BR112021009416A2 - sequências de ácido nucleico para detecção de planta de soja dbn8002 e métodos de detecção das mesmas - Google Patents

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Abstract

SEQUÊNCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO PARA DETECÇÃO DE PLANTA DE SOJA DBN8002 E MÉTODOS DE DETECÇÃO DAS MESMAS. São divulgadas sequências de ácido nucleico para detectar a planta de soja DBN8002 e um método de detecção das mesmas. As sequências de ácido nucleico compreendem SEQ ID NO: 1 ou a sequência complementar da mesma e / ou SEQ ID NO: 2 ou a sequência complementar da mesma. A planta de soja DBN8002 tem uma resistência relativamente boa a insetos lepidópteros, tem uma tolerância relativamente boa a herbicidas glufosinato-amônio e não tem influência no rendimento, e os métodos de detecção podem identificar com precisão e rapidamente se uma amostra biológica contém uma molécula de DNA do evento transgênico de soja DBN8002.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “SEQUÊNCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO PARA DETECÇÃO DE PLANTA DE SOJA DBN8002 E MÉTODOS DE DETECÇÃO DAS MESMAS "
[0001] CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A presente invenção se refere ao campo da biologia molecular de plantas, especialmente ao campo do melhoramento genético de culturas transgênicas na pesquisa de biotecnologia agrícola. Em particular, a presente invenção se refere a um evento transgênico de soja resistente a insetos e tolerante a herbicida glufosinato DBN8002 e sequências de ácido nucleico para detectar se uma amostra biológica contém o evento transgênico de soja específico DBN8002 e seus métodos de detecção.
[0003] ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0004] A soja (Glycine max) é uma das cinco principais culturas do mundo. A biotecnologia tem sido aplicada à soja para o aprimoramento dos traços agronômicos e da qualidade dos mesmos. A tolerância a herbicidas, particularmente a tolerância a um herbicida glifosato, é um importante traço agronômico na produção de soja. Por exemplo, há eventos de soja bem- sucedidos, tais como GTS40-3-2 e MON89788, que foram amplamente cultivados nas principais áreas de plantio de soja, como os EUA. Outro traço agronômico importante é a resistência a insetos, especialmente a resistência a insetos Lepidoptera. Por exemplo, há eventos de soja bem-sucedidos, como o MON87701, que foi amplamente cultivado nas principais áreas de plantio de soja, como o Brasil. Vale ressaltar que as proteínas Vip possuem mecanismo de ação diferente das proteínas Cry, pois são proteínas inseticidas durante o período vegetativo e podem ser utilizadas como meio de manejo eficaz de insetos resistentes às proteínas Cry. A resistência a lepidópteros da soja pode ser conferida pela expressão de genes resistentes a lepidópteros em plantas de soja por meio de um método transgênico. Além disso, o herbicida glufosinato tem um mecanismo de ação diferente do herbicida glifosato, uma vez que o herbicida glufosinato é um herbicida do tipo de contato não seletivo e pode ser usado como um meio para controlar efetivamente ervas daninhas resistentes ao glifosato. A tolerância ao herbicida glufosinato de soja pode ser conferida pela expressão de genes tolerantes a herbicida glufosinato (por exemplo, PAT) em plantas de soja por meio de um método transgênico.
[0005] É de grande importância projetar um vetor de expressão contendo gene estranhos funcionais (genes Vip3Aa e PAT) adequados para transformar safras de soja e obter os eventos comerciais de soja transgênica correspondentes. Até o momento, o caso de aplicação bem-sucedida de proteínas Vip para controlar insetos em plantas de soja ainda não está disponível, enquanto a tolerância a herbicidas como um importante traço agronômico na produção de soja é quase indispensável. Assim, um bom evento de transformação de soja comercialmente adequado requer uma consideração abrangente dos fatores, tais como projeto de vetor para os genes Vip3Aa e PAT em plantas de soja, interações entre os dois cassetes de expressão, eficácia de resistência a insetos, eficácia de tolerância a herbicida e o efeitos sobre o rendimento e outros índices fisiológicos da planta, de modo que os genes Vip3Aa e PAT possam ser expressos em quantidades apropriadas na soja e servir às suas funções correspondentes sem influenciar o rendimento e outros índices fisiológicos do evento soja.
[0006] A expressão de genes exógenos em plantas é conhecida por ser influenciada por suas posições nos cromossomos, talvez devido à estrutura da cromatina (por exemplo, heterocromatina) ou a proximidade de elementos de regulação da transcrição (por exemplo, intensificador) para o sítio de integração. Por esta razão, muitas vezes é necessário rastrear um grande número de eventos a fim de identificar o evento que pode ser comercializado (ou seja, o evento, no qual um gene alvo introduzido é expresso de forma otimizada). Por exemplo, foi observado em plantas e outros organismos que pode haver grande diferença entre os eventos em termos do nível de expressão de um gene introduzido; e também pode haver diferenças em termos de padrões de expressão espaciais ou temporais, por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transgene em vários tecidos vegetais, que se refletem na possível discrepância entre o padrão de expressão real e o padrão de expressão esperado com base em elementos reguladores da transcrição no construto do gene introduzido. Por esse motivo, ele geralmente precisa produzir centenas a milhares de eventos diferentes e rastrear esses eventos para um único evento que tem um padrão e nível de expressão do transgene esperado para fins comerciais. Um evento que tem níveis de expressão ou padrões esperados de um transgene é útil para a introgressão do transgene em outras origens genéticas por cruzamento sexual usando métodos de reprodução convencionais. A progênie reproduzida por tal cruzamento mantém as características de expressão do transgene do transformante original. Esta estratégia é usada para garantir a expressão gênica confiável em uma série de variedades que estão bem adaptadas às condições locais de cultivo.
[0007] Seria vantajoso ser capaz de detectar a presença de um determinado evento para determinar se a progênie de um cruzamento sexual contém um gene alvo. Além disso, o método para detectar um evento específico seria útil para cumprir as regulamentações relacionadas, como as regulamentações que exigem aprovação pré-comercialização e rotulagem dos alimentos derivados de plantas de cultivo recombinantes. É possível detectar a presença de um transgene por quaisquer métodos bem conhecidos para detectar um polinucleotídeo, como reação em cadeia da polimerase (PCR) ou hibridização de DNA usando sondas polinucleotídicas. Esses métodos de detecção geralmente se concentram em elementos genéticos usados com frequência, como promotores, terminadores, genes marcadores. Como resultado, tais métodos podem não ser úteis para distinguir eventos diferentes, particularmente aqueles produzidos usando o mesmo construto de DNA, a menos que a sequência do DNA cromossômico adjacente ao DNA transgênico inserido ("DNA flanqueador"） seja conhecido. Desse modo, um par de iniciadores abrangendo a junção entre o transgene inserido e o DNA flanqueador é geralmente usado para identificar um evento transgênico específico por PCR, em particular, um primeiro iniciador compreendido na sequência inserida e um segundo iniciador compreendido na sequência inserida.
[0008] SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0009] O objetivo da presente invenção é fornecer sequências de ácidos nucleicos para a detecção da planta de soja DBN8002 e métodos de detecção da mesma. O evento transgênico de soja DBN8002 tem boa resistência a insetos, bem como boa tolerância ao herbicida glufosinato. Os métodos de detecção podem identificar com precisão e rapidez se uma amostra biológica contém uma molécula de DNA do evento transgênico de soja DBN8002.
[00010] Para atingir o objetivo acima, a presente invenção fornece uma sequência de ácido nucleico compreendendo pelo menos 11 nucleotídeos consecutivos nas posições 1-642 da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência complementar da mesma, e pelo menos 11 nucleotídeos consecutivos nas posições 643- 1524 da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência complementar desta; e/ou pelo menos 11 nucleotídeos consecutivos nas posições 1-347 da SEQ ID NO: 4 ou uma sequência complementar da mesma, e pelo menos 11 nucleotídeos consecutivos nas posições 348-656 da SEQ ID NO: 4 ou uma sequência complementar da mesma.
[00011] Preferivelmente, a sequência de ácido nucleico compreende 22-25 nucleotídeos consecutivos nas posições 1-642 da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência complementar da mesma, e 22-25 nucleotídeos consecutivos nas posições 643-1524 da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência complementar da mesma; e/ou 22-25 nucleotídeos consecutivos nas posições 1-347 da SEQ ID NO: 4 ou uma sequência complementar da mesma, e 22-25 nucleotídeos consecutivos nas posições 348-656 da SEQ ID NO: 4 ou uma sequência complementar da mesma.
[00012] Preferivelmente, a sequência de ácido nucleico compreende a SEQ ID NO: 1 ou uma sequência complementar da mesma e/ou SEQ ID NO: 2 ou uma sequência complementar da mesma.
[00013] A referida SEQ ID NO: 1 ou uma sequência complementar da mesma é uma sequência de 22 nucleotídeos que está localizada em torno da junção de inserção na extremidade 5 'da sequência inserida no evento transgênico de soja DBN8002. A referida SEQ ID NO: 1 ou uma sequência complementar da mesma abrange a sequência de DNA genômico que flanqueia o sítio de inserção da soja e a sequência de DNA na extremidade 5 'da sequência inserida. Portanto, a inclusão de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência complementar desta pode ser identificada como a presença do evento transgênico de soja DBN8002. A referida SEQ ID NO: 2 ou uma sequência complementar da mesma é uma sequência de 22 nucleotídeos que está localizada em torno da junção de inserção na extremidade 3 'da sequência inserida no evento transgênico de soja DBN8002. A referida SEQ ID NO: 2 ou uma sequência complementar da mesma abrange a sequência de DNA na extremidade 3 'da sequência inserida e a sequência de DNA genômico que flanqueia o sítio de inserção da soja. Portanto, a inclusão de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência complementar da mesma pode ser identificada como a presença do evento transgênico de soja DBN8002.
[00014] Preferivelmente, a sequência de ácido nucleico compreende SEQ ID NO: 3 ou uma sequência complementar da mesma e/ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência complementar da mesma.
[00015] A sequência de ácido nucleico da presente invenção pode ser uma sequência de pelo menos 11 ou mais polinucleotídeos consecutivos em qualquer porção da sequência inserida de T-DNA na SEQ ID NO: 3 ou uma sequência complementar desta (a primeira sequência de ácido nucleico), ou pelo menos 11 ou mais polinucleotídeos consecutivos em qualquer porção da região de DNA genômico de soja que flanqueia 5 ' na SEQ ID NO: 3 ou uma sequência complementar desta (a segunda sequência de ácido nucleico). Além disso, a sequência de ácido nucleico pode ser uma sequência homóloga ou complementar a uma porção da SEQ ID NO: 3 compreendendo toda a SEQ ID NO: 1. Quando usadas em conjunto, a primeira sequência de ácido nucleico e a segunda sequência de ácido nucleico podem atuar como um par de iniciadores de DNA em um método de amplificação de DNA que produz um produto de amplificação. Se o produto de amplificação produzido usando o referido par de iniciadores de DNA no método de amplificação de DNA compreender SEQ ID NO: 1, a presença do evento transgênico de soja DBN8002 ou sua descendência poderá ser diagnosticada. SEQ ID NO: 3 ou uma sequência complementar da mesma é uma sequência de 1524 nucleotídeos que está localizada em torno da junção de inserção na extremidade 5 ' da sequência inserida de T-DNA no evento transgênico de soja DBN8002. SEQ ID NO: 3 ou uma sequência complementar da mesma consiste em 642 nucleotídeos da sequência flanqueadora 5 'genômica de soja (nucleotídeos 1-642 de SEQ ID NO: 3), 384 nucleotídeos da sequência de DNA do construto pDBN4006 (nucleotídeos 643-1026 de SEQ ID NO: 3), e 498 nucleotídeos da sequência de origem da transcrição de prAtAct2
(nucleotídeos 1027-1524 de SEQ ID NO: 3). Portanto, a inclusão de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência complementar da mesma pode ser identificada como a presença do evento transgênico de soja DBN8002.
[00016] A sequência de ácido nucleico pode ser uma sequência de pelo menos 11 ou mais polinucleotídeos consecutivos em qualquer porção da sequência inserida de T-DNA na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência complementar da mesma (a terceira sequência de ácido nucleico), ou em pelo menos 11 ou mais polinucleotídeos consecutivos em qualquer porção da região de DNA genômico de soja flanqueadora 3 ' em SEQ ID NO: 4 ou uma sequência complementar da mesma (a quarta sequência de ácido nucleico). Além disso, a sequência de ácido nucleico pode ser uma sequência homóloga ou complementar a uma porção da SEQ ID NO: 4 compreendendo toda a SEQ ID NO: 2. Quando usadas em conjunto, a terceira sequência de ácido nucleico e a quarta sequência de ácido nucleico podem atuar como um par de iniciadores de DNA em um método de amplificação de DNA que produz um produto de amplificação. Se o produto de amplificação produzido usando o referido par de iniciadores de DNA no método de amplificação de DNA compreender SEQ ID NO: 2, a presença do evento transgênico de soja DBN8002 ou sua descendência poderá ser diagnosticada. SEQ ID NO: 4 ou uma sequência complementar da mesma é uma sequência de 656 nucleotídeos que está localizada em torno da junção de inserção na extremidade 3 'da sequência inserida de T-DNA no evento transgênico de soja DBN8002. SEQ ID NO: 4 ou uma sequência complementar da mesma consiste em 145 nucleotídeos da sequência de DNA de um terminador transcricional t35S (nucleotídeos 1-145 de SEQ ID NO: 4), 202 nucleotídeos da sequência de DNA do construto pDBN4006 (nucleotídeos 146- 347 de SEQ ID NO: 4), e 309 nucleotídeos da sequência flanqueadora 3 'genômica de soja (nucleotídeos 348-656 de SEQ ID NO: 4). Portanto, a inclusão de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência complementar da mesma pode ser identificada como a presença do evento transgênico de soja DBN8002.
[00017] Além disso, a sequência de ácido nucleico compreende a SEQ ID NO: 5 ou uma sequência complementar da mesma.
[00018] A referida SEQ ID NO: 5 ou uma sequência complementar da mesma é uma sequência de 7344 nucleotídeos que caracteriza o evento transgênico de soja DBN8002. Os genomas específicos e os elementos genéticos contidos na SEQ ID NO: 5 são mostrados na Tabela 1. A inclusão da SEQ ID NO: 5 ou uma sequência complementar da mesma pode ser identificada como a presença do evento transgênico de soja DBN8002.
[00019] Tabela 1: Os genomas e elementos genéticos contidos na SEQ ID NO: 5.
