力在本领域技术人员的知识范围内。使用30℃-72℃之间的退火温度。模板分子的起始变性通常于92℃-99℃之间进行4分钟，其后为20-40个循环，每个循环的组成为：变性(94℃-99℃，15秒-1分钟)、退火(由上述讨论确定的温度；1-2分钟)和延伸(72℃，1分钟)。最后延伸步骤一般在72℃进行4分钟，其后为不确定的4℃步骤(0-24小时)。

性质为定量的QRT-PCR也可用于提供基因表达水平的定量测量。在QRT-PCR中逆转录和PCR可以分两步进行，或者可以同时进行逆转录与PCR的组合。对于这些技术之一有商品试剂盒(如TaqMan(Perkin Elmer，Foster City，CA))提供，其中使用转录物特异性反义探针进行。这种探针对PCR产物(如来自基因的核酸片段)具有特异性，并且在寡核苷酸的5’端复合了猝灭剂和荧光报告探针。将不同的荧光标记物连接到不同报告子上，以允许在一个反应中测定两种产物。当Taq DNA聚合酶被活化时，其通过5’-3’外切核酸酶活性将结合到模板上的探针的荧光报告子切除。无猝灭剂时，报告子发荧光。报告子颜色的改变与每种特异性产物的量成比例并可以用荧光计测定；因此，测定每种颜色的量并定量PCR产物。PCR反应在96孔板中进行，以同时处理和测定来自许多个体的样品。TaqMan***还具有不需要凝胶电泳的优点，并在使用标准曲线时可定量。

用于定量检测PCR产物另一种技术是使用嵌入式染料如市售的QuantiTect SYBR Green PCR(Qiagen，Valencia California)。使用SYBR Green作为荧光标记进行RT-PCR，染料在PCR期间掺入PCR产物并产生与PCR产物量成比例的荧光。

TaqMan和QuantiTect SYBR***均可在RNA逆转录之后使用。可以在与PCR步骤相同的反应混合物中进行逆转录(一步方案)，或者可以在使用PCR的扩增之前先进行逆转录(两步方案)。

此外，定量测量mRNA表达产物的其它***也是已知的，包括Molecular

，它使用含荧光分子和猝灭分子的探针，该探针能形成发夹结构，从而在处于发夹形式时使荧光分子淬灭，而在杂交时荧光增加，给出基因表达的定量测量。

定量测量RNA表达的其它技术包括但不限于聚合酶链式反应、连接酶链式反应、Qbeta复制酶(参阅如国际申请No.PCT/US87/00880)、等温扩增法(参阅如Walker等(1992)PNAS89：382-396)、链置换扩增(SDA)、修复链反应、不对称定量PCR(例如见美国公开No.US200330134307A1)和描述于Fuja等，2004，Journal of Biotechnology108：193-205的多重微球珠测定。

可以通过使用基于转录的扩增***(TAS)从样品扩增RNA来测量基因表达水平，包括核酸序列扩增(NASBA)和3SR。参阅如Kwoh等(1989)PNAS USA86：1173；国际公开No.WO88/10315；和美国专利No.6,329,179。在NASBA中，可以按如下制备用于扩增的核酸：用常规酚/氯仿提取、热变性、裂解缓冲液和小离心柱处理分离DNA和RNA或盐酸胍提取RNA。这些扩增技术涉及使具有靶特异性序列的引物退火。聚合之后，DNA/RNA杂合体用RNase H消化，而双链DNA分子再次热变性。在每种情况下均通过加入第二种靶特异性引物接着聚合将单链DNA制成双链。然后用聚合酶如T7或SP6重复转录双链DNA分子。在等温循环反应中，RNA逆转录成双链DNA，并以聚合酶如T7或SP6转录一次。所得产物(无论是截短的还是完整的)指示靶特异性序列。

可以使用若干技术分离扩增产物。例如，可以使用常规方法通过琼脂糖、琼脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。参阅Sambrook等，1989。也可以根据本发明使用无需电泳而定量检测PCR产物的若干技术(参阅如《PCR Protocols，A Guide to Methodsand Applications》，Innis等，Academic Press，Inc.N.Y.，(1990))。例如，可以使用层析技术进行分离。多种层析均可用于本发明：吸附、分配、离子交换和分子筛、HPLC和很多使用它们的专用技术，包括柱、纸、薄层和气相色谱(Freifelder，《Physical Biochemistry Applications toBiochemistry and Molecular Biology》，第二版，Wm.Freeman and Co.，New York，N.Y.，1982)。

分离方法的另一实例通过用多种类型的小分子配体共价标记用于PCR反应的寡核苷酸引物而实现。在一种这样的分离中，每种寡核苷酸上存在不同的配体。使用特异性结合一种配体的分子(可能为抗体，或者在配体为生物素时可能为链亲合素蛋白)包被板如96孔ELISA板的表面。在这样制备的板表面上应用PCR反应体系时，PCR产物与表面特异性结合。洗涤板以去除未结合试剂以后，加入含有与第一种配体结合的第二种分子的溶液。该第二种分子与某种类型的报告***连接。仅在PCR产物已经产生，其中两种寡核苷酸引物都掺入最终的PCR产物中时，第二种分子才结合到板上。然后用像检测和定量ELISA反应那样使用商品平板读数器来检测和定量PCR产物的量。Raggio Italgene company已经以商品名C-Track开发了如本文所述的ELISA样***。

必须使扩增产物显像以确认目的核酸序列的扩增。一种典型的显像方法涉及用溴化乙锭使凝胶染色并在紫外光下观察。或者，如果扩增产物用放射性或荧光标记的核苷酸进行了整体标记，则分离以后可以使扩增产物对x射线胶片曝光或在适当的激发光谱下显像。

在一个实施方案中，间接实现显像。分离扩增产物以后，使标记的核酸探针与扩增的目的核酸序列接触。探针优选缀合生色团，但也可以经放射性标记。在另一实施方案中，探针缀合到结合伴侣如抗体或生物素上，而结合对的另一成员携带检测基团。

在另一个实施方案中，使用标记探针通过Southern印迹和杂交进行检测。Southern印迹涉及的技术为本领域技术人员所熟知，并且可见于许多分子操作的标准书籍。参阅Sambrook等，1989，同上。简言之，通过凝胶电泳分离扩增产物。然后使凝胶与膜如硝酸纤维素接触，使核酸转移并且非共价结合。随后，将膜与缀合生色团的探针一起孵育，所述探针能与靶扩增产物杂交。通过使膜对x射线胶片曝光或用离子发射检测设备进行检测。

前述的一个实例描述于引入本文为参考的美国专利5,279,721，其中公开了自动电泳和转移核酸的装置和方法。该装置允许无需外部操作凝胶而进行电泳和印迹，理想地适用于实施本发明的方法。

核酸酶保护测定

在本发明的另一实施方案中，可以使用核酸酶保护测定(包括核糖核酸酶保护测定和S1核酸酶测定)检测和定量本发明生物标志物的RNA产物。在核酸酶保护测定中，反义探针(使用如放射性标记或非同位素标记)在溶液中与RNA样品杂交。杂交以后，单链的未杂交探针和RNA被核酸酶降解。用丙烯酰胺凝胶分离剩余的受保护片段。通常溶液杂交比基于膜的杂交更有效，并且它可以适用于高达100μg的样品RNA，而印迹杂交最多为20-30μg。

核糖核酸酶保护测定(最常见的核酸酶保护测定)需要使用RNA探针。寡核苷酸和其它单链DNA探针只能用于含S1核酸酶的测定中。单链的反义探针通常必须与靶RNA完全同源，以防止核酸酶切割探针：靶杂交体。

Northern印迹

根据本领域普通技术人员已知的常规Northern杂交技术，标准Northern印迹分析还可以用于确认RNA转录物大小、鉴定选择性剪接的RNA转录物和本发明生物标志物RNA产物的相对量。在Northern印迹中，首先在变性条件下通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离RNA样品。然后将RNA转移到膜上，交联，并与标记探针杂交。可以使用非同位素或高比活的放射性标记探针，包括随机引发、缺口翻译或PCR产生的DNA探针、体外转录的RNA探针和寡核苷酸。此外，仅具有部分同源性的序列(如来自不同物种的cDNA或可能含有外显子的基因组DNA片段)也可用作探针。含有全长单链DNA或该DNA序列片段的标记探针(如放射性标记的cDNA)的长度可以为至少20、至少30、至少50或至少100个连续核苷酸。可以用本领域技术人员已知的多种不同方法的任一种来标记探针。这些研究中最常用的标记物是放射性元素、酶、暴露于紫外光时发出荧光的化学品等。多种荧光物质是已知的并可以用作标记物。它们包括但不限于荧光素、罗丹明、金胺、德克萨斯红、AMCA蓝和萤光黄。具体的检测物质是山羊中制备并通过异硫氰酸酯缀合了荧光素的抗兔抗体。也可以用放射性元素或酶标记蛋白质。可以用当前可用的任何计数方法检测放射性标记。同位素的非限制性实例包括³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、³⁶Cl、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I和¹⁸⁶Re。同样可以使用酶标记，并可以用当前使用的比色、光谱、荧光光谱、电流定量或气体定量技术的任一种进行检测。通过与桥联分子如碳二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等反应将酶缀合到选定的颗粒上。可以使用本领域技术人员已知的任何酶。这种酶的实例包括但不限于过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加过氧化物酶和碱性磷酸酶。实例参考美国专利No.3,654,090、3,850752和4,016,043，其中公开了备选的标记材料和方法。

5.16测量本发明生物标志物蛋白质产物的技术

蛋白质产物

还可以用标准技术确定样品中存在的目的蛋白质的量。例如可以使用如免疫测定如Western印迹、免疫沉淀之后的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫细胞化学等利用标准技术确定样品中存在的目的蛋白质的量。检测目的蛋白质的优选物质是能结合目的蛋白质的抗体，优选带有检测标记的抗体。

对于这些检测方法，可以使用本领域技术人员熟知的技术便利地分离待分析样品中的蛋白质。蛋白质分离方法例如可以是Harlow和Lane(Harlow，E.和Lane，D.，《Antibodies：A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1988))中描述的方法。

检测目的蛋白质的优选方法涉及通过与蛋白质特异性抗体的相互作用进行检测。例如，可以如本文所述使用针对目的蛋白质的抗体。可以使用本领域技术人员熟知的标准技术产生抗体。关于这些抗体产生技术的更详细讨论参阅如本申请5.19.1节和美国公开No.20040018200中的5.2节，其内容引入本文为参考。简言之，这些抗体可以是多克隆抗体，或更优选是单克隆抗体。例如，可以使用完整抗体或与抗原结合的抗体片段(如Fab或F(ab’)₂)。抗体优选为人抗体或人源化抗体。

例如，可以使用对目的蛋白质具有特异性的抗体或抗体片段定量或定性检测该蛋白质的存在。这可以通过如免疫荧光技术实现。此外，抗体(或其片段)可用于组织学如免疫荧光或免疫电镜分析，以原位检测目的蛋白质。可以通过从患者中取出组织学样品(如活检样品)并对其应用针对蛋白质的标记抗体来实现原位检测。优选通过将标记抗体(或其片段)覆盖到生物样品上来使用抗体(或其片段)。使用这种方法不仅可以确定样品内目的蛋白质的存在，而且还可以确定其分布、其在细胞(如软骨细胞和淋巴细胞)中的存在。可以使用各种公知组织学方法(如染色法)以实现这种原位检测。

目的蛋白质的免疫测定通常包括将生物样品与能识别目的蛋白质的检测标记的抗体一起孵育，并通过多种熟知技术中的任一种检测结合抗体。如下文更详细的讨论，术语“标记”可以指直接标记抗体，例如通过将可检测物质偶联(即物理连接)在抗体上，还可以指通过与直接标记的另一种试剂的反应性间接标记抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的第二抗体来检测第一抗体。

例如，可以使生物样品与相支持物或载体如硝酸纤维素或能固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白质的其它支持物接触并固定在其上。然后可以用适当的缓冲液洗涤支持物，随后用可检测标记的指纹基因特异性抗体处理。接着可以用缓冲液再次洗涤相支持物，以去除未结合抗体。然后可用常规手段检测结合到支持物上的标记物的量。

在蛋白质类物质的上下文中，“相支持物或载体”表示能结合抗原或抗体的任何支持物。熟知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁石。就本发明目的而言，载体的性质可以在一定程度可溶或不可溶。支持物材料可以具有几乎任何可能的构型，只要偶联分子能结合抗原或抗体。因此，支持物构型可以是球形，如珠；或圆柱形，如试管的内表面或棒的外表面。或者，表面可以是平的，如薄片、测试条等。优选的支持物包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员了解很多适用于结合抗体或抗原的其他载体，或者能通过使用常规实验确认它们。

可检测地标记特异性抗体的方式之一是将其与酶连接并用于酶免疫测定(EIA)(Voller，A.，″The Enzyme Linked ImmunosorbentAssay(ELISA)″，1978，Diagnostic Horizons2：1-7，MicrobiologicalAssociates Quarterly Publication，Walkersville，MD)；Voller，A.等，1978，J.Clin.Pathol.31：507-520；Butler，J.E.，1981，Meth.Enzymol.73：482-523；Maggio，E.(编辑)，1980，《Enzyme Immunoassay》，CRCPress，Boca Raton，FL；Ishikawa，E.等，(编辑)，1981，EnzymeImmunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo)。与抗体结合的酶将与适当的底物反应，优选与显色底物反应，以此方式产生通过如光谱、荧光光谱或观察手段检测的化学基团。可用于可检测地标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、三糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。可以使用酶的显色底物通过比色法进行检测。还可以通过将底物酶促反应的程度与相似制备的标准品观察比较来进行检测。

还可以使用多种其它免疫测定的任一种进行检测。例如，通过放射性标记抗体或抗体片段，可以通过使用放射免疫测定(RIA)检测目的蛋白质(参阅如Weintraub，B.，《Principles ofRadioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques》，The Endocrine Society，March，1986，其内容引入本文为参考)。可以通过如使用γ计数器或闪烁计数器或放射自显影的方式检测放射性同位素(如¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H)。

也可以用荧光化合物标记抗体。当荧光标记的抗体暴露于适当波长的光时，可以由荧光检测其存在。最常用的荧光标记化合物为异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。

也可以用发射荧光的金属如¹⁵²Eu或其它镧系元素可检测地标记抗体。可以用金属螯合基团如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)将这些金属连接到抗体上。

还可以通过将抗体偶联到化学发光化合物上来可检测地标记抗体。然后通过检测化学反应期间产生发光的存在来确定化学发光标记抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例为鲁米诺、异鲁米诺、theromatic acridinium ester、咪唑、acridinium盐和草酸酯。

同样，也可使用生物发光化合物标记本发明的抗体。生物发光是可见于生物***的一种化学发光类型，其中催化蛋白提高化学发光反应的效率。通过检测发光的存在来确定生物发光蛋白的存在。对标记目的具有重要性的生物发光化合物是萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。

蛋白质阵列

可以将与本发明生物标志物蛋白质产物特异性和/或选择性结合的多肽固定在蛋白质阵列上。蛋白质阵列可以用作诊断工具，如用于筛选医学样品(如分离的细胞、血、滑液、血清、活检标本等)中是否存在本发明生物标志物的多肽蛋白质产物。蛋白质阵列还可包括抗体以及其它配体，例如与本发明生物标志物编码的多肽结合的抗体或配体。

产生多肽阵列的方法描述于例如De Wildt等，2000，NatureBiotech.18：989-994；Lueking等，1999，Anal.Biochem.270：103-111；Ge，2000，Nuc.Acids Res.28：e3；MacBeath和Schreiber，2000，Science289：1760-1763；国际公开No.WO 01/40803和WO 99/51773A1；和U.S.专利No.6,406,921。用于阵列的多肽可以高速点样，例如使用市售的机器人装置，如来自Genetic MicroSystems和Affymetrix(SantaClara，California，USA)或BioRobotics(Cambridge，UK)的机器人装置。阵列衬底可以是例如硝酸纤维素、塑料、玻璃，如表面改性玻璃。阵列还可以包括多孔衬底，如丙烯酰胺、琼脂糖或其他聚合物。

例如，阵列可以是抗体阵列，如De Wildt，同上所述。可以以阵列格式在滤膜上培养产生多肽配体的细胞。诱导多肽产生，并将表达的抗体固定在滤膜的细胞位置处。关于阵列上每一地址结合程度的信息可以作为图谱保存，例如保存在计算机数据库中。

在一个实施方案中，所述阵列为蛋白质产物阵列，它由本发明生物标志物中多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50的任何数目或全部或任何组合组成。在另一实施方案中，所述阵列为蛋白质产物阵列，它基本由本发明生物标志物中多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50的任何数目或全部或任何组合组成。在另一实施方案中，所述阵列为蛋白质产物阵列，它基本由任何一种或多种表1生物标志物的蛋白质产物(包括表3中所列出的产物)与多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40种或全部的表2生物标志物蛋白质产物中的任何一种或多种一起组成。在另一实施方案中，所述阵列为蛋白质产物阵列，它由任何一种或多种表1生物标志物的蛋白质产物(包括表3中所列出的产物)与多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40种或全部的表2生物标志物蛋白质产物中的任何一种或多种一起组成。

在一个方面中，本发明提供与阵列结合的抗体或其抗原结合片段，所述阵列与本发明生物标志物的蛋白质产物选择性结合。

5.17蛋白质的产生

可以使用标准重组核酸方法表达本发明的多肽或抗体(如本发明生物标志物的蛋白质产物)。一般将编码多肽的核酸序列克隆到核酸表达载体中。当然，如果蛋白质包括多条多肽链，则必须将每条链克隆进在相同或不同细胞中表达的表达载体中，如相同或不同的载体中。如果蛋白质足够小，即蛋白质是小于50个氨基酸的肽，则可使用自动有机合成法合成蛋白质。由仅有对应于生物标志物5’区、3’区或内部编码区相应核酸序列的核酸表达载体表达包含本发明生物标志物5’区、3’区或内部编码区的多肽。产生抗体的方法，所述抗体针对本发明生物标志物蛋白质产物或由本发明生物标志物的5’区、3’区或内部编码区编码的多肽。

除了编码多肽或其片段的区段以外，表达多肽的表达载体还可包括与目的核酸有效连接的调节序列，包括如启动子。大量合适的载体和启动子为本领域技术人员熟知并以商品提供，可用于产生本发明的重组构建体。提供以下载体用于示例。细菌：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene，La Jolla，California，USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。真核：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXTI、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。优选文库的一种优选类型为下文描述的展示文库。

可以使用本领域技术人员熟知的方法构建含本发明多核苷酸和适当的转录/翻译控制信号的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参阅如以下描述的技术：Sambrook＆Russel，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》，第三版，ColdSpring Harbor Laboratory，N.Y.(2001)和Ausubel等，《CurrentProtocols in Molecular Biology》  (Greene Publishing Associates andWiley Interscience，N.Y.(1989)。使用CAT(氯霉素转移酶)载体或其它带选择标记的载体，启动子区可以选自任何期望的基因。两种合适的载体为pKK232-8和pCM7。具体提出的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP和trc。真核启动子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒的LTR、小鼠金属硫蛋白-I和多种已知组织特异性启动子。在一些具体实施方案中，启动子为诱导型启动子。在另一些实施方案中，启动子为组成型启动子。在另一些实施方案中，启动子为组织特异性启动子。

一般而言，重组表达载体将包括复制起点和允许转化宿主细胞的选择标记，如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母(S.cerevisiae)的营养缺陷标记(如URA3、LEU2、HIS3和TRPl基因)以及来自高表达基因的启动子，以指导下游结构序列的转录。这些启动子可以来自编码以下蛋白的操纵子：糖酵解酶如3-磷酸甘油激酶(PGK)、a-因子、酸性磷酸酶或热休克蛋白等。本发明的多核苷酸以适当的相与翻译起始和终止序列装配在一起，优选与能指导翻译蛋白质分泌到周质空间或细胞外介质中的前导序列装配在一起。任选地，本发明核酸可编码包括N-末端识别肽的融合蛋白，所述肽传递期望的特性，如稳定或简化所表达重组产物的纯化。通过***本发明的多核苷酸和适当的翻译起始和终止信号(任选的与功能性启动子为有效阅读相)来构建可用于细菌的表达载体。载体将包含一或多种表型选择标记和复制起点，以保证载体的维持并在需要时提供宿主内扩增。适用于转化的原核宿主包括大肠杆菌(E. coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门氏茵(Salmonella typhimurium)和假单孢茵属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)的多个物种，尽管其它物种也可以作为选择。

