ES2945315T3 - Método para realizar modificaciones específicas de sitio en la planta completa a través de la expresión transitoria de genes - Google Patents
Método para realizar modificaciones específicas de sitio en la planta completa a través de la expresión transitoria de genes Download PDFInfo
- Publication number
- ES2945315T3 ES2945315T3 ES16742765T ES16742765T ES2945315T3 ES 2945315 T3 ES2945315 T3 ES 2945315T3 ES 16742765 T ES16742765 T ES 16742765T ES 16742765 T ES16742765 T ES 16742765T ES 2945315 T3 ES2945315 T3 ES 2945315T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- site
- plant
- nuclease
- fragment
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 230000004048 modification Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 238000012986 modification Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title abstract description 5
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 title abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 93
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 97
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 80
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 62
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 56
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 54
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 52
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 48
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 45
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims description 35
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims description 35
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 31
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 24
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 claims description 18
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 13
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 13
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 claims description 12
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 11
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 claims description 10
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 claims description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 10
- 230000010152 pollination Effects 0.000 claims description 10
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 claims description 8
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 8
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 7
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 claims description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 7
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 6
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 claims description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 claims description 5
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 5
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims description 4
- 235000011303 Brassica alboglabra Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 claims description 3
- 235000011302 Brassica oleracea Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 claims description 3
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000004638 Dendrobium nobile Species 0.000 claims description 3
- 244000061508 Eriobotrya japonica Species 0.000 claims description 3
- 235000009008 Eriobotrya japonica Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000130270 Fagopyrum tataricum Species 0.000 claims description 3
- 235000014693 Fagopyrum tataricum Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000043261 Hevea brasiliensis Species 0.000 claims description 3
- 235000011449 Rosa Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000008530 Rosa canina Species 0.000 claims description 3
- 235000000539 Rosa canina Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 claims description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 claims description 2
- 210000000745 plant chromosome Anatomy 0.000 claims description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 12
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 abstract description 2
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 abstract 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 34
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 31
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 27
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108700008173 Arabidopsis PTPA Proteins 0.000 description 11
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 8
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 6
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 4
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 4
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000743774 Brachypodium Species 0.000 description 2
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 2
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 2
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 2
- 101150073246 AGL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 1
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000221785 Erysiphales Species 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241000207746 Nicotiana benthamiana Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 244000037671 genetically modified crops Species 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 1
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 1
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 1
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 1
- 230000004260 plant-type cell wall biogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000013102 re-test Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
- C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
- C12Y301/03048—Protein-tyrosine-phosphatase (3.1.3.48)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/10—Vectors comprising a non-peptidic targeting moiety
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Se proporciona un método para realizar una modificación específica del sitio en un segmento de gen objetivo en una planta completa a través de la expresión transitoria de genes, el método comprende los siguientes pasos: tomar la planta completa como un objeto de expresión transitoria, expresar transitoriamente una nucleasa distinta del gen objetivo segmento en la planta; bajo la acción de la nucleasa, cortando el segmento objetivo y realizando la modificación específica del sitio del segmento objetivo a través de la reparación del ADN de la planta. También se proporciona un método para cultivar una planta de mutación no transgénica usando el método anterior, y así obtener una planta de mutación no transgénica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Método para realizar modificaciones específicas de sitio en la planta completa a través de la expresión transitoria de genes
Campo técnico
La presente invención pertenece al campo de la ingeniería genética de plantas y está relacionada con un método para la modificación dirigida al sitio de la planta completa a través de la expresión transitoria de genes.
Antecedentes técnicos de la invención
La transgénesis se refiere a un proceso de transferencia de genes exógenos a un organismo específico a través de medios de biología molecular, de modo que las características o funciones biológicas del organismo se modifican parcialmente. En 1983, la primera planta transgénica del mundo, el tabaco antiviral transgénico, se desarrolló en EE. UU. En 1986, el algodón antiviral transgénico se desarrolló en EE. UU. y se sometió a pruebas de campo. En 1987, el gen resistente a los insectos y el gen resistente a los herbicidas se transfirieron a los cultivos. En 1992, se cultivó tabaco transgénico en China. En 1995, Canadá comenzó a comercializar Brassica transgénica resistente a herbicidas. En 1996, se cultivaron a gran escala en EE. UU. algodón transgénico resistente a insectos y soja resistente a herbicidas. Actualmente existen más de 120 plantas transgénicas en el mundo, en las cuales se han comercializado 51 cultivos transgénicos entre los que se encuentran la soja, el algodón y el maíz.
En la actualidad, se plantean cada vez más preocupaciones sobre los productos transgénicos, especialmente por la seguridad de los alimentos transgénicos. La regulación de los organismos transgénicos es muy estricta en la mayoría de los países. Costará mucho dinero y tiempo controlar una técnica o producto transgénico. De acuerdo con la investigación de International Crop Life, se necesitarían unos 5,5 años y 35 millones de dólares para la comercialización de un evento transgénico. Además, los cultivos transgénicos ya comercializados no son bien aceptados por el mercado, por ejemplo, el primer tomate transgénico permitido para la venta finalmente sale del mercado debido a las bajas ventas. Por lo tanto, es muy importante desarrollar métodos libres de transgenes para la mejora de cultivos.
Actualmente, los métodos para la mejora genética de un cultivo o la modificación de genes tienen muchos defectos. Por ejemplo, el cruzamiento tradicional debe llevarse a cabo durante varias generaciones y, por lo tanto, consume mucho tiempo y requiere un trabajo excesivo. También puede estar limitado por el aislamiento reproductivo entre especies y afectado por un enlace genético indeseable. Los métodos de mutagénesis física o química, tal como la mutagénesis por radiación, la mutagénesis EMS, etc., pueden introducir aleatoriamente un gran número de sitios mutados en el genoma, pero la identificación de los sitios mutados sería muy difícil.
Las herramientas de modificación genómica dirigida al sitio, que son técnicas novedosas surgidas en los últimos años, incluyen principalmente tres categorías de nucleasas específicas de secuencia (SSN): Nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN) y repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas/sistemas asociados a CRISPR (CRISPR/Cas9). Su característica común es que pueden actuar como una endonucleasa para escindir secuencias de ADN específicas, que produce la ruptura de doble cadena de ADN (DSB). La DSB puede activar el mecanismo de reparación intrínseco de la célula, la unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la recombinación homóloga (HR), para reparar los daños del ADN. La modificación dirigida al sitio de una secuencia de ADN específica se puede lograr durante el proceso de reparación del ADN.
El uso de técnicas de transferencia de genes para suministrar las herramientas anteriores a los cultivos puede superar los defectos del mejoramiento tradicional, tal como la baja eficiencia, el consumo de tiempo y la poca especificidad. Sin embargo, este proceso implica transgenes y, por lo tanto, debe obtenerse un mutante modificado dirigido al sitio libre de transgenes a través de la segregación en la población de la progenie. Dado que los genes exógenos se han integrado en el genoma de la planta (aunque finalmente se han eliminado por segregación), todavía existen problemas de seguridad. Por lo tanto, todavía existe la necesidad de un método para la modificación de cultivos dirigida al sitio que evite los transgenes.
Los medios de transferencia de genes convencionales, tal como la transformación por bombardeo de partículas, la transformación mediada por Agrobacterium o la transformación basada en protoplastos, requieren el proceso de cultivo de tejidos. El cultivo de tejido vegetal significa que los tejidos, células o protoplastos deseados se aíslan de la planta y se cultivan en condiciones artificiales para regenerar una planta completa. El cultivo de tejidos tiende a producir mutaciones somáticas y está limitado por el genotipo de la planta y el receptor específico. Requiere mucho tiempo obtener la planta regenerada y cuesta muchos recursos. La transformación in situ significa la transformación de una planta viva (no ex vivo), sin necesidad de cultivo de tejidos o células. La transformación in situ generalmente usa una planta completa como sujeto para la transformación e incluye, por ejemplo, el enfoque del tubo polínico, la inmersión de la inflorescencia, la regeneración del ápice del brote, la inyección de ovario, el enfoque del disco de la hoja y similares. La transformación in situ evita el cultivo de tejidos y, por lo tanto, es fácil de realizar y no requiere
equipos específicos. Este método es independiente del genotipo y del receptor y, por lo tanto, se puede aplicar a diferentes variedades de diferentes especies. Además, la descendencia transgénica se puede obtener directamente. Por lo tanto, la modificación dirigida al sitio del genoma de una planta se puede lograr mediante un sistema de expresión transitoria a través de la transformación in situ, lo que es beneficioso para la aplicación de técnicas de edición de genes en plantas.
Jian-Feng Li y otros, "Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9", Nature Biotechnology, vol. 31, núm. 8; 8 de agosto de 2013; páginas 688-691, describen un método para introducir una modificación genética en una planta.
Voytas, D.F. et al., "Precision Genome Engineering and Agriculture: Opportunities and Regulatory Challenges", PLOS Biology, vol. 12, núm. 6; 10 de junio de 2014; páginas 1-6, describen varios métodos para introducir una modificación genética en una planta.
Resumen de la invención
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
El objeto de la invención es proporcionar un método para la modificación dirigida al sitio de la planta completa a través de la expresión transitoria de genes.
La invención proporciona un método para realizar la modificación dirigida al sitio en un fragmento diana de un gen diana en una planta completa, que comprende la etapa de: expresar transitoriamente una nucleasa dirigida al sitio en dicha planta, en donde se usa una planta completa como sujeto para la expresión transitoria, y en donde dicha nucleasa dirigida al sitio se dirige a y escinde dicho fragmento diana, para lograr de esta manera la modificación dirigida al sitio a través de la autorreparación del ADN de dicha planta, en donde la etapa de expresar transitoriamente la nucleasa dirigida al sitio comprende las siguientes etapas: a) suministrar la nucleasa dirigida al sitio o un material genético para expresar la nucleasa dirigida al sitio en dicha planta a través de un tubo polínico, inflorescencia, ápice de brote u ovario después de la polinización, y b) cultivar la planta obtenida en la etapa a) en ausencia de presión de selección, lo que permite la degradación de la nucleasa dirigida al sitio o el material genético no integrado en el cromosoma de la planta, y en donde se omite el cultivo de tejidos; en donde dicho material genético es un vector recombinante o un fragmento lineal de ADN o un ARN transcrito in vitro.
