DE69831265T2 - Zusammensetzungen und verfahren für die genetische modifikation von pflanzen - Google Patents

Zusammensetzungen und verfahren für die genetische modifikation von pflanzen Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die genetische Modifikation von Pflanzen. Es wird insbesondere die Kontrolle der Genintegration und -expression in Pflanzen bereitgestellt.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Genetische Modifikationstechniken erlauben es, exogene Nucleotidsequenzen in das Genom eines Organismus zu insertieren. Für die genetische Modifikation von Pflanzen wurde eine Reihe von Verfahren beschrieben. Alle diese Verfahren basieren auf der Einführung einer fremden DNA in die Pflanzenzelle, Isolierung der Zellen, die die fremde DNA in das Genom integriert enthalten, gefolgt von anschließender Regeneration einer ganzen Pflanze. Unglücklicherweise produzieren solche Verfahren transformierte Zellen, die die eingeführte Fremd-DNA statistisch durch das Genom und oft in vielen Kopien insertiert haben.
  • Die statistische Insertion von eingeführter DNA in das Genom von Wirtszellen kann letal sein, wenn die Fremd-DNA in ein kritisch wichtiges natives Gen insertiert wird und somit dieses mutiert. Selbst wenn ein statistisches Insertionsereignis das Funktionieren eines Wirtszellgens nichts verschlechtert, kann die Expression eines insertierten Fremdgens durch "Positionseffekte", die durch die umgebende genomische DNA bewirkt werden, beeinflusst werden. In einigen Fällen wird das Gen in Stellen insertiert, in denen die Positionseffekte stark genug sind, um die Synthese einer wirksamen Produktmenge aus dem eingeführten Gen zu verhindern. In anderen Fällen hat eine Überproduktion des Genproduktes nachteilige Effekte auf die Zellen.
  • Eine Transgenexpression wird typischerweise durch die Sequenzen, einschließlich Promotoren und Enhancer, die physikalisch mit dem Transgen verbunden sind, gesteuert. Derzeit ist es nicht möglich, die Struktur von Transgenen genau zu modulieren, sobald sie in Pflanzenzellen eingeführt wurden. In vielen Anwendungen der Transgentechnologie wäre es wünschenswert, das Transgen in einer Form einzuführen und dann fähig zu sein, das Transgen in definierter Art zu modifizieren. Durch dieses Mittel könnten Transgene aktiviert oder inaktiviert werden, wenn die Sequenzen, die eine Transgenexpression kontrollieren, verändert werden können, indem entweder Sequenzen, die im ursprünglichen Transgen vorhanden sind, entfernt werden, oder in dem zusätzliche Sequenzen in das Transgen insertiert werden.
  • Für höhere Eukaryoten ist die homologe Rekombination ein essentielles Ereignis, das an Prozessen, wie DNA-Reparatur und Chromatidaustausch während der Mitose und Meiose beteiligt ist. Eine Rekombination hängt von zwei in hohem Maße homologen ausgedehnten Sequenzen und mehreren Hilfsproteinen ab. Eine Strangtrennung kann an einem beliebigen Punkt zwischen Homologieregionen erfolgen, obgleich besondere Sequenzen die Effizienz beeinflussen können. Diese Prozesse können für eine gezielte Integration von Transgenen in das Genom bestimmter Zelltypen ausgenutzt werden.
  • Selbst mit den Fortschritten bei der genetischen Modifikation höherer Pflanzen blieben die Hauptprobleme, die mit den herkömmlichen Gentransformationstechniken verbunden sind, was die oben diskutierten Probleme bezüglich variabler Expressionslevel infolge chromosomaler Positionseffekte und Kopienzahlvariation transferierter Gene angeht, im Wesentlichen ungelöst. Aus diesen Gründen werden effiziente Verfahren zum Targeting und zur Kontrolle der Insertion von Nucleotidsequenzen, die in ein Pflanzengenom integriert werden sollen, benötigt.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es werden Zusammensetzungen und Verfahren für die targetierte Integration von Nucleotidsequenzen in eine transformierte Pflanze bereitgestellt. Die Verfahren verwenden Transferkassetten, die von nicht-identischen Rekombinationsstellen flankiert werden.
  • Die Verfahren finden beim Targeting der Integration von Nucleotidsequenzen von Interesse an eine spezifische chromosomale Stelle, beim Auffinden optimaler Integrationsstellen in einem Pflanzengenom, einem Vergleichen der Promotoraktivität in transformierten Pflanzen, der Entwicklung chromosomaler Neuordnungen und anderer genetischer Manipulation von Pflanzen Verwendung.
  • Es werden auch transgene Pflanzen und Pflanzenzellen, die entsprechende nicht-identische Rekombinationsstellen enthalten, bereitgestellt.
  • Dementsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren zum Targeting der Insertion einer Nucleotidsequenz von Interesse zu einer spezifischen chromosomalen Stelle innerhalb eines Genoms einer Pflanzenzelle bereit, umfassend:
    • (a) Einführen einer Transferkassette, die die Nucleotidsequenz von Interesse flankiert von entsprechenden nicht-identischen Rekombinationsstellen umfasst, in die Pflanzenzelle, deren Genom eine Targetstelle flankiert von nicht-identischen Rekombinationsstellen umfasst; und
    • (b) Bereitstellen einer Rekombinase, die eine Rekombination an den nicht-identischen Rekombinationsstellen erkennt und durchführt.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Anlegen bevorzugter Integrationsstellen innerhalb eines Genoms einer Pflanzenzelle bereit, umfassend Einführen in die Pflanzenzelle eine Targetstelle, die eine Nucleotidsequenz flankiert von nicht-identischen Rekombinationsstellen umfasst (a) Bestimmen des Expressionslevels der Nucleotidsequenz, und (b) Selektieren einer Pflanzenzelle, die die Nucleotidsequenz exprimiert.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Abschätzung einer Promotoraktivität in einer Pflanzenzelle bereit, umfassend: (a) Einführen in die Pflanzenzelle, deren Genom eine Targetstelle flankiert von nicht-identischen Rekombinationsstellen umfasst, einer Transferkassette, die einen Promotor funktionell an eine Nucleotidsequenz, die für ein Markergen codiert, gebunden umfasst, wobei die Transferkassette von entsprechenden nicht-identischen Rekombinationsstellen flankiert wird; und (b) Bereitstellen einer Rekombinase, die eine Rekombination an nicht-identischen Rekombinationsstellen erkennt und durchführt.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Minimierung oder Eliminierung einer Expression, die aus einer statistischen Integration von DNA-Sequenzen in das Genom einer Pflanzenzelle resultiert, bereit, umfassend: (a) Einführen einer Nucleotidsequenz, die eine Targetstelle umfast, welche zwei nicht-identische Rekombinationsstellen umfasst, in das Genom einer Pflanzenzelle, wobei die Targetstelle stromabwärts eines Promotors, fusioniert an eine ATG-Translationsstartsequenz, positioniert ist; (b) Einführen einer Transferkassette, die eine Nucleotidsequenz von Interesse, flankiert von entsprechenden nicht-identischen Rekombinationsstellen, umfasst, wobei die ATG-Translationsstartsequenz der Nucleotidsequenz von Interesse durch eine der entsprechenden nicht-identischen Rekombinationsstellen der Targetstelle ersetzt wurde, und zwar derart, dass nach erfolgreichem Targeting die Nucleotidsequenz von Interesse im korrekten Leseraster positioniert ist, um eine translationale Fusion zwischen der ATG-Translationsstartsequenz und der Nucleotidsequenz von Interesse zu bilden; und (c) Bereitstellen einer Rekombinase, die eine Rekombination an die nicht-identischen Rekombinationsstellen erkennt und durchführt.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum direkten Selektieren transformierter Pflanzenzellen bereit, umfassend (a) Einführen in Pflanzenzellgenome einer Transferkassette, wobei die Pflanzenzellgenome eine Targetstelle umfassen, welche einen Promotor funktionell an eine Nucleotidsequenz, welche eine erste nicht-identische Rekombinationsstelle, eine Nucleotidsequenz von Interesse und eine zweite nicht-identische Rekombinationsstelle umfasst, gebunden, umfasst, und wobei die Transferkassette eine Nucleotidsequenz, welche für ein selektierbares Markergen, nicht-funktionell an einen Promotor gebunden, codiert, umfasst, wobei die Transferkassette von der ersten und zweiten nicht-identischen Rekombinationsstelle flankiert ist, und (b) Bereitstellen einer Rekombinase, die einer Rekombination an den nicht-identischen Rekombinationsstellen erkennt und durchführt, und Wachsenlassen der Pflanzenzelle auf einem geeigneten selektiven Agens, um Zellen zu gewinnen, die den selektierbaren Marker exprimieren.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Reduzierung der Integrationskomplexität von Transgenen in einem Pflanzenzellgenom bereit, umfassend (a) Einführen einer Transferkassette, die von nicht-identischen Rekombinationsstellen flankiert ist, in die Pflanzenzelle, wobei die Transferkassette eine Nucleotidsequenz von Interesse umfasst, das Pflanzenzellgenom eine Targetstelle umfasst, welche entsprechende nicht-identische Rekombinationsstellen umfasst; (b) Bereitstellen einer Rekombinase, die eine Rekombination an den nicht-identischen Rekombinationsstellen erkennt und durchführt, und (c) Selektieren von Pflanzenzellen mit einfachen Integrationsmustern in ihrem Genom.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Kombinieren mehrerer Transferkassetten an einem Ort in einem Genom einer Pflanzenzelle bereit, umfassend (a) Einführen einer Transferkassette, die wenigstens drei nicht-identische Rekombinationsstellen umfasst, in das Genom einer Pflanzenzelle, wobei wenigstens zwei der nicht-identischen Rekombinationsstellen, hierin als die erste und zweite Retargetingstelle bezeichnet, in naher Nachbarschaft zueinander sind; (b) Einführen einer zweiten Transferkassette, die von zwei nicht-identischen Rekombinationsstellen flankiert ist, welche den ersten Retargetingstellen der ersten Transferkassette entsprechen, in das Genom der Pflanzenzelle; und (c) Bereitstellen einer Rekombinase, die eine Rekombination an der ersten Retargetingstelle erkennt und durchführt.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Kombinieren mehrerer Transferkassetten an einem Ort in einem Genom einer Pflanzenzelle bereit, wobei das Verfahren umfasst: (a) Einführen einer Targetstelle, die wenigstens eine erste und eine zweite nicht-identische Rekombinationsstelle umfasst, in die Pflanzenzelle; (b) Einführen einer ersten Transferkassette, die in der folgenden Reihenfolge wenigstens die erste, eine dritte und die zweite nicht-identische Rekombinationsstelle umfasst, in die Pflanzenzelle, wobei die erste und die dritte nicht-identische Rekombinationsstelle der ersten Transferkassette eine erste Nucleotidsequenz von Interesse flankieren; (c) Bereitstellen einer ersten Rekombinase, die eine Rekombination an der ersten und der zweiten nicht-identischen Rekombinationsstelle erkennt und durchführt; (d) Einführen einer zweiten Transferkassette, die wenigstens die zweite und die dritte nicht-identische Rekombinationsstelle umfasst, in die Pflanzenzelle, wobei die zweite und die dritte nicht-identische Rekombinationsstelle der zweiten Transferkassette eine zweite Nucleotidsequenz von Interesse flankieren; und (e) Bereitstellen einer zweiten Rekombinase, die eine Rekombination an der zweiten und der dritten nicht-identischen Rekombinationsstelle erkennt und durchführt.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Entfernung einer Nucleotidsequenz von Interesse, die in das Genom einer Pflanzenzelle eingeführt wurde, bereit, umfassend: (a) Bereitstellen der Pflanzenzelle, in der die Nucleotidsequenz von Interesse von nicht-identischen Rekombinationsstellen flankiert wird; (b) Einführen eines chimären RNA-DNA-Oligonucleotidmoleküls, das fähig ist, eine Nucleotidumwandlung in einer der nicht-identischen Rekombinationsstellen der Transferkassette zu erkennen und durchzuführen, um so zwei identische Rekombinationsstellen zu schaffen, in die Pflanzenzelle; und (c) Bereitstellen einer Rekombinase, die ein Ausschneiden der Sequenzen zwischen zwei identischen Rekombinationsstellen erkennt und durchführt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Dikotylen- oder Monokotylen-Pflanzenzelle bereit, die stabil in ihr Genom eingebaut hat, entweder: (a) eine Transferkassette, die eine Nucleotidsequenz von Interesse umfasst, welche von wenigstens zwei nicht-identischen FRT-Rekombinationsstellen flankiert wird oder diese umfasst; oder (b) wenigstens eine erste und eine zweite Transferkassette, wobei: (i) die erste Transferkassette eine erste Nucleotidsequenz von Interesse flankiert von einer ersten und einer zweiten Rekombinationsstelle umfasst, wobei die erste und die zweite Rekombinationsstelle nicht identisch sind; (ii) die zweite Transferkassette eine zweite Nucleotidsequenz von Interesse flankiert von der zweiten Rekombinationsstelle und einer dritten Rekombinationsstelle umfasst, wobei die dritte Rekombinationsstelle mit der ersten und der zweiten Rekombinationsstelle nicht identisch ist; und (iii) die zweite Re kombinationsstelle zwischen der ersten und der zweiten Transferkassette so aufgeteilt ist, dass das Genom der Pflanzenzelle in der folgenden Reihenfolge die erste Rekombinationsstelle, die erste Nucleotidsequenz von Interesse, die zweite Rekombinationsstelle, die zweite Nucleotidsequenz von Interesse und die dritte Rekombinationsstelle umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Monokotylen-Pflanzenzelle bereit, die stabil in ihr Genom eine Transferkassette eingebaut hat, die eine Nucleotidsequenz von Interesse umfasst, welche von wenigstens zwei nicht-identischen FRT-Rekombinationsstellen oder zwei nicht-identischen LOX-Rekombinationsstellen flankiert ist oder diese umfasst, wobei die Pflanzenzelle aus einer Monokotyle stammt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine transformierte Pflanze bereit, die eine Pflanzenzelle der Erfindung umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch einen transformierten Samen einer solchen Pflanze bereit.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 liefert ein Schema zum "gene stacking" über eine ortsspezifische Integration unter Verwendung des FLP-Systems.
  • 2 liefert ein Konstrukt des repräsentativen Plasmids PHP10616.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Es werden Zusammensetzungen und Verfahren für die gerichtete, targetierte Integration von exogenen Nucleotiden in eine transformierte Pflanze bereitgestellt. Die Verfahren verwenden neue Rekombinationsstellen in einem Gentargeting-System, das ein gerichtetes Targeting von gewünschten Genen und Nucleotidsequenzen in entsprechende Rekombinationsstellen, die vorher in das Target-Pflanzengenom eingeführt wurden, erleichtert.