作为代表性但非限制性的实例，用于细菌的表达载体可包含来自市售质粒的选择标记和细菌复制起点，所述质粒包含熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传元件。这些商品载体包括如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemical，Uppsala，Sweden)和pGEMl(Promega，Madison，Wisconsin，USA)。

本发明提供经遗传改造以包含本发明多核苷酸的宿主细胞。例如，这样的宿主细胞可以含有用已知转化、转染或感染方法导入宿主细胞的本发明核酸。本发明还提供经遗传改造以表达本发明多核苷酸的宿主细胞，其中这些多核苷酸与和宿主细胞异源的调节序列可操作性连接，所述调节序列驱动多核苷酸在细胞中表达。

本发明还提供含有本发明载体的宿主细胞，其中所述核酸已经用已知转化、转染或感染方法引入宿主细胞。宿主细胞可以是真核宿主细胞如哺乳动物细胞、低等真核宿主细胞如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。例如，可以通过磷酸钙转染、DEAE、葡聚糖介导的转染或电穿孔实现将重组构建体引入宿主细胞(Davis，L.等，Basic Methods in Molecular Biology(1986))。也可以使用来自本发明DNA构建体的RNA利用无细胞翻译***产生这些蛋白质。

可以使用任何宿主/载体***表达表2列出的一种或多种基因或剪接变体。用于原核和真核宿主的合适的克隆和表达载体描述于Sambrook等，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》，第二版，Cold Spring Harbor，New York(1989)，其内容整体引入本文为参考。最优选的宿主细胞是正常情况下不表达特定多肽或以低天然水平表达所述多肽的细胞。

在一个具体的实施方案中，改造宿主细胞以在诱导型调节元件控制下表达包含本发明多核苷酸的内源基因，该情况下可通过同源重组替换所述内源基因。如本文所述，可使用基因打靶将基因的现存调节区替换为分离自不同基因的调节序列或经基因工程方法合成的新调节序列。这些调节序列可以包含启动子、增强子、支架附着区、负调节元件、转录起始位点、调节蛋白结合位点或所述序列的组合。或者，可将影响所生成RNA或蛋白质的结构或稳定性的序列替换、去除、添加或靶向修饰，包括多腺苷酸化信号、mRNA稳定性元件、剪接位点、增强或修饰蛋白质转运或分泌性质的前导序列，或者改变或改善蛋白质或RNA分子的功能或稳定性的其它序列。

本发明的宿主还可以为酵母或其它真菌。在酵母中，可以使用含组成型或诱导型启动子的多种载体。综述参阅Ausubel等(编辑)，《Current Protocols in Molecular Biology》，第二卷，Greene Publish.Assoc.＆Wiley Interscience，Ch.13(1988)；Grant等，1987，”Expression and Secretion Vectors for Yeast"，Methods Enzymol.153：516-544；Glover，《DNA Cloning》，第II卷，IRL Press，Wash.，D.C.，Ch.3(1986)；Bitter，1987，”Heterologous Gene Expression inYeast"，Methods Enzymol.152：673-684；和Strathern等(编辑)，《TheMolecular Biology of the Yeast Saccharomyces》，Cold Spring HarborPress，第I、II卷(1982)。

潜在的适用酵母菌株包括酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母菌株(Klueveromyces)、念珠茵(Candida)或能表达异源蛋白质的任何酵母菌株。潜在的适用细菌菌株包括大肠杆菌、肠杆菌科如粘质沙雷氏茵、芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏茵、假单孢茵或能表达异源蛋白质的任何细菌株。如果在酵母或细菌中生产蛋白质，可能有必要修饰产生的蛋白质(例如通过适当位点的磷酸化或糖基化)以获得功能性蛋白质。这些共价连接可以用已知化学或酶方法实现。

也可以使用多种哺乳动物细胞培养***表达重组蛋白质。哺乳动物表达***的实例包括猴COS细胞如描述于Gluzman，1981，Cell23：175(1981)的COS-7猴肾成纤维细胞系、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人肾293细胞、人上皮A431细胞、人Colo205细胞、3T3细胞、CV-1细胞、正常二倍体细胞、来自原代组织体外培养的细胞株，原代外植体、HeLa细胞、小鼠L细胞、BHK、HL-60、U937、HaK、C127、3T3或Jurkat细胞以及能表达相容性载体的其它细胞系。哺乳动物表达载体将包含复制起点、合适的启动子以及任何必要的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体和受***点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。

用于表达蛋白质的微生物细胞可以用任何便利的方法破碎，包括冻融循环、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂。通常通过从细胞沉淀中初步提取和随后一次或多次盐析、水性离子交换或体积排阻层析步骤来分离细菌培养物产生的重组多肽。在一些实施方案中，模板核酸还编码多肽标签，如五组氨酸或六组氨酸。

可以用本领域熟知的技术分离重组蛋白质。例如，Scopes(Protein Purification：Principles and Practice，Springer-Verlag，NewYork(1994))提供了多种纯化重组(和非重组)蛋白质的一般方法。这些方法例如包括离子交换层析、体积排阻层析、亲合层析、选择性沉淀、透析和疏水相互作用层析。

本领域技术人员将可以将本文所述内容的进行改变、改进和其它实现方式而不背离本发明的实质和范围。

公开了以下实施例以更全面地理解本文所述发明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不应认为以任何方式限制本发明。

5.18用于预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状的化合物的鉴定 方法

5.18.1调节生物标志物的表达或活性的化合物的鉴定方法

本发明提供与本发明生物标志物产物结合的化合物的鉴定方法。本发明还提供调节本发明生物标志物的产物的表达和/或活性的化合物的鉴定方法。通过这些方法鉴定的化合物可用于建立研究骨关节炎的一种或多种动物模型。此外，通过这些方法鉴定的化合物可作为先导化合物用于开发预防、治疗、控制和/或改善骨关节炎或其症状的预防和治疗组合物。这些方法特别有用，因为它们使得在体内测试潜在预防剂和治疗剂相关的努力和高费用高效率地集中在通过本文所述体外和离体方法鉴定的化合物上。

本发明提供鉴定待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状能力的化合物的方法，所述方法包括：(a)使表达本发明一种或多种生物标志物的蛋白质产物或其片段或本发明一种或多种生物标志物的RNA产物或其片段的细胞与测试化合物接触；和(b)确定测试化合物与蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或RNA部分结合的能力，从而如果化合物与所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物、RNA部分结合，则鉴定到了待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状能力的化合物。例如，所述细胞可以是酵母细胞或哺乳动物来源的细胞。例如，通过将测试化合物与放射性同位素或酶标记物偶联，以使可以通过检测复合物中的标记化合物来确定测试化合物与蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或RNA部分的结合，从而可以确定测试化合物与蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或RNA部分结合的能力。例如，可以用¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³H直接或间接标记测试化合物，并通过直接计数放射活性或通过闪烁计数来检测放射性同位素。或者，可以用酶标记测试化合物，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶，并通过测定适当底物向产物的转化来检测酶标记。在具体的实施方案中，测定包括使表达本发明一或多种生物标志物的蛋白质产物或其片段或本发明一或多种生物标志物的RNA产物或其部分的细胞与结合所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或RNA部分的已知化合物接触，以形成测定混合物，将测定混合物与测试化合物接触，并测定测试化合物与所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或RNA部分相互作用的能力，其中测定测试化合物与所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或RNA部分相互作用的能力包括测定测试化合物与所述已知化合物相比优先与所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或RNA部分结合的能力。

本发明提供鉴定待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状能力的化合物方法，所述方法包括：(a)使本发明一种或多种生物标志物的蛋白质产物或其片段或本发明一种或多种生物标志物的RNA产物或其部分与测试化合物接触；和(b)测定测试化合物与蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或RNA部分结合的能力，从而如果化合物与所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或RNA部分结合，则鉴定了待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状能力的化合物。可以直接或间接测定测试化合物与蛋白质产物或蛋白质片段的结合。在具体的实施方案中，测定包括使本发明一或多种生物标志物的蛋白质产物或其片段或者本发明一或多种生物标志物的RNA产物或其部分与结合所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或RNA部分的已知化合物接触，以形成测定混合物，将测定混合物与测试化合物接触，并确定测试化合物与所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或RNA部分相互作用的能力，其中测定测试化合物与所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或RNA部分相互作用的能力包括测定测试化合物与所述已知化合物相比优先与所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或RNA部分结合的能力。可使用本领域熟知的技术测定测试化合物与本发明的生物标志物的蛋白质产物或其片段或者本发明的生物标志物的RNA产物或其部分之间的结合。

在本发明以上测定方法的一些实施方案中，可能希望固定本发明的生物标志物的RNA产物或其部分或者其靶分子，以便于分离复合形式与未复合形式的RNA产物或RNA部分、靶分子或二者全部，并提供测定的自动化。在本发明以上测定方法的一种以上实施方案中，可能希望固定本发明的生物标志物的蛋白质产物或其片段或者其靶分子，以便于分离复合形式与未复合形式的一种或全部两种蛋白质，并提供测定的自动化。可以在适于容纳反应物的任何容器中实现测试化合物与本发明生物标志物的蛋白质产物或其片段的结合。这些容器的实例包括微孔板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可以提供融合蛋白，其中添加了一个允许一种或全部两种蛋白质与基质结合的结构域。例如，可以将谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白吸附到谷胱甘肽Sepharose珠(Sigma Chemical；St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生的微孔板上，然后与测试化合物或者测试化合物和非吸附的靶蛋白或本发明生物标志物的蛋白质产物或其片段组合，并在有助于形成复合物的条件下(如生理条件的盐和pH)孵育混合物。孵育后，洗涤珠或微孔板的孔，以去除任何未结合的组分，并如上述直接或间接测量复合物的形成。或者，复合物可以从基质上解离，可以使用标准技术测定本发明生物标志物的蛋白质产物或其片段的结合水平。

将蛋白质固定到衬底上的其它技术也可用于本发明的筛选测定。例如，可以使用生物素和链霉抗生物素蛋白缀合固定本发明生物标志物的蛋白质产物或其片段或者靶分子。可以用本领域熟知的技术(如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals；Rockford，IL)由生物素-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)制备生物素化的本发明生物标志物蛋白质产物或靶分子，并固定在用链霉抗生物素蛋白包被的96孔板(PierceChemical)的孔中。或者，可将与本发明生物标志物的蛋白质产物或其片段反应的抗体衍生到板孔中，通过抗体缀合将蛋白质留在孔中。除了在GST固定复合物中所述的方法以外，检测这些复合物的方法还包括用可与本发明生物标志物的蛋白质产物反应的抗体对复合物进行免疫检测，以及依赖于检测本发明生物标志物的蛋白质产物或其片段或靶分子的相关酶活性的酶联测定。

本发明生物标志物的蛋白质产物或其片段与测试化合物的相互作用或结合也可以用这些蛋白质或蛋白质片段作为“诱饵蛋白”在双杂交测定或三杂交测定中进行测定(参阅如美国专利No.5,283,317；Zervos等(1993)Cell 72：223-232；Madura等(1993)J.Biol.Chem.268：12046-12054；Bartel等  (1993)Bio/Techniques 14：920-924；Iwabuchi等(1993)Oncogene 8：1693-1696；和国际公开No.WO94/10300)。

本发明提供鉴定待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状能力的化合物的方法，所述方法包括：(a)使表达本发明一种或多种生物标志物的蛋白或RNA产物的细胞与测试化合物接触；(b)在孵育期之后测定(a)中存在的蛋白或RNA产物的量；和(c)将(a)中的量与未接触测试化合物的相应对照细胞中的存在量进行比较，从而如果蛋白或RNA产物的量相对于对照中的量发生了变化，则鉴定到了待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状能力的化合物。在具体的实施方案中，使用本文所述的测定(如微阵列或RT-PCR)或本领域技术人员熟知的测定测出表达水平相对于对照中的表达水平改变了5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、5-25％、10-30％、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、4倍、5倍、10倍、25倍、1-10倍或5-25倍。在备选实施方案中，这些方法包括测定细胞中存在的本发明生物标志物中至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少12种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、1-5种、1-10种、5-10种、5-25种或10-40种、全部或任意组合的蛋白或RNA产物的量，并与其在对照中的存在量进行比较，所述本发明生物标志物在表1中列出(包括表3指出的具体产物)或是在表1中所列出(包括表3中列出的具体产物)与表2中所列出生物标志物的产物的任意一种或多种相组合，它们在细胞中存在，并且将其量与对照中所存在的量相比较。

本文所述基于细胞的测定中使用的细胞可以用本领域已知技术进行改造，以表达本发明的生物标志物。参阅如美国专利No.6,245,527中标题为“重组表达载体和宿主细胞”的第III节，其内容引入本文为参考。或者，可以使用内源性表达本发明生物标志物的细胞。例如，可以使用软骨细胞。

在一个具体的实施方案中，软骨细胞分离自“正常”个体或患轻度、重度、显著或重度骨关节炎的个体，并在存在和不存在测试化合物的条件下孵育不同时间(即30分钟、1小时、5小时、24小时、48小时和96小时)。筛选预防或治疗剂时，使用本发明生物标志物的全序列或其功能部分的克隆转染软骨细胞。经转染的软骨细胞在存在或不存在测试化合物的条件下培养不同时间(即1、2、3、5、7、10或14天)。孵育以后，由软骨细胞制备靶核酸样品并与核酸探针杂交，所述核酸探针对应于在来自以下至少两种的软骨细胞中差异表达的核酸序列：正常、轻度骨关节炎、中度骨关节炎和重度骨关节炎。根据本领域熟知的方法及本文所述标记核酸探针，例如使用放射性标记。通过Northern印迹进行杂交，例如Ausubel等，同上或Sambrook等，同上中所述。如本文定义的，相对于来自正常、轻度骨关节炎、中度骨关节炎和重度骨关节炎中任一种的RNA，靶标与阵列上来自正常的样品的差异杂交指示了差异表达的软骨细胞特异性核酸序列相应RNA的表达水平。测试化合物存在下孵育步骤导致的靶序列表达水平改变指示了提高或降低相应软骨细胞生物标志物特异性核酸序列表达的化合物。

本发明还提供鉴定待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状能力的化合物的方法，所述方法包括：(a)使无细胞提取物(如软骨细胞提取物)与编码本发明一种或多种生物标志物的蛋白或RNA产物的核酸序列以及测试化合物接触；(b)测定(a)中存在的蛋白或RNA产物的量；和(c)将(a)中的量与未接触测试化合物的相应对照中存在的量进行比较，从而如果蛋白或RNA产物的量相对于对照中的量发生变化，则鉴定到了待测试其有预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状能力的化合物。在具体的实施方案中，使用本文所述的测定(如微阵列或RT-PCR)或本领域技术人员熟知的测定测出表达水平相对于对照样品中的表达水平改变了5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、5-25％、10-30％、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、4倍、5倍、10倍、25倍、1-10倍或5-25倍。在备选实施方案中，这些方法包括测定提取物中存在的本发明生物标志物中至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少12种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、1-5种、1-10种、5-10种、5-25种或10-40种、全部或任何组合的蛋白或RNA产物的量，并与其在对照中的存在量进行比较。

在某些实施方案中，测定本发明生物标志物的RNA产物的量，而在另外的实施方案中，测定本发明生物标志物的蛋白质产物的量，在另外的实施方案中，确定本发明生物标志物的RNA和蛋白质产物的量。可以使用测定本发明生物标志物的RNA或蛋白质产物的量的标准方法和组合物。这样的方法和组合物在上文已详细描述。

在具体的实施方案中，在本文所述筛选测试中使用试剂盒测定本发明生物标志物的RNA或蛋白质产物的量。这样的试剂盒包含测定至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、全部或任意组合的本发明生物标志物的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种或更多种蛋白或RNA产物表达所需的材料和试剂。在具体的实施方案中，试剂盒还可包含用于所述多种方法的一或多种额外的试剂，如：(1)由血、软骨或滑液细胞纯化RNA的试剂；(2)产生测试核酸的引物；(3)dNTP和/或rNTP(预混的或分开的)，任选具有一或多种独特标记的dNTP和/或rNTP(如生物素化或Cy3或Cy5标记的dNTP)；(4)合成后标记试剂，如荧光染料的化学活性衍生物；(5)酶，如逆转录酶、DNA聚合酶等；(6)多种缓冲介质，如杂交和洗涤缓冲液；(7)标记探针的纯化试剂和组分，如离心柱等；和(8)蛋白质纯化试剂；(9)信号产生和检测试剂，如链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶缀合物、化学荧光或化学发光底物等。在具体的实施方案中，试剂盒包含作为对照的预标记的质量控制蛋白和/或RNA转录物(优选mRNA)。

在一些实施方案中，试剂盒为RT-PCR试剂盒。在其他实施方案中，试剂盒为核酸阵列和蛋白质阵列。这些本发明的试剂盒将至少包含具有本发明相关蛋白质或核酸成员及其包装手段的阵列。或者，可将本发明的蛋白质或核酸成员预包装在阵列上。

在具体的实施方案中，测量本发明生物标志物RNA产物的试剂盒包含测量RNA产物表达所必需的材料和试剂。例如可以使用微阵列或RT-PCR试剂盒，其仅含有测量本发明生物标志物中至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、全部或任何组合的RNA产物水平所必需的试剂和材料。或者，在一些实施方案中，试剂盒可包含不限于测量本发明生物标志物在1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种、20种、25种、全部或任意组合的RNA产物水平所必需的材料和试剂。例如，除了测量至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种或更多种本发明生物标志物以外基因的RNA产物水平所必需的材料和试剂以外，微阵列试剂盒还可以含有测量本发明生物标志物中1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种、20种、25种、全部或任何组合的RNA产物水平所必需的材料和试剂。在具体的实施方案中，微阵列或RT-PCR试剂盒含有测量本发明生物标志物中至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、全部或任何组合以及1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450种或更多种不是本发明生物标志物的基因、或1-10、1-100、1-150、1-200、1-300、1-400、1-500、1-1000、25-100、25-200、25-300、25-400、25-500、25-1000、100-150、100-200、100-300、100-400、100-500、100-1000或500-1000种不是本发明生物标志物的基因的RNA产物水平所必需的材料和试剂。

对于核酸微阵列试剂盒，试剂盒一般包含附着在支持物表面上的探针。可用检测标记来标记探针。在具体的实施方案中，探针对本发明生物标志物中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、全部或任何组合的的5’区、3’区、内部编码区、外显子、内含子、外显子接合处或外显子-内含子接合处具有特异性。微阵列试剂盒可以包含实施测定和方法的说明书，以解释和分析实施测定所得的数据。试剂盒还可以包含杂交试剂和/或检测探针与靶核酸序列杂交时产生的信号所必需的试剂。一般而言，微阵列试剂盒的材料和试剂在一个或多个容器中。试剂盒的每种组分一般在各自的合适容器中。

对于RT-PCR试剂盒，试剂盒一般包含预选的引物，它们对本发明生物标志物中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、全部或任何组合的特定RNA产物(如外显子、内含子、外显子接合处、或外显子-内含子接合处)具有特异性。RT-PCR试剂盒还可以包含适于逆转录和/或扩增核酸的酶(例如聚合酶，如Taq)和进行逆转录反应与扩增的反应混合物需要的脱氧核苷酸和缓冲液。RT-PCR试剂盒还可以包含对本发明生物标志物中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、全部或任何组合具有特异性的探针。所述探针可以用检测标记(如荧光标记)进行标记，也可以不标记。RT-PCR试剂盒的每种组分一般在各自的合适容器中。因此，这些试剂盒一般包含适于每种试剂、酶、引物和探针的不同容器。此外，RT-PCR试剂盒可以包含实施测定和方法的说明书，用于解释和分析实施测定所得的数据。

对于基于抗体的试剂盒，试剂盒可以包含如：(1)第一抗体(可以与固相支持物连接或不连接)，它与目的蛋白质(如本发明生物标志物中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、全部或任何组合的蛋白质产物)结合；和任选地，(2)不同的第二抗体，它与所述蛋白质或第一抗体结合，并缀合了检测标记(如荧光标记、放射性同位素或酶)。基于抗体的试剂盒还可以包含进行免疫沉淀的珠子。基于抗体的试剂盒的每种组分一般在各自的合适容器中。因此，这些试剂盒一般包含适于每种抗体的不同容器。而且，基于抗体的试剂盒可以包含实施测定和方法的说明书，用于解释和分析实施测定所得的数据。

