FI64139B

FI64139B - Polypeptid med inverkan pao djurens fortplantning

Info

Publication number: FI64139B
Application number: FI771480A
Authority: FI
Inventors: Anand Swaroop Dutta; Barrington John Albert Furr; Michael Brian Giles
Original assignee: Ici Plc
Priority date: 1976-05-11
Filing date: 1977-05-10
Publication date: 1983-06-30
Also published as: NL191793B; US4100274A; YU40672B; NO147304C; NO147304B; NL191793C; NO822984L; CH629475A5; ES458691A1; FI64139C; SE437993B; DK149596C; DK207977A; NO771644L; CA1101844A; ATA217979A; SE8007763L; PL108860B1; DD136738A5; GB1524747A

Description

ESSr^l re] (ιΐ)κυυ·-υτυ5ίυ,-ΚΑ,δυ 64139 l J 1 ' utlAggningsskrift ^ ^ ~ ^ (51) Kv.lk.^Int.CI.3 C 07 C 103/52 SUOMI — FINLAND (21) P««nttlhtk*mu* — Patenunsttknlng 771^00 (22) Hakamlapllvl — Anaöknlnjadag 10.05.77 (23) Alkupllvt — Glltighttsdag 10.05.77 (41) Tullut |u1klt«ksi — Bllvlt offantllg 22.11.77

Patentti· ja rekisterihallitus (44) Nihavik..Panon j. kuui.|uik»i*un PvW._

Patent- och registerstyrelsen v Antökan utlagd och utl.»krift*n publiccrad 30.06.03 (32)(33)(31) Pyyd««y etuoikeus—Begird prloritet n. 05.76

Englanti-England(GB) 19327/76 (71) Imperial Chemical Industries PLC, Imperial Chemical House, Millbank,

London SW1P 3JF, Englanti-England(GB) (72) Anand Swaroop Dutta, Macclesfield, Cheshire, Barrington John Albert Furr, Macclesfield, Cheshire, Michael Brian Giles, Macclesfield,

Cheshire, Englanti-England(GB) (7*0 0y Kolster Ab (5*0 Eläinten lisääntymiseen vaikuttava polypeptidi - Polypeptid med inverkan pä djurens fortplantning

Keksinnön kohteena on polypeptidi, jolla on luliberiiniagonisti-sia ominaisuuksia. Luliberiini on kansainvälisesti hyväksytty LH-RF:n (luteinizing hormone releasing factor) triviaalinimi (J.Biol.Chern. , 1975, 250, 3215).

On tunnettua (Dutta, Furr, Giles ja Morley, Clinical Endocrinology, 1976, 5, Supplement, 291s-298s), että substituoimalla luliberiini 06-atsa-aminohapoilla 6- tai 10-asemassa saadaan yhdisteitä, joiden vaikutus keltarauhasmuodostusta ohjaavan hormonin (LH) erittymiseen aivolisäkkeestä on heikompi kuin alkuperäisellä yhdisteellä. Nyt on keksitty, että substituoimalla luliberiinin 10-asema atsaglysiinillä ja samalla 6-asema erilaisilla D- oC-aminohapoilla tai substituoimalla luliberiinin 6-asema atsaglysiinillä tai atsa-alaniinilla ja korvaamalla luliberiinin pääteasemassa oleva glysiiniamidi etyyliaminoradi-kaalilla saadaan yhdisteitä, joiden vaikutus keltarauhasmuodostusta ohjaavan hormonin erittymiseen on voimakkaampi kuin luliberiinilla. Keksinnön mukaisella polypeptidillä on kaava: 2 641 39 Π

*— Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F

jossa A on D-Tyr, D-Tyr(Me), D-Ser, D-SeriBu1") , D-Phe, D-Ala tai D-Trp, B on Leu tai Meleu, E on Azgly, ja F on aminoradikaali, tai A on Azgly tai Azala, B on Leu, E on suora sidos, ja F on etyyliami-noryhmä; keksintö koskee myös fysiologisesti hyväksyttäviä happoaddi-tiosuoloja.

Yllä olevassa kaavassa ja koko patenttitekstissä aminohappotähteistä käytetään niiden standardilyhennyksiä (Pure and Applied Chemistry, 1974, 40, 317-331).«^ -atsa-aminohappotähde on aminohappotähde, jossa aminohapon <*f-CH on korvattu typellä. -atsa-aminohapon lyhennys on johdettu vastaavasta aminohapon lyhennyksestä liittämällä siihen etutavu Az . Azgly tarkoittaa atsaglysiiniä ja Azala atsa-alanii-nia. Milloin määrätyn amiinihapon konfiguraatiota ei ole ilmoitettu, aminohapolla on luonnollinen L-konfiguraatio (paitsisi-atsa-amino-hapoilla, joissa ei ole asymmetriakeskusta karboksiryhmän vieressä).

Keksinnön mukaisten yhdisteiden erityisiä ryhmiä ovat seuraa- vat :

Sellaiset, joissa A on D-Tyr, D-Tyr(Me) , D-Ser, D-Ser(Bu^), D-Phe, D-Ala tai D-Trp, B on Leu tai Meleu, E on Azgly, ja F on aminoradikaali .

Sellaiset, joissa A on Azgly tai Azala, B on Leu, E on suora sido, ja F on etyyliaminoradikaali.

Sellaiset, joissa A on D-Tyr(Me), D-Ser, D-Ser(Bu^), D-Phe,D-Ala, tai D-Trp, B on Leu tai Meleu, E on Azgly, ja F on aminoradikaali.

Edullisia keksinnön mukaisia yhdisteitä ovat sellaiset, joissa A on D-Tyr(Me), D-SertBu1) tai D-Phe, B on Leu tai Meleu, E on Azgly, ja F on amincryhmä.

Kolmella edullisella keksinnön yhdisteellä on seuraavat kaavat:

H

L- Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH^ Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tyr(Me)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH^ t—"Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu1)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2

Keksinnön mukainen fysiologisesti hyväksyttävä happoadditio-suola on esimerkiksi hydrokloridi, fosfaatti, sitraatti tai ase-taatti.

Keksinnön mukainen polypeptidi voidaan valmistaa kemiallisesti analogisten yhdiste? iden valmistuksesta tunnetuilla menetelmillä, 3 64139 joista esimerkkejä ovat seuraavat valmistusmenetelmät, jolloin kaavoissa A, B, E ja F merkitsevät edellä määriteltyä: a) suojatusta polypeptidistä poistetaan yksi tai useampi tavallinen peptidisuojaryhmä, jolloin saadaan kaavan I mukainen peptidi; b) kaavan Π Π n L-Glu-OH, L— Glu-His-OH, >— Glu-His-Trp-OH , Π n 1—Glu-His-Trp-Ser-OH, 1—Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH, Π n i— Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-OH, 1—Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-OH,

Qlu -His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-OH tai Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-OH

mukainen yhdiste tai tällaisen sopiva aktivoitu johdannainen saatetaan reagoimaan vastaavasti kaavan H-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-Trp-Ser-Tyr- A—B-Arg-Pro-E-F, H-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-A-B-Arg-Pro-E-F, Η-B-Arg-Pro-E-F, H-Arg-Pro-E-F, H-Pro-E-F tai H-Azgly-NH^ mukaisen yhdisteen tai tällaisen sopivan aktivoidun johdannaisen kanssa peptidien liittämisessä käytetyllä standardimenetelmällä, tai c) kaavan n

'—Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-OH II

mukaisen karboksyylihappo tai sen aktivoitu johdannainen saatetaan reagoimaan ammoniakin tai etyyliamiinin kanssa.

Menetelmässä (a) suojaryhmiä voi olla lähtöaineessa yhtä monta kuin yhdisteessä on suojausta tarvitsevia radikaaleja, joita ovat esim. kaikki yhd i.» teessä olevan vapaat OH-ryhmät; ja emäksiset NH-ryhmä t. .

Mono I ' I mässä (a) suo jaryhmä tai -ryhmät voivat olla pepl :idi- , 64139 kemian standarditeoksissa kuvattuja ryhmiä. Tällaisista teoksista voidaan mainita: M. Bodansky ja M.A. Ondetti, "Peptide Synthesis", Interscience, Mew York, 1966, luku IV; F.N. Finn ja K. Hofmann, "The Proteins", Vo 1.11, toimittanut H. Meurath ja R.L. Hill, Academic Press Inc., New York, 1976, p.106; "Amino-acids, Peptides and Proteins" (Specialist Periodical Reports), The Chemical Society, London, voi. 1-8.

Näissä kirjoissa on myös esitetty erilaisia menetelmiä näiden suoja-ryhmien poistamiseksi.

Menetelmässä (a) erityisen sopiva NH-suojaryhmä on bentsyyli-oksikarbonyyliradikaali ja erityisen sopiva OH-suojaryhmä on bentsyy-liradikaali. Kumpikin näistä ryhmistä voidaan helposti poistaa hydraa-malla, esim. käyttäen palladium-hiilikatalysaattoria.

Menetelmässä (a) erityisen sopiva NH-suojaryhmä on lisäksi t-bu-toksikarbonyyliradikaali ja erityisen sopiva OH-suojaryhmä on lisäksi t-butyyliradikaali. Kumpikin näistä ryhmistä voidaan helposti poistaa käsittelemällä hapolla, kuten kloorivetyhapolla tai trifluo-rietikkahapolla.

Menetelmässä (a) vielä eräs erityisen sopiva NH-suojaryhmä on bentsyylioksikarbonyyli- tai t-butoksikarbonyyliradikaali ja erityisen sopiva OH-suojaryhmä on t-butyyliradikaali. Nämä suojaryhmät voidaan helposti poistaa käsittelemällä HBr:llä etikkahapossa.

Menetelmässä (b) voidaan käyttää mitä tahansa peptidikemiassa käytettyä standardiliittämismenetelmää, esimerkiksi sellaisia, joita on kuvattu peptidikemian standarditeoksissa, kuten yllä mainitussa Bodansky'n ja Ondetti'n teoksessa, luku V, ja yllä mainituissa Specialist Periodical Reports of the Chemical Society, voi. 1-8.