En ausencia de presión de selección, el sistema de defensa de la planta inhibirá la entrada de un gen exógeno y degradará el gen exógeno que ya se ha suministrado a la planta. Por lo tanto, al cultivar la planta completa que ha experimentado una expresión transitoria, el gen exógeno (incluido cualquier fragmento del material genético para expresar la nucleasa específica del fragmento diana) no se integrará en el genoma de la planta y la planta que finalmente se obtendrá es una planta libre de transgenes con modificación dirigida al sitio.
En una modalidad donde dicha parte de la planta es un tubo polínico, el suministro se realiza mediante la inyección de una solución que contiene un vector recombinante (tal como un plásmido de ADN) o un fragmento lineal de ADN o ARN transcrito in vitro o una solución que contiene dicha nucleasa dirigida al sitio en el estigma después de la polinización, de esta manera el material genético exógeno o la nucleasa dirigida al sitio se suministra al óvulo fertilizado a través del tubo polínico que se forma durante la floración y la fertilización (es decir, el enfoque del tubo polínico).
En una modalidad donde dicha parte de la planta es una inflorescencia, el suministro se realiza al sumergir la inflorescencia en una solución de Agrobacterium tumefaciens que porta un vector recombinante (tal como un plásmido de ADN) o un fragmento lineal de ADN (específicamente, el enfoque de inmersión de inflorescencia o inmersión floral).
En una modalidad donde dicha parte de la planta es un ápice de brote, el suministro se realiza al sumergir el ápice de brote con una solución de Agrobacterium tumefaciens que porta un vector recombinante (tal como un plásmido de ADN) o un fragmento lineal de ADN (específicamente, enfoque de regeneración del ápice del brote).
En una modalidad donde dicha parte de la planta es un ovario, el suministro se realiza mediante la inyección de una solución que contiene un vector recombinante (tal como un plásmido de ADN) o un fragmento lineal de ADN o ARN transcrito in vitro o una solución que contiene dicha nucleasa dirigida al sitio en el ovario después de la polinización (específicamente, enfoque de inyección de ovario).
En una descripción donde dicha parte de la planta es un ovario, el suministro se realiza mediante la inyección de una solución de Agrobacterium tumefaciens que porta un vector recombinante (tal como un plásmido de ADN) o un fragmento lineal de ADN en el ovario después de la polinización (específicamente, el enfoque de inyección de Agrobacterium en el ovario).
En una modalidad donde dicha parte de la planta es una hoja, el suministro se realiza mediante la inyección de una solución de Agrobacterium tumefaciens que porta un vector recombinante (tal como un plásmido de ADN) o un fragmento lineal de ADN en la hoja (específicamente, enfoque de disco de hoja).
En dicho método, la nucleasa dirigida al sitio que es específica del fragmento diana puede ser cualquier nucleasa que pueda lograr la edición del genoma, tal como la nucleasa de dedo de zinc (ZFN) y la nucleasa efectora similar a un activador de transcripción (TALEN) y CRISPR/Cas9. nucleasa, etc.
En una modalidad de la invención, la "nucleasa dirigida al sitio" se refiere específicamente a las nucleasas CRISPR/Cas9. En algunas modalidades, el material genético para expresar las nucleasas CRISPR/Cas9 específicas de un fragmento diana está compuesto específicamente por un vector recombinante o fragmento de ADN para transcribir un ARN guía (o dos vectores recombinantes o fragmentos de ADN para transcribir crARN y tracrARN respectivamente) y para expresar la proteína Cas9; o está compuesto específicamente por un vector recombinante o fragmento de ADN para transcribir un ARN guía (o dos vectores recombinantes o fragmentos de ADN para transcribir crARN y tracrARN respectivamente) y un vector recombinante o fragmento de ADN o ARN para expresar la proteína Cas9; o está compuesto específicamente por un ARN guía (o un crARN y un tracrARN) y un vector recombinante o fragmento de ADN o ARN para expresar la proteína Cas9. Dicho ARN guía es un ARN con estructura palindrómica que se forma por apareamiento parcial de bases entre crARN y tracrARN; dicho crARN contiene un fragmento de ARN capaz de unirse complementariamente al fragmento diana.
Además, en el vector recombinante o fragmento de ADN para transcribir el ARN guía, el promotor para iniciar la transcripción de la secuencia de nucleótidos codificante de dicho ARN guía es un promotor U6 o un promotor U3. Más específicamente, el vector recombinante para la transcripción del ARN guía y la expresión de la proteína Cas9 es un plásmido recombinante que se obtiene mediante la inserción de la secuencia codificante del "fragmento de ARN capaz de unirse complementariamente al fragmento diana" en dirección directa entre dos sitios de restricción BsaI del plásmido pHSN40 o pHSN401.
El vector recombinante para transcribir el ARN guía es un plásmido recombinante que se obtiene mediante la inserción de la secuencia codificante del "fragmento de ARN capaz de unirse complementariamente al fragmento diana" en dirección directa entre dos sitios de restricción BbsI del plásmido pZmU3-ARNg; el vector recombinante de expresión de la nucleasa Cas9 es concretamente el vector pJIT163-Ubi-Cas9
En otra modalidad de la invención, la nucleasa dirigida al sitio es nucleasa TALENs. El material genético para expresar la nucleasa dirigida específica del sitio diana puede ser un vector recombinante (plásmido de ADN) o un fragmento de ADN o ARN que exprese proteínas TALEN emparejadas, en donde la proteína TALEN está compuesta por un dominio de unión a ADN capaz de reconocer y unirse al fragmento diana, y un dominio Fok I.
En el caso de que la nucleasa dirigida al sitio sea nucleasa con dedos de zinc (ZFN), el material genético para expresar la nucleasa dirigida al sitio que es específica del sitio diana puede ser un vector recombinante (plásmido de a Dn ) o fragmento de ADN o ARN que exprese proteínas ZFN emparejadas, en donde la proteína ZFN está compuesta por un dominio de unión a ADN capaz de reconocer y unirse al fragmento diana, y un dominio Fok I. En dicho método, la modificación dirigida al sitio es específicamente inserción, deleción y/o reemplazo en el fragmento diana en el genoma de la planta. En algunas modalidades, el fragmento diana está dentro de la región codificante de un gen diana. En algunas modalidades, el fragmento diana está dentro de la región de regulación de la transcripción de un gen diana, tal como un promotor. En algunas modalidades, el gen diana podría ser un gen estructural o un gen no estructural. En algunas modalidades, dicha modificación da como resultado la pérdida de la función del gen diana. En algunas modalidades, dicha modificación da como resultado la ganancia (o cambio) de la función del gen diana.
En algunas modalidades, la planta puede ser de cualquier genotipo. La planta puede ser monocotiledónea o dicotiledónea, tal como maíz (Zea mays), trigo, soja, algodón, tabaco, arabidopsis, centeno, Rosa roxbunghii, Eriobotrya japónica, Carica papaya, Rosa canina, Dendrobium nobile Lindl., Brassica oleracea, Fagopyrum tataricum o Hevea brasiliensis.
Cuando la planta es maíz, trigo, soja, algodón, tabaco y similares, la nucleasa dirigida al sitio o el material genético puede suministrarse mediante el enfoque del tubo polínico. Cuando la planta es Arabidopsis, trigo, centeno y similares, la nucleasa dirigida al sitio o el material genético pueden suministrarse mediante el enfoque de inmersión de inflorescencia. Cuando la planta es maíz, Rosa roxbunghii, Eriobotrya japonica, Carica papaya, Rosa canina y similares, el material genético puede suministrarse mediante el enfoque de regeneración del ápice del brote. Cuando la planta es trigo, soja, algodón, Dendrobium nobile Lindl. y similares, la nucleasa dirigida al sitio o el material genético pueden suministrarse mediante el enfoque de inyección en el ovario. Cuando la planta es el tabaco, Brassica oleracea, Fagopyrum tataricum, Hevea brasiliensis y similares, el material genético puede suministrarse mediante el enfoque de disco de hoja como parte de la descripción.
En una modalidad (Ejemplo 1) de la invención, la planta es maíz (en particular, maíz híbrido HiII y línea endogámica B73, Zheng58, etc.); la nucleasa es CRISPR/Cas9; el gen diana es el gen endógeno del maíz ZmIPK; el fragmento diana es 5'-AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'; el vector recombinante para transcribir el ARN guía es un plásmido recombinante que se obtiene mediante la inserción del fragmento de ADN como se muestra en 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT -3' en dirección directa entre dos sitios de restricción BbsI del plásmido pZmU3-ARNg; el vector recombinante de expresión de la nucleasa Cas9 es concretamente el vector pJIT163-Ubi-Cas9; el vector recombinante para transcribir el ARN guía y expresar la proteína Cas9 es un plásmido recombinante que se obtiene mediante la inserción del fragmento de ADN como se muestra en 5'-GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3' en dirección directa entre dos sitios de restricción BsaI del plásmido pBUE411.
En otra modalidad (Ejemplo 2) de la invención, la planta es Arabidopsis; la nucleasa es CRISPR/Cas9; el gen diana es el gen endógeno de Arabidopsis AtPTPA; el fragmento diana es 5'-ACGATATCCGCCGATTTCAC-3'; el vector recombinante para transcribir el ARN guía y expresar la proteína Cas9 es un plásmido recombinante que se obtiene mediante la inserción del fragmento de a Dn como se muestra en 5'- ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT -3' en dirección directa entre dos sitios de restricción BsaI del plásmido pHSN401.
