CN111647620A - 一种菜薹非转基因突变株的创制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种菜薹非转基因突变株的创制方法。本发明所提供的创制白菜非转基因突变株的方法，是通过将CRISPR/Cas9技术与白菜原位转化技术相结合实现的，具体包括如下步骤：将携带有靶向白菜基因组中目标基因的sgRNA编码序列的CRIPSR/Cas9基因编辑载体通过真空渗入原位转化的方法导入受体白菜。本发明在2032粒种子中获得了两粒PDS等位基因敲除，率先通过不依赖于组织培养的原位转化技术获得非转基因编辑突变株。编辑效率较之前报道的原位转基因效率大大提高，也为转基因安全和无标记基因编辑提供了一个很好的研究思路。

Description

一种菜薹非转基因突变株的创制方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种菜薹非转基因突变株的创制方法。
背景技术
由于食品安全和基因漂移的问题，转基因安全性一直被人们关注。而CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术可以替代传统的转基因技术而获得非转基因改良材料。通常可以通过对转基因后代有性繁殖和标记选择去除掉含Cas9/sgRNA的外源载体，并保留编辑突变的方法获得安全的非转基因改良材料。同时CRISPR/Cas9技术也提供了无需后代分离而直接获得非转基因突变株的可能。包括农杆菌介导的CRISPR/Cas9瞬时表达(Chen et al.,2018；Iaffaldano et al.,2016)，Cas9/gRNA复合体(RNP)转染(Woo et al.,2015；Murovec etal.,2018；Park et al.,2019)等，但都依赖于组织培养和离体再生。
白菜作为主要蔬菜作物，其转化技术研究进展缓慢，主要由于它的外植体出芽困难，转化效率低。农杆菌介导的浸花(floral-dip)转化方法是一种较简便的不依赖于组织培养的转基因方法。该方法的优点在于可以避开组织培养和离体再生，直接获得转基因的种子，方法简单，省时省力。近年来，很多学者利用原位转化的方法对白菜进行转基因研究，取得了一些可喜进展。曹鸣庆(2000)通过真空渗入法对不结球白菜成功进行转化；严继勇(2003)采用微注射的方法对小白菜进行了转化；另外张广辉(1998)，严继勇(2004)，于占东(2007)通过真空渗入的方法对大白菜成功进行了转化，但转化效率低，多在0.01％左右。菜薹(Brassica campestris L.ssp.chinensis)为不结球白菜类型中以幼嫩花茎为主要食用器官的一个常规栽培品种，播种至产品收获需约40-60天，是研究白菜类蔬菜原位转化技术的好材料。
目前虽有白菜遗传转化和CRISPR/Cas9基因编辑体系建立相关报道，但是尚未有将原位转化和CRISPR/Cas9技术相结合创制白菜非转基因突变株的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种菜薹非转基因突变株的创制方法。
本发明所提供的创制白菜非转基因突变株的方法，是通过将CRISPR/Cas9技术与白菜原位转化技术相结合实现的。
进一步地，所述方法可包括如下步骤：将携带有靶向白菜基因组中目标基因的sgRNA编码序列的CRIPSR/Cas9基因编辑载体通过真空渗入原位转化的方法导入受体白菜。
更进一步地，所述方法可包括如下步骤：
(A1)将携带有靶向白菜基因组中目标基因的sgRNA编码序列的CRIPSR/Cas9基因编辑载体导入农杆菌，得到重组农杆菌。
(A2)待受体白菜进入初花期时，按照如下进行浸花处理：将花蕾浸没在所述重组农杆菌的重悬液中，于100-105Pa(如104Pa)负压条件下真空处理10分钟。
其中，将花蕾浸没在所述重组农杆菌的重悬液中，具体可按照如下进行：将要开放的花蕾用镊子拨开，浸花时将枝条弯曲，使整个花序浸泡在所述重组农杆菌的重悬液。
(A3)从经过(A2)浸花处理的所述受体白菜最终所结种子中即可获得所述目标基因被敲除的非转基因突变株。
在将所述受体白菜进行所述浸花处理前还可包括前一天给所述受体白菜浇透水的步骤。
在将所述受体白菜进行所述浸花处理前还可包括去除已开放的花和角果的步骤。
所述重组农杆菌的重悬液的OD600为0.05。所述重组农杆菌的重悬液具体可为：将所述重组农杆菌在1/2MS(含5％(即5g/100mL)蔗糖、0.05％体积百分含量Silwet L-77)中悬浮至OD600＝0.05。
在本发明具体实施方式中，所述农杆菌为根癌农杆菌，具体为根癌农杆菌C58。
在将花蕾浸没在所述重组农杆菌的悬浮液中，于100-105Pa(如104Pa)负压条件下真空处理10分钟的过程中，中间停顿一次(可在5分钟时停顿，待气压缓慢减至常压后，再次加压，更有利于植株处于易接受菌液侵入的状态)。然后关闭真空泵，缓缓打开空气阀门，恢复常压将植株取出。