还可以实施基于报告基因的测定以鉴定待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状能力的化合物。在具体的实施方案中，本发明提供鉴定待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状能力的化合物的方法，所述方法包括：(a)使化合物接触表达报告基因构建体的细胞，所述报告基因构建体包含与本发明生物标志物的调节元件(如启动子/增强子元件)有效连接的报告基因；(b)测量报告基因的表达；和(c)将(a)中的量与未接触测试化合物的相应对照细胞中的存在量进行比较，从而如果报告基因表达量相对于对照细胞中的量发生变化，则鉴定到了待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状能力的化合物。根据该实施方案，所述细胞可以天然表达所述生物标志物，或经改造以表达所述生物标志物。在另一实施方案中，本发明提供鉴定待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状能力的化合物的方法，所述方法包括：(a)使化合物接触无细胞提取物和报告基因构建体，所述报告基因构建体包含与本发明生物标志物的调节元件(如启动子/增强子元件)有效连接的报告基因；(b)测定报告基因的表达；和(c)将(a)中的量与未接触测试化合物的相应对照中的存在量比较，从而如果报告基因表达量相对于对照中的量发生变化，则鉴定到了待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状能力的化合物。

可将本领域技术人员熟知的任何报告基因用于根据本发明方法使用的报告基因构建体中。报告基因指编码通过其存在(如通过RT-PCR、Northern印迹、Western印迹、ELISA等)或活性而易于检测的RNA转录物或蛋白质的核苷酸序列。下文的表5列出了报告基因的非限制性实例。可以通过本领域技术人员熟知的任何方法获得报告基因并确定所述元件的核苷酸序列。可以从例如文献或数据库如GenBank中获得报告基因的核苷酸序列。或者，可以由来自适当来源的核酸产生编码报告基因的多核苷酸。如果不能获得含编码特定报告基因的核酸的克隆，但是所述报告基因的序列已知，则编码所述报告基因的核酸可以化学合成，或者由适当的来源(如cDNA文库、或产生自表达所述报告基因的任何组织或细胞的cDNA文库、或者分离自表达所述报告基因的任何组织或细胞的核酸，优选polyA+RNA)通过PCR扩增获得。一旦确定了报告基因的核苷酸序列，就可以使用本领域熟知的操作核苷酸序列的方法(例如重组DNA技术、定向诱变、PCR等(参阅如以下描述的技术：Sambrook等，1990，《MolecularCloning，A Laboratory Manual》，第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY和Ausubel等编辑，1998，《Current Protocols in Molecular Biology》，John Wiley&Sons，NY，其内容均引入本文为参考))操作报告基因的核苷酸序列，以产生具有不同氨基酸序列的报告基因，例如产生氨基酸替换、缺失和/或***。

表11：报告基因和报告基因产物的特性

根据本发明，可将天然或正常表达本发明生物标志物中一种或多种、全部或任何组合的细胞用于本文所述的方法。或者，可以使用本领域熟知的技术和用于本文所述方法的技术改造细胞以表达本发明生物标志物中的一种或多种、全部或任何组合或报告基因。这些技术的实例包括但不限于磷酸钙沉淀(参阅如Graham&Van der Eb，1978，Virol.52：546)、葡聚糖介导的转染、磷酸钙介导的转染、polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将核酸包裹在脂质体中和直接将核酸微注射到核中。

在具体的实施方案中，用于本文所述方法的细胞为软骨细胞、淋巴细胞(T或B淋巴细胞)、单核细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、红细胞或血小板。在优选的实施方案中，用于本文所述方法的细胞为软骨细胞。在另一优选的实施方案中，用于本文所述方法的细胞为淋巴细胞。在另一实施方案中，用于本文所述方法的细胞是由来源(如组织)产生的永生化细胞系。

根据本发明所述方法可以使用允许核酸的翻译和任选(但优选)的转录的任何无细胞提取物。无细胞提取物可以分离自任何物种来源的细胞。例如，无细胞提取物可以分离自人细胞、培养的小鼠细胞、培养的大鼠细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、爪蟾***、兔网织红细胞、小麦胚或黑麦胚(参阅如Krieg&Melton，1984，Nature308：203和Dignam等，1990Methods Enzymol.182：194-203)。或者，无细胞翻译提取物如兔网织红细胞裂解物和小麦胚提取物可购自如Promega(Madison，WI)。在优选的实施方案中，无细胞提取物为分离自人细胞的提取物。在具体的实施方案中，所述人细胞是HeLa细胞、淋巴细胞或软骨细胞。

除了调节本发明生物标志物的RNA和/或蛋白质产物表达水平的能力以外，至少在某些情况下可能期望化合物调节本发明生物标志物的蛋白质产物的活性。因此，本发明提供鉴定待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状能力的化合物的方法，包括鉴定调节本发明一种或多种生物标志物蛋白质产物活性的化合物的方法。这些方法包括：(a)使表达一种或多种本发明生物标志物的蛋白质产物的细胞与测试化合物接触；(b)在孵育期之后测定所述蛋白质产物的活性水平；和(c)将活性水平与未接触测试化合物的相应对照细胞进行比较，从而如果(a)中的活性水平相对于对照中的活性水平发生变化，则鉴定到了待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状的能力的化合物。在具体的实施方案中，用本文所述测定(如微阵列或RT-PCR)或本领域技术人员熟知的测定测出活性水平相对于对照中的活性水平改变了最高5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、5-25％、10-30％、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、4倍、5倍、10倍、25倍、1-10倍或5-25倍。在备选实施方案中，这些方法包括测定细胞中存在的本发明生物标志物中至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少12种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、1-5种、1-10种、5-10种、5-25种或10-40种、全部或任何组合的蛋白质产物的活性水平，并与对照中存在的活性水平进行比较。

本发明提供鉴定待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状能力的化合物的方法，所述方法包括：(a)使含有编码一种或多种本发明生物标志物蛋白质产物的核酸的无细胞提取物与测试化合物接触；(b)在孵育期之后测定所述蛋白质产物的活性水平；和(c)将活性水平与未接触测试化合物的相应对照进行比较，从而如果(a)中的活性水平相对于对照中的活性水平发生变化，则鉴定到了待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状的能力的化合物。在具体的实施方案中，用本文所述测定(如微阵列或RT-PCR)或本领域技术人员熟知的测定测出活性水平相对于对照中的活性水平改变了1％、5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、5-25％、10-30％、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、4倍、5倍、10倍、25倍、1-10倍或5-25倍。在备选实施方案中，这些方法包括测定样品中存在的本发明生物标志物中至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少12种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、1-5种、1-10种、5-10种、5-25种或10-40种、全部或任何组合的蛋白质产物的活性水平，并与对照中存在的活性水平进行比较。

可以使用标准技术测定本发明生物标志物蛋白质产物的活性水平。

5.18.2化合物的生物活性

鉴定了待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状能力的化合物(为方便起见，本文中称为“先导”化合物)之后，可以对所述化合物进行进一步研究。例如，可以在公认的炎症(特别骨关节炎，更特别地为骨关节炎)动物模型中对通过本发明方法鉴定的化合物进行体内测试。此外，可以通过能分析其特异性的方法鉴定化合物。具体地，可以通过本领域技术人员熟知的方法测试化合物对软骨细胞制造II型胶原和蛋白聚糖的影响，参阅如Nelson等J.Clin.Invest.102卷，第12，1998年12月，2115-2125Evidence for AlteredSynthesis of Type II Collagen in Patients with Osteoarthritis和Venkatesan，N.等(2004年12月)PNAS101(52)：18087-92Stimulationof proteoglycan synthesis by gliwuronosyltransferase-I gene delivery：A strategy to promote cartilage repair，其内容均引入本文为参考。用于这些额外的化合物研究的技术为本领域技术人员所熟知。

在一个实施方案中，可以通过测量靶细胞的细胞生长或成活力来测定先导化合物的效果。可以使用骨关节炎中涉及的细胞类型的代表性细胞(如软骨细胞)进行这些测试。或者，可以用细胞系的细胞代替培养的患者细胞来筛选先导化合物。

可以使用本领域熟知的许多测定来评价接触先导化合物以后患者细胞或细胞系的存活和/或生长；例如，可以通过测量溴脱氧尿嘧啶(BrdU)掺入(参阅如Hoshino等，1986，Int.J.Cancer38，369；Campana等，1988，J.Immunol.Meth.107：79)或(³H)-胸腺嘧啶掺入(参阅如Chen，J.，1996，Oncogene13：1395-403；Jeoung，J.，1995，J.Biol.Chem.270：18367-73)、通过直接细胞计数、通过检测已知基因如原癌基因(如fos、myc)或细胞周期标志物(Rb、cdc2、细胞周期蛋白A、D1、D2、D3、E等)转录、翻译或活性的改变来测定细胞增殖。这些蛋白质、RNA(如mRNA)和活性的水平可以用本领域熟知的任何方法测定。例如可以使用已知的免疫诊断方法如Western印迹或免疫沉淀用市售抗体定量蛋白质。可以使用本领域熟知和常用的方法例如Northern分析、RNase保护、与逆转录结合的聚合酶链式反应来定量mRNA。可以用台盼蓝染色或本领域已知的其它细胞死亡或成活力标志物评价细胞活力。在具体的实施方案中，测量细胞的ATP水平以确定细胞成活力。分化可通过如基于形态学改变的观察来评价。

软骨细胞增殖测定的一个实例如下：如前述由人重度OA软骨切片回收软骨细胞。(Doherty PJ，Zhang H，Trembley L，Manolopoulos V and Marshall KW.，1998，Osteoarthritis andCartilage6：153-160)。接着洗涤细胞、计数并以1×10⁴个细胞/孔铺在平底96孔板(Corning)的DMEM++中。细胞粘附在板上之后，仅用DMEM洗涤，接着在存在或不存在10％FCS的DMEM中与不同浓度的先导化合物孵育48小时。接着通过在每孔中加入10μl WST-1(四唑盐，在活细胞中可被线粒体脱氢酶切割成甲(Formazan)，Roche)、充分混合1分钟并在37℃孵育1.5小时来测定每个孔中的细胞数。接着在450nm处用微孔板自动读数器(BIO-TEK Instruments)扫描平板。通过测量450nm处吸光度定量的所形成甲臜的量反映了有成活力的细胞数。(Lang I，Hoffmann C，Olip H，Pabst MA，HarmT，Dohr G，Desoye G.，2001，Differential mitogenic responses of humanmacrovascular and microvascular endothelial cells to cytokinesunderline their phenotypic heterogeneity.Cell Prolif34：143-55)。

可以使用本领域熟知的技术测定接触先导化合物的软骨细胞在II型胶原和蛋白聚糖制造上的效应。此外，可以使用所述先导化合物进行本领域熟知的测定，所述测定评估治疗对预防、治疗、控制或改善病症(特别是骨关节炎)的效力。

动物模型

在用于人之前，可以在合适的动物模型***对化合物进行测试。这些动物模型***包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、猪、狗、兔等。可以使用熟知的动物***。在某些实施方案中，在小鼠模型中测试化合物。可以重复施用化合物。

可以使用公认的动物模型测定通过上述方法鉴定的化合物预防、治疗、控制和/或改善骨关节炎或其症状的效力。这些模型可包括本领域已知并描述于Crofford LJ.和Wilder R.L.，"Arthritis andAutoimmunity in Animals"，《Arthritis and Allied Conditions：ATextbook of Rheumatology》，McCarty等(编辑)，第30章(Lee和Febiger，1993)的多种炎性关节炎实验动物模型。本领域已知并广泛使用的关节炎或炎性疾病的主要动物模型包括：佐剂诱导的关节炎大鼠模型、胶原诱导的关节炎大鼠和小鼠模型以及抗原诱导的关节炎大鼠、兔和仓鼠模型，均描述于Crofford LJ.和Wilder R.L.，″Arthritis andAutoimmunity in Animals"，《Arthritis and Allied Conditions：ATextbook of Rheumatology》，McCarty等(编辑)，第30章(Lee和Febiger，1993)，均以其整体引入本文为参考。

在一个实施方案中，使用角叉菜胶诱导的关节炎大鼠模型测定化合物预防、治疗、控制和/或改善骨关节炎或其症状的效力。在慢性关节炎或炎症的研究中，角叉菜胶诱导的关节炎还可用于兔、狗和猪。使用定量组织形态测定术测定疗效。这些角叉菜胶诱导的关节炎模型的使用方法描述于Hansra P.等，″Carrageenan-induced Arthritis inthe Rat，″Inflammation，24(2)：141-155，(2000)。普遍使用的还有本领域已知并已描述的酵母聚糖诱导的炎症动物模型。

可以使用Winter C.K.等，″Carrageenan-induced Edema inHind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs″Proc.Soc.Exp.Biol Med.111，544-547，(1962)所述的方法改良，通过测量对角叉菜胶诱导的爪水肿的抑制来评估化合物的抗炎活性。该测定已作为多数NSAID的主要的抗炎活性体内筛选使用，并且认为可预测人效力。测试化合物的抗炎活性表达为对测试组相对于载体给药对照组的后爪重量增加的抑制百分比。

在另一实施方案中，使用胶原诱导的关节炎(CIA)模型测定化合物预防、治疗、控制和/或改善骨关节炎或其症状的效力。CIA是人自身免疫疾病类风湿性关节炎RA的动物模型(Trenthorn等，1977，J.Exp.Med.，146：857)。可以通过施用异源II型胶原在许多物种中诱导该疾病(Courtenay等，1980，Nature283：665；Cathcart等，1986，Lab.Invest，54：26)。此外，关于关节炎的动物模型可参阅如Hohndahl，R.，1999，Curr.Biol.15：R528-530。

在另一实施方案中，使用测定骨形成和/或骨丢失的测定来测定化合物预防、治疗、控制和/或改善骨关节炎或其症状的效力。本领域已知的动物模型如卵巢切除诱导的骨再吸收小鼠、大鼠和兔模型可用于获得骨形成的参数。可以使用如Yositake等或Yamamoto等所述的方法，通过微机断层摄影分析和骨组织形态测定分析来体内测量骨体积。Yoshitake等，″Osteopontin-Deficient Mice Are Resist ant toOvariectomy-Induced Bone Resorption，″Proc.Natl.Acad.Sci.96：8156-8160，(1999)；Yamamoto等，″The Integrin Ligand EchistatinPrevents Bone Loss in Ovariectomized Mice and Rats，″Endocrinology139(3)：1411-1419，(1998)，均以其整体引入本文为参考。.

毒性

可以通过标准药学方法在细胞培养物或实验动物中测定根据本发明鉴定的化合物的毒性和/或效力，例如确定LD₅₀(群体中50％致死的剂量)和ED₅₀(群体中50％有治疗效果的剂量)。可以用于评价根据本发明鉴定的化合物的细胞毒性的细胞和细胞系包括但不限于外周血单核细胞(PBMC)、Caco-2细胞和Huh7细胞。毒性和疗效之间的剂量比为治疗指数，可以表示为LD₅₀/ED₅₀的比。优选根据本发明鉴定的表现高治疗指数的化合物。虽然可以使用根据本发明鉴定的表现毒副作用的化合物，但是应该仔细设计使这些物质靶向病患组织的递送***，以使对未感染细胞的潜在破坏最小化，并因而降低副作用。

得自细胞培养测试和动物研究的数据可用于配制根据本发明鉴定的化合物用于人时的剂量范围。这些药剂的给药剂量优选处于包括ED₅₀而没有或几乎每一毒性的循环浓度范围内。剂量可在此范围内变化，取决于使用的剂型和给药途径。对于任何用于本发明方法的物质，可以从细胞培养测试初步估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量，以实现包括在细胞培养中测定的IC₅₀(即达到症状最大抑制作用的一半的化合物浓度)的循环血浆浓度范围。可以使用这些信息更精确的确定人的有用剂量。血浆水平可通过如高效液相层析来测定。

同源物或类似物的设计

可以使用显示期望生物活性的化合物作为先导化合物，用于开发或设计具有有用药理活性的同源物或类似物。例如，一旦鉴定到先导化合物，就可以用分子建模技术设计该化合物可能更有效的变体。分子建模***的实例为CHARM和QUANTA程序(PolygenCorporation，Waltham，MA)。CHARM执行能量最小化和分子动力学函数。QUANTA执行构建、图形建模和分子结构分析。QUANTA允许交互式地构建、修饰、显示和分析分子间的行为。

很多论文综述了与特异性蛋白质相互作用的药物计算机建模，如Rotivinen等，1988，Acta Pharmaceutical Fennica97：159-166；Ripka，1998，New Scientist54-57；McKinaly&Rossmann，1989，Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29：111-122；Perry&Davies，OSAR：QuantitativeStructure-Activity Relationships in Drug Design189-193页(Alan R.Liss，Inc.1989)；Lewis&Dean，1989，Proc.R.Soc.Lond.236：125-140and141-162；Askew et al.，1989，J.Am.Chem.Soc.111：1082-1090。筛选和图形描述化学品的其它计算机程序可以从一些公司获得，如BioDesign，Inc.(Pasadena，California)、Allelix，Inc.(Mississauga，Ontario，Canada)和Hypercube，Inc.(Cambridge，Ontario)。尽管它们主要设计用于对特定蛋白质具有特异性的药物，但是可以修改它们用于设计对任何鉴定区域具有特异性的药物。可以用上述生物活性筛选来测试类似物和同源物与目的蛋白质(即本发明生物标志物的蛋白质产物)的结合。或者，筛选中确认的没有或几乎没有生物活性的先导化合物也可以用于设计具有生物活性的化合物的类似物和同源物。

5.18.3化合物

可用本文所述方法进行测试和鉴定的化合物可以包括但不限于得自任何商业来源的化合物，包括Aldrich(1001West St.Paul Ave.，Milwaukee，WI53233)，Sigma Chemical(P.O.Box14508，St.Louis，MO63178)，Fluka Chemie AG(Industriestrasse25，CH-9471Buchs，Switzerland(Fluka Chemical Corp.980South2nd Street，Ronkonkoma，NY11779))，Eastman Chemical Company，FineChemicals(P.O.Box431，Kingsport，TN37662)，BoehringerMannheim GmbH(Sandhofer Strasse116，D-68298Mannheim)，Takasago(4Volvo Drive，Rockleigh，NJ07647)，SST Corporation(635Brighton Road，Clifton，NJ07012)，Ferro(111West Irene Road，Zachary，LA70791)，Riedel-deHaen Aktiengesellschaft(P.O.BoxD-30918，Seelze，Germany)，PPG Industries Inc.，Fine Chemicals(OnePPG Place，34th Floor，Pittsburgh，PA15272)。此外，可以使用本发明方法筛选任何类型的天然产物，包括微生物、真菌、植物或动物提取物。

可以筛选来自大的合成或天然化合物文库的化合物。目前有很多手段可用于随机和定向合成基于糖、肽和核酸的化合物。合成化合物文库可购自多个公司，包括Maybridge Chemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK)、Comgenex(Princeton，NJ)、Brandon Associates(Merrimack，NH)和Microsource(New Milford，CT)。稀有化学品文库可得自Aldrich(Milwaukee，WI)。组合文库是可以获得的，并且是已制备好的。或者，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库可得自如Pan Laboratories(Bothell，WA)或MycoSearch(NC)，或者可通过本领域熟知的方法便利地制备。此外，通过常规化学、物理和生化手段很容易修饰天然和合成产生的文库和化合物。

另外，可以利用测试化合物(包括小分子测试化合物)的多样性文库。用本发明方法筛选的文库可包含多种类型的化合物。可以根据本发明方法筛选的文库实例包括但不限于拟肽；随机生物寡聚物；diversomers如乙内酰脲、苯二氮

和二肽；插烯(vinylogous)多肽；非肽的肽模拟物；寡聚氨基甲酸酯；肽膦酸酯；肽核酸文库；抗体文库；碳水化合物文库和小分子文库(优选小有机分子文库)。在一些实施方案中，筛选库中的化合物为核酸或肽分子。在非限制性的实例中，肽分子可以存在于噬茵体展示文库中。在其他实施方案中，化合物的类型包括但不限于肽类似物，包括含非天然存在氨基酸如D-氨基酸的肽，氨基酸的磷类似物如α-氨基磷酸和具有非肽键的α-氨基磷酸或氨基酸，核酸类似物如硫代磷酸酯和PNA，激素，抗原，合成或天然存在的药物，阿片，多巴胺，血清素，儿荼酚胺，凝血酶，乙酰胆碱，***素，有机分子，信息素，腺苷，蔗糖，葡萄糖，乳糖和半乳糖。多肽或蛋白质的文库也可以用于本发明的测定中。

