KR20170098953A - 일시적인 유전자 발현을 통해 완전한 식물에서 부위-특이적인 변형을 수행하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 식물에서 타겟 유전자 단편과 별개의 뉴클레아제를 일시적으로 발현하는 완전한 식물을 일시적인 발현 대상으로서 입수하는 단계; 뉴클레아제의 작동 하에, 타겟 단편을 절단하는 단계; 및 식물의 DNA 복구를 통해 타겟 단편의 부위-특이적인 변형을 수행하는 단계를 포함하는, 유전자의 일시적인 발현을 통해 완전한 식물에서 타겟 유전자 단편에 부위-특이적인 변형을 수행하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기한 방법에 의해 비-형질전환성 돌연변이 식물을 제조하는 방법을 제공하며, 이로써 비-형질전환성 돌연변이 식물이 제공된다.

Description

일시적인 유전자 발현을 통해 완전한 식물에서 부위-특이적인 변형을 수행하는 방법
본 발명은 식물 유전자 조작 분야에 속하며, 일시적인 유전자 발현을 통해 완전한 식물 (whole plant)을 부위-특이적으로 변형시키는 방법에 관한 것이다.
유전자도입 (transgenesis)은 분자생물학을 통해 특정 유기체에 외인성 유전자(들)를 전달하여, 유기체의 생물학적 특징 또는 기능을 일부 변경시키는 방법을 지칭한다. 1983년도에 세계적으로 최초 형질전환 식물인 항바이러스성 형질전환 담배가 미국에서 개발되었다. 1986년에는 미국에서 항바이러스성 형질전환 목화가 개발되어, 현장 시험에 돌입하였다. 1987년에는, 곤충-저항성 유전자 및 제초제-저항성 유전자가 농작물에 도입되었다. 1992년에는 형질전환 담배가 중국에서 재배되었다. 1995년에는 캐나다에서 제초제-내성의 브래시카 형질전환체가 출시되었다. 1996년에는 곤충-저항성 형질전환 목화와 제초제-저항성 형질전환 대두가 미국에서 대규모로 재배되었다. 현재, 전세계적으로 120주 이상의 형질전환 식물들이 존재하며, 대두, 목화 및 옥수수 등의 형질전환 작물 51주가 상업화되어 있다.
현재, 형질전환 제품에 대한 논의가, 특히 형질전환성 식물의 안전성에 대해 점점 증가하고 있다. 형질전환성 유기체에 대한 규제는 대부분의 국가들에서 매우 엄격하다. 형질전환 기법 또는 제품을 규제하기 위해 많은 돈과 시간이 소요될 것이다. 국제 Crop Life의 조사에 따르면, 형질전환 산물을 상업화하는데 약 5.5년이 소요되며, 미국 달러로 3500만불이 든다. 또한, 이미 상업화된 형질전환 농작물들은 시장에서 만족스럽게 받아들여지지 않고 있으며, 예를 들어, 판매 허가된 최초 형질전환 토마토는 판매 부진으로 인해 결국 시장에서 철수하였다. 즉, 농작물을 개량하기 위한 트랜스유전자-무함유성 방법을 개발하는 것이 매우 중요하다.
현재, 농작물을 유전자 개량하는 방법 또는 유전자 변형 방법은 많은 문제점들을 가지고 있다. 예를 들어, 전통적인 교배 육종은 수 세대 동안 수행되어야 하며, 따라서 시간 소모적이며, 상당한 노동이 요구된다. 또한, 이는 종간 생식 격리 (interspecies reproductive isolation)에 의해 제한적일 수 있으며, 부적절한 유전자 연관 (gene linkage)에 의해 영향을 받을 수 있다. 방사능 조사에 의한 돌연변이 유발, EMS 돌연변이 유발 등과 같은, 물리적 또는 화학적인 돌연변이 유발 방법들로 상당히 많은 수의 돌연변이된 부위를 게놈에 랜덤으로 도입할 수 있지만, 돌연변이된 부위들을 동정하기 매우 어려울 것이다.
게놈 부위-특이적인 변형 툴은, 최근에 떠오른 새로운 기법으로서, 3가지 분류의 서열 특이적인 뉴클레아제 (SSN), 즉, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유자 작동자 뉴클레아제 (TALEN) 및 간헐적으로 반복되는 회문 구조 염기 서열 집합체 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/CRISR 관련 시스템 (CRISPR/Cas9)을 포함한다. 이들의 공통적인 특징은, 특이적인 DNA 서열을 절단하기 위한 엔도뉴클레아제로서 작용하여, DNA 이중 가닥 절단 (DSB)을 형성할 수 있다는 것이다. DSB는, DNA 손상을 복구하기 위해, 세포의 고유 복구 기전, 비-상동적인 말단 연결 (non-homologous end joining, NHEJ) 및 상동적인 재조합 (homologous recombination, HR)을 활성화할 수 있다. DNA 복구 과정 중에 특이적인 DNA 서열에 대한 부위-특이적인 변형이 달성될 수 있다.
유전자 전달 기법을 이용해 상기한 툴을 농작물에 전달함으로써, 낮은 효율, 시간-소모 및 특이성 불량 등의 전통적인 육종법의 문제들을 극복할 수 있다. 그러나, 이 방법은 트랜스유전자를 사용하므로, 트랜스유전자를 포함하지 않는 부위-특이적으로 변형된 돌연변이는 후대 개체군에서 분리 (segregation)를 통해 수득하여야 한다. 외인성 유전자가 식물 게놈에 병합되면 (최종적으로 분리에 의해 제거되더라도), 안전성 문제는 여전히 존재한다. 따라서, 트랜스유전자를 회피하는 부위-특이적인 농작물 변형 방법이 여전히 필요한 실정이다.
유전자총 형질전환 (particle bombardment transformation), 아그로박테리움-매개 형질전환 (Agrobacterium-mediated transformation) 또는 프로토플라스트를 이용한 형질전환 (protoplast-based transformation) 등의 전통적인 유전자 전달 수단에는 조직 배양 단계가 요구된다. 식물 조직 배양은, 원하는 조직, 세포 또는 프로토플라스트를 식물에서 분리하여, 인공적인 조건에서 배양하여 완전한 식물을 재생하는 것을 의미한다. 조직 배양은 체세포 돌연변이를 발생시키는 경향이 있어, 식물 유전자형 및 특정 수여체로 한정된다. 재생된 식물을 수득하기까지 오랜 시간이 걸리며, 많은 자원이 든다. 인 시추 형질전환 (in situ transformation)은, 조직 또는 세포를 배양하지 않고도, 살아있는 식물을 형질전환 (생체외 (ex vivo)는 아님)하는 것을 의미한다. 인 시추 형질전환은 일반적으로 형질전환 대상으로서 완전한 식물 (whole plant)을 이용하며, 화분관 방식 (pollen tube approach), 꽃 침지 (inflorescence-dipping), 정단부 재생 (shoot apex regeneration), 씨방 주입 (ovary injection), 잎 디스크 방식 (leaf disc approach) 등이 있다. 인 시추 형질전환은 조직 배양이 필요없으며, 수행이 용이하고, 특수 장비가 필요없다. 이 방법은 유전자형 및 수여체와 무관하며, 따라서 다양한 종들의 여러 품종들에 적용할 수 있다. 또한, 형질전환 후대를 직접 수득할 수 있다. 따라서, 식물 게놈에 부위-특이적인 변형은 식물에 유전자 편집 기법을 적용하는데 유용한 인 시추 형질전환을 통한 일시적인 발현 시스템에 의해 달성할 수 있다.
본 발명의 목적은 일시적인 유전자 발현을 통해 완전한 식물을 부위-특이적으로 변형하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은, 대상 식물에서 서열-특이적인 뉴클레아제를 일시적으로 발현시키는 단계를 포함할 수 있는, 식물에서 타겟 유전자의 타겟 단편에 부위-특이적인 변형을 수행하는 방법을 제공하며, 이때 완전한 식물이 일시적인 발현의 대상으로서 사용되며, 서열-특이적인 뉴클레아제가 타겟 단편을 타겟으로 하여 이를 절단하며, 이로써 상기 식물의 자기 DNA 복구를 통해 부위-특이적인 변형이 달성된다. 이 방법은 조직 배양 단계를 수반하지 않는다.
본 방법에 대한 일 구현예에서, 식물에서 부위-특이적인 뉴클레아제를 일시적으로 발현시키는 방법은 하기 단계들을 포함한다:
a) 서열-특이적인 뉴클레아제 또는 서열-특이적인 뉴클레아제를 발현하기 위한 유전 물질 (genetic material)을 식물에 전달하는 단계, 및
b) 단계 a)에서 수득된 식물을 선택압이 없는 조건에서 배양하는 단계로서, 식물 염색체에 병합되지 않은 서열-특이적인 뉴클레아제 또는 유전 물질은 분해되는 단계.
본 발명의 방법에 대한 일 구현예에서, 유전 물질은 재조합 벡터 (예, DNA 플라스미드) 또는 DNA 선형 단편 또는 시험관내에서 전사된 RNA이다.
선택압이 없는 조건에서, 식물의 방어 시스템은 외인성 유전자의 도입을 저해할 것이며, 식물에 이미 전달된 외인성 유전자를 분해할 것이다. 따라서, 일시적인 발현을 거친 완전한 식물을 배양하는 경우, (타겟 단편에 특이적인 뉴클레아제를 발현하기 위한 유전 물질의 임의 단편 등의) 외인성 유전자는 식물의 게놈에 병합되지 않을 것이며, 최종적으로 수득되는 식물은 부위-특이적인 변형을 가진 트랜스유전자-무함유성 식물가 된다.
본 발명의 방법에 대한 일 구현예에서, 서열-특이적인 뉴클레아제 또는 유전 물질은, 화분관, 꽃, 정단부, 씨방 또는 잎 등의 서열-특이적인 뉴클레아제 또는 유전 물질을 전달하기 위해 사용될 수 있는, 식물의 임의 부위를 통해 전달된다.
식물의 부위가 화분관인 경우에 대한 일 구현예에서, 전달은 재조합 벡터 (예, DNA 플라스미드) 또는 DNA 선형 단편 또는 시험관내 전사된 RNA가 함유된 용액 또는 서열-특이적인 뉴클레아제가 함유된 용액을 수분 후 암술머리에 주입함으로써 수행되며, 이로써 외인성 유전 물질 또는 서열-특이적인 뉴클레아제는 개화 및 수정 중에 형성된 화분관을 통해 수정된 난 (fertilized ovum)내로 전달된다 (즉, 화분관 방식).
식물의 부위가 꽃인 경우에 대한 일 구현예에서, 전달은 꽃을 재조합 벡터 (예, DNA 플라스미드) 또는 DNA 선형 단편을 운반하는 (carrying) 아그로박테리움 투메팍시엔스 (Agrobaterium tumefaciens) 용액에 침지함으로서 수행된다 (즉, 꽃-침지 (inflorescence-dipping 또는 floral-dip) 방식).
식물의 부위가 정단부인 경우에 대한 일 구현예에서, 전달은 재조합 벡터 (예, DNA 플라스미드) 또는 DNA 선형 단편을 운반하는 아그로박테리움 투메팍시엔스 (Agrobaterium tumefaciens) 용액에 정단부를 침지함으로서 수행된다 (즉, 정단부 재생 방식).
