CN113717982B - 一种利用基因编辑敲除籽粒发育相关蛋白TaGSR1增加小麦籽粒长度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用基因编辑敲除籽粒发育相关蛋白TaGSR1增加小麦籽粒长度的方法，是设计靶向TaGSR1基因的单链引导RNA，构建敲除小麦体内TaGSR1基因的植物双元表达载体pBUE411‑TaGSR1；将该植物双元表达载体通过农杆菌转化到普通小麦中，获得TaGSR1基因敲除的转基因小麦，实现小麦种子籽粒长度的增加；其中所述TaGSR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。实验证实TaGSR1基因敲除的转基因小麦实现了小麦种子籽粒长度的增加和千粒重的提高。本发明的技术方案为利用基因工程技术实现小麦快速育种、提高小麦产量，提供了一种切实可行的方法，具有重要的育种应用价值和广阔市场应用前景。

Description

一种利用基因编辑敲除籽粒发育相关蛋白TaGSR1增加小麦籽 粒长度的方法

技术领域

本发明涉及一种增加小麦籽粒长度的方法，尤其涉及一种利用基因编辑敲除籽粒发育相关蛋白TaGSR1增加小麦籽粒长度的方法；属于植物基因工程及分子育种技术领域。

背景技术

小麦是世界第二大粮食作物，为人类提供20％的碳水化合物和23％的蛋白质。人类的食品安全问题面临着耕地面积的减少、全球气候变暖、人口持续增长以及环境污染加剧等问题，如何在有限的资源条件下提高小麦产量对粮食安全具有重要意义。

油菜素内酯(BR)作为植物第六大植物激素，在细胞伸长与***、叶片衰老、植物形态建成、植物抗逆等过程中起着非常重要的作用。由于BR在植物生长和发育的过程中的广泛作用，其在农业生产上的应用也越来越受到重视。BRI1(Brassinosteroid-insensitive1)作为定位于细胞膜的BR受体，结合BR后，与共受体BAK1(BRI1-associated receptor)相互磷酸化，起始下游信号转导，进而磷酸化BSK/CDG1激酶，磷酸化的BSK/CDG1进一步通过磷酸化而激活下游的BSU1(BRI1-suppressor 1)，BSU1作为一个磷酸酶，通过去磷酸化BIN2(Brassinosteroid-insensitive 2)而使BIN2这个BR信号通路中的负调控因子失活，进而调控下游基因的表达。

申请人研究发现TaGSR1(Grain Size Regulator 1 of Triticum aestivum L.)是BR信号下游的转录因子，具有调控小麦籽粒大小的功能。该调控功能为研究BR在小麦中生长发育及高产育种提供了非常重要的理论依据。但经检索发现，有关小麦TaGSR1基因的编码序列及其编码的籽粒发育相关蛋白TaGSR1，以及利用基因编辑敲除籽粒发育相关蛋白TaGSR1增加小麦籽粒长度的方法未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用基因编辑敲除籽粒发育相关蛋白TaGSR1增加小麦籽粒长度的方法。

本发明所述利用基因编辑敲除籽粒发育相关蛋白TaGSR1增加小麦籽粒长度的方法，其特征在于：设计靶向TaGSR1基因的单链引导RNA(sgRNA)，构建敲除小麦体内TaGSR1基因的表达载体即植物双元表达载体pBUE411-TaGSR1；将该植物双元表达载体通过农杆菌转化到普通小麦中，获得TaGSR1基因敲除的转基因小麦，实现小麦种子籽粒长度的增加；其中所述TaGSR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

其中，上述的方法中：所述靶向TaGSR1基因的单链引导RNA的核苷酸序列是SEQ IDNO.5，或是SEQ ID NO.6，或是SEQ ID NO.7，或是SEQ ID NO.8，或是符合所述特征的sgRNA；优选是SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的sgRNA；所述植物双元表达载体pBUE411-TaGSR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述方法进一步是利用农杆菌侵染小麦幼胚愈伤组织的方法，将双元重组载体pBUE411-TaGSR1含有的靶向TaGSR1基因的特异sgRNA与Cas9元件的表达元件转入小麦，特异性敲除TaGSR1基因，得到籽粒长度与产量增加的小麦突变体。

本发明还公开了一种具有敲除TaGSR1基因功能的双元载体，其特征在于：所述双元载体命名为pBUE411-TaGSR1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述双元载体pBUE411-TaGSR1由表达盒E1和表达盒E2构成；其中表达盒E1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其从上游至下游依次是：来自小麦的TaU3启动子，靶向TaGSR1基因的单链引导RNA(sgRNA)，终止子T1；表达盒E2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其从上游至下游依次是：来自玉米的泛素启动子Ubi，玉米Cas9编码序列，终止子T2。

其中：所述小麦TaU3启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述靶向TaGSR1基因的单链引导RNA的核苷酸序列是SEQ ID NO.5，或是SEQ ID NO.6，或是SEQ ID NO.7，或是SEQ ID NO.8；所述终止子T1的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述玉米泛素启动子Ubi的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述玉米Cas9编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述终止子T2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

本发明还进一步公开了一种获得TaGSR1基因敲除突变体小麦的特异性引导单链RNA，其特征在于：所述特异性引导单链RNA的核苷酸序列是SEQ ID NO.5，或是SEQ IDNO.6，或是SEQ ID NO.7，或是SEQ ID NO.8；其属于TaGSR1编码序列或TaGSR1编码序列的互补序列，长度为22～23个脱氧核糖核苷酸，其3’端最后紧邻三个脱氧核苷酸序列为NGG，其中N为腺嘌呤或鸟嘌呤或胸腺嘧啶或胞嘧啶。

其中：所述特异性引导单链RNA的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示。

本发明提供的利用基因编辑敲除籽粒发育相关蛋白TaGSR1增加小麦籽粒长度的方法是通过构建具有敲除TaGSR1基因功能的表达载体pBUE411-TaGSR1，并转化到普通小麦中实现了对TaGSR1基因敲除，通过降低了TaGSR1基因的表达实现了小麦种子籽粒长度的增加。本发明提供的小麦TaGSR1基因的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，为首次公布。该小麦TaGSR1是BR信号下游的转录因子，具有调控小麦籽粒大小的功能。

发明的突出效果是：通过设计TaGSR1基因的引导单链RNA(sgRNA)，构建了可以敲除小麦体内TaGSR1基因的表达载体；其中所述所述sgRNA序列能够靶向破坏TaGSR1基因的的外显子区域，所述sgRNA序列的靶向结构域序列选自TaGSR1基因的编码序列，能特异性靶向破坏TaGSR1基因编码区域而有效降低TaGSR1的蛋白水平。通过对小麦遗传转化，得到TaGSR1基因敲除的后代，获得了籽粒长度与产量增加的小麦突变体。实验证实TaGSR1基因敲除的转基因小麦实现了小麦种子籽粒长度的增加和千粒重的提高。本发明的技术方案为利用基因工程技术实现小麦快速育种、提高小麦产量，提供了一种切实可行的方法，具有重要的育种应用价值和广阔市场应用前景。