在一个具体实施方案中，组合文库为小有机分子库，包括但不限于苯二氮

类、类异戊二烯、噻唑烷酮、metathiazanones、吡咯烷、吗啉代化合物和苯二氮

类。在另一实施方案中，组合文库包含拟肽；随机生物寡聚物；苯二氮

类；diversomers如乙内酰脲、苯二氮

类和二肽；插烯(vinylogous)多肽；非肽的肽模拟物；寡聚氨基甲酸酯；肽膦酸酯；肽核酸文库；抗体文库或碳水化合物库。组合文库自身是市售的。例如文库可购自例如Specs and BioSpecs B.V.(Rijswijk，The Netherlands)，Chembridge Corporation(San Diego，CA)，Contract Service Company(Dolgoprudny，Moscow Region，Russia)，Comgenex USA Inc.(Princeton，NJ)，Maybridge Chemicals Ltd.(Cornwall PL34OHW，United Kingdom)，Asinex(Moscow，Russia)，ComGenex(Princeton，New Jersey)，Ru，Tripos，Inc.(St.Louis，Missouri)，ChemStar，Ltd(Moscow，Russia)，3D Pharmaceuticals(Exton，Pennsylvania)和Martek Biosciences(Columbia，Maryland)。

在优选的实施方案中，预选择所述文库，以使文库中的化合物更易于被细胞摄取。例如，基于特定参数选择化合物，所述参数例如但不仅限于大小、亲脂性、亲水性和氢键，它们提高了化合物进入细胞的可能性。在另一实施方案中，用三维或四维计算机运算程序分析化合物。

根据本发明方法使用的组合化合物文库可以合成。对于创建小有机化合物的大集合或文库的合成方法受到广泛关注，它们可用于药理、生物或其它活性的筛选。用于创建大组合文库的合成方法在溶液或在固相即支持物上进行。固相合成使得更易于进行多步反应并驱动反应以高产率地完成，因为每个反应步骤后可以容易地添加和洗去过量试剂。固相组合合成还便于改善分离、纯化和筛选。然而，较传统的液相化学支持比固相化学更广泛的有机反应。

可以使用Kilcoin等人的美国专利No.6,190,619所述的装置合成本发明的组合化合物文库，所述专利以其整体引入本文为参考。美国专利No.6,190,619公开了能支持多个反应容器平行合成多种分开的化合物或化合物组合文库的合成装置。

在一个实施方案中，组合化合物文库可以在溶液中合成。Boger等的美国专利No.6,194,612公开的方法表征了用作组合文库液相合成模板的化合物，该专利以其整体引入本文为参考。设计模板以使得易于使用液/液或固/液萃取从未反应的反应物中分离反应产物。使用该模板经组合合成产生的化合物优选为小有机分子。文库中的一些化合物可以模拟非肽或肽的作用。与组合化合物文库的固相合成相反，液相合成不需要使用监测多步骤固相合成中各步骤的专门操作(Egner等，1995，J.Org.Chem.60：2652；Anderson等，1995，J.Org.Chem.60：2650；Fitch等，1994，J.Org.Chem.59：7955；Look等，1994，J.Org.Chem.49：7588；Metzger等，1993，Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.32：894；Youngquist等，1994，Rapid Commun.Mass Spect.8：77；Chu等，1995，J.Am.Chem.Soc.117：5419；Brummel等，1994，Science264：399；和Stevanovic等，1993，Bioorg.Med.Chem.Lett.3：431)。

用于本发明方法的组合化合物文库可以在固体支持物上合成。在一个实施方案中，使用裂分合成法(在合成期间分离并混合支持物的操作)在固体支持物上合成化合物文库(参阅如Lam等，1997，Chem.Rev.97：41-448；Ohlmeyer等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：10922-10926及其中引用的参考文献)。最终文库中的每种固体支持物基本具有附着在其表面的一种类型的化合物。在每种支持物上附着一种产物的其他在固体支持物上合成组合文库的方法为本领域技术人员所熟知的(参阅如Nefzi等，1997，Chem.Rev.97：449-472)。

在本发明的一些实施方案中，化合物可以通过接头附着在固体支持物上。接头可以整合在固相支持物上成为其部分，或者它们可以是非整合的，在固体支持物上合成或者在合成后附着于其上。接头不仅可用于提供化合物附着在固体支持物上的点，而且取决于接头的性质，还允许在不同条件下从固体支持物上切除不同类型的分子。例如，可对接头进行亲电切割、亲核切割、光切割、酶切割、由金属切割、在还原条件下切割或在氧化条件下切割等。在优选的实施方案中，在高通量筛选化合物之前从固体支持物上切割化合物。

如果文库包含化合物的阵列或微阵列，其中每种化合物具有一个地址或标识符，所述化合物可以被去摺合，例如通过将阳性样品与应用于单个测试的原化合物列表交叉参考。

如果文库为肽或核酸文库，可以通过对肽或核酸直接测序来确定化合物的序列。这种方法文本领域技术人员所熟知。

可以使用很多物理化学技术全新表征化合物。这些技术的实例包括但不限于质谱、NMR光谱、X-射线晶体衍射和振动光谱。

5.19鉴定出的化合物预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状的用 途

本发明提供预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状的方法，所述方法包括向需要的受试者施用一种或多种根据本发明方法鉴定的化合物。在优选的实施方案中，所述受试者为人。

在一个实施方案中，本发明提供预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状的方法，所述方法包括的需要的对象施用预防或治疗有效剂量的一种或多种根据本发明方法鉴定的化合物。在具体的实施方案中，如果根据本发明方法鉴定的化合物之前已经用于预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状，则不施用这种化合物来预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状。在另一实施方案中，如果根据本发明方法鉴定的化合物已经被建议用于预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状，则不施用这种化合物来预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状。在另一实施方案中，根据本发明方法鉴定的化合物与仅一种本发明生物标志物的蛋白或RNA产物特异性结合和/或改变其表达和/或活性水平。在另一实施方案中，根据本发明方法鉴定的化合物与最多为至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40种或更多本发明生物标志物的蛋白或RNA产物结合和/或改变其表达和/或活性水平。

在具体的实施方案中，根据本发明方法鉴定的化合物提高或降低软骨细胞的合成代谢和/或分解代谢水平。优选地，与未处理的软骨细胞相比，这些化合物提高或降低软骨细胞的合成代谢和/或分解代谢水平至少1.0倍，更优选1.5-5倍，最优选5-100倍。在另一实施方案中，根据本发明方法鉴定的化合物改善至少一种骨关节炎相关症状和/或改变，包括软骨退化或与软骨退化相关的疼痛、肿胀、衰弱和/或患病关节丧失功能。在具体的实施方案中，为预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状而施用的预防或治疗剂为合成化合物或天然产物(如植物提取物或培养物上清液)或化合物的混合物。

本发明还提供预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状的方法，所述方法包括对需要的受试者给予一种或多种根据本文所述筛选方法鉴定的化合物以及一或多种其它治疗(如预防或治疗剂和手术)。在具体的实施方案中，这些治疗目前正用于、已经用于或已知可用于预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状(包括但不限于下文1.21.2节列出的预防或治疗剂)。本发明联合治疗中的治疗(如预防或治疗剂)可以依次施用或同时施用。在具体的实施方案中，本发明的联合治疗包括根据本发明鉴定的化合物和与所述化合物作用机制相同的至少一种其它治疗。在另一个具体实施方案中，本发明的联合治疗包括根据本发明方法鉴定的化合物和与所述化合物作用机制不同的至少一种其它治疗(如预防或治疗剂)。通过与具有叠加或协同效应的化合物一起发挥功能，本发明的联合治疗提高了本发明化合物的预防或治疗效果。本发明的联合治疗降低了与所述治疗(如预防或治疗剂)相关的副作用。

可以在同一药物组合物中对受试者施用所述联合治疗的预防或治疗剂。或者，可以在分开的药物组合物中同时对受试者施用所述联合治疗中的预防或治疗剂。可以通过相同或不同的给药途径对受试者施用所述预防或治疗剂。

在具体的实施方案中，将包含本文所述测定中鉴定的一种或多种化合物的药物组合物施用于受试者(优选人)，以预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状。根据本发明，所述药物组合物还可以包含一种或多种预防或治疗剂。优选地，这些物质目前正在用于、已经用于或已知可用于预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状。

根据本发明方法鉴定的化合物可以用作骨关节炎的一线、二线、三线、四线或五线治疗。本发明为常规骨关节炎治疗无效的受试者提供了治疗、控制或改善骨关节炎或其症状的方法，所述方法包括对所述受试者施用预防或治疗有效剂量的根据本发明方法鉴定的化合物。

本发明为现有的骨关节炎单剂常规治疗无效的受试者提供了治疗、控制或改善骨关节炎或其症状的方法，所述方法包括对所述受试者施用预防或治疗有效剂量的根据本发明方法鉴定的化合物以及预防或治疗有效剂量的一种或多种其它治疗(如预防或治疗剂)。本发明还提供这样的方法：通过对已证明其它治疗无效且不再进行这些治疗的患者施用根据本发明方法鉴定的化合物以及任一其它治疗(如手术)的组合，以治疗或控制骨关节炎。本发明还提供治疗或控制患有骨关节炎并由于之前接受其它治疗而受到免疫抑制的患者的方法。本发明还提供当已经证明或可能证明激素治疗和/或生物治疗/免疫治疗对于接受治疗或控制的受试者而言毒性太大(即导致不可接受或无法忍受的副作用)时治疗或控制骨关节炎的备选方法。

5.19.1用于预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状的混合物

下文详细描述了根据本发明方法可用于预防、治疗、控制和/或改善骨关节炎或其症状的化合物的代表性非限制性实例。

首先，这些化合物可包括例如能下调本发明生物标志物蛋白或RNA产物的表达或活性的反义、核酶或三螺旋化合物。下面的小节中详细描述了这些化合物。

其次，这些化合物可包括例如能调节本发明生物标志物蛋白或RNA产物的表达或本发明生物标志物蛋白质产物的活性的抗体组合物。在具体的实施方案中，所述抗体组合物下调本发明生物标志物蛋白或RNA产物的表达或本发明生物标志物蛋白质产物的活性。下面的小节中详细描述了这些化合物。

第三，这些化合物可包括例如本发明生物标志物的蛋白质产物。本发明包括肽或肽模拟物用于预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状的用途，其中选择所述肽或肽模拟物用来模拟本发明生物标志物的蛋白质产物。此外，这些化合物可包括例如能调节本发明生物标志物蛋白或RNA产物的表达或本发明生物标志物蛋白质产物的活性的显性负多肽。

所述方法还包括本发明生物标志物蛋白质产物的衍生物、类似物和片段用于预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状的用途。具体而言，本发明包括本发明生物标志物蛋白质产物的片段用于预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状的用途，所述片段包含这些蛋白质的一个或多个结构域。在另一具体实施方案中，本发明包括本发明生物标志物蛋白质产物或这些蛋白质的衍生物、类似物和片段的用途，所述蛋白质及其衍生物、类似物和片段表达为融合或嵌合蛋白质产物(包括通过肽键与异源蛋白质序列连接的蛋白质、片段、类似物或衍生物)。

在具体的实施方案中，施用至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种或更多本发明生物标志物的反义寡核苷酸，以预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状。在其他实施方案中，施用一种或多种本发明生物标志物的蛋白质产物或其片段、类似物或衍生物，以预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状。在其他实施方案中，施用与本发明蛋白质产物特异性结合的一种或多种抗体，以预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状。在另一些实施方案中，施用一种或多种显性负多肽以预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状。

反义、核酶、三螺旋组合物

可用标准技术产生作为本文所述方法的一部分使用的反义、三螺旋或核酶分子。首先，可用标准技术产生反义核酸分子，即与编码目的多肽的正义核酸互补的分子，例如与双链cDNA分子编码链互补或与mRNA序列互补的分子。相应地，反义核酸可与正义核酸形成氢键。反义核酸可与全部编码链或仅一部分编码链互补，例如蛋白编码区(或开放读码框)的全部或部分。反义核酸分子可以与编码目的核酸序列的编码链中的全部或部分非编码区反义。所述非编码区(“5’和3’非翻译区”)是编码区侧翼不翻译成氨基酸的5’和3’序列。

反义寡核苷酸的长度可以为例如5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸或更多。可以使用化学合成和酶促连接反应用本领域已知的方案构建本发明的反义核酸。例如，可以用天然存在的核苷酸或多种修饰核苷酸化学合成反义核酸(如反义寡核苷酸)，所述修饰核苷酸设计用于增加分子的生物稳定性或增加反义与正义核酸之间形成的双链体的物理稳定性，例如可以使用硫代磷酸衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。或者，可以使用表达载体来生物地产生反义核酸，其中以反义方向(即由***核酸转录的RNA将和靶目的核酸为反义取向)将核酸亚克隆进所述表达载体中。

对受试者施用或原位产生反义核酸分子，以使其与编码目的多肽的细胞mRNA杂交或结合，从而例如通过抑制转录和/或翻译而抑制表达。可以通过常规核苷酸互补性进行杂交而形成稳定的双链体，或者，例如对于结合DNA双链体的反义核酸分子的情况，通过在双螺旋大沟中的特异性相互作用进行杂交。本发明反义核酸分子的给药途径实例包括直接注射到组织部位，例如关节(如膝、髋、肘和指节)。或者，可以修饰反义核酸分子使之靶向选定的细胞，然后全身性给药。例如，就全身性给药而言，可以修饰反义分子，以使其与选定细胞如T细胞或软骨细胞表面上表达的受体或抗原特异性结合，例如通过将反义核酸分子与结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体连接。还可以使用载体如下述基因治疗载体将反义核酸分子递送至细胞。为达到足够的反义分子胞内浓度，优选构建将反义核酸分子置于强polII或polIII启动子控制之下的载体。

有意义的反义核酸分子可以为α-端基异构(anomeric)核酸分子。α-端基异构核酸分子与互补RNA形成特异性双链杂合体，其中与通常的α-单元相反，链彼此平行(Gaultier等，1987，Nucleic AcidsRes.15：6625-6641)。反义核酸分子还可以包括2’-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，Nucleic Acids Res.15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等，1987，FEBS Lett.215：327-330)。

核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它能切割与之有互补区的单链核酸如mRNA，也可以使用标准技术产生。因此，核酶(如锤头状核酶(描述于Haselhoff和Gerlach，Nature334：585-591))可用于催化性切割mRNA转录物，从而抑制由该mRNA编码的蛋白质的翻译。可以基于本文公开的cDNA核苷酸序列设计对编码目的多肽的核酸分子有特异性的核酶。例如，可以构建四膜虫L-19IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与待切割核苷酸序列互补，见Cech等U.S.专利No.4,987,071；和Cech等U.S.专利No.5,116,742。或者，可用编码目的多肽的mRNA从RNA分子库中选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA。参阅如Bartel和Szostak，1993，Science261：1411-1418。

三螺旋结构也可以使用熟知的技术产生。例如，通过靶向与编码目的多肽的基因调节区(如启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列以形成阻止靶细胞中所述基因转录的三螺旋结构，可以抑制所述多肽的表达。一般可参阅Helene，1991，Anticancer Drug Des.6(6)：569-84；Helene，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36；和Maher，1992，Bioassays14(12)：807-15。

在多个实施方案中，可以在碱基、糖基或磷酸骨架处修饰核酸组合物，以改善例如分子的稳定性、杂交或溶解度。例如，可以修饰核酸的脱氧核糖磷酸骨架，以产生肽核酸(见Hyrup等，1996，Bioorganic&Medicinal Chemistry4：5-23)。本文使用的术语“肽核酸”或“PNA”表示核酸模拟物，如DNA模拟物，其中脱氧核糖磷酸骨架被假肽骨架替换，仅保留四种天然核酸碱基。已经显示PNA的中心骨架允许在低离子强度条件下与DNA和RNA特异性杂交。可以使用标准固相肽合成方法进行PNA寡聚物的合成，如Hyrup等，1996，同上；Perry-O′Keefe等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：14670-675中所述。

例如，可以通过在PNA上附着亲脂性或其它辅助基团、通过形成PNA-DNA嵌合体、或通过使用脂质体或本领域已知的其它药物递送技术来修饰PNA，例如增强其稳定性或细胞摄取。例如，可以制备PNA-DNA嵌合体，它可以组合PNA和DNA的有利特性。这些嵌合体允许DNA识别酶如RNase H和DNA聚合酶与其DNA部分相互作用，而PNA部分会提供高结合亲和力和特异性。可以使用适当长度的接头连接PNA-DNA嵌合体，根据碱基堆积、核碱基之间的键数和取向进行选择(Hyrup，1996，同上)。可以按照Hyrup，1996，同上，和Finn等，1996，Nucleic Acids Res.24(17)：3357-63进行PNA-DNA嵌合体的合成。例如，可以用标准的亚磷酰胺偶联化学和修饰的核苷类似物在固体支持物上合成DNA链。可以使用化合物如5’-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5’-脱氧-胸腺嘧啶亚磷酰胺作为PNA和DNA的5’末端之间的连接(Mag等，1989，Nucleic Acids Res.17：5973-88)。然后逐步偶联PNA单体，以产生具有5’PNA区段和3’DNA区段的嵌合分子(Finn等，1996，Nucleic Acids Res.24(17)：3357-63)。或者，可以合成具有5’DNA区段和3’PNA区段的嵌合分子(Peterser等，1975，Bioorganic Med.Chem.Lett.5：1119-11124)。

在另一些实施方案中，寡核苷酸可以包含其它附加基团，例如肽(例如为了在体内靶向宿主细胞受体)或辅助跨细胞膜(参阅如Letsinger等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：6553-6556；Lemaitre等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：648-652；国际公开号WO88/09810)或血脑屏障(参阅如国际公开号WO89/10134)转运的因子。此外，可以用杂交触发的切割剂(参阅如Krol等，1988，Bio/Techniques6：958-976)或嵌入剂(参阅如Zon，1988，Pharm.Res.5：539-549)修饰寡核苷酸。为此，寡核苷酸可以与另一分子例如肽、杂交触发的交联剂、转运剂、杂交触发的切割剂等连接。

抗体组合物

在一个实施方案中，将与一种或多种本发明生物标志物的一种或多种蛋白质产物特异性结合的抗体施用于受试者(优选人)，以预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状。在另一实施方案中，将与一种或多种本发明生物标志物的一种或多种蛋白质产物特异性结合的任何抗体组合施用于受试者(优选人)，以预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状。在具体的实施方案中，将与一种或多种本发明生物标志物的一种或多种蛋白质产物特异性结合的一种或多种抗体与其它类型的治疗(如NSAIDS)一起施用于受试者(优选人)，以预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状。在某些实施方案中，将本领域已知的与一种或多种本发明生物标志物的一种或多种蛋白质产物特异性结合的抗体单独或与其它类型治疗(如NSAIDS)一起施用于受试者(优选人)，以预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状。在其他实施方案中，不将本领域已知的与一种或多种本发明生物标志物的一种或多种蛋白质产物特异性结合的抗体单独或与其它类型治疗(如NSAIDS)一起施用于受试者(优选人)，以预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状。

可以使用本领域技术人员已知的多种递送***对受试者(优选人)施用与一种或多种本发明生物标志物的一种或多种蛋白质产物特异性结合的一种或多种抗体。例如，可以通过脂质体包裹、微颗粒或微胶囊施用这些抗体。参阅如美国专利No.5,762,904、美国专利No.6,004,534和国际公开No.WO99/52563。此外，可以使用能表达抗体的重组细胞或能表达抗体的逆转录病毒、其他病毒载体或非病毒载体施用这些抗体。

与一种或多种本发明生物标志物的一种或多种蛋白质产物特异性结合的抗体可得自任何已知的来源。或者，与一种或多种本发明生物标志物的一种或多种蛋白质产物特异性结合的抗体可以用本领域已知合成抗体的任何方法产生，尤其是通过化学合成或优选地通过重组表达技术产生。

抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼化(camelised)抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)(参阅如Bird等(1988)Science242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883)、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)和抗独特型(抗Id)抗体(包括如针对本发明抗体的抗Id抗体)以及以上任何一种的抗原结合和/或表位结合片段。本文使用的术语“抗体”表示免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以为任何类型(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂)或亚类。免疫球蛋白分子的免疫活性片段的实例包括F(ab)片段(由VL、VH、CL和CH1结构域组成的一价片段)和F(ab’)2片段(包含在铰链区通过二硫键连接的两个F(ab)片段的二价片段)，它们可通过用酶如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶处理相应抗体而产生。免疫活性片段还包括但不限于Fd片段(由VH和CH1结构域组成)、Fv片段(由抗体单臂的VL和VH结构域组成)、dAb片段(由VH结构域组成；Ward等，(1989)Nature341：544-546)和分离的互补性决定区(CDR)。与抗原特异性结合的抗体可以使用本领域已知合成抗体的任何方法产生，尤其通过化学合成或优选地通过重组表达技术产生。