Elemento genético Comprimento Posição na SEQ ID NO: 5 /genoma (bp) Genoma 5’ 647 1-647 RB 137 648-784 prAtAct2 1048 1032-2439 mVip3Aa 2370 2446-4815 tNos 253 4822-5074 pr35S 530 5128-5657 cPAT 552 5677-6228 t35S 195 6250-6444 LB 48 6599-6646 Genoma 3’ 698 6647-7344
[00020] Como é bem conhecido pelos versados na técnica, a primeira, segunda, terceira e quarta sequências de ácido nucleico podem não consistir em DNA isoladamente, mas também podem compreender RNA, uma mistura de DNA e RNA, ou uma combinação de DNA , RNA e outros nucleotídeos ou análogos dos mesmos que não atuam como modelos para uma ou mais polimerases. Além disso, as sondas ou iniciadores da presente invenção devem ter pelo menos cerca de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 nucleotídeos consecutivos de comprimento e podem ser selecionados a partir dos nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5. Quando selecionado a partir dos nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, as sondas e iniciadores podem ter pelo menos cerca de 21 a cerca de 50 ou mais nucleotídeos consecutivos de comprimento.
[00021] As sequências de ácido nucleico ou sequências complementares das mesmas podem ser usadas em métodos de amplificação de DNA para produzir amplicons que são usados para detectar a presença do evento transgênico de soja DBN8002 ou sua descendência em uma amostra biológica. As sequências de ácido nucleico ou suas sequências complementares podem ser usadas em métodos de detecção de nucleotídeos para detectar a presença do evento transgênico de soja DBN8002 ou sua descendência em uma amostra biológica.
[00022] Para atingir o objetivo acima, a presente invenção também fornece um método para detectar a presença correspondente ao DNA do evento transgênico de soja DBN8002 em uma amostra, compreendendo:
[00023] - contatar a amostra a ser detectada com pelo menos dois iniciadores para amplificar um produto de amplificação alvo em uma reação de amplificação de ácido nucleico;
[00024] - realizar a reação de amplificação de ácido nucleico; e
[00025] - detectar a presença do produto de amplificação alvo;
[00026] em que o produto de amplificação alvo compreende a sequência de ácido nucleico.
[00027] Preferivelmente, o produto de amplificação alvo compreende SEQ ID NO: 1 ou uma sequência complementar da mesma, SEQ ID NO: 2 ou uma sequência complementar da mesma, SEQ ID NO: 6 ou uma sequência complementar da mesma, e/ou SEQ ID NO: 7 ou uma sequência complementar da mesma.
[00028] Em particular, os iniciadores compreendem um primeiro iniciador e um segundo iniciador, em que o primeiro iniciador é selecionado a partir de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10; e o segundo iniciador é selecionado a partir de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11.
[00029] Para atingir o objetivo acima, a presente invenção também fornece um método para detectar a presença do DNA correspondente ao evento transgênico de soja DBN8002 em uma amostra, compreendendo:
[00030] - contatar a amostra a ser detectada com uma sonda, em que a sonda compreende a sequência de ácido nucleico;
[00031] - hibridizar a amostra a ser detectada com a sonda em condições de hibridização estringentes; e
[00032] - detectar a hibridização da amostra a ser detectada com a sonda.
[00033] As condições estringentes podem ser hibridização a 65 ° C em uma solução de 6 x SSC (citrato de sódio) e 0,5% de SDS (dodecil sulfato de sódio), seguida por lavagem de membrana em uma solução de 2 x SSC e 0,1% SDS e uma solução de 1 x SSC e 0,1% SDS (cada um por uma vez).
[00034] Preferivelmente, a sonda compreende SEQ ID NO: 1 ou uma sequência complementar desta, SEQ ID NO: 2 ou uma sequência complementar da mesma, SEQ ID NO: 6 ou uma sequência complementar da mesma, e/ou SEQ ID NO: 7 ou uma sequência complementar da mesma.
[00035] Opcionalmente, pelo menos uma das sondas é marcada com pelo menos um fluoróforo.
[00036] Para atingir o objetivo acima, a presente invenção também fornece um método para detectar a presença do DNA correspondente ao evento transgênico de soja DBN8002 em uma amostra, compreendendo:
[00037] - contatar a amostra a ser detectada com uma molécula de ácido nucleico marcador, em que a molécula de ácido nucleico marcador compreende a sequência de ácido nucleico;
[00038] - hibridizar a amostra a ser detectada com a molécula de ácido nucleico marcador sob condições de hibridização estringentes;
[00039] - detectar a hibridização da amostra a ser detectada com a molécula de ácido nucleico marcador, e ainda realizar uma análise de reprodução assistida por marcador para determinar se a resistência a insetos e/ou tolerância a herbicida está geneticamente ligada ao ácido nucleico marcador molécula.
[00040] Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico marcadora compreende pelo menos uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 ou uma sequência complementar da mesma, SEQ ID NO: 2 ou uma sequência complementar da mesma, e/ou SEQ ID NOs: 6-11 ou suas sequências complementares.
[00041] Para atingir o objetivo acima, a presente invenção também fornece um kit de detecção de DNA compreendendo pelo menos uma molécula de DNA, em que a molécula de DNA compreende a sequência de ácido nucleico e a molécula de DNA pode atuar como um iniciador de DNA ou uma sonda específica para o evento transgênico de soja DBN8002 ou sua progênie.
[00042] Preferivelmente, a molécula de DNA compreende SEQ ID NO: 1 ou uma sequência complementar da mesma, SEQ ID NO: 2 ou uma sequência complementar da mesma, SEQ ID NO: 6 ou uma sequência complementar da mesma, e/ou SEQ ID NO : 7 ou uma sequência complementar da mesma.
[00043] Para atingir o objetivo acima, a presente invenção também fornece uma célula vegetal compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína Vip3Aa resistente a insetos, uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína PAT tolerante a herbicida glufosinato e uma sequência de ácido nucleico de uma região específica, em que a sequência de ácido nucleico da região específica compreende a sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 e/ou SEQ ID NO: 7.
[00044] Preferivelmente, a célula vegetal compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína Vip3Aa resistente a insetos, uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína PAT tolerante a herbicida glufosinato e uma sequência de ácido nucleico de uma região específica, em que a sequência de ácido nucleico do região específica compreende a sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3 e/ou SEQ ID NO: 4.
[00045] Preferivelmente, a célula vegetal compreende sucessivamente a SEQ ID NO: 1, a sequência de ácido nucleico nas posições 1032-6444 da SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 2, ou compreende a sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 5.
[00046] Para alcançar o objetivo acima, a presente invenção também fornece um método para proteger uma planta de soja a partir da invasão de insetos, compreendendo o fornecimento de pelo menos uma célula de planta de soja transgênica na dieta do inseto alvo, em que a célula de planta de soja transgênica compreende em seu genoma é a sequência apresentada em SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 2; e a ingestão da célula da planta de soja transgênica inibe o inseto alvo de se alimentar mais da planta de soja transgênica.
[00047] Preferivelmente, a célula da planta de soja transgênica compreende em seu genoma a sequência apresentada na SEQ ID NO: 3 e/ou SEQ ID NO: 4.
[00048] Preferivelmente, a célula da planta de soja transgênica compreende sucessivamente em seu genoma SEQ ID NO: 1, a sequência de ácido nucleico nas posições 1032-6444 de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 2, ou compreende SEQ ID NO: 5 .
[00049] Para atingir o objetivo acima, a presente invenção também fornece um método para proteger uma planta de soja de danos causados por um herbicida ou controlar ervas daninhas em um campo no qual uma planta de soja é plantada, compreendendo a aplicação de uma quantidade eficaz de herbicida glufosinato no campo no qual pelo menos uma planta de soja transgênica é plantada, em que a planta de soja transgênica compreende em seu genoma a sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 2, e a planta de soja transgênica apresenta tolerância ao herbicida glufosinato.
[00050] Preferivelmente, a planta de soja transgênica compreende em seu genoma a sequência apresentada na SEQ ID NO: 3 e/ou SEQ ID NO: 4.
[00051] Preferivelmente, a planta de soja transgênica compreende sucessivamente em seu genoma SEQ ID NO: 1, a sequência de ácido nucleico nas posições 1032-6444 de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 2, ou compreende a sequência conforme estabelecido em SEQ ID NO: 5.
[00052] Para alcançar o objetivo acima, a presente invenção também fornece um método para criar uma planta de soja resistente a insetos e/ou tolerante a herbicida glufosinato, compreendendo:
[00053] - plantio de pelo menos uma semente de soja, em que a semente de soja compreende em seu genoma uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína Vip3Aa resistente a insetos e/ou uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína PAT tolerante a herbicida glufosinato e uma sequência de ácido nucleico de uma região específica, ou a semente de soja compreende em seu genoma a sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na SEQ ID NO: 5;
[00054] - crescimento da semente de soja em uma planta de soja; e
[00055] – invasão da planta de soja com um inseto alvo e/ou pulverização da planta de soja com uma quantidade eficaz de herbicida glufosinato e, em seguida, colheita da planta com danos à planta reduzidos em comparação com outras plantas que não compreendem a sequência de ácido nucleico da região específica;
[00056] em que a sequência de ácido nucleico da região específica é a sequência apresentada em SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 2; preferivelmente, a sequência de ácido nucleico da região específica é a sequência apresentada em SEQ ID NO: 3 e/ou SEQ ID NO: 4.
[00057] Para atingir o objetivo acima, a presente invenção também fornece um método para a produção de uma planta de soja resistente a insetos e / ou tolerante a herbicida glufosinato, compreendendo:
[00058] - introdução de uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína Vip3Aa resistente a insetos e / ou uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína PAT tolerante a herbicida glufosinato e uma sequência de ácido nucleico de uma região específica compreendida no genoma de uma primeira planta de soja, ou a sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na SEQ ID NO: 5 compreendida no genoma de uma primeira planta de soja, em uma segunda planta de soja, produzindo assim uma pluralidade de plantas descendentes; e
[00059] - seleção das plantas descendentes compreendendo a sequência de ácido nucleico da região específica, que também são resistentes a insetos e / ou tolerantes a herbicida glufosinato;
[00060] em que a sequência de ácido nucleico da região específica é a sequência apresentada em SEQ ID NO: 1 e / ou SEQ ID NO: 2; preferivelmente, a sequência de ácido nucleico da região específica é a sequência apresentada em SEQ ID NO: 3 e / ou SEQ ID NO: 4.
[00061] Preferivelmente, o método compreende
[00062] – cruzamento sexual do evento transgênico de soja DBN8002, com uma planta de soja que carece da resistência a insetos e / ou traço de tolerância ao herbicida glufosinato, produzindo assim uma pluralidade de plantas descendentes;
[00063] – seleção das plantas descendentes compreendendo a sequência de ácido nucleico da região específica;
[00064] – invasão das plantas descendentes com um inseto alvo e / ou tratamento das plantas descendentes com glufosinato; e
[00065] - seleção das plantas descendentes que são resistentes a insetos e / ou tolerantes a herbicida glufosinato.
[00066] Para alcançar o objetivo acima, a presente invenção também fornece um produto agrícola ou commodity derivado do evento transgênico de soja DBN8002, em que o produto agrícola ou commodity é lecitina, ácidos graxos, glicerol, esteróis, flocos de soja, farinhas de soja, proteínas de soja ou seus concentrados, óleos de soja, fibras de proteína de soja, coágulos de leite de soja ou tofu.
[00067] Nas sequências de ácido nucleico para a detecção de plantas de soja e métodos de detecção das mesmas de acordo com a presente invenção, as seguintes definições e métodos são fornecidos para definir melhor a presente invenção e para orientar aqueles versados na técnica na implementação da presente invenção. Salvo indicação em contrário, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional por aqueles versados na técnica.
[00068] O termo "soja" se refere a Glycine max e compreende todas as variedades de plantas que podem cruzar com a soja, incluindo espécies de soja selvagem.
[00069] O termo "compreendendo", "compreendem" ou "contém" significa "incluindo, mas não se limitando a".
[00070] O termo "planta" inclui todas as plantas, células vegetais, plantas ou orgãos de plantas, protoplastos vegetais, culturas de tecidos de células vegetais a partir das quais as plantas podem ser regeneradas, calos de plantas, aglomerados de plantas e células vegetais que estão intactas nas plantas ou partes da planta, em que as partes da planta podem ser, por exemplo, embriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, ramos, frutos, caules, raízes, pontas de raízes ou outras. Deve ser entendido que dentro do escopo da presente invenção, as partes de plantas transgênicas incluem, mas não estão limitadas a,
células vegetais, protoplastos, tecidos, calos, embriões, flores, caules, frutos, folhas e raízes. As partes da planta acima mencionadas são derivadas das plantas transgênicas ou descendência das mesmas que foram previamente transformadas com as moléculas de DNA da presente invenção e, portanto, pelo menos parcialmente consistem em células transgênicas.
[00071] O termo "gene" se refere a um fragmento de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, incluindo sequências regulatórias que precedem (sequências não codificantes 5 ') e são subsequentes (sequências não codificantes 3') à sequência codificante. “Gene nativo” se refere a um gene encontrado na natureza com suas próprias sequências regulatórias. “Gene quimérico” se refere a qualquer gene que não seja um gene nativo, compreendendo sequências regulatórias e de codificação que não são encontradas na natureza. "Gene endógeno" se refere a um gene nativo em sua localização natural no genoma de um organismo. "Gene exógeno" é um gene estranho atualmente presente no genoma de um organismo que não o contém naturalmente e também se refere a um gene introduzido em uma célula receptora por meio de um procedimento transgênico. Genes exógenos podem compreender genes nativos ou genes quiméricos inseridos em um organismo não nativo. “Transgene” é um gene que foi introduzido em um genoma por um procedimento de transformação. "sítio de inserção" ou "sítio-alvo" se refere ao sítio em um genoma de planta no qual um DNA recombinante foi inserido.
[00072] "DNA flanqueador " pode compreender um genoma naturalmente presente em um organismo, como uma planta, ou um DNA exógeno (heterólogo) introduzido por meio de um procedimento de transformação, por exemplo, um fragmento associado a um evento de transformação. Assim, o DNA flanqueador pode incluir uma combinação de DNA nativo e DNA exógeno. Tal como utilizado na presente invenção, o termo "DNA flanqueador", também denominado como "região flanqueadora", "sequência flanqueadora", "sequência genômica flanqueadora" ou "DNA genômico flanqueador", se refere a uma sequência de pelo menos 3, 5, 10, 11, 15, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 1000, 1500, 2000, 2500 ou 5000 pares de bases ou mais, que está localizada imediatamente a montante ou a jusante da molécula de DNA exógena originalmente inserida e é adjacente a ela . Quando esta região flanqueadora está localizada a jusante, ela também pode ser referida como "flanco 3 '" ou "flanco de borda esquerda" e semelhantes. Quando esta região flanqueadora está localizada a montante, também pode ser referida como "flanco 5 '" ou "flanco de borda direita" e semelhantes.