附图说明

图1为石新828小麦的TaGSR1基因扩增电泳图。

其中：泳道1为Transgen 2K plus marker，泳道2为TaGSR1目的条带。

图2小麦品种石新828的TaGSR1基因编码区。

其中：下划线序列为基因编辑所用的sgRNA序列。

图3 pBUE411-TaGSR1双元表达载体测序结果。

其中：下划线为sgRNA，其余序列为载体pBUE411的载体骨架序列。

图4 T0代小麦转基因株系转化鉴定结果。

其中：泳道1为Transgen 2K plus marker，泳道2为重组质粒pBUE411-TaGSR1扩增结果，泳道3～15为T0代转基因小麦株系鉴定结果，泳道16为野生型JW1扩增结果。

图5三个同源拷贝均发生基因编辑的株系tagsr1-ko测序结果。

图6三个同源拷贝均发生基因编辑的株系tagsr1-ko的蛋白编码结果。

图7 tagsr1-ko株系的三个拷贝特异性扩增结果。

其中：1为Transgen 2K plus marker，2为检测TaGSR1.2A编辑情况的特异PCR片段，3为检测TaGSR1.2B编辑情况的特异PCR片段，4为检测TaGSR1编辑情况的特异PCR片段。

图8 TaGSR1基因编辑后代酶切鉴定结果。

其中：1为Transgen 2K marker，2～6为不同的自交后代三个同源拷贝的酶切结果，7为野生型JW1三个同源拷贝的酶切结果，方框表示该植株三个同源拷贝均被编辑且为纯合敲除株系。

图9 OE-TaGSR1过表达转基因、纯合基因敲除株系tagsr1-ko籽粒大小比较。

其中：A&B，与野生型JW1小麦相比，OE-TaGSR1过表达株系籽粒长度与宽度显著减小；C&D，与野生型JW1小麦相比，纯合基因敲除株系tagsr1-ko籽粒长度显著增加，籽粒宽度无明显变化。Bar＝1cm。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均从常规生化试剂公司购买得到。

PCR扩增所需的高保真酶为KOD-FX NEO(东洋纺)；吉布森组装所需的限制性内切酶BsaI与T4连接酶均购自NEB公司；限制性内切酶CpoI、酶切片段回收所需的凝胶回收试剂盒以及质粒提取试剂盒均购自赛默飞世尔科技公司。培养基配制所需的无机盐购自国药集团，维生素和抗生素购自Sigma公司。植物CRISPR/Cas9基因编辑载体为pBUE411，含有小麦U3启动子TaU3，用以启动sgRNA，Cas9模拟了禾本科植物基因具有5’端GC含量较高的特征，是设计合成的植物密码子优化的基因。所述质粒pBUE411公众可从中国农业大学获得，其序列已公知，为17430bp。本发明所用的大肠杆菌菌株是E.coli Transgen5α，购自北京全式金公司；所使用的引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，相关引物序列如表1所示：

表1：本发明使用的引物

本发明中使用的小麦品种JW1是山东省农科院作物所自行选育的具有良好组织培养能力的新种质，公众可从山东省农业科学院作物研究所获得；石新828是石家庄市小麦新品种新技术研究所经8代系谱选育法于2001年选育而成，并于2005年通过河北省品种审定委员会审定的具有耐寒抗旱、抗倒伏等优良性状的小麦品种，公众可从河北嘉丰种业有限公司获得。

实施例1 表达载体的构建

1.靶向TaGSR1的sgRNA的设计

为设计能够在TaGSR1基因编码区发生编辑的sgRNA，本实验首先在小麦品种石新828里扩增TaGSR1基因的序列，所用引物为TaGSR1-F与TaGSR1-R，PCR反应体系为：KOD-FXNEO buffer：25μL，dNTP(2mM)：10μL，TaGSR1-F(10μM)：1.5μL，TaGSR1-F(10μM)：1.5μL，石新828gDNA(50ng/μL)：1μL，KOD-FX NEO：1μL，ddH₂O补齐50μL。PCR反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性12sec；58℃退火20sec，68℃延伸25sec，反应35个循环；68℃复性5min。

PCR结果如图1所示，泳道1为Transgen 2K plus marker，泳道2为TaGSR1目的条带。

PCR产物送至青岛擎科梓熙生物技术有限公司测序，石新828小麦中的TaGSR1基因的序列如图2所示，与Ensembl Plants数据库(http://plants.ensembl.org/index.html)中小麦的该基因序列93.79％相似。该基因全长612个碱基，不含有内含子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

通过网站CRISPRdirect(http://crispr.dbcls.jp/)在TaGSR1基因的编码区寻找适合的打靶位点，在PAM结构前找到20bp序列片段设定为靶序列，本实施例以其中一个sgRNA为例进行敲除实验，其核苷酸序列为GCGGCGCGTCGTCGCCGGACCGG，以SEQ ID NO.5所示，即图2所示TaGSR1基因序列中下划线标记序列为靶向TaGSR1基因的sgRNA序列，sgRNA3’端的CGG为PAM序列。

2.含有sgRNA片段的获得

用于构建pBUE411-TaGSR1双元表达载体的2条引物TaGSR1-gR1-F和TaGSR1-gR1-R(表1)，由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成。分别将两条引物进行磷酸化，直接退火形成双链，反应体系为：TaGSR1-gR1-F(10μM):4μL，TaGSR1-gR1-R(10μM)：4μL，10×T4 PNKbuffer：1.5μL，PNK：1μL，ATP：1μL，ddH₂O补足15μL。PCR仪反应：37℃，30min；95℃，5min；ramp to 25℃at 5℃/min。

3.pBUE411载体与sgRNA连接

采用吉布森组装完成pBUE411与sgRNA的连接，具体反应体系：pBUE411质粒(100ng/μL)：2μL，步骤2的产物片段：2μL，10×NEB T4 Buffer：1.5μL，10×BSA：1.5μL，BsaI：1μL，T4 Ligase：1μL，ddH₂O补齐15μL。反应体系于37℃水浴锅中反应5小时，得到pBUE411载体与sgRNA连接产物。

4.转化与鉴定

将连接产物转化大肠杆菌，具体的：将连接产物加入大肠杆菌感受态Transgen 5α中冰浴20min，42℃热激反应60sec，冰浴2min，加入无抗LB，放入37℃摇床复苏1h，之后用涂布器涂于LB(含有卡那霉素)平板上，37℃倒置培养培养至克隆长出，挑3个单克隆进行测序，引物用的是pBUE411-F和pBUE411-R。

测序结果(如图3)检测到了sgRNA的靶序列，同时在靶序列上游检测到了TaU3启动子序列，测序结果说明含有sgRNA的表达盒E1成功的组装进入pBUE411双元表达载体，证明了TaGSR1的CRISPR/Cas9基因编辑载体即重组双元表达载体pBUE411-TaGSR1构建成功。该重组双元表达载体pBUE411-TaGSR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例2 转基因后代获得与鉴定