식물의 부위가 씨방인 경우에 대한 일 구현예에서, 전달은 재조합 벡터 (예, DNA 플라스미드) 또는 DNA 선형 단편 또는 시험관내에서 전사된 RNA가 함유된 용액 또는 서열-특이적인 뉴클레아제가 함유된 용액을 수분 후 씨방에 주입함으로써 수행된다 (즉, 씨방 주입 방식).
식물의 부위가 씨방인 경우에 대한 일 구현예에서, 전달은 재조합 벡터 (예, DNA 플라스미드) 또는 DNA 선형 단편을 운반하는 아그로박테리움 투메팍시엔스 (Agrobaterium tumefaciens) 용액을 수분 후 씨방에 주입함으로써 수행된다 (즉, 아그로박테리움 씨방 주입 방식).
식물의 부위가 잎인 경우에 대한 일 구현예에서, 전달은 재조합 벡터 (예, DNA 플라스미드) 또는 DNA 선형 단편을 운반하는 아그로박테리움 투메팍시엔스 (Agrobaterium tumefaciens) 용액을 잎에 주입함으로써 수행된다 (즉, 잎 디스크 방식).
본 방법에서, 타겟 단편에 특이적인 서열-특이적인 뉴클레아제는, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유자 작동자 뉴클레아제 (TALEN) 및 CRISPR/Cas9 뉴클레아제 등의 게놈 편집을 달성할 수 있는 임의의 뉴클레아제일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, "서열-특이적인 뉴클레아제"는 구체적으로 CRISPR/Cas9 뉴클레아제를 지칭한다. 일부 구현예에서, 타겟 단편에 특이적인 CRISPR/Cas9 뉴클레아제를 발현하기 위한 유전 물질은 특히 가이드 RNA의 전사 및 Cas9 단백질의 발현을 수행하기 위한, 재조합 벡터 또는 DNA 단편 (또는 crRNA 및 tracrRNA를 각각 전사하기 위한 2종의 재조합 벡터들 또는 DNA 단편들)으로 구성되거나; 또는 가이드 RNA를 전사하기 위한 재조합 벡터 또는 DNA 단편 (또는 crRNA 및 tracrRNA를 각각 전사하기 위한 2종의 재조합 벡터들 및 DNA 단편들) 및 Cas9 단백질을 발현시키기 위한 재조합 벡터 또는 DNA 단편 또는 RNA로 구성되거나; 또는 특히 가이드 RNA (또는 crRNA 및 tracrRNA), 및 Cas9 단백질을 발현시키기 위한 재조합 벡터 또는 DNA 단편 또는 RNA로 구성된다. 가이드 RNA는, crRNA와 tracrRNA 간의 부분적인 염기-쌍 형성에 의해 형성되는, 회문 구조 (palindromic structure)를 가진 RNA이며; crRNA는 타겟 부위에 상보적으로 결합할 수 있는 RNA 단편을 포함한다.
또한, 가이드 RNA를 전사하기 위한 재조합 벡터 또는 DNA 단편에서, 가이드 RNA의 코딩 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시하기 위한 프로모터는 U6 프로모터 또는 U3 프로모터이다.
보다 구체적으로, 가이드 RNA를 전사하고 Cas9 단백질을 발현하기 위한 재조합 벡터는, 플라스미드 pHSN40 또는 pHSN401의 2개의 BsaI 제한효소 부위들 사이에 정방향으로 "타겟 단편에 상보적으로 결합할 수 있는 RNA 단편"의 코딩 뉴클레오티드 서열을 삽입함으로써 수득되는, 재조합 플라스미드이다.
가이드 RNA를 전사하기 위한 재조합 벡터는 플라스미드 pZmU3-gRNA의 2개의 BbsI 제한효소 부위들 사이에 정방향으로 "타겟 단편에 상보적으로 결합할 수 있는 RNA 단편"의 코딩 서열을 삽입함으로써 수득되는, 재조합 플라스미드이며; Cas9 뉴클레아제를 발현시키기 위한 재조합 벡터는 특히 벡터 pJIT163-Ubi-Cas9이다.
본 발명의 다른 구현예에서, "서열-특이적인 뉴클레아제"는 TALEN 뉴클레아제이다. 타겟 부위에 특이적인 서열-특이적인 뉴클레아제를 발현하기 위한 유전 물질은 쌍을 형성한 TALEN 단백질들 (paired ZFN proteins)을 발현하는 재조합 플라스미드 (DNA 플라스미드) 또는 DNA 단편 또는 RNA일 수 있으며, 여기서 TALEN 단백질은 타겟 단편을 인지하여 결합할 수 있는 DNA 결합 도메인과 FokI 도메인으로 구성된다.
서열-특이적인 뉴클레아제가 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)인 경우, 타겟 부위에 특이적인 서열-특이적인 뉴클레아제를 발현하기 위한 유전 물질은, 쌍을 형성한 ZFN 단백질들을 발현하는 재조합 플라스미드 (DNA 플라스미드) 또는 DNA 단편 또는 RNA일 수 있으며, 이 ZFN 단백질은 타겟 단편을 인지하여 결합할 수 있는 DNA 결합 도메인과 FokI 도메인으로 구성된다.
상기한 방법에서, 부위-특이적인 변형은 특히 식물 게놈의 타겟 단편에의 삽입, 결손 및/또는 치환이다. 일부 구현예에서, 타겟 단편은 타겟 유전자의 코딩 영역내이다. 일부 구현예에서, 타겟 단편은 프로모터와 같은 타겟 유전자의 전사 조절 영역내이다. 일부 구현예에서, 타겟 유전자는 구조 유전자 또는 비-구조 유전자일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기한 변형으로 타겟 유전자의 기능 상실이 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 변형으로 타겟 유전자의 기능 획득 (또는 변경)이 발생한다.
일부 구현예에서, 식물은 임의의 유전자형의 식물일 수 있다. 식물은 외떡잎 또는 쌍떡잎, 예를 들어, 옥수수 (지아 메이스 (Zea mays)), 밀, 대두, 목화, 담배, 아라비돕시스, 호밀, 로사 록스부르기 (Rosa roxbunghii), 에리오보트리아 자포니카 (Eriobotrya japonica), 카리카 파파야 (Carica papaya), 로사 카니나 (Rosa canina), 덴드로비움 노빌 린들. (Dendrobium nobile Lindl .), 브라시카 올레라케아 (Brassica oleracea), 파고피룸 타타리컴 (Fagopyrum tataricum) 또는 헤베아 브라실리엔시스 (Hevea brasiliensis) 일 수 있다.
식물이 옥수수, 밀, 대두, 목화, 담배 등인 경우, 서열-특이적인 뉴클레아제 또는 유전 물질은 화분관 방식에 의해 전달될 수 있다. 식물이 아라비돕시스, 밀, 호밀 등인 경우, 서열-특이적인 뉴클레아제 또는 유전 물질은 꽃-침지 방식에 의해 전달될 수 있다. 식물이 옥수수, 로사 룩스부르기, 에리오보트리아 자포니카, 카리카 파파야, 로사 카니나 등인 경우, 유전 물질은 정단부 재생 방식에 의해 전달될 수 있다. 식물이 밀, 대두, 목화, 덴드로비움 노빌 린들. 등인 경우, 서열-특이적인 뉴클레아제 또는 유전 물질은 씨방 주입 방식에 의해 전달될 수 있다. 식물이 담배, 브라시카 올레라케아, 파고피룸 타타리컴, 헤베아 브라실리엔시스 등인 경우, 유전 물질은 잎 디스크 방식에 의해 전달될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 (실시예 1), 식물은 옥수수 (특히, 옥수수 잡종 HiII 및 순종 계통 B73, Zheng58 등)이고; 뉴클레아제는 CRISPR/Cas9이고; 타겟 유전자는 옥수수 내인성 유전자 ZmIPK이고; 타겟 단편은 5'-AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'이고; 가이드 RNA를 전사하기 위한 재조합 벡터는 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3'로 나타낸 DNA 단편을 플라스미드 pZmU3-gRNA의 2개의 BbsI 제한효소 부위들 사이에 정방향으로 삽입함으로써 수득되는, 재조합 플라스미드이고; Cas9 뉴클레아제를 발현시키기 위한 재조합 벡터는 특히 벡터 pJIT163-Ubi-Cas9이고; 가이드 RNA를 전사하고 Cas9 단백질을 발현하기 위한 재조합 벡터는, 5'-GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3'로 나타낸 DNA 단편을 플라스미드 pBUE411의 2개의 BsaI 제한효소 부위들 사이에 정방향으로 삽입함으로써 수득되는, 재조합 플라스미드이다.
본 발명의 다른 구현예 (실시예 2)에서, 식물은 아라비돕시스이고; 뉴클레아제는 CRISPR/Cas9이고; 타겟 유전자는 아라비돕시스 내인성 유전자 AtPTPA이고; 타겟 단편은 5'-ACGATATCCGCCGATTTCAC-3'이고; 가이드 RNA를 전사하고 Cas9 단백질을 발현하기 위한 재조합 벡터는 5'- ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3'로 나타낸 DNA 단편을 플라스미드 pHSN401의 2개의 BsaI 제한효소 부위들 사이에 정방향으로 삽입함으로써 수득되는, 재조합 플라스미드이다.
타겟 유전자가 기능 상실할 수 있도록 하기 위해 본 발명의 방법을 이용해 대상 식물에 타겟 유전자의 타겟 단편에 부위-특이적인 변형을 수행함으로써 수득되는, 트랜스유전자-무함유성 돌연변이 식물 (transgene-free mutant plant) 및/또는 이의 후대, 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
또한, 본 발명은, 대상 식물의 타겟 유전자의 타겟 단편에 본 발명의 방법을 이용해 부위-특이적인 변형을 수행하여, 타겟 유전자의 기능이 상실되고 게놈에 병합된 외인성 유전자가 존재하지 않는 식물을 수득하는 단계를 포함하는, 트랜스유전자-무함유성 돌연변이 식물의 제조 방법을 제공한다.
본원에서, 형질전환 식물은 외인성 유전자가 식물의 게놈에 병합된 식물을 지칭한다. 트랜스유전자-무함유성 식물은 게놈에 병합된 외인성 유전자가 존재하지 않는 식물을 지칭한다.
본 발명은 완전한 식물이 발현을 위한 대상으로서 사용되는 일시적인 발현 시스템과 게놈 편집 기법을 조합한다. 즉, 본 발명에서, 서열-특이적인 뉴클레아제는 화분관 방식, 꽃-침지, 정단부 재생, 씨방 주입, 잎 디스크 방식 등을 통해 완전한 식물의 세포 또는 조직내로 도입되며; 이후 서열-특이적인 뉴클레아제의 일시적인 발현을 통해 식물 게놈의 변형이 달성된다. 안전성이 높은 돌연변이 후대를 직접 수득할 수 있다. 예를 들어, 화분관 방식의 경우, 서열-특이적인 뉴클레아제 또는 서열-특이적인 뉴클레아제를 발현하기 위한 DNA/RNA를 함유한 용액은 식물의 개화 또는 수정시 형성된 화분관을 통해 수정된 난 세포 또는 생식 세포 (정핵 또는 배주)내로 전달된다. 이들 세포는 프로토플라스트-유사 (세포벽이 형성되지 않음)하며, 활성의 DNA 복제 및 재조합을 이행하게 되며, 따라서 서열-특이적인 뉴클레아제에 의해 효과적으로 편집될 것이다. 변형된 수정된 난 세포 또는 생식 세포는 온전한 돌연변이 식물로 생장할 수 있다. 도입된 서열-특이적인 뉴클레아제, 또는 서열-특이적인 뉴클레아제를 코딩하는 도입된 RNA는 식물 세포에 의해 분해될 것이다. 본 방법은 선택압 없이 완벽하게 수행되기 때문에, 서열-특이적인 뉴클레아제를 코딩하는 DNA 역시, 식물 세포에 의해 분해될 것이다. 따라서, 외인성 유전자는 게놈에 병합되지 않을 것이며, 수득되는 돌연변이는 높은 생물-안전성을 가질 것이다.