Menetelmässä (b) sopiva liittämisreaktio on atsidiliittäminen, aktiivisen esterin liittäminen tai liittäminen käyttäen N,N'-disyklo-heksyylikarbodi-imidiä ja 1-hydroksibentsotriatsolia. Edullinen liittämisreaktio on atsidiliittäminen, ja varsinkin sellainen, jossa muodostuu His-Trp- tai Ser-Tyr-peptidisidos.

li 5 641 39

Menetelmässä (c) lähtöaineena käytettävä sopiva aktivoitu johdannainen on esimerkiksi esteri tai anhydridi. Aktivoitua johdannaista käytettäessä reaktio voidaan suorittaa saattamalla aktivoitu johdannainen kosketuksiin ammoniakin tai etyyliamiinin kanssa lai-mennusaineen tai liuottimen läsnäollessa. Niissä tapauksissa, joissa lähtöaineena on kaavan II mukainen vapaa happo, reaktio ammoniakin tai etyyliamiinin kanssa suoritetaan sopivasti käyttäen peptidiliit-tämisreaktioissa tavallisesti käytettyä reagenssia, kuten Ν,Ν'-disyk-loheksyylikarbodi-imidiä.

Valmistusmenetelmissä käytetyt lähtöaineet voidaan valmistaa tunnetuista yhdisteistä peptidien liittämisessä käytetyillä standardimenetelmillä, peptidien suojauksen standardimenetelmillä ja peptidien suojauksen poiston standardimenetelmillä, jotka kaikki ovat alan asiantuntevalle hyvin tunnettuja, ja joita on lähemmin kuvattu esimerkeissä 1-10.

Kuten yllä mainittiin, keksinnön mukaisilla yhdisteillä on luliberiiniagonistiominaisuuksia, so. niiden vaikutus on samankaltainen kuin luliberiinilla, joka on luonnollinen alanäkökukkulan (hypotalamus) erittämä hormoni, joka vaikuttaa aivolisäkkeeseen saaden sen erittämään keltarauhasmuodostusta ohjaavaa hormonia (LH) ja munarakkulaa stimuloivaa hormonia (FSH). Nämä kaksi aivolisäkehormonia säätelevät lisääntymistapahtumaa, viimeksimainitun (FSH) vaikuttaessa munasarjoihin edistäen munarakkulan kypsymistä ja edellisen (LH) saadessa aikaan munasolun irtoamisen. Kaavan I mukaisen yhdisteen vaikutus LH-eritykseen on odottamattomasti vahvempi kuin luliberiinin, ja sillä on siten käyttöä eläinten lisääntymiseen liittyvissä toimenpiteissä. Sillä on varsinkin käyttöä suurien kotieläinten siemennyksessä näiden hedelmöittymisvälivaiheen aikana ja kaikissa keinotekoisissa siemennystilanteissa munasolun irtoamisajankohdan tarkemmaksi säätämiseksi.

Keksinnön mukaisten yhdisten luliberiini-vaikutus voidaan osoittaa esimerkiksi niiden kyvyllä saada aikaan munasolun irtoaminen androgeeni-steriloiduilla, jatkuvasti kiimassa olevilla rotilla tai niiden kyvyllä saada aikaan LH- ja FSH-eritys kypsymättömien uros-rottien veriplasmaan tai hedelmöittymisvälivaiheessa olevilla tai hedelmättömillä emälampailla, jolloin LH- ja FSH-eritys mitataan kaksinkertaisella vasta-aine-radioimmuunikokeella.

6 641 39

Yllämainittu koe androgeeni-steriloiduilla rotilla suoritetaan seuraavasti:

Androgeeni-steriloiduilla naarasrotilla, joita on käsitelty 3, 4 ja 5 vrk ikäisinälOO jug:lla testosteronipropionaattia, on pysyvä kiimainen emätinlima ja lukuisia munasolun irtoamista edeltäviä munarakkuloita munasarjoissa. Antamalla luliberiiniä tai sen aktiivisia analogeja saadaan aikaan LH:n ja FSH:n vahva vaikutus munasarjoihin, mikä voidaan kokeellisesti osoittaa munasolujen esiintymisestä Fallopiaputkissa ja tuoreesta keltarauhasesta munasarjoissa .

Kaikki keksinnössä esitetyt yhdisteet ovat aktiivisempia kuin liluberiini ovulaation aikaansaamisessa jatkuvakiimaisilla rotilla, eikä niillä ole osoittautunut olevan myrkkyvaikutusta niitä annettaessa vähintään 4-kertaisena minimiaktiiviannoksena. Varsinkin keksinnön esimerkeissä 4, 6,ja 7 kuvatuilla edullisilla yhdisteillä on noin 100-kertainen aktiviteetti luliberiiniin verrattuna, eikä niillä ole saatu myrkkyvaikutusta, kun niitä on annettu 100-kertainen minimiaktiiviannos.

Tulokset nähdään taulukossa 1.

li 7 64139 W ·Η +-1 3 ί-r ¢1 o oo oo

3 ¢) C OliDOtOOOO

CO ,Q H 00 St CM t—1 CM (—I tn f—1 I—(

•η Γη αι I I I I I I I I I I

> H > -3-CMCMOOOOOOOO

•H 3 O O 00 rH tn tn •Hi—I C Γ0 I—l 1—I -< Ή *H -¾ 5 Χ·Η 3 Ö < ^ c -μ +j ft!

·'—I

.¾ -μ OlOO or- or^ oo oo oo OO O CO o r- oo oo

m Ο Γ- O CD O CD O O O O O OO O CD O O

fu iH rH i—I rH rH rH rH rH ι—( rH i—1 r—i o rH μ rH ify CD :r3 H g W 3

Ϊ2 r—I rt & CO CD COCO OO CO CO CO CO CO CO (Ό OO CO COCO COCO iO CO

w N V N. \ \ X \ \ \ \ \ \ \ X \ vN \ x ^ ^ O :rö ^ O co ro oo o co ο co o cd o co cm ,o w co ο π υ 6h * Η μ ώ |i ι il__

bO

L LO

^ tn to cm I (¾ to OUMtOCMOtOCMi—ι CQ +j LncMOLnotOLncjCMi—itncMtofr) lo to

ι -μ otnocMcotncMtncMOOtDcnCbOoouorHrHOrHO

< MO lOCMi—I ι—I O CMrH CMi—I oo oo oo oo oo oo oo I Q f. rs r #> ri fs r> r «s λ fs ^ is t\ r r* λ r r λ a r* r>

L C \ OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

rH 2 6Q

% i ^ 2 Φ ____________________ a co rH I to to

3 6* (M XCM KCM

H EH CM O O CM CM ^CM ^CM ^M ^M ^jJM >__ΓΜ

• H

33___ 3 rH ^>·> ^ >7,

CO ι—I rH rH rH rH rH >—I r~H

,W >> 6060606060606060 J Ö . , 3 3 3 ^ 3 3 CQ 3 33333333.¾^¾

JS

/-s r\ μ» <1> 3 ω S pa 51 Ö <!·^οΛώώάώάο

•H

•5 μ U rHcMooj-tncor^oocno

01 -H rH

6 Q rH

•H C 3

ΓΛ I-J

ω w

ι______I

8 64139

•H I

CO ·Η -μ 3 U 03 3| fc

•H *t—I φ uO

> Ή > I

•H 3 rH

•H«—I G TJ

<! -5 c J

+-> O 00 Γ0

HdP O 00 00 ^ 1—^ rH m I—( :m O) +-> ε

ω M

:r0 oj <x> no

--- C\1 LO i—I

w o ad

I * i—1 P

I sf j? s!

< OH

^ I -------- 3 aa 5 < +J i --.

rd P rd

•ΓΠ >0 -P O LO

^ t-ι ω H oho I 0 0 lo o o HP CP r. r* Γ.

CU C \ o o o

0 CO < bO

I 3 1 $ -- 3 1 cd co esi

Em *H [m H

K g

Dl-- w So

I—I

o 3 «a 3

< I

•H

(Λ ua li 9 64139

Keksinnön eräänä lisäpiirteenä esitetään koostumus, joka sisältää aktiiviaineena keksinnön mukaista yhdistettä yhdessä fysiologisesti hyväksyttävän laimennus- tai kantaja-aineen kanssa.

Koostumukset voidaan yleensä valmistaa tavallisella tavalla käyttäen tavanomaisia täyteaineita. Oraalisesti annettaviksi tarkoitetut koostumukset voidaan kuitenkin sopivasti päällystää suoja-päällysteellä aktiivisen polypeptidiaineosan suojaamiseksi mahalaukun entsyymien vaikutusta vastaan.

Edullinen keksinnön mukainen koostumus on oraaliseen käyttöön sopiva yksikköannos, esim. tabletti tai kapseli, joka sisältää annosta kohti 2,5 - 500 mg, edullisesti 10 - 100 mg polypeptidiä, tai parenteraalisesti annettava valmiste, joka sisältää 5 jig - 1 mg, edullisesti 10 - 100 ^ig polypeptidiä liuoksena ml:aa kohti.

Parenteraalinen koostumus on edullisesti isotoniseen suolaliuokseen tai isotoniseen dekstroosiin valmistettu liuos, joka tarvittaessa on puskuroitu PH 5 - 9:ään.

Keksintöä valaistaan seuraavilla esimerkeillä:

Esimerkeissä R^ viittaa nousevaan ohutkerroskromatografiaan (t.l.c) piihappogeelilevyillä (Kieselgel G). Kromatografiässä käytettiin seuraavia liuotinsysteemejä: butan-l-oli/etikkahappo/vesi (4:1:5 v/v) (R^A), butan-l-oli/etikkahappo/vesi/pyridiini (15:3:12:10 v/v) (R^B), butan-2-oli/3-%:inen, w/v, ammoniumhydroksidin vesiliuos (3:1 v/v) (R^C), asetonitriili/vesi (3:1 v/v) (R^D), asetoni/kloro-formi (1:1 v/v) (R^E), kloroformi/etanoli (1:4 v/v) (R^F), syklo-heksaani/etyyliasetaatti (1:1 v/v) (R^G), sykloheksaani/etyyliase-taatti/metanoli (1:1:1 v/v) (R^H), kloroformi/metanoli/vesi (11:8:2 v/v) (R^K), kloroformi/metanoli (19:1 v/v) (R^P) ja kloroformi/me-tanoli (9:1 v/v) (R^Q). Levyt tutkittiin aina UV-valossa, ja niitä käsiteltiin fluoreskamiinilla, ninhydriinillä ja kloori-tärkkelys-jodidilla. Jollei muuta ilmoiteta, niin R^-arvo tarkoittaa, että näillä menetelmillä saatiin yksi ainoa täplä.

