RU2602042C2

RU2602042C2 - Способ производства дегареликса и его промежуточных соединений

Info

Publication number: RU2602042C2
Application number: RU2013118446/04A
Authority: RU
Inventors: Йон Хольбек РАСМУССЕН; Йенс ФОМСГОРД; Стефан ХАНСЕН; Палле Хеденгран РАСМУССЕН; Вольфганг Оливер ВАКС
Original assignee: Ферринг Б.В.
Priority date: 2010-10-27
Filing date: 2011-10-26
Publication date: 2016-11-10
Also published as: IL225687A0; TWI515201B; JP6007187B2; WO2012055905A1; MX343058B; US9090656B2; IL225687A; US20160145301A1; HUE030184T2; CA2815270A1; MX2013004320A; SI2632935T1; SA111320880B1; HRP20161315T1; JP2013540793A; KR101904808B1; US20130281661A1; BR112013010360B1; RU2013118446A; US9822146B2

Abstract

Изобретение относится к жидкофазному способу получения декапептида - дегареликса и промежуточных соединений для получения декапептида. Изобретение дополнительно относится к промежуточным полипептидам для жидкофазного способа получения дегареликса. Способ осуществляют путем сочетания первого полипептида, представленного формулой (III): (P₁)AA₁-AA₂-AA₃ (III) или его соли со вторым полипептидом, представленным формулой (IV): AA₄(P₄)-AA₅-AA₆(P₆)-AA₇-AA₈(P₈)-AA₉-AA₁₀-NH₂(IV), или его солью в жидкой реакционной среде в присутствии агента сочетания пептидов c получением декапептида формулы (II): (P₁)AA₁-AA₂-AA₃-AA₄(P₄)-AA₅-AA₆(P₆)-AA₇-AA₈(P₈)-AA₉-AA₁₀-NH₂(II), где Р₁, Р₈ каждый независимо представляет собой водород или защитную группу; Р₄, Р₆, каждый независимо представляет собой защитную группу; AA₁ представляет собой D-2Nal; АА₂ представляет собой D-4Cpa; АА₃ представляет собой D-3Pal; АА₄ представляет собой Ser; АА₅ представляет собой 4Aph(L-Hor); АА₆ представляет собой D-Aph(Cbm); АА₇ представляет собой Leu; АА₈ представляет собой Lys(iPr); АА₉ представляет собой Pro; АА₁₀ представляет собой D-Ala. Заявленный способ обеспечивает возможность крупномасштабного производства дегареликса. 8 н. и 4 з.п. ф-лы, 12 ил., 6 табл., 5 пр.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу производства в жидкой фазе (или растворе) для получения декапептида дегареликса, его защищенного предшественника и других полезных промежуточных соединений. Изобретение дополнительно относится к полипептидам, полезным при жидкофазном способе производства, и к очистке самого дегареликса.

Предшествующий уровень техники

Рак предстательной железы является основной причиной заболеваемости и смертности мужчин в промышленно развитых странах. Дегареликс, также известный как FE200486, является антагонистом рецепторов гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) третьего поколения (блокатор ГнРГ), который был разработан и недавно разрешен к применению страдающими раком предстательной железы пациентами, нуждающимися в андроген-депривационной терапии (Doehn et al., Drugs 2006, vol.9, No.8, pp.565-571; WO 09846634). Дегареликс действует путем непосредственной и конкурентной блокады рецепторов ГнРГ в гипофизе и, как другие антагонисты ГнРГ, не вызывает начальной стимуляции выработки лютеинизирующего гормона посредством гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси и, поэтому не вызывает всплеск тестостерона или клиническую вспышку (Van Poppel, Cancer Management and Research, 2010:2 39-52; Van Poppel et al., Urology, 2008, 71(6), 1001-1006); James, E.F. et al., Drugs, 2009, 69(14), 1967-1976).

Дегареликс является синтетическим линейным декапептидом, содержащим семь неприродных аминокислот, пять из которых представляют собой D-аминокислоты. Он имеет десять хиральных центров в остове молекулы декапептида. Аминокислотный остаток в положении 5 в последовательности имеет дополнительный хиральный центр при замещении в боковой цепи, давая в целом одиннадцать хиральных центров. Он имеет регистрационный номер CAS 214766-78-6 (в виде свободного основания) и имеется в продаже под товарным знаком Firmagon™. Лекарственное вещество имеет химическое название N-ацетил-3-(2-нафталинил)-D-аланил-4-хлор-D-фенилаланил-3-(3-пиридинил)-D-аланил-L-серил-4-[[[(4S)-гексагидро-2,6-диоксо-4-пиримидинил]карбонил]амино]-L-фенилаланил-4-[(аминокарбонил)амино]-D-фенилаланил-L-лейцил-N6-(1-метилэтил)-L-лизил-L-пролил-D-аланинамид и представлено приведенной ниже химической формулой (в дальнейшем также именуемой как формула I):

Структура дегареликса может также быть представлена как:

Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH₂,

где Ac представляет собой ацетил, 2Nal представляет собой 2-нафтилаланин, 4Cpa представляет собой 4-хлорфенилаланин, 3Pal представляет собой 3-пиридилаланин, Ser представляет собой серии, 4Aph представляет собой 4-аминофенилаланин, Hor представляет собой гидрооротил, Cbm представляет собой карбамоил, Leu представляет собой лейцин, Lys(iPr) представляет собой N6-изопропиллизин, Pro представляет собой пролин, и Ala представляет собой аланин.

В целях описания этого изобретения каждой аминокислоте в дегареликсе будет дано сокращенное обозначение, как изложено ниже:

AA₁ соответствует D-2Nal, AA₂ соответствует D-4Cpa, AA₃ соответствует D-3Pal, AA₄ соответствует Ser, AA₅ соответствует 4Aph(L-Hor), AA₆ соответствует D-Aph(Cbm), AA₇ соответствует Leu, AA₈ соответствует Lys(iPr), AA₉ соответствует Pro, и AA₁₀ соответствует D-Ala.

Таким образом, например, дегареликс может быть представлен как Ас-AA₁-AA₁₀-NH₂, тетрапептид Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser может быть представлен как AC-AA₁-AA₄, а гексапептид 4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH₂ как AA₅-AA₁₀-NH₂.

Дегареликс ранее получали, используя методику твердофазного синтеза пептидов (SPPS) с Boc-защитой, как сообщалось в WO 98/46634 и Jiang et al., J. Med. Chem. 2001, 44, 453-467. Как правило, Boc-защищенный D-Ala первоначально присоединяют к МВНА (4-метилбензилгидриламиновой) смоле в диметилформамиде (ДМФА)/CH₂Cl₂ при использовании диизопропилкарбодиимида (DIC) и 1-гидроксибензотриазола (HOBt) в качестве активирующих агентов или агентов сочетания. Как только D-Ala присоединяют к смоле, синтез продолжают посредством промывания, деблокирования и затем присоединения следующего аминокислотного остатка, до тех пор пока построение декапептида не будет завершено. Первичные аминогруппы боковых цепей 4Aph, находящегося в положении 5, и D-4Aph, находящегося в положении 6, защищают с помощью Fmoc, когда к ним присоединяют и модифицируют их при помощи L-Hor и Cbm соответственно, перед присоединением следующей аминогруппы в цепи. Это требует дополнительных стадий сначала для снятия защиты с боковой цепи с помощью пиперидина, взаимодействия вновь освобожденной аминогруппы на пептидосмоле с трет-бутилизоцианатом или L-гидрооротовой кислотой при контроле окончания взаимодействия с помощью нингидриновой реакции, а затем промывки пептидосмолы перед добавлением следующего аминокислотного остатка (см. также Sorbera et al., Drugs of the Future 2006, Vol.31, No.9, pp 755-766).

Хотя методика Boc-SPPS до сих пор обеспечивает достаточные количества дегареликса, растущая потребность в этом полипептиде означает, что требуются все возрастающие количества. Методика Boc-SPPS, при которой требуется HF расщепление (с помощью плавиковой кислоты), не подходит для крупномасштабного промышленного синтеза. Действительно, в WO 98/46634 упомянуто, что SPPS подходит только для ограниченных количеств до 1 кг, тогда как классический синтез пептидов в растворе или жидкофазный пептидный синтез (LPPS) является предпочтительным для получения больших количеств продукта. В WO 98/46634 не указано, как следует проводить такой синтез. Несмотря на то, что сообщалось о существовании жидкофазного пептидного синтеза дегареликса [EMEA Report: Assessment Report for Firmagon™ (Дегареликс): Doc. Ref. EMEA/CHMP/635761/2008], на данный момент никаких подробностей такого способа не было публично раскрыто.