본 발명의 이점은 다음과 같다: 조직 배양이 생략되며; 돌연변이가 완전한 식물 수준 (whole plant level)에서 달성되며; 본 방법이 유전자형과 수여체와 독립적이며, 따라서 다양한 종의 다양한 품종들에 적용할 수 있으며; T1 돌연변이를 직접 수득할 수 있으며, 돌연변이를 안정적으로 유전시킬 수 있으며; 보다 중요하게는, 수득된 돌연변이 식물은 외인성 유전자를 함유하고 있지 않으며, 따라서 생물-안정성이 우수하다.
도 1은 프로토플라스트에서 gRNA:Cas9 시스템의 일시적인 발현에 의한 옥수수 내인성 유전자 ZmIPK의 부위-특이적인 돌연변이 유발을 나타낸 것이다. a)는 겔 전기영동 사진이다. 레인 1은 마커로서, 밑에서 위로 각각 250, 500, 750, 1000 bp이고; 레인 2 및 레인 3은 gRNA:Cas9 시스템으로 형질전환된 프로토플라스트 DNA의 PCR 산물에 대한 SacI 제한효소 절단 결과이고; 레인 4는 야생형 프로토플라스트 DNA의 PCR 산물에 대한 SacI 제한효소 절단 결과이고; 레인 5는 야생형 프로토플라스트의 PCR 산물이다. b)는 몇몇 돌연변이들의 서열분석 결과이다.
도 2는 화분관 방식을 통한 옥수수 품종 HiII에서 gRNA:Cas9 시스템의 일시적인 발현에 의한 옥수수 내인성 유전자 ZmIPK의 부위-특이적인 돌연변이 유발 및 서열분석 결과를 나타낸 것이다. a)는 겔 전기영동 사진이다. 레인 1은 마커로서, 밑에서 위쪽으로 각각 100, 250, 500, 750, 1000 bp이고; 레인 2-12는 돌연변이들에 대한 PCR 산물의 SacI 제한효소 절단 결과이고; 레인 13은 야생형 대조군에 대한 PCR 산물의 SacI 제한효소 절단 결과이다. b)는 몇몇 돌연변이들의 서열분석 결과이다.
도 3은 화분관 방식을 통한 옥수수 품종 B73에서 gRNA:Cas9 시스템의 일시적인 발현에 의한 옥수수 내인성 유전자 ZmIPK의 부위-특이적인 돌연변이 유발과 서열분석 결과를 나타낸 것이다. a)는 겔 전기영동 사진이다. 레인 1은 마커로서, 밑에서 위쪽으로 각각 100, 250, 500, 750, 1000 bp이고; 레인 2-6은 돌연변이의 PCR 산물에 대한 SacI 제한효소 절단 결과이고; 레인 7은 야생형 대조군의 PCR 산물에 대한 SacI 제한효소 절단 결과이다. b)는 몇몇 돌연변이들의 서열분석 결과이다.
도 4는 화분관 방식을 통한 옥수수 품종 Zheng58에서 gRNA:Cas9 시스템의 일시적인 발현에 의한 옥수수 내인성 유전자 ZmIPK의 부위-특이적인 돌연변이 유발과 서열분석 결과를 나타낸 것이다. a)는 겔 전기영동 사진이다. 레인 1은 마커로서, 밑에서 위쪽으로 각각 100, 250, 500, 750, 1000 bp이고; 레인 2-9는 돌연변이의 PCR 산물에 대한 SacI 제한효소 절단 결과이고; 레인 10은 야생형 대조군의 PCR 산물에 대한 SacI 제한효소 절단 결과이다. b)는 몇몇 돌연변이들의 서열분석 결과이다.
도 5는 pZmU3-gRNA-C1 및 pJIT163-Ubi-Cas9 벡터용 프라이머 2세트를 이용하여, 여러가지 옥수수 품종에서 화분관 방식을 통해 수득한 ZmIPK 유전자 돌연변이들을, 증폭시킨 결과를 보여주는 겔 전기영동 사진이다. a)는 프라이머 쌍 ZmU3-F/C1R을 이용한 증폭 결과이고; b)는 프라이머 쌍 Cas9-1F/Cas9-1R을 이용한 증폭 결과이다. 레인 1은 마커로서, 밑에서 위쪽으로 각각 100, 250, 500, 750, 1000 bp이고; 레인 2-10은 검사한 대조군들이고; 레인 11은 양성 대조군이다 (플라스미드 pZmU3-gRNA-C1 또는 pJIT163-Ubi-Cas9).
도 6은 프로토플라스트에서 gRNA:Cas9 시스템의 일시적인 발현에 의한 아라비돕시스 내인성 유전자 AtPTPA의 부위-특이적인 돌연변이 유발을 도시한 것이다. a)는 겔 전기영동 사진이다. 레인 1은 마커로서, 밑에서 위쪽으로 각각 100, 250, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 5000 bp이고; 레인 2 및 레인 3은 gRNA:Cas9 시스템으로 형질전환된 프로토플라스트 DNA의 PCR 산물에 대한 EcoRV 제한효소 절단 결과이고; 레인 4는 야생형 프로토플라스트 DNA의 PCR 산물에 대한 EcoRV 제한효소 절단 결과이고; 레인 5는 야생형 프로토플라스트의 PCR 산물이다. b)는 비-절단된 밴드의 서열분석 결과이다.
도 7은 꽃-침지 방식을 통한 gRNA:Cas9 시스템의 일시적인 발현에 의한 아라비돕시스 내인성 유전자 AtPTPA의 부위-특이적인 돌연변이 유발을 도시한 것이다. a)는 겔 전기영동 사진이다. 레인 1은 마커로서, 밑에서 위쪽으로 각각 100, 250, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 5000 bp이고; 레인 2-9는 돌연변이의 PCR 산물들에 대한 EcoRV 제한효소 절단 결과이고; 레인 10은 야생형 대조군의 PCR 산물에 대한 EcoRV 절단 결과이다. b)는 몇몇 돌연변이들의 서열분석 결과이다.
도 8은 pHSN401-C2 벡터용 프라이머를 이용한 AtPTPA 유전자 돌연변이들의 증폭 결과를 나타낸 겔 전기영동 사진이다. a)는 프라이머 쌍 pHSN401-1F/C2R을 이용한 증폭 결과이고; b)는 프라이머 쌍 CAS9-2F/CAS9-2R을 이용한 증폭 결과이다. 레인 1은 마커로서, 밑에서 위쪽으로 각각 100, 250, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 5000 bp이고; 레인 2-9는 테스트한 돌연변이들이고; 레인 10은 양성 대조군 (플라스미드 pHSN401)이다.
도 9는 AtPTPA 유전자 돌연변이의 후대에서 돌연변이를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 레인 1은 마커로서, 밑에서 위쪽으로 각각 100, 250, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 5000 bp이고; 레인 2, 3, 4, 5는 동형접합성 돌연변이의 후대이고; 레인 6, 7은 분리 (segregation)에 의해 수득되는 야생형 후대이고; 레인 8, 9, 10은 이형접합성 돌연변이의 후대이다.
아래 실시예들에서 사용되는 실험 방법들은 그렇지 않은 것으로 언급되지 않은 한 모두 통상적인 방법이다.
아래 실시예들에서 사용되는 재료, 시약은 모두 그렇지 않은 것으로 언급되지 않은 한 상업적으로 구입가능하다.
발현 벡터 pZmU3-gRNA는 "Liang, Z. et al. Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas System. Journal of Genetics and Genomics.41:63-68, (2014)"에서 언급되었다.
발현 벡터 pJIT163-Ubi-Cas9는 "Wang, Y. et al. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nature Biotechnology. 32, 947-951 (2014)"에서 언급되었다.
발현 벡터 pHSN401 및 pBUE411은 "Xing, H. et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biology.14:327, (2014)"에서 언급되었다.
옥수수 품종 HiII는 "Armstrong, C.L., Green, C.E.& Phillips, R.L. Development and availability of germplasm with high type II culture formation response. Maize Genet. Coop. News Lett. 65,92-93 (1991)"에서 언급되었다.
옥수수 품종 B73은 "Russell, W.A. Registration of B70 and B73 parental lines of maize. Crop Sci. 12, 721 (1972)"에서 언급되었다.
옥수수 품종 Zheng58은 "Zhang Falin, Breeding and application of a Maize inbred line Zheng58. Crop Journal, 2001(4):31-31"에서 언급되었다.
아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 생태형 콜롬비아 (Columbia)는 "Koorneef, M. et al. Linkage map of Arabidopsis thaliana. Jornal of Heredity. 74,265-272 (1983)"에서 언급되었다.
MS 배지: 4.43g/L MS 염 (Sigma，M5524), 30g/L 슈크로스, 3g/L 피토겔, pH 5.7, 121℃에서 20분간 자동멸균 처리됨.
LB 배지: 10g/L 트립톤, 5g/L 효모 추출물, 10g/L NaCl, pH7.0 (고체 LB 배지의 경우, 아가 15g이 액체 배지 1 L 당 첨가됨), 20분간 121℃에서 자동멸균 처리됨.
프로토플라스트의 준비 및 형질전환에 사용되는 용액들은 표 1-6에 나타낸다.
표 1: 아라비돕시스에 대한 50 ml 효소적 세포분해용 용액
Figure pct00001
표 2: 옥수수에 대한 50 ml 효소적 세포분해용 용액
Figure pct00002
표 3: 500 ml W5
Figure pct00003
표 4: 250 ml WI 용액
Figure pct00004
표 5: 10 ml MMG 용액
Figure pct00005
표 6: 4 ml PEG 용액
Figure pct00006
표 1-6에서 %는 중량-부피 퍼센트, 즉 g/100 ml이다.
아그로박테리움 투메팍시엔스의 형질전환:
1) 컴피턴트 세포 (competent cell) (-80℃에서 저장됨)를 얼음 위에서 해동한 후, 플라스미드 DNA 2 ㎍을 첨가하여 혼합한다; 혼합물을 30분간 얼음 위에 둔다;
2) EP 시험관을 1분간 액체 질소에 넣은 후 해동 (2분)을 위해 신속하게 37℃ 수조로 옮긴다;
3) 그런 후, LB 액체 배지 1 ml을 첨가하여, 저속 (150rpm)으로 교반하면서 28℃에서 4-5시간 동안 인큐베이션한다;
4) 30초간 10000rpm으로 원심분리하여 박테리아 세포를 회수하고, 상층액은 버리고, 재현탁한 박테리아 세포 100 ㎕를 해당 항생제가 첨가된 선별 플레이트에 접종한다;
5) 플레이트를 28℃에서 백색 콜로니 (형질전환체)가 나타날 때까지 뒤집어서 인큐베이션한다.