  • In den erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Nucleotidsequenz, die von zwei nicht-identischen Rekombinationsstellen flankiert wird, in das Genom des Targetorganismus bzw. Zielorganismus eingeführt, was eine Targetstelle zur Insertion von Nucleotidsequenzen von Interesse einrichtet. Sobald eine stabile Pflanze oder ein kultiviertes Gewebe entwickelt ist, wird ein zweites Konstrukt oder eine Nucleotidsequenz von Interesse, die von entsprechenden Rekombinationsstellen, wie die, die die Targetstelle flankiert, flankiert wird, in die stabil transformierte Pflanze oder die stabil transformierten Gewebe in Gegenwart eines Rekombinaseproteins eingeführt. Dieses Verfahren resultiert in einem Austausch der Nucleotidsequenzen zwischen den nicht-identischen Rekombinationsstellen der Targetstelle und der Transferkassette.
  • Es ist anerkannt, dass die transformierte Pflanze mehrere Targetstellen umfassen kann; d.h., Sätze nicht-identischer Rekombinationsstellen umfassen kann. Auf diese Weise sind mehrere Manipulationen der Targetstelle in der transformierten Pflanze verfügbar. Mit Targetstelle in der transformierten Pflanze ist eine DNA-Sequenz gemeint, die in das Genom der transformierten Pflanze insertiert wurde und nicht-identische Rekombinationsstellen umfasst.
  • Beispiele für Rekombinationsstellen zur Verwendung in der Erfindung sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen FRT-Stellen (siehe z.B. Schlake und Bode (1994) Biochemistry 33: 12746–12751; Huang et al. (1991) Nucleic Acids Research 19: 443–448; Paul D. Sadowski (1995) In Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology Bd. 51, S. 53–91; Michael M. Cox (1989) In Mobile DNA, Berg und Howe (Herausg.) American Society of Microbiology, Washington D. C., S. 116–670; Dixon et al. (1995) 18: 449–458; Umlauf und Cox (1988) The EMBO Journal 7: 1845–1852; Buchholz et al. (1996) Nucleic Acids Research 24: 3118–3119; Kilby et al. (1993) Trends Genet. 9: 413–421: Rossant und Geagy (1995) Nat. Med. 1: 592–594; Albert et al. (1995) The Plant J. 7: 649–659: Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 353–361: Odell et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 223: 369–378; und Dale und Ow (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10558–105620; die alle hier durch Bezugnahme aufgenommen sind); Lox (Albert et al. (1995) Plant J. 7: 649–659; Qui et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1706–1710; Stuurman et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 901–913; Odell et al. (1990) Mol. Gen. Gevet. 223: 369–378; Dale et al. (1990) Gene 91: 79–85; und Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 353–361).
  • Das Zwei-Mikron-Plasmid, das in den meisten natürlich vorkommenden Stämmen von Saccharomyces cerevisiae gefunden wird, codiert für eine ortsspezifische Rekombinase, die eine Inversion der DNA zwischen zwei invertierten Wiederholungen begünstigt. Diese Inversion spielt bei der Plasmidkopienzahl-Amplifikation eine zentrale Rolle. Das Protein, das FLP-Protein genannt wird, katalysiert ortsspezifische Rekombinationsereignisse. Die Minimalrekombinationsstelle (FRT, SEQ ID NO 1) wurde definiert und enthält zwei invertierte 13-Basenpaar (bp)-Wiederholungen, die einen asymmetrischen 8 bp-Spacer umgeben. Das FLP-Protein spaltet die Stelle an den Verbindungen der Wiederholungen und des Spacers und ist über ein 3'-Phosphat kovalent an die DNA gebunden.
  • Ortsspezifische Rekombinasen, wie FLP, spalten und religieren DNA an spezifischen Targetsequenzen, was in einer präzise definierten Rekombination zwischen zwei identischen Stellen resultiert. Um zu arbeiten, benötigt das System die Rekombinationsstellen und die Rekombinase. Es werden keine Hilfsfaktoren benötigt. Demnach kann das gesamte System in Pflanzenzellen insertiert werden und dort arbeiten.
  • Es wurde gezeigt, dass das ortsspezifische Hefe-FLP/FRT-Rekombinationssystem in Pflanzen funktioniert. Bis dato wurde das System zum Ausschneiden unerwünschter DNA verwendet. Siehe Lyznik et al. (1993) Nucleic Acid Res. 21: 969–975. Im Gegensatz dazu verwendet die vorliegende Erfindung nicht-identische FRTs für den Austausch, das Targeting, die Neuordnung, Insertion und Kontrolle der Expression von Nucleotidsequenzen im Pflanzengenom.
  • Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren wird eine transformierte Pflanze, die eine Targetstelle in ihr Genom integriert enthält, benötigt. Die Targetstelle ist dadurch charakterisiert, dass sie von nicht-identischen Rekombinationsstellen flankiert wird. Außerdem ist eine Targetingkassette erforderlich, die eine Nucleotidsequenz enthält, die von entsprechenden nicht-identischen Rekombinationsstellen, wie solche Stellen, die in der Targetstelle des transformierten Organismus enthalten sind, flankiert wird. Eine Rekombinase, die die nichtidentischen Rekombinationsstellen erkennt und eine ortsspezifische Rekombination katalysiert, ist erforderlich.
  • Es ist bekannt, dass die Rekombinase durch ein beliebiges, auf dem Fachgebiet bekanntes Mittel, bereitgestellt werden kann. D.h., sie kann im Organismus oder der Pflanzenzelle bereitgestellt werden, indem der Organismus mit einer Expressionskassette transformiert wird, die fähig ist, die Rekombinase in den Organismus durch transiente Expression zu exprimieren, oder indem Messenger-RNA (mRNA) für die Rekombinase oder das Rekombinaseprotein bereitgestellt wird.
  • Mit "nicht-identische Rekombinationsstellen" ist gemeint, dass die flankierenden Rekombinationsstellen in der Sequenz nicht identisch sind und nicht rekombinieren werden oder dass eine Rekombination zwischen den Stellen minimal sein wird. D.h., eine flankierende Rekombinationsstelle kann eine FRT-Stelle sein, wo die zweite Rekombinationsstelle eine mutierte FRT-Stelle sein kann. Die in den Verfahren der Erfindung verwendeten nicht-identischen Rekombinationsstellen verhindern eine Rekombination zwischen den zwei flankierenden Rekombinationsstellen und ein Ausschneiden der darin enthaltenen Nucleotidsequenz oder unterdrücken diese stark. Folglich ist es anerkannt, dass beliebige geeignete nicht-identische Rekombinationsstellen in der Erfindung verwendet werden können, einschließlich FRT- und mutierter FRT-Stellen, FRT- und lox-Stellen, lox- und mutierte lox-Stellen, wie auch andere Rekombinationsstellen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.
  • Eine geeignete nicht-identische Rekombinationsstelle impliziert, dass in Gegenwart von aktiver Rekombinase eine Exzision von Sequenzen zwischen zwei nicht-identischen Rekombinationsstellen, wenn überhaupt, nur mit einer Effizienz erfolgt, die beachtlich unter der der durch Rekombination vermittelten Austauschtargeting-Neuordnung von Nucleotidsequenzen im Pflanzengenom liegt. Somit umfassen geeignete nicht-identische Stellen zur Verwendung in der Erfindung solche Stellen, bei denen die Effizienz einer Rekombination zwischen den Stellen niedrig ist; beispielsweise bei denen die Effizienz weniger als etwa 30 bis etwa 50%, vorzugsweise weniger als etwa 10 bis etwa 30%, bevorzugter weniger als etwa 5 bis etwa 10%, ist.
  • Wie oben betont wurde, entsprechen die Rekombinationsstellen in der Targetingkassette denen in der Targetstelle der transformierten Pflanze. D.h., wenn die Targetstelle der transformierten Pflanze flankierende, nicht-identische Rekombinationsstellen von FRT und einem mutanten FRT enthält, wird die Targetingkassette dieselben FRT- und mutanten FRT-nicht-identischen Rekombinationsstellen enthalten.
  • Es wird weiter erkannt, dass die Rekombinase, die in der Erfindung verwendet wird, von den Rekombinationsstellen in der Targetstelle der transformierten Pflanze und der Targetingkassette abhängen wird. D.h., wenn FRT-Stellen verwendet werden, wird die FLP-Rekombi nase benötigt werden. Ebenso ist Cre-Rekombinase erforderlich, wenn lox-Stellen verwendet werden. Wenn die nicht-identischen Rekombinationsstellen sowohl eine FRT- als auch eine lox-Stelle umfassen, wird sowohl die FLP- als auch die Cre-Rekombinase in der Pflanzenzelle benötigt werden.
  • Die FLP-Rekombinase ist ein Protein, das eine ortsspezifische Reaktion katalysiert, die beim Amplifizieren der Kopienzahl des 2-Mikron-Plasmids von S. cerevisiae während der DNA-Replikation involviert ist. Das FLP-Protein wurde kloniert und exprimiert. Siehe z.B. Cox (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 4223–4227. Die FLP-Rekombinase zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann die sein, die von der Gattung Saccharomyces stammt. Es kann bevorzugt sein, die Rekombinase unter Verwendung Pflanzen-bevorzugter Kodons für eine optimale Expression in einer Pflanze von Interesse zu synthetisieren. Siehe z.B. die US-Patentanmeldung, Serial-Nr. 08/972 258, eingereicht am 18. November 1997, mit dem Titel "Novel Nucleic Acid Sequence Encoding FLP Recombinase".
  • Die Bakteriophagen-Rekombinase Cre katalysiert eine ortsspezifische Rekombination zwischen zwei lox-Stellen. Die Cre-Rekombinase ist auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. Guo et al. (1997) Nature 389: 40–46; Abremski et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 1509–1514; Chen et al. (1996) Somat. Cell Mol. Genet. 22: 477–488; und Shaikh et al. (1977) J. Biol. Chem. 272: 5695–5702. Eine solche Cre-Sequenz kann auch unter Verwendung Pflanzen-bevorzugter Kodons synthetisiert werden.
  • Wo es möglich ist, können die in das Pflanzengenom zu insertierende Nucleotidsequenzen für eine verstärkte Expression in der transformierten Pflanze optimiert werden. Wenn in der Erfindung Säuger-, Hefe- oder Bakteriengene verwendet werden, können sie unter Verwendung Pflanzen-bevorzugter Kodons zur verbesserten Expression synthetisiert werden. Es ist anerkannt, dass Dikotylengene zur Expression in Monokotylen auch unter Verwendung Monokotylen-bevorzugter Kodons synthetisiert werden können. Auf dem Fachgebiet sind Verfahren zur Synthese von Pflanzen-bevorzugten Genen verfügbar. Siehe z.B. US-Patent Nrn. 5 380 831, 5 436 391, und Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477–498.
  • Die Pflanzen-bevorzugten Kodons können aus den Kodons bestimmt werden, die häufiger in den Proteinen, die in der Pflanze von Interesse exprimiert werden, verwendet werden. Es ist bekannt, dass Monokotylen- oder Dikotylen-bevorzugte Sequenzen ebenso wie Pflanzen-bevorzugte Sequenzen für besondere Pflanzenspezies konstruiert werden können. Siehe z.B. EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324–3328; und Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477–498. US-Patent Nr. 5 380 831; US-Patent Nr. 5 436 391; und dergleichen. Es ist außerdem bekannt, dass die gesamte Gensequenz oder ein beliebiger Teil der Gensequenz optimiert oder synthetisch sein kann. D.h., es können auch vollständig optimierte oder partiell optimierte Sequenzen eingesetzt werden.
  • Es ist bekannt, dass zusätzliche Sequenzmodifikationen eine Genexpression in einem zellulären Wirt verstärken und in der Erfindung verwendet werden können. Diese umfassen Eliminierung von Sequenzen, die für unechte Polyadenylierungssignale, Exon-Intron-Spleißstellen-Signale, Transposon-artige Wiederholungen codieren, und andere gut charakterisierte Sequenzen, die für eine Genexpression schädlich sein können. Der G-C-Gehalt der Sequenz kann auf Level eingestellt werden, die für einen gegebenen zellulären Wirt durchschnittlich sind, wie es unter Bezugnahme auf bekannte Gene, die in der Wirtszelle exprimiert werden, errechnet wird. Wenn es möglich ist, wird die Sequenz so modifiziert, dass vorausgesagte Haarnadelstrukturen sekundärer mRNA vermieden werden.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch neue FLP-Rekombinationstargetstellen (FRT). Die FRT (SEQ ID NO 1) wurde als Minimalsequenz identifiziert, die zwei 13-Basenpaar-Wiederholungen, getrennt durch einen 8-Basen-Spacer, wie folgt umfasst:
    5'-GAAGTTCCTATTC[TCTAGAAA]GTATAGGAACTTC3'
    worin die Nucleotide in den Klammern die Spacerregion angeben. Die Nucleotide in der Spacerregion können durch eine Kombination von Nucleotiden ersetzt werden, solange die zwei 13-Basen-Wiederholungen durch acht Nucleotide getrennt werden. Es scheint, dass die tatsächliche Nucleotidsequenz des Spacers nicht kritisch ist, allerdings können zur Durchführung der Erfindung einige Substitutionen von Nucleotiden in der Spacerregion besser arbeiten als andere.
  • Der Acht-Basenpaar-Spacer ist bei der DNA-DNA-Paarung während des Strangaustauschs involviert. Die Asymmetrie der Region bestimmt die Richtung der Stellenanordnung im Rekombinationsereignis, das anschließend entweder zur Inversion oder zur Exzision führen wird. Wie oben angegeben wurde, kann das meiste des Spacer ohne Funktionsverlust mutiert werden. Siehe z.B. Schlake und Bode (1994) Biochemistry 33: 12746–12751.
  • Neue mutierte FRT-Stellen werden zur Verwendung bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellt. Derartige mutierte Stellen können durch Mutagenese auf PCR-Basis konstruiert werden. Obgleich hier mutierte FRT-Stellen (SEQ ID NOs 2, 3, 4 und 5) bereitgestellt werden, ist es anerkannt, dass andere mutante FRT-Stellen bei der Durchführung der Erfindung verwendet werden können. Die vorliegende Erfindung stellt nicht die Verwendung eines besonderen FRT oder einer besonderen Rekombinationsstelle dar, sondern eher, dass nicht-identische Rekombinationsstellen oder FRT-Stellen für eine targetierte Insertion und Expression von Nucleotidsequenz in einem Pflanzengenom verwendet werden können. So können andere mutierte FRT-Stellen konstruiert werden und auf der Basis der vorliegenden Offenbarung verwendet werden.