1.TaGSR1转基因后代获得

将实验例1构建好的重组双元表达载体pBUE411-TaGSR1转化至农杆菌EHA105感受态细胞，具体的：将重组双元表达载体pBUE411-TaGSR1加入农杆菌EHA105感受态中冰浴5min，液氮速冻5min，37℃热激反应5min，之后冰浴5min，加入无抗LB，放入28℃摇床复苏2h，之后用涂布器涂于LB(含有利福平、链霉素和卡那霉素)平板上，28℃倒置培养培养至克隆长出。挑取单克隆接种于含有相应抗性的LB培养液中，28℃摇菌，160rpm，培养24小时。

取授粉后15天左右的JW1小麦种子，剥取幼胚。农杆菌悬浮液取1ml菌液于1.5ml离心管中，加入1.4ul乙酰丁香酮(0.1M)混匀。加入准备好的菌液侵染5分钟后放到共培培养基上，23℃暗培养3天。共培后放到休息培养基上25℃暗培养5天。将愈伤组织转移至筛选培养基1上，用封口膜封好培养皿，在25.5℃培养箱中暗培养2周。将愈伤切割后转移到筛选培养基2上，用封口膜再次封好培养皿，在25.5℃培养箱中继续暗培养2周。愈伤切割筛选2周后，表现有绿色芽点的抗性愈伤转移到再生培养基上。封好培养皿，放到25℃培养箱中光照/黑暗(16h/8h)培养2周。再生2周后，将健康成长的小苗转移到新的抗性再生小盒里。待苗长到一定大小可以取样检测。

上述小麦遗传转化涉及的各种培养基及其配制见如下文献：

Kan Wang(ed.),Agrobacterium Protocals:Volume 1,Methods in MolecularBiology,vol.1223DOI10.007/978-1-4939-1695-5_15,Spring Science+Businedd MediaNew York 2015。

取再生小麦幼嫩叶片，CTAB法提取基因组DNA，利用BUE-DF1与BUE-DR1两个载体上的引物进行PCR鉴定，PCR反应程序为：2×PCR master mix：10μL，pBUE411-F(10μM)：0.5μL，pBUE411-R(10μM)：0.5μL，gDNA(50ng/μL)：1μL，ddH₂O：8μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30sec；58℃退火30sec，72℃延伸30sec，反应32个循环；72℃复性5min。结果如图4所示，条带代表转化成功的T0代小麦转基因株系，共得到12株阳性转基因株系。

2.TaGSR1转基因敲除后代鉴定

小麦为异源六倍体，TaGSR1基因为2D染色体上的拷贝，在染色体2A、2B上的同源拷贝为TaGSR1.2A和TaGSR1.2B，三个拷贝的DNA序列同源性较高，氨基酸序列相似度达88.6％，需要同时检测三个同源拷贝的基因编辑情况。本实验采用购自西安青雪生物科技有限公司的Hi-TOM基因编辑位点检测试剂盒，该试剂盒通过PCR完成高通量建库过程，并用Hi-TOM在线软件直接解析出多样品多位点的变异信息。利用靶向序列两侧的特异性引物(表1中的Seq-F和Seq-R)同时对TaGSR1.2A、TaGSR1.2B和TaGSR1进行扩增，扩增产物建库后送到西安青雪生物科技有限公司测序。

目的基因小麦TaGSR1.2A、TaGSR1.2B和TaGSR1基因的基因编辑结果如图5所示，其编码的氨基酸序列如图6所示。经过比对，突变体蛋白tagsr1.2a自第112个氨基酸开始出现移码，蛋白tagsr1.2b自第111个氨基酸开始出现移码，蛋白tagsr1自第109个氨基酸开始出现移码。结果表明，sgRNA与Cas9元件转化成功，并发挥了功能，对TaGSR1基因进行了编辑，导致TaGSR1.2A、TaGSR1.2B和TaGSR1三个蛋白移码突变，保守的HLH功能域不能正确表达，基因相应的功能丧失。

其中：第一轮PCR反应体系：以转pBUE411-TaGSR1基因的小麦植株叶片DNA为模板1μL，试剂盒中的2×Taq Master Mix 10μL，Seq-F和Seq-R(表1)(10μM)各0.5μL，Nucleasefree Water补足体积至20μL。PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸20s，共32个循环；最后72℃延伸5min。PCR结束后取5μL琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，确保目标产物存在且特异性良好。之后进行第二轮PCR反应，试剂盒中的Hi-TOM Mix 12μL，以第一轮PCR产物为模板加入1μL，Nuclease-free Water补足体积至20μL。PCR反应程序：94℃变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸25s，共33个循环；最后72℃延伸5min。扩增产物混合进行胶回收，胶回收产物即为建库测序样本，随后送到西安青雪生物科技有限公司测序，基因编辑结果如图5所示。

实施例3 小麦敲除TaGSR1基因后代表型鉴定

为得到TaGSR1.2A、TaGSR1.2B和TaGSR1三个同源拷贝的纯合敲除株系，针对编辑位点开发酶切扩增多态性序列(Caps)标记，对基因编辑突变体的自交后代进行鉴定，直至得到TaGSR1.2A、TaGSR1.2B和TaGSR1同时敲除的纯合突变体。

分别利用Caps-2A-F和Caps-2A-R，Caps-2B-F和Caps-2B-R，Caps-2D-F和Caps-2D-R(表1)对基因编辑后代的TaGSR1.2A、TaGSR1.2B和TaGSR1基因进行PCR扩增。PCR反应体系为：KOD-FX NEO buffer：10μL，dNTP(2mM)：4μL，Caps-2A-F(或Caps-2B-F，或Caps-2D-F)(10μM)：0.6μL，Caps-2A-R(或Caps-2B-R，或Caps-2D-R)(10μM)：0.6μL，基因敲除株系gDNA(约20ng/μL)：1μL，KOD-FX NEO：0.4μL，ddH₂O补齐20μL。PCR反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性12sec；58℃退火20sec，68℃延伸45sec，反应35个循环；68℃复性5min。

取5ul PCR产物进行电泳检测，PCR结果如图7所示。

扩增产物使用赛默飞世尔生产的限制性内切酶CpoI进行酶切，酶切反应体系为：PCR产物：15μL，10×Buffer Tango：2μL，限制性内切酶CpoI：0.5μL。反应体系于37℃水浴锅中酶切2h，之后进行电泳检测，结果如图8所示。电泳鉴定纯合突变体，野生型基因均可被切开，基因编辑成功的位点均不能被切开。野生型植株的TaGSR1.2A、TaGSR1.2B和TaGSR1可被切割为696bp+514bp、729bp+358bp、869bp+306bp大小的片段，而基因编辑突变体不能被切开，由此可筛选出转基因纯合三拷贝基因敲除株系tagsr1-ko。

将野生型受体品种JW1、玉米泛素启动子Ubi驱动的TaGSR1超表达小麦转基因株系(命名为OE-TaGSR1)和TaGSR1基因及其同源拷贝的纯合敲除株系(命名为tagsr1-ko)，一起种植于山东大学青岛校区人工气候室，培养条件为：光照16h，黑暗8小时；白天温度22℃，夜间温度16℃；湿度40％-50％；CO2浓度为500ppm-700ppm。收种后，于30℃烘箱烘干处理14天，利用佳能高性能单反照相机对OE-TaGSR1、tagsr1-ko的籽粒进行拍照，同时利用Image-Pro Plus 6.0对图片进行分析测量，统计OE-TaGSR1、tagsr1-ko籽粒的长度与宽度。