Una planta mutante sin transgén y/o una descendencia de la misma obtenida mediante el uso del método de la invención para realizar una modificación dirigida al sitio en un fragmento diana de un gen diana en una planta de interés para permitir que el gen diana pierda sus funciones, también se describe.
La presente invención también proporciona un método para hacer una planta mutante libre de transgén, que comprende las siguientes etapas: realizar una modificación dirigida al sitio en un fragmento diana de un gen diana en una planta de interés mediante el uso del método de la invención, para obtener una planta en la que se pierden las funciones del gen diana y el genoma está libre de gen exógeno integrado.
Como se usa en la presente descripción, una planta transgénica se refiere a una planta con un gen exógeno integrado en el genoma de la misma. Una planta libre de transgén se refiere a una planta sin un gen exógeno integrado en el genoma de la misma.
La presente invención combina la técnica de edición del genoma y el sistema de expresión transitoria en el que se usa una planta completa como sujeto de expresión. Es decir, en la presente invención, la nucleasa dirigida al sitio se introduce en las células o tejidos de una planta completa a través del enfoque del tubo polínico, inmersión de la inflorescencia, regeneración del ápice del brote, inyección en el ovario y similares; luego se logra la modificación del genoma de la planta mediante la expresión transitoria de la nucleasa dirigida al sitio. La descendencia mutante con alta seguridad se puede obtener directamente. Por ejemplo, en el enfoque del tubo polínico, una solución que contiene la nucleasa dirigida al sitio o el ADN/ARN para expresar la nucleasa dirigida al sitio se suministra en los óvulos fertilizados o en las células germinales (esperma u óvulo) a través del tubo polínico formado durante la floración o fertilización de la planta. Estas células son similares a los protoplastos (sin formación de pared celular) y llevan a cabo una replicación y recombinación activas del ADN y, por lo tanto, serán editadas de manera eficiente por la nucleasa dirigida al sitio. Los óvulos fertilizados modificados o las células germinales pueden convertirse en plantas mutantes intactas. La nucleasa dirigida al sitio introducida o el ARN que codifica la nucleasa dirigida al sitio será degradada por las células vegetales. El ADN que codifica la nucleasa dirigida al sitio también será degradado por las células vegetales ya que el método se realiza completamente en ausencia de presión de selección. Por lo tanto, ningún gen exógeno se integrará en el genoma y los mutantes obtenidos tendrán una mayor bioseguridad. Las ventajas de la presente invención incluyen: se omite el cultivo de tejidos; la mutación se obtiene a nivel de la planta completa; el método es independiente del genotipo y del receptor y, por lo tanto, se puede aplicar a varias variedades de varias especies; los mutantes T1 se pueden obtener directamente y la mutación se puede heredar de forma estable; lo que es más importante, la planta mutante tal como se obtiene está libre de genes exógenos y, por lo tanto, tiene una bioseguridad más alta.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra la mutagénesis dirigida al sitio del gen endógeno del maíz ZmIPK por expresión transitoria del sistema ARNg:Cas9 en protoplasto, a) es un electroferograma en gel. El carril 1 es un marcador, de abajo hacia arriba: 250, 500, 750, 1000 pb respectivamente; el carril 2 y el carril 3 son resultados de digestión de restricción con SacI para productos de PCR de ADN de protoplasto, en donde el protoplasto se transformó con el sistema ARNg:Cas9; el carril 4 es el resultado de la digestión con SacI para el producto de PCR de ADN de protoplasto de tipo salvaje; el carril 5 es el producto de PCR del protoplasto de tipo salvaje, b) son los resultados de la secuenciación de algunos mutantes.
La figura 2 muestra la mutagénesis dirigida al sitio del gen endógeno del maíz ZmIPK mediante la expresión transitoria del sistema ARNg:Cas9 en la variedad de maíz HiII a través del enfoque del tubo polínico, así como también los resultados de la secuenciación. a) es un electroferograma en gel. El carril 1 es un marcador, de abajo hacia arriba: 100, 250, 500, 750, 1000 pb respectivamente; los carriles 2-12 son los resultados de la digestión por restricción con SacI para los productos de PCR de los mutantes; el carril 13 es el resultado de la
digestión con SacI para el producto de PCR del control de tipo salvaje. b) son los resultados de la secuenciación de algunos mutantes.
La figura 3 muestra la mutagénesis dirigida al sitio del gen endógeno del maíz ZmIPK mediante la expresión transitoria del sistema ARNg:Cas9 en la variedad de maíz B73 a través del enfoque del tubo polínico, así como también los resultados de la secuenciación. a) es un electroferograma en gel. El carril 1 es un marcador, de abajo hacia arriba: 100, 250, 500, 750, 1000 pb respectivamente; los carriles 2-6 son los resultados de la digestión por restricción con SacI para los productos de PCR de los mutantes; el carril 7 es el resultado de la digestión con SacI para el producto de PCR del control de tipo salvaje. b) son los resultados de la secuenciación de algunos mutantes.
La figura 4 muestra la mutagénesis dirigida al sitio del gen endógeno del maíz ZmIPK mediante la expresión transitoria del sistema ARNg:Cas9 en la variedad de maíz Zheng58 a través del enfoque del tubo polínico, así como también los resultados de la secuenciación. a) es un electroferograma en gel. El carril 1 es un marcador, de abajo hacia arriba: 100, 250, 500, 750, 1000 pb respectivamente; los carriles 2-9 son los resultados de la digestión por restricción con SacI para los productos de PCR de los mutantes; el carril 10 es el resultado de la digestión con SacI para el producto de PCR del control de tipo salvaje. b) son los resultados de la secuenciación de algunos mutantes.
La figura 5 es un electroferograma en gel que muestra la amplificación de los mutantes de los genes ZmIPK de diferentes variedades de maíz a través del enfoque del tubo polínico, mediante el uso de 2 juegos de cebadores en los vectores pZmU3-ARNg-Cl y pJIT163-Ubi-Cas9, a) es el resultado de la amplificación mediante el uso del par de cebadores ZmU3-HC1R; b) es el resultado de la amplificación mediante el uso del par de cebadores Cas9-1HCas9-1R. El carril 1 es un marcador, de abajo hacia arriba: 100, 250, 500, 750, 1000 respectivamente; los carriles 2-10 son mutantes según se ensayaron; el carril 11 es el control positivo (plásmido pZmU3-ARNg-C1 o pJIT163-Ubi-Cas9).
La figura 6 muestra la mutagénesis dirigida al sitio del gen endógeno de Arabidopsis AtPTPA por expresión transitoria del sistema ARNg:Cas9 en protoplasto, a) es un electroforetograma en gel. El carril 1 es un marcador, de abajo hacia arriba: 100, 250, 500, 750, 1000 pb, 2000, 3000, 5000 pb, respectivamente; el carril 2 y el carril 3 son resultados de digestión de restricción con EcoRV para productos de PCR de ADN de protoplasto, en donde el protoplasto se transformó con el sistema ARNg:Cas9; el carril 4 es el resultado de la digestión con EcoRV para el producto de PCR de ADN de protoplasto de tipo salvaje; el carril 5 es el producto de PCR del protoplasto de tipo salvaje, b) son los resultados de la secuenciación de las bandas sin cortar.
La figura 7 muestra la mutagénesis dirigida al sitio del gen endógeno de Arabidopsis AtPTPA por expresión transitoria del sistema ARNg:Cas9 a través del enfoque de inmersión de inflorescencia, a) es un electroferograma en gel. El carril 1 es un marcador, de abajo hacia arriba: 100, 250, 500, 750, 1000 pb, 2000, 3000, 5000 pb, respectivamente; los carriles 2-9 son resultados de digestión de restricción con EcoRV para productos de PCR de los mutantes; el carril 10 es el resultado de la digestión con EcoRV para el producto de PCR del control de tipo salvaje. b) son los resultados de la secuenciación de algunos mutantes.
La figura 8 es un electroferograma en gel que muestra la amplificación del gen del mutante AtPTPA mediante el uso de cebadores en el vector pHSN401-C2. a) es el resultado de la amplificación mediante el uso del par de cebadores pHSN401-1HC2R; b) es el resultado de la amplificación mediante el uso del par de cebadores CAS9-2HCAS9-2R. El carril 1 es un marcador, de abajo hacia arriba: 100, 250, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 5000 pb respectivamente; los carriles 2-9 son mutantes según se ensayaron; el carril 10 es el control positivo (plásmido pHSN401).
La figura 9 muestra la mutación en la progenie del gen mutante AtPTPA. El carril 1 es un marcador, de abajo hacia arriba: 100, 250, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 5000 pb respectivamente; los carriles 2, 3, 4, 5 son descendientes de mutantes homocigóticos; los carriles 6, 7 son progenie de tipo salvaje obtenida por segregación; los carriles 8, 9, 10 son descendientes de mutantes heterocigóticos.
Modalidades detalladas
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Los métodos experimentales usados en los siguientes ejemplos son todos métodos convencionales, a menos que se indique de otra forma.
Los materiales, reactivos usados en los siguientes ejemplos están todos disponibles comercialmente, a menos que se indique de otra forma.
El vector de expresión pZmU3-ARNg se describió en "Liang, Z. y otros. Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs andthe CRISPR/Cas System. Journal of Genetics and Genomics.41:63-68, (2014)".
Los vectores de expresión pJIT163-Ubi-Cas9 se describieron en "Wang, Y. y otros. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nature Biotechnology. 32, 947-951 (2014)".
Los vectores de expresión pHSN401 y pBUE411 se describieron en "Xing, H. y otros. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biology.l4:327, (2014)".
La variedad de maíz Hill se describió en "Armstrong, C.L., Green, C.E.& Phillips, R.L. Development and availability of germplasm with high type II culture formation response. Maize Genet. Coop. News Lett. 65,92-93 (1991)".
La variedad de maíz B73 se describió en "Russell, W.A. Registration of B70 and B73 parental lines of maize. Crop Sci. 12, 721 (1972)".
