CN108374020A - 一种改良的农杆菌介导大豆整体转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改良的农杆菌介导大豆整体转化方法，是将含有外源DNA的质粒导入根癌农杆菌中，得到重组农杆菌，将所得到的重组农杆菌用如下溶液进行悬浮后，通过自制的工具，在大豆开花的当天下午3～4点对大豆的子房壁进行针扎和注射处理，进行遗传转化:溶剂为水，溶质是非离子表面活性剂Sillwet L‑77，蔗糖和乙酰丁香酮；其中，Sillwet L‑77的体积百分比浓度为0.1％‑0.3％，蔗糖的质量百分比浓度为5％，乙酰丁香酮的质量百分比浓度为0.003％。利用本方法将一个大豆热激蛋白90合成相关的基因导入大豆植株中，获得转基因大豆植株。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种改良的农杆菌介导大豆整体转化方法。
背景技术
1988年由Hinchee报道大豆转基因植株的获得开始，大豆转基因技术以其定向改造和育种年限短等优点，开始发展成为一种重要的大豆育种手段。大豆转基因中常用 的转基因方法是农杆菌介导法，基因枪法和花粉管通道法，其它转化方法应用得较少。
农杆菌介导法是运用较广泛的一种大豆转化方法，其优点是操作简单、研究费用较低，转基因植株通常以单拷贝或低拷贝形式存在，后代遗传表现较稳定。但其缺点 是转化频率较低，无论是植株的再生还是转化的过程都有较强的基因型依赖性，受限 制因素较多。
基因枪法也是运用较广泛的一种遗传转化方法，其优点是受体材料的影响较小，不受受体基因型和轰击靶组织的限制，转化效率相对高，操作简便，可控度高。但也 具有一定的缺点，比如研究费用较昂贵、转化率偏低，转化过程中经常发生重排和高 拷贝***现象，容易导致外源基因的失活和后代遗传规律紊乱，使后期筛选能够表达 目的基因转基因植株比较困难，在植物基因组中拷贝数高，易引起基因沉默。
花粉管通道法摆脱了受体再生条件的限制，转化过程完成后能直接获得转基因受体的种子，减少了时间周期，但因为其转化效率极低，操作要求高，而且有转化目标 混乱等问题，所以应用较少。
因此，寻找一种能在大田条件下规模化进行转化大豆工作，且操作要求低转化效率高的转化方法尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种改良的农杆菌介导大豆整体转化方法。
一种改良的农杆菌介导大豆整体转化方法，其特征在于具体包括如下步骤：
选取携带目的基因的根癌农杆菌培养至OD600值在0.8-1.2，离心后去上清液,加入与弃去的上清液等体积的溶液A,混匀得农杆菌转化液；选取大豆开花的当天下午3～4点对大豆的子房壁进行注射农杆菌转化液处理，操作完成后加套塑料袋保湿，维持至次 日凌晨5:00～6:00；其中,所述的溶液A以水为溶剂，溶质为非离子表面活性剂Sillwet L-77，蔗糖和乙酰丁香酮；其中，Sillwet L-77的体积百分比浓度为0.1％-0.3％，蔗 糖的质量百分比浓度为3％-5％，乙酰丁香酮的质量百分比浓度为0.001-0.004％，乙酰 丁香酮用适量二甲基亚砜溶解。
本发明方法适用于所有大豆品种所述的大豆品种优选Williams 82、南农88-31、猴子毛。
所述的注射农杆菌转化液采用注射器注射或采用以下自制注射工具处理；自制注射工具是将市售胶头吸管，吸水处通过火烧等加热方法，将管口直径控制在0.5毫米 之内，其结构基本是一端是市售的胶头滴管，一端是直径小于0.5毫米的注射口，中 间长度不限。
所述的溶液A优选以水为溶剂，溶质为非离子表面活性剂Sillwet L-77，蔗糖和乙酰丁香酮；其中，Sillwet L-77的体积百分比浓度为0.1％-0.3％，蔗糖的质量百分 比浓度为5％，乙酰丁香酮的质量百分比浓度为0.003％，乙酰丁香酮用适量二甲基亚砜 溶解。
有益效果
本发明与现有技术相比，具有如下优点和积极效果：
1.整个转化过程在大田条件下可完成，可规模化进行转化实验。
2.转化过程脱离了组织培养的限制，可缩短实验时间3-5个月。
3.直接以受精卵为侵染目标，能直接获得转基因T1代种子或嵌合体转基因种子。
4.通过自制工具直接将农杆菌注射进入子房壁，能有效增加农杆菌侵染受精卵的效率。
5.实验操作简便，难度低。
附图说明
图1为大豆花器官子房壁针扎和注射位置示意图
图2为自制农杆菌注射用工具
图3为质粒pCambia3301:GmHSP90A2图谱
图4为转基因大豆T1代bar喷洒筛选结果
图5转基因大豆T2代Bar试纸条检测结果
图6为转基因大豆T1代Bar抗性植株PCR检测(M：标准分子量；1：阴性对照；2：阳性 对照；3～8:Bar抗性植株)
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1
(1)大豆种植