结果显示：与野生型JW1相比，过表达株系OE-TaGSR1的籽粒长度与宽度显著降低，而突变体株系tagsr1-ko籽粒长度显著增加，籽粒宽度无明显变化(如表2，图9所示)。测量其籽粒千粒重，OE-TaGSR1过表达转基因株系千粒重显著降低，tagsr1-ko千粒重显著增加(如表2)。表明：TaGSR1基因对小麦籽粒发育具有负向调控作用，本发明通过构建含有sgRNA、能够特异靶向TaGSR1基因的pBUE411-TaGSR1双元重组载体，利用农杆菌侵染小麦幼胚诱导的愈伤组织，特异性的编辑TaGSR1基因，使其丧失功能，显著增加了小麦籽粒长度从而增加产量，为培育高产小麦提供了一个新的方法。

表2 纯合三拷贝敲除突变体tagsr1-ko产量性状统计

注：不同的小写字母上标表示在95％置信度水平有显著性差异。

序 列 表

<110> 山东大学

<120> 一种利用基因编辑敲除籽粒发育相关蛋白TaGSR1增加小麦籽粒长度的方法

<141> 2021-08-05

<160> 13

<210> 1

<211> 934

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 表达盒E1的核苷酸序列

<222>（1）...（934）

<400> 1

catgaatcca aaccacacgg agttcaaatt cccacagatt aaggctcgtc cgtcgcacaa 60

ggtaatgtgt gaatattata tctgtcgtgc aaaattgcct ggcctgcaca attgctgtta 120

tagttggcgg cagggagagt tttaacattg actagcgtgc tgataatttg tgagaaataa 180

taattgacaa gtagatactg acatttgaga agagcttctg aactgttatt agtaacaaaa 240

atggaaagct gatgcacgga aaaaggaaag aaaaagccat actttttttt aggtaggaaa 300

agaaaaagcc atacgagact gatgtctctc agatgggccg ggatctgtct atctagcagg 360

cagcagccca ccaacctcac gggccagcaa ttacgagtcc ttctaaaagc tcccgccgag 420

gggcgctggc gctgctgtgc agcagcacgt ctaacattag tcccacctcg ccagtttaca 480

gggagcagaa ccagcttata agcggaggcg cggcaccaag aagcggcggc ggcgcgtcgt 540

cgccggacat gctgctcgac gagcagcgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 600

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttt tttcgttttg 660

cattgagttt tctccgtcgc atgtttgcag ttttattttc cgttttgcat tgaaatttct 720

ccgtctcatg tttgcagcgt gttcaaaaag tacgcagctg tatttcactt atttacggcg 780

ccacattttc atgccgtttg tgccaactat cccgagctag tgaatacagc ttggcttcac 840

acaacactgg tgacccgctg acctgctcgt acctcgtacc gtcgtacggc acagcatttg 900

gaattaaagg gtgtgatcga tactgcttgc tgct 934

<210> 2

<211> 6799

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 表达盒E2的核苷酸序列

<222>（1）...（6799）

<400> 2

ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60

agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120

tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180

tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240

gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300

ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360

gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420

agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480

taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540

aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600

cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660

cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720

acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780

ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca cggcagctac gggggattcc tttcccaccg 840

ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga caccccctcc acaccctctt 900

tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac cagatctccc ccaaatccac 960

ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc ctctctacct 1020

tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta gttctacttc tgttcatgtt 1080

tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc gttcgtacac ggatgcgacc 1140

tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg 1200

atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt tcgttgcata 1260

gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg tgcacttgtt tgtcgggtca 1320

tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct 1380

agatcggagt agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat 1440

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aatactgttt caaactacct ggtgtattta ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata 1680

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ctaaccttga gtacctatct attataataa acaagtatgt tttataatta ttttgatctt 1860

gatatacttg gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc 1920

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gagtgcttcg attcggtcga gatctctggc gttgaggacc gcttcaacgc ctccctgggg 3900

acctaccacg atctcctgaa gatcattaag gataaggact tcctggacaa cgaggagaat 3960

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gaggagcgcc tgaagactta cgcccatctc ttcgatgaca aggtcatgaa gcagctcaag 4080

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aaggcgggct tcatcaagag gcagctggtc gagacacggc agatcactaa gcacgttgcg 4920

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atttccgagt tctccaagcg cgtgatcctg gccgacgcga atctggataa ggtcctctcc 6000

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catcggtttc gacaacgttc gtcaagttca atgcatcagt ttcattgcgc acacaccaga 6360

atcctactga gtttgagtat tatggcattg ggaaaactgt ttttcttgta ccatttgttg 6420

tgcttgtaat ttactgtgtt ttttattcgg ttttcgctat cgaactgtga aatggaaatg 6480

gatggagaag agttaatgaa tgatatggtc cttttgttca ttctcaaatt aatattattt 6540

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gttttgagta aaaatgtgtc aaatcgtggc ctctaatgac cgaagttaat atgaggagta 6660

aaacacttgt agttgtacca ttatgcttat tcactaggca acaaatatat tttcagacct 6720

agaaaagctg caaatgttac tgaatacaag tatgtcctct tgtgttttag acatttatga 6780

actttccttt atgtaattt 6799

<210> 3

<211> 16248

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> pBUE411-TaGSR1双元载体的核苷酸序列

<222>（1）...（16248）

<400> 3

taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta 60

aactgaaggc gggaaacgac aatctgatcc aagctcaagc tgctctagca ttcgccattc 120

aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 180

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aagtacgcag ctgtatttca cttatttacg gcgccacatt ttcatgccgt ttgtgccaac 1080

tatcccgagc tagtgaatac agcttggctt cacacaacac tggtgacccg ctgacctgct 1140

cgtacctcgt accgtcgtac ggcacagcat ttggaattaa agggtgtgat cgatactgct 1200

tgctgctaag cttgcatgcc tgcagtgcag cgtgacccgg tcgtgcccct ctctagagat 1260

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tgcatgtgtt ctcctttttt tttgcaaata gcttcaccta tataatactt catccatttt 1560

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ttatttaata atttagatat aaaatagaat aaaataaagt gactaaaaat taaacaaata 1740

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ctggttgggc ggtcgttcta gatcggagta gaattctgtt tcaaactacc tggtggattt 2640

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cagcatctat tcatatgctc taaccttgag tacctatcta ttataataaa caagtatgtt 3060

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tagcgctcag tcgttcatcg agaggatgac gaatttcgac aagaacctgc caaatgagaa 4860

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catcaacggc attcgggaca agcagtccgg gaagacgatc ctcgacttcc tgaagagcga 5400

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caggaaggat ttccagttct acaaggttcg ggagatcaac aattaccacc atgcccatga 6300

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ggatccgaag aagtacggcg ggttcgacag ccccactgtg gcctactcgg tcctggttgt 6780