  • Wie oben diskutiert wurde, führt ein Zusammenbringen genomischer DNA, die eine Targetstelle mit nicht-identischen Rekombinationsstellen enthält, mit einem Vektor, der eine Transferkassette mit entsprechenden nicht-identischen Rekombinationsstellen enthält, in Gegenwart der Rekombinase zu einer Rekombination. Die Nucleotidsequenz der Transferkassette, die sich zwischen den flankierenden Rekombinationsstellen befindet, wird mit der Nucleotidsequenz der Targetstelle, die sich zwischen den flankierenden Rekombinationsstellen befindet, ausgetauscht. Auf diese Weise können Nucleotidsequenzen von Interesse präzise in das Genom des Wirts eingebaut werden.
  • Es ist bekannt, dass viele Variationen der Erfindung durchgeführt werden können. Beispielsweise können Targetstellen konstruiert werden, die viele nicht-identische Rekombinationsstellen haben. Auf diese Weise können mehrere Gene oder Nucleotidsequenzen an genauen Orten "gestapelt" oder im Pflanzengenom angeordnet werden. Ebenso können, sobald eine Targetstelle innerhalb des Genoms angeordnet wurde, weitere Rekombinationen eingeführt werden, indem solche Stellen in die Nucleotidsequenz der Transferkassette eingebaut werden und der Transfer der Stellen zu der Zielsequenz bzw. Targetsequenz durchgeführt wird. Sobald eine Targetstelle etabliert ist, ist es somit möglich, anschließend durch Rekombination Stellen anzufügen oder Stellen zu verändern.
  • Eine andere Variation beinhaltet die Bereitstellung einer Promotor- oder Transkriptionsinitiations-Region, die funktionell mit einer Targetstelle verknüpft ist, in einem Organismus. Vorzugsweise wird der Promotor 5' zu der ersten Rekombinationsstelle sein. Durch Transformieren des Organismus mit einer Transferkassette, die eine codierende Region umfasst, wird eine Expression der codierenden Region nach Integration der Transferkassette in die Targetstelle erfolgen. Diese Ausführungsform sorgt für ein Verfahren zur Selektion transformierter Zellen, insbesondere Pflanzenzellen, indem eine selektierbare Markersequenz als codierende Sequenz bereitgestellt wird.
  • Andere Vorzüge des erfindungsgemäßen Systems umfassen die Fähigkeit, die Komplexität der Integration von Transgenen oder transformierte DNA in einen Organismus zu reduzieren, indem Transferkassetten, wie sie oben diskutiert wurden, verwendet werden, und Organismen mit einfachen Integrationsmustern selektiert werden. In der gleichen Weise können bevorzugte Stellen innerhalb des Genoms identifiziert werden, indem mehrere Transformationsereignisse verglichen werden. Eine bevorzugte Stelle innerhalb des Genoms umfasst eine, die die Expression von essentiellen Sequenzen nicht unterbricht und für eine adäquate Expression der Transgensequenz sorgt.
  • Die Verfahren der Erfindung sorgen auch für Mittel, um mehrere Kassetten an einem Ort innerhalb des Genoms zu kombinieren. Siehe z.B. 1. Rekombinationsstellen können an Targetstellen innerhalb des Genoms addiert oder deletiert werden.
  • Um die drei Komponenten des Systems zusammen zu bringen, können beliebige Mittel, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, in der Erfindung eingesetzt werden. Beispielsweise kann eine Pflanze stabil transformiert werden, um die Targetstelle in ihrem Genom zu beherbergen. Die Rekombinase kann transient exprimiert oder bereitgestellt werden. Alternativ kann eine Nucleotidsequenz, die fähig ist, die Rekombinase zu exprimieren, stabil in das Genom der Pflanze integriert werden. In Gegenwart der entsprechenden Targetstelle und der Rekombinase wird die Transferkassette, die von entsprechenden nicht-identischen Rekombinationsstellen flankiert ist, in das Genom der transformierten Pflanze insertiert.
  • Alternativ können die Komponenten des Systems durch sexuelle Kreuzung transformierter Pflanzen zusammengebracht werden. In dieser Ausführungsform kann eine transformierte Pflanze, Elter eins, der eine Targetstelle in seinem Genom integriert hat, sexuell mit einer zweiten Pflanze, Elter zwei, der genetisch mit einer Transferkassette, die flankierende nicht-identische Rekombinationsstellen enthält, welche denen in Pflanze eins entsprechen, transformiert ist, gekreuzt werden. Entweder Pflanze eins oder Pflanze zwei enthält in ihrem Genom eine Nucleotidsequenz, die Rekombinase exprimiert. Die Rekombinase kann unter der Kontrolle eines konstitutiven oder induzierbaren Promotors stehen.
  • Induzierbare Promotoren umfassen durch Wärme induzierbare Promotoren, auf Östradiol reagierende Promotoren, durch Chemikalien induzierbare Promotoren und dergleichen. Durch ein Pathogen induzierbare Promotoren umfassen von Pathogenese abgeleitete Proteine (PR-Proteine), die nach Infektion mit einem Pathogen induziert werden, z.B. PR-Proteine, SAR-Proteine, beta-1,3-Glucanase, Chitinase, usw. Siehe z.B. Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89: 245–254; Uknes et al. (1992) The Plant Cell 4: 645–656; und Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4: 111–116. Auf diese Weise kann eine Expression von Rekombinase und anschließender Aktivität an den Rekombinationsstellen kontrolliert werden.
  • Konstitutive Promotoren zur Expression von Genen in Pflanzen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Solche Promotoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf den 35S-Promotor von Blumenkohl-Mosaikvirus (Depicker et al. (1982) Mol. Appl. Genet. 1: 561–573; Odell et al. (1985) Nature 313: 810–812), Ubiquitin-Promotor (Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675–689), Promotoren aus Genen, wie Ribulosebiphosphatcarboxylase (De Almeida et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 218: 78–98), Actin (McElroy et al. (1990) Plant J. 2: 163–171), Histon, DnaJ (Baszczynski et al. (1997) Maydica 42: 189–201), und dergleichen.
  • Die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung finden beim Targeting die Integration von transferierten Nucleotidsequenzen zu einer spezifischen chromosomalen Stelle Verwendung. Die Nucleotidsequenz kann für eine beliebige Nucleotidsequenz von Interesse codieren. Besondere Gene von Interesse umfassen die, die ein einfach analysierbares, funktionelles Merkmal für die Wirtszelle und/oder den Organismus bereitstellen, z.B. Markergene, wie auch andere Gene, die den Phänotyp der Empfängerzelle verändern, und dergleichen. Somit können Gene, die das Pflanzenwachstum, die Größe, die Suszeptibilität für eine Krankheit, für Insekten, den Nährwert und dergleichen beeinflussen, in der Erfindung ausgenützt werden. Die Nucleotidsequenz kann auch für eine "Antisense"-Sequenz codieren, um die Genexpression abzustellen oder zu modifizieren.
  • Es wird erkannt, dass die Nucleotidsequenzen in einer funktionellen Expressionseinheit oder -kassette verwendet werden können. Mit funktioneller Expressionseinheit oder -kassette ist die interessierende Nucleotidsequenz mit einem funktionellen Promotor, und in den meisten Fällen einer Terminationsregion, gemeint. Es gibt verschiedene Wege, um die funktionelle Expressionseinheit bei der Durchführung der Erfindung zu erreichen. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Nucleinsäure von Interesse in das Genom als funktionelle Expressionseinheit transferiert oder insertiert. Alternativ kann die Nucleotidsequenz in eine Stelle innerhalb des Genoms, welche 3' zu einer Promotorregion ist, insertiert werden. In diesem zuletzt genannten Fall ist die Insertion der codierenden Sequenz 3' zu der Promotorregion so, dass eine funktionelle Expressionseinheit nach Integration erreicht wird. Aus Gründen der Zweckdienlichkeit können zur Expression in Pflanzen die Nucleinsäure, die für die Zielstellen und die Transferkassetten, die die Nucleotidsequenzen von Interesse enthalten, codiert, innerhalb der Expressionskassetten enthalten sein. Die Expressionskassette wird eine transkriptionale Initiationsregion oder einen Promotor funktionell mit der Nucleinsäure, welche für das Peptid von Interesse codiert, verknüpft, umfassen. Eine solche Expressionkassette ist mit einer Vielzahl von Restriktionsstellen für die Insertion des Gens oder der Gene von Interesse ausgestattet, um unter der Transkriptionsregulation der regulatorischen Regionen zu stehen.
  • Die transkriptionale Initiationsregion, der Promotor, kann für den Wirt nativ oder homolog oder fremd oder heterolog sein oder könnte die natürliche Sequenz oder eine synthetische Sequenz sein. Mit fremd ist gemeint, dass die transkriptionale Initiationsregion im Wildtyp-Wirt, in den die transkriptionale Initiationsregion eingeführt wird, nicht gefunden wird. Bezüglich der codierenden Sequenz von Interesse kann entweder ein nativer oder heterologer Promotor verwendet werden.
  • Die Transkriptionskassette wird in 5'→3'-Richtung der Transkription eine Transkriptions- und Translationsinitiationsregion, eine DNA-Sequenz von Interesse und eine Transkriptions- und Translations-Terminierungsregion, die in Pflanzen funktionell ist, einschließen. Die Terminierungsreaktion kann mit der Transkriptionsinitiierungs-Region nativ sein, kann mit der DNA-Sequenz von Interesse nativ sein oder kann aus einer anderen Quelle stammen. Zweckdienliche Terminationsregionen sind aus dem Kartoffelproteinase-Inhibitor (PinII)-Gen oder aus dem Ti-Plasmid von A. tumifaciens verfügbar, z.B. die Octopinsynthase- und Nopalinsynthase-Terminationsregionen. Siehe auch Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141–144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671–674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141–149; Morgen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261–1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151–158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891–7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627–9639.
  • Die Expressionskassetten können zusätzlich 5'-Leadersequenzen im Expressionskassettenkonstrukt enthalten. Solche Leadersequenzen können zur Verstärkung der Translation wirken. Translations-Leader sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen: Picornavirus-Leader, z.B. EMCV-Leader (Encephalomyokarditis 5'-nicht-codierende Region) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R., und Moss, B. (1989) PNAS USA, 86: 6126–6130); Potyvirus-Leader, z.B. TEV-Leader (Tabakätzvirus) (Allison et al. (1986); MDMV-Leader (Maisverzwergungs-Mosaikvirus); Virology, 154: 9–20) und humanes Immunglobulin-schwere Kette-bindendes Protein (BiP), (Macejak, D. G. und P. Sarnow (1991) Nature, 353: 90–94); nicht-translatierter Leader aus der Hüllprotein-mRNA von Alfalfa-Mosaikvirus (AMV RNA 4) (Jobling, S. A., und Gehrke, L., (1987) Nature, 325: 622–625); Tabak-Mosaikvirus-Leader (TMV) (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, Seiten 237–256, Gallie et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15: 3257–3273); und Mais-chlorotische Fleckungsvirus-Leader (MCMV) (Lommel, S. A. et al. (1991) Virology, 81: 382–385). Siehe auch Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology, 84: 965–968. Andere Verfahren, von denen bekannt ist, dass sie die Translation verstärken, können auch verwendet werden, z.B. Introns und dergleichen.
  • Die Expressionskassetten können ein oder mehr als ein Gen oder eine oder mehr als eine Nucleinsäuresequenz enthalten, das/die übertragen und in der transformierten Pflanze exprimiert werden soll/sollen. Auf diese Weise wird jede Nucleinsäuresequenz funktionell an regulatorische 5'- und 3'-Sequenzen gebunden. Alternativ können mehrere Expressionkassetten bereitgestellt werden.
  • Im Allgemeinen wird die Expressionskassette ein selektierbares Markergen für die Selektion transformierter Zellen umfassen. Für die Selektion transformierter Zellen oder Gewebe werden selektierbare Markergene verwendet.
  • Siehe allgemein G. T. Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech., 3: 506–511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6314–6318; Yao et al. (1992) Cell, 71: 63–72; W. S. Reznikoff (1992) Mol. Microbiol., 6: 2419–2422; Barkley et al. (1980) The Operon, S. 177–220; Hu et al. (1987) Cell, 48: 555–566; Brown et al. (1987) Cell, 49: 603–612; Figge et al. (1988) Cell, 52: 713–722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA, 86: 5400–5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2549–2553; Deuschle et al. (1990) Science, 248: 480–483; M. Gossen (1993) PhD Thesis, Universität Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1917–1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell Bio., 10: 3343–3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3952–3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5072–5076; Wyborski et al. (1991) Nuc. Acids res., 19: 4647–4653; A. Hillenand-Wissmann (1989) Topics in Mol. and Struc. Biol., 10: 143–162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother., 35: 1591–1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry, 27: 1094–1104; Gatz et al. (1992) Plant J., 2: 397–404; A. L. Bonin (1993) PhD Thesis, Universität Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547–5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother., 36: 913–919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Exp. Pharmacology, 78; Gill et al. (1988) Nature 334: 721–724.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können auch ausgenutzt werden, um optimale Integrationsstellen innerhalb eines Pflanzengenoms zu finden. Auf diese Weise wird eine Pflanze mit einer Expressionskassette, die ein selektierbares Markergen umfasst, transformiert. Die Expressionskassette ist eine Targetstelle, weil das Markergen von nicht-identischen Rekombinationsstellen flankiert ist. Transformierte Protoplasten, Gewebe oder ganze Pflanzen können getestet werden, um die Aktivitätslevel des insertierten Gens zu bestimmen. Durch Vergleich zel lulärer Aktivitäten des Gens in unterschiedlichen Insertionsstellen können bevorzugte Integrationsstellen gefunden werden, in denen das Gen bei hohen oder akzeptablen Leveln exprimiert wird. Diese Pflanzen können dann mit nachfolgenden Retargeting-Techniken verwendet werden, um das Markergen durch andere Gene oder Nucleotidsequenzen von Interesse zu ersetzen. Auf diese Weise können viele Gene an der optimalen Stelle zur Expression insertiert werden. Siehe z.B. 2, die ein Schema zum "gene stacking" darstellt, welches eine ortsspezifische Integration unter Verwendung des FRT/FLP-Systems verwendet.
  • Es sind eine Vielzahl von genetischen Manipulationen verfügbar, die die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwenden, einschließlich z.B. der Vergleich der Promotoraktivität in einer transformierten Pflanze. Vor der vorliegenden Erfindung konnte die Promotoraktivität nicht genau analysiert und verglichen werden, da die chimären Gene an verschiedenen Stellen innerhalb des Pflanzengenoms insertiert wurden. Solche chromosomalen Stellen beeinträchtigten die Aktivität. Durch Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung ist ein direkter Vergleich der Promotoraktivität in einem definierten chromosomalen Kontext möglich. Unter Verwendung der Verfahren kann so eine verstärkte Aktivität von Genen erreicht werden, indem optimale chromosomale Stellen, wie auch optimale Promotoren, zur Expression in der Pflanzenzelle selektiert werden.