[00073] Os procedimentos de transformação que conduzem à integração aleatória de um DNA exógeno resultarão em transformantes contendo diferentes regiões flanqueadoras que são específicas para cada transformante. Quando um DNA recombinante é introduzido em uma planta por meio do cruzamento tradicional, suas regiões flanqueadoras geralmente não serão alteradas. Os transformantes também conterão junções únicas entre um DNA inserido heterólogo e um fragmento de DNA genômico, ou entre dois fragmentos de DNA genômico, ou entre dois fragmentos de DNA heterólogo. “Junção” é um ponto onde dois fragmentos de DNA específicos estão ligados. Por exemplo, existe uma junção na posição em que um DNA inserido está ligado a um DNA flanqueador. Um ponto de junção também existe em um organismo transformado no qual dois fragmentos de DNA estão ligados entre si de uma maneira modificada daquela encontrada no organismo nativo. “Região de junção” ou “sequência de junção” refere-se ao DNA que compreende um ponto de junção.
[00074] A presente invenção fornece um evento transgênico de soja denominado DBN8002 e sua progênie. O evento transgênico de soja DBN8002 também é referido como uma planta de soja DBN8002, incluindo plantas e sementes do evento transgênico de soja DBN8002, juntamente com células vegetais ou suas partes renováveis, em que as partes da planta do evento transgênico de soja DBN8002 incluem, mas não estão limitadas a, células, pólens, óvulos, flores, botões, raízes, caules, folhas, vagens e produtos derivados da planta de soja DBN8002, como farelos, pós e óleos de soja, especificamente lecitina, ácidos graxos, glicerol, esteróis, óleos comestíveis, flocos de soja desengordurados, farinhas de soja desengordurada e tostadas, coágulos de leite de soja, tofu, concentrados de proteína de soja, proteínas de soja isoladas, proteínas vegetais hidrolisadas, proteínas de soja organizadas e fibras de proteína de soja.
[00075] O evento transgênico de soja DBN8002 da presente invenção contém um construto de DNA que, quando expressa em células vegetais, confere ao evento transgênico de soja DBN8002 resistência a insetos e tolerância ao herbicida glufosinato. O construto de DNA compreende dois cassetes de expressão dispostos em tandem. O primeiro cassete de expressão compreende um promotor adequado para expressão em uma planta e uma sequência de sinal de poliadenilação adequada, em que o promotor está operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico da proteína Vip3Aa, que é principalmente resistente a insetos da ordem Lepidoptera. O segundo cassete de expressão compreende um promotor adequado para expressão em uma planta e uma sequência de sinal de poliadenilação adequada, em que o promotor está operacionalmente ligado a um gene que codifica fosfinotricina N- acetiltransferase (PAT), e a sequência de ácido nucleico da proteína PAT é tolerante ao herbicida glufosinato. Além disso, o promotor pode ser um promotor adequado isolado de plantas, incluindo promotores constitutivos, indutíveis e / ou específicos de tecido. O promotor adequado inclui, mas não está limitado a, promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), promotor 35S do vírus do mosaico da figueira (FMV), promotor de Ubiquitina, promotor de Actina, promotor do gene da nopalina sintetase (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, promotor da octopina sintetase (OCS), Promotor do vírus frisado do amarelo do Cestrum, promotor de Patatina, promotor de ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase / oxigenase (RuBisCO), promotor de glutationa S-transferase (GST), promotor E9, promotor GOS, promotor de al-cA / alcR, promotor do gene Agrobacterium rhizogenes RolD e promotor de Arabidopsis thaliana Suc2. A sequência de sinal de poliadenilação pode ser uma sequência de sinal de poliadenilação adequada que funciona em plantas. A sequência de sinal de poliadenilação adequada inclui, mas não está limitada a, uma sequência de sinal de poliadenilação derivada do gene da nopalina sintetase (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, uma sequência de sinal de poliadenilação derivada do terminador 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), uma sequência de sinal de poliadenilação derivada do gene de Inibidor de Protease II (PIN II) e uma sequência de sinal de poliadenilação derivada do gene de α-tubulina.
[00076] Além disso, o cassete de expressão pode compreender ainda outros elementos genéticos, incluindo, mas não se limitando a, um potencializador e um peptídeo sinal / peptídeo de trânsito. O potencializador, que potencializa o nível de expressão gênica, inclui, mas não está limitado ao ativador de tradução do vírus etch do tabaco (TEV), intensificador CaMV35S e intensificador FMV35S. O peptídeo sinal / peptídeo de trânsito pode direcionar a proteína Vip3Aa e / ou a proteína PAT para transporte para o espaço extracelular ou para um compartimento ou organela intracelular específica. Por exemplo, uma sequência que codifica o peptídeo de trânsito de cloroplasto é usada para o alvejamento do cloroplasto, ou uma sequência de retenção "KDEL" é usada para alvejamento do retículo endoplasmático.
[00077] O referido gene mVip3Aa pode ser isolado de Bacillus thuringiensis (abr. Como Bt) e a sequência de nucleotídeos do gene mVip3Aa pode ser alterada por meio de otimização de códon ou outros métodos, de modo a melhorar a estabilidade e disponibilidade de um transcrito na células transformadas.
[00078] O termo "Lepidoptera", incluindo mariposas e borboletas, é a maior ordem de pragas na agricultura e silvicultura. Inclui, por exemplo, Agrotis ypsilon (Rottemberg), Helicoverpa armigera (Hubner), Prodenia litura, Athetis lepigone e Conogethes punctiferalis.
[00079] O gene da fosfinotricina N-acetiltransferase (PAT) pode ser uma enzima isolada da cepa de Streptomyces viridochromogenes, que catalisa a conversão de L-fosfinotricina em sua forma inativa por acetilação de modo a conferir tolerância ao herbicida glufosinato à planta. A fosfino-tricina (PTC, ácido 2-amino-4-metilfosfinil-butírico) é um inibidor da glutamina sintetase. PTC é uma unidade estrutural do antibiótico 2-amino-4-metilfosfinil-alanil-alanina. Este tripeptídeo (PTT) é ativo contra bactérias e fungos Gram-positivos e Gram- negativos, Botrytis cinerea. O gene da fosfinotricina N-acetiltransferase (PAT) também pode servir como um gene marcador seletivo.
[00080] O "glufosinato" (também conhecido como fosfinotricina) se refere a 2-amino-4- [hidroxi (metil) fosfinil] butirato de amônio. Os tratamentos com um “herbicida glufosinato” se referem a tratamentos com qualquer formulação de herbicida contendo glufosinato. Está dentro das habilidades do técnico agrícola comum selecionar taxas de aplicação para uma formulação de glufosinato de modo a obter uma quantidade biologicamente eficaz. O tratamento de um campo contendo materiais vegetais do evento transgênico de soja DBN8002 com qualquer formulação de herbicida contendo glufosinato controlará o crescimento de ervas daninhas no campo e não afetará o crescimento ou rendimento dos materiais vegetais derivados do evento transgênico de soja DBN8002.
[00081] O construto de DNA é introduzido em uma planta por meio de métodos de transformação incluindo, mas não se limitando a, transformação mediada por Agrobacterium, transformação balística e transformação do projeto seguido pelo tubo polínico.
[00082] A transformação mediada por Agrobacterium é um método comumente usado para transformação de plantas. O DNA exógeno a ser introduzido em uma planta é clonado em um vetor entre as sequências de consenso das bordas da esquerda e direita, isto é, uma região T-DNA. O vetor é transformado em células de Agrobacterium, que são subsequentemente usadas para infectar tecidos vegetais. A região do T-DNA no vetor que compreende o DNA exógeno é inserida no genoma da planta.
[00083] A transformação balística é o bombardeio de células vegetais com um vetor que compreende o DNA exógeno (transformação biolística mediada por partículas).
[00084] A transformação do trajeto seguido pelo tubo polínico é um método para transportar o DNA exógeno para um saco embrionário através de uma via nucelar usando um tubo polínico natural (também conhecido como o tecido transmissor do tubo polínico) formado após a polinização da planta.
[00085] Após a transformação, é necessário regenerar a planta transgênica a partir do tecido da planta transformada e selecionar a progênie com o DNA exógeno usando um marcador adequado.
[00086] Um construto de DNA é um conjunto de moléculas de DNA ligadas entre si que fornece um ou mais cassetes de expressão. O construto de DNA é preferivelmente um plasmídeo que pode se auto-replicar em uma célula bacteriana e contém vários sítios de endonuclease de restrição que são úteis para a introdução de moléculas de DNA que fornecem elementos genéticos funcionais, ou seja, promotores, íntrons, sequências líder, sequências de codificação, regiões de terminação 3 ' e outras sequências. Os cassetes de expressão contidos em um construto de DNA compreendem elementos genéticos que são necessários para a transcrição de um RNA mensageiro e podem ser concebidas para se expressar em células procariotas ou células eucarióticas. Mais preferivelmente, os cassetes de expressão da presente invenção são concebidos para se expressarem em células vegetais.
[00087] Um "evento" transgênico é produzido pela transformação de células vegetais com um construto de DNA heterólogo, incluindo as etapas de inserção de um cassete de expressão de ácido nucleico compreendendo pelo menos um gene alvo no genoma de uma planta através de um método transgênico a fim de gerar uma população de plantas, pela regeneração da população de plantas e pela seleção de uma planta particular tendo as características de inserção em um sítio de genoma particular. O termo "evento" se refere ao transformante original e sua progênie que inclui um DNA heterólogo. O termo "evento" também se refere à progênie produzida pelo cruzamento sexual do transformante original com um indivíduo de outras variedades que incluem o DNA heterólogo. Mesmo após retrocruzamento repetido com um parental retrocruzado, o DNA inserido e o DNA genômico flanqueador do parental transformante original ainda estão presentes na mesma localização cromossômica na progênie de cruzamento. O termo "evento" também se refere a uma sequência de DNA do transformante original compreendendo um DNA inserido e sequências genômicas flanqueadoras imediatamente adjacentes ao DNA inserido, em que seria esperado que a sequência de DNA fosse transferida para uma progênie que é produzida pelo cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e sua progênie resultante de autofecundação) com uma linhagem parental que não contém o DNA inserido e recebe o DNA inserido incluindo o gene alvo.
[00088] "Recombinação", tal como utilizado na presente invenção, se refere a uma forma de um DNA e / ou uma proteína e / ou um organismo que normalmente não seria encontrado na natureza e, como tal, é criado por intervenção humana. Tal intervenção humana pode produzir uma molécula de
DNA recombinante e / ou uma planta recombinante. A "molécula de DNA recombinante" é obtida por uma combinação artificial de dois segmentos de sequência separados, por exemplo, por síntese química ou pela manipulação de segmentos de ácido nucleico isolados usando tecnologia de engenharia genética. A tecnologia de operação de ácidos nucleicos é bem conhecida no estado da técnica.
[00089] O termo "transgene" inclui qualquer célula, linhagem celular, calo, tecido, parte de planta ou planta, cujo genótipo foi alterado devido à presença de um ácido nucleico heterólogo. “Transgene” inclui aqueles organismos transgênicos inicialmente alterados, bem como a progênie individual produzida a partir do organismo transgênico original por cruzamento sexual ou propagação assexuada. O termo "transgene", tal como utilizado na presente invenção, não abrange a alteração (cromossômica ou extracromossômica) do genoma por métodos convencionais de melhoramento de plantas ou por eventos de ocorrência natural, como fertilização cruzada aleatória, infecção viral não recombinante, transformação bacteriana não recombinante, transposição não recombinante ou mutação espontânea.
[00090] "Heterólogo", conforme usado neste documento, se refere a uma primeira molécula que normalmente não é encontrada em combinação com uma segunda molécula na natureza. Por exemplo, uma molécula pode ser derivada de uma primeira espécie e inserida no genoma de uma segunda espécie. A molécula seria assim heteróloga para o hospedeiro e artificialmente introduzida no genoma da célula hospedeira.
[00091] O evento transgênico de soja DBN8002 com resistência a insetos da ordem Lepidoptera e tolerância a herbicida glufosinato pode ser gerado pelas seguintes etapas: em primeiro lugar, cruzamento sexual de uma primeira planta de soja parental consistindo de uma planta de soja cultivada a partir do evento transgênico de soja DBN8002 e sua descendência, com uma segunda planta de soja parental que carece de resistência a insetos da ordem Lepidoptera e tolerância a herbicida glufosinato, produzindo assim uma pluralidade de primeiras plantas descendentes, em que o evento transgênico de soja DBN8002 e sua descendência são obtidos a partir da transformação usando o cassete de expressão da presente invenção que é resistente a insetos da ordem Lepidoptera e tolerante ao herbicida glufosinato; e, em seguida, seleção de uma planta descendente que é resistente à invasão de insetos da ordem Lepidoptera e / ou tolerante ao herbicida glufosinato, criando assim uma planta de soja que é resistente à invasão de insetos da ordem Lepidoptera e tolerante ao herbicida glufosinato. Estas etapas podem incluir ainda o retrocruzamento da progênie de Lepidoptera resistente a insetos e / ou tolerante a glufosinato com a segunda planta de soja progenitora ou uma terceira planta de soja progenitora, em seguida, a triagem da progênie por invasão de insetos da ordem Lepidoptera, aplicação de herbicida glufosinato ou identificação de marcadores moleculares (por exemplo, a molécula de DNA que compreende as junções identificadas das extremidades 5 'e 3' da sequência inserida no evento transgênico de soja DBN8002) associada à característica, produzindo assim uma planta de soja resistente a insetos da ordem Lepidoptera e tolerante a herbicida glufosinato.
[00092] Também deve ser entendido que duas plantas transgênicas diferentes também podem ser cruzadas para produzir uma progênie que contém dois genes exógenos independentes e adicionados separadamente. A autofecundação da progênie apropriada pode produzir plantas descendentes que são homozigotas para ambos os genes exógenos adicionados. O retrocruzamento com uma planta parental e o cruzamento com uma planta não transgênica, conforme descrito anteriormente, também são contemplados, assim como a propagação vegetal.