실시예 1. 화분관 방식 및 정단부 재생 방식을 통한 옥수수 내인성 유전자 ZmIPK 의 부위-특이적인 편집
I. 타겟 단편의 설계: 타겟-C1
타겟-C1: 5'-CCGAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'; (Genbank No. AY172635에 나타낸 유전자 ZmIPK의 393-415번 위치).
II. C1 부위를 포함하는 pZmU3-gRNA 플라스미드 및 pBUE411 플라스미드의 제조
C1은 타겟-C1에 상보적으로 결합할 수 있는 RNA의 DNA 서열이다.
스티키 엔드 (밑줄 표시됨)를 가진 아래 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 합성하였다:
C1-1F: 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3';
C1-2F:5'-GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3';
C1R: 5'-AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'.
스티키 엔드를 가진 이중 가닥 DNA를 C1-1F/C1R의 어닐링을 통해 형성시키고, pZmU3-gRNA 플라스미드의 BbsI 제한효소 부위 2곳 사이에 삽입해 C1 사이트를 가진 pZmU3-gRNA 플라스미드를 제조하였다. 서열분석으로 양성 플라스미드를 검증하였다. pZmU3-gRNA 플라스미드의 BbsI 제한효소 부위에 정방향으로 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3'로 표시되는 DNA 단편을 삽입함으로써 수득한 재조합 플라스미드는 양성 대조군이며, 이를 pZmU3-gRNA-C1으로 명명하였다.
스티키 엔드를 가진 이중 가닥 DNA를 C1-2F/C1R의 어닐링을 통해 형성시키고, 이를 pBUE411 플라스미드의 BsaI 제한효소 부위 2곳 사이에 삽입하여 C1 사이트를 가진 pBUE411 플라스미드를 제조하였다. 이 양성 플라스미드를 서열분석으로 검증하였다. pBUE411 플라스미드의 BsaI 제한효소 부위에 정방향으로 5'-GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3'로 표시되는 DNA 단편을 삽입함으로써 수득한 재조합 플라스미드는 양성 대조군이며, 이를 pBUE411-C1으로 명명하였다.
III. 옥수수 프로토플라스트로의 gRNA:Cas9 시스템 전달
단계 II에서 수득한 pJIT163-Ubi-Cas9 벡터 및 pZmU3-gRNA-C1 플라스미드를 옥수수 프로토플라스트에 도입하였다. 구체적인 과정은 다음과 같다:
1. 옥수수 유식물의 생장
옥수수 잡종 품종 HiII 및 순종 계통 B73 및 Zheng58의 종자들을 밤새 물에 담군 다음 흡수지가 들어 있는 (물 첨가) 플레이트로 이동시켜, 발아를 위해 3일간 광 조건 하에 처리하였다. 발아된 옥수수 종자는 10-11일간 24℃에서 흙에 파종하여, 옥수수 유식물을 재배하였다.
2. 프로토플라스트의 단리
1) 옥수수의 어린 잎을 취하여, 이의 중간 부분을 커터 블레이드를 사용해 0.5 - 1 mm 가닥으로 절단하여 효소적 세포분해용 용액 50 ml에 넣어 5시간 분해하였다 (0.5h 효소적 세포분해는 진공 하에 수행한 다음, 10 rpm으로 4.5시간 교반함).
주의: 효소적 세포분해시의 온도는 20-25℃로 유지되어야 하며, 반응은 암 조건에서 수행되어야 하며; 용액은 프로토플라스트를 분리하기 위해 반응 후 부드럽게 교반하여야 한다.
2) 효소적 세포분해 산물에 W5 30 ml을 첨가하여 희석한 다음 75 ㎛ 나일론 필터 막을 이용해 둥근 바닥형 50 ml 원심분리 시험관으로 여과하여 넣었다.
주의: 나일론 필터 막은 75% (부피 퍼센트) 에탄올에 젖신 후 물로 헹군 다음 사용하기 전에 2분간 W5에 담구어야 한다.
3) 3분간 23℃에서 150 g로 원심분리하고, 상층액을 제거하였다.
4) 펠렛을 W5 10 ml로 현탁하여, 3분간 150 g에서 원심분리한 다음 상층액을 제거하였다.
5) MMG 용액을 적량 첨가하여 프로토플라스트를 현탁한 후, 형질전환할 때까지 얼음 위에 두었다.
주의: 프로토플라스트의 농도를 현미경 (x100)으로 측정하여야 한다. 프로토플라스트의 양은 2 x 105/ml - 1 x 106/ml이었다.
3. 옥수수 프로토플라스트의 형질전환
1) 10 ㎍ pJIT163-2NLSCas9 벡터와 10 ㎍ pZmU3-gRNA-C1 플라스미드를 2 ml 원심분리 시험관에 넣었다. 프로토플라스트 200 ㎕를 파이펫을 사용해 첨가한 다음 부드럽게 패팅하여 혼합하였고, 3-5분간 계속 유지하였다. PEG4000 용액 220 ㎕를 첨가하고, 부드럽게 패팅하여 혼합하였다. 형질전환은 암 조건에서 15분간 수행하였다;
2) W5 (실온) 880 ㎕를 첨가하고, 상하 뒤집어 혼합한 다음 3분간 100 g로 원심분리 후 상층액을 제거하였다;
3) WI 용액 1 ml을 첨가하고, 상하 뒤집어 혼합한 다음 내용물을 (WI 용액 1 ml이 미리 첨가된) 6웰 플레이트에 조심하여 이동시킨 다음 밤새 23℃에서 배양하였다.
IV. PCR/RE 실험을 이용한, gRNA:Cas9 시스템에 의한 옥수수 내인성 유전자 ZmIPK의 돌연변이 유발 분석
옥수수 프로토플라스트 형질전환 후 48시간 경과시, 게놈 DNA를 추출하였으며, 이를 PCR/RE (중합효소 연쇄 반응/제한효소 절단) 실험 분석의 주형으로 사용하였다. 동시에, 야생형 옥수수 품종 HiII의 프로토플라스트를 대조군으로 사용하였다. PCR/RE 분석 방법은 Shan, Q. et al. Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs. Molecular Plant (2013)를 토대로 하였다. 옥수수 내인성 유전자 ZmIPK (Genbank No. AY172635)의 타겟 단편 (Genbank No. AY172635의 393-415 위치)이 엔도노클레아제 제한효소 SacI의 인지 서열 (5'-GAGCTC-3')을 가지고 있어, 엔도뉴클레아제 제한효소 SacI을 PCR/RE 검사를 수행하는 실험에 이용하였다. PCR 증폭에 사용되는 프라이머는 다음과 같다:
ZmIPK-1F: 5'- TCGCAGCCCCTGGCAGAGCAA-3';
ZmIPK-1R: 5'- GAGACCTGGGAGAAGGAGACGGATCC-3'.
PCR/RE 실험의 결과는 도 1에서 볼 수 있으며, 그 결과, 돌연변이가 ZmIPK 유전자의 타겟 부위에 발생되어, 비-절단 밴드를 회수하였으며, 서열을 분석한 결과 ZmIPK 유전자의 타겟 부위에 삽입/결손 (indel)이 생긴 것을 확인하였다.
V. 화분관 방식을 통한 옥수수 내인성 유전자 ZmIPK의 부위-특이적인 편집
세포-침투성 펩타이드 (CPP)는 세포내로 거대 분자 (단백질 및 핵산 등)를 운반할 수 있는 짧은 펩타이드 클래스이다. 최근 실험에서, 세포-침투성 펩타이드가, DNA에 결합하면, 효소적 분해로부터 DNA를 보호할 수 있는 것으로 확인되었다. 따라서, 세포-침투성 펩타이드는 효율을 개선하기 위해 화분관 방식에 널리 사용된다.
1) CPP가 함유된 DNA 용액의 제조: CPP (아미노산 서열: RKKRRQRRRRKKRRQRRR, Shanghai Bio-engineering Co., Ltd.에서 합성함) 고체 분말을 멸균수를 사용해 30 mg/ml의 스톡 용액으로 제제화하였다. CCP를, 중량비 1:1의 pZmU3-gRNA-C1 플라스미드 및 pJIT163-Ubi-Cas9 플라스미드 (혼합물에서 pZmU3-gRNA-C1 및 pJIT163-Ubi-Cas9의 중량비는 1:1임) 혼합물에, DNA 및 CPP 최종 농도가 25-30 ㎍/ml (2종의 플라스미드의 합한 최종 농도 = 25-30 ㎍/ml, CPP의 최종 농도 = 25-30 ㎍/ml)이 되도록, 첨가하였다.
2) 야외에서 강한 옥수수 식물 (HiII, B73 및 Zheng 58)을 수여체 물질로서 선택하였다. 개화 후, 이 식물의 암술머리에 봉투를 씌워, 자가-수정 또는 교배-수정을 방지하였다. 적절한 시기에 수동으로 수분시켰다. 수분 후 18-21시간째에, 봉투를 제거하고, 수술대와 포엽을 자르고, 옥수수속 (cob)의 정상부에서 2-3 cm 길이를 유지하였다. 수술대의 절단 섹션은 포엽 보다 약간 낮으며, 수술대와 포엽 사이에 작은 홈이 형성되며, 여기에 단계 1)의 DNA 용액 300-400 ㎕를 파이펫을 사용해 신속하게 점적하였다. 수술대를 DNA 용액으로 젖시고, 암술머리에 봉투를 다시 씌웠다. 각 실험에는 옥수수속 40-50개를 사용하였다. 알곡이 익은 후, 옥수수 속대를 수확하여, 각각 건조시켰다.
3) 건조시킨 종자를 파종하고, ZmIPK 유전자 돌연변이를 발아 후 PCR/RE 방법으로 검출하였다 (구체적인 과정과 사용된 프라이머는 IV에서 볼 수 있음).
여러가지 유전자형의 옥수수 식물에 대해, 화분관 방식을 통한 돌연변이가 입수되었다. 몇몇 돌연변이들의 검출 결과는 도 2-4에 나타내며, 다양한 옥수수 품종들에서 ZmIPK 유전자의 타겟 부위에 돌연변이가 유발되었다. 비-절단 밴드를 회수하여 서열분석하였으며, 서열분석 결과, 삽입/결손 (indel)이 ZmIPK 유전자의 타겟 부위에서 확인되었다. 본 발명에 제공되는 화분관 방식을 통해 완전한 식물 수준에서 돌연변이를 수득할 수 있음을 알 수 있으며, 이는 유전자형 또는 수여체와 독립적이다.
VI. 정단부 재생 방식을 통한 옥수수 내인성 유전자 ZmIPK의 부위-특이적인 편집
1. 옥수수 재료 준비
1) 옥수수 순종 계통 HiII 종자를 삼각형 플라스크에 넣고, 5분간 (v/v) 알코올로, 그리고 30분간 5% (v/v) 염화수소나트륨으로 멸균한 후, 멸균수에서 5회 세척하였다. 1.5 부피의 물을 첨가하고, 플라스크를 밀봉한 다음 28℃에서 4-6시간 인큐베이션하였다.
2) 2차 멸균. 종자를 30분간 5% (v/v) 염화수소나트륨으로 멸균 처리한 다음 멸균수에서 5회 세척하였다.
3) 멸균된 종자를 필터지가 든 멸균처리된 플레이트 위에 놓고, 발아를 위해 3-4일간 암 조건에서 28℃에서 배양하였다. 동시 배양한 발아된 종자들을 MS 배지로 옮겨, 유식물이 4-5 cm가 될 때까지 3-4일간 암 조건에서 28℃에서 배양하였다.