  • Die vorliegende Erfindung kann zur Transformation beliebiger Pflanzenspezies eingesetzt werden; diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Mais (Zea mays), Raps (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), Alfalfa (Medicago sativa), Reis (Oryza sativa), Roggen (Secale cereale), Sorghum (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), Sonnenblume (Helianthus annuus), Weizen (Triticum aestivum) Sojabohne (Glycine max), Tabak (Nicotiana tabacum), Kartoffel (Solanum tuberosum), Erdnuss (Arachis hypogaea), Baumwolle (Gossypium hirsutum), Süßkartoffel (Ipomoea batatus), Manihot (Manihot esculenta), Kaffee (Cofea spp.), Kokosnuss (Cocos nucifera), Ananas (Ananas comosus), Zitrusbäume (Citrus spp.), Kakao (Theobroma cacao), Tee (Camellia sinensis), Banane (Musa spp.), Avocado (Persea americana), Feigenbaum (Ficus casica), Guayave (Psidium guajava), Mango (Mangifera indica), Olive (Olea europaea), Papaya (Carica papaya), Cashew (Anacardium occidentale), Macadamia (Macadamia integrifolia), Mandel (Prunus amygdalus), Zuckerrüben (Beta vulgaris), Hafer, Gerste, Gemüse, Zierpflanzen und Koniferen.
  • Gemüse umfassen Tomaten (Lycopersicon esculentum), Salat (z.B. Lactuca sativa), grüne Bohnen (Phaseolus vulgaris), Limabohnen (Phaseolus limensis), Erbsen (Lathyrus spp.) und Mitglieder der Gattung Cucumis, z.B. Gurke (C. sativus), Kantalupe (C. cantalupensis) und Zuckermelone (C. melo). Zierpflanzen umfassen Azaleen (Rhododendron spp.), Hortensien (Macrophylla hydrangea), Hibiskus (Hibiscus rosasanensis), Rosen (Rosa spp.), Tulpen (Tulipa spp.), Narzissen (Narcissus spp.), Petunien (Petunia hybrida), Nelken (Dianthus caryophyllus), Weihnachtsstern (Euphorbia pulcherrima) und Chrysanthemen. Koniferen, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen z.B. Kiefern, wie Taedaföhre (Pinus taeda), Karibische Kiefer (Pinus elliotii), Gelbkiefer (Pinus ponderosa), Drehkiefer (Pinus contorta) und Montereykiefer (Pinus radiata); Douglasien (Pseudotsuga menziesii); Westamerikanische Hemlocktanne (Tsuga canadensis); Sitkafichte (Picea glauca); Redwood (Sequoia sempervirens); echte Tanne, wie Silbertanne (Abies amabilis) und Balsamtanne (Abies balsamea); und Zedern, z.B. Rote Westernzedern (Thuja plicata) und Alaska-Gelbzeder (Chamaecyparis nootkatensis). Vorzugsweise sind Pflanzen der vorliegenden Erfindung Nutzpflanzen (z.B. Mais, Alfalfa, Sonnenblume, Canola, Sojabohne, Baumwolle, Erdnuss, Sorghum, Weizen, Tabak, usw.), bevorzugter Mais- und Sojabohnenpflanzen, noch bevorzugter Maispflanzen. Es wird erkannt, dass die Verfahren der Erfindung in einem beliebigen Pflanzensystem angewendet werden können. Verfahren zur Transformation sind auf dem Fachgebiet bekannt. Auf diese Weise können genetisch modifizierte Pflanzen, Pflanzenzellen, genetisch modifiziertes Pflanzengewebe, genetisch modifizierter Pflanzensamen und dergleichen erhalten werden. Transformationsprotokolle können in Abhängigkeit vom Typ der Pflanze oder der Pflanzenzelle, d.h., Monokotyle oder Dikotyle, der zur Transformation targetiert wird, variieren. Geeignete Verfahren zum Transformieren von Pflanzenzellen umfassen Mikroinjektion (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320–334), Elektroporation (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 5602–5606, Agrobacterium-vermittelte Transformation (Hinchee et al. (1988) Biotechnology, 6: 915–921), direkten Gentransfer (Paszkowski et al. (1984) EMBO J., 3: 2717–2722) und ballistische Partikelbeschleunigung (siehe z.B. Sanford et al., US-Patent 4 945 050; WO91/10725 und McCabe et al. (1988) Biotechnology, 6: 923–926). Siehe auch Weissinger et al. (1988) Annual Rev. Genet., 22: 421–477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology, 5: 27–37 (Zwiebel); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87: 671–674 (Sojabohne); McCabe et al. (1988) Bio/Technology, 6: 923–926 (Sojabohne); Datta et al. (1990) Biotechnology, 8: 736–740 (Reis); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4305–4309 (Mais); Klein et al. (1988) Biotechnology, 6: 559–563 (Mais); WO91/10725 (Mais); Klein et al. (1988) Plant Physiol., 91: 440–444 (Mais); Fromm et al. (1990) Biotechnology, 8: 833–839; und Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell, 2: 603–618 (Mais); Hooydaas-Van Slogteren & Hooykaas (1984) Nature (London), 311: 763–764; Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 5345–5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, Herausg. G. P. Chapman et al., S. 197–209. Longman, NY (Pollen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports, 9: 415–418; und Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet., 84: 560–566 (Whisker-vermittelte Transformation); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell, 4: 1495–1505 (Elektroporation); Li et al. (1993) Plant Cell Reports, 12: 250–255, und Christou und Ford (1995) Annals of Botany, 75: 407–413 (Reis); und Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology, 14: 745–750 (Mais via Agrobacterium tumefaciens).
  • Die Zellen, die transformiert wurden, können nach herkömmlichen Ansätzen zu Pflanzen wachsen gelassen werden. Siehe z.B. McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports, 5: 81–84. Diese regenerierten Pflanzen können dann entweder mit demselben transformierten Stamm oder unterschiedlichen Stämmen bestäubt werden, und der resultierende Hybrid, der das gewünschte phänotypische Merkmal hat, identifiziert werden. Es können zwei oder mehr Generationen wachsen gelassen werden, um sicherzustellen, dass das gewünschte phänotypische Merkmal in stabiler Weise beibehalten und vererbt wird, und dann können Samen geerntet werden, um sicherzustellen, dass der gewünschte Phänotyp oder eine andere Eigenschaft erhalten wurde.
  • Es ist anzuerkennen, dass viele Mittel der Transformation für die vorliegende Erfindung eingesetzt werden können. Zum Insertieren der Targetstelle in die transformierte Pflanze kann allerdings eine Agrobacterium-vermittelte Transformation bevorzugt sein. Eine Agrobacteriumvermittelte Transformation neigt im Allgemeinen dazu, eine niedrigere Kopienzahl an transformierter DNA zu insertieren als dies bei Partikelbeschuss oder einem anderen Transformationsmittel der Fall ist.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung angeführt.
  • Experimentelles
  • Die vorliegende Erfindung stellt im Allgemeinen ein Verfahren zur Verwendung existierender und neuer FRT-Stellen in einem neuen Gentargeting-System bereit, welches ein gerichtetes Retargeting von gewünschten Genen in FRT-Stellen, die vorher in das Genom des Targetorganismus eingeführt worden waren, erleichtert. Die neuen FRT-Stellen unterscheiden sich von den früher beschriebenen FRT-Stellen in der Sequenz der 8 bp-Spacerregionen der FRT-Stellen. Frühere Publikationen haben auch gezeigt, dass eine Rekombination von Sequenzen zwischen zwei FRT-Stellen in Gegenwart von FLP-Protein nur effizient mit zwei identischen FRT-Stellen erfolgt. Siehe z.B. Umlauf und Cox (1988) Embo J. 7: 1845–1852; Schlake und Bode (1994) Biochem. 33: 12746–12751. Um die Erfindung zu verwenden, wird ein Gen oder eine DNA-Sequenz von zwei nicht-identischen FRT-Stellen flankiert und in das Genom eines Targetorganismus eingeführt. Das eingeschlossene Gen kann ein selektierbarer Marker sein, wodurch eine Selektion auf erfolgreich eingeführte Sequenzen ermöglicht wird. Eine molekulare Charakterisierung bestätigt die Integration von erwünschten Sequenzen, einschließlich vollständiger FRT-Stellen. Die nachfolgend angegebene Liste zeigt allgemeine Beispiele für Vektorkonstruktionen, die bei der Durchführung der Erfindung nützlich sind:
    • A. FRTa-P1-G1-T1-FRTb
    • B. FRTa-P1-G1-T1-FRTa
    • C. FRTb-P1-G1-T1-FRTb
    • D. P1-FRTa-P1-G1-T1-FRTb
    • E. P1-FRTa-P1-G1-T1-FRTa
    • F. P1-FRTb-P1-G1-T1-FRTb
    • G. P1-ATG::FRTa::G1(keinATG)-T1-P2-G2-T2-FRTb
    • H. P1-ATG::FRTa::G1(keinATG)-T1-P2-G2-T2-FRTb-P3-G3-T3
    • I. P1-ATG::FRTa::G1(keinATG)-T1-FRTa::G2(keinATG)-T2-FRTb
    • J. P1-ATG::FRTa::G1(keinATG)-T1-FRTa::G2(keinATG)-T2-FRTb-P3-G3-T3
    • K. P1-FRTa-G1-T1-P2-G2-T2-FRTb
    • L. P1-FRTa-G1-T1-P2-G2-T2-FRTb-P3-G3-T3
    • M. P1-FRTa-G1-T1-FRTa-G2-T2-FRTb
    • N. P1-FRTa-G1-T1-FRTa-G2-T2-FRTb-P3-G3-T3
  • Variationen davon können mit anderen Promotoren, Genen, Terminatoren oder FRT-Stellen konstruiert werden.
  • FRTa und FRTb sind zwei Beispiele für nicht-identische FRT-Stellen. P1, P2 und P3 sind unterschiedliche Promotoren, G1, G2 und G3 sind unterschiedliche Gene, T1, T2 und T3 sind unterschiedliche Terminatoren. ATG ist das Starttranslationskodon für das nachfolgende Gen. Die Bezeichnung keinATG zeigt an, dass dieses bestimmte Gen frei vom ATG-Translationsstartkodon ist. Das Symbol :: beinhaltet eine Fusion zwischen benachbarten Elementen, und wo es zwischen ATG, FRT und einem Gen verwendet wird, impliziert es, dass die Sequenzen aneinandergefügt sind, um eine "Im-Raster"-Translationsfusion zu erzeugen, die in einem korrekt exprimierten und funktionellen Genprodukt resultiert.
  • A bis F sind bevorzugte Konfigurationen zum Testen neuer FRT-Stellen auf die Fähigkeit, Sequenzen zwischen ihnen zu rekombinieren; die gewünschte Situation ist die, dass, wenn zwei gleiche Stellen verwendet werden, die Rekombination effizient ist, und dass, wenn zwei unterschiedliche Stellen verwendet werden, in Gegenwart des FLP-Proteins keine Rekombination zwischen ihnen stattfindet. G bis J sind bevorzugte Konfigurationen für eine allgemeine Verwendung bei der Entwicklung von Linien zum Retargeting. Es ist selbstverständlich, dass eine beliebige Anzahl von Genen oder andere Kombinationen von Sequenzen zur Verwendung als Teil dieser Erfindung zusammengefügt werden können. K bis N sind mögliche Konfigurationen, die auch verwendet werden könnten.
  • Sobald eine stabile Pflanze oder ein kultiviertes Gewebe mit einem der obigen Konstrukte erhalten wird, wird ein zweites Konstrukt, das von denselben FRT-Stellen, die zum Flankieren der Sequenzen im ersten Konstrukt oben verwendet wurden, flankiert ist, in Verbindung mit der Expression des FLP-Proteins eingeführt. Die neuen Vektorkonstrukte können die Folgenden sein, sind aber nicht auf diese beschränkt:
    • O. FRTa::G1(keinATG)-T1-FRTb
    • P. FRTa::G1(keinATG)-T1-P2-G2-T2-FRTb
    • Q. FRTa-G1-T1-FRTb
    • R. FRTa-G1-T1-P2-G2-T2-FRTb
  • Das FLP-Protein kann durch a) Co-Transformieren mit einem Plasmid, das ein Gen trägt, das für FLP codiert; b) Co-Einführen von FLP-mRNA oder Protein direkt; c) Verwendung einer Linie für die Anfangstransformation, die FLP entweder konstitutiv oder nach Induktion exprimiert; oder d) Auswachsenlassen der Pflanzen, die die ursprünglichen targetierten Vektoren tragen, Kreuzen zu Pflanzen, die aktives FLP-Protein exprimieren, und Selektieren von Ereignissen in der Nachkommenschaft, geliefert werden.
  • Als Arbeitsbeispiel wird die obige Sequenz O in eine Linie eingeführt, die eine Kopie der Sequenz G stabil in das Genom integriert enthält, und zwar in Gegenwart von funktionellem FLP-Protein. Zwischen identischen FRT-Stellen findet eine Rekombination statt, so dass die Sequenz zwischen FRT-Stellen in O die Sequenz zwischen den entsprechenden FRT-Stellen von Sequenz G ersetzt, was eine gelenkt targetierte, reintegrierte neue Sequenz liefert. Das neue Gen in O wird nun von dem P1-Promotor in G angetrieben. Der Zweck der Entwicklung einiger der Konstrukte ohne ein ATG-Startkodon an dem Gen ist der, dass, wenn eine zufällige Integration auftritt, es eine extrem niedrige Wahrscheinlichkeit der Expression des eingeführten Gens gibt, da, damit dies auftritt, das Fragment hinter einer endogenen Promotorregion und im korrekten Leseraster integriert werden müsste. Dies wäre extrem selten, und unsere Daten bis heute haben keine Beispiele für dieses Ereignis unter Verwendung einer Sequenz, wie z.B. O, worin das enthaltene Gen ein leicht bewertbares GUS-Gen ist, geliefert. Eine Anforderung für jedes Gen, das auf diese Weise konstruiert werden soll (d.h., kein ATG auf dem Gen, aber mit dem ATG stromaufwärts der FRT-Stelle), ist der Beweis, dass das Gen eine Fusion der FRT-Sequenz zwischen dem ATG-Kodon und dem zweiten Kodon des Proteins tolerieren kann. Bis jetzt funktionierte dies für eine ziemliche Anzahl, nicht aber für alle Gene; in den letztgenannten Fällen könnte die andere Form des Konstrukts, die das ATG beibehält (z.B. Q.), verwendet werden. Von all den oben aufgelisteten Sequenzen wird erwartet, dass sie in diesem Schema funktionieren, einige mit unterschiedlichen Frequenzen oder Effizienzien als andere.