[00093] O termo "sonda" significa uma molécula de ácido nucleico isolada que está ligada a um marcador detectável convencional ou molécula repórter, por exemplo, um isótopo radioativo, um ligante, um agente quimioluminescente ou uma enzima. Tal sonda é complementar a uma fita de um ácido nucleico alvo, na presente invenção, a uma fita de DNA do genoma do genoma do evento transgênico de soja DBN8002, não importa se o DNA do genoma é do evento transgênico de soja DBN8002 ou semente ou de uma planta ou semente ou extrato derivado do evento transgênico de soja DBN8002. As sondas da presente invenção incluem não apenas ácidos desoxirribonucleicos ou ácidos ribonucleicos, mas também poliamidas e outros materiais de sonda que se ligam especificamente a uma sequência de DNA alvo e podem ser usados para detectar a presença dessa sequência de DNA alvo.
[00094] O termo "iniciador" é um fragmento de molécula de ácido nucleico isolada que é hibridizada a uma fita de DNA alvo complementar por hibridização de ácido nucleico para formar um híbrido entre o iniciador e a fita de DNA alvo, então estendido ao longo da fita de DNA alvo sob a ação de uma polimerase (por exemplo, uma DNA polimerase). Os pares de iniciadores da presente invenção se referem à sua utilização na amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo, por exemplo, por reação em cadeia da polimerase (PCR) ou outros métodos convencionais de amplificação de ácido nucleico.
[00095] Sondas e iniciadores são geralmente 11 polinucleotídeos ou mais em comprimento, preferivelmente 18 polinucleotídeos ou mais, mais preferivelmente 24 polinucleotídeos ou mais, mais preferivelmente 30 polinucleotídeos ou mais. Tais sondas e iniciadores hibridizam especificamente com uma sequência alvo sob condições de hibridização de alta estringência. Preferivelmente, as sondas e iniciadores da presente invenção têm identidade de sequência de DNA completa com ácidos nucleicos consecutivos em uma sequência alvo, embora uma sonda que difere da sequência de DNA alvo e retenha a capacidade de hibridizar com a sequência de DNA alvo em condições de alta estringência possa ser projetada por métodos convencionais.
[00096] Iniciadores e sondas com base no DNA genômico flanqueador e na sequência inserida da presente invenção podem ser determinados por métodos convencionais, por exemplo, pelo isolamento da molécula de DNA correspondente de um material vegetal derivado do evento transgênico de soja DBN8002, e determinação da sequência de ácido nucleico da molécula de DNA. A molécula de DNA compreende a sequência transgênica inserida e as sequências flanqueadoras genômicas de soja, e um fragmento da molécula de DNA pode ser usado como um iniciador ou sonda.
[00097] A sonda de ácido nucleico e o iniciador da presente invenção hibridizam com uma sequência de DNA alvo sob condições estringentes. Qualquer método convencional de hibridização ou amplificação de ácido nucleico pode ser usado para identificar a presença de um DNA do evento transgênico de soja DBN8002 em uma amostra. As moléculas de ácido nucleico ou seus fragmentos são capazes de hibridizar especificamente com outras moléculas de ácido nucleico em certas circunstâncias. Tal como utilizado na presente invenção, duas moléculas de ácido nucleico são capazes de hibridizar especificamente uma com a outra se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de ácido nucleico de fita dupla antiparalela. Uma molécula de ácido nucleico é considerada o "complemento" da outra molécula de ácido nucleico se exibir complementaridade completa. Tal como utilizado na presente invenção, duas moléculas de ácido nucleico são referidas como exibindo "complementaridade completa", se cada nucleotídeo de uma molécula de ácido nucleico for complementar ao nucleotídeo correspondente da outra molécula de ácido nucleico. Duas moléculas de ácido nucleico são consideradas "minimamente complementares", se elas puderem hibridizar uma com a outra com estabilidade suficiente de modo que possam parear e se ligar uma à outra sob pelo menos condições convencionais de "baixa estringência". Da mesma forma, duas moléculas de ácido nucleico são ditas possuírem "complementaridade", se elas puderem hibridizar entre si com estabilidade suficiente de modo que possam parear e se ligar uma à outra sob condições convencionais de "alta estringência". Desvios da complementaridade completa são permitidos, desde que tais desvios não impeçam completamente as duas moléculas de formar uma estrutura de fita dupla. Para servir como um iniciador ou sonda, uma molécula de ácido nucleico só precisa ter complementaridade suficiente na sequência de modo que possa formar uma estrutura de fita dupla estável sob o solvente particular e as concentrações de sal utilizadas.
[00098] Como usado na presente invenção, uma sequência substancialmente homóloga é uma molécula de ácido nucléico que hibridizará especificamente com uma fita complementar de outra molécula de ácido nucleico correspondente sob condições de alta estringência. As condições estringentes apropriadas que promovem a hibridização de DNA são conhecidas dos versados na técnica, por exemplo, tratamento com 6,0 x cloreto de sódio / citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 ° C, seguido por lavagem com 2,0 x SSC a 50 ° C. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser de cerca de 2,0 x SSC a 50 ° C em condições de baixa estringência até cerca de 0,2 x SSC a 50 ° C em condições de alta estringência. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada da temperatura ambiente (cerca de 22 ° C) em condições de baixa estringência até cerca de 65 ° C em condições de alta estringência. A temperatura e a concentração de sal podem ser variadas, ou uma delas pode ser mantida constante enquanto a outra variável é alterada. Preferivelmente, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção hibridizará especificamente com uma ou mais moléculas de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7, ou sequências complementares das mesmas, ou qualquer fragmento das sequências acima sob condições de estringência moderadas, por exemplo a cerca de 2,0 x SSC e cerca de 65 ° C. Mais preferivelmente, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção hibridizará especificamente com uma ou mais moléculas de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7, ou sequências complementares das mesmas, ou qualquer fragmento das sequências acima sob condições de alta estringência. Uma molécula de ácido nucléico marcador preferida da presente invenção compreende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7, ou sequências complementares das mesmas, ou qualquer fragmento das sequências acima. Outra molécula de ácido nucleico marcador preferida da presente invenção tem 80% a 100% ou 90% a 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7, ou suas sequências complementares, ou qualquer fragmento das sequências acima. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7 podem ser usadas como marcadores em métodos de melhoramento de plantas para identificar a progênie do cruzamento genético. A hibridização de uma sonda para uma molécula de DNA alvo pode ser detectada por qualquer método bem conhecido dos versados na técnica, incluindo, mas não se limitando a, marcadores fluorescentes, marcadores radioativos, marcadores baseados em anticorpos e marcadores quimioluminescentes.
[00099] Em relação à amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo usando iniciadores de amplificação específicos (por exemplo, PCR), "condições estringentes" são condições que permitem que um iniciador hibridize apenas com uma sequência de ácido nucleico alvo em uma reação de amplificação térmica de DNA , em que o iniciador tem uma sequência de tipo selvagem correspondente à sequência de ácido nucleico alvo (ou sua sequência complementar) e, portanto, pode se ligar a ela, preferivelmente para produzir um produto de amplificação único, isto é, amplicon.
[000100] O termo "se liga especificamente a (uma sequência alvo)" indica que, sob condições de hibridização rigorosas, uma sonda ou iniciador hibridiza apenas para uma sequência alvo em uma amostra que compreende a sequência alvo.
[000101] Tal como utilizado na presente invenção, "amplicon" se refere a um produto de amplificação de ácido nucleico de uma sequência de ácido nucleico alvo usada como parte do modelo de ácido nucleico. Por exemplo, a fim de determinar se uma planta de soja é produzida pelo cruzamento sexual do evento transgênico de soja DBN8002 da presente invenção, ou se uma amostra de soja coletada de um campo compreende o evento transgênico de soja DBN8002, ou se uma amostra de extrato de soja (tal como uma farinha alimentar, farinha ou óleo) compreende o evento transgênico de soja DBN8002, o DNA extraído de uma amostra de tecido de planta de soja ou extrato pode ser sujeito a um método de amplificação de ácido nucleico usando um par de iniciadores para produzir um amplicon que é diagnóstico para a presença do DNA do evento de soja transgênica DBN8002. O par de iniciadores inclui um primeiro iniciador derivado das sequências flanqueadoras no genoma da planta adjacente ao sítio de inserção do DNA exógeno inserido e um segundo iniciador derivado do DNA exógeno inserido. O amplicon apresenta um comprimento e uma sequência que também são diagnósticos para o evento transgênico de soja DBN8002. O amplicon pode apresentar um comprimento igual à soma do comprimento combinado dos pares de iniciadores mais um par de bases de nucleotídeo, ou preferivelmente mais cerca de 50 pares de bases de nucleotídeo, ou preferivelmente mais cerca de 250 pares de bases de nucleotídeo, ou preferivelmente mais cerca de 450 nucleotídeos pares de bases ou mais.
[000102] Alternativamente, um par de iniciadores pode ser derivado de sequências genômicas flanqueadoras em ambos os lados do DNA inserido, de modo a produzir um amplicon que inclui toda a sequência de nucleotídeos inserida. Um dos pares de iniciadores derivados da sequência genômica da planta pode estar localizado a uma distância da sequência de DNA inserida e esta distância pode variar de um par de base nucleotídeo a cerca de vinte mil pares de bases de nucleotídeo. Conforme usado neste documento, o termo "amplicon" exclui especificamente dímeros de iniciador formados em uma reação de amplificação térmica de DNA.
[000103] A reação de amplificação de ácido nucleico pode ser realizada por qualquer um dos vários métodos de amplificação de ácido nucleico conhecidos no estado da técnica, incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR). Uma variedade de métodos de amplificação de ácido nucleico são conhecidos pelos versados na técnica. Métodos de amplificação por PCR foram desenvolvidos para amplificar DNA genômico de até 22 kb e DNA de bacteriófago de até 42 kb. Estes métodos, bem como outros métodos de amplificação de DNA conhecidos no estado da técnica, podem ser usados na presente invenção. A sequência de DNA exógena inserida e as sequências de DNA flanqueadoras do evento transgênico de soja DBN8002 podem ser amplificadas no genoma do evento transgênico de soja DBN8002 usando as sequências de iniciador fornecidas. Após a amplificação, o amplicon de PCR ou DNA clonado é sequenciado por métodos de sequenciamento padrão.
[000104] Os kits de detecção de DNA que são baseados em métodos de amplificação de DNA contêm moléculas de DNA usadas como iniciadores que hibridizam especificamente para um DNA alvo e amplificam um amplicon de diagnóstico sob condições de reação apropriadas. O kit pode fornecer um método de detecção baseado em gel de agarose ou muitos métodos conhecidos no estado da técnica para detectar um amplicon de diagnóstico. É fornecido pela presente invenção um kit que contém iniciadores de DNA que são homólogos ou complementares a qualquer porção do genoma de soja em SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 e a qualquer porção da região transgênica inserida em SEQ ID NO: 5. Um par de iniciadores que é especificamente identificado como útil em um método de amplificação de DNA compreende SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, que amplificam um amplicon de diagnóstico homólogo a uma porção da região 5 ' do transgene / genoma do evento de soja transgênica DBN8002, em que o amplicon compreende a SEQ ID NO: 1. Outras moléculas de DNA úteis como iniciadores de DNA podem ser selecionadas a partir de SEQ ID NO: 5.
[000105] O amplicon produzido por esses métodos pode ser detectado por uma pluralidade de técnicas. Um desses métodos é a análise de bits genéticos, no qual uma fita de oligonucleotídeo de DNA que abrange a sequência de DNA inserida e as sequências de DNA genômico adjacentes que flanqueiam, é projetada. A fita de oligonucleotídeo é imobilizada em poços de uma placa de micropoços. Após a amplificação por PCR da região alvo (usando dois iniciadores respectivamente para a sequência inserida e a sequência genômica flanqueadora adjacente), um produto de PCR de fita simples pode ser hibridizado com o oligonucleotídeo imobilizado e servir como um modelo para uma reação de extensão de base única usando uma DNA polimerase e ddNTPs especificamente marcados para a próxima base esperada. O resultado pode ser obtido por métodos fluorescentes ou baseados em ELISA. Um sinal indica a presença da sequência genômica inserida / flanqueadora, o que demonstra que a amplificação, hibridização e extensão de base única foram bem-sucedidas.
[000106] Outro método é a técnica de pirosequenciamento. Neste método, uma fita de oligonucleotídeo que abrange a sequência de DNA inserida e a parte adjacente da junção de DNA genômico é projetada. A fita de oligonucleotídeo é hibridizada com o produto de PCR de fita simples da região alvo (usando dois iniciadores, respectivamente, para a sequência inserida e a sequência genômica adjacente flanqueadora) e incubada junto com uma DNA polimerase, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina-5'-fosfosulfato e luciferina. Os dNTPs são adicionados separadamente e o sinal luminoso produzido é medido. Um sinal luminoso indica a presença da sequência inserida / flanqueadora, o que demonstra que a amplificação, a hibridização e a extensão de uma ou múltiplas bases foram bem-sucedidas.
[000107] Fenômeno de polarização de fluorescência conforme descrito por Chen et al. (Genome Res., 1999, 9: 492-498) também é um método que pode ser usado para detectar o amplicon da presente invenção. Para usar este método, uma fita de oligo-nucleotídeo que abrange a sequência de DNA inserida e a parte adjacente da junção do DNA genômico precisa ser projetada. A fita de oligonucleotídeo é hibridizada com o produto de PCR de fita simples da região alvo (usando dois iniciadores, respectivamente, para a sequência inserida e a sequência genômica adjacente flanqueadora) e incubada junto com uma DNA polimerase e um ddNTP marcado com fluorescência. A extensão de base única resulta na incorporação de ddNTP. Tal incorporação pode ser medida como uma mudança na polarização usando um fluorômetro. Uma mudança na polarização indica a presença da sequência inserida / flanqueadora, o que demonstra que a amplificação, hibridização e extensão de base única foram bem-sucedidas.
[000108] Taqman é descrito como um método para detectar e analisar quantitativamente a presença de uma sequência de DNA e é totalmente descrito nas instruções fornecidas pelo fabricante. Agora, é brevemente ilustrado como segue. Uma sonda de oligonucleotídeo FRET que abrange a sequência de DNA inserida e a parte adjacente da junção flanqueadora genômica é projetada. A sonda FRET e os iniciadores de PCR (usando dois iniciadores respectivamente para a sequência inserida e a sequência genômica adjacente) estão sujeitos a ciclos de reação na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. A hibridização da sonda FRET resulta na clivagem entre a porção fluorescente e porção de extinção na sonda FRET e liberação da porção fluorescente. A geração de um sinal fluorescente indica a presença da sequência inserida / flanqueadora, o que demonstra que a amplificação e hibridização foram bem- sucedidas.