WO 97/34923 и WO 99/26964 являются документами, посвященными жидкофазным способам получения биологически активных пептидов. WO 99/26964, в частности, посвящен жидкофазному синтезу декапептидов, обладающих активностью в качестве антагонистов ГнРГ. В WO 99/26964 перечислен ряд ограничений, присущих SPPS методике получения антагонистов ГнРГ, включая ограниченную емкость смолы, большой избыток необходимых реагентов и аминокислот, а также необходимость защиты всех реакционноспособных боковых цепей, таких как гидроксигруппа в Ser, ароматические аминогруппы в Aph и D-Aph, ε-i-пропиламиногруппа в Lys(i-Pr).

В WO 99/26964 предложен жидкофазный способ, который включает сначала получение центральных фрагментов пептидов 5 и 6 положений декапептида с полностью законченными боковыми цепями, а затем сборку пептида по схеме сборки фрагментов "4-2-4", "3-3-4" или "3-4-3". Например, при получении антагониста ГнРГ, азалина B, тетрапептид соединяют с гексапептидом с образованием требуемого декапептида. Когда такую же схему сборки фрагментов пытаются применить для дегареликса, происходит рацемизация аминокислоты Ser (AA₄), что в результате приводит к примерно 20% примеси L-Ser. Эта примесь переходит в конечный декапептид и, ее трудно удалить. Кроме того, при получении тетрапептида AA₁-AA₄ посредством добавления молекулы Ser к трипептиду AA₁-AA₃ согласно методу, описанному в WO 99/26964, ионы тетрабутиламммония, образовавшиеся при гидролизе бензильной сложноэфирной группы, не могли быть полностью удалены во время последующих операций и переходили в конечный продукт. В дальнейшем было установлено, что при синтезе дегареликса L-гидрооротильная группа превращается в свой гидантоинацетильный аналог, когда L-дигидрооротиловую кислоту соединяют с 4Amp с получением AA₅. Эти и другие проблемы при жидкофазном синтезе дегареликса теперь преодолены, и новый жидкофазный полипептидный синтез этого декапептида раскрыт здесь впервые.

Краткое описание сущности изобретения

Проблемы SPPS методов получения дегареликса и недостатки LPPS методов, которые описаны в WO 97/34923 и WO 99/26964, теперь преодолены и являются объектом этого изобретения.

В основном, это изобретение относится к жидкофазному синтезу декапептида дегареликса.

В одном аспекте изобретение относится к жидкофазному способу получения дегареликса, имеющего формулу Ac-AA₁-AA₁₀-NH₂, или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, включающему стадию, при которой предшественник дегареликса формулы II или его соль или сольват подвергаются обработке расщепляющим агентом:

Соединение формулы II, таким образом, соответствует

,

где обозначения от AA₁ до AA₁₀ являются такими, как в формуле (I),

P₁ представляет собой защитные группы для амино или ацетил;

P₄ представляет собой водород или защитную группу для гидроксила, предпочтительно защитную группу для гидроксила;

P₆ представляет собой водород или защитные группы для амино; предпочтительно защитные группы для амино; и

P₈ представляет собой защитную группу для амино.

Предпочтительно, защитная группа P₁, если присутствует, является ортогональной относительно P₈, то есть обе защитные группы можно отщеплять независимо.

В предпочтительном воплощении, представляет собой ацетил и как P₄, так и P₈ представляют собой защитные группы, которые можно отщеплять за одну стадию, и P₆ представляет собой водород или защитную группу, которую можно отщеплять вместе с защитными группами P₄ и P₈. Отщепление защитных групп предпочтительно проводят посредством обработки предшественника формулы II трифторуксусной кислотой (ТФУК). Особенно предпочтительно, когда P₄, P₆ и P₈ представляют собой защитные группы, выбранные из трет-бутила (tBu) и трет-бутилоксикарбонила (Boc), и наиболее предпочтительным является предшественник формулы II, где P₄ представляет собой tBu, P₆ представляет собой водород или tBu, и P₈ представляет собой Boc.

Настоящее изобретение также относится к способу жидкофазного производства промежуточного соединения, представленного формулой (II), или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, включающему стадию сочетания первого полипептида, представленного формулой (III)

,

или его соли со вторым полипептидом, представленным формулой (IV)

,

или его солью в жидкой реакционной среде в присутствии агента сочетания пептидов возможно вместе с органическим амином в форме основания с образованием декапептида, представленного формулой (II). В этом случае обозначения от AA₁ до AA₁₀, P₄, P₆ и P₈ являются такими, как в формуле (II).

Соли включают кислые соли, такие как гидрохлориды, и основные соли, такие как соли щелочных металлов, соли щелочноземельных металлов и соли аммония.

Согласно изобретению второй полипептид, представленный формулой (IV), может быть получен посредством отщепления защитной группы P_N от следующего соединения (IVa):

P_N предпочтительно представляет собой защитную группу N-концевой аминогруппы и более предпочтительно защитную группу, которую можно отщепить посредством гидрирования, такую как бензилоксикарбонил.

Соединение формулы (IVa) может быть получено посредством сочетания полипептида, представленного формулой (V), с полипептидом, представленным формулой (VI):

или солей этих соединений, где обозначения от AA₄ до AA₁₀, P_N, P₄, P₆ и P₈ являются такими, как в формуле (IVa).

Изобретение также относится к полипептидам, представленным формулами со (II) по (VI), которые полезны в жидкофазном способе производства по изобретению.

Описание графических материалов

На фиг.1 показана блок-схема синтеза производных AA₁ и AA₂ для синтеза пептидов.

На фиг.2 показана блок-схема синтеза производного AA₂-AA₃ для синтеза пептидов.

На фиг.3 показана блок-схема синтеза Ac-AA₁-AA₃.

На фиг.4 показана блок-схема синтеза производного AA₆-AA₇.

На фиг.5 показана блок-схема синтеза производного АА₅-АА₇.

На фиг.6 показана блок-схема синтеза Z-AA₄-AA₇.

На фиг.7 показана блок-схема синтеза AA₉-AA₁₀.

На фиг.8 и 9 показана блок-схема синтеза Z-AA₈-AA₁₀.

На фиг.10 показана блок-схема синтеза Z-AA₄-AA₁₀.

На фиг.11 показана блок-схема синтеза предшественника формулы (II).

На фиг.12 показана блок-схема синтеза дегареликса из предшественника формулы (II) и очистки и лиофилизации.

Подробное описание сущности изобретения

Настоящее изобретение теперь будет описано более подробно.

Стадия снятия защиты

В первом аспекте настоящее изобретение относится к жидкофазному способу получения дегареликса, имеющего формулу Ac-AA₁-AA₁₀-NH₂, или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата. Способ включает стадию отщепления защитных групп (P₄), (P₆) и (P₈), если они присутствуют, от предшественника дегареликса согласно формуле (II) ((P₁)AA₁-AA₂-AA₃-AA₄(P₄)-AA₅-AA₆(P₆)-AA₇-AA₈(P₈)-AA₉-AA₁₀-NH₂) или его соли или сольвата в органическом растворе, содержащем предшественник и расщепляющий агент, растворенные в нем.

Обозначения от AA₁ до AA₁₀ в формуле (II) имеют такое же значение, как в формуле (I), и P₁ представляет собой защитные группы для амино или ацетил, предпочтительно ацетил.

P₈ представляет собой защитную группу для амино. Предпочтительно, P₈ представляет собой любую защитную группу боковой цепи, известную в данной области техники, такую как группы, описанные в E. Gross & J. Meienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology, Vol.3: Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis (Academic Press, N.Y., 1981). Подходящие примеры включают 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc), бензилоксикарбонил (Cbz или Z) и замещенные Cbz, такие как, например 2-бром-бензилоксикарбонил (2-Br-Z), 2-хлор-бензилоксикарбонил (2-Cl-Z), пара-хлорбензилоксикарбонил, пара-6-нитробензилоксикарбонил, пара-бромбензилоксикарбонил и пара-метоксибензилоксикарбонил, орто-хлорбензилоксикарбонил, 2,4-дихлорбензилоксикарбонил, 2,6-дихлорбензилоксикарбонил и тому подобное; алифатические защитные группы уретанового типа, такие как трет-бутилоксикарбонил (Boc), трет-амилоксикарбонил, изопропилоксикарбонил, 2-(пара-бифенилил)-изопропилоксикарбонил и тому подобное; циклоалкильные защитные группы уретанового типа, такие как циклопентилоксикарбонил, адамантилоксикарбонил и циклогексилоксикарбонил; аллилоксикарбонил (Alloc), ацетил (Ac), бензоил (Bz), трифторацетил (Tfa), толуолсульфонил (Tos), бензил (Bn), трифенилметил (Trt), орто-нитрофенил-сульфенил (Nps), трет-бутил-диметилсилилоксикарбонил, [2-(3,5-диметоксифенил)-пропил-2-оксикарбонил] (Ddz), 2,2,2-трихлорэтилоксикарбонил (Troc), бифенилилизопропилоксикарбонил (Bpoc) и орто-нитробензилоксикарбонил. Предпочтительными защитными группами являются Fmoc, Boc и Alloc, причем Boc является наиболее предпочтительной.