  • Ein Problem, dem sich diese Strategie zuwendet, sind Beschränkungen mit gängigen Transformationsansätzen, insbesondere bei Pflanzen, wo eine Abgabe von DNA in Zellen oder Zellkerne und eine anschließende Integration in das Genom mehr oder weniger zufällig und nicht vorhersagbar erfolgt. Dies gilt insbesondere für Verfahren des Partikelbeschusses; es wurde argumentiert, dass Verfahren auf Agrobacterium-Basis die Tendenz zeigen, T-DNA-Randflankierte Sequenzen an stärker aktiv transkribierte Regionen des Genoms abzugeben, dass darüber hinaus aber das Verfahren noch zufallsbedingt bleibt. Für eine kommerzielle Produktentwicklung müssen daher große Zahlen (Schätzungen > 200) an Ereignissen erzeugt werden, um ein Ereignis zu identifizieren: a) das bei dem gewünschten Level exprimiert; b) bei dem das Genprodukt funktionell und wirksam ist; c) das eine einfache Integrationskomplexität hat, um eine Züchtung zu erleichtern; d) das keine externen Sequenzen enthält, die mögliche regulatorische Probleme aufwerfen; e) das über Generationen Stabilität bei der Expression aufrecht erhält; f) am wichtigsten, das keinen negativen Einfluss auf die agonomischen Leistungscharakteristika hat, wenn es während eines Züchtungsprogramms durchgeführt wird, das eine Introgression des Merkmals in verschiedene genetische Hintergründe involviert. Die Ressourcenausnutzung ist sehr groß, und so wären Schemata, die den Ressourcenbedarf deutlich verringern, für eine Produktion größerer Zahlen gewünschter Endprodukte äußerst günstig.
  • Beispiel 1. Schaffung neuer nicht-identischer FRT-Stellen
  • DNA-Fragmente, die neue FRT-Sequenzen enthalten, wurden entweder durch Synthese, Annealing und Ligieren komplementärer Oligonucleotide oder durch Schaffung von Primern zur PCR-Amplifikation (Mullis und Faloona, 1987) eines DNA-Produkts, das die neue FRT-Sequenz nahe dem 5'-Ende des PCR-Produkts enthält, konstruiert. Das neu konstruierte FRT-Produkt umfasst flankierende Restriktionsstellen, die zur Klonierung in Pflanzenexpressionseinheiten einsetzbar sind. Im Allgemeinen wird das 5'-Ende durch eine NheI-Stelle und eine terminale NcoI-Stelle flankiert. Die NcoI-Stelle enthält die Basen ATG, die vorteilhafterweise in neu entwickelten Vektorkonstrukten als Erkennungssequenz zur Initiierung eines offenen Leserasters verwendet werden. In Konstrukten auf Sequenzbasis, die keinATG/FRT genannt werden, wird die NheI-Stelle zur Klonierung verwendet; dadurch wird das stromaufwärts gelegen ATG im Verfahren eliminiert. Am 3'-Ende der FRT-Sequenz ist eine Restriktionsstelle enthalten, die eine spezifische Identifizierung der einzelnen Spacersequenze ermöglicht. Als spezifische Beispiele werden genannt: die Wildtyp-FRT-Stelle (hier FRT1 genannt) wird mit einer flankierenden BglII-Stelle kloniert, die FRT5-Stelle (Spacer TTCAAAAG) hat eine ScaI-Stelle, die FRT6-Stelle (Spacer TTCAAAAA) hat eine AatII-Stelle und die FRT7-Stelle (Spacer TTCAATAA) hat eine SpeI-Stelle. Die äußerste flankierende Restriktionsstelle ist eine XhoI-Stelle, und diese wird verwendet, um ein Gen von Interesse in das offene Leseraster zu klonieren.
  • Nachfolgend werden die Strukturen und Sequenzen der FRT-Stellen, wie sie geplant und/oder im erfindungsgemäßen Beispiel verwendet wurden, gezeigt, wobei die Positionen der Restriktionsstellen, Wiederholungen und Spacerregionen angegeben sind.
    Figure 00190001
    • 1) Wiederholung 1
    • 2) Wiederholung 2
    • 3) Invertierte Wiederholung
  • Beispiel 2. Schaffung von Pflanzentransformationsvektoren, die neue nicht-identische FRT-Stellen enthalten.
  • Auf der Basis des oben beschriebenen Konzepts von FRT-Stellen wurden PCR- oder Standardmutagenese-Protokolle verwendet, um eine XhoI-Stelle zu schaffen, die mit dem Start einer Gensequenz überlappt, welche zur Klonierung stromabwärts der FRT-Stelle verwendet werden soll; dadurch wird das ATG-Startkodon in GTG umgewandelt. Eine Ligation einer FRT mit der mutierten Gensequenz an XhoI erzeugt ein neues offenes Leseraster, das 5' zu der FRT beginnt. Eine zweite FRT-Sequenz kann stromabwärts des Terminators kloniert werden, wobei eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich PCR oder Ligation, verwendet werden. Die FRT/Gen/Terminator/FRT-Einheit kann dann verwendet werden, um Target- oder Substratkonstrukte herzustellen.
  • Targets werden geschaffen, indem ein Promotor an der NcoI-Stelle stromaufwärts der ersten FRT insertiert wird. Dies hält ein vollständiges offenes Leseraster für die FRT/Gen-Fusion aufrecht. Diese Targetkonstrukte sind zur Verwendung in Transformationsexperimenten, um erwünschte "Targetlinien" zu schaffen. Substratvektoren werden durch Klonierung mit der NheI-Stelle unter Verkürzung des Startkodons der FRT/Gen-Einheit konstruiert, wodurch das geeignete offene Leseraster eliminiert wird. Diese Substratvektoren werden in Experimenten eingesetzt, die so konzipiert sind, dass sie ein neues Gen, das durch FRT-Stellen flankiert wird, in die entsprechenden FRT-Stellen, die vorher in die Targetlinien eingeführt wurden, retargetieren. Um Mehrfach-Gen-Kassetten zu schaffen, werden in jedem Fall zusätzliche Promotor/Gen/Terminator-Einheiten zwischen dem Terminator und der zweiten FRT in Target- oder Substratmoleküle insertiert.
  • Beispiel 3. Beweis der Funktionalität neuer FRT-Stellen und des Erfordernisses für zwei identische Stellen für eine effiziente Rekombination von DNA-Sequenzen, die zwischen zwei FRT-Stellen positioniert sind.
  • Plasmide, die zwei identische oder zwei unterschiedliche FRT-Sequenzen enthalten, wurden auf Effizienz der Rekombination von Sequenzen zwischen den FRT-Stellen durch Transformation in 294-FLP, einer Variante des E. coli-Stamms MM294, mit FLP-Rekombinase, integriert in den lacZ-Lokus (Buchholz et al., 1996), untersucht. Die Stämme wurden über Nacht bei 37°C unter Schütteln wachsen gelassen, was eine konstitutive Expression von FLP-Rekombinase in den Kulturen ermöglicht. Die Plasmid-DNA wurde unter Anwendung von Standardverfahren isoliert und mit Restriktionsenzymen verdaut, die neue Restriktionsfragmente nach FLP-vermittelter Rekombination schaffen. Das Ausmaß einer Rekombination zwischen FRT-Stellen wurde abgeschätzt, indem Bandenmuster auf einem Agarosegel untersucht wurden. Tabelle 1 fasst Daten aus der Genanalyse zusammen.
  • Tabelle 1
    Figure 00210001
  • Die Resultate aus diesen Untersuchungen zeigen, dass eine Exzision von Sequenzen zwischen identischen FRT-Stellen im Allgemeinen mit hoher Effizienz erfolgt (FRT5-Stelle, SEQ ID NO 3, schien insgesamt weniger effizient zu sein als FRT1-Stelle, SEQ ID NO 2 oder die neue FRT6-Stelle, SEQ ID NO 4, und die neue FRT7-Stelle, SEQ ID NO 5). Von Bedeutung ist, dass eine Rekombination mit zwei unterschiedlichen FRT-Stellen fehlte oder wenigstens unter den Bedingungen dieses Assays für alle Kombinationen, außer FRT6, SEQ ID NO 4 und FRT7, SEQ ID NO 5, wo ein geringer Rekombinationsgrad festgestellt wurde, zumindest nicht nachweisbar war. Diese Daten lieferten eine starke Unterstützung für die potentielle Verwendbarkeit von nicht-identischen FRT-Stellen bei der Entwicklung eines gesteuerten Gen-Integrationssystems. Ein zu bemerkender Punkt ist der, dass, da eine Rekombination von Sequenzen zwischen zwei identischen FRT-Stellen mit unterschiedlichen Effizienzien in Abhängigkeit von der spezifischen verwendeten FRT-Stelle (z.B. FRT5, SEQ ID NO 3, im vorliegenden Experiment) auftreten kann, die Entwicklung von Konstrukten für eine gelenkte targetierte Integration eine wohlüberlegte Selektion von Paaren der FRT-Stellen erfordern kann, um so die gewünschte Rekombinationseffizienz zu optimieren oder eine unerwünschte Rekombination zu vermeiden.
  • Beispiel 4. Einführung von DNA-Sequenzen, die neue nicht-identische FRT-Stellen enthalten, in Pflanzenzellen, Erzeugung und Gewinnung von stabilen transgenen Ereignissen ("Targetlinien"), Konservierung von "Targetlinien" und Regeneration von Pflanzen.
  • Es wurde eine Reihe stabiler transgener Ereignisse produziert, die FRT-Targetstellen tragen. Diese Targetlinien wurden erzeugt, indem eines einer Reihe von Konstrukten, einschließlich z.B. PHP9643, PHP10616, PHP11407, PHP11410, PHP11457, PHP11599, PHP11893 oder PHP14220 (siehe Tabelle 2), in Maiszellen eingeführt wurde, und zwar entwe der durch Partikelbeschuss, wie bei Register et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25: 951–961 beschrieben wurde, oder via Agrobacterium-Co-Kultur, wie es bei Heath et al. (1997) Mol. Plant-Microbe Interact. 10: 22–227; Hiei et al. (1994) Plant J. 6: 271–282 und Ishida et al. (1996) Nat. Biotech. 14: 745–750, und US-Patentanmeldung Serial-Nr. 60/045 121 für "Agrobacterium Mediated Sorghum Transformation", eingereicht am 30. April 1997, beschrieben ist. Alle Vektoren wurden unter Verwendung von Standardtechniken der Molekularbiologie konstruiert, wie sie z.B. in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y.) beschrieben sind. Die folgende Tabelle 2 beschreibt die Komponenten in jedem der Vektoren, die zur Schaffung eines neuen Satzes an Targetlinien eingesetzt wurden. Die Kombinationsstrategie war wie folgt. Die erste Expressionseinheit enthält in jedem Fall das 2,0 kb PstI-Fragment des Mais-Ubiquitin-Promotors Ubi-1 (Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675–689). Stromabwärts zum Ubiquitin-Promotor wurden variierende FRT-Sequenzen insertiert, wobei NcoI oder andere Stellen verwendet wurden, die das ATG-Startkodon beibehielten. PHP10616 hat die codierende Sequenz mo-PAT (vorläufige US-Patentanmeldung, Serial Nr. 60/035 560, "Methods for Improving Transformation Efficiency", eingereicht am 14. Januar 1997) im Raster fusioniert an der XhoI-Stelle, die FRT1 (siehe oben, SEQ ID NO 2) flankiert. PHP11407 und PHP11893 haben GFPm-C3 (PCT/US97/07688, eingereicht am 1. Mai 1997, aus der vorläufigen Anmeldung 60/016345, eingereicht am 1. Mai 1996), das das zweite Intron aus Kartoffel-ST-LS1 enthält (Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220: 245–250) im Raster fusioniert an der XhoI-Stelle von FRT1 bzw. FRT6. Der Kartoffel-Proteinase-Inhibitor II (PinII)-Terminator (Basen 2 bis 310 von An et al. (1989) Plant Cell 1: 115–122) wurde stromabwärts der codierenden Sequenzen ligiert. PHP10616 hat eine FRT5-Sequenz (SEQ ID NO 3) stromabwärts des PinII-Terminators kloniert.
  • Figure 00230001
  • Die zweiten Expressioneinheiten haben entweder den Mais-Ubiquitin-Promotor oder alternativ entweder die verstärkte oder die Standardvariante des Blumenkohl-Mosaikvirus-35S-Promotors. Der Standard-35S-Promotor enthält die Basen –421 bis +2 (von Gardner et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9: 2871–2888), und die verstärkte Variante hat eine Basenverdoppelung –421 bis –90 stromaufwärts dieses Standard-35S-Promotors. Der 79 bp Tabak-Mosaikvirus-Leader O' (Gallie et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15: 3257–3273) wird stromabwärts des 35S-Promotors, gefolgt von dem ersten Intron des Maisalkoholdehydrogenase-ADH1-S-Gen (Dennis et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 3983–3990), insertiert. Codierende Sequenzen in diesen zweiten Expressionseinheiten umfassen entweder das Gen mo-PAT, bar (Thompson et al. (1987) EMBO J. 6: 2519–2523) oder das Gen HM1 (Johal und Briggs, Science 258: 985–987), gefolgt entweder vom PinII-Terminator oder dem 35S-Terminator (Nucleotide 7487–7639 in Gardner et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9: 2871–2888). Variierende FRT-Stellen werden stromabwärts der Terminatoren ligiert, wie es in der Tabelle gezeigt ist. In PHP9643 ist eine dritte Expressionseinheit vorhanden, und sie hat eine FRT1/GFPm-Fusion, kloniert unter Verwendung der flankierenden NheI-Stelle von FRT1 (SEQ ID NO 2), um das ATG-Startkodon von GFPm zu entfernen, wodurch es im existierenden Konstrukt nicht-funktionell gemacht wird, wobei aber eine korrekte Exzision von Sequenzen zwischen FRT1 (SEQ ID NO 2)-Stellen das GFPm mit dem Ubiquitin-Promotor und dem ATG der ersten Expressionseinheit in ein Raster bringen kann, wodurch es funktionell gemacht wird. Stromabwärts von GFPm ist der PinII-Terminator, gefolgt von einer FRT5-Sequenz (SEQ ID NO 3).