[000109] Com base no princípio de hibridização, as técnicas adequadas para a detecção de materiais vegetais do evento transgênico de soja DBN8002 também compreendem Southern blot, Northern blot e hibridização in situ. Particularmente, as técnicas adequadas envolvem incubar uma sonda com uma amostra, lavá-las para remover a sonda não ligada e detectar se a sonda foi hibridizada. O método de detecção é dependente do tipo de marcador anexado à sonda, por exemplo, uma sonda marcada radioativamente pode ser detectada por exposição e desenvolvimento de filme de raios-X, ou uma sonda marcada enzimaticamente pode ser detectada por conversão de um substrato para efetuar uma mudança de cor.
[000110] A aplicação de marcadores moleculares na detecção de sequência foi descrita por Tyangi et al. (Nature Biotech., 1996, 14: 303-308), que é brevemente descrito como se segue. Uma sonda de oligonucleotídeo FRET que abrange a sequência de DNA inserida e a parte adjacente da junção flanqueadora genômica é projetada. Devido à estrutura única da sonda FRET, ela contém uma estrutura secundária que mantém a porção fluorescente e a porção de extinção em estreita proximidade. A sonda FRET e os iniciadores de PCR (usando dois iniciadores respectivamente para a sequência inserida e a sequência genômica flanqueadora) estão sujeitos a ciclos de reação na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Após a amplificação por PCR com sucesso, a hibridização da sonda FRET com a sequência alvo resulta na perda da estrutura secundária da sonda, de modo que a porção fluorescente e a porção de extinção são espacialmente separadas e um sinal fluorescente é gerado. A geração de um sinal fluorescente indica a presença da sequência inserida / flanqueadora, o que demonstra que a amplificação e hibridização foram bem-sucedidas.
[000111] Outros métodos descritos, como microfluídicos, fornecem métodos e dispositivos para isolar e amplificar amostras de DNA. Os corantes ópticos são usados para detectar e determinar moléculas de DNA específicas. Dispositivos de nanotubos são úteis para detectar as moléculas de DNA da presente invenção, que compreendem um sensor eletrônico para detectar moléculas de DNA ou nanopérolas para ligar moléculas de DNA específicas e, portanto, podem ser detectadas.
[000112] Kits de detecção de DNA podem ser desenvolvidos usando as composições descritas na presente invenção, e os métodos descritos ou conhecidos no campo da detecção de DNA. Os kits são úteis para identificar se uma amostra contém o DNA do evento transgênico de soja DBN8002 e podem ser aplicados para criar plantas de soja contendo o DNA do evento transgênico de soja DBN8002. Os kits podem conter iniciadores ou sondas de DNA que são homólogos ou complementares a pelo menos uma porção da SEQ ID NO: 1, 2,
3, 4 ou 5, ou conter outros iniciadores de DNA ou sondas homólogas ou complementares ao DNA contido nos elementos genéticos transgênicos do DNA, e essas sequências de DNA podem ser usadas em reações de amplificação de DNA ou como sondas em métodos de hibridização de DNA. A estrutura de DNA da sequência transgênica inserida e a parte da junção genômica da soja contida no genoma da soja e ilustrada na figura 1 e a Tabela 1 compreendem: o DBN8002 de soja que flanqueia a região genômica adjacente à extremidade 5 'da sequência transgênica inserida; uma porção de uma sequência inserida da região de borda direita (RB) de Agrobacterium; um primeiro cassete de expressão consistindo em um promotor Arabidopsis ACTIN2 (prAtAct2), operacionalmente ligado ao gene mVip3Aa resistente a insetos de Bacillus thuringiensis, ainda operacionalmente ligado a um terminador de nopalina sintetase (tNos); um segundo cassete de expressão que consiste em um promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (pr35S), operacionalmente ligado a um gene de fosfinotricina-N-acetiltransferase tolerante ao glufosinato (cPAT) de Streptomyces, ainda operacionalmente ligado a um terminador 35S do vírus do mosaico da couve-flor (t35S); uma porção de uma sequência inserida da região da borda esquerda (LB) de Agrobacterium; e planta de soja DBN8002 que flanqueia a região genômica na extremidade 3 'da sequência transgênica inserida (SEQ ID NO: 5). Em métodos de amplificação de DNA, as moléculas de DNA úteis como iniciadores podem ser qualquer porção derivada da sequência inserida do transgene no evento transgênico de soja DBN8002, ou qualquer porção derivada da sequência de DNA genômico de soja flanqueadora no evento transgênico de soja DBN8002.
[000113] O evento transgênico de soja DBN8002 pode ser usado em combinação com outras variedades de soja transgênica, por exemplo, variedades de soja transgênica tolerantes a herbicidas (como glifosato e dicamba) ou variedades de soja transgênica carregando outros genes resistentes a insetos. Várias combinações destes diferentes eventos transgênicos, quando usados para cruzar com o evento transgênico de soja DBN8002 da presente invenção, podem fornecer variedades de soja transgênica híbrida melhoradas resistentes a vários insetos e tolerantes a vários herbicidas.
Essas variedades exibem melhores desempenhos, como aumento de rendimento, em comparação com variedades não transgênicas e variedades transgênicas de característica única.
[000114] O evento transgênico de soja DBN8002 da presente invenção é resistente aos danos de ingestão causados por pragas de lepidópteros e tolerante à fitotoxicidade de herbicidas agrícolas contendo glufosinato. A planta de soja de dupla característica expressa a proteína Vip3Aa de Bacillus thuringiensis, proporcionando resistência aos danos de ingestão causados por pragas de Lepidópteros (como Clanis bilineata) e expressa a proteína fosfinotricina-N-acetil-transferase (PAT) resistente ao glufosinato de Streptomyces, conferindo tolerância ao glufosinato à planta. A soja de duas características tem as seguintes vantagens: 1) perdas econômicas devido a pragas de Lepidoptera (como Clanis bilineata e Prodenia litura) são evitadas, em que Clanis bilineata e Prodenia litura são as principais pragas nas áreas de plantio de soja; 2) a aplicação de herbicidas agrícolas contendo glufosinato confere à soja uma capacidade de combate de amplo espectro em relação a ervas daninhas; e 3) a produção de soja não é reduzida. Além disso, os transgenes que codificam traços resistentes a insetos e tolerantes a glufosinato estão ligados no mesmo segmento de DNA e existem em um único loco genético do genoma do evento DBN8002 de soja transgênica, que fornecem uma eficácia de melhoramento aprimorada e permitem rastrear os fragmentos transgênicos inseridos na população de propagação e sua progênie usando marcadores moleculares. Enquanto isso, nos métodos de detecção da presente invenção, SEQ ID NO: 1 ou uma sequência complementar desta, SEQ ID NO: 2 ou uma sequência complementar desta, SEQ ID NO: 6 ou uma sequência complementar desta, ou SEQ ID NO : 7 ou uma sequência complementar da mesma pode ser usada como iniciadores de DNA ou sondas para produzir diagnóstico de produtos de amplificação para o evento transgênico de soja DBN8002 ou sua progênie e identificar de forma rápida, precisa e estável a presença de materiais vegetais do evento transgênico de soja DBN8002.
[000115] BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS
[000116] SEQ ID No. 1: uma sequência de 22 nucleotídeos de comprimento que está localizada em torno da junção de inserção na extremidade 5 'da sequência inserida no evento transgênico de soja DBN8002, em que os nucleotídeos 1-11 e nucleotídeos 12-22 estão localizados respectivamente em cada lado do sítio de inserção do genoma da soja;
[000117] SEQ ID No. 2: uma sequência de 22 nucleotídeos de comprimento que está localizada em torno da junção de inserção na extremidade 3 'da sequência inserida no evento transgênico de soja DBN8002, em que os nucleotídeos 1-11 e os nucleotídeos 12-22 estão localizados respectivamente em cada lado do sítio de inserção do genoma da soja;
[000118] SEQ ID No.3: uma sequência de 1524 nucleotídeos que está localizada em torno da junção de inserção na extremidade 5 'da sequência inserida no evento transgênico de soja DBN8002;
[000119] SEQ ID No. 4: uma sequência de 656 nucleotídeos que está localizada em torno da junção de inserção na extremidade 3 'da sequência inserida no evento transgênico de soja DBN8002;
[000120] SEQ ID No. 5: toda a sequência de T-DNA, sequências flanqueadoras genômicas de soja de extremidade 5 'e 3';
[000121] SEQ ID No.6 : uma sequência localizada na SEQ ID NO: 3, abrangendo a sequência de DNA do construto pDBN4006 e uma sequência de origem da transcrição prAtAct2;
[000122] SEQ ID No.7: uma sequência localizada em SEQ ID NO: 4, abrangendo uma sequência de terminação transcricional t35S e a sequência de DNA do construto pDBN4006;
[000123] SEQ ID No.8: um primeiro iniciador para amplificar SEQ ID NO: 3;
[000124] SEQ ID No.9: um segundo iniciador para amplificar SEQ ID NO: 3;
[000125] SEQ ID No.10: um primeiro iniciador para amplificar SEQ ID NO: 4;
[000126] SEQ ID No. 11: um segundo iniciador para amplificar SEQ ID NO: 4;
[000127] SEQ ID No.12: um iniciador da sequência genômica da região flanqueadora de 5 ';
[000128] SEQ ID No.13: um iniciador de T-DNA, que está emparelhado com
SEQ ID NO: 12;
[000129] SEQ ID No.14: um iniciador da sequência genômica da região flanqueadora 3 ', que pode ser usado em par com a SEQ ID No.12 para detectar se um transgene é homozigoto ou heterozigoto;
[000130] SEQ ID No.15: um iniciador de T-DNA, que está emparelhado com SEQ ID No. 14;
[000131] SEQ ID No.16: um primeiro iniciador para detectar o gene mVip3Aa em Taqman;
[000132] SEQ ID No.17: um segundo iniciador para detectar o gene mVip3Aa em Taqman;
[000133] SEQ ID No.18: uma sonda para detectar o gene mVip3Aa em Taqman;
[000134] SEQ ID No. 19: um primeiro iniciador para detectar o gene PAT em Taqman;
[000135] SEQ ID No. 20: um segundo iniciador para detectar o gene PAT em Taqman;
[000136] SEQ ID No. 21: uma sonda para detectar o gene PAT em Taqman;
[000137] SEQ ID No. 22: um primeiro iniciador para lectina do gene endógeno de soja;
[000138] SEQ ID No. 23: um segundo iniciador para lectina do gene endógeno de soja;
[000139] SEQ ID No. 24: uma sonda para o gene mVip3Aa no ensaio de Southern blot;
[000140] SEQ ID No. 25: uma sonda para o gene PAT no ensaio de Southern blot;
[000141] SEQ ID No. 26: um iniciador de T-DNA, que tem a mesma direção que SEQ ID NO: 13;
[000142] SEQ ID No.27: um iniciador de T-DNA, que tem uma direção oposta à SEQ ID NO: 13 e é usado para obter uma sequência flanqueadora;
[000143] SEQ ID No.28: um iniciador de T-DNA, que tem uma direção oposta à SEQ ID No. 13 e é usado para obter uma sequência flanqueadora;
[000144] SEQ ID No. 29: um iniciador de T-DNA, que tem a mesma direção que SEQ ID No. 15;
[000145] SEQ ID No.30: um iniciador de T-DNA, que tem uma direção oposta à SEQ ID NO: 15 e é usado para obter uma sequência flanqueadora;
[000146] SEQ ID No.31: um iniciador de T-DNA, que tem uma direção oposta à SEQ ID No. 15 e é usado para obter uma sequência flanqueadora.
[000147] As soluções técnicas da presente invenção serão ainda descritas abaixo em detalhes com referência às figuras e exemplos anexos.
[000148] BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[000149] A figura 1 é um esquema estrutural dos sítios de junção entre as sequências transgênicas inseridas e o genoma de soja, e um esquema de posições relativas de sequências de ácido nucleico para a detecção de planta de soja DBN8002 (para o esquema de posições relativas, consulte Wm82.a2 RefGen) nas sequências de ácido nucleico para a detecção de plantas de soja DBN8002 e métodos de detecção das mesmas de acordo com a presente invenção;
[000150] A figura 2 é um esquema estrutural do vetor de expressão recombinante pDBN4006 nas sequências de ácido nucleico para detectar a planta de soja DBN8002 e métodos de detecção da mesma de acordo com a presente invenção;
[000151] A figura 3 mostra o efeito do bioensaio do evento transgênico de soja DBN8002 contra Helicoverpa armigera (Hubner) nas sequências de ácido nucleico para detectar a planta de soja DBN8002 e métodos de detecção da mesma de acordo com a presente invenção;
[000152] A figura 4 mostra o efeito de bioensaio do evento transgênico de soja DBN8002 contra Spodoptera litura nas sequências de ácido nucleico para a detecção da planta de soja DBN8002 e métodos de detecção da mesma de acordo com a presente invenção;
[000153] A figura 5 mostra o efeito de bioensaio do evento transgênico de soja DBN8002 contra Spodoptera exigua nas sequências de ácido nucleico para a detecção da planta de soja DBN8002 e métodos de detecção da mesma de acordo com a presente invenção;
[000154] A figura 6 mostra o efeito de bioensaio do evento transgênico de soja DBN8002 contra Clanis bilineata nas sequências de ácido nucleico para detectar a planta de soja DBN8002 e métodos de detecção da mesma de acordo com a presente invenção;
[000155] A figura 7 mostra o efeito de campo do evento transgênico de soja DBN8002 inoculada com Helicoverpa armigera (Hubner) nas sequências de ácido nucleico para detectar a planta de soja DBN8002 e métodos de detecção da mesma de acordo com a presente invenção;
[000156] A figura 8 mostra o efeito de campo do evento transgênico de soja DBN8002 nas sequências de ácido nucleico para a detecção da planta de soja DBN8002 e métodos de detecção da mesma de acordo com a presente invenção, nas condições de Spodoptera exigua de ocorrência natural;
[000157] A figura 9 mostra o efeito de campo do evento transgênico de soja DBN8002 nas sequências de ácido nucleico para detectar a planta de soja DBN8002 e métodos de detecção da mesma de acordo com a presente invenção, nas condições de Spodoptera litura de ocorrência natural;
[000158] A figura 10 mostra o efeito de bioensaio do evento transgênico de soja DBN8002 contra Spodoptera frugiperda nas sequências de ácido nucleico para a detecção da planta de soja DBN8002 e métodos de detecção da mesma de acordo com a presente invenção.
[000159] MODALIDADES PARTICULARES DA INVENÇÃO
[000160] Soluções técnicas das sequências de ácido nucleico para detectar a planta de soja DBN8002 e métodos de detecção da mesma de acordo com a presente invenção serão ilustrados abaixo com referência aos exemplos específicos.