Kaikkien tässä kuvattujen tuotteiden happohydrolysaatit valmistettiin kuumentamalla peptidiä tai suojattua peptidiä 6-n kloori-vetyhapossa, joka sisälsi 1 % w/v fenolia, suljetussa tyhjiöputkessa 16 tuntia 100°C:ssa. Kunkin hydrolysaatin aminohappokoostumus määritettiin LoCarte-aminohappoanalysaattorilla, ja kaikissa tapauksissa se täsmäsi odotetun koostumuksen kanssa. Esimerkeissä käytetyllä ilmaisulla "jatkokäsiteltiin tavallisella tavalla" tarkoitetaan, 1» 64139 että reaktion jälkeen mahdollinen kiinteä jäännös poistettiin suodattamalla, suodos haihdutettiin kuiviin alle 40°C:n lämpötilassa, etyyliasetaattiin liuotettu jäännös pestiin 20-%:isella sitruuna-hapolla, vedellä, kyllästetyllä natriumvetykarbonaattiliuoksella ja vedellä, kuivattiin vedettömällä natriumsulfaatilla, ja etyyliasetaatti haihdutettiin tyhjössä, jolloin saatiin haluttu yhdiste. Esimerkit 1-10 L-pyroglutamyyli-L-histidyyli-L-tryptofyyli-L-seryyli-L-tyro-syyli-A-L-leusyyli-L-arginyyli-L-prolyyli-E-F:n synteesi Yleinen menetelmä (m) (kaaviot 1 ja 2) Jäähdytettyyn (0°C) ja sekoitettuun L-pyroglutamyyli-L-histi-diinihydratsidin (0,2 mmoolia) suspensioon dimetyyliformamidissa (0,9 ml) ja dimetyylisulfoksidissa (0,7 ml) lisättiin 5-7-n kloori-vedyn dioksaaniliuosta (0,8 mmoolia). 5 minuutin voimakkaan sekoituksen jälkeen saatiin kirkas liuos. Liuos jäähdytettiin -?0°C:een, siihen lisättiin t-butyylinitriittiä (0,22 mmoolia), ja sekoitusta jatkettiin 20 minuuttia. Sitten lämpötila alennettiin -30°C:een, ja liuos neutraloitiin lisäämällä trietyyliamiinia (0,8 mmoolia). Lisättiin jäähdytetty (-20°C) L-tryptofyyli-L-seryyli-L-tyrosyyli-A-L-leusyyli-L-arginyyli-L-propyyli-E-F-dihydrokloridin (0,1 mmoolia, saatu hydraamalla N-bentsyylioksikarbonyylijohdannainen 80-%:isessa vesi/metanoliliuoksessa (v/v), joka sisälsi 2 ekvivalenttia kloori-vetyä Pd/C-katalysaattorin, 5 % w/w, länsäollessa 16 tuntia) ja tri-etyyliamiinin (0,1 mmoolia) seos dimetyyliformamidissa (1 ml), ja reaktioseosta sekoitettiin 24 tuntia 4°C:ssa. Dimetyyliformamidi haihdutettiin tyhjössä, ja jäännös kromatografoitiin Sephadex LH-20-pylväällä käyttäen eluenttina dimetyyliformamidia. Peptidihydroklori-di lisäpuhdistettiin partitiokromatografiällä Sephadex G-25:llä käyttäen liuotinsysteemiä n-butanoli/etikkahappo/vesi/butanoli (5:1:5:1 v/v).

L-pyroglutamyyli-L-histidyyli-L-tryptofyyli-L-seryyli-L-tyrosyyli-A-B-L-arginyyli-L-prolyyll-atsaglysiiniamidi Yleinen menetelmä (n) (Kaaviot 3, 4 ja 5) L-pyroglutamyyli-L-histidyyli-L-tryptofyyli-L-seriini-hydrat-sidi (0,2 mmoolia) liuotettiin dimetyyliformamidiin (4 ml) ja muutettiin atsidiksi menetelmässä (m) kuvatulla tavalla. Se liitettiin menetelmässä (m) kuvatulla tavalla L-tyrosyyli-A-B-L-arginyyli-L-prolyyli- li 64139 atsaglysiini-amidihydrokloridiin (0,15 mmoolia), joka oli valmistettu pelkistämällä katalyyttisestä N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bent-syyli-L-tyrosyyli-A-L-leusyyli(N1^ -nitro)-L-arginyyli-L-prolyyli-atcaglysiini-amidi 80-%:isessa (v/v) vesipitoisessa metanolissa 20 tuntia Pd/C-katalysaattorin (5 % w/w) läsnäollessa, ja hydrokloridi-na saatu hydrokloridi puhdistettiin yllä kuvatulla tavalla.

L-pyroglutamyyli-L-histidyyli-L-tryptofyyli-L-seryyli-L-tyro- syyli-A-B-L-arginyyli-L-prolyyli-atsaglysiini-amidln synteesi

Yleinen menetelmä (o) (kaaviot 4 ja 6)

Suojatun dekapeptidijohdannaisen (jossa on SerCBu"1·) 6-asemas-sa tai Tyr(Bu"^) 5-asemassa) (50 mg) liuos valmistettiin 90-%:iseen (v/v) trifluorietikkahapon vesiliuokseen (5 ml). Lisättiin 3 tippaa /3 -merkaptoetanolia, ja liuos sai seistä huoneen lämpötilassa 4 5 minuuttia. Liuotin poistettiin tyhjössä, ja jäännös kylmäkuivattiin kerran vedestä ja 2 kertaa t-butanolissa. Saanto 90-100 %.

Taulukossa 2 on lueteltu näillä yleisillä menetelmillä valmistetut esimerkkien 1-10 yhdisteet.

Esimerkki 11

Edellä esimerkeissä 1-10 kuvatuilla analogisilla menetel-mävaiheilla valmistettiin kaavan I mukainen yhdiste, jossa A on D-Ser(Bu ), B on Leu, E on Azgly ja F on NH^· Tuotteella on samat analyyttiset tunnusmerkit kuin esimerkin 7 yhdisteellä.

Kaavio 7 kuvaa tätä valmistusta.

i2 641 39

oooot^t^LnLOLOLn^r <C CNOOPOCsICOCNCNICsIOOOO

QS oooooooooo

uO

c · 1)1000 I—lt^r^(0(0r~0 Φ ooot^oococncnooCT) ή£ S H ι-l »H O O O O O O O ω p u tn §.5 _ 21 -H ^ X 0) ΦΛΗ 00 c- oocni.3-j3-j3-c~-

rH *H *CDCT)CDOi-OCJ)CnCJ)00 00 <D rH CM

•HP ΟΟΌι—IOOOOO O

^ rH 30 s.w α tO 1h D-. 0i

dP

r>

o lOCNCnOlOlOi—I lO <_0 CO

^ CNjj-roj-r—( rH <r> cd jJ- cm CM ___ 'i g I—! d) 2 -h sesccccooc 8 8 .Ji__

LO lO

^ ^_JM CM ^ CM CXI OJ Cxi CM CM CXI

I I fM

W ΙΙγΗγΗ»—IrHf-Hr—IrH rH

I W bJlbObObötiOtiObObO

Jh p p < „ ppppppppcutu

4 S S

£---- EH /-\ +J r-r J 0) P 0) h ^rOfOojftscQ^^x: 0) rH r~) r—] ,£0 £2 '—r m H \—/ CO < W)(0<i0-H^S-iCOCU^ o. 3<QQnf0i/)OQH' 6 Λ A Λ 'Λ •rl------- :π :j -¾ r~< U) Ο Ή r j ff) _t I r> (O f- - rjf.) <7> c >

I—<JJ V) C rH

L_J ----

II

13 641 39

Yllä nainituissa menetelmissä käytetyt lähtöaineet voidaan valmistaa seuraavien kaavioiden 1 ja 2 (menetelmä (m)), kaavioiden 3, 4 ja 5 (menetelmä (n)) ja kaavioiden 4 ja 6 (menetelmä (o)) mukaan.

Näissä kaavioissa käytetään seuraavia lyhennyksiä: OCp= 2,4,5-trikloorifenyyliesteri Bzl = bentsyyli Z = bentsyylioksikarbonyyli Boc = t-butoksikarbonyyli DMF = dimetyyliformamidi

Ympyröidyt numerot viittaavat kulloinkin käytettyyn reaktio-vaiheeseen .

14 641 39 lpi in m in in in in in in

—r— *ητ* H|rH t-j»H ky» ky< WH ky» «—H

*-!·< > I 4 »1 « > i * 1-1 | 1 I I *-l—I kJ—< 1-1—1 nj c\j nj oj nj oo c\j nj c\j o c_> ο οουοοο g_g § £ I i £ s s g §

^ N1 0 CO X

© Q

OJX f\J r\J OJ .