在将所述受体白菜进行所述浸花处理后还可包括如下步骤：取未经浸花处理的所述受体白菜的成熟花粉对经过浸花处理的所述受体白菜进行辅助授粉。
进行所述辅助授粉后还可包括如下步骤：用有孔的保鲜袋将处理完的花序套住，遮银灰膜，次日揭下保鲜袋，用硫酸钠纸袋套住花序，于终花期将花序上的纸袋取下。
在本发明的具体实施方式中，所述CRIPSR/Cas9基因编辑载体为pHSE401-Bar载体。所述pHSE401-Bar载体为将pHSE401载体中的标记基因Hyg改造为Bar基因后得到的载体。
在所述方法中，所述白菜可为不结球白菜。
进一步地，所述不结球白菜可为菜薹。
在本发明的具体实施方式中，所述白菜具体为菜薹品种“四九菜心”。
在本发明的具体实施方式中，所述目标基因为八氢番茄红素脱氢酶基因。
相应的，所述靶向白菜基因组中目标基因的sgRNA编码序列中的特异性识别序列(对应于spacer)如SEQ ID No.1所示。所述携带有靶向白菜基因组中目标基因的sgRNA编码序列的CRIPSR/Cas9基因编辑载体为将pHSE401-Bar载体的两个BsaI位点之间的小片段替换为SEQ ID No.1所示DNA片段后得到的重组载体。所述pHSE401-Bar载体为将pHSE401载体中的标记基因Hyg改造为Bar基因后得到的载体。
本发明在真空介导的白菜原位转化技术的基础上，借鉴和改良转化技术。获得了2032粒拟通过CRISPR/Cas9***(编辑载体上携带有Bar基因)敲除番茄红素脱氢酶基因PDS(phytoene desaturase)编码基因的菜薹“四九菜心”的种子。T0代种子播种开始，分别进行了表型观察、Basta蛋白试纸条检测和PDS基因测序。结果显示2株表现矮小白化(PDS基因敲除的表型)的植株Basta蛋白试纸条检测为阴性,PCR扩增未检测到外源载体序列，但PDS基因测序验证在靶点区域发生了碱基缺失突变造成PDS基因提前终止敲除，且没有保留野生型PDS基因。本实验通过原位转化在菜薹中基因编辑敲除成功的事例表明：转化载体并未整合到植物基因组DNA中，但在宿主细胞中发生了瞬时表达，达到了基因编辑的结果。在2032粒种子中获得了两粒PDS等位基因敲除，率先通过不依赖于组织培养的原位转化技术获得非转基因编辑突变株。编辑效率较之前报道的原位转基因效率大大提高，也为无标记基因编辑提供了一个很好的研究思路。
附图说明
图1为菜薹PDS基因编辑敲除载体构建和原位转化植株鉴定。a:“四九菜心”PDS基因的前四个外显子序列，不同颜色背景代表不同外显子，gRNA在第一个外显子末端，用下划线标出，红色字体的三个碱基为PAM区。b:pHSE401-Bar-PDS转化载体左右边界间示意图。gRNA由U6-26启动子启动转录，含有Bar植物筛选标记基因。c:2032颗苗中有两株一直弱小白化。d:白化苗PDS基因目标区段PCR测序结果显示在gRNA靶点区发生序列多样性变异。e:对PCR产物进行单克隆测序，两株白化苗在PDS靶点区产生的不同突变类型。
图2为Basta蛋白试纸检测结果。a:Basta蛋白试纸灵敏度检测，CK1为非转化正常株，呈阴性反应；CK2为一株鉴定的转化苗，呈阳性反应；20,40,80分别是1株阳性苗与19、39、79株非转化苗的混合液，均呈阳性反应。b:原位转化2032颗幼苗中部分试纸检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及到的菜薹早熟品种“四九菜心”：禾之元种业有限公司产品。
下述实施例中所涉及到的pHSE401载体：Addgene公司产品，货号62201。
实施例1、创制白菜非转基因突变株
PDS基因(八氢番茄红素脱氢酶基因)的敲除可以造成植株白化，作为可视性标记常被用于基因编辑研究。本发明在前期成功获得菜薹原位转化苗的基础上开展菜薹的原位转化基因编辑技术研究。
一、材料与方法
1、材料
本发明受体材料为菜薹早熟品种“四九菜心”原产于中国南方，播种到收获约40-50天。在温室的花盆里播种。约30天左右现蕾开花，开花植物高约50厘米，可方便地放置在真空处理罐中。
根癌农杆菌C58。
CRIPSR/Cas9基因编辑载体pHSE401-Bar，是将pHSE401载体中的选择标记Hyg改造为在芸薹属蔬菜中比较适用的Bar基因后所得的载体。原pHSE401载体通过EcoRI和AsiSI酶切回收约15kb的大片段，再与合成的两头含有EcoRI和AsiSI酶切位点的SEQ ID No.2连接。其中，SEQ ID No.2的第126-803位为35S启动子，第890-1442位为Bar基因。
2、方法
(1)CRIPSR/Cas9基因编辑重组载体构建
根据“四九菜心”PDS基因的结构和序列在第一个外显子上选取靶点，靶序列如下：
5’-AACGAGAAGAAGCAAGCCT-3’(SEQ ID No.1)。
针对上述靶序列设计一对带接头的互补核苷酸引物：