La variedad de maíz Zheng58 se describió en "Zhang Falin, Breeding and application of a Maize inbred line Zheng58. Crop Journal, 2001(4):31-31".
Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia se describió en "Koorneef, M. y otros. Linkage map of Arabidopsis thaliana. Jornal of Heredity. 74,265-272 (1983)".
Medio MS: 4,43 g/l de sales MS (Sigma, M5524), 30 g/l de sacarosa, 3 g/l de fitogel, pH 5,7, esterilizado en autoclave a 121 °C durante 20 min.
Medio LB: 10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de NaCl, pH 7,0 (para medio LB sólido, se adicionaron 15 g de agar por litro de medio líquido), esterilizado en autoclave a 121 °C durante 20 min.
Las soluciones usadas en la preparación y transformación de protoplastos se muestran en las tablas 1-6.
Tabla 1: Solución de enzimólisis 50 ml para Arabidopsis
Tabla 2: 50ml de solución de enzimólisis para Maíz
Tabla 3: 500 ml de W5
Tabla 4: 250 ml de solución WI
Tabla 5: 10 ml de solución MMG
Tabla 6: 4 ml de solución de PEG
Transformación de Agrobacterium tumefaciens:
1) Las células competentes (almacenadas a -80°C) se descongelaron en hielo, luego se adicionaron 2 |jg de ADN plasmídico y se mezclaron; la mezcla se colocó en hielo durante 30 min;
2) el tubo EP se sumergió en nitrógeno líquido durante 1 min y se transfirió rápidamente a un baño de agua a 37 °C para descongelarlo (2 min);
3) luego se adicionó 1 ml de medio líquido LB y se incubó a 28 °C durante 4-5 h con agitación a baja velocidad (150 rpm);
4) las células bacterianas se colectaron mediante centrifugación a 10 000 rpm durante 30 s, se descartó el sobrenadante y se sembraron 100 j l de células bacterianas resuspendidas en las placas de selección que contenían los antibióticos correspondientes.
5) las placas se incubaron boca abajo a 28 °C hasta que emergieron colonias blancas (transformantes).
Ejemplo 1. Edición dirigida al sitio del gen endógeno del maíz ZmIPK a través del enfoque del tubo polínico y el enfoque de regeneración del ápice del brote
I. Diseño del fragmento diana: diana-C1
Diana-Cl: 5'-CCGAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'; (posición 393-415 del gen ZmIPK como se muestra en Genbank Núm. AY172635).
II. Preparación del plásmido pZmU3-ARNg y el plásmido pBUE411 que contiene el sitio C1
C1 es la secuencia de ADN para el ARN que se puede unir de manera complementaria a la diana-C1.
Se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos monocatenarios con extremos cohesivos (subrayados):
C1-1F: 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT 3';
C1-2F:5'-GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT 3';
C1R: 5'-AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'.
El ADN de doble cadena con extremos cohesivos se formó a través de la hibridación entre C1-1HC1R y se insertó entre los dos sitios de restricción Bbsl en el plásmido pZmU3-ARNg, lo que resultó en un plásmido pZmU3-ARNg
que contenía el sitio Cl. El plásmido positivo se verificó mediante secuenciación. Un plásmido recombinante, que se obtuvo mediante la inserción del fragmento de ADN como se muestra en 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCgAg CT-3' en dirección directa en el sitio de restricción BbsI del plásmido pZmU3-ARNg, fue positivo y se designó como pZmU3-ARNg-C1.
El ADN de doble cadena con extremos cohesivos se formó a través de la hibridación entre C1-2HC1R y se insertó entre los dos sitios de restricción BsaI en el plásmido pBUE411, lo que resultó en un plásmido pBUE411 que contenía el sitio Cl. El plásmido positivo se verificó mediante secuenciación. Un plásmido recombinante, que se obtuvo mediante la inserción del fragmento de ADN como se muestra en 5'-GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3' en dirección directa en el sitio de restricción BsaI del plásmido pBUE411, fue positivo y se denominó pBUE411-C1.
III. Suministro del sistema ARNg:Cas9 en protoplasto de maíz
El vector pJIT163-Ubi-Cas9 y el plásmido pZmU3-ARNg-C1 obtenidos en la etapa II se introdujeron en el protoplasto de maíz. El proceso específico incluye:
1. Cultivo de las plántulas de maíz.
Las semillas de la variedad híbrida de maíz Hill y las líneas puras B73 y Zheng58 se empaparon en agua durante toda la noche y se transfirieron a una placa que contenía papel absorbente (se adicionó agua), se trataron con luz durante 3 días para la germinación. Las semillas de maíz germinadas se cultivaron en suelo a 24 °C durante 10-11 días, para dar como resultado las plántulas de maíz.
2. Aislamiento de protoplasto
1) Se tomaron hojas tiernas de maíz, y la parte media de las mismas se cortó en hilos de 0,5-1 mm con una cuchilla cortadora, se colocaron en 50 ml de solución de enzimólisis durante 5 h de digestión (0,5 h de enzimólisis al vacío, luego 4,5 h de agitación lenta a 10 rpm).
Nota: La temperatura durante la enzimólisis debe mantenerse entre 20-25 °C, la reacción debe realizarse en la oscuridad; y la solución debe agitarse suavemente después de la reacción para liberar los protoplastos.
2) el producto de la enzimólisis se diluyó al adicionar 30 ml de W5 y se filtró en un tubo de centrífuga de fondo redondo de 50 ml mediante el uso de una membrana de filtro de nailon de 75 pm.
Nota: La membrana del filtro de nailon debe sumergirse en etanol al 75 % (porcentaje en volumen), lavarse con agua y luego remojarse en W5 durante 2 minutos antes de su uso.
3) 23°C, centrifugar 150 g por 3min, y se descartó el sobrenadante.
4) el sedimento se suspendió con 10 ml de W5, se centrifugó a 150g por 3min y se descartó el sobrenadante. 5) los protoplastos se suspendieron al adicionar una cantidad adecuada de solución de MMG, se colocaron en hielo hasta la transformación.
Nota: La concentración de los protoplastos debe determinarse por microscopía (x 100). La cantidad de protoplastos fue de 2*105/ml a 1*106/ml.
3. Transformación del protoplasto de maíz
1) Se adicionaron 10 μg del vector pJIT163-2NLSCas9 y 10 μg del plásmido pZmU3-ARNg-C1 a un tubo de centrífuga de 2 ml. Se adicionaron 200 pl del protoplasto mediante el uso de una pipeta y luego se mezcló con suaves palmaditas, se mantuvo quieto durante 3-5 min. Luego se adicionaron 220 pl de solución de PEG4000 y se mezclaron con suaves palmaditas. La transformación se realizó en la oscuridad durante 15 min;
2) Se adicionaron 880 pl de W5 (temperatura ambiente) y se mezclaron por inversión, se centrifugó a 100 g durante 3 min y se descartó el sobrenadante;
3) Se adicionó 1 ml de solución WI y se mezcló por inversión, el contenido se transfirió suavemente a una placa de 6 pocillos (con 1 ml de solución W i adicionado previamente) y luego se cultivó a 23 °C durante toda la noche. IV. Uso de experimentos de PCR/RE para analizar la mutagénesis del gen endógeno del maíz ZmIPK mediante el uso del sistema ARNg:Cas9
48 horas después de la transformación del protoplasto de maíz, se extrajo el ADN del genoma, que se usó como plantilla para el análisis del experimento de Pc R/Re (reacción en cadena de la polimerasa/digestión por restricción). Al mismo tiempo, los protoplastos de la variedad de maíz de tipo salvaje Hi II se usaron como control. El método de análisis de PCR/RE se basa enShan, Q. y otros. Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs. Molecular Plant (2013). Dado que el fragmento diana (posiciones 393-415 de Genbank Núm. AY172635) del gen endógeno del maíz ZmIPK (Genbank No. AY172635) contiene la secuencia de reconocimiento (5'-GAGCTC-3') de la endonucleasa de restricción SacI y, por lo tanto, la endonucleasa de restricción SacI se usó en el experimento para realizar la prueba de PCR/RE. Los cebadores usados en la amplificación por PCR fueron: ZmIPK-1F: 5'-TCCGACGCCCCTGGCAGAGCAA-3';
ZmIPK-1R: 5'- GAGACCTGGGAGAAGGAGACGGATCC-3'.
Los resultados de los experimentos de PCR/RE se pueden ver en la figura 1, y los resultados mostraron que: ocurrieron mutaciones en el sitio diana del gen ZmIPK, las bandas sin cortar se recuperaron y secuenciaron, y los resultados de la secuenciación mostraron que la inserción/deleción (indel) ocurrió en el sitio diana del gen ZmIPK. V. Edición dirigida al sitio del gen endógeno de maíz ZmIPK a través del enfoque del tubo polínico
Los péptidos de penetración celular (CPP) son una clase de péptidos cortos que pueden transportar macromoléculas (incluidas proteínas y ácidos nucleicos) a las células. Un estudio reciente muestra que los péptidos que penetran en las células, cuando se unen al ADN, pueden proteger el ADN contra la degradación enzimática. Por lo tanto, los péptidos que penetran en las células se usan comúnmente en el enfoque del tubo polínico para mejorar la eficiencia.
1) Preparación de la solución de ADN que contiene CPP: se formularon CPP en polvo sólido (secuencia de aminoácidos: RKKRRQRRRRICICRRQRRR, sintetizada por Shanghai Bio-engineering Co., Ltd.) en una solución madre de 30 mg/ml con agua estéril. Se agregaron los CPP a una mezcla de plásmido pZmU3-ARNg-Cl y plásmido pJIT163-Ubi-Cas9 (la relación en peso de pZmU3-ARNg-Cl y pJIT163-Ubi-Cas9 en la mezcla es 1:1) en una relación en peso de 1:1, de manera que las concentraciones finales de ADN y CPP sean 25-30 μg/ml (la concentración final de la suma de los dos plásmidos es 25-30 μg/ml, la concentración final de CPP es 25-30 μg/ml).