  • PHP9643 wurde in eine von pUC abgeleitete Plasmid-Hauptkette kloniert. Alle anderen Vektoren wurden in ein Plasmid vom pSB11-Typ (siehe z.B. EPA0672752A1, EPA0604662A1, EPA0687730A1 und US-Patent Nr. 5 591 616) kloniert, wobei die Expressionseinheiten zwischen den TDNA-Bordersequenzen enthalten waren. Alle sind mit der Expressionseinheit eins benachbart zu dem rechten Border ausgerichtet. Die Plasmide auf pSB11-Basis wurden in das superbinäre Plasmid pSB1 (siehe z.B. EPA0672752A1, EPA0604662A1, EPA0687730A1 und US-Patent Nr. 5 591 616) durch homologe Rekombination zwischen den zwei Plasmiden integriert. Der E. coli-Stamm HB101, der die pSB11-Derivate enthielt, wurde mit dem Agrobacterium-Stamm LBA4404, der pSB1 beherbergt, gepaart, um die co-integrierten Plasmide PHP10616, PHP11407, PHP11410, PHP11457, PHP11599, PHP11893 und PHP14220 in Agrobacterium zu schaffen (durch das Verfahren von Ditta et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 7347–7351). Die Co-Integrationsprodukte wurden durch Agrobacterium-Resistenz gegenüber Spectinomycin und SalI-Restriktions-Verdau bewiesen.
  • Tabelle 2 enthält auch ein Beispiel für einen Vektor zur Schaffung einer Targetlinie, bei der die FRT-Stellen in das Mais-Ubiquitin-Intron (letzter Eingang) als alternativer Ort zur Anordnung von FRT- oder anderen Targetstellen insertiert sind.
  • Nach Selektion von stabil transformierten Ereignissen wurden Proben dieser Targetlinien als Vorrat für zukünftige Experimente kryokonserviert, wobei der Ansatz verwendet wurde, der von Peterson (siehe Anmeldung 08/859 313) beschrieben wurde. Für einige, nicht aber für alle Ereignisse, wurde weitere Kallusprobe aus verschiedenen der stabilen transgenen Ereignisse wachsen gelassen, auf Regenerationsmedium übertragen, um eine Schösslingsbildung zu induzieren, und anschließend wurden Pflanzen isoliert und zur Reife wachsen gelassen (Register et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25: 951–961).
  • Beispiel 5. Beweis der Funktionalität neuer FRT-Stellen in Pflanzen.
  • (A) Exzision von DNA-Sequenzen zwischen zwei identischen FRT-Stellen, aber nicht, wenn sie von zwei nicht-identischen FRT-Sequenzen flankiert werden
  • Das Ausmaß einer Intraplasmid-Rekombination wurde in Pflanzen untersucht, wobei die in der folgenden Tabelle 3 beschriebenen FRT-Exzisionskonstrukte verwendet wurden. Die Vektoren PHP10968, PHP10998, PHP10969, PHP11272, PHP11243, PHP11244, PHP12140, PHP12141, PHP12156 und PHP12157 wurden konstruiert, indem der Mais-Ubiquitin-Promotor stromaufwärts der FRT-Sequenzen unter Verwendung von NcoI, oder an anderen Stellen, die das ATG-Startkodon beibehielten, ligiert wurde. Die FRT-Sequenz wurde im Raster an der flankierenden XhoI-Stelle an eine GFPm-Sequenz fusioniert, die eine Serin-zu-Threonin-Mutation am Amionsäurerest 65 in der Wildtypsequenz enthält (neue Sequenz GFPm-S65T genannt). Der pinII-Terminator wurde stromabwärts von GFPm kloniert. Die zweite Expressionseinheit besteht aus einem Promotor-freien FRT, kloniert mit der 5'-flankierenden NheI-Stelle, um das ATG-Startkodon zu entfernen, im Raster fusioniert an die GUS-codierende Sequenz (Jefferson et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 8447–8451) und gefolgt vom pinII-Terminator. Die Vektor-Hauptkette ist in allen Fällen ein von pUC abgeleitetes Plasmid. Es wurden Experimente durchgeführt, indem die angegebenen Plasmide zusammen mit dem Konstrukt PHP5096, das eine funktionelle Expressionskassette für FLP-Protein trägt, in Maiszellen geschossen wurden. PHP5096, der FLPm-Expressionsvektor, der in Experimenten mit den Exzisions- und Substratvektoren verwendet wurde, besteht aus dem Mais-Ubiquitin-Promotor, kloniert stromaufwärts der FLPm-codierenden Sequenz (US-Patentanmeldung, Serial Nr. 08/972 258 mit dem Titel "Novel Nucleic Acid Sequence Encoding FLP Recombinase"), und dem pinII-Terminator in einer von pUC abgeleiteten Plasmid-Hauptkette. In jedem Fall würde eine erfolgreiche Exzision intervenierende Sequenzen zwischen den angegebenen FRT-Stellen entfernen und dadurch ein inaktives uidA (GUS)-Gen in das Raster mit und in Nachbarschaft zu dem Ubiquitin-Promotor bringen, was zu GUS-Aktivität führt. Wenn keine Exzision erfolgt, wird keine GUS-Expression erwartet. Die Resultate für eine GUS-Expression aus diesen Experimenten sind in Tabelle 4 unten angegeben. Bei diesen Untersuchungen trat nur eine effiziente Exzision auf, wenn Konstrukte zwei identische FRT-Stellen enthielten. Im Falle der Kombination FRT6 (SEQ ID NO 4) und FRT7 (SEQ ID NO 5) wurde ein geringer Rekombinationsgrad beobachtet, was wiederum die Notwendigkeit zum Testen von Targetstellenkombinationen und zum wohlüberlegten Selektieren geeigneter Kombinationen für die Anwendung unterstreicht.
  • Figure 00260001
  • TABELLE 4
    Figure 00270001
  • B) Transiente Integration einer zweiten DNA-Sequenz, die von zwei nicht-identischen FRT-Sequenzen flankiert wird, in Pflanzenzellen
  • In Tabelle 5 unten sind Daten aus Experimenten zusammengefasst, in denen Targetlinien, die unter Verwendung der in Tabelle 2 beschriebenen Plasmide geschaffen worden waren, mit einem Substratplasmid beschossen wurden, das ein GUS-Reportergen, flankiert durch die entsprechenden FRT-Stellen, die in den Targetkonstrukten eingesetzt wurden, enthält. Dieses Experiment maß die Fähigkeit, eine transiente GUS-Expression kurz nach Einführung des Substratplasmids zu detektieren. Da es keinen Promotor vor der ersten codierenden Sequenz in den Substratplasmiden gibt, würde eine zufällige Integration, wenn sie nicht im Raster hinter einer geeigneten regulatorischen Sequenz irgendwo im Genom auftritt, nicht zu einer GUS-Expression führen. Dieses Assaysystem beurteilt dann die Fähigkeit, FRT-flankierte Gene in FRT-Stellen im Genom zu targetieren. Im Allgemeinen werden FRT-Substratvektoren (Tabelle 6) als Promotor-lose FRT/Gen-Fusionen konstruiert, die unter Verwendung der 5'-flankierenden NheI-Stelle des FRT kloniert sind, um das ATG-Startkodon zu entfernen. Gene, die im Raster an die FRT mit der flankierenden XhoI-Stelle fusioniert sind, umfassen eines von mehreren bewertbaren oder selektierbaren Markergenen, z.B. aadA (Svab et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14: 197–205), uidA, GFPm, GFPm-C3/Intron oder bar; auf diese folgt ein pinII-Terminator. In einigen Fällen (PHP10259, PHP10603, PHP11561 und PHP11633) enthalten Plasmide eine einzelne Expressionseinheit, und die zweite heterologe FRT-Stelle ist stromabwärts des pinII-Terminators kloniert. Die Substratplasmide PHP10859, PHP10997, PHP11204, PHP11699 und PHP12190 haben zusätzlich zu der ersten Expressionseinheit, die oben beschrieben wurde, eine zweite Einheit, bestehend aus dem Mais-Ubiquitin-Promotor, dem verstärkten 35S-Promotor oder einem chimären Promotor, bestehend aus der 35S-Enhancer-Region, kloniert stromaufwärts eines synthetischen Kernpromotors, der Rsyn7 genannt wird (US-Patentanmeldung, Seri al Nr. 08/661 601, eingereicht am 11. Juni 1996), kloniert stromaufwärts entweder der codierenden Sequenzen HM1, aadA, GUS oder bar, und dem pinII-Terminator. Stromabwärts des zweiten Terminators ist eine heterologe FRT insertiert. Schließlich enthalten PHP11003 und PHP11809 drei Expressionseinheiten. Die erste Einheit ist eine Promotor-lose keinATG/FRT/Gen-Fusion, wie sie oben beschrieben wurde, die zweite Einheit enthält entweder den chimären 35S-Enhancer/Rsyn7-Promotor, der oben beschrieben wurde, oder den ZmdJ1-Promotor (Baszczynski et al. (1997) Maydica 42: 189–201) stromaufwärts der GUS-codierenden Sequenz kloniert, und den pinII-Terminator. Die dritte Expressionseinheit besteht aus dem Mais-Ubiquitin-Promotor, kloniert stromaufwärts der HM1-codierenden Sequenz, den pinII-Terminator und eine heterologe FRT-Sequenz. Alle FRT-Substratvektoren werden in eine von pUC-abgeleitete Plasmid-Hauptkette kloniert. Details der Komponenten dieser Vektoren sind in Tabelle 6 beschrieben. In Tabelle 6 sind auch zwei Vektoren mit einer alternativen Anordnung von FRT-Stellen im Ubiquitin-5'-UTR oder -Intron aufgelistet.
  • TABELLE 5
    Figure 00280001
  • Figure 00290001
  • Die Resultate in Tabelle 5 zeigen, dass die Häufigkeit und der Grad der GUS-Expression unter unterschiedlichen Ereignissen variiert, wie es für Gene vorausgesagt werden könnte, die in unterschiedlichen Positionen im Genom insertiert sind. Die Voraussage ist, dass, sobald eine mit hoher Frequenz in hohem Level exprimierende Linie identifiziert ist, die Expression der Gene, die anschließend in dieselben Stellen eingeführt werden, auch höher sein wird als in anderen, niedriger exprimierenden Ereignissen.
  • C) Stabile Integration einer zweiten DNA-Sequenz, die von zwei nicht-identischen FRT-Sequenzen flankiert wird, in Pflanzenzellen
  • Ein Untersatz der stabilen transgenen "Targetlinien", die in Beispiel 4 oben beschrieben wurden, wurde in Experimenten eingesetzt, die darauf abzielen, ein neues Gen, das von denselben FRT-Stellen, die in den Targetlinien verwendet wurden und in einem zweiten Konstrukt "Substrat"-Plasmid-kloniert wurden, in diese primären Targetlinien in stabiler Weise zu retargetieren. Tabelle 7 listet die Konstrukte, die in den primären Targetlinien (aus Tabelle 2) enthalten sind, die FRT-Stellen, die in diesen Linien enthalten sind, und die Substratplasmide (aus Tabelle 6), die anschließend in die Targetlinien retargetiert wurden, auf.
  • Tabelle 8 präsentiert Daten aus stabilen transgenen Ereignissen, die ein erfolgreiches und reproduzierbares Targeting von eingeführten Sequenzen an vorher geschaffenen genomischen Targetstellen beweisen. Die angegebenen Daten sind für 18 unabhängige Targetlinien, jede mit einem Promotor-losen GUS-Konstrukt retargetiert, angegeben. Da das bar-Gen gleichzeitig in dasselbe Plasmid eingeführt wurde, liefert das Verhältnis von GUS-exprimierenden Ereignissen, die bei einer Bialophos-Selektion gewonnen wurden, ein Maß für die Retargetinghäufigkeit im Vergleich zur zufälligen Integration.
  • Tabelle 7
    Figure 00300001
  • Tabelle 8
    Figure 00310001
  • Beispiel 6. Beurteilung des Einflusses von eingeführten FRT-Sequenzen auf die Pflanzenentwicklung, Genexpression und die agronomische Leistung.
  • Eine Anfangsbeurteilung des Einflusses der eingeführten Sequenzen auf Pflanzenwachstum und Genexpression wird im Gewächshaus durchgeführt, indem regelmäßige Beobachtungen von der Bestäubung bis zum Samenansatz durchgeführt werden. Pflanzen werden sowohl selbstbestäubt als auch mit anderen Genotypen gekreuzt, um T1-Samen für eine anschließende Gewächshaus- und Feldbeurteilung zu erhalten. Zur Beurteilung der Genexpression werden sowohl qualitative wie auch quantitative Daten gesammelt und analysiert. T1-Samen von transgenen Ereignissen, die akzeptable oder wünschenswerte Expressionslevel liefern und die keinen signifikanten negativen Einfluss auf die Pflanzenentwicklung haben (beispielsweise normale Entwicklungsmorphologie haben, männlich und weiblich fertil sind, usw.), werden dann zu sammen mit nicht-transgenen Kontrollpflanzen in bewirtschafteten Feldparzellen wachsen gelassen, und es werden Standarddaten für die agronomische Leistungsfähigkeit gesammelt und beurteilt.
  • Beispiel 7. Umwandlung einer eingeführten funktionellen FRT-Sequenz in eine zweite nicht-identische funktionelle FRT-Sequenz
  • Der hier durchgeführte Ansatz zur Entwicklung eines Verfahrens zur Umwandlung zwischen verschiedenen FRT-Stellen zur Verwendung in verschiedenen Anwendungen basiert auf der vorher beschriebenen "Chimeraplasty"-Strategie zur Herstellung spezifischer targetierter Nucleotidmodifikationen an einer spezifizierten extrachromosomalen oder genomischen Zielsequenz in Tierzellen (Yoon et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 2071–2076; Cole-Strauss et al. (1996) Science 273: 1386–1389). Diese Fähigkeit in Pflanzen ist, wie es kürzlich in unseren Labors bewiesen wurde, zur Ausweitung der potentiellen Verwendung der vorliegenden Erfindung für eine breitere Anwendung günstig. Die vorgeschlagene Verwendung dieser "Chimeraplasty"-Technologie in der vorliegenden Erfindung würde Nucleotide in einer FRT-Stelle eines Paars nicht-identischer FRT-Stellen, die eine DNA-Sequenz von Interesse flankieren, targetieren und modifizieren, so dass die zwei FRT-Stellen identisch gemacht werden. Eine anschließende oder gleichzeitige Expression von FLP-Rekombinase in Zellen mit diesen FRT-Stellen-Modifikationen wird zu einer Exzision der Sequenzen zwischen diesen nun identischen FRT-Stellen führen, wodurch spezifisch die unerwünschten DNA-Sequenzen aus dem vorher geschaffenen stabilen transgenen Ereignis, das solche Sequenzen enthält, entfernt werden. Eine Anwendung dieses Ansatzes wäre z.B. der Fall eines selektierbaren Markers, der während der Anfangsschritte eines Züchtungs- oder Rückkreuzungsprogramms notwendig ist, um bevorzugte einzelne Pflanzen aufrecht zu erhalten und zu selektieren, der aber im Endprodukt nicht erwünscht ist.