[000161] Exemplo 1: Clonagem e Transformação
[000162] 1.1 Clonagem Vetorial
[000163] Um vetor de expressão recombinante pDBN4006 (como mostrado na Figura 2) foi construído usando técnicas de clonagem de gene padrão. O vetor pDBN4006 compreende dois cassetes de expressão transgênica dispostos em tandem: o primeiro cassete de expressão consistindo em um promotor Arabidopsis ACTIN2 (prAtAct2), operacionalmente ligado ao gene mVip3Aa resistente a insetos da ordem Bacillus thuringiensis (CN103509808B), ainda operativamente ligado a um terminador da nopalina ); o segundo cassete de expressão consistindo em um promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (pr35S), operacionalmente ligado a um gene de fosfinotricina-N-acetiltransferase tolerante ao glufosinato (cPAT) de Streptomyces, ainda operacionalmente ligado a um terminador transcricional 35S do vírus do mosaico da couve-flor (t35S).
[000164] Agrobacterium LBA4404 (Invitrogen, Chicago, EUA; Cat. No: 18313-015) foi transformado com o vetor pDBN4006 pelo método de nitrogênio líquido, e 4- [hidroxi (metil) fosfinil] -DL-homoalanina foi usado como um marcador seletivo para o rastreio de células transformadas.
[000165] 1.2 Transformação de planta
[000166] A transformação foi realizada por um método de transformação mediada por Agrobacterium convencional, compreendendo: co-cultura de tecidos de nó cotiledonar de soja estéril cultivada com Agrobacterium como descrito no Exemplo 1.1 para transferir o T-DNA no vetor de expressão recombinante pDBN4006 aos cromossomos de soja, de modo a produzir o evento de soja transgênico DBN8002.
[000167] Resumidamente, a transformação de soja mediada por Agrobacterium compreende: a germinação de sementes de soja maduras em um meio de germinação de soja (3,1 g / L de sal B5, vitamina B5, 20 g / L de sacarose e 8 g / L de ágar; pH 5,6); inoculação das sementes no meio de germinação; e cultivo das mesmas nas seguintes condições: temperatura de 25 ± 1 ° C e fotoperíodo (claro / escuro) de 16 h / 8 h; 4-6 dias após a germinação, coleta de mudas estéreis de soja verde fresca com nó cotiledonar inflado; excisão dos hipocótilos aproximadamente 3-4 mm abaixo do nó cotiledonar; realização de cortes longitudinais através dos cotilédones e remoção de botões apicais, botões laterais e raízes seminais; ferimento no nó cotiledonar com o dorso de uma lâmina cirúrgica, e colocação em contato dos tecidos do nó cotiledonar ferido com uma suspensão de Agrobacterium; em que Agrobacterium pode fornecer a sequência de nucleotídeos do gene mVip3Aa e a sequência de nucleotídeos do gene PAT aos tecidos do nó cotiledonar ferido (etapa 1: etapa de infecção). Nesta etapa, os tecidos do nó cotiledonar foram preferivelmente imersos na suspensão de Agrobacterium (OD660 = 0,5-0,8, meio de infecção
(2,15 g / L de sal MS, vitamina B5, 20 g / L de sacarose, 10 g / L de glicose, 40 mg / L acetosiringona (AS), 4 g / L de ácido 2-morfolina etanossulfônico (MES) e 2 mg / L de zeatina (ZT); pH 5,3) para iniciar a infecção.
Os tecidos do nó cotiledonar foram co-cultivados com Agrobacterium por um período de tempo (3 dias) (etapa 2: etapa de co-cultura). Preferivelmente, os tecidos do nó cotiledonar foram cultivados em um meio sólido (contendo 4,3 g / L de sal MS, vitamina B5, 20 g / L de sacarose, 10 g / L glicose, 4 g / L de MES, 2 mg / L de ZT e 8 g / L de ágar; pH 5,6) após a etapa de infecção.
Após a etapa de co-cultura, pode haver uma etapa opcional de "recuperação". Na etapa de "recuperação", o meio de recuperação (3,1 g / L de sal B5, vitamina B5, 1 g / L de MES, 30 g / L de sacarose, 2 mg / L de ZT, 8 g / L de ágar, 150 mg / L de cefalosporina, 100 mg / L de ácido glutâmico e 100 mg / L de ácido aspártico; pH 5,6) compreende pelo menos um antibiótico (150-250 mg / L cefalosporina) conhecido por inibir o crescimento de Agrobacterium, embora não compreenda qualquer agente seletivo para transformantes de plantas (etapa 3: etapa de recuperação). Preferivelmente, os blocos de tecido regenerados a partir do nó cotiledonar foram cultivados em um meio sólido compreendendo antibiótico, mas sem agente seletivo para eliminar Agrobacterium e fornecer um estágio de recuperação para as células infectadas.
Posteriormente, os blocos de tecido regenerados a partir do nó cotiledonar foram cultivados em um meio contendo um agente seletivo (4 - [(hidroxi (metil) fosfinil)] - DL-homoalanina), e os calos transformados em crescimento foram selecionados (etapa 4: etapa de seleção ) Preferivelmente, os blocos de tecido regenerados a partir do nó cotiledonar foram cultivados em um meio seletivo sólido (3,1 g / L de sal B5, vitamina B5, 1 g / L de MES, 30 g / L de sacarose, 1 mg / L de 6-benziladenina ( 6-BAP), 8 g / L de ágar, 150 mg / L de cefalosporina, 100 mg / L de ácido glutâmico, 100 mg / L de ácido aspártico e 10 mg / L de 4- (hidroxi (metil) fosfinil) -DL-homoalanina; pH 5,6) compreendendo um agente seletivo, que resultou no crescimento contínuo das células transformadas.
Em seguida, as células transformadas regeneraram em plantas (etapa 5: etapa de regeneração). Preferivelmente, os blocos de tecido regenerados a partir do crescimento de nódulo cotiledonar no meio contendo um agente seletivo foram cultivados em um meio sólido (meio de diferenciação B5 e meio de enraizamento B5) para regenerar plantas.
[000168] Os tecidos resistentes obtidos na triagem foram transferidos para meio de diferenciação B5 (3,1 g / L de sal B5, vitamina B5, 1 g / L de MES, 30 g / L de sacarose, 1 mg / L de ZT, 8 g / L de ágar, 150 mg / L de cefalosporina, 50 mg / L de ácido glutâmico, 50 mg / L de ácido aspártico, 1 mg / L de giberelina, 1 mg / L de auxina e 5 mg / L de 4- (hidroxi (metil) fosfinil) -DL-homoalanina ; pH 5,6), e cultivadas para diferenciação a 25 ° C. As mudas diferenciadas foram transferidas para meio de enraizamento B5 (3,1 g / L de sal B5, vitamina B5, 1 g / L de MES, 30 g / L de sacarose, 8 g / L de ágar, 150 mg / L de cefalosporina e 1 mg / L de ácido indol-3-butírico (IBA)), e cultivadas a 25 ° C. Quando as mudas atingiram cerca de 10 cm de altura, foram transferidas para a estufa e cultivadas até a frutificação. Na estufa, elas foram cultivadas a 26 ° C por 16 horas e, em seguida, a 20 ° C por 8 horas por dia.
[000169] 1.3. Identificação e triagem de eventos transgênicos
[000170] Foi produzido um total de 288 plantas T0 transgênicas independentes. A fim de rastrear um evento transgênico com desempenho ideal, as 288 plantas T0 transgênicas independentes acima foram movidas para a estufa para transplante, cultivo e propagação para proporcionar plantas transgênicas T1 únicas.
[000171] Uma vez que o processo de transformação genética de soja usando sementes de soja maduras e glufosinato como um agente seletivo tende a gerar eventos transgênicos falso-positivos, a geração T1 foi pulverizada com glufosinato para identificar eventos transgênicos positivos e um total de 154 plantas únicas transgênicas positivas foram obtidas. Por análise TaqManTM, as 154 plantas de soja transgênica acima foram detectadas quanto à presença de genes mVip3Aa e PAT de cópia única e ausência de sequências estruturais do vetor; e um total de 90 plantas transgênicas isoladas foram obtidas. Pela análise dos sítios de inserção transgênica, um total de 24 plantas transgênicas únicas foram obtidas por triagem, em que as sequências em ambos os lados do T-DNA estavam intactas, o T-DNA não foi inserido em genes importantes do genoma da soja e a inserção do gene não resultou em nenhuma fase de leitura aberta grande (ORF). Por avaliação e comparação da resistência contra os principais insetos-alvo (como Helicoverpa armigera (Hubner), Prodenia litura e Spodoptera exigua), um total de 21 plantas transgênicas únicas com boa resistência a insetos foram obtidas por triagem. Uma vez que a transformação genética e a inserção do gene podem afetar os traços agronômicos das plantas de soja (como vigor da muda, período de propagação, altura da planta ou acamamento), as 21 plantas transgênicas da geração T2 acima foram plantadas em um campo para identificar o desempenho dos traços agronômicos das plantas transgênicas T2 isoladas em diferentes estágios (do estágio de muda até o estágio de floração completa, estágio inicial de formação de grãos até o estágio de maturidade) Por meio de autofecundação e cruzamento retrocruzado, é rastreado se os traços agronômicos, biologia molecular, resistência contra os insetos-alvo e tolerância ao herbicida glufosinato das plantas de soja transgênica podem ser herdadas de forma estável nas condições de diferentes gerações, diferentes ambientes geográficos e / ou diferentes materiais de base, e o evento transgênico de soja DBN8002 foi selecionado como um evento excelente, que tem uma única cópia dos transgenes (ver exemplo 2), boa resistência a insetos, tolerância a herbicida glufosinato e desempenho de traço agronômico (ver Exemplos 6 e 7 ).
[000172] Exemplo 2: Detecção do evento transgênico de soja DBN8002 por TaqMan
[000173] Usando um kit de extração de DNA de planta (DNeasy Plant Maxi Kit, Qiagen), o DNA genômico foi extraído da folha (cerca de 100 mg) do evento transgênico de soja DBN8002 como uma amostra e os números de cópia de mVip3Aa e os genes PAT foram detectados por um método de PCR quantitativo fluorescente usando a sonda Taqman. Enquanto isso, uma planta de soja de tipo selvagem como controle foi sujeita à detecção e análise de acordo com os métodos acima. As experiências foram realizadas em triplicata e o valor médio foi calculado.
[000174] O método específico é o seguinte:
[000175] Etapa 1: 100 mg de folha do evento transgênico de soja DBN8002 foram moídos em um homogenato em um almofariz com nitrogênio líquido, e cada amostra foi preparada em triplicata;
[000176] Etapa 2: os DNAs genômicos das amostras acima foram extraídos usando um kit de extração de DNA de planta (DNeasy Plant Maxi Kit, Qiagen, para métodos detalhados, consulte as Instruções do Produto);
[000177] Etapa 3: as concentrações dos DNAs genômicos das amostras acima foram medidas usando ultra microespectrofotômetro (NanoDrop 2000, Thermo Scientific);
[000178] Etapa 4: as concentrações dos DNAs genômicos das amostras acima foram ajustadas para o mesmo valor de concentração variando de 80 a 100 ng / μL;
[000179] Etapa 5: o número de cópias das amostras foi identificado por um método de PCR quantitativo fluorescente usando a sonda Taqman, em que a amostra identificada com um número de cópias conhecido foi usada como padrão e uma amostra de uma planta de soja tipo selvagem foi utilizada como controle. Cada amostra foi testada em triplicata e o valor médio foi calculado. As sequências de iniciadores e sondas para PCR quantitativo fluorescente são as seguinte:
[000180] Os seguintes iniciadores e sonda são usados para detectar a sequência do gene mVip3Aa:
[000181] Iniciador 1: cgaatacagaaccctgtcggc conforme estabelecido na SEQ ID NO: 16 na LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS;
[000182] Iniciador 2: cgtgaggaaggtctcagaaatgac conforme estabelecido na SEQ ID NO: 17 na LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS;
[000183] Sonda 1: cgacgatggcgtgtatatgcctcttgg conforme estabelecido na SEQ ID NO: 18 na LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS;
[000184] Os seguintes iniciadores e sonda são usados para detectar a sequência do gene PAT:
[000185] Iniciador 3: gagggtgttgtggctggtattg conforme estabelecido na SEQ ID NO: 19 na LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS;
[000186] Iniciador 4: tctcaactgtccaatcgtaagcg conforme estabelecido na SEQ ID NO: 20 na LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS;
[000187] Sonda 2: cttacgctgggccctggaaggctag conforme estabelecido na SEQ ID NO: 21 na LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS.
[000188] O sistema de reação de PCR compreende
JumpStart™ Taq ReadyMix™ (Sigma) 10 μL Mistura 50x d iniciador/sonda 1 μL DNA genômico 3 μL Água duplamente destilada (ddH2O) 6 μL
[000189] em que a mistura 50 x iniciador / sonda compreende 45 μl de cada iniciador a uma concentração de 1 mM, 50 μl da sonda a uma concentração de 100 μM e 860 μl de tampão TE lx (Tris- 10 mM HCl, EDTA 1 mM; pH 8,0), e foi armazenada em um tubo âmbar a 4 ° C.
[000190] Condição de reação PCR compreende: Etapa Temperatura Tempo 1 95°C 5 minutos 2 95°C 30 segundos 3 60°C 1 minuto 4 volte para a etapa 2 e repita 40 vezes
[000191] Os dados foram analisados usando software de sistema de PCR quantitativo fluorescente em tempo real rápido (Applied Biosystems 7900HT Sistema de PCR em tempo real rápido SDS v2.3, Applied Biosystems). Os resultados demonstram que o evento transgênico de soja resultante DBN8002 é uma cópia única.
[000192] Exemplo 3: Análise do sítio de inserção do evento transgênico de soja DBN8002
[000193] 3.1 Extração de DNA genômico
[000194] O DNA foi extraído pelo método convencional CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio): após 2 g de folha jovem do evento transgênico de soja DBN8002 terem sido moídos em pó em nitrogênio líquido, 0,5 mL de tampão de extração de DNA CTAB (20 g / L CTAB, NaCl 1,4 M, Tris-HCl 100 mM e EDTA 20 mM (ácido edético), com um pH ajustado para pH 8,0 com NaOH) pré- aquecido a 65 ° C foram adicionados, em seguida eles foram completamente misturados e extraídos a 65 ° C por 90 min; 0,5 volume de fenol e 0,5 volume de clorofórmio foram adicionados e misturados por inversão; a mistura foi centrifugada a 12.000 rpm (revolução por minuto) durante 10 min; o sobrenadante foi pipetado e 2 volumes de etanol absoluto foram adicionados; o tubo de centrifugação foi agitado suavemente e em seguida deixado em repouso a 4 ° C por 30 min; o tubo de centrifugação foi centrifugado novamente a 12.000 rpm por 10 min de modo que o DNA foi coletado para o fundo do tubo; o sobrenadante foi descartado e o sedimento foi lavado com 1 mL de etanol 70% (concentração em massa); a mistura foi centrifugada a 12.000 rpm durante 5 min; o sedimento foi seco no vácuo ou seco em uma bancada superlimpa; e o sedimento de DNA resultante foi dissolvido em uma quantidade apropriada de tampão TE e armazenado a -20 ° C.