2) Se seleccionaron plantas de maíz fuertes (HUI, B73 y Zheng 58) en el campo como materiales receptores. Después de la floración, los estigmas de estas plantas se embolsaron para evitar la fecundación cruzada o la autofecundación. La polinización manual se realizó en el momento adecuado. 18-21 h después de la polinización, se retiraron las bolsas y se cortaron los filamentos y las brácteas, con una longitud de 2-3 cm desde la parte superior de la mazorca retenida. La sección de corte de los filamentos es ligeramente más baja que la de las brácteas, lo que forma una pequeña ranura entre los filamentos y las brácteas, en el que se gotearon rápidamente con una pipeta 300-400 ul de solución de ADN de la etapa 1). Los filamentos se sumergieron en solución de ADN y los estigmas se embolsaron de nuevo. Cada experimento se llevó a cabo en 40-50 mazorcas de maíz. Una vez que los granos maduraron, las mazorcas de maíz se cosecharon y secaron individualmente. 3) Se cultivaron las semillas secas, y los genes mutantes de ZmIPK se detectaron con el método de PCR/RE (las etapas específicas y los cebadores usados se pueden ver en IV) después de la germinación.
Los mutantes se obtuvieron mediante el método del tubo polínico para plantas de maíz de diferentes genotipos. Los resultados de detección de algunos mutantes se muestran en las figuras 2-4, lo que indica que ocurrieron mutaciones dentro del sitio objetivo del gen ZmIPK en varias variedades de maíz. Las bandas sin cortar se recuperaron y secuenciaron, y los resultados de la secuenciación mostraron que la inserción/deleción (indel) ocurrió en el sitio diana del gen ZmIPK. Puede verse que los mutantes pueden obtenerse a nivel de la planta completa a través del enfoque del tubo polínico como se proporciona en la presente invención, que es independiente del genotipo o del receptor.
VI. Edición dirigida al sitio del gen endógeno del maíz ZmIPK a través del enfoque de regeneración del ápice del brote
1. Preparación de los materiales de maíz
1) Las semillas de maíz de la línea pura Hill se colocaron en un matraz triangular, se esterilizaron con alcohol al 70 % (v/v) durante 5 min y con hipoclorito sódico al 5 % (v/v) durante 30 min, luego se lavaron con agua estéril 5 veces. Se adicionaron 1,5 volúmenes de agua y el matraz se selló y se incubó a 28 °C durante 4-6 h.
2) Segunda esterilización. Las semillas se esterilizaron con hipoclorito sódico al 5 % (v/v) durante 30 min y luego se lavaron en agua estéril 5 veces.
3) Las semillas esterilizadas se colocaron en una placa esterilizada con papel filtro, se incubaron a 28 °C en oscuridad durante 3-4 días para la germinación. Las semillas germinadas con cultivo sincrónico se transfirieron a medio MS y se cultivaron a 28 °C en la oscuridad durante 3-4 días hasta que las plántulas alcanzaron los 4-5 cm.
2. Regeneración del ápice de brotes de maíz
1) Cortar los cogollos: el tallo se cortó transversalmente a 1,5-2 mm por encima de las juntas, lo que deja al descubierto el cogollo dentro del tallo. Luego, la yema se cortó por la mitad longitudinalmente hasta 0,2 mm por debajo de las juntas (o simplemente a través de las juntas). Se retuvo alrededor de 0,8 mm de raíz.
2) El plásmido pBUE411-C1 que contenía C1 se transformó en una célula AGL1 competente de Agrobacterium. Después de la verificación por PCR y digestión de restricción, se usó la cepa positiva para infectar las plantas. 3) La cepa positiva se sembró en medio sólido LB, se cultivó a 28 °C en la oscuridad durante 2 días. Se rasparon algunas bacterias en 20 ml de medio líquido MS, se cultivaron a 28 °C a aproximadamente la OD600=0,8. Luego se adicionó acetosiringona 200 pM.
4) Las plantas cortadas se colocaron en una placa, con las incisiones hacia abajo. La placa se colocó de forma inclinada (30-45 °C) en un dispositivo de vacío; se adicionó solución de Agrobacterium para sumergir las
incisiones y permitir una infección de 20 min. Durante la infección se fijó la evacuación durante 10 min, con una presión de 0,05 MP.
5) Después de la infección, las plantas se extrajeron de la solución de Agrobacterium (el exceso de solución de Agrobacterium de las plantas se eliminó mediante el uso de papel de filtro) y se insertaron en medio MS, se cultivaron a 23 °C en la oscuridad durante 3 días.
6) Después del cocultivo, los materiales se sacaron y lavaron para eliminar el medio y luego se cultivaron en una maceta (4/5 de suelo común, 1/5 de vermiculita en la parte superior). Después del trasplante, las plántulas se cultivaron a 28 °C en la oscuridad durante 2 días y luego de 7-10 días en la luz, y luego se cultivaron en condiciones normales hasta la fructificación. Las semillas de maíz obtenidas se cultivaron y probaron para la mutación del gen ZmIPK a través del método de PCR/RE después de la germinación.
Los resultados indican que ocurrieron mutaciones en el sitio diana del gen ZmIPK. Las bandas sin cortar se recuperaron para la secuenciación. Los resultados de secuenciación indican que la inserción/deleción (indel) ocurrió en el gen ZmIPK.
VII. Determinación de si pZmU3-ARNg-C1 y pJIT163-Ubi-Cas9 están presentes en los mutantes de maíz obtenidos a través del enfoque del tubo polínico
Se diseñaron dos conjuntos de cebadores de acuerdo con las secuencias del plásmido pZmU3-ARNg-C1 y el plásmido pJIT163-Ubi-Cas9, para amplificar los dos plásmidos respectivamente.
ZmU3-HC1R ubicado entre ZmU3 y el fragmento diana:
ZmU3-F: 5'-CTGCCAAGATCAACAGCAACCA-3';
C1R: 5'- AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC -3'.
En teoría, el fragmento amplificado debería tener aproximadamente 322 pb y la secuencia debería estar en las posiciones 467-788 de SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:1 es la secuencia de pZmU3-ARNg-C1.
Cas9-1H Cas9-1R ubicado en el vector pJIT163-Ubi-Cas9:
Cas9-1F: 5'-CTTCCCAAGCATTCCCTCCTGT-3';
Cas9-1R: 5'-CTTATGCCGTCCCATGACCTTC-3'.
En teoría, el fragmento amplificado debería tener aproximadamente 744 pb y la secuencia debería estar en las posiciones 1573-2316 de SEQ ID NO:2. SEQ ID NO:2 es la secuencia de Cas9 en pJIT163-Ubi-Cas9.
No se amplificaron bandas diana para todas las plantas (Figura 5), lo que indica que la presente invención evita la inserción o el transporte de un transgén cuando se realiza una modificación dirigida al sitio en una planta, y el mutante obtenido tiene una bioseguridad relativamente alta.
VIII. Determinación de si pBUE411-C1 está presente en los mutantes de maíz obtenidos a través del enfoque de regeneración del ápice del brote
Se diseñaron dos conjuntos de cebadores de acuerdo con la secuencia del plásmido pBUE411-C1, para amplificar OsU3p y Cas9 respectivamente.
pBUE411-1HC1R se localiza entre OsU3p y el fragmento diana:
pBUE411-1F: 5'-GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC-3';
C1R: 5'-AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'.
En teoría, el fragmento amplificado debería tener aproximadamente 289 pb y la secuencia debería estar en las posiciones 174-462 de SEQ ID NO:3. SEQ ID NO:3 es la secuencia de ARNg de pBUE411-Cl.
CAS9-2H CAS9-2R se localiza en la región Cas9 en el vector pBUE411-Cl:
CAS9-2F: 5'-CTCCCTAAGCACTCGCTCCTGT-3';
CAS9-2R: 5'-TTCTGCGTGGTCTGATTCTCCC -3'.
En teoría, el fragmento amplificado debería tener aproximadamente 794 pb y la secuencia debería estar en las posiciones 1639-2432 de la SEQ ID NO:4. SEQ ID nO:4 es la secuencia Cas9 de pHSN411-Cl.
No se amplificaron las bandas diana para todas las plantas, lo que indica que la presente invención evita la inserción o el transporte de un transgén cuando se realiza una modificación dirigida al sitio en una planta, y el mutante obtenido tiene una bioseguridad relativamente alta.
Ejemplo 2. Edición dirigida al sitio del gen endógeno de Arabidopsis AtPTPA a través del enfoque de inmersión de la inflorescencia
I. Diseño del fragmento diana: diana-C2
Diana-C2: 5'-CCGACGATATCCGCCGATTTCAC-3'; (posición 351-373 del gen AtPTPA como se muestra en Genbank Núm. AF360133).
II. Preparación del plásmido pHSN401 que contiene el fragmento C2
C2 es la secuencia de ADN para el ARN que se puede unir de manera complementaria a la diana-C2.
Se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos monocatenarios con extremos cohesivos (subrayados):
C2F: 5'-ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3';
C2R: 5'-AAACACGATATCCGCCGATTTCAC-3'.
El ADN de doble cadena con extremos cohesivos se formó a través de hibridación de oligonucleótidos y se insertó entre los dos sitios de restricción BsaI en el plásmido pHSN401, lo que resultó en un plásmido pHSN401 que contenía el sitio C2. El plásmido positivo se verificó mediante secuenciación. Un plásmido recombinante, que se obtuvo mediante la inserción del fragmento de ADN como se muestra en 5'-ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3' en dirección directa en el sitio de restricción BsaI del plásmido pHSN401, fue positivo y se designó como pHSN401-C2.