OQOOO+ + + + |?_7~^j ^_±^|_=3^ 18 “ * © h ä ^ £ mx (?) (E)

3 O <5 S S o ^ ^ rH

a-1---------O

6 -H

il > O rt rt o v 0 o o PD CQ O Co fr rt < cc-x cc—e CC—§ CC—2 bi bO (0----- 1 I I 1 M 10 to c\j x g X < < < I© © ® 0 © 1—1 O (ifl) 1-11 1 (k\ rH I—I Γ-Η r-ι r-H o t. No '^-r' N Os/ to \n; t·] N N N N ^ fr m\| m^| m^[ ca^|c0^|a>^|___ COCOCO CO CO CO M CO X « © ΐ , ? g I rn® :s <d b C/0- ^

I—I

_ Π3

X I

©© @ I

& .s H-------s I tl M N1 M tx) N] X ΡΪ w fV ,

X «H

ω Oi £ C

m £ m -H

m O O X X -h 3-1----“ >1 I i—i

X bO

rt ® © « d—-- -i...........11 < li 641 39 . 15

rvjojojpjojojojrviojfM

E K P; ΙΠ K t?; Ph !5 Ρπ Ξ έ Λ 0 * - ,4 0-4 0 -4 ·' «*-Η fH f hO---------- N » g © © s__4_________ * n m * /a ^ y ©

f\JX OIX OJ

o o o o o + + + + + + 7Z x 7:: x X χ x^ X. X x g1 \| N_^_\_^_\_7_^^

X

o ® 3 5---------

(S3 M CO X

H J? lf „ ® (§) cö Ö 6 iä x

rH

---------- 3 x (§)©(§)

»-H ζΥ f—I rH rH rH

tO O to N to N

k no^j cn^ cn^ (S^ ca^

I? "| ^ I CN

M N) tsi M M X Q

•H

sf © J

0) JU X v-^ ä s Sd u o ö g x «-i-^^--^-- x B © © © o £--—|—^^^^——- ts3 hO NI (S3 N3

C\J

.« .«j jjj •2-----1 '1 I -r]—

X

@ © $ [3---1---- 15 CM CM CM ~ CM CM CM CM CM 64^139 t—l" 1 1 1 * 1 1-1 o g © ®

in I

a.-1------- M N x ® © PJ OJ OJ OJ , £0 § ci § § § +n: ^ £_N N x_ ο υ cc

O O

CQ CQ

s I I I I_:_zi ®__ x s| ! © © ®___ n ~ = (D © © r~i Cu r-C t—i I—( r—i

NO N N N CO

^ CQ O CQ al CQV CQ.

&_M_h... MS_is_is__

CM CM CM CSJ CM X

CO

CM O

ϋ I I I I ^ > s* oooaxx 2

Si_I_I_I_I_I_I_ s

X

H

a @ © © £ ['3-1—^—1—1—1—1—*— 17 641 39

CM CM CM CM

X X X X

>> s X X 2;

rH

t>0 M ------ < ©

O

P. ------ PLi

(M CM

o o + + *>J__N»_^^ <

X

CM

X

cu ο» α> X

£ ss ε: x § o o o x 2: 3 ^ g> - I_______- J | : © © _ -~v o © © © © ® © <_ί I Γ© © © © o > _. ^ H H H ^ 2 £ 8 « m « ®v * S_NJ_A_^^^__ (P 1 1 ]3 N Μ M M ►£

CM

S Γ^Λ

E Z

t, S

<U---

CO

.—\

-P

3

' CQ

0) a w t,---<

fH Q

© I

w P

•H >>

X - H

Q

II < 3 r—I - - -_ 1 _ * —

Cf 18 641 39

C\J ro CM CM

K K te K

>, z 2: z z rH i bO_______ to < © o____

CC

CM CM’ O O + + s 2. cc cc 2—_\^_N.

< *-r-«

CM

a» Φ <u oj te

s s s 2: Z

3 0 0 0 0 K

<D Z

vl 4)---------

S

T X© © © © © © t j________- ^ o Q CM CM X > fÖ

t—I Q< r~I Ή f—I r—I

N O N N N N

m o en co co co s_:4 4.-n,___ CM _.

[Sj CM N3 CSJ CC

ro cc π: κλ

Ci «e. z 4) ________I _ co a u_____

H

X

3 rH ----- ' ‘ ' ^*———J *

Cf 19 641 39

(M OJ (M (Μ CM

K X X X X

^ z 22 x x x #H | bO.........................1 ^ I ! © o ____—------ 5-.

X

X .

O + + + 2 X X χ .

»___\ \J \_ <

X

CM

x

φ Φ Φ <D X

3 S £ s S 35 2© (D o o o o *-. x μ-) I _I ____ <L> ------ ' s ! © © © © © ©

Qj x .CO co X _____

I------ O

Q _ X > MM 0) rtf

4-) -P 4J> +5 +L +3... X

3X33 3 3 3 3 caocQCQ x 00 ® x

- N \ \ \ N N—^_I

£ I I t I x

M M M M

CM

X K'C

I z c ________________

OJ

CO

X

Π 20 641 39 ro ro S g >5 ^ t? _______ < ~ ----

X

C\J

Oi ω φ φ qj 0 g

g I δ B 6 i sP

a! ' ------_ x

§<M _ ro CM CM

S ' S S β + + + + +

O 2 2 g E XX 2 V

l—S). ^ ^ \ ν^_λ_λ_Λ a o cc <s a Ά----:------ .3 o

v— *H

U > °? -------- (0 Q * I—t f—f

N N

CO CQ, t--1 N l---;-- N3 M tn

.sP

u

Ci-- 00 -- a £ -:----- w H --—______

X

3 M -------------- C3 21 - 641 39

Vaihe 1 N-bentsyylioksikarbonyyli-L-proliinia (1994· g, 80 mmoolia) ja N-metyylimorfoliinia (8,8 ml, 80 mmoolia) liuotettiin kuivaan tetrahydrofuraaniin (200 ml), ja liuos jäähdytettiin -20°C:een.

Lisättiin tipoittain etyyliklooriformiaattia (7,15 ml, 76 mmoolia), ja 2 minuutin sekoituksen jälkeen jäähdytettyä (-20°C) etyyliamii-nin vesiliuosta (20 ml, 300 mmoolia), ja sekoitusta jatkettiin 18 tuntia 4°C:ssa. Reaktioseosta jatkokäsiteltiin tavallisella tavalla, ja jäännös kiteytettiin etyyliasetaatti/petrolieetteristä (kp. 60-80°C) . Saanto 12,97 g (58,7 %),sp. 107-108°C, Λ*/25 ’5-43,88° (c, 1 metanolissa), R^D 0,69, R^E 0,53, R^F 0,67, R^H 0,62, R^P 0,57, R^-Q 0,66.

Vaihe 2

Katalyyttinen pelkistys Pd/C-katalysaattorin (5 %) läsnäollessa vesipitoisessa etanolissa, jossa on 1 ekvivalentti kloorivetyä, 5 tunnin ajan huoneen lämpötilassa.

Vaihe 3 N Qi-t-butoksikarbonyyli-NOC-nitro-L-arginiinin (13,5 g, 42,3 mmoolia), L-proliini-etyyliamidihydrokloridin (7,15 g, 47 mmoolia), 1-hydroksibentsotriatsolin (11,5 g 85 mmoolia) ja trietyyliamiinin (6,58 ml, 47 mmoolia) liuos DMF:ssä jäähdytettiin 0°C:een, ja liuokseen lisättiin disykloheksyylikarbodi-imidiä (9,13 g, 44,4 mmoolia). Reaktioseosta sekoitettiin 4°C:ssa yön yli, se suodatettiin kiinteän aineksen poistamiseksi, ja suodos haihdutettiin kui-, viin tyhjössä. Jäännös jaettiin etyyliasetaatin ja veden kesken vas- tavirtajakomenetelmällä (4 siirtoa). Vesifaasit yhdistettiin, haihdutettiin kuiviin ja jäännös jaettiin n-butanolin ja 5-%:isen (v/v) etikkahapon vesiliuoksen kesken vastavirtajakomenetelmällä (12 siirtoa). Yhdistetyistä n-butanolifaaseista haihduttamalla saatu raakapeptidi puhdistettiin kromatografoimalla piihappogeelipylväällä käyttäen elu-ointiin 5-%:ista (v/v) metanoli/kloroformia ja 10-%:ista (v/v) meta-noli/kloroformia. Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin, haihdutettiin kuiviin, ja jäännöksen vesiliuos laskettiin anioninvaihto-hartsipylvään (AG 1-X2) lävitse n -t-butoksikarbonyyli-N*'* -nitro-arginiinin poistamiseksi. Pylväs pestiin sitten vedellä, ja yhdistetyt vesifaasit ja pesunesteet kylmäkuivattiin, jolloin saatiin atsapeptidi-johdannainen, saanto 16,67 g (89 %), sp. 109-111°C (hajoaa), /<£/p ~ 39,0° (c, 1 metanolissa), R^A 0,62, R^B 0,74, R^C 0,59, R^D 0,70, 22 64139

RfH 0,20, RfF 0,60, RfH 0,61, RfK 0,85, PfQ 0,121.

Vaihe 4 N-t-butoksikarbonyylijohdannainen liuotettiin etyyliasetaattiin, ja liuosta käsiteltiin 3-n HCl-etyyliasetaattiliuoksella (M· ekvivalenttia) tunnin ajan huoneen lämpötilassa.

Vaihe 5 (R=H) t-butoksikarbonyylihydratsid.i n (2,90 g, 22 mmoolia) ja tiheni syylioksikarbonyy li-0-bent syy li-L-tyros iini-2 , 4-, 5-trikloorifenyy-liesterin (11,71 g, 20 mmoolia) liuosta dimetyyliformamidissa (40 ml) pidettiin yön yli huoneen lämpötilassa. Jatkokäsittely suoritettiin tavallisella tavalla, ja jäännös kiteyte :tiin eetteri/petrolieette-ristä (kp. 60-80°C), jolloin suojattu hydratsidi saatiin valkeana jauheena, 3,46 g (67 %), sp. 126-1?7°C, /oc/^ = -13,2° (c, 1 meta-nolissa) , RfD 0,82, Rf.E 0,65, RfF 0,63, RfH 0,70.

Vaihe 6 (R = H) 1-(N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosyyli)- 2-t-butoksikarbonyylihydratsidi (5,19 g, 1C mmoolia) liuotettiin etyyliasetaattiin (50 ml), ja liuosta käsiteltiin 5-n kloorivedyllä etyyliasetaatissa (8 ml, 40 mmoolia) tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Etyyliasetaatti haihdutettiin tyhjössä, jäännökseen lisättiin eetteriä, hydrokloridi suodatettiin ja kuivattiin.

Vaihe 7 (R=H). Yllä saatu hydrokloridi liuotettiin tetrahydrofuraaniin (75 ml), ja liuokseen lisättiin trietyyliamiinia (1,15 g, 8 mmoolia) ja sitten N-karbonyyli-L-leusiinimetyyliesteriä (1,36 g, 8 mmoolia).