P₄ представляет собой водород или защитную группу гидроксила, предпочтительно защитную группу гидроксила. Защитная группа гидроксила Ser (P₄) представляет собой предпочтительно C₄-С₆алкил (например, трет-бутил, циклогексил), ацетил (Ac), тритил, бензил, бензиловый эфир, такой как пара-метоксибензил, или другие замещенные бензилы, такие как пара-нитробензиловый, пара-хлорбензиловый, орто-хлорбензиловый и 2,6-дихлорбензиловый, тетрагидропираниловый, три(C₁-C₆)алкилсилиловый, 2-метоксиэтоксиметиловый (MEM), 4-диметилкарбамоилбензиловый и O-феноксиацетиловый эфиры.

Особо предпочтительными являются трет-бутиловый, бензиловый и 9-флуоренилметиловый эфиры, причем трет-бутиловый является наиболее предпочтительным.

P₆ представляет собой водород или защитные группы для амино, предпочтительно защитные группы для амино. Предпочтительные защитные группы включают C₄-С₆алкил (например, трет-бутил, циклогексил), ацетил (Ac), тритил, бензил, бензиловый эфир, такой как пара-метоксибензил, или другие замещенные бензилы, такие как пара-нитробензиловый, пара-хлорбензиловый, орто-хлорбензиловый и 2,6-дихлорбензиловый, тетрагидропираниловый, три(C₁-C₆)алкилсилиловый, 2-метоксиэтоксиметиловый (MEM), 4-диметилкарбамоилбензиловый и O-феноксиацетиловый эфиры. Особо предпочтительными являются трет-бутиловый, бензиловый и 9-флуоренилметиловый эфиры, причем трет-бутиловый является наиболее предпочтительным.

Расщепляющий агент, используемый для удаления защитных групп, зависит от природы защитной группы, и эти агенты хорошо известны в данной области техники.

Предпочтительными расщепляющими агентами для защитной группы гидроксила Ser, P₄, являются:

- трифторуксусная кислота (ТФУК), соляная кислота (HCl) или метансульфоновая кислота, в частности для трет-бутилового эфира в качестве защитной группы,

- H₂/Pd-C, фтороводородная кислота (HF) или трифторметансульфоновая кислота, в частности для бензилового эфира в качестве защитной группы, и

- SiCl₄/анизол, в частности для 2-(метилсульфинил)бензилового эфира в качестве защитной группы.

Предпочтительными расщепляющими агентами для защитной группы для амино, P₈, являются:

- трифторуксусная кислота (ТФУК), HCl или метансульфоновая кислота, в частности для трет-бутилкарбаматов в качестве защитной группы,

- H₂/Pd-C, (HF) или трифторметансульфоновая кислота, в частности для бензилкарбаматов в качестве защитной группы, и

- пиперидин, 1,8-диаза-бицикло[5.4.0]-ундец-7-цен (DBU) и диэтиламин (DEA), в частности для Fmoc в качестве защитной группы.

Предпочтительные растворители включают ДХМ (дихлорметан), ДМФА (диметилформамид), N-метилпирролидон (NMP), диоксан, этанол (EtOH), неразбавленную HF и ТФУК.

Особо предпочтительными являются различные условия отщепления, указанные в следующей таблице 1:

Таблица 1
условия отщепления
Защитная группа		Защищенная группа	Расщепляющий агент	Растворитель
Аббревиатура	Наименование
t-Bu	трет-Бутиловые простые и сложные эфиры	-OH и -CO₂H	ТФУК HCl Метансульфоновая кислота	ДХМ Диоксан ДХМ
Bzl	Бензиловые простые и сложные эфиры	-OH и -CO₂H	H₂/Pd-C HF Трифторметансульфоновая кислота	EtOH/вода Неразбавленный ДХМ
MsOb	4-(Метилсульфинил)-бензиловый эфир	-OH	SiCl₄/анизол	ТФУК
Cbz или Z	Бензилоксикарбонил	-NH₂	H₂/Pd-C HF Трифторметансульфоновая кислота	EtOH/вода/ксилота Неразбавленный ДХМ
Boc	трет-Бутокси-карбонил	-NH₂	ТФУК HCl Метансульфоновая кислота	ДХМ Диоксан ДХМ
Fmoc	9-Флуоренил-метокси-карбонил	-NH₂	Пиперидин DBU (1,8-диаза-бицикло[5.4.0]-ундец-7-цен)	ДМФА ДМФА
			DEA (диэтиламин)		ДМФА
Trt	Тритил (Trt)	-OH -NH₂	1% ТФУК-ДХМ		ДХМ
TBDMS	трет-Бутил-диметил-силил	-OH	ТФУК АСОН-ТГФ-H₂O (3:1:1), 18 ч		ТГФ (тетрагидрофуран)
Циклогексил (CHX или CH_x)	Циклогексил	-OH	HF или TFSMA		Неразбавленный HF или ДХМ

Ссылка: Chem. Rev. 2009, 109, 2465-2504 (Albert Isidro-Llobet)

Типично, предшественник формулы (II) растворяют в расщепляющем агенте, предпочтительно ТФУК, с добавлением или без добавления растворителя, при комнатной температуре (от 20 до 25°C) в течение периода от 20 до 30 часов, предпочтительно 24 часов. Когда защитная группа удалена (предпочтительно степень превращения составляет более 95%, наиболее предпочтительно более 99%), неочищенный дегареликс затем предпочтительно вливают в забуференную смесь вода-этанол с получением забуференного раствора неочищенного дегареликса для последующей очистки. Предпочтительное значение pH находится предпочтительно в пределах от 2 до 4, более предпочтительно в пределах от 2,5 до 3,5 и наиболее предпочтительно приблизительно 3.

Конкретные воплощения стадии снятия защиты показаны на фиг.12 и в примере 4 (см. стадию 12).

Очистка и лиофилизация

Раствор неочищенного дегареликса предпочтительно очищают при использовании хроматографических методов, таких как препаративная обращенно-фазовая хроматография (ОФХ).

Полученный продукт затем предпочтительно лиофилизируют.

Сочетание 3+7

В дополнительном аспекте настоящее изобретение также относится к способу жидкофазного производства промежуточного соединения, представленного формулой (II), или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, включающему стадию сочетания первого полипептида, представленного формулой (III)

,

или его солью в жидкой реакционной среде в присутствии агента сочетания пептидов и возможно органического амина в форме основания с образованием декапептида, представленного формулой (II). В этом случае обозначения от AA₁ до AA₁₀, P₁, P₄, P₆ и P₈ являются такими, как в формуле (II). Соли включают кислые соли, такие как гидрохлориды, и основные соли, такие как соли щелочных металлов, соли щелочноземельных металлов и соли аммония.

Реакцию сочетания проводят в органическом растворе, в котором растворены два пептида и агент сочетания пептидов и возможно органический амин в форме основания. Вспомогательное вещество для сочетания пептидов и/или органический амин также могут присутствовать.

Органический растворитель, агент сочетания пептидов, вспомогательное вещество для сочетания пептидов и органический амин в форме основания могут быть любыми из тех, которые известны в области LPPS.

Типичными органическими растворителями являются ТГФ, NMP (N-метилпирролидон), ДХМ, ДМФА, ДМСО (диметилсульфоксид) и их смеси. Наиболее предпочтительным растворителем является ДМСО.