III. Suministro del sistema ARNg:Cas9 en el protoplasto de Arabidopsis
El plásmido pHSN401-C2 obtenido en la etapa II se introdujo en los protoplastos de Arabidopsis ecotipo Columbia. El proceso específico incluye:
1. Cultivo de plántulas de Arabidopsis
1) Tratamiento de semillas: Semillas de Arabidopsis ecotipo Columbia se colocaron en un tubo de 1,5 ml y se remojaron en alcohol al 75 % (v/v) durante 1 min e hipoclorito sódico al 10 % (v/v) durante 15 min, luego se lavaron en agua estéril durante 5-6 veces.
2) Las semillas esterilizadas se sembraron individualmente en medio MS con una micropipeta. Las placas se sellaron y se colocaron a 4 °C, 3-4 días para la vernalización.
3) Después de la vernalización, las placas se transfirieron a una incubadora, se cultivaron en las siguientes condiciones: 25±2 °C, iluminancia 5500±300 Lx, 12h luz/día. Después de 3 semanas de cultivo, se trasplantaron las plántulas.
4) Las plántulas se trasplantaron al suelo (suelo de turba: vermiculita: perlita = 1:1:1) cuidadosamente, se cubrieron con una película durante 3-4 días y luego se cultivaron a 21 °C, 6300±300 Lx.
2. Aislamiento de protoplasto
1) Se tomaron hojas tiernas de Arabidopsis ecotipo Columbia (cultivadas durante aproximadamente 1 mes) y se cortaron en hilos de 0,5 mm mediante el uso de una cuchilla de corte, se colocaron en 50 ml de solución enzimólisis durante 5 h de digestión (0,5 h enzimólisis al vacío, luego 4,5 h de agitación lenta a 10 rpm).
Nota: La temperatura durante la enzimólisis debe mantenerse entre 20-25 °C, la reacción debe realizarse en la oscuridad; y la solución debe agitarse suavemente después de la reacción para liberar los protoplastos.
2) el producto de la enzimólisis se diluyó al adicionar 30 ml de W5 y se filtró en un tubo de centrífuga de fondo redondo de 50 ml mediante el uso de una membrana de filtro de nailon de 75 pm.
Nota: La membrana del filtro de nailon debe sumergirse en etanol al 75 % (porcentaje en volumen), lavarse con agua y luego remojarse en W5 durante 2 minutos antes de su uso.
3) 23 °C, centrifugación de 60 g por 5 min, y se descartó el sobrenadante.
4) el sedimento se resuspendió con 10 ml de W5 mediante agitación suave; se centrifugó a 60 g durante 5 min y se descartó el sobrenadante.
5) los protoplastos se suspendieron al adicionar una cantidad adecuada de solución de MMG, se colocaron en hielo hasta la transformación.
Nota: La concentración de los protoplastos debe determinarse por microscopía (x100). La cantidad de protoplastos fue de 2*105/ml a 1*106/ml.
3. Transformación del protoplasto de Arabidopsis
1) Se adicionaron 20 μg de plásmido pHSN401-C2 a un tubo de centrífuga de 2 ml. Se adicionaron 200 pl del protoplasto obtenido en la etapa 2 anterior mediante el uso de una pipeta y luego se mezcló con suaves
golpecitos. Luego se adicionaron 250 |jl de PEG4000 y se mezclaron con suaves golpecitos. La transformación se realizó en la oscuridad durante 15-30 min;
2) Se adicionaron 880 j l de W5 (temperatura ambiente) y se mezclaron por inversión, se centrifugó a 60 g durante 5 min y se descartó el sobrenadante;
3) Se adicionaron 1 ml de W5 y se mezcló por inversión, el contenido se transfirió suavemente a una placa de 6 pocillos (con 1 ml de W5 adicionado previamente) y luego se cultivó a 23 °C durante toda la noche.
IV. Uso de experimentos de PCR/RE para analizar la mutagénesis dirigida al sitio del gen endógeno de Arabidopsis AtPTPA mediante el uso del sistema ARNg:Cas9
48 horas después de la transformación del protoplasto de Arabidopsis, se extrajo el ADN genómico, que se usó como plantilla para el análisis del experimento de PCR/RE (reacción en cadena de la polimerasa/digestión por restricción). El método de análisis de PCR/RE se basó en Shan, Q. y otros. Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs. Molecular Plant (2013). Dado que el fragmento diana (posiciones 351-373 de Genbank Núm. AF360133) del gen endógeno de Arabidopsis AtPTPA (Genbank Núm. AF360133) contiene la secuencia de reconocimiento (5'-GATATC-3') de la endonucleasa de restricción EcoRV y, por lo tanto, se usó la endonucleasa de restricción EcoRV en el experimento para realizar la prueba de PCR/RE. Los cebadores usados en la amplificación por PCR fueron:
PTPA-F: 5'-GATGCTCCAGCCACCATATC-3';
PTPA-R: 5'- CAGTTCGGTACACCACTTATATCA-3'.
Los resultados de los experimentos de PCR/RE se pueden ver en la figura 6, y los resultados mostraron que: ocurrieron mutaciones en el sitio diana del gen AtPTPA, las bandas sin cortar en la figura 6 se recuperaron y secuenciaron, y los resultados de secuenciación mostraron que la inserción/deleción (indel) ocurrió en el sitio diana del gen AtPTPA.
V. Edición dirigida al sitio del gen endógeno de Arabidopsis AtPTPA a través del enfoque de inmersión de la inflorescencia
1) Preparación de los materiales de Arabidopsis
Los cogollos de Arabidopsis se eliminaron en la primera floración para facilitar la ramificación. Las silicuas se cortaron antes de la transformación por inmersión de la inflorescencia.
2) El plásmido pHSN401-C2 que contenía C2 se transformó en la célula GV3101 competente de Agrobacterium. Después de la verificación por PCR y digestión de restricción, se usó la cepa positiva para infectar las plantas. 3) La cepa de Agrobacterium positiva se cultivó en un tubo de 2 ml durante 8-10 h y luego se transfirió a 200 ml de medio LB (inoculado en una relación de 1:100), se cultivó durante toda la noche hasta una OD600 de aproximadamente 0,8 ~ 1,0. Las células de Agrobacterium se recogieron mediante centrifugación durante 15 min y se resuspendieron en tampón de infección (2,16 g/L de MgCl2-6H2O, 5 % de sacarosa, 0,02 % de silwet L-77) para infectar las plantas.
4) Las inflorescencias de Arabidopsis se sumergieron en 100 ml de tampón de infección contenido en una placa grande durante 2 min, con rotación continua de las plantas. Después de la infección, se eliminó el exceso de solución de Agrobacterium en las plantas mediante el uso de papel de filtro. Las plantas se cubrieron con una bolsa de plástico negra o una película para un cultivo de 24 horas en la oscuridad. Como el período de floración de Arabidopsis es relativamente largo, generalmente requiere 2-3 infecciones.
5) Las plantas se cultivaron en condiciones normales. Las semillas T1 se colectaron y cultivaron. Después de la germinación, el gen AtPTPA se evaluó mediante el uso de PCR/RE (las etapas específicas y los cebadores usados se pueden ver en IV). De las 500 plantas obtenidas, 20 son mutantes del gen AtPTPA. El ecotipo Columbia de Arabidopsis de tipo salvaje se estableció como control.
Los resultados se muestran en la figura 7, y los resultados indicaron que ocurrieron mutaciones en el sitio diana del gen AtPTPA, las bandas sin cortar en la figura 7 se recuperaron y secuenciaron, y los resultados de secuenciación mostraron que la inserción/deleción (indel) ocurrió en el sitio diana del gen AtPTPA.
6) Se realizaron aplicaciones de PCR contra los 20 mutantes obtenidos en 5) para determinar si pHSN401-C2 está presente en los mutantes. Se diseñaron 2 conjuntos de cebadores para la amplificación (diana para U6-26p y Cas9, respectivamente). pHSN401-lHC2R se localizó entre U6-26p y el fragmento diana:
pHSN401-1F: 5'-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3';
C2R: 5'-AAACACGATATCCGCCGATTTCAC-3'.
En teoría, el fragmento amplificado debería tener aproximadamente 286 pb y la secuencia debería estar en las posiciones 170-455 de s Eq ID NO:5. SEQ ID NO:5 es la secuencia parcial de ADNg en pHSN401-C2. CAS9-2H CAS9-2R se localiza en la región Cas9 del vector pHSN401-C2:
CAS9-2F: 5'-CTCCCTAAGCACTCGCTCCTGT-3';
CAS9-2R: 5'- TTCTGCGTGGTCTGATTCTCCC -3'.
En teoría, el fragmento amplificado debería tener aproximadamente 794 pb y la secuencia debería estar en las posiciones 1639-2432 de la SEQ ID NO:4. SEQ ID nO:4 es la secuencia Cas9 en pHSN401-C2.
El electroferograma en gel de la amplificación del gen mutante AtPTPA de Arabidopsis que usa los cebadores pHSN401-1HC2R en pHSN401-C2 se muestra en la figura 8a. El electroferograma en gel de la amplificación del gen mutante AtPTPA de Arabidopsis que usa los cebadores CAS9-2HCAS9-2R en pHSN401-C2 se muestra en la figura 8b. Se puede ver que no se amplificaron bandas diana en los genes mutantes AtPTPA de Arabidopsis obtenidos en 5), lo que indica que no hay ningún fragmento del sistema ADNg:Cas9 presente en los mutantes.
7) Se seleccionaron al azar 9 plantas de la progenie de los 20 mutantes obtenidos en 5) para análisis de PCR/RE y los resultados se muestran en la figura 9. Puede verse que la mutación del gen AtPTPA de Arabidopsis tal como se obtiene se puede transmitir de forma estable a la progenie. Por lo tanto, la presente invención evita la inserción o el transporte de un transgén cuando se realiza una modificación dirigida al sitio en una planta, lo que evita las preocupaciones del público sobre la seguridad del producto transgénico y también evita el proceso de cultivo de tejidos.