16 tunnin seisotuksen jälkeen huoneen lämpötilassa reöktioseosta jatkokäsiteltiin tavallisella tavalla, ja jäännös kiteytettiin etyy-liasetaatti/petrolieetteristä (kp. 60-80°C), jolloin saatiin atsa-tripeptidijohdannainen, 4,57 g (77,7 %), sp. 156-157°C, /= -10,3° (c, 1 metanolissa), RfD 0,81, RfE 0,45, R^p 0,26, RfQ C,47.

Vaihe 8 N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosyylistsaglysyyli-L-l le us nnime t yy 1 i gs Lsnn (2,95 g, 5 nunoo lie) liuokseen tie t anoi isse (50 ml) lisättiin hydratsiinihydraattia (5 ml, ICO mmoolia). 2 tunnin seisotuksen jälkeen huoneen lämpötilassa hydratsidi säestettiin vedellä ja kiteytettiin uudelleen metanoli/eetteristä, jolloin saatiin 2,74 g.

23 641 39 (92,8 %), sp. 169-170°C., /^/^-9,05° (c, 1 dimetyyliformamidissa),

RfA 0,76, RfB 0,75, RfC 0,73, RfD 0,63, R F 0,60, RfH 0,55.

Vaiheet 9 ja 10 (R=H). N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosyyli-atsaglysyyli-L-leusiinihydratsidia (1,18 g, 2,0 mmoolia) liuotettiin dimetyyliformamidiin (10 ml), liuos jäähdytettiin -20°C:seen, ja siihen lisättiin 5,49-m kloorivedyn liuos dioksaanissa (1,46 ml, 8 mmoolia) ja sitten t-butyylinitriittiä (0,25 ml, 2,2 mmoolia).

5 minuutin kuluttua liuos jäähdytettiin -30°C:seen, ja siihen lisättiin jäähdytetty N1*3 -nitro-L-arginyyli-L-proliini-etyyliamidihydro-kloridin (0,836 g, 2,2 mmoolia) ja trietyyliamiinin (1,43 ml, 10,2 mmoolia) seos dimetyyliformamidissa (10 ml ). Reaktioseosta sekoitettiin tunnin ajan -10°C:ssa ja 48 tuntia 4°C:ssa. Jatkokäsittely suoritettiin tavallisella tavalla ja pentapeptidi puhdistettiin pii-happogeelipylväällä kromatografoimalla käyttäen eluointiin kloroformia ja 3 % (v/v) metanolia sisältävää kloroformia, saanto 0,695 g (38,5 %), R^ 0,71, RfB 0,72, RfC 0,84.

Vaihe 11 (R=H). Katalyyttinen pelkistys käyttäen katalysaattorina Pd/C (5 % w/w) 80-%:isessa (v/v) vesipitoisessa etikkahapossa, joka sisälsi 2 ekvivalenttia HC1.

Vaihe 12 N-bentsyylioksikarbonyyli-L-tryptofaanin (33,84 g, ICO mmoolia) ja N-metyylimorfoliinin (11,0 ml, 100 mmoolia) voimakkaasti sekoitettuun, jäähdytettyyn (~20°C) liuokseen tetrahydrofuraanissa (200 ml), lisättiin etyyliklooriformiaattia (9,0 ml, 95 mmoolia). 2 minuutin kuluttua lisättiin L-seriini-metyyliesterihydrokloridin (17,10 g 110 mmoolia) ja N-metyylimorfoliinin (12,1 ml, 110 mmoolia) esi-jäähdytetty (-20°C) liuos dimetyyliformamidissa (150 ml), ja sekoitusta jatkettiin -20°C:ssa 30 minuuttia ja huoneen lämpötilassa 3 tuntia. Tavallisella tavalla suoritetulla jatkokäsittelyllä saatiin öljy. Kiteyttämällä 2 kertaa etyyliasetaatti/petrolieetteristä (kp. 60-80°C) saatiin dipeptidijohdannainen (30,53 g, 69,5 %), sp. 140,5-141°C, /Gi/p4 = -22,13° (c, 1,4 dimetyyliformamidissa).

Vaihe 13

Edellä saatu esteri (30,53 g, 69,5 mmoolia) liuotettiin meta-noliin (1 litra), ja liuokseen lisättiin 62-%:ista (w/v) hydratsiini- ., 2^ 64139 hydraatin liuosta (15 ml). 16 tunnin kuluttua hydratsidi koottiin, pestiin metanolilla ja eetterillä ja kiteytettiin kuumasta etanolista (23,18 g, 75,8 %), sp. 178-179°C, /06/^4 = -25,27° (c, 1 dimetyyli-formamidissa) , R^D 0,65, R^E 0,20, R^F 0,43, R^-H 0,50.

Vaiheet 14 ja 15 N-bentsyylioksikarbonyyli-L-tryptofyyli-L-seriinihydratsidin (0,502 g, 1,16 mmoolia) jäähdytettyyn (-20°C) ja sekoitettuun liuokseen dimetyyliformamidissa (5 ml) lisättiin 6,02-n kloorivedyn di-oksaaniliuosta (0,77 ml, 4,64 mmoolia) ja senjälkeen t-butyylinit-riittiä (0,14 ml, 1,22 mmoolia). 30 minuutin kuluttua liuos jäähdytettiin -30°C:seen ja neutraloitiin lisäämällä trietyyliamiinia (0,65 ml, 4,65 mmoolia). Lisättiin L-tyrosyyliatsaglysyyli-L-leusyyli-L-arginyyli-L-proliini-etyyliamididihydrokloridin (0,547 g, 0,77 mmoolia) ja trietyyliamiinin (0,108 ml, 0,77 mmoolia) esijäähdytetty (-20°C) seos dimetyyliformamidissa (5 ml), ja sekoitusta jatkettiin tunnin ajan -20°C:ssa ja 48 tuntia 4°C:ssa. Reaktioseos suodatettiin, ja suodos haihdutettiin kuiviin tyhjössä. Raakapeptidi puhdistettiin pylväskromatografiällä piihappogeelillä käyttämällä eluoin-tiin kloroformia, 10-%:ista (v/v) metanoli/kloroformia ja kloroformi/ metanoli/vesiseosta (11:8:2 v/v), saanto 0,424 g (52,9 %), /oc/j^ = -16,84° (c, 1,5 metanolissa), R^A 0,61, R^C 0,36, R^D 0,67, R^K 0,90.

Vaihe 18 o 24 (R=Me). Samoin kuin vaihe 5, saanto 66 %, sp. 102-104 C, /oc/^ = -15,5° (c, 1 metanolissa), R^D 0,76, R^E 0,68, R^F 0,76, R^H 0,74.

Vaihe 19 (R=Me). Samoin kuin vaihe 6.

Vaihe 20 (R=Me). Samoin kuin vaihe 7, saanto 93 %, sp. 145-146°C, /oi/^s + 8,7° (c, 1,2 metanolissa), R^-A 0,88, R^B 0,88, R^C 0,83, R^D 0,80,

RfE 0,59, RfF 0,78, RfH 0,73.

Vaihe 21 N-bentsyylioksikarbonyyli-0-bentsyyli-L-tyrosyyli-atsa-ala-nyyli-L-leusiini-metyyliesterin (2,41 g, 4 mmoolia) sekoitettuun liuokseen metanolissa (36 ml) lisättiin 1-n natriumhydroksidia (12 ml, 12 mmoolia) huoneen lämpötilassa, ja sekoitusta jatkettiin 3 tuntia. Metanoli poistettiin tyhjössä, ja jäännöksen vesiliuos (40 ml) tentiin happameksi sitruunahapolla (pH 3) ja uutettiin etyyliasetaa- 11 64139 25 tiliä. Etyyliasetaatti pestiin vedellä ja kuivattiin (^£50^), liuotin poistettiin, ja jäännös liuotettiin dimetyyliformamidi/vesiseokseen (3:2 v/v, 200 ml) ja vietiin AG 1 x-2-hartsipylväälle (100 ml). Pylväs pestiin yllä mainitulla liuottimena (50 ml), ja tripeptidi eluoi-tiin 0,2-m etikkahapolla dimetyyliformamdi/vesiseoksessa (3:2 v/v). Tripeptidiä sisältävät fraktiot yhdistettiin, haihdutettiin tyhjössä, ja jäännöstä trituroitiin eetterin kanssa. Tuotetta saatiin 1,22 g (51,7 %), sp. 195°C (hajoaa), /(y/^4 = -25,4° (c, 1 dimetyyliformami-dissa).

Vaihe. 7 7 (R=Me). Samoin kuin vaihe 10, saanto 43 %, /(37^5 = -25,9° (c, 1 metanolissa), R^A 0,72, R^B 0,76, R^C 0,85.

Vaihe 23 (R = Me). Samoin kuin vaihe 11.

Vaihe 2 4 (R = Me). Samoin kuin vaihe 15 paitsi, että lopputuote puhdistettiin piihappogeeli-pylväskromatografoinnin jälkeen lisäksi geelisuodatuksella Sephadex LH-20:llä dimetyyliformamidissa. Saanto C O Λ l J ^ ^

bcs *, _ -24,76° (c, 0,8 metanolissa), RfA 0,58, RfC 0,42, RfD

0,65, RfK 0,95.

Vaihe 25 N-bentsyylioksikarbonyyli-L-proliinin (24,9 g, 100 mmoolia), semikarbatsidihydrokloridin (11,2 g, 100 mmoolia) ja trietyyliamiinin (14,5 ml, 100 mmoolia) sekoitettuun ja jäähdytettyyn (0°C) suspensioon dimetyyliformamidissa (200 ml) lisättiin disykloheksyylikarbodi-imidiä (20,6 g, 100 mmoolia), ja sekoitusta jatkettiin 16 tuntia 4°C:ssa. Disykloheksyyliurea poistettiin suodattamalla, ja suodos haihdutettiin pieneen tilavuuteen. Lisättiin vettä (200 ml), ja liuos uutettiin etyyliasetaatilla (3 x 50 ml). Tuote saostui vesiliuoksesta noin tunnin kuluessa. Uudelleenkiteyttämällä vesipitoisesta metanolista saatiin dipeptidiamidi (16,5 g, 53,9 %), sp. 189-190°C, /θ(/^ = -43,6° (c, 1,4 dimetyyliformamidissa), R^.D 0,54, R^F 0,52, R^H 0,38, R^K 0,78.