Типичными агентами сочетания пептидов являются один или более чем один из гексафторфосфата o-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (HATU), гексафторфосфата o-(бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (HBTU), тетрафторбората o-(бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (TBTU), гексафторфосфата бензотриазол-1-ил-окси-трис(диметиламино)фосфония (BOP), гексафторфосфата бензотриазол-1-ил-окси-трис-пирролидинфосфония (PyBOP), дихлорида N,N-бис-(2-оксо-3-оксазолидинил)фосфоновой кислоты (BOP-Cl), гексафторфосфата бром-трис-пирролидин-фосфония (PyBroP), изо-бутилхлорформиата (IBCF), 1,3-дициклогексилкарбодиимида (DCC), 1,3-диизопропил-карбодиимида (DIC), гидрохлорида 1-(диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (WSCDI), N-этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолина (EEDQ), изопропилхлорформиата (IPCF), тетрафторбората 2-(5-норборнен-2,3-дикарбоксимидо)-1,1,3,3-тетраметилурония (TNTU), ангидрида пропанфосфоновой кислоты (PPAA) и тетрафторбората 2-сукцинимидо-1,1,3,3-тетраметилурония (TSTU).

Предпочтительным агентом сочетания является DCC. DCC предпочтительно используют без органического амина. В особо предпочтительном воплощении DCC используют в комбинации с ДМСО. DCC предпочтительно используют в количестве от 1,3 до 2, наиболее предпочтительно от 1,4 до 1,6 эквивалента относительно трипептида.

Другим предпочтительным агентом сочетания является DIC, который предпочтительно используют в комбинации с 6-хлор-HOBt, возможно совместно с солями меди.

Типичными вспомогательными веществами для сочетания пептидов являются 1-гидрокси-1H-бензотриазол (HOBt), 6-хлор-HOBt и 1-гидрокси-7-азабензотриазол (HOAt).

Типичными органическими аминами в форме оснований являются NMM (N-метилморфолин), DIPEA (N,N-диизопропилэтиламин), TEA (триэтиламин) и коллидин.

Особенно предпочтительным является проведение реакции сочетания при использовании ДМСО в качестве растворителя и DCC в качестве агента сочетания.

Конкретные воплощения стадии сочетания показаны на фиг.11 и в примере 4 (см. стадию 11).

Синтез гептапептида

Соединение формулы IV, то есть АА₄(Р₄)-АА₅-AA₆(P₆)-АА₇-АА₈(Р₈)-АА₉-AA₁₀-NH₂, предпочтительно получают посредством отщепления защитной группы Pn следующего соединения IVa:

Наряду с тем, что обозначения от AA₁ до AA₁₀, P₄, P₆ и P₈ имеют такое же значение, как и ранее, P_N представляет собой защитную группу N-концевой аминогруппы. В предпочтительном воплощении P_N представляет собой защитную группу, которую можно отщепить посредством гидрирования, например при использовании водорода и палладиевого катализатора (такого, как Pd/C). Наиболее предпочтительная защитная группа P_N представляет собой бензилоксикарбонил (Z).

Конкретные воплощения стадии отщепления P_N показаны на фиг.11 и в примере 4 (см. стадию 11).

Соединение формулы (IVa) может быть получено посредством сочетания полипептида, представленного формулой (V), с полипептидом, представленным формулой (VI),

или солей одного или обоих этих соединений, где обозначения от AA₄ до AA₁₀, P₄, P₆ и P₈ являются такими, как в формуле (IVa). Реакцию сочетания проводят в органическом растворе, в котором растворены два пептида и агент сочетания пептидов. Вспомогательное вещество для сочетания пептидов и/или органический амин также могут присутствовать. Могут быть использованы такие же агенты сочетания пептидов, органические растворители, вспомогательные вещества для сочетания пептидов и органические амины, как описано выше. В предпочтительном воплощении DCC используют в качестве агента сочетания, возможно с этил ацетатом в качестве растворителя.

Синтез тетрапептида формулы V

В предпочтительном воплощении тетрапептид формулы V, то есть (P_N)AA₄(P₄)-AA₅-AA₆(P₆)-A₇, получают способом, включающим следующие стадии:

a) получение (P_N2)АА₅-АА₆(P₆)-АА₇(P_C), где P₆ имеет такое же значение, как выше в формуле IVa, (P_N2) представляет собой защитную группу N-концевой аминогруппы или водород, и (P_C) представляет собой защитную группу C-концевого карбоксила, которую можно отщепить посредством гидрирования;

b) удаление защитной группы для амино (P_N2), если она присутствует;

c) гидрирование H-AA₅-AA₆(P₆)-AA₇(P_C) с получением H-AA₅-AA₆(P₆)-AA₇; и

d) взаимодействие H-AA₅-AA₆(P₆)-AA₇ с активированным сложным эфиром (P_N)AA₄(P₄) с получением (P_N)AA₄(P₄)-AA₅-AA₆(P₆)-AA₇, где (P₄) представляет собой защитную группу гидроксила или водород, P₆ представляет собой водород или защитную группу для амино, и P_N представляет собой защитную группу, которую можно предпочтительно отщепить посредством гидрирования, например при использовании водорода и палладиевого катализатора (такого, как Pd/C).

Наиболее предпочтительной защитной группой P_N является бензилоксикарбонил (Z).

Предпочтительным активированным эфиром (P_N)AA₄(P₄) является 4-нитрофениловый эфир (ONp).

Поэтому, предпочтительно, бензиловый эфир удаляли в промежуточном соединении AA₅-AA₇ с получением как N-, так и C-незащищенного AA₅-AA₇. Этот трипептид затем подвергали взаимодействию с предварительно активированным серином (например, Z-Ser(tBu)-ONp).

Производство дегареликса

Настоящее изобретение, таким образом, относится к производству дегареликса, при этом рассмотренная выше стадия снятия защиты является существенной стадией этого производства. В предпочтительном воплощении эта стадия снятия защиты следует за сочетанием 3+7, рассмотренным выше. В еще более предпочтительном воплощении сочетание 3+7 следует за синтезом гептапептида, рассмотренным выше, то есть способ включает следующие стадии:

a) синтез AA₄(P₄)-AA₅-AA₆(P₆)-AA₇-AA₈(P₈)-AA₉-AA₁₀-NH₂ или его соли, или сольвата;

b) сочетание АА₄(Р₄)-AA₅-AA₆(P₆)-АА₇-АА₈(P₈)-AA₉-АА₁₀-NH₂ и (P₁)AA₁-AA₂-АА₃ с получением (P₁)АА₁-АА₂-AA₃-АА₄(Р₄)-АА₅-AA₆(P₆)-AA₇-AA₈(P₈)-AA₉-АА₁₀-NH₂ или его соли, или сольвата;

c) снятие защиты с (P₁)АА₁-АА₂-AA₃-АА₄(Р₄)-АА₅-AA₆(P₆)-AA₇-AA₈(P₈)-АА₉-AA₁₀-NH₂ или его соли, или сольвата с получением дегареликса или его сольвата, или соли.

Обозначения от AA₁ до AA₁₀ и P₁, P₄, P₆ и P₈ имеют такие же значения, как определено ранее.

В особо предпочтительном воплощении:

- P₁ представляет собой ацетил;

- P₄ представляет собой защитную группу, которая расщепляется ТФУК, предпочтительно tBu;

- P₆ представляет собой водород или защитную группу, которая расщепляется ТФУК, предпочтительно tBu;

- P₈ представляет собой защитную группу, которая расщепляется ТФУК, предпочтительно Boc.

В наиболее предпочтительном воплощении гептапептид получают при использовании синтеза гептапептидов, описанного выше. Кроме того, за стадией снятия защиты предпочтительно следуют методы очистки и лиофилизации, описанные выше.

При синтезе дегареликса или его предшественников и особенно на всех стадиях, содержащих пептид с гидрооротильной группировкой, значение pH предпочтительно поддерживают ниже 9, предпочтительно ниже 8,5, еще более предпочтительно ниже 8. Предпочтительно использовать слабое основание, такое как NaHCO₃, для регулирования pH. Особенно предпочтительно, чтобы все процессы экстракции после стадий сочетания проводились в пределах значений pH от 2 до 9, предпочтительно от 2,5 до 8 (см. стадии 6, 7, 10 и 11 в экспериментальной части). Кроме того, предпочтительным является и добавление C_4-5алифатического спирта, такого как н-бутанол или 2-бутанол, перед стадией экстракции или промывки.

Промежуточные соединения

Изобретение также относится к полипептидам, представленным формулами от (II) до (VI), которые являются полезными при жидкофазном способе производства по изобретению.

Предпочтительные воплощения формулы (II)

Таблица 2
Соединение	P₁	P₄	P₆	P₈
IIa	Ac	tBu	tBu	Fmoc
IIb	Ac	tBu	tBu	Boc
IIc	Ac	H	H	Alloc
IId	Ac	H	H	Boc
IIe	Ac	tBu	H	Boc
IIf	Boc	tBu	tBu	Fmoc
IIg	Fmoc	tBu	tBu	Boc
IIh	Boc	tBu	H	Fmoc
IIi	Fmoc	tBu	H	Boc
IIj	Ac	H	tBu	Boc
IIk	Ac	H	tBu	Fmoc
IIl	Ac	H	H	Fmoc

Предпочтительные воплощения включают соли этих соединений.