Claims (9)
1. Un método para realizar la modificación dirigida al sitio en un fragmento diana de un gen diana en una planta completa, que comprende la etapa de: expresar transitoriamente una nucleasa dirigida al sitio en dicha planta, en donde se usa una planta completa como sujeto para la expresión transitoria, y en donde dicha nucleasa dirigida al sitio se dirige a y escinde dicho fragmento diana, para lograr de esta manera la modificación dirigida al sitio a través de la autorreparación del ADN de dicha planta,
en donde la etapa de expresar transitoriamente la nucleasa dirigida al sitio comprende las siguientes etapas:
a) suministrar la nucleasa dirigida al sitio o un material genético para expresar la nucleasa dirigida al sitio en dicha planta a través de un tubo polínico, inflorescencia, ápice de brote u ovario después de la polinización, y
b) cultivar la planta obtenida en la etapa a) en ausencia de presión de selección, lo que permite la degradación de la nucleasa dirigida al sitio o el material genético no integrado en el cromosoma de la planta, y en donde se omite el cultivo de tejidos;
en donde dicho material genético es un vector recombinante o un fragmento lineal de ADN o un ARN transcrito in vitro.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el suministro de la nucleasa dirigida al sitio es a través de
a) el tubo polínico, el suministro se realiza mediante la inyección de una solución que contiene dicho vector recombinante o fragmento lineal de ADN o ARN transcrito in vitro o una solución que contiene dicha nucleasa dirigida al sitio en el estigma después de la polinización;
b) la inflorescencia, el suministro se realiza al sumergir la inflorescencia en una solución de Agrobacterium tumefaciens que porta dicho vector recombinante o fragmento lineal de ADN;
c) el ápice del brote, el suministro se realiza al sumergir el ápice del brote con una solución de Agrobacterium tumefaciens que porta dicho vector recombinante o fragmento lineal de ADN, y/o
d) el ovario, el suministro se realiza mediante la inyección de una solución que contiene dicho vector recombinante o fragmento lineal de ADN o ARN transcrito in vitro o una solución que contiene dicha nucleasa dirigida al sitio en el ovario después de la polinización, o mediante la inyección de una solución de Agrobacterium tumefaciens que porta dicho vector recombinante o fragmento lineal de ADN en el ovario después de la polinización.
3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque dicha nucleasa dirigida al sitio es una nucleasa CRISPR/Cas9, una nucleasa TALENs, una nucleasa con dedos de zinc o cualquier nucleasa que pueda lograr la edición del genoma, en donde
a) la nucleasa dirigida al sitio es una nucleasa CRISPR/Cas9, y el material genético está compuesto por un vector recombinante o fragmento de ADN capaz de transcribir el ARN guía y expresar la proteína Cas9; o está compuesto por un vector recombinante o fragmento de ADN capaz de transcribir el ARN guía y un vector recombinante o fragmento de ADN o ARN capaz de expresar la proteína Cas9; o está compuesto por un ARN guía y un vector recombinante o fragmento de ADN o ARN capaz de expresar la proteína Cas9; en donde el ARN guía es un ARN con estructura palindrómica que se forma por apareamiento parcial de bases entre crARN y tracrARN; el crARN contiene un fragmento de ARN que puede unirse complementariamente al fragmento diana;
b) la nucleasa dirigida al sitio es una nucleasa TALENs, y el material genético es un vector recombinante o fragmento de ADN o ARN capaz de expresar proteínas TALEN emparejadas, en donde la proteína TALEN está compuesta por un dominio de unión a ADN capaz de reconocer y unirse al sitio diana y un dominio Fok I; o
c) la nucleasa dirigida al sitio es una nucleasa con dedos de zinc, y el material genético es un vector recombinante fragmento de ADN o ARN capaz de expresar proteínas ZFN emparejadas, en donde la proteína ZFN está compuesta por un dominio de unión a ADN capaz de reconocer y unirse al sitio diana, y un dominio Fok I.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la modificación dirigida al sitio es una mutación de inserción, deleción y/o reemplazo en el fragmento diana.
5. Un método para fabricar una planta mutante libre de transgén, que comprende las siguientes etapas:
realizar una modificación dirigida al sitio en un fragmento diana de un gen diana en una planta de interés mediante el uso del método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para obtener una planta en la que se pierden las funciones del gen diana y su genoma está libre de gen exógeno integrado.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicha planta es una planta de cualquier genotipo, preferentemente en donde la planta se selecciona de un grupo que consiste en maíz, trigo, soja, algodón, tabaco, Arabidopsis, centeno, Rosa roxbunghii, Eriobotrya japónica, Carica papaya, Rosa canina, Dendrobium nobile Lindi., Brassica oleracea, Fagopyrum tataricum y Hevea brasiliensis.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la planta es maíz, la nucleasa dirigida al sitio es una nucleasa CRISPR/Cas9 y el gen diana es ZmIPK.
8. El método de la reivindicación 7, en donde el fragmento diana es 5-AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'; el vector recombinante para la transcripción del ARN guía se obtiene mediante la inserción de un fragmento de ADN de 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3' entre los dos sitios de restricción Bbsl del plásmido pZmU3-ARNg; y el vector recombinante para expresar la nucleasa CR1SPR/Cas9 es pJIT163-Ubi-Cas9.
9. El método de la reivindicación 7, en donde el fragmento diana es 5'-AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3', y el vector recombinante para transcribir el ARN guía y expresar la nucleasa CRISPR/Cas9 se obtiene mediante la inserción de un fragmento de ADN de 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3' entre los dos sitios de restricción Bsal del plásmido pBUE411.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510040078 | 2015-01-27 | ||
PCT/CN2016/072352 WO2016119703A1 (zh) | 2015-01-27 | 2016-01-27 | 一种通过基因瞬时表达对整株植物定点改造的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2945315T3 true ES2945315T3 (es) | 2023-06-30 |
Family
ID=56542435
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES16742765T Active ES2945315T3 (es) | 2015-01-27 | 2016-01-27 | Método para realizar modificaciones específicas de sitio en la planta completa a través de la expresión transitoria de genes |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11421241B2 (es) |
EP (2) | EP3252162B1 (es) |
JP (1) | JP2018503392A (es) |
KR (1) | KR102046450B1 (es) |
CN (1) | CN105821073B (es) |
AR (1) | AR103539A1 (es) |
AU (1) | AU2016212529B2 (es) |
BR (1) | BR112017015988B1 (es) |
CA (1) | CA2973903C (es) |
DK (1) | DK3252162T3 (es) |
EA (1) | EA039511B1 (es) |
ES (1) | ES2945315T3 (es) |
WO (1) | WO2016119703A1 (es) |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106834341B (zh) * | 2016-12-30 | 2020-06-16 | 中国农业大学 | 一种基因定点突变载体及其构建方法和应用 |
US11859219B1 (en) | 2016-12-30 | 2024-01-02 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Methods of altering a target nucleotide sequence with an RNA-guided nuclease and a single guide RNA |
JP2020072645A (ja) * | 2017-01-31 | 2020-05-14 | 日本たばこ産業株式会社 | 植物に物質を導入する方法 |
CN107164402B (zh) * | 2017-05-31 | 2020-10-16 | 未名兴旺***作物设计前沿实验室(北京)有限公司 | 一种基于CRISPR-Cas9***的基因编辑载体及其应用 |
CN107287230B (zh) * | 2017-08-03 | 2020-10-13 | 沈阳农业大学 | 一种质粒载体及其构建方法 |
WO2019103034A1 (ja) * | 2017-11-27 | 2019-05-31 | 国立研究開発法人理化学研究所 | ゲノム編集植物の生産方法 |
CN109929872A (zh) * | 2017-12-18 | 2019-06-25 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种通过基因编辑技术创制番茄白果材料的方法 |
CN108374020A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-08-07 | 南京农业大学 | 一种改良的农杆菌介导大豆整体转化方法 |
EP3749767A1 (en) * | 2018-02-05 | 2020-12-16 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies |
CN110408647A (zh) * | 2018-04-28 | 2019-11-05 | 青岛清原化合物有限公司 | 一种生物突变体库的构建方法 |
CN108642078A (zh) * | 2018-05-18 | 2018-10-12 | 江苏省农业科学院 | 基于CRISPR/Cas9基因编辑技术选育绿豆开花传粉突变体的方法及专用gRNA |
CN108866096B (zh) * | 2018-07-26 | 2021-11-16 | 山东农业大学 | 大田蔷薇属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法 |
CN111254159B (zh) * | 2018-11-30 | 2023-03-31 | 东北农业大学 | 一种大豆GmST1基因突变体植株及其制备方法 |
EP4110929A1 (en) * | 2020-02-28 | 2023-01-04 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Immature inflorescence meristem editing |