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gggcagcccc gaggacaacg agcagaagca gctgttcgtc gagcagcaca agcattacct 7140

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tctggataag gtcctctccg cgtacaacaa gcaccgcgac aagccaatca gggagcaggc 7260

tgagaatatc attcatctct tcaccctgac gaacctcggc gcccctgctg ctttcaagta 7320

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cctcatccac cagtcgatta ccggcctcta cgagacgcgc atcgacctgt ctcagctcgg 7440

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cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 8340

gcgcggggag aggcggtttg cgtattggct agagcagctt gccaacatgg tggagcacga 8400

cactctcgtc tactccaaga atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa gggctattga 8460

gacttttcaa caaagggtaa tatcgggaaa cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg 8520

tcacttcatc aaaaggacag tagaaaagga aggtggcacc tacaaatgcc atcattgcga 8580

taaaggaaag gctatcgttc aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc 8640

acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga 8700

ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac tctcgtctac tccaagaata tcaaagatac 8760

agtctcagaa gaccaaaggg ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat cgggaaacct 8820

cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcaaa aggacagtag aaaaggaagg 8880

tggcacctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcgttcaag atgcctctgc 8940

cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt 9000

tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga 9060

cgcacaatcc cactatcctt cgcaagacct tcctctatat aaggaagttc atttcatttg 9120

gagaggacac gctgaaatca ccagtctctc tctacaaatc tatctctctc gagtctacca 9180

tgagcccaga acgacgcccg gccgacatcc gccgtgccac cgaggcggac atgccggcgg 9240

tctgcaccat cgtcaaccac tacatcgaga caagcacggt caacttccgt accgagccgc 9300

aggaaccgca ggagtggacg gacgacctcg tccgtctgcg ggagcgctat ccctggctcg 9360

tcgccgaggt ggacggcgag gtcgccggca tcgcctacgc gggcccctgg aaggcacgca 9420

acgcctacga ctggacggcc gagtcgaccg tgtacgtctc cccccgccac cagcggacgg 9480

gactgggctc cacgctctac acccacctgc tgaagtccct ggaggcacag ggcttcaaga 9540

gcgtggtcgc tgtcatcggg ctgcccaacg acccgagcgt gcgcatgcac gaggcgctcg 9600

gatatgcccc ccgcggcatg ctgcgggcgg ccggcttcaa gcacgggaac tggcatgacg 9660

tgggtttctg gcagctggac ttcagcctgc cggtaccgcc ccgtccggtc ctgcccgtca 9720

ccgagatttg actcgagttt ctccataata atgtgtgagt agttcccaga taagggaatt 9780

agggttccta tagggtttcg ctcatgtgtt gagcatataa gaaaccctta gtatgtattt 9840

gtatttgtaa aatacttcta tcaataaaat ttctaattcc taaaaccaaa atccagtact 9900

aaaatccaga tcccccgaat taattcggcg ttaattcagt acattaaaaa cgtccgcaat 9960

gtgttattaa gttgtctaag cgtcaatttg tttacaccac aatatatcct gccaccagcc 10020

agccaacagc tccccgaccg gcagctcggc acaaaatcac cactcgatac aggcagccca 10080

tcagtccggg acggcgtcag cgggagagcc gttgtaaggc ggcagacttt gctcatgtta 10140

ccgatgctat tcggaagaac ggcaactaag ctgccgggtt tgaaacacgg atgatctcgc 10200

ggagggtagc atgttgattg taacgatgac agagcgttgc tgcctgtgat caccgcggtt 10260

tcaaaatcgg ctccgtcgat actatgttat acgccaactt tgaaaacaac tttgaaaaag 10320

ctgttttctg gtatttaagg ttttagaatg caaggaacag tgaattggag ttcgtcttgt 10380

tataattagc ttcttggggt atctttaaat actgtagaaa agaggaagga aataataaat 10440

ggctaaaatg agaatatcac cggaattgaa aaaactgatc gaaaaatacc gctgcgtaaa 10500

agatacggaa ggaatgtctc ctgctaaggt atataagctg gtgggagaaa atgaaaacct 10560

atatttaaaa atgacggaca gccggtataa agggaccacc tatgatgtgg aacgggaaaa 10620

ggacatgatg ctatggctgg aaggaaagct gcctgttcca aaggtcctgc actttgaacg 10680

gcatgatggc tggagcaatc tgctcatgag tgaggccgat ggcgtccttt gctcggaaga 10740

gtatgaagat gaacaaagcc ctgaaaagat tatcgagctg tatgcggagt gcatcaggct 10800

ctttcactcc atcgacatat cggattgtcc ctatacgaat agcttagaca gccgcttagc 10860

cgaattggat tacttactga ataacgatct ggccgatgtg gattgcgaaa actgggaaga 10920

agacactcca tttaaagatc cgcgcgagct gtatgatttt ttaaagacgg aaaagcccga 10980

agaggaactt gtcttttccc acggcgacct gggagacagc aacatctttg tgaaagatgg 11040

caaagtaagt ggctttattg atcttgggag aagcggcagg gcggacaagt ggtatgacat 11100

tgccttctgc gtccggtcga tcagggagga tatcggggaa gaacagtatg tcgagctatt 11160

ttttgactta ctggggatca agcctgattg ggagaaaata aaatattata ttttactgga 11220

tgaattgttt tagtacctag aatgcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 11280

ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 11340

cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 11400

tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 11460

tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 11520

tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 11580

tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 11640

ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 11700

acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 11760

ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 11820

gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 11880

ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 11940

ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 12000

taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 12060

cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca 12120

tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc 12180

atagttaagc cagtatacac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga 12240

cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac 12300

agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg 12360

aaacgcgcga ggcagggtgc cttgatgtgg gcgccggcgg tcgagtggcg acggcgcggc 12420

ttgtccgcgc cctggtagat tgcctggccg taggccagcc atttttgagc ggccagcggc 12480

cgcgataggc cgacgcgaag cggcggggcg tagggagcgc agcgaccgaa gggtaggcgc 12540

tttttgcagc tcttcggctg tgcgctggcc agacagttat gcacaggcca ggcgggtttt 12600

aagagtttta ataagtttta aagagtttta ggcggaaaaa tcgccttttt tctcttttat 12660

atcagtcact tacatgtgtg accggttccc aatgtacggc tttgggttcc caatgtacgg 12720

gttccggttc ccaatgtacg gctttgggtt cccaatgtac gtgctatcca caggaaacag 12780

accttttcga cctttttccc ctgctagggc aatttgccct agcatctgct ccgtacatta 12840

ggaaccggcg gatgcttcgc cctcgatcag gttgcggtag cgcatgacta ggatcgggcc 12900

agcctgcccc gcctcctcct tcaaatcgta ctccggcagg tcatttgacc cgatcagctt 12960

gcgcacggtg aaacagaact tcttgaactc tccggcgctg ccactgcgtt cgtagatcgt 13020

cttgaacaac catctggctt ctgccttgcc tgcggcgcgg cgtgccaggc ggtagagaaa 13080

acggccgatg ccgggatcga tcaaaaagta atcggggtga accgtcagca cgtccgggtt 13140

cttgccttct gtgatctcgc ggtacatcca atcagctagc tcgatctcga tgtactccgg 13200

ccgcccggtt tcgctcttta cgatcttgta gcggctaatc aaggcttcac cctcggatac 13260

cgtcaccagg cggccgttct tggccttctt cgtacgctgc atggcaacgt gcgtggtgtt 13320

taaccgaatg caggtttcta ccaggtcgtc tttctgcttt ccgccatcgg ctcgccggca 13380

gaacttgagt acgtccgcaa cgtgtggacg gaacacgcgg ccgggcttgt ctcccttccc 13440

ttcccggtat cggttcatgg attcggttag atgggaaacc gccatcagta ccaggtcgta 13500

atcccacaca ctggccatgc cggccggccc tgcggaaacc tctacgtgcc cgtctggaag 13560

ctcgtagcgg atcacctcgc cagctcgtcg gtcacgcttc gacagacgga aaacggccac 13620

gtccatgatg ctgcgactat cgcgggtgcc cacgtcatag agcatcggaa cgaaaaaatc 13680

tggttgctcg tcgcccttgg gcggcttcct aatcgacggc gcaccggctg ccggcggttg 13740

ccgggattct ttgcggattc gatcagcggc cgcttgccac gattcaccgg ggcgtgcttc 13800

tgcctcgatg cgttgccgct gggcggcctg cgcggccttc aacttctcca ccaggtcatc 13860

acccagcgcc gcgccgattt gtaccgggcc ggatggtttg cgaccgctca cgccgattcc 13920

tcgggcttgg gggttccagt gccattgcag ggccggcaga caacccagcc gcttacgcct 13980

ggccaaccgc ccgttcctcc acacatgggg cattccacgg cgtcggtgcc tggttgttct 14040

tgattttcca tgccgcctcc tttagccgct aaaattcatc tactcattta ttcatttgct 14100

catttactct ggtagctgcg cgatgtattc agatagcagc tcggtaatgg tcttgccttg 14160

gcgtaccgcg tacatcttca gcttggtgtg atcctccgcc ggcaactgaa agttgacccg 14220

cttcatggct ggcgtgtctg ccaggctggc caacgttgca gccttgctgc tgcgtgcgct 14280

cggacggccg gcacttagcg tgtttgtgct tttgctcatt ttctctttac ctcattaact 14340

caaatgagtt ttgatttaat ttcagcggcc agcgcctgga cctcgcgggc agcgtcgccc 14400

tcgggttctg attcaagaac ggttgtgccg gcggcggcag tgcctgggta gctcacgcgc 14460

tgcgtgatac gggactcaag aatgggcagc tcgtacccgg ccagcgcctc ggcaacctca 14520

ccgccgatgc gcgtgccttt gatcgcccgc gacacgacaa aggccgcttg tagccttcca 14580

tccgtgacct caatgcgctg cttaaccagc tccaccaggt cggcggtggc ccatatgtcg 14640

taagggcttg gctgcaccgg aatcagcacg aagtcggctg ccttgatcgc ggacacagcc 14700

aagtccgccg cctggggcgc tccgtcgatc actacgaagt cgcgccggcc gatggccttc 14760

acgtcgcggt caatcgtcgg gcggtcgatg ccgacaacgg ttagcggttg atcttcccgc 14820

acggccgccc aatcgcgggc actgccctgg ggatcggaat cgactaacag aacatcggcc 14880

ccggcgagtt gcagggcgcg ggctagatgg gttgcgatgg tcgtcttgcc tgacccgcct 14940

ttctggttaa gtacagcgat aaccttcatg cgttcccctt gcgtatttgt ttatttactc 15000

atcgcatcat atacgcagcg accgcatgac gcaagctgtt ttactcaaat acacatcacc 15060

tttttagacg gcggcgctcg gtttcttcag cggccaagct ggccggccag gccgccagct 15120

tggcatcaga caaaccggcc aggatttcat gcagccgcac ggttgagacg tgcgcgggcg 15180

gctcgaacac gtacccggcc gcgatcatct ccgcctcgat ctcttcggta atgaaaaacg 15240

gttcgtcctg gccgtcctgg tgcggtttca tgcttgttcc tcttggcgtt cattctcggc 15300

ggccgccagg gcgtcggcct cggtcaatgc gtcctcacgg aaggcaccgc gccgcctggc 15360

ctcggtgggc gtcacttcct cgctgcgctc aagtgcgcgg tacagggtcg agcgatgcac 15420

gccaagcagt gcagccgcct ctttcacggt gcggccttcc tggtcgatca gctcgcgggc 15480

gtgcgcgatc tgtgccgggg tgagggtagg gcgggggcca aacttcacgc ctcgggcctt 15540

ggcggcctcg cgcccgctcc gggtgcggtc gatgattagg gaacgctcga actcggcaat 15600

gccggcgaac acggtcaaca ccatgcggcc ggccggcgtg gtggtgtcgg cccacggctc 15660

tgccaggcta cgcaggcccg cgccggcctc ctggatgcgc tcggcaatgt ccagtaggtc 15720

gcgggtgctg cgggccaggc ggtctagcct ggtcactgtc acaacgtcgc cagggcgtag 15780

gtggtcaagc atcctggcca gctccgggcg gtcgcgcctg gtgccggtga tcttctcgga 15840

aaacagcttg gtgcagccgg ccgcgtgcag ttcggcccgt tggttggtca agtcctggtc 15900

gtcggtgctg acgcgggcat agcccagcag gccagcggcg gcgctcttgt tcatggcgta 15960

atgtctccgg ttctagtcgc aagtattcta ctttatgcga ctaaaacacg cgacaagaaa 16020

acgccaggaa aagggcaggg cggcagcctg tcgcgtaact taggacttgt gcgacatgtc 16080

gttttcagaa gacggctgca ctgaacgtca gaagccgact gcactatagc agcggagggg 16140

ttggatcaaa gtactttgat cccgagggga accctgtggt tggcatgcac atacaaatgg 16200

acgaacggat aaaccttttc acgccctttt aaatatccgt tattctaa 16248

<210> 4

<211> 612

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<221> 编码蛋白TaGSR1的核苷酸序列

<222>（1）...（612）

<400> 4

atggacgcca agggcgcgac ggagagctca aaccctaacc gccgtccagc cagcgtaccg 60

tcggccgccg tggcgtcggc gtcggcgccg acgaagcgca tgctggcgtt ccacttcctg 120

cgcgcgctgt cccggatcca cggcgcggcc ggcccggcga ggcgccgcac gcgcaccatc 180

cgccgcgcgg cctactcctc catggcgcgc gccaccggcc cgcgccgcgc ctggagccgc 240

gcgctgctgc tccaggccca ggcgcgcgcg cggagatcca gggcggagac gtcgaggcgg 300

gccgccgtgc tcgtacggcg gcgcgtcgtc gccggaccgg cggtagcagc agcaccagca 360

ccggcacgcg ccgcttctgt cggcggacag acgtcgtcgg cggctgctat tcgcgcggcg 420

ctggtccctc cgccccctcc ggcgcggcag gcgggggagc cggccaggag cgacgcgctg 480

cggcggctcg tccccggagg cgccgggatg gagtactgca gcctgctgga ggagaccgcc 540

gactacgtcc gctgcctccg cgcgcaggtg cagctcatgc agggcctcgc cgacctcttc 600

tcctgccaat ga 612

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<221> TaGSR1的sgRNA核苷酸序列

<222>（1）...（23）

<400> 5

gcggcgcgtcgtcgccggaccgg 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 小麦 （Triticum aestivum L.）