2. 옥수수 정단부의 재생
1) 눈 (bud) 절단: 마디에서 1.5-2 mm 위쪽에서 줄기를 가로로 절단하여, 줄기 내부의 눈을 노출시켰다. 눈을 마디에서 0.2 mm 아래까지 (또는 마디를 관통하여) 중앙에서 길이 방향으로 절단하였다. 뿌리 약 0.8 mm는 유지시켰다.
2) C1 사이트가 포함된 pBUE411-C1 플라스미드를 아그로박테리움 컴피턴트 세포 AGL1에 형질전환하였다. PCR 및 제한효소 절단으로 검증한 후, 양성 균주를 식물 감염용으로 사용하였다.
3) 양성 균주를 LB 고체 배지에 접종하여, 2일간 암 조건에서 28℃에서 배양하였다. 박테리아 일부를 긁어 MS 액체 배지 20 ml에 접종하고, 28℃에서 약 OD600 = 0.8이 될 때까지 배양하였다. 그런 후, 200 μM 아세토시린곤을 첨가하였다.
4) 자른 식물을 절단면을 아래쪽으로 하여 플레이트에 두었다. 플레이트를 진공 디바이스에 비스듬하게 넣고 (30-45℃); 아그로박테리움 식물을 절개부가 잠기도록 첨가하여, 20분간 감염시켰다. 감염 중에, 10분간 압력 0.05 MP로 배기를 실시하였다.
5) 감염 후, 식물을 아그로박테리움 용액에서 꺼내 (식물에 남아있는 과량의 아그로박테리움 용액은 필터지를 사용해 제거함), MS 배지에 넣어 23℃에서 3일간 암 조건에서 배양하였다.
6) 공동-배양한 후, 식물을 꺼내 헹궈 배지를 제거한 다음 포트 (4/5 일반 흙, 상층에 1/5 버미쿨라이트)에 심었다. 식수 후, 유식물을 2일간 암 조건에서 28℃에서, 이후 광 조건에서 7-10일간 생장시킨 다음, 열매가 형성될 때까지 정상 조건에서 재배하였다. 수득된 옥수수 종자를 파종하여, 발아 후 PCR/RE 방법을 통한 ZmIPK 유전자의 돌연변이 유발을 검사하였다.
그 결과, ZmIPK 유전자의 타겟 부위에서 돌연변이가 발생하였다. 비-절단 밴드를 회수하여 서열분석하였다. 서열분석 결과, ZmIPK 유전자에서 삽입/결손 (indel)이 발생되었음을 확인하였다.
VII. 화분관 방식을 통해 수득된 옥수수 돌연변이에서의 pZmU3-gRNA-C1 및 pJIT163-Ubi-Cas9의 존재 확인
2종의 플라스미드를 각각 증폭하기 위해, pZmU3-gRNA-C1 플라스미드 및 pJIT163-Ubi-Cas9 플라스미드의 서열에 따라 2쌍의 프라이머를 설계하였다.
ZmU3 및 타겟 단편 사이에 위치된 ZmU3-F/C1R:
ZmU3-F: 5'- CTGCCAAGATCAACAGCAACCA-3';
C1R: 5'- AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC -3'.
이론적으로, 증폭 단편은 약 322bp이어야 하며, 서열은 서열번호 1의 467-788 위치이어야 한다. 서열번호 1은 pZmU3-gRNA-C1의 서열이다.
pJIT163-Ubi-Cas9 벡터에 위치된 Cas9-1F/ Cas9-1R:
Cas9-1F: 5'- CTTCCCAAGCATTCCCTCCTGT -3';
Cas9-1R: 5'- CTTATGCCGTCCCATGACCTTC -3'.
이론적으로, 증폭 단편은 약 744bp이어야 하며, 서열은 서열번호 2의 1573-2316번 위치이어야 한다. 서열번호 2는 pJIT163-Ubi-Cas9내 Cas9의 서열이다.
식물들 전체에서 타겟 밴드는 증폭되지 않았는데 (도 5), 이는 본 발명이 식물에 부위-특이적인 변형을 수행하였을 때 트랜스유전자의 삽입 또는 운반을 방지하며, 수득되는 돌연변이가 비교적 생물-안전성이 높다는 것을 의미한다.
VIII. 정단부 재생 방식을 통해 수득된 옥수수 돌연변이에서의 pBUE411-C1의 존재 확인
OsU3p 및 Cas9를 각각 증폭하기 위해, pBUE411-C1 플라스미드의 서열에 따라 2개의 프라이머 세트를 설계하였다.
OsU3p와 타겟 단편 사이에 위치된 pBUE411-1F/C1R:
pBUE411-1F: 5'-GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC-3';
C1R: 5'-AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'.
이론적으로, 증폭 단편은 약 289 bp이어야 하며, 서열은 서열번호 2의 174-462번 위치이어야 한다. 서열번호 3은 pBUE411-C1의 gRNA 서열이다.
pBUE411-C1 벡터 상의 Cas9 영역에 위치된 CAS9-2F/ CAS9-2R:
CAS9-2F: 5'- CTCCCTAAGCACTCGCTCCTGT-3';
CAS9-2R: 5'- TTCTGCGTGGTCTGATTCTCCC -3'.
이론적으로, 증폭 단편은 약 794 bp이어야 하며, 서열은 서열번호 4의 1639-2432번 위치이어야 한다. 서열번호 4는 pHSN411-C1의 Cas9 서열이다.
식물들 전체에서 타겟 밴드는 증폭되지 않았는데, 이는 본 발명이 식물에 부위-특이적인 변형을 수행하였을 때 트랜스유전자의 삽입 또는 운반을 방지하며, 수득되는 돌연변이가 비교적 생물-안전성이 높다는 것을 의미한다.
실시예 2. 꽃 침지 방식을 통한 아라비돕시스 내인성 유전자 AtPTPA 의 부위-특이적인 편집
I. 타겟 단편의 설계: 타겟-C2
타겟-C2: 5'-CCGACGATATCCGCCGATTTCAC-3'; (Genbank No. AF360133에 나타낸 유전자 AtPTPA의 351-373번 위치).
II. C2 단편을 가진 pHSN401 플라스미드의 제조
C2는 타겟 C2에 상보적으로 결합할 수 있는 RNA에 대한 DNA 서열이다.
스티키 엔드 (밑줄 침)를 가진 아래 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 합성하였다:
C2F: 5'-ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3';
C2R: 5'-AAACACGATATCCGCCGATTTCAC-3'.
스티키 엔드를 가진 이중 가닥 DNA를 올리고뉴클레오티드 어닐링을 통해 만든 다음 pHSN401 플라스미드내 2개의 BsaI 제한효소 부위 사이에 삽입하여, C2 사이트를 가진 pHSN401 플라스미드를 제조하였다. 이 양성 플라스미드는 서열분석을 통해 검증하였다. pHSN401 플라스미드의 BsaI 제한효소 부위에 정방향으로 5'-ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3'로 표시되는 DNA 단편을 삽입함으로써 수득한 재조합 플라스미드는 양성 대조군이며, 이를 pHSN401-C2로 명명하였다.
III. 아라비돕시스 프로토플라스트로의 gRNA:Cas9 시스템 전달
단계 II에서 수득한 pHSN401-C2 플라스미드를 아라비돕시스 생태형 콜롬비아의 프로토플라스트에 도입하였다. 구체적인 과정은 다음과 같다:
1. 아라비돕시스 유식물의 생장
1) 종자 처리: 아라비돕시스 생태형 콜롬비아의 종자를 1.5 ml 시험관에 넣고, 1분간 75% (v/v) 알코올에 담군 후 15분간 10% (v/v) 염화수소나트륨에 침지한 다음 멸균수로 5-6회 헹구었다.
2) 멸균 처리한 종자를 각각 마이크로파이펫으로 MS 배지 위에 두었다. 플레이트를 밀봉하고, 4℃에서 3-4일간 춘화처리 (vernalization)를 위해 두었다.
3) 춘화처리 후, 플레이트를 인큐베이터로 이동시켜, 다음과 같은 조건에서 배양하였다: 25 ± 2℃, 조도 5500 ± 300 Lx, 12h 명/d. 3주간 배양한 후, 유식물을 식수하였다.
4) 유식물을 3-4일간 필름으로 덮어 둔 흙 (이탄토: 버미쿨라이트: 펄라이트 = 1:1:1)으로 조심스럽게 옮긴 다음 21℃, 6300 ± 300 Lx 하에 생육시켰다.
2. 프로토플라스트의 단리
1) 아라비돕시스 생태형 콜롬비아의 어린 잎 (약 1달 키움)을 취하여, 커터 블레이드를 사용해 0.5 mm 가닥으로 절단하여 효소적 세포분해용 용액 50 ml에 넣어 5시간 분해하였다 (0.5h 효소적 세포분해는 진공 하에 수행한 다음, 10 rpm으로 4.5시간 교반함).
주의: 효소적 세포분해시의 온도는 20-25℃로 유지되어야 하며, 반응은 암 조건에서 수행되어야 하며; 용액은 프로토플라스트를 분리하기 위해 반응 후 부드럽게 교반하여야 한다.
2) 효소적 세포분해 산물에 W5 30 ml을 첨가하여 희석한 다음 75 ㎛ 나일론 필터 막을 이용해 둥근 바닥형 50 ml 원심분리 시험관으로 여과하여 넣었다.
주의: 나일론 필터 막은 75% (부피 퍼센트) 에탄올에 젖신 후 물로 헹군 다음 사용하기 전에 2분간 W5에 담구어야 한다.
3) 5분간 23℃에서 60 g로 원심분리하고, 상층액을 제거하였다.
4) 펠렛을 W5 10 ml로 현탁하여, 5분간 60 g에서 천천히 원심분리한 다음 상층액을 제거하였다.
5) MMG 용액을 적량 첨가하여 프로토플라스트를 현탁한 후, 형질전환할 때까지 얼음 위에 두었다.
주의: 프로토플라스트의 농도는 현미경 (x100)으로 측정하여야 한다. 프로토플라스트의 양은 2 x 105/ml - 1 x 106/ml이었다.
3. 아라비돕시스 프로토플라스트의 형질전환
1) 20 ㎍ pHSN401-C2 플라스미드를 2 ml 원심분리 시험관에 넣었다. 단계 2에서 수득한 프로토플라스트 200 ㎕를 파이펫을 사용해 첨가한 다음 부드럽게 패팅하여 혼합하였다. 그런 후, PEG4000 용액 250 ㎕를 첨가하고, 부드럽게 패팅하여 혼합하였다. 형질전환은 암 조건에서 15-30분간 수행하였다;
2) W5 (실온) 880 ㎕를 첨가하고, 상하 뒤집어 혼합한 다음 5분간 60 g로 원심분리 후 상층액을 제거하였다;
3) W5 용액 1 ml을 첨가하고, 상하 뒤집어 혼합한 다음 내용물을 (W5 용액 1 ml이 미리 첨가된) 6웰 플레이트에 조심하여 이동시킨 다음 밤새 23℃에서 배양하였다.