Vaihe 26

Katalyyttinen pelkistys 80-%:isessa (v/v) vesipitoisessa dimetyyliformamidissa 5-%:isen (w/w) Pd/C-katalysaattorin avulla 6 tunnin ajan huoneen lämpötilassa HCl:n läsnäollessa (2 ekvivalenttia).

26 6 4 1 39

Vaihe 27 N-bentsyylioksikarbonyyli-L-leusiinin (8,24 g, 31 mmoolia) ja trietyyliamiinin (4,55 ml, 32,5 mmoolia) liuokseen tetrahydro-furaanissa (100 ml) lisättiin -10 - -15°C:ssa etyyliklooriformiaattia (2,83 ml, 29,5 mmoolia). Reaktioseosta sekoitettiin 3 minuuttia tässä lämpötilassa, ja sitten se kaadettiin N^-nitro-L-arginiinin (5,79g, 31 mmoolia) voimakkaasti sekoitettuun liuokseen 2-n natriumhydroksi-dissa (15,5 ml, 31 mmoolia) ja dimetyyliformamidissa (50 ml) -10°C:ssa. Sekoitusta jatkettiin -10°C:ssa. Sekoitusta jatkettiin -10°C:ssa 30 minuuttia ja sitten huoneen lämpötilassa tunnin ajan. Liuottimet poistettiin tyhjössä, ja jäännös jaettiin etyyliasetaatin (50 ml) ja veden (50 ml) ja veden (50 ml) kesken. Vesifaasi erotettiin ja uutettiin vielä kahdella etyyliasetaattiannoksella. Yhdistetyt orgaaniset faasit pestiin vielä kerran vedellä (25 ml) ja hyljättiin.

Yhdistetyt vesifaasit tehtiin happameksi sitruunahappoliuoksella ja uutettiin etyyliasetaatilla (3 x 100 ml). Etyyliasetaattiuutteet yhdistettiin, pestiin vedellä, kuivattiin (Ν32304) ja haihdutettiin kuiviin. Kiteyttämällä jäännös etyyliasetaatti/petrolieetteristä (kp. 60-80°C) saatiin dipeptidi (8,98 g, 62 %), sp. 150-165°C (hajoaa).

Vaihe 28 N-bentsyylioksikarbonyyli-L-leusyyli-(Nw-nitro)-L-arginiinin (9,2 g, 20 mmoolia), L-prolyyliatsaglysiiniamidihydrokloridin (4,2 g, 20 mmoolia), 1-hydroksibentsotriatsolin (5,4 g, 40 mmoolia) ja trietyyliamiinin (3 ml, 20 mmoolia) liuos dimetyyliformamidissa (200 ml) jäähdytettiin 0°C:seen, ja liuokseen lisättiin disyklohek-syylikarbodi-imidiä (8,2 g, 40 mmoolia). Reaktioseosta sekoitettiin yön yli huoneen lämpötilassa. Disykloheksyyliurea poistettiin suodattamalla, ja suodos haihdutettiin kuiviin. Uudelleenkiteyttämällä jäännös metanoli/eetteristä saatiin tetrapeptidijohdannainen (12,2 g, 98 %), sp. 88-90°C, /Oc/^ = -30,2° (c, 1,6 dimetyyliformamidissa),

RfD 0,57, RfF 0,40, RfH 0,26, RfK 0,63.

Vaihe 29

Hydraus 5 % risen (w/w) Pd/C-katalysaattorin avulla vesipitoisessa etanolissa kloorivedyn (2 ekvivalenttia) läsnäollessa 16 tunnin ajan.

Vaihe 30 N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosiini-2,4,5-triklo-rifenyyliesteriä (6,484 g, 11,0 mmoolia) ja D-alaniinimetyyliesteri- 2? 64139 hydrokloridia (1,396 g, 10 mmoolia) liuotettiin dimetyyliformamidiin (50 ml) ja liuokseen lisättiin trietyyliamiinia (1,4 ml, 10,0 mmoolia), ja liuosta sekoitettiin yön yli huoneen lämpötilassa. Reak-tioseoksen jatkokäsittely suoritettiin tavallisella tavalla, ja jäännös kiteytettiin kuumasta etyyliasetaatista, jolloin saatiin 3,782 g, 77,2 % suojattua dipeptidimetyyliesteriä, sp. 163°C, = -12,84° (c, 1,1 dimetyyliformamidissa).

Vaihe 31 N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosyyli-D-alanii-nimetyyliesteriä (3,453 g, 7,0 mmoolia) liuotettiin lämpimään metanoliin (400 ml), ja liuosta käsiteltiin 62 %:isella (w/v) hydrat-siinihydraatilla (10 ml, 120 mmoolia), ja seos jätettiin yöksi 25°C: seen. Hydratsidi suodatettiin, pestiin metanolilla ja eetterillä ja kiteytettiin 2 kertaa kiehuvasta metanolista, saanto 3,068 g, 89,2 %, sp. 217°C, AV/^4 -20,44° (c, 1,1 dimetyyliformamidissa) R^A 0,73 RfB 0,75, RfC 0,67, RfD 0,70, RfE 0,50, RfF 0,54, RfH 0,67, RfK 0,85, RfQ 0,25.

Vaiheet 32 ja 33 Jäähdytettyyn (-20°C) ja sekoitettuun N-bentsyylioksikar-bonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosyyli-D-alaniinihydratsidin (1,18 g, 2,4 mmoolia) liuokseen lisättiin 6,02-m kloorivetyliuos dioksaanissa (1,6 ml, 9,6 mmoolia) ja sitten t-butyylinitriittiä (0,29 ml, 2,52 mmoolia). 15 minuutin kuluttua lisättiin esijäähdytetty (-20°C) L-leusyyli-L-arginyyli-L-prolyyliatsaglysiiniamididihydrokloridin (1,03 g, 2,0 mmoolia) ja trietyyliamiinin (1,62 ml, 11,6 mmoolia) liuos dimetyyliformamidissa (15 mml/. Sekoitusta jatkettiin 4°C:ssa 24 tuntia. Trietyyliamiinihydrokloridi poistettiin suodattamalla, ja suodos haihdutettiin kuiviin tyhjössä. Jäännös vietiin piihappo-geelipylväälle, ja pylväs eluoitiin 5-%:isella (v/v) metanoli/kloro-formiseoksella, 10-%:isella metanoli/kloroformiseoksella ja kloro-formi/metanoli/vesiseoksella (11:8:2 v/v). Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin, haihdutettiin ja kromatografoitiin uudelleen piihappogeelipylväällä käyttäen eluointiliuottimena asetonitriili/ve-siseosta (3:1 v/v), jolloin saatiin 890 mg /<v/j^ = -45,7° (c, 1,1 metanolissa), R^A 0,54, R^B 0,69, R^C 0,41.

Vaihe 34

Samoin kuin vaihe 11.

Vaihe 35

Samoin kuin vaihe 15, saanto 43 %, /^/^ = -41,4° (c, 1,3 28 641 39 metanolissa), R^A 0,80, R^-C 0,47, R^D 0,65, R^K 0,95.

Vaihe 38

Samoin kuin vaihe 3, saanto 69 %, sp. 135°C, R^A 0,49, Rj.B 0,65, RfC 0,46, RfD 0,64, R F 0,35, RfH 0,19, RfK 0,86.

Vaihe 39

Samoin kuin vaihe 4.

Vaihe 40 (A = D-Phe). N-bentsyylioksikarbonyyli-D-fenyylialaniinin (7,41 g, 24,8 mmoolia) ja L-leusiinimetyyliesterin (3,62 g, 25 mmoo-lia) liuos etyyliasetaatissa (100 ml) jäähdytettiin 0°C:seen, ja liuokseen lisättiin disykloheksyylikarbodi-imidiä (5,15 g, 25 mmoo-lia). Reaktioseosta sekoitettiin yön yli 4°C:ssa. Tavallisella jatkokäsittelyllä ja kiteyttämällä jäännös etyyliasetaatti/petrolieette-ristä (kp. 60-80°C) saatiin dipeptidi (9,1 g, 86 %), sp. 123-124°C, - “18,7° (c, 2,1 metanolissa), R^D 0,76, R^E 0,65, R^F 0,74,

RfH 0,73.

Vaihe 41 (A = D-Phe) Katalyyttinen pelkistys 5 tunnin aikana käyttäen 5 %:ista (w/w) Pd/hiiltä etanolissa, joka sisälsi 1 ekvivalentin kloorivetyä.

Vaihe 4_2 (A = D-Phe). N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosii-ni-2,4,5-trikloorifenyyliesterin (4,89 g, 8,36 mmoolia) ja D-fenyyli-alanyyli-L-leusiinimetyyliesterihydrokloridin (2,5 g, 7,6 mmoolia) sekoitettuun liuokseen dimetyyliformamidissa lisättiin trietyyliamii-nia (1,1 ml, 7,6 mmoolia), ja sekoitusta jatkettiin huoneen lämpötilassa yön yli. Trietyyliamiinihydrokloridi suodatettiin, ja suodos haihdutettiin kuiviin. Uudelleenkiteytt ämällä jäännös vesipitoisesta metanolista saatiin tripeptidijohdannainen (3,6 g, 69,7 %), sp. 183-184°C, RfD 0,82, RfE 0,69, RfH 0,78, RfP 0,71, RfQ 0,82.

Vaihe 43 (A = D-Phe). Edellä saadun metyyliesterin (3,42 g, 5,04 mmoolia) ja hydratsiinihydraatin (60 mmoolia) liuosta dimetyyliformamidissa (30 ml) sekoitettiin huon-en lämpötilassa 4 tuntia, sitten liuos haihdutettiin pienempään tilavuuteen ja hydratsidi saostettiin lisäämällä vettä (500 ml). Se koottiin, pestiin vedellä metanoli/eette-rillä (1:4 v/v) ja eetterillä ja kuivattiin. Saanto 2,94 g (85,9 %), sp. 179-180°C, RfA 0,81, RfB 0,79, RfC 0,88, RfD 0,69, RfE 0,49, li 29 641 39

RfF 0,65, RfH 0,67, RfP 0,25, RfQ 0,57.