PDS-F：5’-ATTGAACGAGAAGAAGCAAGCCT-3’；
PDS-R：5’-AAACAGGCTTGCTTCTTCTCGTT-3’。
等体积100μmol/L正向和反向引物混合，在95℃下孵育5分钟，并且缓慢冷却至室温，获得双链互补并带有BsaI粘性末端的DNA片段。然后将该DNA片段与pHSE401-Bar通过BsaI和T4连接酶酶切和连接，并对构建好的载体pHSE401-Bar-PDS进行测序验证。
(2)农杆菌重悬液的制备
携带pHSE401-Bar-PDS质粒的C58菌株在加入了Rif(25mg/L)和Kana(50mg/L)的YEB培养基上划线培养单菌落。挑取单菌落至加入Rif(25mg/L)和Kana(50mg/L)的液体YEB培养基20ml中培养过夜，待菌液浑浊后移入200ml培养基中进行扩大培养。待菌液OD600达到1.0左右时，4000rpm离心15min收集菌体。将菌体在1/2MS(含5％(即5g/100mL)蔗糖、0.05％体积百分含量Silwet L-77)中悬浮至OD600＝0.05，悬浮液倒入烧杯中备用。
(3)真空渗入原位转化方法
待植株进入初花期，绝大部分花蕾处于含苞未放可拨蕾授粉是进行真空处理浸花转化。浸花前一天给实验材料浇透水，浸花前除去已开放的花和角果，将要开放的花蕾用镊子拨开。浸花时将枝条弯曲，使整个花序浸泡在农杆菌重悬液中，在104pa负压条件下真空处理10分针，中间5分钟时停顿一次，待气压缓慢减至常压后，再次加压(更有利于植株处于易接受菌液侵入的状态)然后关闭真空泵，缓缓打开空气阀门，恢复常压将植株取出。浸花处理后，取未经过浸花处理的实验材料的成熟花粉辅助授粉，授粉后用有孔的保鲜袋将处理完的花序套住，遮银灰膜，次日小心揭下保鲜袋。用硫酸钠纸袋套住花序，于终花期将花序上的纸袋取下，管理好植株。待种子成熟后采种进行下一步的抗性筛选。
(4)Basta蛋白试纸条检测
原位转化所用的载体上携带编码除草剂Basta抗性的Bar基因。BAR快速检测试纸条(北京奥创金标生物公司，A07-13-413)可以快速检测到极微量的Basta蛋白，从而明确植株中是否有Bar基因的表达。具体操作如下：用直径0.5cm打孔器取新鲜幼嫩的叶片，每30株取样混合，置于研钵中加入约20mL干净的ddH2O，研碎成汁状，用Basta蛋白试纸条对液体检测，阳性出现2条线，阴性则是1条线。如果混合样品有阳性反应再通过缩小混合样本数量找到目标阳性单株。
(5)PDS基因编辑测序鉴定
如果PDS基因发生了等位基因的纯合敲除会产生植株白化表型，对白化苗进行DNA提取。分别对Cas9区域，用引物nCas9-IDF和nCas9-IDR；gRNA区域，用引物gRNA-IDF和gRNA-IDR进行扩增。并对PDS基因靶点区域用引物PDS1和PDS356进行扩增，将PCR产物克隆后进行测序分析，每个样本送测15个克隆。
nCas9-IDF：5’-CATACCTCCCAGAACACAAATAAGC-3’；
nCas9-IDR：5’-ACTGAAGGGCAATAGTGAAGAATGT-3’。
gRNA-IDF：5’-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3’；
gRNA-IDR：5’-CCCCAGAAATTGAACGCCGAAGAAC-3’。
PDS1：5’-ATGCAACTGATCAATGCGGT-3’；
PDS356：5’-CGGGAATATCGCAGCTAAAG-3’。
二、结果与分析
1、基因编辑靶点选择与载体构建
八氢番茄红素脱氢酶(PDS)作为类胡萝卜素生物合成途径的关键酶，是叶绿素合成必须要有的。所以PDS基因的敲除会产生植株白化性状，便于简单识别。因此，本发明选择了BrPDS(Gene ID:103863556，NCBI数据库)，白菜PDS基因作为Cas9基因编辑敲除的靶点。在第一个外显子上选取一个gRNA，连接到pHSE401-Bar载体上，用于白菜的原位转化基因编辑研究。
“四九菜心”PDS基因的前四个外显子序列如图1中a所示。经测序验证正确的重组载体命名为pHSE401-Bar-PDS，该重组载体的结构描述为：将pHSE401-Bar载体的两个BsaI位点之间的小片段替换为SEQ ID No.1所示DNA片段后得到的重组载体(结构图如图1中b所示)。
2、PDS基因编辑鉴定
原位转化共做了三批，45株，共收货了2000多粒种子。全部播种后出苗2032颗，表型观察，有两株幼苗从出苗后一直表现白化弱小(如图1中c所示)。对两株白化苗进行DNA提取，对PDS包含靶点区域进行扩增，PCR产物测序后发现靶点区域发生了混乱的序列变化(图1中d)，将PCR产物克隆后进行单克隆测序分析。测序结果显示两株白化苗PDS基因发生了不同的基因编辑敲除，且没有发现野生型PDS等位基因的保留(图1中e)。
3、Basta蛋白试纸检测结果及分析