  • A) Vektor-Entwicklung und -Konstruktion zum Testen einer FRT-Stellenumwandlung auf der Basis der "Chimeraplasty"
  • Die Targetvektoren zur Beurteilung dieser FRT-Stellen-Modifikationsstrategie sind unten allgemein dargestellt, worin P1 und P2 zwei verschiedene Promotoren darstellen, G1 und G2 zwei Gene darstellen und T1 und T2 zwei Terminatorregionen darstellen; diese Regionen sind als weiße Kästchen gezeigt. Andere FRT-Stellen sind angegeben und sind als dunkle Kästchen gezeigt. Eine Variante des Konstrukts hat eine dritte einmal vorkommende FRT-Stelle stromabwärts des zweiten Gens eingebaut und wird verwendet, um zu beurteilen, ob die targetierte Konversion, in diesem Fall von FRT5 in FRT6 (SEQ ID NO 4) auch zu einer Umwandlung der stromabwärts gelegenen FRT1 (SEQ ID NO 2)-Stelle zu einer FRT6 (SEQ ID NO 4)-Stelle führt. Im erstgenannten Fall sollte die Expression des stromabwärts gelegenen Gens (G1) detektiert werden, während, wenn die Umwandlung nicht für FRT5 (SEQ ID NO 3) spezifisch ist und auch die FRT1 (SEQ ID NO 2)-Stelle umgewandelt wird, dann werden beide Genaktivitäten verloren gehen. Für die hier verwendeten spezifischen Beispiele ist P1 der Mais- Ubiquitin-Promotor, ist P2 der verstärkte CaMV-35S-Promotor, ist G1 das uidA (GUS)-Gen, ist G2 das bar-Gen und sind T1 und T2 pinII-Terminatoren. Auf der Basis der verschiedenen Beschreibungen der Vektorkonstrukte vorher in der vorliegenden Anmeldung ist es verständlich, dass eine Vielzahl verschiedener Promotoren, Gene, Terminatoren oder DNA-Sequenzen oder FRT-Stellen bei der Durchführung dieses Komponentenverfahrens verwendet werden können. Die DNA-Kassetten, wie sie unten gezeigt sind, könnten entweder zu einem Plasmid auf pUC-Basis für direkte DNA-Abgabeverfahren (z.B. Partikelbeschuss) oder zu einem binären Vektor für eine Agrobacterium-basierte Transformation, wie sie früher beschrieben wurde, angeordnet werden.
  • Figure 00330001
  • B) Entwicklung von chimären Oligonucleotid-Molekülen für Chimeraplasty-basierte, targetierte Umwandlung einer FRT-Stelle
  • Unten sind spezifische Beispiele für chimäre Moleküle gezeigt, die verwendet werden, um ein einzelnes Nucleotid so zu modifizieren, dass die FRT5 (SEQ ID NO 3)-Stelle in Konstrukten, wie den oben Beschriebenen, in eine FRT6 (SEQ ID NO 4)-Stelle umgewandelt wird. Sowohl die lineare Sequenz dieser chimären Moleküle wie auch die vorausgesagte aktive Form des Moleküls (auf der Basis der obigen Publikationen von Yoon et al. und Cole-Strauss et al.) sind gezeigt. DNA-Reste sind in Großbuchstaben angegeben, RNA-Reste sind in Kleinbuchstaben angegeben, und die Stelle, die modifiziert werden soll (ein einzelnes Nucleotid als Unterschied zwischen FRT5, SEQ ID NO 3, und FRT6, SEQ ID NO 4), ist unterstrichen und fettgedruckt. Zwei Beispiele von Chimären sind unten angegeben, die sich in der Zahl der Reste stromabwärts der FRT5 (SEQ ID NO 4)-Stelle unterscheiden, die im chimären Molekülkonzept enthalten sein wird, und damit die Spezifität für die Targetsequenz bestimmen werden.
  • 1. Chimäre lineare Oligonucleotidsequenz (Sequenz enthält sechs Targetspezifische Reste stromabwärts der FRT-Stelle, die im Targetkonstrukt modifiziert wird, und sollte nur diese einzige spezifische FRT5-Stelle, SEQ ID NO 3, in eine FRT6-Stelle, SEQ ID NO 4, umwandeln)
    Figure 00330002
  • Aktive Oligonucleotid-Konformation
    Figure 00340001
  • 2. Chimäre lineare Oligonucleotidsequenz (Sequenz enthält Reste, die nur für Sequenzen in der FRT-Stelle spezifisch sind, und so nur eine FRT5-Stelle, SEQ ID NO 3, in einem Zielmolekül in einer FRT6-Stelle (SEQ ID NO 4) umwandeln sollten)
    Figure 00340002
  • Aktive Oligonucleotid-Konformation
    Figure 00340003
  • Vektorkonstruktionen und chimäre Oligonucleotid-Moleküle, wie sie oben beschrieben sind, wurden gebildet und in Experimenten verwendet.
  • C) Beweis einer Umwandlung einer FRT-Stelle in eine andere
  • Stabile transgene Maislinien werden mit den Konstrukten, wie sie oben beschrieben wurden, oder mit verwandten, durch Transformieren in die Konstrukte und Selektieren an Bialophos, wie vorstehend beschrieben, erzeugt. Gewebe, die zur chimären Abgabe zu verwenden sind, werden in nicht-Bialophos-enthaltende Medien übertragen, und die chimären Oligonucleotide werden in Zellen dieser stabilen Ereignisse durch Partikelbeschuss zusammen mit Co-Abgabe von PHP5096, das eine funktionelle FLP-Rekombinase-Expressionskassette trägt, abgegeben. In Kontrollexperimenten werden nur chimäre Moleküle oder nur PHP5096 abgegeben. Nach genügend Zeit, um Zellen ohne Bialophos-Selektion zu gewinnen, werden Proben der beschossenen Ereignisse auf GUS-Experession beurteilt. Für diese beschossenen Ereignisse, die das Konstrukt mit der stromabwärts gelegenen FRT1-Stelle (SEQ ID NO 2) enthalten, die keine GUS-Expression zeigen, wird eine entsprechende Probe von Zellen plattiert und auf Medium mit oder ohne Bialophos-Selektion plattiert und wachsen gelassen, um die Empfindlichkeit gegenüber der Chemikalie zu analysieren. Wenn die chimären Moleküle spezifisch sind, um nur die FRT5-Stelle (SEQ ID NO 3) zu modifizieren, dann sollten zwischen Behand lungen mit oder ohne Selektion keine Unterschiede in der Zahl und im Wachstum von Zellen beobachtet werden. Anderenfalls sollte reduziertes Wachstum und reduzierte Gewinnung festgestellt werden.
  • D) Molekulare Verifikation einer stabilen Umwandlung von FRT-Stellen
  • DNA von den Proben, die eine GUS-Expression aufweisen, wird isoliert, bei Bedarf durch PCR amplifiziert und durch Standardverfahren in der Region, die der vorausgesagten Nucleotidkonversion entspricht, sequenziert. Eine ausreichende Strecke an DNA wird sequenziert, um die gesamte ursprünglich eingeführte DNA-Region abzudecken, um so eine korrekte und spezifische Umwandlung zu bestätigen. Unter Verwendung von Standardverfahren für PCR, Southern-Analyse und/oder Sequenzierung von GUS-exprimierenden und nicht-exprimierenden Proben wird das Vorliegen oder das Fehlen spezifischer DNA-Fragmente vor und nach dem chimären Molekül und FLP-Rekombinase-Abgabe entwickelt, und somit werden die oben gemachten visuellen und biochemischen Beobachtungen untermauert.
  • E) Verwendbarkeit der FRT-Stellenumwandlung auf Chimeraplasty in einer "transgene stacking"-Strategie für Pflanzen
  • In 1 ist eine potentielle Strategie zum Kombinieren oder "stacking" mehrerer gewünschter Transgene an einem genomischen Ort unter Verwendung des Systems der vorliegenden Erfindung beschrieben, welches auf nicht-identischen FRT beruht. Während ein "gene stacking" ohne die Verwendung des targetierten FRT-Umwandlungsverfahrens, das in diesem Beispiel 7 beschrieben wird, erreicht werden kann, erweitert dieses zuletzt genannte Verfahren die Fähigkeit des Systems, indem es eine in vivo-Umwandlung von FRT-Stellen unter Schaffung neuer Stellen anstatt einer Wiedereinführung neuer FRT-Stellen durch Transformation ermöglicht. Im Schaubild von 1 zeigt eine FRT-Stelle mit einem Stern daneben an, dass sie ursprünglich geschaffen wurde, um bezüglich einer Rekombination zwischen ihr und der äquivalenten FRT-Stelle ohne Stern nicht funktionell zu sein, die aber bei Umwandlung mit dem hier beschriebenen Ansatz auf Chimeraplasty-Basis zur Rekombination mit ihrem äquivalenten Gegenstück ohne Stern fähig gemacht wird. In dem in der Figur präsentierten spezifischen Beispiel würde diese z.B. die Entfernung eines selektierbaren Markers, entweder um ihn nicht länger vorliegen zu haben, oder um eine Wiederverwendung des selektierbaren Markers in zukünftigen Transformationen zu ermöglichen, erleichtern. Somit liefert dieses Verfahren auch einen Mechanismus zum Recycling selektierbarer Marker, wie es bei der Verwendung des FRT-Systems der vorliegenden Erfindung allein möglich ist.
  • Diskussion
  • Bis dato war die Hauptanwendung des FLP/FRT-Systems in Pflanzen die DNA-Exzision (Lyznik et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21: 969–975). Beispielsweise wird zuerst ein Gen, z.B. ein selektierbarer Marker, der von FRT-Stellen flankiert wird, durch einen von mehreren Transformationsansätzen eingeführt, und stabile transgene Ereignisse oder Pflanzen werden über geeignete Selektion gewonnen. Um das selektierbare Markergen zu eliminieren, wird dann das FLP-Protein in den Zellen entweder transient durch Einführung eines Plasmids, das eine FLP-Expressionskassette trägt, oder stabil durch Integration einer eingeführten FLP-Expressionskassette oder durch Kreuzen von Pflanzen, die das FRT-flankierte, selektierbare Markergen tragen, mit Pflanzen, die Sequenzen für aktives FLP-Protein tragen und exprimieren, exprimiert (US-Patentanmeldung, Serial Nr. 08/972 258, "Novel Nucleic Acid Sequence Encoding FLP Rekombinase").
  • Ein Hauptproblem, das mit der Entwicklung des FLP/FRT-Systems zum Integrieren von Genen in Tiere oder Pflanzen verbunden ist, resultiert aus der Tatsache, dass die durch Hefe-FLP-Rekombinase katalysierte Rekombinationsreaktion ein reversibler Prozess ist (Sadowski (1995) in Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology 51: 53–91). Beispielsweise sollte eine Rekombination nach Einführung einer DNA-Sequenz, die von ähnlich orientierten FRT-Stellen flankiert wird, in Pflanzenzellen in Gegenwart von aktiv exprimierender FLP-Rekombinase zur Insertion der neuen DNA-Sequenzen an der endogenen FRT-Stelle führen. Allerdings würde die Umkehrreaktion bei fortgesetzter Expression des FLP-Enzyms zur Reexzision der eingeführten Sequenzen führen, und zwar infolge einer Rekombination zwischen den identischen FRT-Stellen. Da die Reaktion reversibel ist, können Integration und Exzision sich wiederholt in Richtung eines Gleichgewichts fortsetzen. Wenn sich die Zellen teilen und die DNA-Substratkonzentration pro Zelle abnimmt, nimmt die Integrationswahrscheinlichkeit ab, so dass, solange das aktive FLP-Protein exprimiert wird, die Reaktion in Richtung des nicht-integrierten Zustands gesteuert werden wird. Um eine Integration zu begünstigen, muss eine Situation entwickelt werden, die eine Reexzision ausschließt, sobald eine Integration auftritt. Es wurde eine Reihe von Strategien vorgeschlagen, einschließlich Begrenzung der Aktivitätsdauer von FLP-Rekombinase durch induzierbare Expression oder durch direkte Einführung von FLP-Protein oder RNA in Zellen (Sadowski (1995) Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology 51: 53–91), aber bis dato wurde kein routinemäßiges, nicht-zufälliges Integrationssystem für Pflanzen entwickelt.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt die Entwicklung eines nützlichen neuen Gentargeting-Systems für Pflanzen, das die Hefe-FLP-Rekombinase oder eine modifizierte FLP-Rekombinase verwendet, die so konzipiert ist, dass sie in bestimmten Pflanzenspezies arbeitet und das neue nicht-identische FRT-Stellen verwendet, die für eine gerichtete, nicht-reversible DNA-Integration verwendet werden können. Außerdem wird hierin eine neue Verwendung von akzessorischen Technologien, z.B. "Chimeraplasty", beschrieben, die eine in vivo- oder in vitro-Modifikation von DNA-Sequenzen, z.B. FRT-Stellen, um die Nützlichkeit des Systems weiter auszudehnen, ermöglicht. Bereitgestellte Daten beweisen die erfolgreiche, stabile Integration von DNA-Sequenzen zwischen vorher eingeführten, nicht-identischen FRT-Stellen in Mais. Wir zeigen auch, dass die DNA-Sequenzen zwischen den FRT-Stellen anschließend durch eine zweite DNA-Sequenz, die durch dieselben FRT-Stellen wie die erste flankiert wird, ersetzt werden können. Zusammen beweisen diese Resultate, dass es möglich ist, Paare nicht- identischer FRT-Stellen an bestimmten genomischen Orten einzuführen und wiederzugewinnen, dass man wünschenswerte oder bevorzugte genomische Orte zum Exprimieren von DNA-Sequenzen von Interesse selektieren kann und dass diese selektierten Orte eingesetzt werden können, um andere DNA-Sequenzen von Interesse zu retargetieren. Außer dem offensichtlichen Nutzen, fähig zu sein, Gene in das Genom von Pflanzen zu integrieren, stellt die vorliegende Erfindung ein Mittel zur Erleichterung der Einführung von neuen Genen oder DNA-Sequenzen in genomische Orte, von denen vorher bestimmt wurde, dass sie unter dem Gesichtspunkt der Bereitstellung geeigneter Level einer stabilen Expression des eingeführten Gens (der eingeführten Gene) günstig sind und keine nachteiligen Einflüsse auf agronomische Charakteristika, einschließlich Ertrag, haben, bereit. Außerdem stellt die Erfindung ein System bereit, durch das eine Integration von zwei oder mehr Genen auf denselben genomischen Ort targetiert werden kann, wodurch ein Mechanismus zum "gene stacking" geliefert wird. Diese gestapelten Gene können dann aufrecht erhalten werden und in Züchtungsprogrammen als ein eng verknüpftes Paar von Merkmalen behandelt werden. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Einführung, Beibehaltung und Züchtung mehrerer genetischer Merkmale von Interesse, einschließlich agronomischer Merkmale, kommerziell wichtiger Gene oder heterologer Genprodukte, bereit.