与抗原特异性结合的多克隆抗体可以使用本领域熟知的多种方法产生。例如，可以将人抗原施用于多种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，以诱导产生含有对所述人抗原具有特异性的多克隆抗体的血清。取决于宿主物种，可以使用多种佐剂提高免疫应答，包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔槭血蓝蛋白、二硝基苯酚和可能有用的人佐剂如BCG(卡介苗)和小棒杆菌。这些佐剂也为本领域所熟知。

术语“单特异性抗体”指对特定靶标如表位表现单结合特异性和亲和力的抗体。该术语包括单克隆抗体。单克隆抗体可以使用本领域已知的各种技术制备，包括使用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术或这些技术的组合。参阅如美国专利No.RE32,011、4,902,614、4,543,439、4,411,993和4,196,265；Kennett等(编辑)，《MonoclonalAntibodies，Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses》，Plenum Press(1980)；和Harlow和Lane(编辑)，《Antibodies.ALaboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)，均引入本文为参考。例如，单克隆抗体可用杂交瘤技术制备，包括本领域已知的技术和下文教导的技术，例如Harlow等，《Antibodies：ALaboratory Manual》，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版.1988)；Hammerling，等，《Monoclonal and T-cell Hybridomas》563-681(Elsevier，N.Y.，)(所述参考以其整体引入本文为参考)。也可使用通过重组技术产生抗体的其它技术来构建单克隆抗体(例如以下所述技术：William D.Huse等，1989，Science，246：1275-1281；L.Sastry等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：5728-5732；和Michelle Alting-Mees等，Strategies in Molecular Biology，3：1-9(1990)，其中包括可从Stratacyte，La Jolla，Calif.获得的商品***)。本文使用的术语“单克隆抗体”不仅限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指来自单个克隆的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，不涉及其产生方法。

使用杂交瘤技术生产和筛选特异性抗体的方法是常规的，并为本领域所熟知。简言之，可以使用本发明生物标志物的蛋白质产物免疫小鼠，一旦检测到免疫应答，例如，在小鼠血清中检测到对所述蛋白质有特异性的抗体，则收获小鼠的脾并分离脾细胞。然后使用熟知的技术将所述脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞融合，如来自可从ATCC获得的细胞系SP20的细胞。通过有限稀释选择和克隆杂交瘤。此外，可以使用RIMMS(多点重复免疫)技术来免疫动物(Kilptrack等，1997，Hybridoma16：381-9，以其整体引入本文为参考)。然后用本领域已知方法测定杂交瘤克隆中分泌能结合本发明多肽的抗体的细胞。通常可通过使用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠来制备含高水平抗体的腹水。

因此，本发明提供通过培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞来产生抗体的方法，其中优选通过以下方法产生所述杂交瘤：将分离自用本发明生物标志物蛋白质产物免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后在融合得到的杂交瘤中筛选分泌能与所述蛋白质或蛋白质片段结合的抗体的杂交瘤克隆。

识别本发明生物标志物蛋白质产物的特异性表位的抗体片段可以使用本领域技术人员已知的任何技术产生。例如，可以通过用酶如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)蛋白水解性切割免疫球蛋白分子来产生本发明的Fab和F(ab’)2片段。F(ab’)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链CH1结构域。此外，本发明抗体还可以使用本领域已知的多种噬菌体展示方法产生。

在噬菌体展示方法中，将功能性抗体结构域展示到携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面。具体地，从动物cDNA文库(如人或小鼠受感染组织的cDNA文库)中扩增编码VH和VL结构域的DNA序列。通过PCR将编码VH和VL结构域的DNA与scFv接头重组在一起，并克隆到噬粒载体中。将载体电穿孔进大肠杆菌中，并使用辅助噬菌体感染大肠杆菌。用于这些方法的噬菌体一般是丝状噬菌体，包括fd和M13，并且VH和VL结构域通常与噬菌体基因III或基因VIII重组融合。可以使用抗原选择或鉴定表达与特定抗原结合的抗原结合结构域的噬菌体，例如使用标记抗原或结合或捕获到固体表面或珠子上的抗原。可用于产生本发明抗体的噬菌体展示方法实例包括以下公开的那些：Brinkman等，1995，J.Immunol.Methods 182：41-50；Ames等，1995，J.Immunol.Methods 184：177-186；Kettleborough等，1994，Eur.J.Immunol.24：952-958；Persic等，1997，Gene187：9-18；Burton等，1994，Advances in Immunology57：191-280；PCT申请No.PCT/GB91/O1 134；国际公开No.WO90/02809、WO91/10737、WO92/01047、WO92/18619、WO93/1 1236、WO95/15982、WO95/20401和WO97/13844；以及美国专利No.5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108；其中每篇均以其整体引入本文为参考。

如以上参考文献所述，噬菌体选择以后，可以从噬菌体分离抗体编码区并用于产生完整抗体(包括人抗体)或任何其它期望的抗原结合片段，并在任何期望的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，如下文所述。也可以使用本领域熟知的方法使用重组制备Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术，例如如以下公开的技术：国际公开No.WO92/22324；Mullinax等，1992，BioTechniques12(6)：864-869；Sawai等，1995，AJRI 34：26-34；和Better等，1988，Science240：1041-1043(所述参考均以其整体引入本文为参考)。

为了产生完整抗体，可以使用包含VH或VL核苷酸序列、限制性位点和保护限制性位点的侧翼序列的PCR引物来扩增scFv克隆中的VH或VL序列。可以使用本领域技术人员已知的克隆技术将PCR扩增的VH结构域克隆进表达VH恒定区如人γ4恒定区的载体，将PCR扩增的VL结构域克隆进表达VL恒定区如人κ或λ恒定区的载体。用于表达VH或VL结构域的载体优选包含EF-1α启动子、分泌信号、可变结构域克隆位点、恒定结构域以及选择标记如新霉素。还可以将VH和VL结构域克隆进表达必要恒定区的一种载体。然后使用本领域技术人员已知的技术将重链转换载体和轻链转换载体共转染进细胞系，以产生表达全长抗体如IgG的稳定或瞬时细胞系。

就一些应用而言，包括抗体在人中的体内使用和体外检测测定，可能优选使用人抗体或嵌合抗体。对于人受试者的治疗性处理，特别期望全人抗体。可以通过本领域已知的多种方法产生人抗体，包括上述使用来自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。还可参阅美国专利No.4,444,887和4,716,111和国际公开No.WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735和WO91/10741；其中每篇均以其整体引入本文为参考。

还可以通过转基因动物产生抗体。具体地，可以用不能表达功能性内源免疫球蛋白但能表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生人抗体。例如，可将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机引入或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。或者，除了人重链和轻链基因以外，还可以将人可变区、恒定区和多变区引入小鼠胚胎干细胞。可以在通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座的同时或分开地使小鼠轻链和重链免疫球蛋白基因无功能。具体地，J_H区的纯合缺失防止内源性抗体的生成。可以扩增经修饰的胚胎干细胞并微注射进胚泡，以产生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠产生表达人抗体的纯合后代。以正常方式使用选定的抗原如全部或部分的本发明多肽免疫转基因小鼠。可以使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得针对所述抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，随后经历类型转换和体细胞突变。因此，可以使用这样的技术产生有治疗用途的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。这种人抗体产生技术的概述参阅Lonberg和Huszar(1995，Int.Rev.Immunol.13：65-93)。关于这种产生人抗体和人单克隆抗体的技术和产生这些抗体的操作的详细讨论参阅如国际公开No.WO98/24893，WO96/34096和WO96/33735；和美国专利No.5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598，以其整体引入本文为参考。此外，可以使公司如Abgenix，Inc.(Freemont，CA)和Genpharm(San Jose，CA)使用与上述相似的技术提供针对选定抗原的人抗体。

例如，美国专利No.5,849,992描述了在转基因哺乳动物乳腺中表达抗体的方法。构建转基因，所述转基因包含乳特异性启动子以及编码目的抗体和分泌信号序列的核酸。这些雌性转基因动物产生的乳包含分泌到其中的目的抗体。可以从乳中纯化抗体，或在一些应用中直接使用。

嵌合抗体是抗体的不同部分来自不同免疫球蛋白分子的一种分子。制备嵌合抗体的方法为本领域已知。参阅如Morrison，1985，Science229：1202；Oi等，1986，BioTechniques4：214；Gillies等，1989，J.Immunol.Methods125：191-202；和美国专利No.5,807,715、4,816,567、4,816,397和6,331,415，均以其整体引入本文为参考。

人源化抗体是能结合预定抗原的抗体或其变体或片段，其包含基本具有人免疫球蛋白氨基酸序列的框架区和基本具有非人免疫球蛋白氨基酸序列的CDR。人源化抗体基本包含全部的至少一个、通常两个可变结构域(Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fabc、Fv)，其中全部或基本全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的CDR区，全部或基本全部的框架区为人免疫球蛋白共有序列的框架区。优选地，人源化抗体还包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为至少部分的人免疫球蛋白。一般地，所述抗体将含有轻链以及重链的至少可变结构域。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。人源化抗体可以选自任何类型的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，并且可以选自任何同种型，包括IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。期望人源化抗体表现细胞毒活性时，恒定结构域通常为固定补体的恒定结构域，类型一般是IgG₁。如果不期望这种细胞毒活性时，恒定区可以为IgG₂类型。人源化抗体可以包含来自一种以上类型或同种型的序列，选择特定的恒定区以优化期望的效应子功能在本领域普通技术人员的能力范围内。人源化抗体的框架和CDR区不必与母体序列精确对应，例如可以通过替换、***或缺失至少一个残基诱变供体CDR或共有框架区，使得该位点的CDR或框架残基不与共有序列或输入抗体对应。然而，这些突变并不广泛。通常，至少75％的人源化抗体残基与母体FR和CDR序列中的残基对应，更经常为90％，最优选大于95％。可以用多种本领域已知的技术产生人源化抗体，包括但不限于CDR移植(欧洲专利No.EP239,400；国际公开No.WO91/09967；和美国专利No.5,225,539、5,530,101和5,585,089)，表面覆盖(veneering)或表面重建(resurfacing)(欧洲专利No.EP592,106和EP519,596；Padlan，1991，Molecular Immunology28(4/5)：489-498；Studnicka等，1994，Protein Engineering7(6)：805-814；和Roguska等，1994，PNAS91：969-973)，链混排(chain shuffling)(美国专利No.5,565,332)和例如下文中公开的技术：美国专利No.6,407,213、美国专利No.5,766,886、WO9317105、Tan等，2002，J.Immunol.169：1119-25，Caldas等，2000，Protein Eng.13(5)：353-60，Morea等，2000，Methods20(3)：267-79，Baca等，1997，J.Biol.Chem.272(16)：10678-84，Roguska等，1996，Protein Eng.9(10)：895-904，Couto等，1995，CancerRes.55(23Supp)：5973s-5977s，Couto等，1995，Cancer Res.55(8)：1717-22，Sandhu JS，1994，Gene150(2)：409-10，和Pedersen等，1994，J.Mol.Biol.235(3)：959-73。常以CDR供体抗体的相对应残基替换框架区的框架残基，以改变、优选提高抗原结合。这些框架替换通过本领域熟知的方法鉴定，例如，通过模拟CDR和框架残基的相互作用鉴定对抗原结合具有重要性的框架残基，进行序列比较以鉴定在特定位置不常见的框架残基。(参阅如Queen等，美国专利No.5,585,089；和Riechmann等，1988，Nature332：323，以其整体引入本文为参考)。

可以通过本领域熟知的方法产生单结构域抗体，例如缺乏轻链的抗体。参阅Riechmann等，1999，J.Immune.231：25-38；Nuttall等，2000，Curr.Pharm.1(3)：253-263；Muylderman，2001，J.Biotechnol.74(4)：277302；美国专利No.6,005,079；和国际公开No.WO94/04678，WO94/25591和WO01/44301，均以其整体引入本文为参考。

此外，可以使用本领域技术人员熟知的技术将与抗原特异性结合的抗体再用于产生“模拟”抗原的抗独特型抗体。(参阅如Greenspan&Bona，1989，FASEB J.7(5)：437-444；和Nissinoff，1991，J.Immunol.147(8)：2429-2438)。这些抗体可以单独或与其它治疗组合使用，以预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状。

本发明包括多核苷酸，所述多核苷酸包含编码与抗原特异性结合的抗体或其片段的核苷酸序列。本发明还包括在高严谨、中等或低严谨杂交条件下与编码本发明抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。

可以通过本领域已知的任何方法获得所述多核苷酸并测定所述多核苷酸的核苷酸序列。可以用本领域熟知的方法测定编码已知抗体的核苷酸序列，即以产生编码该抗体的核酸的方式装配编码特定氨基酸的核苷酸密码子。编码所述抗体的这些多核苷酸可以装配自化学合成的寡核苷酸(例如Kutmeier等，1994，BioTechniques17：242所述)，简言之，它包括合成重叠寡核苷酸，所述寡核苷酸含有编码所述抗体或其片段或变体的部分，退火并连接这些寡核苷酸，接着通过PCR扩增连接的寡核苷酸。

或者，可以由来自合适来源的核酸产生编码抗体的多核苷酸。如果含编码特定抗体的核酸的克隆无法获得，但抗体分子的序列已知，则可以化学合成获得编码所述免疫球蛋白的核酸，或者使用可与所述序列的3’和5’端杂交的合成引物通过PCR扩增获得，或使用对待鉴定的特定基因序列(如编码该抗体的来自cDNA文库的cDNA克隆)具有特异性的寡核苷酸探针通过克隆从合适的来源(例如，从表达所述抗体的任何组织或细胞，如选择用于表达本发明抗体的杂交瘤细胞中产生的抗体cDNA文库或cDNA文库，或从所述组织或细胞中分离的核酸，优选polyA+RNA)获得。接着可以使用本领域熟知的任何方法将通过PCR制备的扩增核酸克隆进可复制克隆载体。

测定抗体的核苷酸序列以后，可以用本领域熟知的操作核苷酸序列的方法例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(参阅如以下描述的技术：Sambrook等，1990，《Molecular Cloning，A LaboratoryManual》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY和Ausubel等编辑，1998，《Current Protocols inMolecular Biology》，John Wiley&Sons，NY，均以其整体引入本文为参考)操作所述抗体的核苷酸序列，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸替换、缺失和/或***。

一旦获得编码本发明的抗体分子、抗体分子的轻链或重链或其片段(优选但不必须地含有重链或轻链可变结构域)的多核苷酸以后，就可以使用本领域熟知的技术通过重组DNA技术制备用于产生所述抗体分子的载体。

在一个优选的实施方案中，在哺乳动物细胞中产生单克隆抗体。表达所述克隆抗体或其抗原结合片段的优选哺乳动物宿主细胞包括与DHFR选择标记如Kaufman和Sharp(1982，Mol.Biol.159：601-621)中所述一起使用的中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin(1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220)、淋巴细胞系如NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞、COS细胞以及来自转基因动物如转基因哺乳动物的细胞。例如，所述细胞为哺乳动物上皮细胞。

除了编码高变免疫球蛋白结构域的核酸序列以外，重组表达载体还可以携带其他序列，如调节载体在宿主细胞中复制的序列(如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因便于选择已在其中引入载体的宿主细胞(参阅如美国专利No.4，399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，选择标记基因通常赋予已在其中引入载体的宿主细胞药物抗性，如G418、潮霉素或氨甲喋呤抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(和氨甲喋呤选择/扩增一起用于dhfr^-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。

在重组表达本发明抗体或其抗原结合部分的示例性***中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr^-CHO细胞。在重组表达载体中，抗体重链和轻链基因分别与增强子/启动子调节元件(如来自SV40、CMV、腺病毒等，如CMV增强子/AdMLP启动子调节元件和SV40增强子/AdMLP启动子调节元件)有效连接，以驱动所述基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，它允许用氨甲喋呤选择/扩增选择已经转染了载体的CHO细胞。培养筛选的转化体宿主细胞以使其表达抗体重链和轻链，并从培养基中回收完整抗体。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体、转染宿主细胞、筛选转化体、培养宿主细胞和从培养基回收抗体。例如，一些抗体可以通过A蛋白和G蛋白亲合层析分离。

对于包括Fc结构域的抗体，抗体产生***优选地合成Fc区已糖基化的抗体。例如，IgG分子的Fc区在CH2结构域的天冬酰胺297处糖基化。该天冬酰胺为双天线型寡糖修饰的位点。已经证明Feγ受体和补体C1q介导的效应子功能需要这种糖基化(Burton和Woof，1992，Adv.Immunol.51：1-84；Jefferis等，1998，Immunol.Rev.163：59-76)。在优选的实施方案中，在天冬酰胺297相应残基已适当地糖基化的哺乳动物表达***中产生Fc结构域。Fc结构域还可以包括其它真核翻译后修饰。

通过重组表达产生了抗体分子以后，就可以用本领域已知的纯化免疫球蛋白分子的任何方法进行纯化，例如通过层析(如离子交换、亲和、尤其是A蛋白以后的特异性抗原亲和，体积排阻柱层析)、离心、差异溶解度，或通过纯化蛋白质的任何其它标准技术。此外，可将所述抗体或其片段与本领域已知的异源多肽融合，以便于纯化。

基因治疗技术

基因治疗指通过对受试者施用经表达或可表达核酸而进行的治疗。本领域可用的任何基因治疗的方法均可根据本发明使用。下文描述了示例性方法。

在具体的实施方案中，可以通过基因治疗的方式施用一种或多种本发明生物标志物的一种或多种反义寡核苷酸，以预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状。在其他实施方案中，通过基因治疗的方式施用一种或多种核酸分子，以预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状，所述核酸分子包含编码与一种或多种本发明生物标志物的一种或多种蛋白质产物特异性结合的一种或多种抗体的核苷酸。在其他实施方案中，通过基因治疗的方式施用一种或多种核酸分子，以预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状，所述核酸分子包含编码一种或多种本发明生物标志物的一种或多种蛋白质产物或其类似物、衍生物或片段的核苷酸。在其他实施方案中，通过基因治疗的方式施用一种或多种核酸分子，以预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状，所述核酸分子包含编码一种或多种本发明生物标志物的一种或多种蛋白质产物的一种或多种显性负多肽的核苷酸。

基因治疗方法的一般性综述参阅Goldspiel等，1993，ClinicalPharmacy12：488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy3：87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan，1993，Science260：926-932；和Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62：191-217；May，1993，TIBTECH11(5)：155-215)。可以使用的重组DNA技术领域公知方法描述于Ausubel等(编辑)，1993，《Current Protocols in Molecular Biology》，John Wiley&Sons，NY；和Kriegler，1990，《Gene Transfer and Expression，A LaboratoryManual》，Stockton Press，NY。

在一个方面中，本发明的组合物包含编码与一种或多种本发明生物标志物的一种或多种蛋白质产物特异性结合的一种或多种抗体的核酸序列，所述核酸序列是在合适宿主中表达一种或多种抗体的表达载体的一部分。具体地，这些核酸序列具有与所述抗体有效连接的启动子，所述启动子为诱导型或组成型，任选地为组织特异性。

在另一方面中，本发明的组合物包含编码一种或多种本发明生物标志物的一种或多种蛋白质产物的显性负多肽的核酸序列，所述核酸序列是在合适宿主中表达显性负多肽的表达载体的一部分。具体地，这些核酸序列具有与所述显性失活多肽有效连接的启动子，所述启动子是诱导型或组成型，任选地为组织特异性。在另一具体实施方案中，使用这样的核酸分子，其中所述显性负编码序列和任何其它期望序列的侧翼为促进在基因组中期望位点发生同源重组的区域，从而提供显性负核酸的染色体内表达(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：8932-8935；Zijlstra等，1989，Nature342：435-438)。

可以直接或者间接向患者递送核酸，在直接递送情况下患者直接接触所述核酸或携带核酸的载体，在间接递送情况下首先用所述核酸体外转化细胞，然后移植入患者。这两种方法分别称为体内或离体基因治疗。