<221> TaGSR1的sgRNA核苷酸序列

<222>（1）...（22）

<400> 6

atccacggcgcggccggcccgg 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 小麦 （Triticum aestivum L.）

<221> TaGSR1的sgRNA核苷酸序列

<222>（1）...（23）

<400> 7

aacgccagcatgcgcttcgtcgg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 小麦 （Triticum aestivum L.）

<221> TaGSR1的sgRNA核苷酸序列

<222>（1）...（23）

<400> 8

tcccggatccacggcgcggccgg 23

<210> 9

<211> 527

<212> DNA

<213> 小麦 （Triticum aestivum L.）

<221> 小麦的TaU3启动子核苷酸序列

<222>（1）...（527）

<400> 9

catgaatcca aaccacacgg agttcaaatt cccacagatt aaggctcgtc cgtcgcacaa 60

ggtaatgtgt gaatattata tctgtcgtgc aaaattgcct ggcctgcaca attgctgtta 120

tagttggcgg cagggagagt tttaacattg actagcgtgc tgataatttg tgagaaataa 180

taattgacaa gtagatactg acatttgaga agagcttctg aactgttatt agtaacaaaa 240

atggaaagct gatgcacgga aaaaggaaag aaaaagccat actttttttt aggtaggaaa 300

agaaaaagcc atacgagact gatgtctctc agatgggccg ggatctgtct atctagcagg 360

cagcagccca ccaacctcac gggccagcaa ttacgagtcc ttctaaaagc tcccgccgag 420

gggcgctggc gctgctgtgc agcagcacgt ctaacattag tcccacctcg ccagtttaca 480

gggagcagaa ccagcttata agcggaggcg cggcaccaag aagcggc 527

<210> 10

<211> 291

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 终止子T1的核苷酸序列

<222>（1）...（291）

<400> 10

tttttttttt cgttttgcat tgagttttct ccgtcgcatg tttgcagttt tattttccgt 60

tttgcattga aatttctccg tctcatgttt gcagcgtgtt caaaaagtac gcagctgtat 120

ttcacttatt tacggcgcca cattttcatg ccgtttgtgc caactatccc gagctagtga 180

atacagcttg gcttcacaca acactggtga cccgctgacc tgctcgtacc tcgtaccgtc 240

gtacggcaca gcatttggaa ttaaagggtg tgatcgatac tgcttgctgc t 291

<210> 11

<211> 1992

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays L.）

<221> 玉米泛素启动子Ubi的核苷酸序列

<222>（1）...（1992）

<400> 11

ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60

agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120

tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180

tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240

gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300

ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360

gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420

agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480

taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540

aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600

cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660

cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720

acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780

ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca cggcagctac gggggattcc tttcccaccg 840

ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga caccccctcc acaccctctt 900

tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac cagatctccc ccaaatccac 960

ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc ctctctacct 1020

tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta gttctacttc tgttcatgtt 1080

tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc gttcgtacac ggatgcgacc 1140

tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg 1200

atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt tcgttgcata 1260

gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg tgcacttgtt tgtcgggtca 1320

tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct 1380

agatcggagt agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat 1440

gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta 1500

ggataggtat acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc 1560

gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag 1620

aatactgttt caaactacct ggtgtattta ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata 1680