[000195] 3.2 Análise de sequências de DNA flanqueadoras
[000196] A concentração da amostra de DNA extraída acima foi medida. A concentração da amostra a ser testada é de 80-100 ng / μL. O DNA genômico foi digerido usando as enzimas de restrição EcoR I (análise da extremidade 5 ') e EcoR V (análise da extremidade 3'), respectivamente. Cada sistema de digestão enzimática foi adicionado com 26,5 μL de DNA genômico, 0,5 μL das enzimas de restrição acima e 3 μL de tampão de digestão enzimática (todas as enzimas de restrição empregadas são enzimas com tampões variados ou tampões genéricos da empresa NEB (agora conhecido como NEBCutSmart) ), e foi digerido por 1 hora. Após a digestão, o sistema de digestão enzimática foi adicionado com 70 μL de etanol absoluto, mantido em banho de gelo por 30 min e centrifugado a 12.000 rpm por 7 min. Depois de descartar o sobrenadante, o sedimento foi seco com secador e adicionado com 8,5 μL de água bidestilada, 1 μL de tampão 10 x T4-DNA ligase (NEB T4 DNA Ligase Reaction Buffer; para sua formulação específica, visite o sites da NEB ou consulte https://www.neb.com/products/restriction-endonucleases ou https://www.neb.com/products/b0202-t4-dna-ligase-reaction-buffer) e 0,5 μL de T4-DNA ligase, e em seguida ligado durante a noite a 4 ° C. Os DNAs genômicos das extremidades 5 'e 3' foram isolados por amplificação por PCR usando uma série de iniciadores aninhados. Especificamente, a combinação de iniciadores para isolar o DNA genômico da extremidade 5 'compreende SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 26 como primeiros iniciadores, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 28 como segundos iniciadores e SEQ ID NO: 13 como um iniciador de sequenciamento. A combinação de iniciadores para o isolamento de DNA genômico da extremidade 3 'compreende SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 29 como primeiros iniciadores, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31 como segundos iniciadores e SEQ ID NO: 15 como um iniciador de sequenciamento. As condições da reação de PCR foram mostradas na Tabela 3.
[000197] O produto de amplificação resultante da amplificação por PCR acima foi submetido a eletroforese em um gel de agarose com uma fração de massa de 2,0% para isolar o produto de amplificação por PCR; subsequentemente, o fragmento alvo foi isolado da matriz de agarose usando um kit de extração de gel (QI-Aquick Gel Extraction Kit, catálogo # _28704, Qiagen Inc., Valencia, CA). Em seguida, o produto de amplificação de PCR purificado foi sequenciado (por exemplo, usando ABI PrismTM 377, PE Biosystems, Foster City, CA) e analisado (por exemplo, usando software de análise de sequência DNASTAR, DNASTAR Inc., Madison, WI).
[000198] As sequências flanqueadoras 5 'e 3' e as sequências de junção foram confirmadas usando procedimentos de PCR padrão. As sequências flanqueadoras e de junção 5 'foram confirmadas usando SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 12 em combinação com SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO:
26. As sequências flanqueadoras e de junção 3' foram confirmadas usando SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 14 em combinação com SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 29. Os sistemas de reação de PCR e as condições de amplificação foram mostrados nas tabelas 2 e 3. Será reconhecido por aqueles versados na técnica que outras sequências de iniciador também podem ser usadas para confirmar as sequências flanqueadoras e de junção.
[000199] O sequenciamento de DNA dos produtos de amplificação de PCR fornece um DNA que pode ser usado para projetar outras moléculas de DNA que podem ser usadas como iniciadores e sondas para identificar plantas de soja ou sementes derivadas do evento transgênico de soja DBN8002.
[000200] A sequência inserida do evento transgênico de soja DBN8002 se apresentou flanqueada na borda direita (sequência flanqueadora 5 ') pela sequência genômica de soja mostrada nos nucleotídeos 1-647 de SEQ ID NO: 5 e flanqueada na borda esquerda (sequência flanqueadora 3 ') pela sequência genômica de soja mostrada nos nucleotídeos 6647-7344 da SEQ ID NO: 5. A sequência de junção 5' foi estabelecida na SEQ ID NO: 1 e a sequência de junção 3 'foi definida adiante na SEQ ID NO: 2.
[000201] 3.3. Ensaio de PCR quanto à zigosidade
[000202] A sequência de junção é uma molécula polinucleotídica relativamente curta, que é uma nova sequência de DNA e é diagnóstica para o DNA do evento transgênico de soja DBN8002 quando detectado na detecção e análise de polinucleotídeo. As sequências de junção em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente, são 11 polinucleotídeos em cada lado do sítio de inserção do fragmento transgênico e DNA genômico de soja no evento transgênico de soja DBN8002. Sequências de junção polinucleotídica mais longas ou mais curtas podem ser selecionadas a partir de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. As sequências de junção (SEQ ID NO: 1 usada como região de junção 5 'e SEQ ID NO: 2 usada como região de junção 3' ) foram úteis no método para detectar DNA como sondas de DNA ou moléculas de iniciador de DNA. As sequências de junção SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7 também eram novas sequências de DNA do evento transgênico de soja DBN8002, e também poderiam ser usadas para detectar a presença do evento transgênico de soja DBN8002 como sondas de DNA ou moléculas de iniciador de DNA. SEQ ID NO: 6 (os nucleotídeos 911-1129 de SEQ ID NO: 3) abrange uma sequência de DNA e uma sequência de origem de transcrição prAtAct2 no construto pDBN4006 e SEQ ID NO: 7 (os nucleotídeos 1-243 de SEQ ID NO: 4) abrange uma sequência de terminação transcricional t35S e uma sequência de DNA no construto pDBN4006.
[000203] Além disso, um amplicon foi gerado usando pelo menos um iniciador derivado de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, e o referido iniciador, quando usado em um método de PCR, gerou um amplicon de diagnóstico para o evento transgênico de soja DBN8002 .
[000204] Especificamente, o produto de amplificação de PCR foi gerado a partir da extremidade 5 'da sequência transgênica inserida, compreendendo uma porção do DNA genômico na extremidade 5' que flanqueia a sequência inserida de T-DNA no genoma de materiais vegetais derivados do evento transgênico de soja DBN8002. O produto de amplificação por PCR compreende SEQ ID NO: 3. Para amplificação por PCR, foram projetados iniciador 5 (SEQ ID NO: 8), que pode hibridizar com uma sequência de DNA genômico na extremidade 5 ' que flanqueia a sequência transgênica inserida, e iniciador 6 (SEQ ID NO : 9), que estava em par com o iniciador 5 e localizado na sequência de origem da transcrição prAtAct2 da sequência inserida de T-DNA.
[000205] O produto de amplificação por PCR foi gerado a partir da extremidade 3 'da sequência transgênica inserida, compreendendo uma porção do DNA genômico na extremidade 3' que flanqueia a sequência inserida de T- DNA no genoma de materiais vegetais derivados do evendo de soja transgênica DBN8002. O produto de PCR compreende SEQ ID NO: 4. Para amplificação de PCR, iniciador 7 (SEQ ID NO: 10), que estava localizado na sequência de terminação transcricional t35S da sequência inserida de T-DNA e iniciador 8 (SEQ ID NO: 11) , que estava em par com o iniciador 7 e pode hibridizar com uma sequência de DNA genômico na extremidade 3 'que flanqueia a sequência transgênica inserida, foram projetados.
[000206] As condições de amplificação de DNA descritas nas Tabelas 2 e 3 poderiam ser usadas nos ensaios de PCR acima para zigosidade para gerar um amplicon diagnóstico para o evento transgênico de soja DBN8002. A detecção de amplicon pode ser conduzida usando um termociclador, tal como Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700 ou Eppendorf Mastercycler Gradient, ou por métodos e aparelhos conhecidos pelos versados na técnica.
[000207] Tabela 2: As etapas e condições da mistura de reação na reação de PCR para a identificação da inserção transgênica da extremidade 5 '/ região de junção genômica do evento transgênico de soja DBN8002.
Eta Reagente Quantidade Nota Água livre de nuclease Adicionado a um volume 1 final de 20 μL 10 x tampão de reação A concentração final (com MgCl2) de 1 x tampão; a 2 2.0 μL concentração final de MgCl2: 1,5 mM Solução 10 mM de A concentração final 3 dATP, dCTP, dGTP e 0.2 μL de cada dNTP: 200 dTTP μM Iniciador 5 (SEQ ID A concentração 4 No.8) ressuspenso em 0.2 μL final: 0,1 μM tampão TE 1 x ou água livre de nuclease a uma concentração de 10 μM Iniciador 6 (SEQ ID A concentração No.9) ressuspenso em final: 0,1 μM tampão TE 1 x ou 5 0.2 μL água livre de nuclease a uma concentração de 10 μM RNase; Livre de 50 ng / reação 6 0.1 μL DNase (500 μg / ml) REDTaq® DNA 1,0 μL (recomendado 1 unidade / reação 7 polimerase (1 unidade para trocar uma pipeta / μL) antes da próxima etapa) DNA extraído 200 ng de DNA (modelo): folhas das genômico amostras a serem analisadas Controle negativo 50 ng de DNA genômico de soja não transgênica 8 Controle negativo Sem DNA padrão (a solução para ressuspender DNA) Controle positivo 50 ng de DNA genômico de soja compreendendo DBN8002
[000208] Tabela 3: Condições de amplificação do termociclador No.de ciclos Configuração 1 94°C 3 min 94°C 30 seg 34 64°C 30 seg 72°C 1 min 1 72°C 10 min
[000209] As soluções de reação foram suavemente misturadas e, se não houvesse topo quente no termociclador, adiciounou-se 1-2 gotas de óleo mineral no topo de cada solução de reação. A reação de PCR foi conduzida em um termociclador, como Stratagene Robocycler (Stratagene, La Jolla, CA), MJ Engine (MJ R-Biorad, Hercules, CA), Perkin-Elmer 9700 (Perkin Elmer, Boston, MA), ou Eppendorf Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) usando os parâmetros de ciclo mostrados na Tabela 3. O termociclador MJ Engine ou Eppendorf Mastercycler Gradient deve ser executado no modo calculado. O termociclador Perkin-Elmer 9700 deve ter uma velocidade de rampa definida no máximo durante a operação.
[000210] Os testes mostram os seguintes resultados: quando usados em uma reação de PCR do DNA genômico de evento transgênico de soja DBN8002, os iniciadores 5 e 6 (SEQ ID NO: 8 e 9) resultam em um fragmento de 1524 bp do produto de amplificação, mas quando os iniciadores foram usados em reações de PCR de um DNA genômico de soja não transformado e DNA genômico de soja não DBN8002, nenhum fragmento foi amplificado; quando usados em uma reação de PCR do DNA genômico de soja do evento transgênico de soja DBN8002, os iniciadores 7 e 8 (SEQ ID NO: 10 e 11) resultam em um fragmento de 656 pb do produto de amplificação, mas quando os iniciadores foram usados em reações de PCR de um DNA genômico de soja não transformado e DNA genômico de soja não DBN8002, nenhum fragmento foi amplificado.
[000211] Os ensaios de PCR para zigosidade também podem ser usados para identificar se o material derivado do evento transgênico de soja DBN8002 é homozigoto ou heterozigoto. O iniciador 9 (SEQ ID NO: 12), o iniciador 10 (SEQ ID NO: 13) e o iniciador 11 (SEQ ID NO: 14) foram usados em uma reação de amplificação para produzir um amplicon de diagnóstico para o evento transgênico de soja DBN8002. As condições de amplificação de DNA descritas nas Tabelas 4 e 5 podem ser usadas nos ensaios acima para zigosidade para produzir um diagnóstico de amplicon para o evento transgênico de soja DBN8002.
[000212] Tabela 4: Solução de reação para os ensaios de zigosidade Eta Reagente Quantidade Nota Água livre nuclease Adicionado a um volume final 1 de 5 μl 2 x Mistura Principal Universal （ 1x 2 Catálogo da Applied Biosystems 2.5 μL concentração nº 4304437） final Iniciador 9 (SEQ ID NO: 12) e A 3 iniciador 10 (SEQ ID NO: 13) 0.05 μL concentração ressuspenso em água livre de final: 0,25 μM nuclease a uma concentração de 10 μM
A Iniciador 11 (SEQ ID NO: 14) concentração ressuspenso em tampão TE 1 x final: 0,15 μM 4 0.01 μL ou água livre de nuclease a uma concentração de 10 μM REDTaq® DNA polimerase (1 1,0 μl (recomendado para 1 5 unidade / μl) trocar uma pipeta antes da unidade/reação próxima etapa) DNA extraído (padrão): 200 ng de DNA genômico folhas das amostras a serem 50 ng de DNA genômico de analisadas soja não transgênica 6 Controle negativo Sem DNA modelo (a solução para ressuspender DNA) Controle negativo 50 ng de DNA genômico de soja compreendendo DBN8002
[000213] Tabela 5: Condições de amplificação do termociclador para os ensaios de zigosidade No.Ciclo Configuração 1 95°C 10 min 95°C 15 seg 10 64°C 1 min (-1°C/ciclo) 95°C 15 seg 30 54°C 1 min 1 10°C imersão
[000214] A reação de PCR foi conduzida em um termociclador, como Stratagene Robocycler (Stratagene, La Jolla, CA), MJ Engine (MJ R-Biorad, Her- cules, CA), Perkin-Elmer 9700 (Perkin Elmer, Boston, MA) , ou Eppendorf Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) usando os parâmetros de ciclo mostrados na Tabela 5. O termociclador MJ Engine ou Eppendorf Mastercycler Gradient deve ser executado no modo calculado. O termociclador Perkin-Elmer 9700 deve ter uma velocidade de rampa definida no máximo durante a operação.