CN111647620A (zh) * | 2020-06-10 | 2020-09-11 | 北京市农林科学院 | 一种菜薹非转基因突变株的创制方法 |
CN112385539A (zh) * | 2020-11-05 | 2021-02-23 | 贵州师范大学 | 一种果壳不破裂早熟优质黑米荞的选育方法 |
CN112501179B (zh) * | 2020-11-12 | 2022-05-24 | 福建农林大学 | GmPIN1基因突变调控大豆结瘤和密植的方法及其应用 |
CN113717982B (zh) * | 2021-08-30 | 2023-09-01 | 山东大学 | 一种利用基因编辑敲除籽粒发育相关蛋白TaGSR1增加小麦籽粒长度的方法 |
CN113846075A (zh) * | 2021-11-29 | 2021-12-28 | 科稷达隆(北京)生物技术有限公司 | Mad7-nls融合蛋白、用于植物基因组定点编辑的核酸构建物及其应用 |
Family Cites Families (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1288073C (en) | 1985-03-07 | 1991-08-27 | Paul G. Ahlquist | Rna transformation vector |
US5736369A (en) | 1994-07-29 | 1998-04-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Method for producing transgenic cereal plants |
US6051409A (en) | 1995-09-25 | 2000-04-18 | Novartis Finance Corporation | Method for achieving integration of exogenous DNA delivered by non-biological means to plant cells |
DE69831265T2 (de) | 1997-11-18 | 2006-06-08 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Zusammensetzungen und verfahren für die genetische modifikation von pflanzen |
CA2365590A1 (en) | 1999-04-29 | 2000-11-09 | Zeneca Limited | Herbicide resistant plants |
US6603061B1 (en) | 1999-07-29 | 2003-08-05 | Monsanto Company | Agrobacterium-mediated plant transformation method |
WO2002026995A1 (en) | 2000-09-29 | 2002-04-04 | Syngenta Limited | Herbicide resistant plants |
US20030135891A1 (en) | 2001-12-04 | 2003-07-17 | The Texas A&M University System | Method of transforming intact plants |
EP1551966B1 (en) | 2002-07-18 | 2013-06-05 | Monsanto Technology LLC | Methods for using artificial polynucleotides and compositions thereof to reduce transgene silencing |
CN101878307B (zh) | 2007-09-27 | 2017-07-28 | 陶氏益农公司 | 以5‑烯醇式丙酮酰莽草酸‑3‑磷酸合酶基因为靶的改造锌指蛋白 |
JP2011120478A (ja) | 2008-03-31 | 2011-06-23 | Japan Tobacco Inc | アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法 |
BR112013024337A2 (pt) | 2011-03-23 | 2017-09-26 | Du Pont | locus de traço transgênico complexo em uma planta, planta ou semente, método para produzir em uma planta um locus de traço transgênico complexo e construto de expressão |
WO2013096567A2 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | Duke University | The hsf-like transcription factor, tbf1, is a major molecular switch for growth-to-defense transition in plants |
CN102558309B (zh) | 2012-02-10 | 2014-09-17 | 浙江大学 | 一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用 |
US9637739B2 (en) | 2012-03-20 | 2017-05-02 | Vilnius University | RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex |
CN104428414B (zh) | 2012-05-02 | 2022-01-21 | 陶氏益农公司 | 苹果酸脱氢酶的靶向修饰 |
CN104471067B (zh) | 2012-05-07 | 2020-08-14 | 桑格摩生物治疗股份有限公司 | 用于核酸酶介导的转基因靶向整合的方法和组合物 |
PT2800811T (pt) | 2012-05-25 | 2017-08-17 | Univ California | Métodos e composições para modificação de adn alvo dirigida por arn e para modulação dirigida por arn de transcrição |
US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
EP2970997A1 (en) | 2013-03-15 | 2016-01-20 | Regents of the University of Minnesota | Engineering plant genomes using crispr/cas systems |
US20150067922A1 (en) | 2013-05-30 | 2015-03-05 | The Penn State Research Foundation | Gene targeting and genetic modification of plants via rna-guided genome editing |
AU2014279694B2 (en) | 2013-06-14 | 2020-07-23 | Cellectis | Methods for non-transgenic genome editing in plants |
CN103343120B (zh) | 2013-07-04 | 2015-03-04 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种小麦基因组定点改造方法 |
CN103382468B (zh) | 2013-07-04 | 2015-04-29 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种水稻基因组定点改造方法 |
CN103555711A (zh) | 2013-07-22 | 2014-02-05 | 安徽省农业科学院水稻研究所 | 一种主要农作物非转基因的基因组定向分子改良方法和应用 |
CN105829536A (zh) | 2013-08-22 | 2016-08-03 | 纳幕尔杜邦公司 | 用于在不掺入选择性转基因标记的情况下,在植物基因组中产生基因修饰的方法,以及用于这种方法的组合物 |
CN105683357B (zh) | 2013-11-04 | 2020-10-30 | 美国陶氏益农公司 | 用于基因打靶的通用供体*** |
US10787684B2 (en) | 2013-11-19 | 2020-09-29 | President And Fellows Of Harvard College | Large gene excision and insertion |
CN103667338B (zh) | 2013-11-28 | 2016-01-27 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种玉米基因组定点改造方法 |
KR20180015731A (ko) | 2014-08-06 | 2018-02-13 | 주식회사 툴젠 | 캄필로박터 제주니 crispr/cas 시스템 유래 rgen을 이용한 유전체 교정 |
KR20170081268A (ko) | 2014-11-27 | 2017-07-11 | 단지거 이노베이션즈 엘티디. | 게놈 편집용 핵산 구조체 |
DE102015004187A1 (de) | 2015-04-02 | 2016-10-06 | Kws Saat Se | Männlich sterile Pflanze der Gattung Triticum |
CN106811479B (zh) | 2015-11-30 | 2019-10-25 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 利用CRISPR/Cas9***定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的***及其应用 |
-
2016
- 2016-01-27 US US15/546,481 patent/US11421241B2/en active Active
- 2016-01-27 EP EP16742765.7A patent/EP3252162B1/en active Active
- 2016-01-27 WO PCT/CN2016/072352 patent/WO2016119703A1/zh active Application Filing
- 2016-01-27 JP JP2017540758A patent/JP2018503392A/ja active Pending
- 2016-01-27 ES ES16742765T patent/ES2945315T3/es active Active
- 2016-01-27 EP EP23157476.5A patent/EP4219730A1/en active Pending
- 2016-01-27 CN CN201610055436.XA patent/CN105821073B/zh active Active
- 2016-01-27 AR ARP160100227A patent/AR103539A1/es unknown
- 2016-01-27 EA EA201791681A patent/EA039511B1/ru unknown
- 2016-01-27 CA CA2973903A patent/CA2973903C/en active Active
- 2016-01-27 BR BR112017015988-0A patent/BR112017015988B1/pt active IP Right Grant
- 2016-01-27 DK DK16742765.7T patent/DK3252162T3/da active
- 2016-01-27 AU AU2016212529A patent/AU2016212529B2/en not_active Ceased
- 2016-01-27 KR KR1020177022452A patent/KR102046450B1/ko active IP Right Grant
-
2022
- 2022-08-19 US US17/820,930 patent/US20220411810A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AR103539A1 (es) | 2017-05-17 |
US11421241B2 (en) | 2022-08-23 |
CN105821073B (zh) | 2021-08-10 |
US20220411810A1 (en) | 2022-12-29 |
DK3252162T3 (da) | 2023-06-06 |
AU2016212529B2 (en) | 2018-11-01 |
CA2973903A1 (en) | 2016-08-04 |
EA039511B1 (ru) | 2022-02-04 |
EA201791681A1 (ru) | 2018-03-30 |
KR20170098953A (ko) | 2017-08-30 |
BR112017015988A2 (pt) | 2018-03-20 |
EP3252162A1 (en) | 2017-12-06 |
CA2973903C (en) | 2024-03-12 |
JP2018503392A (ja) | 2018-02-08 |
EP3252162A4 (en) | 2018-02-21 |
BR112017015988B1 (pt) | 2024-02-27 |
KR102046450B1 (ko) | 2019-11-19 |
WO2016119703A1 (zh) | 2016-08-04 |
EP3252162B1 (en) | 2023-03-01 |
EP4219730A1 (en) | 2023-08-02 |
AU2016212529A1 (en) | 2017-08-03 |
US20180016589A1 (en) | 2018-01-18 |
CN105821073A (zh) | 2016-08-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2945315T3 (es) | Método para realizar modificaciones específicas de sitio en la planta completa a través de la expresión transitoria de genes | |
ES2539110T3 (es) | Evento de maíz MIR604 | |
ES2590177T3 (es) | Acontecimiento de planta de maíz MON87460 y composiciones y procedimientos para la detección del mismo | |
CN109153988B (zh) | 植物的基因组编辑方法 | |
JP6967217B2 (ja) | 形質転換植物の作製方法 | |
WO2022233271A1 (en) | Method for generating new gene in organism and use thereof | |
WO2019219046A1 (zh) | 一种快速高效获得非转基因的定向基因突变植物的方法和应用 | |
ES2750530T3 (es) | Medios y procedimientos para producir rendimiento en plantas | |
CN116390644A (zh) | 通过基因组编辑产生具有改进的转基因基因座的植物 | |
BR112021009416A2 (pt) | sequências de ácido nucleico para detecção de planta de soja dbn8002 e métodos de detecção das mesmas | |
US20240011042A1 (en) | Excisable plant transgenic loci with signature protospacer adjacent motifs or signature guide rna recognition sites | |
CN102286511B (zh) | 一种用于有性繁殖植物外源基因生物安全控制的基因自动删除双元***及其相关植物表达载体 | |
CN103409445A (zh) | 抗草甘膦基因mtp-smg2-epsps及其在培育抗草甘膦玉米中的应用 | |
Nguyen et al. | An efficient root transformation system for recalcitrant Vicia sativa | |
CN113151258B (zh) | 一种抗虫转基因玉米am63***位点的外源***片段的旁侧序列及其应用 | |
Okeyo-Ikawa et al. | In planta seed transformation of Kenyan cowpeas (Vigna unguiculata) with P5CS gene via Agrobacterium tumefaciens. | |
WO2021137299A1 (ja) | 植物の改変方法 | |
ES2371645T3 (es) | Promotores específicos del polen de rigrás y las construcciones de expresión. | |
US20230265445A1 (en) | Removable plant transgenic loci with cognate guide rna recognition sites | |
WO2024065009A1 (en) | Methods of plant manipulation | |
Qurashi et al. | Improvement of ornamental plants through CRISPR-Cas | |
Suna et al. | Red fluorescent protein (DsRed2), an ideal reporter for cotton genetic transformation and molecular breeding | |
EP4172342A2 (en) | Removable plant transgenic loci with cognate guide rna recognition sites | |
CN116529370A (zh) | 具有特征性原间隔子相邻基序或特征性指导rna识别位点的可切除植物转基因基因座 | |
CN116367714A (zh) | 具有经修饰的转基因基因座的转基因作物植物的基因组编辑 |