在具体的实施方案中，直接体内施用核酸序列，其表达产生编码产物。这可通过本领域已知众多方法中的任何一种来实现，例如通过将其构建为适当核酸表达载体的一部分并施用，使其进入细胞内，如通过用缺陷型或减毒逆转录病毒或其它病毒载体感染(参阅美国专利No.4,980,286)，或直接注射裸DNA，或使用微粒轰击(如基因枪；Biolisitic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被，包裹在脂质体、微粒或微胶囊中，或将它们与已知入核的肽连接施用，将其与参与受体介导的胞吞作用的配体连接施用(参阅如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)(可用于靶向特异性表达该受体的细胞类型)等。在另一实施方案中，可以形成核酸-配体复合物，其中配体包含致溶性病毒肽以破坏内体，从而使所述核酸免遭溶酶体降解。在另一实施方案中，可以通过靶向特异性受体将核酸体内靶向细胞特异性摄取和表达(参阅如国际公开No.WO92/06180公开日1992年4月16日(Wu等)；WO92/22635公开日1992年12月23日(Wilson等)；WO92/20316公开日1992年11月26日(Findeis等)；WO93/14188公开日1993年7月22日(Clarke等)，WO93/20221公开日1993年10月14日(Young))。或者，可通过同源重组将核酸引入细胞内并整合进宿主细胞DNA中进行表达(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：8932-8935；Zijlstra等，1989，Nature342：435-438)。

例如，可以使用逆转录病毒载体。这些逆转录病毒载体已经修饰而删除了不是包装病毒基因组和整合进宿主细胞DNA所必需的逆转录病毒序列。将用于基因治疗的编码目的抗体或目的蛋白质或其片段的核酸序列克隆进一种或多种载体中，所述载体便于将所述基因递送进患者。逆转录病毒的更详细描述可见于Boesen等，1994，Biotherapy6：291-302，其中描述了使用逆转录病毒递送mdr1基因到造血干细胞，以使造血干细胞对化疗更具抗性。展示逆转录病毒载体在基因治疗中应用的其它参考文献为Clowes等，1994，J.Clin.Invest.93：644-651；Kiem等，1994，Blood83：1467-1473；Salmons和Gunzberg，1993，Human Gene Therapy4：129-141以及Grossman和Wilson，1993，Curr. Opin.in Genetics and Devel.3：110-114。

腺病毒是可用于基因治疗的其它病毒载体。腺病毒是向呼吸道上皮递送基因特别有力的载体。腺病毒天然感染呼吸道上皮，引起轻度疾病。基于腺病毒的递送***的其它目标为肝、中枢神经***、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能感染非***细胞的优点。Kozarsky和Wilson，1993，Current Opinion in Genetics and Development3：499-503提供了基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout等，1994，Human Gene Therapy5：3-10展示了腺病毒载体将基因转移到猕猴呼吸道上皮细胞中的用途。腺病毒在基因治疗中应用的其它实例可以见Rosenfeld等，1991，Science252：431-434；Rosenfeld等，1992，Cell68：143-155；Mastrangeli等，1993，J.Clin.Invest.91：225-234；PCT公开WO94/12649；和Wang，等，1995，Gene Therapy2：775-783。在优选的实施方案中，使用腺病毒载体。

还已经提出将腺相关病毒(AAV)用于基因治疗(Walsh等，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300；美国专利No.5,436,146)。

另一种基因治疗方法涉及通过诸如电穿孔、脂质体转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染的方法将基因转移到组织培养的细胞中。转移方法通常包括将选择标记转移进细胞。然后将细胞置于选择下以分离已经摄入并表达转移基因的细胞。然后将这些细胞递送至患者。

在该实施方案中，在体内施用得到的重组细胞之前，先将核酸引入细胞。这种引入可通过本领域已知的任何方法实现，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用含所述核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、质体融合等。用于将外源基因引入细胞的多种技术为本领域已知(参阅如Loeffler和Behr，1993，Meth.Enzymol.217：599-618；Cohen等，1993，Meth.Enzymol.217：618-644；Cline，1985，Pharmac.Ther.29：69-92)，并可根据本发明使用，只要不破坏受体细胞必要的发育和生理功能。所述技术应提供核酸向细胞的稳定转移，以使所述核酸可由细胞表达，并优选可由其细胞后代遗传并表达。

可以用本领域已知的多种方法将得到的重组细胞递送至患者。重组血细胞(如造血干细胞或祖细胞)和/或软骨细胞优选静脉内施用。拟使用的细胞量取决于期望的效果、患者状态等，并且可由本领域技术人员确定。

可以引入核酸用于基因治疗的细胞包括任何期望的可用细胞类型，包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；多种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，如得自骨髓、脐带血、外周血、胎肝等的细胞。

在优选的实施方案中，用于基因治疗的细胞为患者自体细胞。

在一个将重组细胞用于基因治疗的实施方案中，将编码目的抗体、目的蛋白质或其片段的核酸序列引入细胞，以使其可由该细胞或其后代表达，然后体内施用重组细胞以产生疗效。在具体的实施方案中，使用干细胞或祖细胞。能体外分离和维持的任何干细胞和/或祖细胞均可有利地根据本发明的这个实施方案使用。(参阅如公开于1994年4月28日的国际公开No.WO94/08598；Stemple和Anderson，1992，Cell71：973-985；Rheinwald，1980，Meth.Cell Bio.21A：229；和Pittelkow和Scott，1986，Mayo Clinic Proc.61：771)。

可用于控制编码目的抗体、目的蛋白质或其片段的核酸序列表达的启动子可以是组成型、诱导型或组织特异性的。非限制性实例包括SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，1981，Nature290：304-310)、劳斯肉瘤病毒的3’长末端重复中含有的启动子(Yamamoto，等，1980，Cell22：787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：1441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等，1982，Nature296：39-42)；原核表达载体如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75：3727-3731)或tac启动子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：21-25)；还参阅″Useful proteins from recombinant bacteria″in Scientific American，1980，242：74-94；植物表达载体，包含胭脂碱合成酶启动子区(Herrera-Estrella等，Nature303：209-213)或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner等，1981，Nucl.Acids Res.9：2871)和光合作用酶核酮糖二磷酸羧化酶(Herrera-Estrella等，1984，Nature310：115-120)；来自酵母或其它真菌的启动子元件如Gal4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子，以及表现组织特异性并已被用于转基因动物的以下动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等，1984，Cell38：639-646；Ornitz等，1986，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald，1987，Hepatology7：425-515)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature315：115-122)；在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等，1984，Cell38：647-658；Adames等，1985，Nature318：533-538；Alexander等，1987，Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)、在睾丸、***、淋巴样细胞和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等，1986，Cell45：485-495)、在肝脏中有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等，1987，Genes and Devel.1：268-276)、在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等，1985，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer等，1987，Science235：53-58；在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等，1987，Genes and Devel.1：161-171)、在髓样细胞中有活性的β-珠蛋白基因控制区(Mogram等，1985，Nature315：338-340；Kollias等，1986，Cell46：89-94；在脑的少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead等，1987，Cell48：703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani，1985，Nature314：283-286)和在下丘脑中有活性的***释放激素基因控制区(Mason等，1986，Science234：1372-1378)。

在具体的实施方案中，待引入用于基因治疗的核酸包含与编码区有效连接的诱导型启动子，从而可通过控制适当转录诱导物的存在与否来控制所述核酸的表达。

5.19.2抗炎治疗

表明抗炎剂已在骨关节炎的治疗、控制和改善中显示了成功，并且现在是这些疾病的普遍而标准的治疗。可以将本领域技术人员公知的任何抗炎药用于本发明的组合物和方法中。抗炎药的非限制性实例包括非甾体类抗炎药(NSAID)、甾体类抗炎药、β-激动剂、anticholingeric agent和甲基黄嘌呤。NSAID的实例包括但不限于阿司匹林、布洛芬、塞来昔布(CELEBREX^TM)、双氯芬酸(VOLTAREN^TM)、依托度酸(LODINE^TM)、非诺洛芬(NALFON^TM)、吲哚美辛(INDOCIN^TM)、酮洛酸(TORADOL^TM)、奥沙普秦(DAYPRO^TM)、萘丁美酮(RELAFEN^TM)、舒林酸(CLINORIL^TM)、托美丁(TOLECTIN^TM)、罗非昔布(VIOXX^TM)、萘普生(ALEVE^TM、NAPROSYN^TM)、酮洛芬(ACTRON^TM)和萘丁美酮(RELAFEN^TM)。这些NSAID通过抑制环氧合酶(如COX-1和/或COX-2)而发挥功能。甾体抗炎剂的实例包括但不限于糖皮质激素类、***(DECADRON^TM)、可的松、氢化可的松、***(DELTASONE^TM)、***龙、曲安西龙、柳氮磺吡啶和类花生酸，如***素、血栓素和白三烯。

5.20药物组合物

使用本发明方法鉴定的生物活性化合物或其可药用盐可施用于患骨关节炎的患者，优选哺乳动物，更优选人。在具体的实施方案中，将化合物或其可药用的盐施用于患以下阶段骨关节炎的患者，优选哺乳动物，更优选人：轻度、中度、显著或重度。在另一实施方案中，将化合物或其可药用盐作为针对骨关节炎的预防措施施用于患者，优选哺乳动物，更优选人。根据这些实施方案，患者可以为儿童、成人或老年人，其中“儿童”是年龄在24个月和18岁之间的受试者，“成人”是年龄在18岁或更年长的受试者，而“老年人”是年龄在65岁或更年长的受试者。

施用于患者时，化合物或其可药用盐优选作为组合物的组分施用，所述组合物任选地包含可药用载体。组合物可以经口施用或通过任何其它方便的途径施用，例如经输注或推注，通过上皮或粘膜内层(如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并可以与另一种生物活性剂一起施用。可以全身性或局部施用。多种递送***如脂质体包裹、微粒、微胶囊、胶囊等是已知的，并可用于施用所述化合物及其可药用盐。

给药方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、经口、舌下、鼻内、脑内、***内、透皮、直肠、吸入或外用，特别是外用于耳、鼻、眼或皮肤。给药模式由医师判断。多数情况下，施用将导致所述化合物或其可药用盐释放到血流中。

在具体的实施方案中，可能期望局部施用化合物或其可药用盐。这可以通过以下方式实现，例如但不仅限于手术期间局部输注、表面涂敷如手术后与创伤敷料一起表面涂敷、注射、导管手段、栓剂方式，或植入物方式，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状材料，包括膜如sialastic膜或纤维。在具体的实施方案中，化合物局部施用于受骨关节炎影响的关节。

在某些实施方案中，可能期望将所述化合物或其可药用盐以任何合适的途径引入中枢神经***，所述方式包括脑室内、鞘膜内和硬膜外注射。脑室内注射可以用脑室内导管辅助，例如与储药器如Ommaya储药器连接的室内导管。

也可以经肺施用，例如使用吸入器或喷雾器和带雾化剂的配方，或经在碳氟化合物或合成肺表面活性剂中灌注。在某些实施方案中，所述化合物及其可药用盐可以与传统粘合剂和赋形剂如甘油三酯一起配制成栓剂。

在另一实施方案中，可以在小泡中尤其是脂质体中递送化合物及其可药用盐(参阅Langer，1990，Science249：1527-1533；Treat等，《Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer》，Lopez-Berestein和Fidler(编辑)，Liss，New York，353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同上，317-327页；一般参阅同上)。

在另一实施方案中，可以在控释***中递送化合物及其可药用盐(参阅如Goodson，《Medical Applications of Controlled Release》，同上，第2卷，115-138页(1984))。也可以使用Langer，1990，Science249：1527-1533综述中讨论的其它控释***。在一个实施方案中，可以使用泵(参阅Langer，同上；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald等，1980，Surgery88：507；Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一实施方案中，可以使用聚合物材料(参阅《Medical Applications of Controlled Release》，Langer和Wise(编辑)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；《Controlled DrugBioavailability，Drug Product Design and Performance》，Smolen和Ball(编辑)，Wiley，New York；Ranger和Peppas，1983，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；还参阅Levy等，1985，Science228：190；During等，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71：105)。在另一实施方案中，可将控释***置于所述化合物或其可药用盐的靶RNA附近，从而只需要全身剂量的一部分。

本文所述化合物可以引入适于施用的药物组合物中。这些组合物通常包含活性化合物和可药用载体。本文所用表述“可药用载体”包括任何及所有与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这些介质和物质在药物活性物质中的用途为本领域所熟知。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或物质以外，考虑其在组合物中的用途。还可以向组合物中引入补充性活性化合物。

本发明包括用于调节目的多肽或核酸的表达或活性的药物组合物的制备方法。这些方法包括将可药用载体与调节目的多肽或核酸的表达或活性的物质配制在一起。这些组合物还可以包括其他的活性剂。因此，本发明还包括通过将可药用载体与调节目的多肽或核酸的表达或活性的物质以及一种或多种其他活性化合物配制在一起来制备药物组合物的方法。

将本发明的药物组合物配制成与其期望的给药途径相容。给药途径的实例包括胃肠外给药，如静脉内、皮内、皮下、经口(如吸入)、经皮肤(外用)、经粘膜和直肠给药。优选静脉内给药。用于胃肠道外、皮内或皮下应用的溶液或悬液可包括以下成分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；鳌合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及张力调节剂如氯化钠或葡萄糖。pH可以用酸或碱如盐酸或氢氧化钠调节。胃肠道外制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制造的多剂量小管中。

适于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(为水溶性时)或分散剂以及用于即时制备无菌注射溶液或分散剂的无菌粉剂。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲液(PBS)。在所有情况下，组合物都必须是无菌的，并且应该是程度为存在易注射性的流体。它必须在制造和保存条件下是稳定的，并且必须对微生物如细菌和真菌的污染作用提供保护。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可以通过以下方法维持适当的流动性：使用包衣如卵磷脂，维持需要的颗粒大小(对于分散剂的情况)、使用表面活性剂。可通过多种抗细菌和抗真菌剂实现对微生物作用的保护，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可通过在组合物中包括延迟吸收的成分例如单硬脂酸铝和明胶可以实现注射组合物的延长吸收。

可以如下制备无菌注射溶液：将所需量的活性化合物(如多肽或抗体)掺入含有所需的上述一种成分或成分组合的适当溶剂中，然后过滤除菌。一般地，可以通过将活性化合物掺入无菌载体来制备分散剂，所述载体中含有基础分散介质和所需的上述其它成分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥预先无菌过滤的溶液，从而获得活性成分和另外的期望成分的粉剂。

经口组合物一般包括惰性稀释剂或食用载体。可将其封装在明胶胶囊中或压成片剂。对于经口治疗性施用的目的，可将活性化合物与赋形剂掺在一起并以片剂、锭剂或胶囊剂形式使用。还可以食用流体载体制备经口组合物用作漱口剂，其中流体载体中的化合物经口使用和漱口，并吐出或咽下。

药物相容性粘合剂和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分而包括在内。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以含有任何一种以下成分或相似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖，崩解剂如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如二氧化硅胶体；甜味剂如蔗糖或糖精；或芳香剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙味香精。

对于吸入给药，化合物以气溶胶喷雾的形式由含有合适推进剂的压力容器或分配器或喷雾器递送，所述推进剂例如气体如二氧化碳。

也可以通过经粘膜或皮肤方式全身给药。对于经粘膜或皮肤给药，可以在配方中使用对于待透过屏障适当的通透剂。这些通透剂为本领域所公知，例如，对经粘膜给药而言可包括去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可通过使用鼻腔喷鼻剂或栓剂实现。对于皮肤给药，将活性化合物配制成本领域公知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或霜剂。

还可将化合物制备成栓剂(如用常规栓剂基质如可可脂和其它甘油三酯)或保留灌肠剂的形式，用于直肠递送。

在一个实施方案中，将活性化合物与保护化合物免于从身体快速清除的载体制备在一起，如控释配方，包括植入物和微胶囊递送***。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯-乙酸乙烯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这些制剂的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。所述材料还可购自AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.。脂质体悬液(包括用针对抗病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染细胞的脂质体)也可以用作可药用载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备，如美国专利No.4,522,811所述。

特别有利的是将经口或胃肠外组合物配制成剂量单位形式，以便于给药和维持剂量均一性。本文使用的剂量单位形式指适于作为单位剂量施用于待治疗受试者的物理上分离的单位；每个单位含有经计算产生期望疗效的预定量活性化合物所需的可药用载体。本发明剂量单位形式的规格遵从并直接取决于活性化合物的独特性质和要实现的具体疗效，以及这些活性化合物用于治疗个体的配制法中固有的限制。

对于抗体，优选的剂量为0.1mg/kg-100mg/kg体重(更优选0.1-20mg/kg、0.1-10mg/kg或0.1-1.0mg/kg)。如果抗体在脑中起作用，通常50mg/kg-100mg/kg的剂量是适当的。一般而言，部分人抗体和全人抗体在人体内具有比其它抗体更长的半衰期。因此，较低的剂量和较低给药频率经常是可能的。可使用修饰如脂化来稳定抗体并增强摄取和组织通透性(如脑中)。Cruikshank等描述了脂化抗体的方法(1997，J.Acquired Immune Deficiency Syndromes and HumanRetrovirology14：193)。

在具体的实施方案中，蛋白质或多肽的有效量(即有效剂量)范围为约0.001mg/kg-30mg/kg体重，优选约0.01-25mg/kg体重，更优选0.1-20mg/kg体重，甚至更优选0.1-1.0mg/kg、1-10mg/kg、2-9mg/kg、3-8mg/kg、4-7mg/kg或5-6mg/kg体重。

技术人员会了解，某些因素可以影响有效治疗受试者所需的剂量，包括但不限于疾病或病症的严重性、之前的治疗、一般健康状况和/或受试者的年龄以及存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的蛋白质、多肽或抗体治疗受试者可以包括单个治疗，或优选的是可以包括一系列治疗。

除了上述化合物以外，本发明包括调节目的核酸或多肽的表达或活性的小分子的用途。小分子的非限制性实例包括肽、肽模拟物、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、分子量小于约10,000g/mol的有机或无机化合物(即包括异源有机化合物和有机金属化合物)、分子量小于约5,000g/mol的有机或无机化合物、分子量小于约1,000g/mol的有机或无机化合物、分子量小于约500g/mol的有机或无机化合物以及盐、酯及这些化合物的其它可药用形式。

应该理解，小分子物质的适当剂量依赖于具有普通技术的医生、兽医或研究人员知识范围内的很多因素。例如，小分子剂量的变化将取决于受治患者或样本的身份、大小和状况而变化，还取决于施用组合物的途径(如果适用的话)以及医生期望小分子对本发明核酸或多肽产生的效果。

示例性剂量包括每千克受试者或样本重量毫克或微克量的小分子(如约1微克/千克到约500毫克/千克、约100微克/千克到约5毫克/千克，或约1微克/千克到约50微克/千克)。还应该理解，小分子的适当剂量取决于所述小分子对待调节的表达或活性的效能。以用本文所述的测定来确定这些适当的剂量。对受试者(如人)施用一种或多种这些小分子以调节本发明多肽或核酸的表达或活性时，医生、兽医或研究人员例如可以首先开相对低剂量的处方，随后增加剂量直至获得适当反应。此外，应该理解，对于任何特定动物受试者的具体剂量水平将取决于多种因素，包括所使用具体化合物的活性、受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、给药时间、给药途径、***率、任何药物组合以及待调节的表达或活性的程度。

所述药物组合物可以与给药说明书一起包括在容器、包装或分配器中。

5.21试剂盒

本发明提供试剂盒，其用于测量本发明生物标志物中至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少12种、至少15种、至少20种、至少25种或全部或任何组合的蛋白和RNA产物的表达。这些试剂盒包含测量这些蛋白和RNA产物的表达所需要的材料和试剂。在具体的实施方案中，试剂盒还可以包含多种方法中使用的一种或多种其它试剂，如(1)从血、软骨细胞或滑液中纯化RNA的试剂；(2)产生测试核酸的引物；(3)dNTP和/或rNTP(预混或分开的)，任选地含一种或多种独特标记的dNTP和/或rNTP(如生物素化或带Cy3或Cy5标签的dNTP)；(4)合成后标记试剂，如荧光染料的化学活性衍生物；(5)酶，如逆转录酶、DNA聚合酶等；(6)多种缓冲介质，如杂交和洗涤缓冲剂；(7)标记探针的纯化试剂和组分，如离心柱等；和(8)蛋白质纯化试剂；(9)信号产生和检测试剂，如链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶缀合物、化学荧光或化学发光底物等。在具体的实施方案中，所述试剂盒包含从样品(如血、软骨细胞或滑液)中分离的作为对照使用的预标记质量控制蛋白和/或RNA。