IV. gRNA:Cas9 시스템에 의한 아라비돕시스 내인성 유전자 AtPTPA의 돌연변이 유발에 대한, PCR/RE 실험을 이용한 분석
아라비돕시스 프로토플라스트 형질전환 후 48시간 경과시, 게놈 DNA를 추출하였으며, 이를 PCR/RE (중합효소 연쇄 반응/제한효소 절단) 실험 분석의 주형으로 사용하였다. PCR/RE 분석 방법은 Shan, Q. et al. Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs. Molecular Plant (2013)를 토대로 하였다. 아라비돕시스 내인성 유전자 AtPTPA (Genbank No. AF360133)의 타겟 단편 (Genbank No. AF360133의 351-373번 위치)이 엔도노클레아제 제한효소 EcoRV의 인지 서열 (5'-GATATC-3')을 가지고 있어, 엔도뉴클레아제 제한효소 EcoRV를 PCR/RE 검사 실험에 이용하였다. PCR 증폭에 사용되는 프라이머는 다음과 같다:
PTPA-F: 5'-　GATGCTCCAGCCACCATATC-3';
PTPA-R: 5'- CAGTTCGGTACACCACTTATATCA-3'.
PCR/RE 실험의 결과는 도 5에서 볼 수 있으며, 그 결과, 돌연변이가 AtPTPA 유전자의 타겟 부위에 유발되었으며, 도 6에서의 비-절단 밴드를 회수하여 서열분석한 결과, AtPTPA 유전자의 타겟 부위에서 삽입/결손 (indel)이 확인되었다.
V. 꽃-침지 방식을 통한 아라비돕시스 내인성 유전자 AtPTPA의 부위-특이적인 편집
1) 아라비돕시스 재료 준비
아라비돕시스 눈을 1차 개화시 제거하여, 가지 형성을 촉진하였다. 장각 (silique)을 꽃-침지에 의한 형질전환 이전에 절단하였다.
2) C2 사이트를 가진 pHSN401-C2 플라스미드를 아그로박테리아 컴피턴트 세포 GV3101로 형질전환하였다. PCR 및 제한효소 절단으로 검증한 후, 양성 균주를 식물 감염용으로 사용하였다.
3) 양성 아그로박테리움 균주를 8-10시간 동안 2 ml 시험관에서 배양한 다음 MS 액체 배지 200 ml로 옮겨 (접종 비율 1:100) 약 OD600 = 0.8-1.0이 될 때까지 밤새 배양하였다. 이를 15분간 원심분리하여 아그로박테리움 세포를 취한 다음 식물 감염을 위해 감염 완충제 (2.16 g/L MgCl2·6 H2O, 5% 슈크로스, 0.02% silwet L-77)에 재현탁하였다.
4) 아라비돕시스 꽃을 감염 완충제 100 ml이 든 큰 플레이트에 2분간 담구고 계속 꽃을 회전시켰다. 감염 후, 식물에 남아있는 과량의 아그로박테리움 용액을 필터지로 제거하였다. 암 조건에서 24시간 배양하기 위해 식물을 검정색 플라스틱 백 또는 필름으로 덮었다. 아라비돕시스는 개화 기간이 비교적 길기 때문에, 통상 2-3회 감염시켜야 한다.
5) 식물을 정상 조건에서 생장시켰다. T1 종자를 수확하여, 재배하였다. 발아 후, AtPTPA 유전자를 PCR/RE 방법으로 검출하였다 (구체적인 과정과 사용된 프라이머는 IV에서 볼 수 있음). 수득한 식물 500주 중 20주는 AtPTPA 유전자의 돌연변이였다. 야생형 아라비돕시스 생태형 콜롬비아를 대조군으로서 설정하였다.
그 결과를 도 7에 나타내며, 그 결과, AtPTPA 유전자의 타겟 부위에서 돌연변이가 발생되었으며, 도 7의 비-절단 밴드를 회수하여 서열분석한 바, 삽입/결손 (indel)이 AtPTPA 유전자의 타겟 부위에서 확인되었다.
6) 수득한 돌연변이 20주에서, 돌연변이에 pHSN401-C2의 존재 유무를 확인하기 위해, PCR 방법을 수행하였다. 증폭을 위해 프라이머 2 세트 (각각 U6-26p 및 Cas9을 타겟팅함)를 설계하였다.
U6-26p와 타겟 단편 사이에 위치된 pHSN401-1F/C2R:
pHSN401-1F: 5'-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3';
C2R: 5'-AAACACGATATCCGCCGATTTCAC-3'.
이론적으로, 증폭되는 단편은 약 286 bp이어야 하며, 서열은 서열번호 5의 170-455번 위치이어야 한다. 서열번호 5는 pHSN401-C2에서 gDNA의 일부 서열이다.
pHSN401-C2 벡터의 Cas9 영역에 위치된 CAS9-2F/ CAS9-2R:
CAS9-2F: 5'- CTCCCTAAGCACTCGCTCCTGT-3';
CAS9-2R: 5'- TTCTGCGTGGTCTGATTCTCCC-3'.
이론적으로, 증폭 단편은 약 794 bp이어야 하며, 서열은 서열번호 4의 1639-2432번 위치이어야 한다. 서열번호 4는 pHSN401-C2의 Cas9 서열이다.
pHSN401-C2 상의 프라이머 pHSN401-1F/C2R을 이용해, 아라비돕시스 AtPTPA 유전자 돌연변이를 증폭한 겔 전기영동 사진은 도 8a에 도시한다. pHSN401-C2 상의 프라이머 CAS9-2F/ CAS9-2R을 이용해, 아라비돕시스 AtPTPA 유전자 돌연변이를 증폭한 겔 전기영동 사진은 도 8b에 도시한다. 5)에서 수득된 아라비돕시스 AtPTPA 유전자 돌연변이들에서는 타겟 밴드가 증폭되지 않았음을 알 수 있는데, 이는 돌연변이에 gDNA:Cas9 시스템의 단편이 존재하지 않는다는 것을 의미한다.
7) 5)에서 수득한 돌연변이 20주의 후대로부터 무작위로 9주를 선별하여 PCR/RE 분석하였으며, 그 결과를 도 9에 나타낸다. 수득한 아라비돕시스 AtPTPA 유전자 돌연변이가 후대에게 안정적으로 전달됨을 알 수 있었다. 즉, 본 발명은 식물에 부위-특이적인 변형을 수행하였을 때 트랜스유전자의 삽입 또는 보유를 방지하여, 형질전환 산물의 안전성에 대한 사회적 문제를 회피할 뿐만 아니라 조직 배양 과정을 생략한다.
SEQUENCE LISTING <110> Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences <120> A method for site-directed modification of whole plant <130> WI931 <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 883 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pZmU3-gRNA-C1 <400> 1 gaattccatc taagtatctt ggtaaagcat ggattaattt ggatgcccac ttcaggtcta 60 tgcagctccg gtgccttgtg attgtgagtt gtgaccgatg ctcatgctat tctgcatttc 120 tgcgatgtat gtagctagta gatcttcaaa actaacaccg catgccatca tcatccactg 180 cttgatttta gtctcaccgc tggccaaaaa tgtgatgatg ccagaaacct caactacctt 240 gaatcaacac gggcccaaca gtgtgatgac gacagaaaca aaaaaaaatg agccaatagt 300 tcagaaggag gcactatgca gaaactacat ttctgaaggt gactaaaagg tgagcgtaga 360 gtgtaattac tagtagttta gccaccatta cccaaatgct ttcgagcttg tattaagatt 420 tcctaagctg agcatcatca ctgatctgca ggccaccctc gcttcgctgc caagatcaac 480 agcaaccatg tggcggcaac atccagcatt gcacatgggc taaagattga gctttgtgcc 540 tcgtctaggg atcagctgag gttatcagtc tttccttttt ttcatccagg tgaggcatca 600 agctactact gcctcgattg gctggacccg aagcccacat gtaggatacc agaatgggcc 660 gacccaggac gcagtatgtt ggccagtccc accggttagt gccatctcgg ttgctcacat 720 gcgtagaagc cagcttaaaa atttagcttt ggtgactcac agcagtcggc ggcgtggtcg 780 agctgtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa 840 aagtggcacc gagtcggtgc tttttttggt accggatcct acg 883 <210> 2 <211> 4206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9 sequence in pJIT163-Ubi-Cas9 <400> 2 atggccccta agaagaagag aaaggtcggt attcacggcg ttcctgcggc gatggacaag 60 aagtatagta ttggtctgga cattgggacg aattccgttg gctgggccgt gatcaccgat 120 gagtacaagg tcccttccaa gaagtttaag gttctgggga acaccgatcg gcacagcatc 180 aagaagaatc tcattggagc cctcctgttc gactcaggcg agaccgccga agcaacaagg 240 ctcaagagaa ccgcaaggag acggtataca agaaggaaga ataggatctg ctacctgcag 300 gagattttca gcaacgaaat ggcgaaggtg gacgattcgt tctttcatag attggaggag 360 agtttcctcg tcgaggaaga taagaagcac gagaggcatc ctatctttgg caacattgtc 420 gacgaggttg cctatcacga aaagtacccc acaatctatc atctgcggaa gaagcttgtg 480 gactcgactg ataaggcgga ccttagattg atctacctcg ctctggcaca catgattaag 540 ttcaggggcc attttctgat cgagggggat cttaacccgg acaatagcga tgtggacaag 600 ttgttcatcc agctcgtcca aacctacaat cagctctttg aggaaaaccc aattaatgct 660 tcaggcgtcg acgccaaggc gatcctgtct gcacgccttt caaagtctcg ccggcttgag 720 aacttgatcg ctcaactccc gggcgaaaag aagaacggct tgttcgggaa tctcattgca 780 ctttcgttgg ggctcacacc aaacttcaag agtaattttg atctcgctga ggacgcaaag 840 ctgcagcttt ccaaggacac ttatgacgat gacctggata accttttggc ccaaatcggc 900 gatcagtacg cggacttgtt cctcgccgcg aagaatttgt cggacgcgat cctcctgagt 960 gatattctcc gcgtgaacac cgagattaca aaggccccgc tctcggcgag tatgatcaag 1020 cgctatgacg agcaccatca ggatctgacc cttttgaagg ctttggtccg gcagcaactc 1080 ccagagaagt acaaggaaat cttctttgat caatccaaga acggctacgc tggttatatt 1140 gacggcgggg catcgcagga ggaattctac aagtttatca agccaattct ggagaagatg 1200 gatggcacag aggaactcct ggtgaagctc aatagggagg accttttgcg gaagcaaaga 1260 actttcgata acggcagcat ccctcaccag attcatctcg gggagctgca cgccatcctg 1320 agaaggcagg aagacttcta cccctttctt aaggataacc gggagaagat cgaaaagatt 1380 ctgacgttca gaattccgta ctatgtcgga ccactcgccc ggggtaattc cagatttgcg 1440 tggatgacca gaaagagcga ggaaaccatc acaccttgga acttcgagga agtggtcgat 1500 aagggcgctt ccgcacagag cttcattgag cgcatgacaa attttgacaa gaacctgcct 1560 aatgagaagg tccttcccaa gcattccctc ctgtacgagt atttcactgt ttataacgaa 1620 ctcacgaagg tgaagtatgt gaccgaggga atgcgcaagc ccgccttcct gagcggcgag 1680 caaaagaagg cgatcgtgga ccttttgttt aagaccaatc ggaaggtcac agttaagcag 1740 ctcaaggagg actacttcaa gaagattgaa tgcttcgatt ccgttgagat cagcggcgtg 1800 gaagacaggt ttaacgcgtc actggggact taccacgatc tcctgaagat cattaaggat 1860 aaggacttct tggacaacga ggaaaatgag gatatcctcg aagacattgt cctgactctt 1920 acgttgtttg aggataggga aatgatcgag gaacgcttga agacgtatgc ccatctcttc 1980 gatgacaagg ttatgaagca gctcaagaga agaagataca ccggatgggg aaggctgtcc 2040 cgcaagctta tcaatggcat tagagacaag caatcaggga agacaatcct tgactttttg 2100 aagtctgatg gcttcgcgaa caggaatttt atgcagctga ttcacgatga ctcacttact 2160 ttcaaggagg atatccagaa ggctcaagtg tcgggacaag gtgacagtct gcacgagcat 2220 atcgccaacc ttgcgggatc tcctgcaatc aagaagggta ttctgcagac agtcaaggtt 2280 gtggatgagc ttgtgaaggt catgggacgg cataagcccg agaacatcgt tattgagatg 