  • Die Erfindung schlägt ferner eine Verwendung des nicht-rekombinanten Merkmals nicht-identischer FRT-Stellen vor, um die Schaffung eines Satzes von "Elter"-Linien zu ermöglichen, die zunächst für die gewünschte Expression und Leistungsparameter, die oben beschrieben werden, gut charakterisiert werden. Diese Linien dienen dann als Grundlage zur Einführung neuer Merkmale in dieselben vorher definierten Stellen im Genom, in das die Anfangsgene eingeführt worden waren. Es müssten viel weniger Ereignisse erzeugt werden, da eine Integration vorzugsweise in Stellen erfolgt, von denen gezeigt wurde, dass sie gut exprimieren und einen minimalen negativen Einfluss auf die Leistungsfähigkeit haben.
  • Obgleich die vorstehende Erfindung durch Erläuterung und Beispiele zu Zwecken der Klarheit des Verständnisses im Detail beschrieben wurde, wird es klar sein, dass gewisse Änderungen und Modifikationen innerhalb des Rahmens der beigefügten Ansprüche durchgeführt werden können.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001

Claims (37)

  1. Verfahren zum Targeting der Insertion einer Nucleotidsequenz von Interesse zu einer spezifischen chromosomalen Stelle innerhalb eines Genoms einer Pflanzenzelle, umfassend: (a) Einführen einer Transferkassette, die die Nucleotidsequenz von Interesse flankiert von entsprechenden nicht-identischen Rekombinationsstellen umfasst, in die Pflanzenzelle, deren Genom eine Targetstelle flankiert von nicht-identischen Rekombinationsstellen umfasst; (b) Bereitstellen einer Rekombinase, die eine Rekombination an den nicht-identischen Rekombinationstellen erkennt und durchführt.
  2. Verfahren zum Anlegen bevorzugter Integrationsstellen innerhalb eines Genoms einer Pflanzenzelle, umfassend: (a) Einführen in die Pflanzenzelle eine Targetstelle, die eine Nucleotidsequenz flankiert von nicht-identischen Rekombinationsstellen umfasst; (b) Bestimmen des Expressionslevels der Nucleotidsequenz; und (c) Selektieren einer Pflanzenzelle, die die Nucleotidsequenz exprimiert.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, weiter umfassend: (d) Einführen in die Pflanzenzelle von Schritt (c) eine Transferkassette, wobei die Transferkassette eine Nucleotidsequenz von Interesse flankiert von entsprechenden nicht-identischen Rekombinationsstellen umfasst; und (e) Bereitstellen eine Rekombinase, die eine Rekombination an den nicht-identischen Rekombinationsstellen erkennt und durchführt.
  4. Verfahren zur Abschätzung einer Promotoraktivität in einer Pflanzenzelle, umfassend: (a) Einführen in die Pflanzenzelle, deren Genom eine Targetstelle flankiert von nicht-identischen Rekombinationsstellen umfasst, einer Transferkassette, die einen Promotor funktionell an eine Nucleotidsequenz, die für ein Markergen codiert, umfasst, wobei die Transferkassette von entsprechenden nicht-identischen Rekombinationsstellen flankiert wird; und (b) Bereitstellen einer Rekombinase, die eine Rekombination an den nicht-identischen Rekombinationsstellen erkennt und durchführt.
  5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei die Transferkassette außerdem ein selektierbares Markergen umfasst.
  6. Verfahren zur Minimierung oder Eliminierung einer Expression, die aus einer statistischen Integration von DNA-Sequenzen in das Genom einer Pflanzenzelle resultiert, umfassend: (a) Einführen einer Nucleotidsequenz, die eine Targetstelle umfasst, welche zwei nicht-identische Rekombinationsstellen umfasst, in das Genom einer Pflanzenzelle, wobei die Targetstelle, stromabwärts eines Promotors fusioniert, an eine ATG-Translationsstartsequenz positioniert ist; (b) Einführen einer Transferkassette, die eine Nucleotidsequenz von Interesse flankiert von entsprechenden nicht-identischen Rekombinationsstellen umfasst, wobei die ATG-Translationsstartsequenz der Nucleotidsequenz von Interesse durch eine der entsprechenden nicht-identischen Rekombinationsstellen einer Targetstelle ersetzt wurde und zwar derart, dass nach erfolgreichem Targeting die Nucleotidsequenz von Interesse im korrekten Leseraster positioniert ist, um eine translationale Fusion zwischen der ATG-Translationsstartsequenz und der Nucleotidsequenz von Interesse zu bilden; und (c) Bereitstellen einer Rekombinase, die eine Rekombination an die nicht-identischen Rekombinationsstellen erkennt und durchführt.
  7. Verfahren zum direkten Selektieren transformierter Pflanzenzellen, umfassend: (a) Einführen in Pflanzenzellgenome eine Transferkassette, wobei die Pflanzenzellgenome eine Targetstelle umfassen, welche einen Promotor funktionell an eine Nucleotidsequenz, welche eine erste nicht-identische Rekombinationsstelle, eine Nucleotidsequenz von Interesse und eine zweite nicht-identische Rekombinationsstelle umfasst, umfasst und wobei die Transferkassette eine Nucleotidsequenz, welche für ein selektierbares Markergen, nicht funktionell an einen Promotor gebunden, codiert, umfasst, wobei die Transferkassette von der ersten und zweiten nicht-identischen Rekombinationsstelle flankiert ist; und (b) Bereitstellen einer Rekombinase, die eine Rekombination an den nicht-identischen Rekombinationsstellen erkennt und durchführt, und Wachsen der Pflanzenzelle auf einem geeigneten selektiven Agens, um Zellen zu gewinnen, die den selektierbaren Marker exprimieren.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Transferkassette wenigstens eine zusätzliche codierende Region, funktionell an einen dritten Promotor gebunden, umfasst, welcher eine Expression in der Pflanzenzelle steuert.
  9. Verfahren zur Reduzierung der Integrationskomplexität von Transgenen in einem Pflanzenzellgenom, umfassend: (a) Einführen einer Transferkassette, die von nicht-identischen Rekombinationsstellen flankiert ist, in die Pflanzenzelle, wobei die Transferkassette eine Nucleotidsequenz von Interesse umfasst, das Pflanzenzellgenom eine Targetstelle umfasst, welche entsprechende nicht-identische Rekombinationsstellen umfasst; (b) Bereitstellen einer Rekombinase, die eine Rekombination an den nicht-identischen Rekombinationsstellen erkennt und durchführt; und (c) Selektieren von Pflanzenzellen mit einfachen Integrationsmustern in ihrem Genom.
  10. Verfahren zum Kombinieren mehrerer Transferkassetten an einem Ort in einem Genom einer Pflanzenzelle, umfassend: (a) Einführen einer Transferkassette, die wenigstens drei nicht-identische Rekombinationsstellen umfasst, in das Genom der Pflanzenzelle, wobei wenigstens zwei der nicht-identischen Rekombinationsstellen, hierin als die erste und zweite Retargetingstelle bezeichnet, in naher Nachbarschaft zueinander sind; (b) Einführen einer zweiten Transferkassette, die von zwei nicht identischen Rekombinationsstellen flankiert ist, welche den ersten Retargetingstellen der ersten Transferkassette entsprechen, in das Genom der Pflanzenzelle; und (c) Bereitstellen einer Rekombinase, die eine Rekombination an der ersten Retargetingstelle erkennt und durchführt.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die zweite Transferkassette eine vierte nicht-identische Rekombinationsstelle umfasst.
  12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die zweite Transferkassette einen selektierbaren Marker umfasst.
  13. Verfahren zum Kombinieren mehrerer Transferkassetten an einem Ort in einem Genom einer Pflanzenzelle, wobei das Verfahren umfasst: (a) Einführen einer Targetstelle, die wenigstens eine erste und eine zweite nicht-identische Rekombinationsstelle umfasst, in die Pflanzenzelle; (b) Einführen einer ersten Transferkassette, die in der folgenden Reihenfolge wenigstens die erste, eine dritte und die zweite nicht-identische Rekombinationsstelle umfasst, in die Pflanzenzelle, wobei die erste und die dritte nicht-identische Rekombinationsstelle der ersten Transferkassette eine erste Nucleotidsequenz von Interesse flankieren; (c) Bereitstellen einer ersten Rekombinase, die eine Rekombination an der ersten und der zweiten nicht-identischen Rekombinationsstelle erkennt und durchführt; (d) Einführen einer zweiten Transferkassette, die wenigstens die zweite und die dritte nicht-identische Rekombinationsstelle umfasst, in die Pflanzenzelle, wobei die zweite und die dritte nicht-identische Rekombinationsstelle der zweiten Transferkassette eine zweite Nucleotidsequenz von Interesse flankieren; und (e) Bereitstellen einer zweiten Rekombinase, die eine Rekombination an der zweiten und der dritten nicht-identischen Rekombinationsstelle erkennt und durchführt.
  14. Verfahren zur Entfernung einer Nucleotidsequenz von Interesse, die in das Genom einer Pflanzenzelle eingeführt wurde, umfassend: (a) Bereitstellen der Pflanzenzelle, in der die Nucleotidsequenz von Interesse von nicht-identischen Rekombinationsstellen flankiert wird; (b) Einführen eines chimeren RNA-DNA-Oligonucleotidmoleküls, das fähig ist, eine Nucleotidumwandlung in einer der nicht-identischen Rekombinationsstellen der Transferkassette zu erkennen und durchzuführen, um so zwei identische Rekombinationsstellen zu schaffen, in die Pflanzenzelle; und (c) Bereitstellen einer Rekombinase, die ein Ausschneiden der Sequenzen zwischen den zwei identischen Rekombinationsstellen erkennt und durchführt.
  15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei wenigstens eine der nicht-identischen Rekombinationsstellen eine FRT-, eine mutierte FRT-, eine LOX- oder mutierte LOX-Stelle ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei wenigstens eine der Stellen eine FRT-Stelle oder eine mutierte FRT-Stelle ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die mutierte FRT-Stelle FRT 5 (SEQ ID NO: 3), FRT 6 (SEQ ID NO: 4) oder FRT 7 (SEQ ID NO: 5) ist.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 3 bis 14, wobei ein Bereitstellen der Rekombinase genetisches Transformieren der Pflanze mit eine Expressionskassette, die eine Nucleotidsequenz enthält, welche für die Rekombinase codiert, umfasst.
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 3 bis 12, 14 oder 15, wobei die Rekombinase FLP oder Cre umfasst.
  20. Verfahren nach Anspruch 13, wobei wenigstens die erste oder die zweite Rekombinase FLP oder Cre umfasst.
  21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei die Rekombinase unter Verwendung Mais-bevorzugter Codons synthetisiert wurde.
  22. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Pflanzenzelle aus einer Monokotyle stammt.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Monokotyle Mais ist.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die Pflanzenzelle aus einer Dikotyle stammt.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Dikotyle Canola, Brassica, Sojabohne, Sonnenblume oder Baumwolle ist.
  26. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Pflanzenzelle in einer Pflanze enthalten ist.
  27. Dikotylen- oder Monokotylen-Pflanzenzelle, die stabil in ihr Genom eingebaut hat, entweder: (a) eine Transferkassette, die eine Nucleotidsequenz von Interesse umfasst, welche von wenigstens zwei nicht-identischen Rekombinationsstellen flankiert wird oder diese umfasst; oder (b) wenigstens eine erste und eine zweite Transferkassette, wobei: (i) die erste Transferkassette eine erste Nucleotidsequenz von Interesse flankiert von einer ersten und einer zweiten Rekombinationsstelle umfasst, wobei die erste und die zweite Rekombinationsstelle nicht identisch sind; (ii) die zweite Transferkassette eine zweite Nucleotidsequenz von Interesse flankiert von der zweiten Rekombinationsstelle und einer dritten Rekombinationsstelle umfasst, wobei die dritte Rekombinationsstelle mit der ersten und der zweiten Rekombinationsstelle nicht identisch ist; und (iii) die zweite Rekombinationsstelle zwischen der ersten und der zweiten Transferkassette so aufgeteilt ist, dass das Genom der Pflanzenzelle in der folgenden Reihenfolge die erste Rekombinationsstelle, die erste Nucleotidsequenz von Interesse, die zweite Rekombinationsstelle, die zweite Nucleotidsequenz von Interesse und die dritte Rekombinationsstelle umfasst; oder eine Monokotylen-Pflanzenzelle, die stabil in ihr Genom eine Transferkassette eingebaut hat, die eine Nucleotidsequenz von Interesse umfasst, welche von wenigstens zwei nicht-identischen FRT-Rekombinationsstellen oder zwei nicht-identischen LOX-Rekombinationsstellen flankiert ist oder diese umfasst, wobei die Pflanzenzelle aus einer Monokotyle stammt.
  28. Dikotylen-Pflanzenzelle nach Anspruch 27, die eine Zelle aus einer Canola-, Brassica-, Sojabohnen-, Sonnenblumen- oder Baumwollpflanze ist.
  29. Monokotylenpflanzenzelle nach Anspruch 27, wobei die Zelle aus einer Maispflanze stammt.
  30. Pflanzenzelle nach Anspruch 27, die stabil in ihr Genom wenigstens eine erste und eine zweite Transferkassette, wie sie in Teil (b) definiert ist, hat, wobei wenigstens eine der nicht-identischen Rekombinationsstellen eine FRT-Stelle, eine mutierte FRT-Stelle, eine LOX-Stelle oder eine mutierte LOX-Stelle ist.
  31. Pflanzenzelle nach Anspruch 30, wobei wenigstens eine der mutierten FRT-Stellen FRT5 (SEQ ID NO: 3), FRT6 (SEQ ID NO: 4) oder FRT7 (SEQ ID NO: 5) ist.
  32. Transformierte Pflanze, die eine Zelle nach einem der Ansprüche 27 bis 31 umfasst.
  33. Transformierter Samen der Pflanze nach Anspruch 32.
  34. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, das außerdem Wachsen der Zelle zu einer Pflanze umfasst.
  35. Verfahren nach Anspruch 34, das außerdem Bestäuben der Pflanze mit Pollen aus einer Pflanze desselben Stamms oder eines anderen Stamms und Identifizieren der resultierenden Pflanzen mit dem gewünschten phänotypischen Merkmal umfasst.
  36. Verfahren nach Anspruch 34 oder 35, das Wachsenlassen von zwei oder mehreren Pflanzengenerationen umfasst.
  37. Verfahren nach Anspruch 35 oder 36, das außerdem ein Ernten von Samen aus den Pflanzen umfasst.
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