在一些实施方案中，试剂盒为RT-PCR试剂盒。在另一些实施方案中，试剂盒是核酸阵列和蛋白质阵列。根据本发明的这些试剂盒将至少包含具有本发明相关蛋白质或核酸成员的阵列及其包装物。或者，本发明的蛋白质或核酸成员可以预包装到阵列上。

在一些实施方案中，试剂盒为定量RT-PCR试剂盒。在一个实施方案中，定量RT-PCR试剂盒包括：(a)用于扩增每种本发明生物标志物组合的引物；(b)缓冲剂和酶，包括逆转录酶；(c)一种或多种热稳定聚合酶；和(d)Green。在优选的实施方案中，本发明的试剂盒还包括(a)参照对照RNA和(b)峰值(spiked)对照RNA。

本发明提供试剂盒，所述试剂盒可用于(a)诊断骨关节炎；(b)区分两种阶段的骨关节炎(OA)和(c)将个体诊断为患特定阶段的骨关节炎(OA)。例如，在本发明具体的实施方案中，试剂盒包含正向和反向引物，其中将所述正向和反向引物设计为定量可用于确定个体是患轻度OA还是未患OA的所有mRNA种类的表达，所述mRNA对应于根据本发明方法鉴定的每种生物标志物。在某些实施方案中，至少将一种引物设计为跨越外显子接合处。

本发明提供用于检测、诊断、监测和预后骨关节炎的试剂盒，其基于样品中至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、全部或任何组合的本发明生物标志物的蛋白质或RNA产物的表达。在某些实施方案中，这些试剂盒不包括测量已在现有技术中提出与骨关节炎有关的本发明生物标志物蛋白或RNA产物表达的材料和试剂。在其他实施方案中，这些试剂盒包括测量已在现有技术中提出与骨关节炎有关的本发明生物标志物和本发明生物标志物以外至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种或更多基因的蛋白或RNA产物表达的材料和试剂。

本发明提供的用于监测受试者接受的一种或多种治疗的效力的试剂盒，其基于样品中至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种或全部或任何组合的本发明生物标志物蛋白和RNA产物的表达。在某些实施方案中，这些试剂盒不包括测量已在现有技术中提出与骨关节炎有关的本发明生物标志物蛋白或RNA产物表达的材料和试剂。在其他实施方案中，这些试剂盒包括测量已在现有技术中提出与骨关节炎有关的本发明生物标志物和本发明生物标志物以外至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种或更多基因的蛋白或RNA产物表达的材料和试剂。

本发明提供的用于确定受试者对治疗是否有反应的试剂盒，其基于样品中至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、全部或任何组合的本发明生物标志物蛋白和RNA产物的表达。在某些实施方案中，这些试剂盒不包括测量已在现有技术中提出与骨关节炎有关的本发明生物标志物蛋白或RNA产物表达的材料和试剂。在其他实施方案中，这些试剂盒包括测量已在现有技术中提出与骨关节炎有关的本发明生物标志物和本发明生物标志物以外至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种或更多基因的蛋白或RNA产物表达的材料和试剂。

本发明提供用于测量样品中至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、全部或任何组合的本发明生物标志物RNA产物的表达的试剂盒。在具体的实施方案中，这些试剂盒包含测量本发明生物标志物RNA产物的表达所必需的材料和试剂。例如，可以制备用于骨关节炎的微阵列或RT-PCR试剂盒，并且其仅含有测量至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、全部或任何组合的本发明生物标志物RNA产物的水平所必需的试剂和材料。或者，在一些实施方案中，所述试剂盒可包含不仅限于测量1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种、20种、25种、30种、35种、40种、45种、50种、全部或任何组合的本发明生物标志物RNA产物的水平所必需的试剂和材料。例如，除了测量至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、全部或任何组合的本发明生物标志物RNA产物水平必需的试剂和材料以外，微阵列试剂盒还可以含有测量不一定与骨关节炎相关或指示骨关节炎的RNA产物水平所需的材料和试剂。在具体的实施方案中，微阵列或RT-PCR试剂盒含有测量以下RNA产物水平所需的试剂和材料：至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、全部或任何组合的本发明生物标志物，以及本发明生物标志物以外的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450种或更多基因，或本发明生物标志物以外的1-10、1-100、1-150、1-200、1-300、1-400、1-500、1-1000、25-100、25-200、25-300、25-400、25-500、25-1000、100-150、100-200、100-300、100-400、100-500、100-1000、500-1000种基因。

对于核酸微阵列试剂盒，所述试剂盒通常包含附着在固体支持物表面上的探针。可以用检测标记来标记所述探针。在具体的实施方案中，探针对本发明生物标志物中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、全部或任何组合的RNA产物的外显子、内含子、外显子接合处或外显子-内含子接合处具有特异性。所述微阵列试剂盒可以包含实施测定的说明书和解释与分析实施测试所得数据的方法。在具体的实施方案中，所述试剂盒包含诊断骨关节炎的说明书。所述试剂盒还可以包含杂交试剂和/或检测探针与靶核酸序列杂交时产生的信号所必需的试剂。一般而言，微阵列试剂盒的材料和试剂在一个或多个容器中。试剂盒的每种组分一般在各自的合适容器中。

对于RT-PCR试剂盒，试剂盒通常包含预选的引物，它们对1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、全部或任何组合的本发明生物标志物的特定RNA产物(如外显子、内含子、外显子连接处或外显子-内含子连接处)具有特异性。RT-PCR试剂盒还可以包含适于逆转录和/或扩增核酸的酶(例如聚合酶，如Taq)以及逆转录和扩增的反应混合物需要的脱氧核苷酸和缓冲液。RT-PCR试剂盒还可以包含特异性针对1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、全部或任何组合的本发明生物标志物RNA产物的探针。所述探针可用检测标记(如荧光标记)进行标记，或者不标记。RT-PCR试剂盒的每种组分一般在各自的合适容器中。因此，这些试剂盒通常包含适于每种相应试剂、酶、引物和探针的不同容器。此外，RT-PCR试剂盒可以包含实施测定的说明书和解释与分析实施测试所得数据的方法。在具体的实施方案中，所述试剂盒包含诊断骨关节炎的说明书。

在一个具体的实施方案中，所述试剂盒为实时RT-PCR试剂盒。这种试剂盒可以包含96孔板和SYBR Green检测所需的材料和试剂。所述试剂盒可包含使得可以使用β-肌动蛋白校正使结果标准化的试剂和材料。所述试剂盒还可以包含对照，如水、磷酸盐缓冲液和噬菌体MS2RNA。此外，所述试剂盒可以包含实施测定的说明书和解释与分析实施测定所得数据的方法。在具体的实施方案中，说明中指出应该在差别为如5倍到10倍的两个浓度检查1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、全部或任何组合的本发明生物标志物RNA产物水平。

对于基于抗体的试剂盒，试剂盒可包含例如：(1)第一抗体(可以与附着在固体支持物上或不附着)，它与目的蛋白(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、全部或任何组合的本发明生物标志物的蛋白质产物)结合；和任选地(2)不同的第二抗体，它与所述蛋白质或第一抗体结合，并缀合了检测标记(如荧光标记、放射性同位素或酶)。基于抗体的试剂盒还可以包含进行免疫沉淀的珠子。基于抗体的试剂盒的每种组分一般在各自的合适容器中。因此，这些试剂盒通常包含适于每种抗体的不同容器。此外，基于抗体的试剂盒可以包含实施测定的说明书和解释与分析实施测定所得数据的方法。在具体的实施方案中，试剂盒含有诊断骨关节炎的说明书。

6.实施例

以下实施例为非限制性，仅展示本发明的多个方面和特征。

实施例1

微阵列的构建

按以下构建本发明一个方面的阵列。

在与扩增相同的96孔管中将cDNA克隆的PCR产物(～40μl)以4μl(1/10体积)3M乙酸钠(pH5.2)和100μl(2.5倍体积)乙醇沉淀，并在-20℃保存过夜，所述cDNA来自OA软骨cDNA文库。然后在4℃以3,300rpm将其离心1小时。所得沉淀用50μl冰冷的70％乙醇洗涤，接着再离心30分钟。其后晾干沉淀并完全重悬于50％二甲基亚砜(DMSO)或20μl3×SSC中过夜。然后用机器人GMS 417或427阵列仪(Affymetrix，Ca)将样品单次或一式二份点样在γ氨基丙基硅烷(Corning CMT-GAPS或CMT-GAP2，目录号40003，40004)或包被了聚赖氨酸的载玻片(Sigma目录号P0425)上。用钻石刻刀标记微阵列上DNA点的边界。本发明提供将10-20000种PCR产物点样在固体支持物上以制备阵列的阵列。

将载片悬于温的无颗粒ddH₂O皿中约1分钟(点将轻微溶胀但不会互相接触)以再水化阵列，在70-80℃的倒置加热块上快速干燥3秒。然后将核酸紫外交联到载玻片上(Stratagene，Stratalinker，65mJ-设置显示为“650”，表示650×100μJ)或者在80℃烘2-4小时。将阵列置于片架上。准备空片室并充入以下溶液：溶于189ml1-甲基-2-吡咯烷酮中的3.0g琥珀酸酐(Aldrich)(迅速加入试剂很关键)；最后一片琥珀酸酐溶解以后立即混入21.0ml 0.2M硼酸钠并将溶液倒入片室内。迅速且均匀地将片架置入片室并剧烈地来回摇动几秒，确保载玻片不离开溶液，然后在定轨摇床上混合15-20分钟。然后将片架轻轻置入95℃ddH₂O中2分钟，随后投入95％乙醇中5次。将过量乙醇滴到纸巾上，晾干载片。室温下将阵列保存在片盒中待用。

实施例2

RNA的分离

从血中分离

在微量离心管中获得10ml全血并在4℃以2,000rpm(800g)离心5分钟，除去上清液。以每10μl原始血样约6μl

的比例用

(GIBCO/BRL)使沉淀细胞匀浆并充分振荡。样品在室温放置5分钟。每10μl

使用12μl氯仿提取RNA。在4℃以12000rpm离心样品5分钟，收集上层。按5μl/10μl的比例向上层中加入异丙醇。样品于-20℃静置过夜或在-20℃放置1小时。根据已知方法沉淀RNA，晾干RNA沉淀，并将沉淀重悬于经DEPC处理的ddH₂O中。RNA样品也可以保存在75％乙醇中，在此条件下样品在室温下稳定，以便运输。

从离心裂解血中分离

将10ml全血收集于Vacutainer中并在4℃以2,000rpm(800g)离心5分钟，除去血浆层。以3份裂解缓冲液比1份血的比例加入裂解缓冲液(裂解缓冲液(1L)：0.6g EDTA；1.0g KHCO₂，8.2g NH₄Cl，用NaOH调节到pH7.4)。混合样品置于冰上5-10分钟至透明。在4℃以1000rpm离心裂解的样品10分钟，并吸弃上清液。将沉淀重悬于5ml裂解缓冲液，在4℃以1000rpm再次离心裂解的样品10分钟。以每10ml原始血样约6ml

的比例用

(GIBCO/BRL)匀浆沉淀细胞并充分振荡。样品在室温静置5分钟。用1.2ml氯仿/1ml

提取RNA。在4℃以12,000×g离心样品5分钟并收集上层。按0.5ml/1ml

的比例向上层中加入异丙醇。样品于-20℃静置过夜或在-20℃放置1小时。根据已知方法沉淀RNA，空气干燥RNA沉淀，并将沉淀重悬于DEPC处理的ddH₂O中。RNA样品也可以保存于75％乙醇中，在此条件下样品在室温下稳定，以便运输。

从无血清全血中分离

将10ml全血收集在Vacutainer中并在4℃以2,000rpm(800g)离心5分钟，除去血浆层。以每10ml原始血样约6ml

的比例用

(GIBCO/BRL)匀浆沉淀细胞并充分振荡。样品在室温下静置5分钟。用1.2ml氯仿/1ml

提取RNA。在4℃以12,000×g离心样品5分钟，并收集上层。按0.5ml/1ml

的比例向上层中加入异丙醇。样品于-20℃静置过夜或在-20℃放置1小时。根据已知方法沉淀RNA，晾干RNA沉淀，并将沉淀重悬于经DEPC处理的ddH₂O中。RNA样品也可以保存在75％乙醇中，在此条件下样品在室温下稳定，以便运输。

实施例3

靶核酸的制备和杂交

由mRNA制备荧光DNA探针

制备荧光标记的RNA靶核酸样品用于本发明的阵列分析。

在10μl的总体积中，通过在70℃加热10分钟并在冰上冷却将1μg Oligo-dT引物与10μg总RNA一起退火，所述总RNA分离自诊断为患有骨关节炎或怀疑患有骨关节炎的患者的血。在25μl体积中将样品在42℃孵育40分钟以逆转录mRNA，所述体积中含有终浓度50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl₂、25mM DTT、25mM未标记dNTP、400单位Superscript II(200U/μl，Gibco BRL)和15mM Cy3或Cy5(Amersham)。通过加入2.5μl500mM EDTA和5μl1M NaOH并在65℃孵育10分钟来终止反应。加入12.5μl1MTrisHCl(pH7.6)中和反应混合物。

通过在Centricon-30微量浓缩器(Amicon)中离心来纯化已标记的靶核酸样品。如果通过与同一阵列杂交来分析和比较两种不同的靶核酸样品(如来自不同患者的两个样品)，则用不同的荧光标记(如Cy3和Cy5)来标记每种靶核酸样品并分别浓缩。将分别浓缩的靶核酸样品(Cy3和Cy5标记的)合并到新Centricon中，用500μl TE洗涤，并再次浓缩至体积小于7μl。加入1μL10μg/μl polyA RNA(Sigma，#P9403)和1μL10μg/μl tRNA(GIBCO-BRL，#15401-011)并用蒸馏水将体积调整至9.5μl。对于最终的靶核酸制备物，加入2.1μl20×SSC(1.5M NaCl，150mM柠檬酸钠(pH8.0))和0.35μl10％SDS。

杂交

通过在100℃加热2分钟变性已标记核酸，在37℃孵育20-30分钟，然后放置于核酸阵列上，用22mm×22mm盖玻片盖上。在定制玻片室中以65℃杂交14-18小时，以3×SSC的小容器维持湿度。依次浸入含0.1％SDS的2×SSC、1×SSC和0.1×SSC中并搅拌2-5分钟来洗涤阵列。最后，在Beckman GS-6台式离心机中Microlus托架上的片架中以650RPM离心2分钟以干燥阵列。

实施例4

实时RT PCR

可以使用其中公开的生物标志物RNA产物进行实时RT PCR。本文使用的术语“生物标志物特异性引物”指引物组，所述引物组能产生与一种或多种本发明生物标志物RNA产物的一部分互补的双链DNA。例如，所述引物可包括第一种引物和第二种引物，其中第一种引物是可与本发明生物标志物区域的互补RNA、eDNA或EST选择性杂交而产生延伸产物的序列，第二种引物能与延伸产物选择性杂交，用于产生与本发明生物标志物区域互补的双链DNA。本发明包括用于测量本发明生物标志物RNA产物表达的引物。表5和表8提供了本发明引物和探针的代表性种类，包括表3中指出的使用Qiagen的

Green试剂盒(产品号204143)的引物和探针。

可以使用一步(逆转录和PCR的组合)或两步(首先逆转录，然后再进行PCR)法。在两步操作的情况下，首先使用AppliedBiosystems的High-Capacity cDNA Archive试剂盒(产品号4322171)，遵照其中使用的操作方案进行逆转录。

更具体地，将本文前面所述的纯化RNA与逆转录缓冲液、dNTP、随机引物和逆转录酶一起孵育，在25℃孵育10分钟，随后在37℃孵育2小时，将得到的混合物用作定量PCR的起始产物。

将逆转录获得的cDNA与所提供形式的QuantiTect

Green PCR Master Mix一起孵育，不调节镁浓度。任选地可加入尿嘧啶-N-糖基化酶。加入5μM对本发明基因具有特异性的正向引物和反向引物，孵育反应物，并按照标准操作用ABI PRISM7700/ABIGeneAmp5700/iCycler/DNA Engine Opticon进行监测。

实施例5

还可以使用Qiagen的QuantiTect^TM探针RT-PCR***(产品号204343)与目的基因的相应

双标记探针和引物组合来进行定量实时RT-PCR。可以从Applied BiosystemsAssays-On-Demand^TM定购

探针和引物。

双标记探针同时含有荧光团和猝灭分子。猝灭分子接近荧光报告子，阻止报告子发出荧光，但在PCR延伸步骤中，Taq DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性释放荧光团，使其发出荧光。这样，荧光的量与生成的PCR产物量相关。

实施例6

实时PCR结果的统计学分析

使用已知方法对分离自分类为正常或患轻度骨关节炎个体的血样所进行的实时PCR分析进行统计学分析，以获得训练群中本发明生物标志物丰度水平的相应数据。

优选选择年龄和体重指数(BMI)相似的个体进行进一步分析。使用KW单向秩方差分析来确定可基于年龄和BMI进行比较的样本选择，这是本领域技术人员能够理解的。

可以在年龄和BMI匹配样本的组(大小约为20至50名)中使用ΔCT值和MW秩和检验。本领域技术人员十分清楚，可以对本文鉴定的任何序列进行类似的分析。

实施例7

使用图1所述生物标志物的RNA产物分析来自患轻度骨关节炎个体 血样的基因表达谱与来自正常个体的基因表达谱的比较

本实施例展示了要求保护的本发明通过检测与健康患者血样相比轻度骨关节炎患者血样中的差异性基因表达来诊断轻度骨关节炎的用途。

血样取自如本文定义临床诊断为患轻度骨关节炎的患者、如本文定义临床诊断为未患骨关节炎的患者和一个或多个测试患者。然后分析本发明生物标志物组合的基因表达谱，并将测试个体的谱与两种对照谱进行比较。

首先使用试剂(GIBCO)从取自每名患者的裂解全血中分离总mRNA，然后产生每种血样的荧光标记探针，变性并与微阵列杂交，所述微阵列含有表1所述19种基因中的每一种的全长cDNA序列。用GMS扫描仪418扫描并用Scananalyzer软件(Michael Eisen，Stanford University)处理试验数据，随后用GeneSpring软件(SiliconGenetics，CA)分析，从而测量与阵列的特异性杂交。通过用WilcoxMann Whitney秩和检验进行统计分析来确定测试个体与两个对照群之间血样中生物标志物相应RNA产物的差异表达(Glantz SA.《Primer of Biostatistics》.第五版.New York，USA：McGraw-HillMedical Publishing Division，2002)。

实施例8

使用表1所述生物标志物的RNA产物应用逻辑回归鉴定区分轻度OA 与非OA的分类器和组合

从使用Marshall(同上)***分类为轻度OA的82名患者和82名正常受试者的血样中分离RNA。使用引物收集164名患者的每名患者中选自表1的四种生物标志物RNA产物水平的相应数据，所述引物设计用于扩增表3指出的四种生物标志物的mRNA产物。使用由四种生物标志物的QRT-PCR产生的ΔCt值组成的参照数据集输入逻辑回归，以确定来自这四种候选生物标志物的不同ΔCt值组合的诊断能力。在2⁴-1种可能的生物标志物组合中，以最大似然逻辑回归评估每种组合，以确定“轻度骨关节炎”与“对照”的鉴别力(ROC面积＞0.5)。

实施例9

使用逻辑回归鉴定区分轻度骨关节炎与非骨关节炎的生物标志物组合 和分类器

通过将标记样品与Affymetrix U133Plus2.0基因芯片(Affymetrix；Santa Clara，CA)杂交对每种来自诊断为患轻度OA的患者和诊断为未患OA的患者的样品进行初始分析。简言之，使用通过将每个阵列的总体修剪平均信号强度值调整为500而确定的比例因子，在Affymetrix GCOS软件(1.1.1版)中按比例确定杂交信号，并输入GeneSpring7.2版(Silicon Genetics；Redwood City，CA)。接着将信号强度集中到每个芯片的50百分位数，对于每个基因，集中到整个样本集的中位数强度。仅将在每组样品中至少80％由GCOS软件评为存在或边缘的基因用于进一步分析。使用多种统计学检验中的一种鉴定差异表达基因，包括(a)非参数的Wilcoxon-Mann-Whitney非参数检验(P＜0.05)，2)或(b)参数t检验(P＜0.05)。分析了来自大量微阵列实验的结果(数据未显示)，其后如下文所述使用额外样品的实时RT-PCR法对选定基因进行分析。