大豆品种Williams 82，与六月中旬种植于转基因试验区大田中，以每两行隔一行的方法种植，当年8月中旬进入盛花期，开始用作试验受体。
(2)农杆菌培养
pCambia3301:GmHSP90A2质粒图谱见图3，以pCambia3301为出发质粒,该质粒T-DNA 上带有目的基因，Bar筛选基因,其中目的基因GmHSP90A2(SEQ ID NO.1)位于酶切位点是BamH1和Xba1之间。根癌农杆菌菌株为EHA105。将保存于-80℃的含有pCambia3301质 粒的EHA105菌株进行活化，划线培养在含50mg/L抗生素利福平和50mg/L卡那霉素的YEB 固体平板上，28℃下培养2d，然后挑取单菌落于无菌的1.5ml离心管中(离心管中加入 1ml含50mg/L抗生素利福平和50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基)震荡培养1d，28℃， 200rpm。而后进行PCR检测，选取PCR阳性的菌液作为母液。
配制YEB液体培养基，加入50mg/L抗生素利福平，50mg/L卡那霉素和1ml/L母液，震荡 培养1d，28℃，200rpm，直到OD600的值为1.0。4000rpm离心10min，去上清，加入等量 的农杆菌转化液(溶剂为水，溶质是非离子表面活性剂Sillwet L-77，蔗糖和乙酰丁 香酮；其中，Sillwet L-77的体积百分比浓度为0.2％，蔗糖的质量百分比浓度为5％， 乙酰丁香酮的质量百分比浓度为0.003％，乙酰丁香酮用适量二甲基亚砜溶解。)
(3)选择下午3～4点钟左右的时间，将配置好的农杆菌转化液，通过自制工具(图2) 刺入大豆子房壁(图1)，注射农杆菌进行侵染。
(4)浸染操作完成后加套塑料袋保湿，维持至次日凌晨去袋。待种子成熟后，收获晒 干，即得T1代种子。
(4)转基因植株的筛选，将获得的T1代种子10000粒以上播种于大棚内，在幼苗期喷 施除草剂Basta，每隔5天喷施一次，连续喷6次，在完成最后喷施的30天后统计存活植株共计39株，收取叶片提取DNA，进行转基因PCR检测，发现阳性植株17株(图5)。本 发明的大豆转化效率为0.17％左右。后代植株Bar试纸条检测结果证实遗传转化事件成 功(图4)，获得了可遗传的转基因植株。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种改良的农杆菌介导大豆整体转化方法
<150> 2017114590192
<151> 2017-12-28
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2097
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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gatatgcccc cattggaaga ggacggtgct gaggagagca agatggagga agtggac 2097
Claims (4)
1.一种改良的农杆菌介导大豆整体转化方法，其特征在于具体包括如下步骤：
选取携带目的基因的根癌农杆菌培养至OD600值在0.8-1.2，离心后去上清液,加入与上清液等体积的溶液A,混匀得农杆菌转化液；选取大豆开花的当天下午3～4点对大豆的子房壁进行注射农杆菌转化液处理，操作完成后加套塑料袋保湿，维持至次日凌晨5:00～6:00；其中,所述的溶液A以水为溶剂，溶质为非离子表面活性剂Sillwet L-77，蔗糖和乙酰丁香酮；其中，Sillwet L-77的体积百分比浓度为0.1％-0.3％，蔗糖的质量百分比浓度为3％-5％，乙酰丁香酮的质量百分比浓度为0.001-0.004％，乙酰丁香酮用适量二甲基亚砜溶解。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述的大豆品种为Williams 82、南农88-31、猴子毛。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于所述的注射农杆菌转化液采用注射器注射或采用自制注射工具处理；所述的自制注射工具是将市售胶头吸管，吸水处通过火烧等加热方法，将管口直径控制在0.5毫米之内，其结构基本是一端是市售的胶头滴管，一端是直径小于0.5毫米的注射口，中间长度不限。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于所述的溶液A以水为溶剂，溶质为非离子表面活性剂Sillwet L-77，蔗糖和乙酰丁香酮；其中，Sillwet L-77的体积百分比浓度为0.1％-0.3％，蔗糖的质量百分比浓度为5％，乙酰丁香酮的质量百分比浓度为0.003％，乙酰丁香酮用适量二甲基亚砜溶解。
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