根据前期Basta蛋白试纸检混合检测的经验，我们将一株确定的阳性转化苗(通过离体转化获得)分别与19、39、79株非转化苗混合，置于研钵中用30mL干净的ddH2O稀释叶片汁液，试纸测试都能获得到阳性的结果(图2中a)。可见，Basta蛋白试纸的灵敏度非常高，鉴于操作便利和确保测试结果准确，本实验选择每30株取样混合，20mL干净的ddH2O稀释叶片汁液，用Basta蛋白试纸条对样本混合检测。检测结果显示：所有的蛋白试纸条都是阴性反应，在蛋白质水平上未发现阳性植株(图2中b)。同时对转化载体的nCas9和gRNA区域用特定引物扩增，也均未检测到目的条带。
本实验通过原位转化在菜薹中基因编辑敲除成功的事例初步表明：转化载体并未整合到植物基因组DNA中，但在宿主细胞中发生了瞬时表达，达到了基因编辑的结果。在2032粒种子中获得了两粒PDS等位基因敲除，率先通过不依赖于组织培养的原位转化技术获得非转基因编辑突变株。编辑效率较之前报道的原位转基因万分之一左右的效率相比大大提高，也为转基因安全和无标记基因编辑提供了一个很好的研究思路。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 北京市农林科学院
<120> 一种菜薹非转基因突变株的创制方法
<130> GNCLN201398
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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acgacgcccg gccgacatcc gccgtgccac cgaggcggac atgccggcgg tctgcaccat 960
cgtcaaccac tacatcgaga caagcacggt caacttccgt accgagccgc aggaaccgca 1020
ggagtggacg gacgacctcg tccgtctgcg ggagcgctat ccctggctcg tcgccgaggt 1080
ggacggcgag gtcgccggca tcgcctacgc gggcccctgg aaggcacgca acgcctacga 1140
ctggacggcc gagtcgaccg tgtacgtctc cccccgccac cagcggacgg gactgggctc 1200
cacgctctac acccacctgc tgaagtccct ggaggcacag ggcttcaaga gcgtggtcgc 1260
tgtcatcggg ctgcccaacg acccgagcgt gcgcatgcac gaggcgctcg gatatgcccc 1320
ccgcggcatg ctgcgggcgg ccggcttcaa gcacgggaac tggcatgacg tgggtttctg 1380
gcagctggac ttgagcctgc cggtaccgcc ccgtccggtc ctgcccgtca ccgagatctg 1440
atctcacgcg tctaggatcg acctgcagat cgttcgcgat ggcaa 1485

Claims (10)

1.一种创制白菜非转基因突变株的方法，是通过将CRISPR/Cas9技术与白菜原位转化技术相结合实现的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：将携带有靶向白菜基因组中目标基因的sgRNA编码序列的CRIPSR/Cas9基因编辑载体通过真空渗入原位转化的方法导入受体白菜。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(A1)将携带有靶向白菜基因组中目标基因的sgRNA编码序列的CRIPSR/Cas9基因编辑载体导入农杆菌，得到重组农杆菌；
(A2)待受体白菜进入初花期时，按照如下进行浸花处理：将花蕾浸没在所述重组农杆菌的重悬液中，于100-105Pa负压条件下真空处理10分钟；
(A3)从经过(A2)浸花处理的所述受体白菜最终所结种子中获得所述目标基因被敲除的非转基因突变株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在将所述受体白菜进行所述浸花处理前还包括前一天给所述受体白菜浇透水的步骤。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：在将所述受体白菜进行所述浸花处理前还包括去除已开放的花和角果的步骤。
6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于：在将花蕾浸没在所述重组农杆菌的悬浮液中，于100-105Pa负压条件下真空处理10分钟的过程中，中间停顿一次。