使用实时RT-PCR分析了总计100个个体。从University ofToronto的Toronto Western Hospital，University Health Network(UHN)招募诊断为患有轻度OA的患者。UHN Research Ethics Board批准了该研究，参与者均提供书面的知情同意书。作为半月板撕裂、前交叉韧带(ACL)损伤和/或髌骨轨迹异常(patellar maltracking)的结果，这些患者在进行关节镜检查时偶然地诊断出OA并分级。按照Marshall KW所述已确定的关节镜评分法对严重性进行分级。(以关节镜对骨关节炎严重性进行分级的简单方法，参阅J Rheumatol1996；23：582-5)。简言之，该***对六个关节面中每一个的最严重损伤给予0-4的分数。0级为正常(0分)。I级软骨为柔软或肿胀，但关节面完整(1分)。在II级损伤中，关节面不完整，但损伤未继续延伸至软骨下的骨上(2分)。III级损伤延伸至关节下的骨上，但骨没有受到侵蚀或象牙化(3分)。在IV级损伤中，骨发生象牙化或受到侵蚀(4分)。将所有面的分数相加得到总分，用于将OA严重性分类为轻度(早期)：1-6；中度：7-12；显著：13-18；重度：19-24。

51名个体诊断为患轻度OA，并与来自无膝部症状且先前无膝部损伤史的对照受试者的49个样本进行比较。

从每名个体收集10ml外周全血至EDTA真空采血管(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ.)中并保存在冰上直至处理(6小时内)。离心后，将血样分离成血浆、血沉棕黄层和红细胞层。除去血浆并以3∶1的体积比加入低渗缓冲液(1.6mM EDTA，10mM KHCO₃，153mM NH₄Cl，pH7.4)以裂解红细胞。离心混合物获得细胞沉淀，根据生产商的说明书将其溶解并匀浆在1.0ml

试剂(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA)和0.2ml氯仿中。离心后，以1∶1的比例向水相中加入异丙醇，在-20℃沉淀。其后离心获得RNA沉淀，重悬于水中用于实验。如生产商的说明以Agilent2100Bioanalyzer RNA6000Nano Chip评估RNA的质量，在Beckman-Coulter DU640分光光度计中通过260nm处的吸光度测定RNA的量。

使用Qiagen(Product Number204143)的Green试剂盒进行定量实时RT PCR(QRT-PCR)。使用Prism7500工具(AppliedBiosystems)实时检测扩增子。首先遵照本文使用的操作使用AppliedBiosystems的High-Capacity cDNA Archive试剂盒(产品号4322171)进行逆转录。

更具体地，将如本文前述纯化的RNA与逆转录酶缓冲液、dNTP、随机引物和逆转录酶一起孵育，在25℃孵育10分钟，其后在37℃孵育2小时，将得到的混合物用作定量PCR的起始产物。将逆转录所得cDNA与供货形式的QuantiTect

Green PCR MasterMix孵育，不调整镁浓度。不加入尿嘧啶-N-糖基化酶。加入对选定基因具有特异性的5μM正向引物和反向引物，孵育反应物并使用ABIPRISM7700/ABI GeneAmp5700/iCycler/DNA Engine Opticon按照标准操作进行监测。选择显示至少＜0.2的p值的基因，但优选选择p值小于0.05的基因。我们先前已经发现，显示0.05与0.2之间p值的基因尽管作为单个生物标志物不显著，但对诊断目的的基因组合则可以有显著贡献(数据未显示)。鉴定了p值＜0.2的32个基因的选集以区分轻度OA和非OA。表4标出了这些基因。

使用表5所示引物构建含有表4中标出基因的ΔCt值的参照(训练)数据集。可以使用本文所述技术测试表4中标出的生物标志物的所有可能组合并对每种生物标志物组合产生分类器，接着如所述进行评分，以帮助选择最有用的组合和分类器。下文讨论的是测试的选定组合所鉴定的代表性分类器。

使用逻辑回归分析二元诊断变量Y(0＝对照，1＝疾病)对参照数据集ΔCt值的依赖性。如果P＝患者样品鉴定为“疾病”的概率，则函数X＝Logit(p)可定义如下：

X＝Logit(P)＝ln(P/(1-P))＝b₀+b₁ΔCt₁+b₂ΔCt₂+...+b_nΔCt_n  (Eq1)

如果X≥阈值，则Y＝1(诊断＝“患轻度OA”)，如果X＜阈值，则Y＝0(诊断＝未患OA)。通过最大似然(ML)拟合法获得定义X与实验测量值{ΔCti，其中i代表样品}之间关系的(经验)系数{bi}。使用若干不同的商品软件程序也可获得相同的{bi}值：MedCalc(MedCalc Software，Mariakerke，Belgium)和XL-Stat(AddinsoftSoftware，Paris，France)。接着使用ROC曲线分析评估组合的区分能力。对于使用表6的引物在患轻度OA的51名个体和未患OA的49名个体中鉴定的表4基因，使用定量实时RT-PCR产生表4中标出生物标志物中所有两基因比例的分类器。两基因比例产生以下方程形式：X＝Logit(P)＝ln(P/(1-P))＝b₀+b₁(ΔCt₁-ΔCt₂)(Eq2)

在861中可能的两基因比例中，其中465种曲线下的面积(AUC)大于0.60，取决于测试的组合而具有不同的灵敏度和特异性。该分析的图示结果可见于图1。19种组合的AUC大于0.80。需要注意，AUC低于0.7仍然是有价值的，仍可提供显著的临床有用组合。例如特异性95％、灵敏度75％的组合仍然可能产生仅为0.7的曲线下面积。这19种组合的结果示于下文表A：

表A

注：AUC为曲线下面积，列出了特异性设置为50％时的灵敏度。类似地，标出了灵敏度设置为50％时的特异性。显示了Eq2中所列方程的常数(B₀)和系数(B₁)。

对于使用表5的引物在患轻度OA的51名个体和未患OA的49名个体中鉴定的表4基因，还使用定量实时RT-PCR产生了表4标出生物标志物中选定4组两基因比例(例如8种生物标志物的组合，各为两种生物标志物的比例)的分类器。结果为以下方程的形式：

X＝Logit(P)＝ln(P/(I-P))＝b₀+b₁(ΔCt₁-ΔCt₂)+b₂(ΔCt₃-ΔCt₄)+b₃(ΔCt₅-ΔCt₆)+b₄(ΔCt₇-ΔCt₈)(Eq3)

注：下文表B显示AUC(曲线下面积)，列出了特异性设置为90％时的灵敏度。类似地，标出了灵敏度设置为90％时的特异性。显示了Eq3的方程中的常数(B₀)以及系数B₁、系数B₂、系数B₃和系数B₄。

表B

实施例10

使用分类器确定测试个体中是否存在轻度骨关节炎

可以使用分类器如实施例9所指出的分类器来诊断测试个体。例如，可以对测试个体测定表A指出的任一方程的生物标志物相应RNA种类的测量值。因此，例如当下文指出的分类器使用两种生物标志物CPT1A和IL13RA1时，使用定量实时RT PCR测定CPT1A和IL13RA1相应RNA产物的测量值。表5和表8中列出了对CPT1A和IL13RA1具有特异性的引物。使用定量实时RT-PCR测量Ct，可使用所述引物与嵌入染料如Green结合或与

探针结合而获得。表8指出了用于这两种生物标志物的示例性

探针。

使用已确定在轻度OA个体与未患OA个体之间无差异表达的管家基因如β肌动蛋白将原始Ct转换为ΔCt。将CPT1A(Ct1)和IL13RA1(Ct2)的ΔCt值代入下列方程：

X＝Logit(P)＝ln(P/(1-P))＝b₀+b₁(ΔCt₁-ΔCt₂)(Eq2)

X＝Logit(P)＝ln(P/1-P)＝-9.44x10-2-2.1336(ΔCt₁-ΔCt₂)

其中X指示个体患轻度OA的可能性。在一些实施方案中，选择用于表示轻度OA和非OA的截止值为0，从而X大于0表示个体患轻度OA，而X小于0表示个体未患OA。在一些情况下，截止值不为0，而是基于训练集或评分群进行选择，以保证对尽可能多的个体群作出正确判断，或者取决于选择的标准而保证灵敏度或特异性提高。

实施例11

通过测量生物标志物组合的RNA或蛋白质产物，使用鉴定的组合确 定测试个体中是否存在轻度骨关节炎。

还可以独立于分类器地使用通过分类器鉴定的生物标志物组合例如实施例9中鉴定的生物标志物组合，以诊断测试个体。可以对测试个体测定表A指出任一方程的生物标志物RNA或蛋白质产物的测量值。因此，例如当下文指出的分类器使用两种生物标志物CPT1A和IL13RA1时，使用定量实时RT PCR测定CPT1A和IL13RA1相应RNA产物的测量值。表5和表8中列出了对CPT1A和IL13RA1具有特异性的引物。使用定量实时RT-PCR测量Ct，可使用所述引物与嵌入染料如

Green结合或与

探针结合而获得。表8指出了用于这两种生物标志物的示例性

探针。或者，可以使用CPT1A和IL13RA1相应蛋白质产物的抗体。表4中生物标志物相应的市售抗体可见于表8。可以如本文所述使用标准分子生物学技术产生其他本发明生物标志物的相应抗体。可以通过将测试个体中CPT1A和IL13RA1相应蛋白或RNA产物的量与对照个体中CPT1A和IL13RA1相应产物的量进行比较来不使用分类器地诊断测试个体，所述对照包括患轻度OA的阳性对照个体和未患OA的阴性对照个体。其后如果与阴性对照个体相比，测试个体的基因表达模式与阳性对照个体更为相似，则将该测试个体诊断为患轻度OA。

X＝Logit(P)＝ln(P/(1-P))＝b₀+b₁(ΔCt₁-ΔCt₂)(Eq2)

X＝Logit(P)＝ln(P/1-P)＝-9.44x10-2-2.1336(ΔCt₁-ΔCt₂)

其中X指示个体患轻度OA的可能性。在一些实施方案中，选择用于表示轻度OA而非OA的截止值为0，从而X大于0指示个体患轻度OA，而X小于0指示个体未患OA。在一些情况下，截止值不为0，而是基于训练组或评分群进行选择，以保证对尽可能多的个体群作出正确判断，或者取决于选择的标准而保证灵敏度或特异性提高。

附表

表1

表2

备选基因符号	HGNC_符号	Locus Link ID
			ABCA1	ABCA1	19
ABCG1	ABCG1	9619
			ACP1	ACP1	52
ADPRT	ADPRT	142
			ANGPTL2	ANGPTL2	23452
B2M	B2M	567
			BCL6	BCL6	604
BMPR2	BMPR2	659
			C19orf13	C19orf13	26065
C1QR1	C1QR1	22918

备选基因符号	HGNC_符号	Locus Link ID
			CCNC	CCNC	892
CLECSF6	CLECSF6	50856
			CLIC4	CLIC4	25932
CLN3	CLN3	1201
			DNAPTP6	DNAPTP6	26010
EBNA1BP2	EBNA1BP2	10969
			EGR1	EGR1	1958
F2RL1	F2RL1	2150
			FLJ11000	FLJ11000	55281
FLJ11142	FLJ11142	55779
			FLJ13612	EFHD1	80303
FLJ32234	C6orf151	154007
			G2AN	GANAB	23193
HSPCA	HSPCAL3	3320
			HSPCB	HSPCB	3326
IKBKAP	IKBKAP	8518
			IL13RA1	IL13RA1	3597
ILF1	FOXK2	3607
			IRF1	IRF1	3659
LAMC1	LAMC1	3915
			LCMT2	LCMT2	9836
MAFB	MAFB	9935
			NCOA1	NCOA1	8648

备选基因符号	HGNC_符号	Locus Link ID
			NXN	NXN	64359
PAIP2	PAIP2	51247
			PDCD5	PDCD5	9141
PDK4	PDK4	5166
			PER1	PER1	5187
PF4	PF4V1	5196
			PF4	PF4	5197
PMSCL2	EXOSC10	5394
			PPIF	PPIF	10105
SETBP1	SETBP1	26040
			SFRS6	SFRS6	6431
SLC5A6	SLC5A6	8884
			TNFAIP6	TNFAIP6	7130
TSPAN2	TSPAN-2	64521
			WDR9	C21orf107	54014
YES1	YES1	7525
			ZFR	ZFR	51663
ZNF397	ZNF397	84307
			WWP2	WWP2	11060

表3

表4

表5

表7

参考文献

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The contents of all references，patents and patent applications(including，published patentapplications)cited throughout this application are hereby incorporated by reference.

Equivalents

Those skilled in the art will recognize，or be able to ascertain using no more than routineexperimentation，many equivalents to the specific embodiments of the invention describedherein.Such equivalents are intended to be encompassed by the following claims.

本申请全文中引用的所有参考文献、专利和专利申请(包括公开的专利申请)均引入本文为参考。

等价方式

本领域技术人员会理解，或能够使用常规实验确定本文所述具体发明实施方案的许多等价方式。这些等价方式旨在包括在以下权利要求中。

以下部分对应于母案申请的权利要求书：

1.包含至少两种分离多核苷酸的组合物，其中每种分离多核苷酸与选自表1或表4所列出生物标志物的生物标志物选择性杂交，且其中所述组合物允许测量所述生物标志物中至少两种的表达水平。

2.包含至少两种分离多核苷酸的组合物，其中每种分离多核苷酸与以下选择性杂交：

(a)选自表1或表4所列出生物标志物的生物标志物的RNA产物，和/或

(b)与(a)互补的多核苷酸序列，

其中所述组合物允许测量所述生物标志物中至少两种的RNA表达水平。

3.包含两种或更多分离多核苷酸的集合的组合物，其中每种分离多核苷酸与以下选择性杂交：

(a)表3或表5所列出的RNA序列，和/或

(b)与(a)互补的多核苷酸序列。

4.包含至少两种表6和/或表8所列出的生物标志物特异性引物的组合物。

5.包含至少两种表8所列出的多核苷酸探针的组合物。

6.根据项1的组合物，其中所述分离多核苷酸包括单链或双链RNA。

7.根据项1的组合物，其中所述分离多核苷酸包括单链或双链DNA。

8.包含至少两种分离蛋白质的组合物，其中每种分离蛋白质与选自表1或表4所列出生物标志物的生物标志物的蛋白质产物选择性结合，且其中所述组合物允许测量所述生物标志物中至少两种的表达水平。

9.根据项8的组合物，其中所述分离蛋白质选自表7所列出的蛋白质。

10.项9的组合物，其中所述分离蛋白质为配体。

11.项10的组合物，其中所述配体为抗体。

12.根据项11的组合物，其中所述抗体为单克隆抗体。

13.诊断或检测个体中轻度OA的方法，其包括：

(a)测定来自该个体的血样中一种或多种生物标志物的RNA产物的水平，所述生物标志物选自表1和/或表4所列出的生物标志物；和

(b)将来自所述个体的血样中RNA产物的水平与对照中同一RNA产物的水平进行比较，其中所述RNA产物在该个体与对照之间的差异表达指示个体中的轻度OA。

14.根据项13的方法，其中所述样品包括全血。

15.根据项14的方法，其中所述样品包括全血滴。

16.根据项13的方法，其中所述样品包括已经裂解的血。

17.根据项13的方法，其中在测定步骤之前，所述方法包括从所述血样中分离RNA。

18.根据项13的方法，其中测定所述RNA产物水平的步骤包括使用定量RT-PCR(QRT-PCR)。

19.根据项18的方法，其中所述QRT-PCR包括与所述一种或多种RNA产物或其互补物杂交的引物相杂交。

20.根据项19的方法，其中所述引物长度为15-25个核苷酸。

21.根据项17的方法，其中测定RNA产物水平的步骤包括将所述分离RNA与包含多种分离多核苷酸的阵列杂交。

22.根据项21的方法，其中所述阵列包含多种分离多核苷酸，所述分离多核苷酸包括RNA、DNA、cDNA、PCR产物或EST。

23.根据项22的方法，其中所述阵列上第二类多种分离多核苷酸包括与表1和/或表4中一种或多种生物标志物相对应的多核苷酸。

24.根据项13的方法，其中所述对照来自未患轻度OA的个体。

25.用于诊断或检测轻度OA的试剂盒，包括根据项1的组合物及其包装材料。

26.用于诊断或检测轻度OA的试剂盒，包括根据项2的组合物及其包装材料。

27.用于诊断或检测轻度OA的试剂盒，包括根据项3的组合物及其包装材料。

28.用于诊断或检测轻度OA的试剂盒，包括根据项8的组合物及其包装材料。

29.用于诊断或检测轻度OA的试剂盒，包括至少两组生物标志物特异性引物，其中每组生物标志物特异性引物产生与选自表1和/或表4的独特生物标志物互补的双链DNA；其中所述组中的每种第一引物含有可与所述生物标志物之一的互补RNA、cDNA或EST选择性杂交而产生延伸产物的序列，并且所述组中的每种所述第二引物能与所述延伸产物选择性杂交。

30.项29的试剂盒，还包含具有逆转录酶活性的酶、具有热稳定DNA聚合酶活性的酶或标记手段。

31.诊断或检测个体中轻度OA的方法，包括：

(a)测定来自该个体血样中一种或多种生物标志物的蛋白质产物的水平，所述生物标志物选自表1和/或表4列出的生物标志物；和

(b)将所述血样中蛋白质产物的水平与对照进行比较，其中所述蛋白质产物在该个体与对照之间的差异表达指示个体中的轻度OA。

32.根据项31的方法，其中使用抗体或其片段测定蛋白质产物的水平。

33.根据项32的方法，其中所述抗体选自表7列出的抗体。

34.根据项32的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。

35.包含至少两种分离多核苷酸的组合物，其中每种分离多核苷酸与选自表1、表2和/或表4所列出生物标志物的生物标志物选择性杂交，且其中所述组合物允许测量至少两种生物标志物的表达水平，并且其中所述至少两种生物标志物中的至少一种选自表1或表4。

36.包含至少两种分离多核苷酸的组合物，其中每种分离多核苷酸与以下选择性杂交：

(a)选自表1、表2或表4所列出生物标志物的生物标志物的RNA产物，和/或

(b)与(a)互补的多核苷酸序列，

其中所述组合物允许测量所述生物标志物中至少两种的RNA表达水平，并且其中所述生物标志物中的至少一种选自表1或表4。

37.包含至少两种抗体的组合物，其中每种抗体与选自表1、表2或表4所列出生物标志物的生物标志物的蛋白质产物选择性结合，且其中所述组合物允许测量所述生物标志物中至少两种的表达水平，并且其中所述生物标志物中的至少一种选自表1或表4。

38.鉴定待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状的能力的化合物的方法，包括：

(a)使一种或多种本发明生物标志物的蛋白质产物或其片段与测试化合物相接触，和

(b)测定所述测试化合物与所述蛋白质产物结合的能力；

其中如果化合物与所述蛋白质产物结合，则将该化合物鉴定为待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎的能力的化合物。

39.鉴定待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状的能力的化合物的方法，包括：

(a)使表达一种或多种本发明生物标志物的RNA产物的细胞与测试化合物相接触，

(b)使用项1、2或3的任意组合物测定与测试化合物接触的细胞中存在的RNA产物的量；

(c)将与测试化合物接触的细胞中RNA产物的量与未接触该测试化合物的相应对照细胞中存在的同一RNA产物的量进行比较；

其中如果蛋白质或RNA产物的量相对于对照中的量发生了变化，则将该化合物鉴定为待测试其预防、治疗、控制或改善骨关节炎或其症状的能力的化合物。

Claims (6)

1.用于确定测试个体患有轻度骨关节炎之可能性的试剂盒，其包含：对于选自表1或表4所示基因的两个或更多个基因的组中的每种基因来说，用于特异性扩增所述基因之cDNA的引物。

2.权利要求1的试剂盒，其中所述试剂盒还包含具有逆转录酶活性的酶。

3.权利要求1或2的试剂盒，其中所述试剂盒还包含具有热稳定DNA聚合酶活性的酶。

4.试剂盒在制备用于确定测试个体患有轻度骨关节炎之可能性的药物中的用途，其中所述试剂盒包含：对于选自表1或表4所示基因的两个或更多个基因的组中的每种基因来说，用于特异性扩增所述基因之cDNA的引物。

5.权利要求4的用途，其中所述试剂盒还包含具有逆转录酶活性的酶。

6.权利要求4或5的用途，其中所述试剂盒还包含具有热稳定DNA聚合酶活性的酶。

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