2340 gccagagaaa atcagaccac acaaaagggt cagaagaact cgagggagcg catgaagcgc 2400 atcgaggaag gcattaagga gctggggagt cagatcctta aggagcaccc ggtggaaaac 2460 acgcagttgc aaaatgagaa gctctatctg tactatctgc aaaatggcag ggatatgtat 2520 gtggaccagg agttggatat taaccgcctc tcggattacg acgtcgatca tatcgttcct 2580 cagtccttcc ttaaggatga cagcattgac aataaggttc tcaccaggtc cgacaagaac 2640 cgcgggaagt ccgataatgt gcccagcgag gaagtcgtta agaagatgaa gaactactgg 2700 aggcaacttt tgaatgccaa gttgatcaca cagaggaagt ttgataacct cactaaggcc 2760 gagcgcggag gtctcagcga actggacaag gcgggcttca ttaagcggca actggttgag 2820 actagacaga tcacgaagca cgtggcgcag attctcgatt cacgcatgaa cacgaagtac 2880 gatgagaatg acaagctgat ccgggaagtg aaggtcatca ccttgaagtc aaagctcgtt 2940 tctgacttca ggaaggattt ccaattttat aaggtgcgcg agatcaacaa ttatcaccat 3000 gctcatgacg catacctcaa cgctgtggtc ggaacagcat tgattaagaa gtacccgaag 3060 ctcgagtccg aattcgtgta cggtgactat aaggtttacg atgtgcgcaa gatgatcgcc 3120 aagtcagagc aggaaattgg caaggccact gcgaagtatt tcttttactc taacattatg 3180 aatttcttta agactgagat cacgctggct aatggcgaaa tccggaagag accacttatt 3240 gagaccaacg gcgagacagg ggaaatcgtg tgggacaagg ggagggattt cgccacagtc 3300 cgcaaggttc tctctatgcc tcaagtgaat attgtcaaga agactgaagt ccagacgggc 3360 gggttctcaa aggaatctat tctgcccaag cggaactcgg ataagcttat cgccagaaag 3420 aaggactggg acccgaagaa gtatggaggt ttcgactcac caacggtggc ttactctgtc 3480 ctggttgtgg caaaggtgga gaagggaaag tcaaagaagc tcaagtctgt caaggagctc 3540 ctgggtatca ccattatgga gaggtccagc ttcgaaaaga atccgatcga ttttctcgag 3600 gcgaagggat ataaggaagt gaagaaggac ctgatcatta agcttccaaa gtacagtctt 3660 ttcgagttgg aaaacggcag gaagcgcatg ttggcttccg caggagagct ccagaagggt 3720 aacgagcttg ctttgccgtc caagtatgtg aacttcctct atctggcatc ccactacgag 3780 aagctcaagg gcagcccaga ggataacgaa cagaagcaac tgtttgtgga gcaacacaag 3840 cattatcttg acgagatcat tgaacagatt tcggagttca gtaagcgcgt catcctcgcc 3900 gacgcgaatt tggataaggt tctctcagcc tacaacaagc accgggacaa gcctatcaga 3960 gagcaggcgg aaaatatcat tcatctcttc accctgacaa accttggggc tcccgctgca 4020 ttcaagtatt ttgacactac gattgatcgg aagagataca cttctacgaa ggaggtgctg 4080 gatgcaaccc ttatccacca atcgattact ggcctctacg agacgcggat cgacttgagt 4140 cagctcgggg gggataagag accagcggca accaagaagg caggacaagc gaagaagaag 4200 aagtag 4206 <210> 3 <211> 544 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA sequence of pBUE411-C1 <400> 3 agtaattcat ccaggtctcc aagttctagg attttcagaa ctgcaactta ttttatcaag 60 gaatctttaa acatacgaac agatcactta aagttcttct gaagcaactt aaagttatca 120 ggcatgcatg gatcttggag gaatcagatg tgcagtcagg gaccatagca caagacaggc 180 gtcttctact ggtgctacca gcaaatgctg gaagccggga acactgggta cgttggaaac 240 cacgtgatgt gaagaagtaa gataaactgt aggagaaaag catttcgtag tgggccatga 300 agcctttcag gacatgtatt gcagtatggg ccggcccatt acgcaattgg acgacaacaa 360 agactagtat tagtaccacc tcggctatcc acatagatca aagctgattt aaaagagttg 420 tgcagatgat ccgtggcggt cggcggcgtg gtcgagctgt tttagagcta gaaatagcaa 480 gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 540 tttt 544 <210> 4 <211> 4272 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9 sequence of pHSN411-C1 <400> 4 atggattaca aggaccacga cggggattac aaggaccacg acattgatta caaggatgat 60 gatgacaaga tggctccgaa gaagaagagg aaggttggca tccacggggt gccagctgct 120 gacaagaagt actcgatcgg cctcgatatt gggactaact ctgttggctg ggccgtgatc 180 accgacgagt acaaggtgcc ctcaaagaag ttcaaggtcc tgggcaacac cgatcggcat 240 tccatcaaga agaatctcat tggcgctctc ctgttcgaca gcggcgagac ggctgaggct 300 acgcggctca agcgcaccgc ccgcaggcgg tacacgcgca ggaagaatcg catctgctac 360 ctgcaggaga ttttctccaa cgagatggcg aaggttgacg attctttctt ccacaggctg 420 gaggagtcat tcctcgtgga ggaggataag aagcacgagc ggcatccaat cttcggcaac 480 attgtcgacg aggttgccta ccacgagaag taccctacga tctaccatct gcggaagaag 540 ctcgtggact ccacagataa ggcggacctc cgcctgatct acctcgctct ggcccacatg 600 attaagttca ggggccattt cctgatcgag ggggatctca acccggacaa tagcgatgtt 660 gacaagctgt tcatccagct cgtgcagacg tacaaccagc tcttcgagga gaaccccatt 720 aatgcgtcag gcgtcgacgc gaaggctatc ctgtccgcta ggctctcgaa gtctcggcgc 780 ctcgagaacc tgatcgccca gctgccgggc gagaagaaga acggcctgtt cgggaatctc 840 attgcgctca gcctggggct cacgcccaac ttcaagtcga atttcgatct cgctgaggac 900 gccaagctgc agctctccaa ggacacatac gacgatgacc tggataacct cctggcccag 960 atcggcgatc agtacgcgga cctgttcctc gctgccaaga atctgtcgga cgccatcctc 1020 ctgtctgata ttctcagggt gaacaccgag attacgaagg ctccgctctc agcctccatg 1080 atcaagcgct acgacgagca ccatcaggat ctgaccctcc tgaaggcgct ggtcaggcag 1140 cagctccccg agaagtacaa ggagatcttc ttcgatcagt cgaagaacgg ctacgctggg 1200 tacattgacg gcggggcctc tcaggaggag ttctacaagt tcatcaagcc gattctggag 1260 aagatggacg gcacggagga gctgctggtg aagctcaatc gcgaggacct cctgaggaag 1320 cagcggacat tcgataacgg cagcatccca caccagattc atctcgggga gctgcacgct 1380 atcctgagga ggcaggagga cttctaccct ttcctcaagg ataaccgcga gaagatcgag 1440 aagattctga ctttcaggat cccgtactac gtcggcccac tcgctagggg caactcccgc 1500 ttcgcttgga tgacccgcaa gtcagaggag acgatcacgc cgtggaactt cgaggaggtg 1560 gtcgacaagg gcgctagcgc tcagtcgttc atcgagagga tgacgaattt cgacaagaac 1620 ctgccaaatg agaaggtgct ccctaagcac tcgctcctgt acgagtactt cacagtctac 1680 aacgagctga ctaaggtgaa gtatgtgacc gagggcatga ggaagccggc tttcctgtct 1740 ggggagcaga agaaggccat cgtggacctc ctgttcaaga ccaaccggaa ggtcacggtt 1800 aagcagctca aggaggacta cttcaagaag attgagtgct tcgattcggt cgagatctct 1860 ggcgttgagg accgcttcaa cgcctccctg gggacctacc acgatctcct gaagatcatt 1920 aaggataagg acttcctgga caacgaggag aatgaggata tcctcgagga cattgtgctg 1980 acactcactc tgttcgagga ccgggagatg atcgaggagc gcctgaagac ttacgcccat 2040 ctcttcgatg acaaggtcat gaagcagctc aagaggagga ggtacaccgg ctgggggagg 2100 ctgagcagga agctcatcaa cggcattcgg gacaagcagt ccgggaagac gatcctcgac 2160 ttcctgaaga gcgatggctt cgcgaaccgc aatttcatgc agctgattca cgatgacagc 2220 ctcacattca aggaggatat ccagaaggct caggtgagcg gccaggggga ctcgctgcac 2280 gagcatatcg cgaacctcgc tggctcgcca gctatcaaga aggggattct gcagaccgtg 2340 aaggttgtgg acgagctggt gaaggtcatg ggcaggcaca agcctgagaa catcgtcatt 2400 gagatggccc gggagaatca gaccacgcag aagggccaga agaactcacg cgagaggatg 2460 aagaggatcg aggagggcat taaggagctg gggtcccaga tcctcaagga gcacccggtg 2520 gagaacacgc agctgcagaa tgagaagctc tacctgtact acctccagaa tggccgcgat 2580 atgtatgtgg accaggagct ggatattaac aggctcagcg attacgacgt cgatcatatc 2640 gttccacagt cattcctgaa ggatgactcc attgacaaca aggtcctcac caggtcggac 2700 aagaaccggg gcaagtctga taatgttcct tcagaggagg tcgttaagaa gatgaagaac 2760 tactggcgcc agctcctgaa tgccaagctg atcacgcagc ggaagttcga taacctcaca 2820 aaggctgaga ggggcgggct ctctgagctg gacaaggcgg gcttcatcaa gaggcagctg 2880 gtcgagacac ggcagatcac taagcacgtt gcgcagattc tcgactcacg gatgaacact 2940 aagtacgatg agaatgacaa gctgatccgc gaggtgaagg tcatcaccct gaagtcaaag 3000 ctcgtctccg acttcaggaa ggatttccag ttctacaagg ttcgggagat caacaattac 3060 caccatgccc atgacgcgta cctgaacgcg gtggtcggca cagctctgat caagaagtac 3120 ccaaagctcg agagcgagtt cgtgtacggg gactacaagg tttacgatgt gaggaagatg 3180 atcgccaagt cggagcagga gattggcaag gctaccgcca agtacttctt ctactctaac 3240 attatgaatt tcttcaagac agagatcact ctggccaatg gcgagatccg gaagcgcccc 3300 ctcatcgaga cgaacggcga gacgggggag