Предпочтительные воплощения формулы (III)

Таблица 3
Соединение	P_N
IIIa	Ac
IIIb	Boc

Предпочтительные воплощения формулы (IV)/(IVA)

Таблица 4
Соединение	P₄	P₆	P₈	P_N
IVa	tBu	tBu	Fmoc	H
IVb	tBu	tBu	Boc	H
IVc	H	H	Alloc	H
IVd	H	H	Boc	H
IVe	tBu	H	Boc	H
IVf	H	H	Fmoc	H
IVg	tBu	H	Fmoc	H
IVh	tBu	tBu	Fmoc	Z
IVi	tBu	tBu	Boc	Z
IVj	H	H	Alloc	Z
IVk	H	H	Boc	Z
IVl	tBu	H	Boc	Z
IVm	H	tBu	Boc	Z
IVn	H	H	Fmoc	Z
IVo	tBu	H	Fmoc	Z
IVp	H	tBu	Fmoc	Z

Предпочтительные воплощения формулы (V)

Таблица 5
Соединение	P₄	P₆	P_N
Va	tBu	tBu	Z
Vb	tBu	H	Z
Vc	H	tBu	Z
Vd	H	H	Z

Предпочтительные воплощения включают соли и сольваты этих соединений.

Предпочтительные воплощения формулы (VI)

Таблица 6
Соединение	P₈
Via	Boc
VIb	Alloc
Vic	Fmoc

Когда защитная группа отсутствует, функциональная группа является незащищенной группой (например, >NH).

Экспериментальная часть

Материалы, используемые в экспериментальной части

Материалы, используемые в экспериментальной части, перечислены ниже.

Химические вещества:

Водный аммиак NH₃ (водн.)

Ацетонитрил C₂H₃N

н-Бутанол C₄H₁₀O

2-Бутанол C₄H₁₀O

Изопропанол (изопропанол) C₃H₈O

Бутилацетат C₅H₁₂O₂

Этанол, 99,9% C₂H₆O

Метанол CH₄O

Гептан C₇H₁₆

Очищенная вода H₂O

Этилацетат C₃H₈O₂

Уксусная кислота C₂H₄O₂

Ацетат аммония C₂H₇NO₂

цетилимидазол C₅H₆N₂O

Триэтиламин C₆H₁₅N

N-Метилморфолин C₅H₁₁NO

N-Метилпирролидон C₅H₉NO

N,N'-Дициклогексилкарбодиимид C₁₃H₂₂N₂

Дициклогексиламин C₁₂H₂₃N

N,N'-Диизопропилкарбодиимид C₇H₁₄N₂

N,N-Диметилэтилендиамин C₄H₁₂N

N,N-Диметилформамид C₃H₇NO

Диметилсульфоксид C₂H₆OS

1-Гидроксибензотриазол C₆H₅N₃O

пара-Нитрофенол C₆H₅NO₃

N-Гидроксисукцинимид C₄H₅NO₃

Изобутилхлорформиат C₅H₉ClO₂

Хлорид натрия NaCl

Гидроксид натрия, водный NaOH (водн.)

Соляная кислота, водная HCl (водн.)

Фосфорная кислота H₃PO₄

Гидросульфат натрия NaHSO₄

Гидрокарбонат натрия NaHCO₃

Метансульфоновая кислота CH₄SO₃

Трифторуксусная кислота C₂HF₃O₂

Палладий на угле, 5% Pd-C

Водород H₂

Толуол C₇H₈

Исходные вещества:

N-трет-Бутилоксикарбонил-D-4-хлорфенилаланин
N-трет-Бутилоксикарбонил-D-4-хлорфенилаланин	Boc-D-4Cpa-OH C₁₄H₁₈NO₄
N-трет-Бутилоксикарбонил-D-2-нафтилаланин
N-трет-Бутилоксикарбонил-D-2-нафтилаланин	Boc-D-2Nal-OH C₁₈H₂₁NO₄
D-3-Пиридилаланин гидрохлорид	H-D-3Pal-OH × 2HCl C₈H₁₂C_l2N₂O₂
N-α-трет-Бутилоксикарбонил-N-4-(трет-бутилкарбамоил)-D-4-аминофенилаланин	Boc-D-4Aph(tBuCbm)-OH C₁₉H₂₉N₃O₅
N-α-трет-Бутилоксикарбонил-N-4-(L-гидрооротил)-4-аминофенилаланин
	Boc-4Aph(L-Hor)-OH C₁₉H₂₄N₄O₇
пара-Тозилат бензилового эфира лейцина	H-Leu-OBzl × TOS C₂₀H₂₇NO₅
N-Бензилоксикарбонил-O-трет-бутил-серин	Z-Ser(tBu)-OH C₈H₁₅NO₅
N-трет-Бутилоксикарбонил-пролин	Boc-Pro-OH C₁₀H₁₇NO₄
D-Аланинамид гидрохлорид	H-D-Ala-NH₂× HCl C₃H₈ClNO₂
N-α-Бензилоксикарбонил-N-ε-трет-бутилоксикарбонил-N-ε-изопропил-лизин, дициклогексиламинная соль	Z-Lys(iPr, Boc)-OH × DCHA C₃₄H₅₇N₃O₆

Пример 1: синтез промежуточного соединения Ac(1-3)ONa: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-ONa [7]

Активация Boc-D-4Cpa-OH и выделение

Стадия 1 (стадия реакции)

Boc-D-4Cpa-OH (299,75 г) растворяли в изопропиловом спирте (3,53 кг), смесь перемешивали и добавляли HOSu (0,184 кг) и DIC (0,164 кг) и перемешивали при 0°C в течение 1 часа. Осадок отфильтровывали и промывали изопропиловым спиртом. Твердое вещество сушили при пониженном давлении с получением Boc-D-4Cpa-OSu [1].

Активация Boc-D-2Nal-OH и выделение

Стадия 2 (стадия реакции)

Boc-D-2Nal-OH (315,38 г) растворяли в изопропиловом спирте (5,35 кг) и добавляли IBC (157,07 г) и NMM (116,7 г). Смесь воды (42 мл), изопропилового спирта (1,1 кг) и HOSu (230,14 г) добавляли после охлаждения до -10°C вместе с дополнительным количеством NMM (10,11 г) и смесь перемешивали в течение 30 минут. Добавляли воду (0,82 л), осадок отфильтровывали и промывали изопропиловым спиртом и сушили при пониженном давлении с получением Boc-D-2Nal-OSu [2].

Синтез Boc(2-3)ОН: Boc-D-4Cpa-D-3Pal-OH

Стадия 3 (стадия реакции)

H-D-3Pal-OH × 2 HCl (0,251 кг) и Boc-D-4Cpa-OSu [1] (0,397 кг) со стадии (1) растворяли в ДМСО (3,33 л) и добавляли NMM (318,8 г). Смесь перемешивали при 20°C в течение 6 часов.

Добавляли воду (17 л), и pH регулировали посредством добавления HCl до pH 4,25. Осадок отфильтровывали и диспергировали в воде. Полученную суспензию затем фильтровали и промывали водой. Твердое вещество сушили при пониженном давлении с получением Boc-D-4Cpa-D-3Pal-OH [3].

Синтез промежуточного соединения Ac(1-3)ONa: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-ONa [7] (соединение формулы IIIa)

Стадия 4 (стадия реакции)

Boc-D-4Cpa-D-3Pal-OH [3] (447,93 г) со стадии (3) растворяли в смеси AcOEt (3,4 л) и АсОН (675 мл), смесь охлаждали при 5°C, после в нее добавляли MSA (672,77 г). Взаимодействие продолжается при 10°C в течение 2 часов и в раствор добавляли TEA (1214,28 г) с получением H-D-4Cpa-D-3Pal-OH [4].

Boc-D-2Nal-OSu [2] (412,44 г) со стадии (2) добавляли к H-D-4Cpa-D-3Pal-ОН [4], перемешивали в течение 24 часов при 20°C. Добавляли 25%-ный водный NH₃ (0,154 л) и н-бутанол (4,5 л) и смесь перемешивали при 45°C в течение 1 часа.

Раствор промывали:

- водой,

- водой при pH 9,5 (pH регулировали при смешивании с водным NaOH),

- водой.