Vaiheet 44 ja 45 (A = D-Phe). N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyro-syyli-D-fenyylialanyyli-L-leusiinihydratsidin (1,86 g, 2,75 mmoolia) liuokseen dimetyyliformamidissa (5 ml) lisättiin -20°C:ssa 6,02-m kloorivetyliuos dioksaanissa (1,83 ml, 11 mmoolia) ja senjälkeen t-butyylinitriittiä (0,33 ml, 2,89 mmoolia). 2 minuutin kuluttua lisättiin esijäähdytetty (-20°C) trietyyliamiinin (1,89 ml, 13,5 mmoolia) ja NU> -nitro-L-arginyyli-L-prolyyliatsaglysiiniamidihydro-kloridin (1,02 g, 2,5 mmoolia) liuos dimetyyliformamidissa (10 ml), ja reaktioseosta sekoitettiin yön yli 4°C:ssa. Jatkokäsittelemällä tavallisella tavalla saatiin heksapeptidijohdannainen, joka puhdistettiin edelleen piihappogeelillä (120 g) pylväskromatografiällä käyttämällä eluointiliuottimina 5-%:ista (v/v) metanoli/kloroformiseosta, 10-%:ista (v/v) metanoli/kloroformiseosta ja kloroformi/metanoli/vesi-seosta (11:8:2 v/v). Saanto 0.74 g (29,3 %), sp. 137-139°C, RfA 0,68, RfB 0,72, RfC 0,58, RfD 0,62, RfH 0,39, RfK 0,95.

Vaiheet 46, 47 ja 48 L-pyroglutamyyli-L-histidiinihydratsidi (10 mmoolia) muutettiin atsidiksi yleisessä menetelmässä (m) kuvatulla tavalla ja liitettiin L-tryptofyyli-L-seriinimetyyliesteriin (11 mmoolia, valmistettu hydraamalla N-bentsyylioksikarbonyylijohdannainen dimetyyliformamidissa 5-%:isen Pd/C:n, w/w, läsnäollessa reaktion tapahtuessa -10°C:ssa 30 minuutin ajan ja 4°C:ssa 24 tuntia. Trietyyliamiinihyd-rokloridi poistettiin suodattamalla, ja suodos haihdutettiin kuiviin. Raaka peptidi puhdistettiin piihappogeeliä sisältävällä pylväällä käyttäen eluointiin 10-%:ista (v/v) metanoli/kloroformiseosta, 20-%:ista (v/v) metanoli/kloroformiseosta ja kloroformi/metanoli/vesiseosta (11:8:2 v/v), saanto 70 %, sp. 142-145°C (hajoaa), R^A 0,39, R^-B 0,72, RfC 0,45, RfD 0,48, RfK 0,61.

Vaihe 49 L-pyroglutamyyli-L-histidyyli-L-tryptofyyli-L-seriinimetyyli-esteriä (5,4 mmoolia) liuotettiin dimetyyliformamidiin (70 ml) ja käsiteltiin hydratsiinihydraatilla (100 mmoolia) 4 tuntia. Dimetyy-liformamidi poistettiin tyhjössä, ja jäännöstä trituroitiin etanolissa, suodatettiin, pestiin etanolilla ja eetterillä ja kuivattiin (88,2 %), sp. 184-189°C, RfA 0,18, RfB 0,55, RfC 0,39, RfD 0,27,

RfK 0,58.

641 39 30

Vaihe 50 (A = D-Trp). N-bentsyylioksikarbonyyli-D-tryptofaanin (7,27 g, 21,5 mmoolia), leusiinimetyyliestErin (3,12 g, 21,5 mmoolia) ja 1-hydroksibentsotriatsolin (5,8 g, 4 3 mmoolia) liuokseen dimetyyli-formamidissa (50 ml) lisättiin 0°C:ssa disykloheksyylikarbodi-imi-diä (4,87 g, 23,6 mmoolia). Reaktioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa yön yli, sitten sitä jatkokäsiteltiin tavallisella tavalla. Kiteyttämällä etyyliasetaatti/petrolieetteristä (kp. 60-80°C) saatiin dipeptidijohdannainen (9,55 g), jossa ohutkerroskromatografiän mukaan oli hieman epäpuhtauksia. Se puhdistettiin kromatografoimalla pii-happogeeliä (300 g) sisältävällä pylväällä käyttäen eluointiin kloroformia ja 5-%:ista (v/v) metanoli/kloroformiseosta. Saanto 9,18 g (91,7 %), sp. 151-153°C, RfA 0,84, RfB 0,80, RfC 0,86, RfD 0,78, RfE 0,61, RfF 0,68, RfH 0,73, RfP 0,55, RfQ 0,73.

Vaihe 51 (A = D-Trp). Katalyyttinen pelkistys 80-%:isessa (v/v) vesipitoisessa dimetyyliformamidissa 5-%:isen (w/w) Pd/C:n avulla 5 tunnin aikana.

Vaihe 52 (A = D-Trp). N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyro-siini-2,4,5-trikloorifenyyliesterin (11,69 g, 20 mmoolia), D-trypto-fyyli-L-leusiinimetyyliesterin (6,28 g, 19 mmoolia) liuosta dimetyyliformamidissa (100 ml) sekoitettiin huoneen lämpötilassa 60 tuntia. Reaktioseoksen jatkokäsittely suoritettiin tavallisella tavalla ja jäännös kiteytettiin etyyliasetaatti/petrolieetteristä (kp. 60-80°C), jolloin saatiin 8,52 g tripeptidijohdannaista (62,5 %), sp. 165-166°C, RfA 0,78, RfB 0,73, RfC 0,84, RfD 0,80, RfE 0,62, RfF 0,70, RfH 0,76, RfP 0,58, RfQ 0,68.

Vaihe 53 (A = D-Trp). N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosyyli-D-tryptofyyli-L-leusiinimetyyliesterin (7,26 g, 10,1 mmoolia) liuosta metanolin (200 ml) ja dimetyyliformamidin (50 ml) seoksessa käsiteltiin hydratsiinihydraatilla (100 mmoolia) huoneen lämpötilassa.

24 tunnin kuluttua liuos väkevöitiin (noin 30 ml:ksi) ja siihen lisättiin vettä (500 ml). Tripeptidihydratsidi koottiin, pestiin vedellä, metanoli/eetterillä (1:4 v/v) ja eetterillä ja kuivattiin, jolloin saatiin 6,86 g (94,6 %) , sp. 200-202°C, RfA 0,90, RfB 0,95, RfC 0,90 RfD 0,74, RfQ 0,59.

I! 3i 6413 9

Vaiheet 54 ja 55 (A = D-Trp). N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyro-syyli-D-tryptofyyli-L-leusiinihydratsidin (1,97 g, 2,75 mmoolia) sekoitettua ja jäähdytettyä (-20°C) liuosta dimetyyliformamidissa (10 ml) käsiteltiin 6,0-m kloorivedyn dioksaaniliuoksella (1,83 ml, 11 mmoolia) ja senjälkeen t-butyylinitriitillä (0,33 ml, 2,89 mmoo-lia). 2 minuutin kuluttua lisättiin esijäähdytetty (-20°C) N^-nitro-L-arginyyli-L-propyyliatsaglysiiniamidihydrokloridin (1,02 g, 2,5 mmoolia) ja trietyyliamiinin (1,89 ml, 13,5 mmoolia) jäähdytetty (-20°C) liuos dimetyyliformamidissa (10 ml), ja reaktioseosta sekoitettiin yön yli 4°C:ssa. Sen jatkokäsittely suoritettiin tavallisella tavalla, ja jäännös vietiin piihappogeeliä (230 g) sisältävälle pylväälle, joka eluoitiin kloroformilla ja 5-%:isella (v/v) metanoli/kloroformiseoksella. Saanto 0,91 g (34,H %) , sp. 139-140°C (hajoaa), RfA 0,67, RfB 0,72, RfC 0,58, RfD 0,62, RfH 0,34, RfK 0,95.

Vaihe 56 (A = D-Tyr(Me)). Z-D-Tyr(Me)-OH:n (3,17 g, 9,64 mmoolia, H-Leu-OMe.HC1:n (1,92 g, 10,6 mmoolia), 1-hydroksibentsotriatsolin (2,6 g, 19,2 mmoolia) ja trietyyliamiinin (1,6 ml, 11 mmoolia) liuos dimetyyliformamidissa (30 ml) jäähdytettiin 0°C:seen, ja siihen lisättiin N,N-disykloheksyylikarbodi-imidiä (2,29 g, 11,1 mmoolia). Reaktioseosta sekoitettiin yön yli 4°C:ssa, jatkokäsittely suoritettiin tavallisella tavalla. Uudelleenkiteyttämällä kuumasta syk-loheksaanista saatiin suojattu dipeptidijohdannainen. Saanto 1,41 g (95,2 %), RfD 0,83, RfE 0,69, RfP 0,72, RfQ 0,76.

Vaihe 57 (A = D-Tyr(Me)). Katalyyttinen pelkistys 3 tunnin ajan meta-noli/dimetyyliformamidi/vesiseoksessa (8:1:1), joka sisältää 1,2 ekvivalenttia kloorivetyä. Katalysaattorina Pd/C (5 % w/w).

Vaihe 58 (A = D-Tyr(Me)). Z-Tyr(Bzl)-OCp:n (8,2 mmoolia), H-D-Tyr(Me)-Leu-OMe.HC1:n (8,2 mmoolia) ja trietyyliamiinin (8,2 mmoolia) liuosta dimetyyliformamidissa (60 ml) sekoitettiin yön yli huoneen lämpötilassa, sitten reaktioseosta jatkokäsiteltiin tavallisella tavalla. Tuote suodatettiin eetterin kanssa, pestiin eetterillä ja kuivattiin. Saanto 81,2 %, sp. 191-192°C, RfD 0,85, RfE 0,73, RfF 0,72, RfQ 0,78.