7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于：在将所述受体白菜进行所述浸花处理后还包括如下步骤：取未经浸花处理的所述受体白菜的成熟花粉对经过浸花处理的所述受体白菜进行辅助授粉。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：进行所述辅助授粉后还包括如下步骤：用有孔的保鲜袋将处理完的花序套住，遮银灰膜，次日揭下保鲜袋，用硫酸钠纸袋套住花序，于终花期将花序上的纸袋取下。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述CRIPSR/Cas9基因编辑载体为将pHSE401载体中的标记基因Hyg改造为Bar基因后得到的载体。
10.根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于：所述白菜为不结球白菜；
进一步地，所述不结球白菜为菜薹；
和/或
所述目标基因为八氢番茄红素脱氢酶基因；
进一步地，所述靶向白菜基因组中目标基因的sgRNA编码序列中的特异性识别序列如SEQ ID No.1所示；
更进一步地，所述携带有靶向白菜基因组中目标基因的sgRNA编码序列的CRIPSR/Cas9基因编辑载体为将pHSE401-Bar载体的两个BsaI位点之间的小片段替换为SEQ ID No.1所示DNA片段后得到的重组载体，所述pHSE401-Bar载体为将pHSE401载体中的标记基因Hyg改造为Bar基因后得到的载体。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1821415A (zh) * 2006-03-07 2006-08-23 中国农业科学院油料作物研究所 油菜转基因的方法
CN105087641A (zh) * 2015-07-31 2015-11-25 贵州省园艺研究所 一种新的农杆菌介导的大白菜原位转基因方法
CN105821073A (zh) * 2015-01-27 2016-08-03 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种通过基因瞬时表达对整株植物定点改造的方法
US20160312239A1 (en) * 2013-08-02 2016-10-27 Cornell University Increasing leaf longevity and disease resistance by altering salicylic acid catabolism
CN107604001A (zh) * 2017-09-15 2018-01-19 扬州大学 一种基于真空渗入的甘蓝和甘蓝型油菜叶片瞬时表达的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1821415A (zh) * 2006-03-07 2006-08-23 中国农业科学院油料作物研究所 油菜转基因的方法
US20160312239A1 (en) * 2013-08-02 2016-10-27 Cornell University Increasing leaf longevity and disease resistance by altering salicylic acid catabolism
CN105821073A (zh) * 2015-01-27 2016-08-03 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种通过基因瞬时表达对整株植物定点改造的方法
CN105087641A (zh) * 2015-07-31 2015-11-25 贵州省园艺研究所 一种新的农杆菌介导的大白菜原位转基因方法
CN107604001A (zh) * 2017-09-15 2018-01-19 扬州大学 一种基于真空渗入的甘蓝和甘蓝型油菜叶片瞬时表达的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAO MING QING 等: ""Transformation of Pakchoi (Brassica rapa L. ssp. chinensis) by Agrobacterium infiltration"", 《MOLECULAR BREEDING》 *
NIKOLAY E. ZLOBIN 等: ""CRISPR/Cas9 genome editing through in planta transformation"", 《CRITICAL REVIEWS IN BIOTECHNOLOGY》 *
刘凡 等: ""白菜中农杆菌介导真空渗入转基因机理研究"", 《2009年全国植物分子育种学术研讨会论文集》 *
刘庆昌 等: "《植物细胞组织培养》", 31 January 2003, 中国农业大学出版社 *

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