AcOH (4,5 л) добавляли в органическую фазу, и раствор концентрировали до получения масла при пониженном давлении. Масло повторно растворяли в AcOH (4,5 л) и повторно концентрировали при пониженном давлении с получением Boc-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-OH [5] в виде масла.

Boc-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-OH [5] растворяли в воде (0,09 л) и уксусной кислоте (AcOH) (1,8 л). Добавляли MSA (672,77 г), и смесь перемешивали при температуре ниже 35°C в течение 2 часов. Раствор нейтрализовали TEA (779,16 г). Раствор концентрировали при пониженном давлении до получения масла. Масло повторно растворяли в толуоле (2,5 л) и повторно концентрировали при пониженном давлении до получения масла. Последнюю стадию повторяли с получением H-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-OH [6].

H-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-OH [6] растворяли в толуоле (2,0 л) и добавляли раствор ацетилимидазола (132,14 г) в толуоле (0,25 л). Раствор перемешивали при 20°C в течение 2 часов и добавляли воду (0,1 л).

Добавляли н-бутанол (4,5 л), и органическую смесь промывали при 35°C:

- 5% водным NaCl,

- метанолом и водой при кислых значениях pH 5,5 (pH регулировали при смешивании с водным NaOH),

- метанолом и водой при pH 11 (рН регулировали при смешивании с водн. NaOH),

- метанолом и 10% водным NaCl.

К перемешиваемой органической фазе после процессов экстракции добавляли гептан (15 л) при 20°C в течение 1 часа, полученную суспензию оставляли при перемешивании при 20°C в течение 1 часа. Осадок выделяли посредством фильтрации и суспендировали в гептане (3,5 л). Суспензию снова фильтровали. Последнюю стадию промывки гептаном и фильтрацию повторяли. Твердое вещество затем сушили при пониженном давлении с получением Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-ONa [7].

Характеристики ключевых промежуточных соединений

Промежуточное соединение Ac(1-3)ONa [7] стадии 4

Контроль качества	Критерии приемлемости
Описание	"Порошок от белого до бледно-желтого цвета (визуальный контроль)"
Идентификация (1)	"587,2±0,4 Да (MC)"
Идентификация (2)	"2Nal 0,9-1,1; 4Cpa 0,9-1,1; 3Pal 0,9-1,1 (AAA)"
Хиральная чистота	L-2Nal ≤ 1,3%; L-4Cpa ≤ 0,7%; L-3Pal ≤ 2,0% (ГХ-МС)
Чистота	≥90% (ВЭЖХ, % площади)

Пример 2: синтез промежуточного соединения Z(4-7)OH × DCHA: Z-SerftBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH × DCHA [15]

Синтез промежуточного соединения Boc(6-7)OBzl: Boc-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl

Стадия 5 (стадия реакции)

Boc-D-4Aph(tBuCbm)-OH (379,45 г) растворяли в NMP (0,76 л) и AcOEt (4,4 кг). После охлаждения при -4°C добавляли IBC (150,2 г) и NMM (101,1 г), и раствор перемешивали при -7°C в течение 0,5 часа с получением Boc-D-4Aph(tBuCbm)-OAct [8].

H-Leu-OBzl×TOS (491,88 г) растворяли в NMP (1,5 л) и добавляли AcOEt (2,7 кг) с последующим добавлением NMM (126,4 г). Этот раствор затем переносили в Boc-D-4Aph(tBuCbm)-OAct [8] и перемешивали при -10°C в течение 1 часа. Затем добавляли воду (0,5 л).

Реакционную смесь промывали при 20°С:

- водой при pH 8,5 (рН регулировали при смешивании с водным NaOH),

- водой при pH 2,0 (рН регулировали при смешивании с водным HCl),

- водой.

Органическую фазу концентрировали при пониженном давлении до получения масла. Масло повторно растворяли в AcOEt (0,6 кг) и повторно концентрировали при пониженном давлении до получения масла. Оставшееся масло растворяли в AcOEt (0,6 кг). Добавляли гептан (15,5 л) при перемешивании при 20°C. Осадок выделяли посредством фильтрации и промывали гептаном и затем сушили при пониженном давлении с получением Boc-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl [9].

Синтез Boc-(5-7)-OBzl: Boc-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl

Стадия 6 (стадия реакции)

Boc-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl [9] (582,7 г) со стадии 5 растворяли в AcOEt (3,15 кг). Добавляли MSA (481 г) и перемешивали при температуре ниже 15°C в течение 5 часов и добавляли TEA (406 г). Добавляли ДМФА (0,333 кг) с последующим добавлением TEA (101 г) и NMM (51 г) с получением H-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl [10].

Boc-4Aph(L-Hor)-OH (462,46 г) растворяли в ДМФА (2,09 кг) и AcOEt (1,44 кг). Добавляли IBC (150,24 г) и NMM (111,27 г) и перемешивали при -10°C в течение 0,5 часа с получением Boc-4Aph(L-Hor)-OAct [11].

H-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl [10] добавляли к Boc-4Aph(L-Hor)-OAct [11] и перемешивали при -10°C в течение 1,5 часа. Затем добавляли AcOEt (5,4 кг) и л-бутанол (6,0 л).

Органическую фазу промывали при 20°C:

- 5% водным NaHCO₃ при значении pH примерно 8 (pH регулировали при смешивании с водным NaHCO₃),

- 10% водным NaCl при pH 2,5 (pH регулировали при смешивании с водным H₃PO₄).

ДМФА (0,9 л) добавляли в органическую фазу, которую затем концентрировали при пониженном давлении до получения масла. Раствор вливали в воду (14 л) при перемешивании. Осадок выделяли на фильтре и промывали водой. Твердое вещество сушили при пониженном давлении с получением Boc-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl [12].

Синтез промежуточного соединения Z(4-7)OH × DCHA: Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH × DCHA (соединение формулы Va)

Стадия 7 (стадия реакции)

Boc-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl [12] (885,02 г) со стадии 6 добавляли в смесь MSA (961,1 г) и AcOEt (7,2 кг) и добавляли 2-бутанол (2 л), полученную смесь перемешивали при 0°C в течение 6 часов. Затем MSA нейтрализовали с помощью TEA (909,0 г).

Добавляли диспергированный в 2-бутаноле (1 л) 5% Pd/C (88,5 г), смесь гидрировали под давлением при 20°C в течение 3 часов. Затем Pd/C отфильтровывали и промывали 2-бутанолом с получением раствора, содержащего H-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH [13].

Z-Ser(tBu)-OH (413,5 г) растворяли в MeCN (2,5 л), раствор охлаждали до -5°C. Добавляли HONp (195 г) с последующим добавлением DCC (278,5 г), смесь перемешивали при 20°C в течение 24 часов. Смесь затем фильтровали и промывали MeCN с получением Z-Ser(tBu)-ONp [14].

NMM (354,2 г), ДМФА (4,75 кг) и Z-Ser(tBu)-ONp [14] добавляли к раствору H-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH [13], смесь оставляли при перемешивании при 20°C в течение 3 суток.

Полученную смесь промывали:

- 10% водным NaCl при pH 2,5 (pH регулировали при смешивании с водным HCl),

- водой при кислых значениях pH (pH 2,5) (pH регулировали при смешивании с водным HCl),

- 7,5% водным NaHCO_3,

- 5% водным NaCl при (pH 2,5) (pH регулировали при смешивании с водным HCl),

-10% водным NaCl.

В конечную органическую фазу добавляли дициклогексиламин (DCHA) (181 г), органическую фазу концентрировали при пониженном давлении до получения масла. Масло повторно растворяли в iPrOH (3,14 кг) и повторно концентрировали при пониженном давлении до получения масла. Оставшееся масло повторно растворяли в iPrOH (3,14 кг) и при перемешивании раствор вливали в AcOEt (31,5 кг). Перемешивание продолжали при 20°C в течение 1 часа до осаждения, осадок затем выделяли посредством фильтрации и промывали AcOEt. Твердое вещество сушили при пониженном давлении при 30°C в течение 30 часов с получением Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH × DCHA [15]. Чистота промежуточного соединения Z(4-7)OH × DCHA [15] составляет не менее 80% (ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография).