Vaihe 59 (A = D-Tyr(Me)). Z-Tyr(Bzl)-D-Tyr(Me)-Leu-OMe:n (4,59 g, 32 64139 6,4 imnoolia) liuokseen dimetyyliformamidissa (25 ml) ja metanolissa (50 ml) lisättiin hydratsiinihydraattia (12,9 mmoolia), ja reak-tioseos sai seistä huoneen lämpötilassa yön yli. Metanoli poistettiin tyhjössä, ja tuote saostettiin vedellä, koottiin, pestiin vedellä ja kuivattiin, sp. 212-213°C, RfE 0,49, RfF 0,66, RfH 0,69, RfH 0,69, RfQ 0,70.

Vaiheet 60 ja 61 (A = D-Tyr(Me)). Vaiheesta 59 saatu hydratsidi (3,54 g, 5,0 mmoolia) liuotettiin DMF:ään (10 ml), ja sekoitettu liuos jäähdytettiin -20°C:seen. Siihen lisättiin 5,92-m HC1 dioksaanissa (3,38 ml, 20 mmoolia) ja sitten t-butyylinitriittiä (0,6 ml, 5,25 mmoolia). 2 minuutin kuluttua lisättiin H-Arg(NC>2 )-Per-Azgly-NH^ .HC1:n (2,04 g, 5 mmoolia) ja trietyyliamiinin (3,55 ml, 25 mmoolia) jäähdytetty liuos DMF:ssä (10 ml), ja sekoitusta jatkettiin yön yli 4°C: ssa. Reaktioseoksen jatkokäsittely suoritettiin tavallisella tavalla, ja raakatuote puhdistettiin kromatografoimalla piihappogeeli-pylväällä käyttäen eluointiin kloroformia, 5-%:ista (v/v) metanoli/klo-roformiseosta ja 10-%:sta (v/v) metanoli/kloroformiseosta. Saanto 3,72 g (70,9 %), RfA 0,64, RfB 0,72, RfC 0,55, RfD 0,66, RfF 0,40,

RfH 0,52.

Vaihe 62 (A = D-Ser(But)). Samoin kuin vaihe 56. Tuote kiteytettiin vesipitoisesta metanolista. Saanto 90,4 %, sp. 107-108°C, R^D 0,80,

RfE 0,68, RfF 0,73, RfH 0,73, RfH 0,72, RfP 0,72, RfQ 0,74.

Vaihe 63 (A = D-Ser(Bu^)). Katalyyttinen pelkistys 5 tunnin aikana DMF/vesiseoksessa (8:2), katalysaattorina Pd/C, 5 % (w/w) .

Vaihe 64 (A = D-Ser ( Bu^" ) ) . Z-Tyr (Bzl)-OCp: n (19,17 g, 32,7 mmoolia) ja H-D— Ser(Bu1:)-Leu-OMe :n (32,7 mmoolia) liuos DMF:ssa (100 ml) jätetyin huoneen lämpötilaan 72 tunniksi. Jatkokäsittely suoritettiin tavallisella tavalla, saatu kiinteä aine pestiin eetterillä ja kuivattiin. Saanto 17,6 g (79,4 %), sp. 135-137°C, R^D 0,80, R^H 0,77,

RfQ 0,81.

Vaihe 65 (A = D-SeriBu1")). Samoin kuin vaihe 59. Uudelleenkiteytys vesipitoisesta metanolista. Saanto 56,2 %, sp. 134-136°C, R^D 0,66,

RfH 0,64, R Q 0,64.

I! 33 641 39

Vaiheet 66 ja 67 (A = D-Ser(Bu^)). Samoin kuin vaiheet 60 ja 61. Tuote puhdistettiin kromatografoimalla piihappopylväällä käyttäen eluointiin kloroformia, 5-%:ista (v/v)metanoli kloroformiseosta. Saanto 38,5 %, sp. 142-145°C, RfA 0,64, R B 0,71, RfC 0,55, RfD 0,65, RfF 0,46,

RfH 0,43, RfQ 0,16.

Vaihe 68 (A = D-Tyr(Me)-OH:n (22,6 mmoolia), H-MeLeu-OMe.HBr:n (5,98 g, 24,9 mmoolia), trietyyliamiinin (3,5 ml, 24,9 mmoolia) ja 1-hydrok-sibentsotriatsolin (6,12 g, 45,2 mmoolia) jäähdytettyyn (0°C) ja sekoitettuun liuokseen DMF:ssä (50 ml) lisättiin disykloheksyyli-karbodi-imidiä (5,13 g, 24,9 mmoolia), ja sekoitusta jatkettiin yön yli 4°C:ssa. Reaktioseoksen jatkokäsittely suoritettiin tavallisella tavalla, ja tuote puhdistettiin kromatografoimalla piihap-pogeelipylväällä käyttäen eluenttina kloroformia. Saanto 55,2, öljy,

RfD 0,83, RfE 0,78, RfH 0,79, RfP 0,80, RfQ 0,79.

Vaihe 69 (A = D-Tyr(Me)). Katalyyttinen pelkistys 6 tunnin aikana meta-noli/vesiseoksessa (8:2 v/v), joka sisältää 1 ekvivalentin kloori-vetyä, katalysaattorina Pd/C, 5 % (w/w).

Vaihe 70 (A = D-Tyr(Me)). Samoin kuin vaihe 58. Tuote puhdistettiin kromatografoimalla piihappogeelipylväällä käyttäen eetteriliuotintä.

Vaihe 71 (A = D-Tyr(Me)). Z-Tyr(Bzl)-D-Tyr(Me)-MeLeu-OM:n (4,85 g, 6,69 mmoolia) ja hydratsiinihydraatin (120,7 mmoolia) liuos meta-nolissa (150 ml) jätettiin huoneen lämpötilaan yön yli. Hydratsidi saostettiin lisäämällä vettä, se koottiin ja kiteytettiin metanoli/-vesiseoksesta. Saanto 91,1 %, sp. 129-131°C, R^D 0,79, R^E 0,60, R^F 0,68, RfH 0,73, RfQ 0,77.

Vaiheet 72 ja 73 (A = D-Tyr(Me). Samoin kuin vaiheet 60 ja 61. Uudelleenkitey-tys metanoli/eetteristä, saanto 23,8 %, sp. 152-154°C, R^-A 0,67, R^-B 0,68, RfC 0,58, RfD 0,59, RfH 0,50, RfK 0,94, RfQ 0,35.

Vaihe 74 Z-D-Phe-OH:n (5,99 g, 20 mmoolia) ja N-metyylimorfoliinin (2,2 ml, 20 mmoolia) jäähdytettyyn (-15°C) ja sekoitettuun liuokseen DMFrssä (60 ml) lisättiin etyyliklooriformiaattia (1,8 ml, 18 mmoolia).

64139 34 2 minuutin kuluttua lisättiin H-MeLeu-OMe.HBr:n (4,8 g, 20 mmoolia) ja trietyyliamiinin (2,8 ml, 20 mmoolia) jäähdytetty (-15°C) liuos DMFrssä (20 ml), ja reaktioseosta sekoitettiin 30 minuuttia 0°C:ssa ja yön yli huoneen lämpötilassa. Jatkokäsittely suoritettiin tavallisella tavalla. Saanto 7,54 g (90 %) öljyä.

Vaihe 75

Katalyyttinen pelkistys 3 tunnin aikana metanolissa, joka sisälsi 1 ekvivalentin kloorivetyä, katalysaattorina Pd/C, 5 %, w/w.

Vaihe 76

Valmistus liittämällä Z-Tyr (Bu1")-OH (16,02 g, 43,2 mmoolia) ja H-D-Phe-MeLeu-OMe.HC1 (13,15 g, 40,0 mmoolia) yhteen samoin kuin vaiheessa 74. Tuote puhdistettiin kromatografoimalla piihappogeeli-pylväällä käyttäen eluointiin kloroformia ja 5-%:ista (v/v) metanoli/-kloroformiseosta. Saanto 60 %, öljy, RfG 0,48, R^P 0,71, RfQ 0,73.

Vaihe 77 Z-Tyr(Bu"t)-D-Phe-MeLeu-OMe :n (6,52 g, 9,76 mmoolia) ja hydrat-siinihydraatin (97,6 mmoolia) liuos metanolissa (50 ml) jätettiin yöksi huoneen lämpötilaan. Metanoli poistettiin tyhjössä, ja hydrat-sidi kiteytettiin metanoli/eetteriseoksesta, pestiin metanoli/vesi-seoksella (1:1 v/v) ja eetterillä ja kuivattiin. Saanto 5,2 g (80 %), sp. 135°C, RfD 0,75, RfE 0,69, RfF 0,66, RfH 0,79, RfQ 0,73.

Vaiheet 78 ja 79

Samoin kuin vaiheet 60 ja 61. Jatkokäsittelyssä tuote saostui etyyliasetaatista. Se suodatettiin, pestiin etyyliasetaatilla ja eetterillä ja kuivattiin. Saanto 58,5 %, sp. 145-148°C, R^D 0,72,

RfF 0,40, RfH 0,53, RfQ 0,18.

Claims

641 39 36

1. Eläinten lisääntymiseen vaikuttava polypeptidi, tunnet-t u siitä, että sillä on kaava I: ^-“Llu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F I jossa A on D-Tyr, D-Tyr(Me), D-Ser, D-SerCBu^), D-Phe, D-Ala tai D-Trp, B on Leu tai Meleu, E on Azgly, ja F on aminoryhmä, tai A Azgly tai Azala, B on Leu, E on suona sidos, ja F on etyyliami-noryhmä, ja sen fysiologisesti hyväksyttävät happoaddit.iosuolat.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että se on n *— Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH^.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että se on n 1— Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tyr(Me)-Leu-Ang-Pro-Azgly-NH2.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että se on Glu-His -Trp-Ser-Tyr-D-Ser (Bu1") -Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2 .

5. Eläimille tarkoitettu, eläinten lisääntymiseen vaikuttava koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaista polypeptidiä yhdessä fysiologisesti hyväksyttävän laimennus- tai kantaja-aineen kanssa.