atcgtgtggg acaagggcag ggatttcgcg 3360 accgtcagga aggttctctc catgccacaa gtgaatatcg tcaagaagac agaggtccag 3420 actggcgggt tctctaagga gtcaattctg cctaagcgga acagcgacaa gctcatcgcc 3480 cgcaagaagg actgggatcc gaagaagtac ggcgggttcg acagccccac tgtggcctac 3540 tcggtcctgg ttgtggcgaa ggttgagaag ggcaagtcca agaagctcaa gagcgtgaag 3600 gagctgctgg ggatcacgat tatggagcgc tccagcttcg agaagaaccc gatcgatttc 3660 ctggaggcga agggctacaa ggaggtgaag aaggacctga tcattaagct ccccaagtac 3720 tcactcttcg agctggagaa cggcaggaag cggatgctgg cttccgctgg cgagctgcag 3780 aaggggaacg agctggctct gccgtccaag tatgtgaact tcctctacct ggcctcccac 3840 tacgagaagc tcaagggcag ccccgaggac aacgagcaga agcagctgtt cgtcgagcag 3900 cacaagcatt acctcgacga gatcattgag cagatttccg agttctccaa gcgcgtgatc 3960 ctggccgacg cgaatctgga taaggtcctc tccgcgtaca acaagcaccg cgacaagcca 4020 atcagggagc aggctgagaa tatcattcat ctcttcaccc tgacgaacct cggcgcccct 4080 gctgctttca agtacttcga cacaactatc gatcgcaaga ggtacacaag cactaaggag 4140 gtcctggacg cgaccctcat ccaccagtcg attaccggcc tctacgagac gcgcatcgac 4200 ctgtctcagc tcgggggcga caagcggcca gcggcgacga agaaggcggg gcaggcgaag 4260 aagaagaagt ga 4272 <210> 5 <211> 487 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> partial gDNA sequence of pHSN401-C2 <400> 5 aagcttcgac ttgccttccg cacaatacat catttcttct tagctttttt tcttcttctt 60 cgttcataca gttttttttt gtttatcagc ttacattttc ttgaaccgta gctttcgttt 120 tcttcttttt aactttccat tcggagtttt tgtatcttgt ttcatagttt gtcccaggat 180 tagaatgatt aggcatcgaa ccttcaagaa tttgattgaa taaaacatct tcattcttaa 240 gatatgaaga taatcttcaa aaggcccctg ggaatctgaa agaagagaag caggcccatt 300 tatatgggaa agaacaatag tatttcttat ataggcccat ttaagttgaa aacaatcttc 360 aaaagtccca catcgcttag ataagaaaac gaagctgagt ttatatacag ctagagtcga 420 agtagtgatt ggtgaaatcg gcggatatcg tgttttagag ctagaaatag caagttaaaa 480 taaggct 487

Claims (16)

  1. 완전한 식물 (whole plant)에서 타겟 유전자의 타겟 단편에 부위-특이적인 변형을 수행하는 방법으로서,
    상기 식물에서 서열-특이적인 뉴클레아제 (sequence-specific nuclease)를 일시적으로 발현시키는 단계를 포함하며,
    상기 완전한 식물이 일시적인 발현을 위한 대상으로서 사용되며, 상기 서열-특이적인 뉴클레아제가 상기 타겟 단편을 타겟팅하여 절단하며, 이로써 상기 부위-특이적인 변형이 상기 식물의 자가 DNA 복구 (self DNA repairing)를 통해 달성되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 식물에서 상기 부위-특이적인 뉴클레아제를 일시적으로 발현시키는 방법이,
    a) 상기 식물에, 상기 서열-특이적인 뉴클레아제 또는 상기 서열-특이적인 뉴클레아제를 발현하기 위한 유전 물질 (genetic material)을 전달하는 단계;
    b) 단계 a)에서 수득되는 식물을 선택압이 없는 조건에서 배양하고, 이로써 식물 염색체에 병합되지 않은 상기 서열-특이적인 뉴클레아제 또는 상기 유전 물질은 분해되는, 단계를 포함하며,
    상기 유전 물질이 재조합 벡터 또는 DNA 선형 단편 또는 시험관내에서 전사된 RNA인, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 서열-특이적인 뉴클레아제 또는 상기 유전 물질이, 상기 서열-특이적인 뉴클레아제 또는 상기 유전 물질을 전달하기 위해 사용될 수 있는 임의의 식물의 부위를 통해 전달되는, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    전달되는 상기 식물의 부위가 화분관 (pollen tube), 꽃 (inflorescene), 정단부 (shoot apex), 씨방, 잎 또는 전달에 적합한 완전한 식물의 다른 부위인, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 식물의 부위가 화분관인 경우, 상기 전달은 상기 재조합 벡터 또는 DNA 선형 단편 또는 시험관내 전사된 RNA가 함유된 용액 또는 상기 서열-특이적인 뉴클레아제가 함유된 용액을 수분 (pollination) 후 암술머리에 주입함으로써 수행되고;
    상기 식물의 부위가 꽃인 경우, 상기 전달은 상기 재조합 벡터 또는 DNA 선형 단편을 운반하는 아그로박테리움 투메팍시엔스 (Agrobaterium tumefaciens) 용액에 꽃을 침지함으로써 수행되고;
    상기 식물의 부위가 정단부인 경우, 상기 전달은 상기 재조합 벡터 또는 DNA 선형 단편을 운반하는 아그로박테리움 투메팍시엔스 (Agrobaterium tumefaciens) 용액에 정단부를 침지함으로써 수행되고;
    상기 식물의 부위가 씨방인 경우, 상기 전달은 상기 재조합 벡터 또는 DNA 선형 단편 또는 시험관내 전사된 RNA가 함유된 용액 또는 상기 서열-특이적인 뉴클레아제가 함유된 용액을 수분 후 씨방에 주입하거나, 또는 상기 재조합 벡터 또는 DNA 선형 단편을 운반하는 아그로박테리움 투메팍시엔스 (Agrobaterium tumefaciens) 용액을 수분 후 씨방에 주입함으로써 수행되고;
    상기 식물의 부위가 잎인 경우, 상기 전달은 상기 재조합 벡터 또는 DNA 선형 단편을 운반하는 아그로박테리움 투메팍시엔스 (Agrobaterium tumefaciens) 용액을 잎에 주입함으로써 수행되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 서열-특이적인 뉴클레아제가 CRISPR/Cas9 뉴클레아제, TALEN 뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제 또는 그외 게놈 편집을 달성할 수 있는 뉴클레아제이고,
    상기 서열-특이적인 뉴클레아제가 CRISPR/Cas9 뉴클레아제인 경우, 상기 유전 물질은 가이드 RNA를 전사하고 Cas9 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터 또는 DNA 단편으로 구성되거나; 또는 가이드 RNA를 전사할 수 있는 재조합 벡터 또는 DNA 단편과 Csa9 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터 또는 DNA 단편 또는 RNA로 구성되거나; 또는 Cas9 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터 또는 DNA 단편 또는 RNA와 가이드 RNA로 구성되고; 상기 가이드 RNA가 crRNA와 tracrRNA 간에 일부 염기-쌍 형성에 의해 형성되는 회문 구조 (palindromic structure)를 가진 RNA이고; 상기 crRNA가 상기 타겟 단편에 상보적으로 결합할 수 있는 RNA 단편을 포함하며;
    상기 서열-특이적인 뉴클레아제가 TALEN 뉴클레아제인 경우, 상기 유전 물질은 쌍을 형성한 TALEN 단백질 (paired TALEN protein)을 발현할 수 있는 재조합 벡터 또는 DNA 단편 또는 RNA이고, 상기 TALEN 단백질은 상기 타겟 부위를 인지하여 결합할 수 있는 DNA 결합 도메인과 FokI 도메인으로 구성되며;
    상기 서열-특이적인 뉴클레아제가 징크 핑거 뉴클레아제인 경우, 상기 유전 물질은 쌍을 형성한 ZFN 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터 또는 DNA 단편 또는 RNA이고, 상기 ZFN 단백질은 상기 타겟 부위를 인지하여 결합할 수 있는 DNA 결합 도메인과 FokI 도메인으로 구성되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 부위-특이적인 변형이 상기 타겟 단편에서의 삽입, 결손 및/또는 치환 돌연변이인, 방법.
  8. 타겟 유전자에서 유전자의 기능 상실을 달성하기 위해 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용해 대상 식물에서 타겟 유전자의 타겟 단편에 부위-특이적인 변형을 수행함으로써 수득되는, 트랜스유전자-무함유성 돌연변이 식물 (transgene-free mutant plant) 및/또는 이의 후대.
  9. 트랜스유전자-무함유성 돌연변이 식물의 제조 방법으로서,
    대상 식물에서 타겟 유전자의 타겟 단편에 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용해 부위-특이적인 변형을 수행하여, 타겟 유전자의 기능은 상실되고 게놈에 병합된 외인성 유전자가 존재하지 않는 식물을 수득하는 단계를 포함하는, 트랜스유전자-무함유성 돌연변이 식물의 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물이 임의 유전자형의 식물인, 방법 또는 트랜스유전자-무함유성 돌연변이 식물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물이 옥수수, 밀, 대두, 목화, 담배, 아라비돕시스, 호밀, 로사 록스부르기 (Rosa roxbunghii), 에리오보트리아 자포니카 (Eriobotrya japonica), 카리카 파파야 (Carica papaya), 로사 카니나 (Rosa canina), 덴드로비움 노빌 린들. (Dendrobium nobile Lindl.), 브라시카 올레라케아 (Brassica oleracea), 파고피룸 타타리컴 (Fagopyrum tataricum) 및 헤베아 브라실리엔시스 (Hevea brasiliensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법 또는 트랜스유전자-무함유성 돌연변이 식물.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물은 옥수수이고; 상기 서열-특이적인 뉴클레아제는 CRISPR/Cas9 뉴클레아제이고; 상기 타겟 유전자는 ZmIPK인, 방법 또는 트랜스유전자-무함유성 돌연변이 식물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 타겟 단편은 5'-AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'이고; 상기 가이드 RNA를 전사하기 위한 재조합 벡터는 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3'의 DNA 단편을 플라스미드 pZmU3-gRNA의 2개의 BbsI 제한효소 부위 사이에 삽입함으로써 수득되고; CRISPR/Cas9 뉴클레아제를 발현하기 위한 재조합 벡터는 pJIT163-Ubi-Cas9인, 방법 또는 트랜스유전자-무함유성 돌연변이 식물.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 타겟 단편은 5'-AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'이고; 상기 가이드 RNA를 전사하고 CRISPR/Cas9 뉴클레아제를 발현하기 위한 재조합 벡터는 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3'의 DNA 단편을 플라스미드 pBUE411의 2개의 BsaI 제한효소 부위 사이에 삽입함으로써 수득되는, 방법 또는 트랜스유전자-무함유성 돌연변이 식물.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물은 아라비돕시스이고; 상기 서열-특이적인 뉴클레아제는 CRISPR/Cas9 뉴클레아제이고;타겟 유전자는 AtPTPA인, 방법 또는 트랜스유전자-무함유성 돌연변이 식물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 타겟 단편은 5'-AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'이고; 상기 가이드 RNA를 전사하고 CRISPR/Cas9 뉴클레아제를 발현하기 위한 재조합 벡터는 DNA 단편 5'- ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3'를 플라스미드 pHSN401의 2개의 BsaI 제한효소 부위 사이에 삽입함으로써 수득되는, 방법 또는 트랜스유전자-무함유 돌연변이 식물.
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