Промежуточное соединение Z(4-7)OH [15] стадии 7

Контроль качества	Критерии приемлемости
Описание	"Порошок от белого до желтого цвета (визуальный контроль)"
Идентификация (1)	"972,5±0,4 Да (МС)"
Идентификация (2)	"Ser 0,9-1,1; 4Aph 1,8-2,2; Leu 0,9-1,1 (AAA)"
Хиральная чистота	D-Ser ≤ 2,0%; D-4Aph 47-53%; D-Leu ≤ 0,7% (ГХ-МС)
Чистота 1	[4Aph⁵ (гидантоинацетил)] Z(4-7)OH DCHA ≤ 0,5% (ВЭЖХ, % площади)
Чистота (2)	≥80% (ВЭЖХ, % площади)

Пример 3: синтез промежуточного соединения H(8-10)NH₂: H-Lys(iPr, Boc)-Pro-D-Ala-NH₂ [21]

Синтез Boc(9-10)NH₂: Boc-Pro-D-Ala-NH₂

Стадия 8 (стадия реакции)

Boc-Pro-OH (226,02 г) растворяли в iPrOH (1,73 кг). Реакционную смесь охлаждали до -5°C. Добавляют IBC (143,4 г) и NMM (106,2 г), смесь перемешивали при 5°C в течение 0,5 часа с получением Boc-Pro-OAct [16].

H-D-Ala-NH₂× HCl (124,57 г) суспендировали в смеси iPrOH (1,57 кг) и NMM (106,2 г). Суспензию добавляли к Boc-Pro-OAct [16]. Реакционную смесь оставляли при перемешивании при 10°C в течение 3 часов. Затем добавляли DMEDA (10,6 мл). Смесь фильтровали, фильтрат концентрировали при пониженном давлении до получения масла. Масло повторно растворяли и повторно концентрировали с AcOEt (1,125 кг).

Остаточное масло растворяли в смеси AcOEt (1,8 кг) и н-бутанола (0,6 л). Органическую фазу промывали:

- 15% водным NaCl при pH 2,5 (pH регулировали при смешивании с водным HCl),

- 15% водным NaCl при pH 9,5 (pH регулировали при смешивании с водным NaOH).

Органическую фазу концентрировали при пониженном давлении, повторно растворяли в AcOEt (1,08 кг) и повторно концентрировали до получения масла.

Добавляли смесь AcOEt (0,33 кг) и гептана (0,75 л) при 20°C и перемешивали в течение 16 часов. Полученный осадок фильтровали и промывали смесью AcOEt и гептана на фильтре. Твердое вещество затем сушили при пониженном давлении с получением Boc-Pro-D-Ala-NH₂ [17]

Синтез промежуточного соединения H(8-10)NH₂: H-Lys(iPr, Boc)-Pro-D-Ala-NH₂ (соединение формулы VIa)

Стадия 9 (стадия реакции)

Boc-Pro-D-Ala-NH₂ [17] (313,89 г) со стадии 8 растворяли в смеси MSA (528,61 г) и iPrOH (0,785 кг), раствор перемешивали при 45°C в течение 1 часа. Смесь затем нейтрализовали TEA (607,14 г) с получением H-Pro-D-Ala-NH₂[18].

Z-Lys(iPr, Boc)-OH × DCHA (603,83 г) суспендировали в AcOEt (1,17 кг) и промывали:

- 12% водным NaHSO_4,

- водой,

- 15% водным NaCl.

Органическую фазу Z-Lys(iPr, Boc)-OH [19] после процессов экстракции добавляли к H-Pro-D-Ala-NH2 [18]. Добавляли растворенные в AcOEt (0,135 кг) HOBt (183,79 г) и DCC (227,0 г), смесь перемешивали при 2°C в течение 0,5 часа. Затем добавляли воду (0,2 л). Смесь фильтровали и промывали AcOEt. Объединенные фильтраты концентрировали при пониженном давлении до получения масла. Масло растворяли в AcOEt (0,9 кг), фильтровали и раствор промывали:

- водой при pH 2,5 (pH регулировали при смешивании с водным HCl),

- водой при pH 9 (pH регулировали при смешивании с водным NaOH),

- 10% водным NaCl при pH 7 (pH регулировали при смешивании с водным HCl или водным NaOH).

Органическую фазу концентрировали при пониженном давлении с получением Z-Lys(iPro,Boc)-Pro-D-Ala-NH₂ [20].

Z-Lys(iPro, Boc)-Pro-D-Ala-NH2 [20] растворяли в этаноле (0,04 кг) и воде (0,5 л) и добавляли 5% Pd/C (50 г). Суспензию подкисляли до значения pH 2,5 посредством добавления 6 М HCl и гидрировали при 20°C. После завершения взаимодействия катализатор удаляли посредством фильтрации и pH повышали до значения pH 7,0 посредством добавления 32% NaOH. Затем этанол удаляли посредством выпаривания при пониженном давлении. н-Бутанол (1 л) добавляли к полученной водной фазе, и уровень pH регулировали до щелочных значений pH 9 водным NaOH, и экстракция начинается. Эту стадию повторяли. Объединенные органические фазы концентрировали при пониженном давлении до получения масла.

Масло растворяли в AcOBu (0,5 л), концентрировали при пониженном давлении при 20°C и повторно растворяли в AcOBu (0,5 л). Затем добавляли гептан (2 л) при 50°C в течение 1 часа. Суспензию оставляли при перемешивании при 0°C в течение 16 часов. Осадок выделяли посредством фильтрации и промывали гептаном. В конце твердое вещество сушили при пониженном давлении с получением H-Lys(iPr, Boc)-Pro-D-Ala-NH₂ [21]. Чистота промежуточного соединения H(8-10)NH₂ [21] составляла не менее 95% (ВЭЖХ).

Промежуточное соединение H(8-10)NH₂ [21] стадии 9

Контроль качества	Критерии приемлемости
Описание	"Порошок от белого до бледно-желтого цвета (визуальный контроль)"
Идентификация (1)	"456,3±0,4 Да (МС)"
Идентификация (2)	"Lys(iPr) 0,9-1,1; Pro 0,9-1,1; Ala 0,9-1,1 (AAA)"
Хиральная чистота	D-Lys(iPr) ≤ 0,3%; D-Pro ≤ 0,3%; L-Ala ≤ 0,5% (ГХ-МС)
Чистота	≥95% (ВЭЖХ, % площади)

Пример 4: процессы сегментной конденсации конечного промежуточного соединения (соединение формулы II)

Промежуточное соединение Z(4-10)NH₂: Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH₂ [22] (соединение формулы IVg)

Стадия 10 (стадия реакции)

Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH×DCHA [15] (1153,41 г) со стадии 7 растворяли в ДМФА (2,1 кг). Затем добавляли HOBt (153,2 г) совместно с AcOEt (6,9 кг) и H-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH₂ [21] (569,5 г) со стадии 9. Когда все твердые вещества растворились, добавляли MSA (96,1 г). Раствор охлаждали до температуры ниже 5°C и добавляли DCC (309,5 г), растворенный в AcOEt (0,810 кг). Температуру повышали до 20°C, реакция продолжалась в течение 24 часов. Превращение Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH × DCHA [15] составляет не менее 96% (ВЭЖХ). Добавляли AcOEt (4,95 кг) и воду (5,5 л), и смесь перемешивали и фильтровали. 7,5% NaHCO₃ (водн.) (35 л) добавляли к фильтрату при перемешивании. Фазы разделяли, и органический слой дополнительно промывали:

- 7,5% NaHCO_3,

- водой при pH 3 (pH регулировали при смешивании с водным HCl),

- водой.

Конечную органическую фазу концентрировали при пониженном давлении до получения масла. Масло повторно концентрировали ЕЮН (0,405 кг) и затем AcOEt (0,45 кг). Оставшееся масло растворяли в ЕЮН (0,405 кг) и добавляли AcOEt (0,45 кг) и AcOBu (4,6 л). Раствор добавляли к гептану (27,6 л) при 20°C в течение 1 часа. Затем осадок фильтровали и промывали гептаном. Твердое вещество сушили при пониженном давлении при максимуме с получением Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH₂ [22]. Чистота Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr, Boc)-Pro-D-Ala-NH₂ [22] составляет не менее 70% (ВЭЖХ).

Конечное промежуточное соединение Ac(1-10)NH₂: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH₂ [24]

Стадия 11 (стадия реакции)

Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH₂ [22] (1409,67 г) со стадии 10 добавляли к смеси EtOH (10,98 кг) и воды (3,2 л) и перемешивали до тех пор, пока раствор не станет гомогенным. Добавляли 5% Pd/C (211 г). Смесь гидрировали при 20°C с контролем pH при pH 2,5 водным HCl.

Катализатор удаляли посредством фильтрации и pH регулировали с помощью водного NaOH до pH 3,8. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении до получения масла. EtOH (4,7 кг) добавляли к маслу и повторно концентрировали. Затем к маслу добавляли AcOEt (5,4 кг) и повторно концентрировали, этот процесс повторяли снова с получением H-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH₂ [23].