catcttcata gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg 1740

ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct 1800

ctaaccttga gtacctatct attataataa acaagtatgt tttataatta ttttgatctt 1860

gatatacttg gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc 1920

atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg 1980

ttacttctgc ag 1992

<210> 12

<211> 4101

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 玉米Cas9编码的核苷酸序列

<222>（1）...（4101）

<400> 12

gacaagaagt actcgatcgg cctcgatatt gggactaact ctgttggctg ggccgtgatc 60

accgacgagt acaaggtgcc ctcaaagaag ttcaaggtcc tgggcaacac cgatcggcat 120

tccatcaaga agaatctcat tggcgctctc ctgttcgaca gcggcgagac ggctgaggct 180

acgcggctca agcgcaccgc ccgcaggcgg tacacgcgca ggaagaatcg catctgctac 240

ctgcaggaga ttttctccaa cgagatggcg aaggttgacg attctttctt ccacaggctg 300

gaggagtcat tcctcgtgga ggaggataag aagcacgagc ggcatccaat cttcggcaac 360

attgtcgacg aggttgccta ccacgagaag taccctacga tctaccatct gcggaagaag 420

ctcgtggact ccacagataa ggcggacctc cgcctgatct acctcgctct ggcccacatg 480

attaagttca ggggccattt cctgatcgag ggggatctca acccggacaa tagcgatgtt 540

gacaagctgt tcatccagct cgtgcagacg tacaaccagc tcttcgagga gaaccccatt 600

aatgcgtcag gcgtcgacgc gaaggctatc ctgtccgcta ggctctcgaa gtctcggcgc 660

ctcgagaacc tgatcgccca gctgccgggc gagaagaaga acggcctgtt cgggaatctc 720

attgcgctca gcctggggct cacgcccaac ttcaagtcga atttcgatct cgctgaggac 780

gccaagctgc agctctccaa ggacacatac gacgatgacc tggataacct cctggcccag 840

atcggcgatc agtacgcgga cctgttcctc gctgccaaga atctgtcgga cgccatcctc 900

ctgtctgata ttctcagggt gaacaccgag attacgaagg ctccgctctc agcctccatg 960

atcaagcgct acgacgagca ccatcaggat ctgaccctcc tgaaggcgct ggtcaggcag 1020

cagctccccg agaagtacaa ggagatcttc ttcgatcagt cgaagaacgg ctacgctggg 1080

tacattgacg gcggggcctc tcaggaggag ttctacaagt tcatcaagcc gattctggag 1140

aagatggacg gcacggagga gctgctggtg aagctcaatc gcgaggacct cctgaggaag 1200

cagcggacat tcgataacgg cagcatccca caccagattc atctcgggga gctgcacgct 1260

atcctgagga ggcaggagga cttctaccct ttcctcaagg ataaccgcga gaagatcgag 1320

aagattctga ctttcaggat cccgtactac gtcggcccac tcgctagggg caactcccgc 1380

ttcgcttgga tgacccgcaa gtcagaggag acgatcacgc cgtggaactt cgaggaggtg 1440

gtcgacaagg gcgctagcgc tcagtcgttc atcgagagga tgacgaattt cgacaagaac 1500

ctgccaaatg agaaggtgct ccctaagcac tcgctcctgt acgagtactt cacagtctac 1560

aacgagctga ctaaggtgaa gtatgtgacc gagggcatga ggaagccggc tttcctgtct 1620

ggggagcaga agaaggccat cgtggacctc ctgttcaaga ccaaccggaa ggtcacggtt 1680

aagcagctca aggaggacta cttcaagaag attgagtgct tcgattcggt cgagatctct 1740

ggcgttgagg accgcttcaa cgcctccctg gggacctacc acgatctcct gaagatcatt 1800

aaggataagg acttcctgga caacgaggag aatgaggata tcctcgagga cattgtgctg 1860

acactcactc tgttcgagga ccgggagatg atcgaggagc gcctgaagac ttacgcccat 1920

ctcttcgatg acaaggtcat gaagcagctc aagaggagga ggtacaccgg ctgggggagg 1980

ctgagcagga agctcatcaa cggcattcgg gacaagcagt ccgggaagac gatcctcgac 2040

ttcctgaaga gcgatggctt cgcgaaccgc aatttcatgc agctgattca cgatgacagc 2100

ctcacattca aggaggatat ccagaaggct caggtgagcg gccaggggga ctcgctgcac 2160

gagcatatcg cgaacctcgc tggctcgcca gctatcaaga aggggattct gcagaccgtg 2220

aaggttgtgg acgagctggt gaaggtcatg ggcaggcaca agcctgagaa catcgtcatt 2280

gagatggccc gggagaatca gaccacgcag aagggccaga agaactcacg cgagaggatg 2340

aagaggatcg aggagggcat taaggagctg gggtcccaga tcctcaagga gcacccggtg 2400

gagaacacgc agctgcagaa tgagaagctc tacctgtact acctccagaa tggccgcgat 2460

atgtatgtgg accaggagct ggatattaac aggctcagcg attacgacgt cgatcatatc 2520

gttccacagt cattcctgaa ggatgactcc attgacaaca aggtcctcac caggtcggac 2580

aagaaccggg gcaagtctga taatgttcct tcagaggagg tcgttaagaa gatgaagaac 2640

tactggcgcc agctcctgaa tgccaagctg atcacgcagc ggaagttcga taacctcaca 2700

aaggctgaga ggggcgggct ctctgagctg gacaaggcgg gcttcatcaa gaggcagctg 2760

gtcgagacac ggcagatcac taagcacgtt gcgcagattc tcgactcacg gatgaacact 2820

aagtacgatg agaatgacaa gctgatccgc gaggtgaagg tcatcaccct gaagtcaaag 2880

ctcgtctccg acttcaggaa ggatttccag ttctacaagg ttcgggagat caacaattac 2940

caccatgccc atgacgcgta cctgaacgcg gtggtcggca cagctctgat caagaagtac 3000

ccaaagctcg agagcgagtt cgtgtacggg gactacaagg tttacgatgt gaggaagatg 3060

atcgccaagt cggagcagga gattggcaag gctaccgcca agtacttctt ctactctaac 3120

attatgaatt tcttcaagac agagatcact ctggccaatg gcgagatccg gaagcgcccc 3180

ctcatcgaga cgaacggcga gacgggggag atcgtgtggg acaagggcag ggatttcgcg 3240

accgtcagga aggttctctc catgccacaa gtgaatatcg tcaagaagac agaggtccag 3300

actggcgggt tctctaagga gtcaattctg cctaagcgga acagcgacaa gctcatcgcc 3360

cgcaagaagg actgggatcc gaagaagtac ggcgggttcg acagccccac tgtggcctac 3420

tcggtcctgg ttgtggcgaa ggttgagaag ggcaagtcca agaagctcaa gagcgtgaag 3480

gagctgctgg ggatcacgat tatggagcgc tccagcttcg agaagaaccc gatcgatttc 3540

ctggaggcga agggctacaa ggaggtgaag aaggacctga tcattaagct ccccaagtac 3600

tcactcttcg agctggagaa cggcaggaag cggatgctgg cttccgctgg cgagctgcag 3660

aaggggaacg agctggctct gccgtccaag tatgtgaact tcctctacct ggcctcccac 3720

tacgagaagc tcaagggcag ccccgaggac aacgagcaga agcagctgtt cgtcgagcag 3780

cacaagcatt acctcgacga gatcattgag cagatttccg agttctccaa gcgcgtgatc 3840

ctggccgacg cgaatctgga taaggtcctc tccgcgtaca acaagcaccg cgacaagcca 3900

atcagggagc aggctgagaa tatcattcat ctcttcaccc tgacgaacct cggcgcccct 3960

gctgctttca agtacttcga cacaactatc gatcgcaaga ggtacacaag cactaaggag 4020

gtcctggacg cgaccctcat ccaccagtcg attaccggcc tctacgagac gcgcatcgac 4080

ctgtctcagc tcgggggcga c 4101

<210> 13

<211> 571

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 终止子T2的核苷酸序列

<222>（1）...（571）

<400> 13

aagcggccag cggcgacgaa gaaggcgggg caggcgaaga agaagaagtg agctcagagc 60

tttcgttcgt atcatcggtt tcgacaacgt tcgtcaagtt caatgcatca gtttcattgc 120

gcacacacca gaatcctact gagtttgagt attatggcat tgggaaaact gtttttcttg 180

taccatttgt tgtgcttgta atttactgtg ttttttattc ggttttcgct atcgaactgt 240

gaaatggaaa tggatggaga agagttaatg aatgatatgg tccttttgtt cattctcaaa 300

ttaatattat ttgttttttc tcttatttgt tgtgtgttga atttgaaatt ataagagata 360

tgcaaacatt ttgttttgag taaaaatgtg tcaaatcgtg gcctctaatg accgaagtta 420

atatgaggag taaaacactt gtagttgtac cattatgctt attcactagg caacaaatat 480

attttcagac ctagaaaagc tgcaaatgtt actgaataca agtatgtcct cttgtgtttt 540

agacatttat gaactttcct ttatgtaatt t 571

Claims (3)

1.一种利用基因编辑敲除籽粒发育相关蛋白TaGSR1增加小麦籽粒长度的方法，其特征在于：设计靶向TaGSR1基因的单链引导RNA，构建敲除小麦体内TaGSR1基因的植物双元表达载体pBUE411-TaGSR1；利用农杆菌侵染小麦幼胚愈伤组织将植物双元表达载体pBUE411-TaGSR1含有的靶向TaGSR1基因的单链引导RNA与Cas9的表达元件转入小麦，特异性敲除TaGSR1基因，获得TaGSR1基因敲除的转基因小麦，实现小麦种子籽粒长度的增加；其中所述TaGSR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述利用基因编辑敲除籽粒发育相关蛋白TaGSR1增加小麦籽粒长度的方法，其特征在于：所述靶向TaGSR1基因的单链引导RNA的核苷酸序列是SEQ ID NO.5。

3.根据权利要求1所述利用基因编辑敲除籽粒发育相关蛋白TaGSR1增加小麦籽粒长度的方法，其特征在于：所述植物双元表达载体pBUE411-TaGSR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。