H-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH₂ [23] диспергировали в AcOEt (1,125 кг), затем добавляли HOBt (153,16 г) и смесь охлаждали до 0°C. Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-ONa [7] (609 до 05 г) со стадии 4 растворяли в ДМСО (2,5 л), этот раствор смешивали с суспензией, содержащей H-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH₂ [23], и добавляли DCC (309,5 г), растворенный в AcOEt (0,45 кг). Смесь перемешивали при °C в течение 24 часов. Превращение соединения [23] составляет не менее 96% (ВЭЖХ).

Добавляли воду (150 мл) и ДМСО (0,5 л), и перемешивание продолжали при 20°C в течение более чем 3 часов. Осадок фильтровали и промывали смесью AcOEt и ДМСО. Фильтраты объединяли и добавляли н-бутанол (17 л). Органический раствор промывали:

- 7% NaHCO₃ (водным),

- 10% водным NaCl (pH смеси нейтрализовали до значения pH 7,0, если это необходимо, при смешивании с водным HCl).

Добавляли ДМФА (4,75 кг), и органическую фазу концентрировали при пониженном давлении до получения масла. Масло медленно добавляли в воду (50 л) при 20°C в течение 1 часа при интенсивном перемешивании. Осадок выделяли на фильтре и дважды промывали водой. Твердое вещество затем сушили при пониженном давлении с получением Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH₂ [24] [Конечное промежуточное соединение]. Чистота соединения [24] составляет не менее 70% (ВЭЖХ).

Пример 5: Снятие защиты с конечного промежуточного соединения Ас(1-10)NH₂ с получением неочищенного дегареликса [25]

Стадия 12 (стадия реакции)

Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH₂ [24] (соединение формулы IIb)(1844,59 г) со стадии 11 растворяли в ТФУК (28,3 кг) при 20°C. Раствор перемешивали при 20°C (удаление 3 защитных групп) в течение 24 часов. Превращение соединения [24] составляет не менее 99% (ВЭЖХ).

Реакционную смесь затем смешивали с холодным раствором (ниже 10°C) AcONH₄ (19,1 кг), AcOH (18,4 л) и EtOH (14,52 кг) в воде (74 л). Во время смешивания двух растворов температуру поддерживали ниже 25°C. pH конечного раствора регулировали до значения pH 3 с помощью ТФУК или AcONH₄, если это необходимо, с получением раствора Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH₂ [25] [Неочищенный дегареликс].

Стадия 13 (очистка и лиофилизация)

Раствор неочищенного дегареликса прокачивали через колонку с обращенной фазой. Дегареликс элюировали с колонки градиентом EtOH/0,12% ТФУК в воде. Фракции с чистотой не менее 95% повторно очищали на колонке с обращенной фазой при использовании градиента EtOH/1% АсОН в воде. Фракции высокой чистоты лиофилизировали.

Claims

1. Жидкофазный способ получения декапептида, представленного формулой (II)

где AA₁ представляет собой D-2Nal, АА₂ представляет собой D-4Cpa, АА₃ представляет собой D-3Pal, АА₄ представляет собой Ser, АА₅ представляет собой 4Aph(L-Hor), АА₆ представляет собой D-Aph(Cbm), АА₇ представляет собой Leu, АА₈ представляет собой Lys(iPr), АА₉ представляет собой Pro, АА₁₀ представляет собой D-Ala;
Р₁ представляет собой защитные группы для амино или ацетил;
Р₄ представляет собой водород или защитную группу для гидроксила, предпочтительно защитную группу для гидроксила;
Р₆ представляет собой водород или защитные группы для амино; предпочтительно защитные группы для амино; и
Р₈ представляет собой защитную группу для амино,
или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата, включающий стадию сочетания первого полипептида, представленного формулой (III)

или его солью в жидкой реакционной среде в присутствии агента сочетания пептидов.

2. Способ по п. 1, где P₁ представляет собой ацетил; Р₄ представляет собой защитную группу для гидроксила, Р₆ представляет собой водород или защитные группы для амино; и Р₈ представляет собой защитную группу для амино.

3. Жидкофазный способ получения дегареликса, включающий способ по п. 1 или 2 с последующим способом, включающим стадию, при которой предшественник дегареликса, представленный формулой II, или его соль или сольват подвергают обработке расщепляющим агентом для удаления защитных групп Р₄, Р₆ и Р₈.

4. Способ по п. 1, 2 или 3, где P₁ представляет собой ацетил; Р₄ представляет собой tBu (трет-бутил); Р₆ представляет собой водород или tBu; и Р₈ представляет собой Вос (трет-бутилоксикарбонил).

5. Способ получения полипептида, представленного формулой (IV)

где Р₄ представляет собой водород или защитную группу для гидроксила, предпочтительно защитную группу для гидроксила;
Р₆ представляет собой водород или защитные группы для амино; предпочтительно защитные группы для амино; и
Р₈ представляет собой защитную группу для амино,
посредством сочетания полипептида, представленного формулой (V), или его соли или сольвата с полипептидом, представленным формулой (VI), или его солью или сольватом,

и затем удаления защитной группы P_N, где обозначения от АА₄ до АА₁₀, Р₄, Р₆ и Р₈ являются такими, как определено в п. 1, и P_N представляет собой защитную группу, которая может быть удалена посредством гидрирования.

6. Способ по п. 5, где P_N представляет собой бензилоксикарбонил, который удаляют посредством гидрирования соединения (P_N)AA₄(P₄)-AA₅-AA₆(P₆)-AA₇-AA₈(P₈)-AA₉-AA₁₀-NH₂ в присутствии Pd/C катализатора.

7. Способ получения декапептида, включающий способ по п. 5 или 6 с последующим способом по п. 1 или 2.

8. Способ получения дегареликса, включающий способ по п. 5 или 6 с последующим способом по п. 3.

9. Способ получения соединения (P_N)АА₄(Р₄)-АА₅-АА₆(Р₆)-АА₇, где обозначения от АА₄ до АА₇, Р₄ и Р₆ являются такими, как определено в п. 1, и P_N представляет собой защитную группу, которая может быть удалена посредством гидрирования, включающий следующие стадии:
a) получение (P_N2)АА₅-АА₆(Р₆)-АА₇(Р_С), где Р₆ имеет такое же значение, как указано выше, (P_N2) представляет собой защитную группу для N-концевой аминогруппы или водород, и (Р_С) представляет собой защитную группу для С-концевого карбоксила, которую можно отщепить посредством гидрирования;
b) удаление защитной группы для амино (P_N2), если она присутствует;
c) гидрирование Н-АА₅-АА₆(Р₆)-АА₇(Р_С) с получением Н-АА₅-АА₆(Р₆)-АА₇; и
d) взаимодействие Н-АА₅-АА₆(Р₆)-АА₇ с активированным сложным эфиром (P_N)АА₄(Р₄) с получением (P_N)АА₄(Р₄)-АА₅-АА₆(Р₆)-АА₇, где АА₄ имеет такое же значение, как указано выше, (Р₄) представляет собой защитную группу для гидроксила или водород, и P_N представляет собой защитную группу, которую можно предпочтительно отщепить посредством гидрирования.

10. Способ получения раствора дегареликса, включающий способ по п. 9, с последующим способом по любому из пп. 3-4.

11. Способ по любому из пп. 1, 5 и 9, где значение рН поддерживают ниже 9, предпочтительно ниже 8.

12. Полипептидные соединения, представленные следующими формулами:
AA₄(P₄)-AA₅-AA₆(P₆)-AA₇-AA₈(P₈)-AA₉-AA₁₀-NH₂,
(P_N)AA₄(P₄)-AA₅-AA₆(P₆)-AA₇-AA₈(P₈)-AA₉-AA₁₀-NH₂,
(P_N)AA₄(Р₄)-АА₅-АА₆(Р₆)-АА₇,
или соли, или сольваты,
где АА₄ представляет собой Ser, АА₅ представляет собой 4Aph(L-Hor), AA₆ представляет собой D-Aph(Cbm), АА₇ представляет собой Leu, АА₈представляет собой Lys(iPr), АА₉ представляет собой Pro, АА₁₀ представляет собой D-Ala;
Р₄ представляет собой водород или защитную группу для гидроксила, предпочтительно защитную группу для гидроксила;
Р₆ представляет собой водород или защитные группы для амино; предпочтительно защитные группы для амино; и
Р₈ представляет собой защитную группу для амино, и P_N представляет собой защитную группу.