[000215] Na reação de amplificação, a amostra biológica compreendendo DNApadrão contém o diagnóstico de DNA para a presença do evento transgênico de soja DBN8002. Alternativamente, a reação de amplificação resultaria em dois amplicons de DNA diferentes gerados a partir da amostra biológica compreendendo o DNA derivado do genoma da soja, e o DNA derivado do genoma da soja é heterozigoto para o alelo correspondente do DNA inserido presente no evento transgênico de soja DBN8002. Os dois amplicons diferentes corresponderiam a um primeiro amplicon (SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14) derivado do loco genético do genoma de soja de tipo selvagem e um segundo amplicon (SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13) diagnóstico para a presença do DNA do evento transgênico de soja DBN8002. Uma amostra de DNA de soja que gera apenas um único amplicon correspondente ao segundo amplicon conforme descrito em relação ao genoma heterozigoto poderia ser diagnosticada como a presença do evento transgênico de soja DBN8002 nessa amostra, e a amostra foi produzida a partir de sementes de soja homozigotas para o correspondente alelo do DNA inserido presente na planta de soja transgênica DBN8002.
[000216] Deve-se notar que os pares de iniciadores para o evento transgênico de soja DBN8002 são usados para produzir um amplicon de diagnóstico para DNA genômico do evento transgênico de soja DBN8002. Estes pares de iniciadores incluem, mas não estão limitados a iniciadores 5 e 6 (SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9) e iniciadores 7 e 8 (SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11), e são usados no método de amplificação de DNA. Além disso, os iniciadores de controle 12 e 13 (SEQ ID NOs: 22 e 23) para a amplificação de um gene endógeno de soja são incluídos como um padrão interno para as condições de reação. A análise da amostra de extração de DNA do evento transgênico de soja DBN8002 deve incluir um extrato de DNA de tecido do evento transgênico de soja DBN8002 como controle positivo, um extrato de DNA de uma planta de soja que não é o evento transgênico de soja DBN8002 como controle negativo, e controle negativo sem extrato de DNA padrão de soja. Além destes pares de iniciadores, qualquer par de iniciadores de SEQ ID NO: 3 ou de uma sequência complementar da mesma, ou SEQ ID NO: 4 ou de uma sequência complementar da mesma, poderá ser usado. Quando esses iniciadores são usados para a reação de amplificação de DNA, eles produzem respectivamente amplicons compreendendo SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 e são diagnósticos para tecidos derivados do evento de soja transgênica DBN8002. As condições de amplificação de DNA, conforme descrito nas Tabelas 2 a 5, podem ser usadas na produção de um amplicon de diagnóstico para o evento transgênico de soja DBN8002 usando pares de iniciadores adequados. O extrato de DNA de plantas ou sementes de soja que produz um amplicon de diagnóstico para o evento transgênico de soja DBN8002 em um método de amplificação de DNA e se presume que contenha o evento transgênico de soja DBN8002, ou um produto derivado do evento transgênico de soja DBN8002, pode ser usado como um padrão para amplificação para determinar a presença do evento transgênico de soja DBN8002.
[000217] Exemplo 4: Detecção do evento transgênico de soja DBN8002 por Southern blot
[000218] 4.1 Extração de DNA para uso em Southern blot
[000219] Aproximadamente 5 a 10 g de tecido vegetal foi moído em nitrogênio líquido usando um almofariz e um pilão. 4 a 5 g de tecido vegetal moído foi ressuspenso em 20 mL de tampão de lise CTAB (Tris-HCl 100 mM pH 8,0, EDTA 20 mM pH 8,0, NaCl 1,4 M, 0,2% v / v β-mercaptoetanol, 2% p / v CTAB), e incubados a uma temperatura de 65 ° C durante 60 minutos. Durante a incubação, a amostra foi uniformemente misturada por inversão uma vez a cada 10 minutos. Após a incubação, um volume igual de fenol / clorofórmio / álcool isoamílico (25: 24: 1) foi adicionado e suavemente misturado por inversão para extração e, em seguida, centrifugado a uma velocidade de rotação de 4.000 rpm por 20 minutos. A fase aquosa foi coletada e reextraída uma vez com igual volume de clorofórmio / álcool isoamílico (24: 1). A fase aquosa foi recolhida e adicionada a um volume igual de isopropanol. A mistura foi misturada uniformemente, deixada em repouso a uma temperatura de -20 ° C por 1 hora para precipitar o DNA e, em seguida, centrifugada a uma velocidade de rotação de 4.000 rpm por 5 minutos para obter o sedimento de DNA, que foi subsequentemente ressuspenso em 1 mL de Tampão TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM; pH 8,0). A fim de degradar qualquer RNA possível, o DNA foi incubado com 40 µL de 10 mg / mL RNase A a uma temperatura de 37 ° C por
30 minutos, centrifugado a uma velocidade de rotação de 4.000 rpm por 5 minutos e, em seguida, centrifugado a uma velocidade de rotação de 12.000 rpm por 10 minutos na presença de 0,1 vezes o volume de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e 2 vezes os volumes de etanol absoluto para precipitar o DNA. Depois que o sobrenadante foi descartado, o sedimento foi lavado com 1 mL de etanol 70% (v / v) e seco à temperatura ambiente, e então o DNA foi redissolvido em 1 mL de tampão TE.
[000220] 4.2 Digestão de enzima de restrição
[000221] A concentração de DNA genômico na amostra mencionada acima foi medida usando um espectrofotômetro de ultravolume (NanoDrop 2000, Thermo Scientific).
[000222] Em um sistema de reação de 100 μL, 5 μg de DNA foram digeridos a cada vez. O DNA genômico foi digerido respectivamente com as enzimas de restrição Mfe I e Nco I, usando uma porção das sequências dos genes mVip3Aa e PAT no T-DNA como sondas. Para cada enzima, os produtos da digestão foram incubados durante a noite a uma temperatura apropriada. A amostra foi centrifugada em um concentrador de vácuo centrífugo (speed Vacuum, Thermo Scientific) para reduzir o volume para 20 μl.
[000223] 4.3 Eletroforese em gel
[000224] Corante de carga azul de bromofenol foi adicionado a cada amostra do Exemplo 4.2, e cada amostra foi carregada em um gel de agarose 0,7% contendo brometo de etídio e eletroforese para isolamento em tampão de eletroforese TAE (40 mM de tris-ácido acético, 2 mM EDTA, pH 8,5). A eletroforese em gel foi executada durante a noite a uma tensão de 20 V.
[000225] Após a eletroforese, o gel foi tratado com 0,25 M de HCl por 10 minutos para depurinar o DNA e, em seguida, tratado com uma solução de desnaturação (1,5 M de NaCl, 0,5M de NaOH) e uma solução de neutralização (1,5 M de NaCl, 0,5 M de Tris-HCl; pH 7,2) por 30 minutos, respectivamente. 5 × SSC (3 M de NaCl, 0,3 M de citrato de sódio; pH 7,0) foi vertido para um prato de porcelana; um pedaço de vidro foi coberto; e então uma ponte de papel de filtro úmido, um gel, uma membrana de náilon carregada positivamente (Roche, Cat. No. 11417240001), três pedaços de papel de filtro, uma torre de papel e um objeto pesado foram colocados sucessivamente. Após a transferência de membrana à temperatura ambiente durante a noite, a membrana de náilon foi enxaguada com água desionizada duas vezes e o DNA foi imobilizado na membrana por reticulador ultravioleta (UVP, UV Crosslinker CL-1000).
[000226] 4.4 Hibridização
[000227] Uma sequência de DNA adequada foi amplificada por PCR para preparação da sonda. As sondas de DNA eram SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 25, ou parcialmente homólogas ou complementares às sequências acima. A marcação DIG das sondas, Southern blot, lavagem da membrana e outras operações foram realizadas usando o DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche, Cat. No. 11585614910). Para métodos específicos, consulte as instruções do produto. Finalmente, um filme de raios-X (Roche, Cat. No. 11666916001) foi usado para detectar a posição onde a sonda foi ligada.
[000228] Cada Southern blot incluiu duas amostras de controle: (1) DNA de um segregante negativo (não transformado), que foi usado para identificar quaisquer sequências endógenas de soja que poderiam hibridizar com a sonda específica do elemento; e (2) DNA de um segregante negativo, no qual o plasmídeo pDBN4006 digerido por Hind III foi introduzido em uma quantidade equivalente a um único número de cópias com base no comprimento da sonda, que foi usado como um controle positivo para mostrar a sensibilidade do experimento quando uma única cópia do gene foi detectada no genoma da soja.
[000229] Os dados de hibridização fornecem evidências corroboratórias para apoiar a análise de TaqManTM PCR, ou seja, a planta de soja DBN8002 contém os genes mVip3Aa e PAT em uma única cópia. Ao usar a sonda para o gene mVip3Aa, as digestões enzimáticas de Mfe I e Nco I, respectivamente, geram bandas únicas de cerca de 5,5 kb e 11 kb; e usando a sonda para o gene PAT, as digestões enzimáticas de Mfe I e Nco I, respectivamente, geram bandas únicas de cerca de 2,5 kb e 10 kb. Isso indica que os genes mVip3Aa e PAT estavam respectivamente presentes na planta de soja DBN8002 em uma cópia. Além disso, nenhuma banda de hibridização foi obtida usando a sonda estrutural. Isso indica que nenhuma sequência estrutural do vetor pDBN4006 foi introduzida no genoma da planta de soja DBN8002 durante a transformação.
[000230] Exemplo 5: Detecção da expressão de proteínas no evento transgênico de soja DBN8002 por ELISA
[000231] As faixas de expressão das proteínas Vip3Aa e PAT no evento transgênico de soja DBN8002 podem ser detectadas por ELISA.
[000232] 2 mg de folha liofilizada do evento transgênico de soja DBN8002 foram pesados e tomados como a amostra. A folha foi moída em nitrogênio líquido e, em seguida, adicionado 1 mL de tampão de extração (8 g / L de NaCl, 0,27 g / L de KH2PO4, 1,42 g / L de Na2HPO4, 0,2 g / L de KCl e 5,5 mL / L de Tween-20 ; pH 7,4). A mistura foi misturada uniformemente, deixada em repouso a uma temperatura de 4 ° C durante 30 minutos e, em seguida, centrifugada a uma velocidade de rotação de 12.000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi pipetado e diluído com o tampão de extração acima para uma diluição adequada. 80 µL de sobrenadante diluído foram coletados para detecção por ELISA.
[000233] As quantidades de proteína (proteínas Vip3Aa e PAT) na amostra pelo peso seco da folha foram medidas e analisadas por kits de detecção de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (ENVIRLOGIX Company, kit Vip3Aa (AP085) e kit PAT (AP014 )). Para métodos específicos, consulte as instruções do produto. Enquanto isso, uma folha de planta de soja de tipo selvagem (não transgênica, NGM) foi usada como uma amostra de controle. A detecção e análise foram realizadas de acordo com o método mencionado acima, com 6 replicatas por planta.
[000234] Os resultados experimentais dos conteúdos de proteína (proteínas Vip3Aa e PAT) do evento transgênico de soja DBN8002 foram mostrados na Tabela 6. Os níveis médios de expressão de proteínas Vip3Aa no evento transgênico de soja DBN8002 e folhas de planta de soja de tipo selvagem por peso seco de folha (µg / g) foram 14,49 e 0, respectivamente; e os níveis médios de expressão de proteínas PAT no evento transgênico de soja DBN8002 e folhas de plantas de soja de tipo selvagem por peso seco de folha (µg / g) foram 227,29 e 0, respectivamente.
[000235] Tabela 6 Resultados médios dos ensaios sobre os níveis de expressão de proteínas (µg / g) no evento transgênico de soja DBN8002.
Proteína / planta DBN8002 NGM Proteína Vip3Aa 14.49±2.62 0±0 Proteína PAT 227.29±11.30 0±0
[000236] Exemplo 6: Detecção da resistência do evento contra insetos
[000237] 6.1 Bioensaio da planta de soja DBN8002 na China
[000238] Dois tipos de plantas, o evento transgênico de soja DBN8002 e a planta de soja de tipo selvagem (não transgênica, NGM), foram testados usando Helicoverpa armigera (CBW), Spodoptera litura (TCW), Spodoptera exigua (BAW) e Clanis bilineata (BHM) através dos seguintes bioensaios:
[000239] As segundas folhas superiores no estágio V3 de dois tipos de plantas, o evento transgênico de soja DBN8002 e a planta de soja de tipo selvagem (não transgênica, NGM), foram preparadas respectivamente. Eles foram enxaguados com água esterilizada e aspirados à secura com uma gaze. Em seguida, com a retirada das nervuras, as folhas da soja foram cortadas em formatos de cerca de 2,5 cm × 3 cm. 1 a 3 pedaços da folha (o número da folha foi determinado com base no consumo de folhas do inseto) foram colocados em papel de filtro umedecido com água destilada no fundo de placas de Petri de plástico redondas. 10 larvas recém-eclodidas por alimentação artificial foram colocadas em cada prato. Em seguida, as placas de Petri foram cobertas com tampas e mantidas por 3 dias nas condições de temperatura de 26-28 ° C, umidade relativa de 70% -80% e fotoperíodo (claro / escuro) de 16: 8 antes da obtenção. um resultado estatístico. Três indicadores, taxa de desenvolvimento de larvas, mortalidade dos insetos testados e taxa de danos à folha, foram analisados estatisticamente para obter uma pontuação total do traço resistente (pontuação total: 300 pontos). A pontuação total da característica resistente = 100 × mortalidade + [100 × mortalidade + 90 × (número de inseto recém-eclodido / total de larvas inoculadas) + 60 × (número de insetos recém-eclodidos para controle negativo / total de insetos inoculados) larvas) + 10 × (número de insetos para controle negativo / total de larvas inoculadas)] + 100 × (razão de danos nas folhas 1), em que o total de larvas inoculadas se refere ao número total de larvas inoculadas, ou seja, 10 larvas em cada prato; a taxa de desenvolvimento larval foi refletida pela fórmula do escore total do traço resistente; e a taxa de dano foliar refere-se à proporção da área de alimentação de insetos na área total da folha. Para cada inseto, cinco plantas do evento transgênico de soja DBN8002 e a planta de soja de tipo selvagem (não transgênica, NGM) foram testadas, 6 replicatas por planta. Os resultados foram mostrados nas Tabelas 7-8 e Figuras 3-6, respectivamente.
[000240] Tabela 7: O resultado do bioensaio de resistência a insetos do evento transgênico de soja DBN8002 na China - Mortalidade (%).
Inseto/planta DBN8002 NGM CBW 60±12 7±3 TCW 99±1 3±4 BAW 98±1 4±3 BHM 85±6 7±3
[000241] Tabela 8: O resultado do bioensaio da resistência a insetos do evento transgênico de soja DBN8002- Pontuação total do traço resistente (pontos) Insetos/plantas DBN8002 NGM CBW 198±22 35±12 TCW 289±3 42±20 BAW 286±10 55±17 BHM 284±7 34±15
[000242] Os resultados mostram que o evento transgênico de soja DBN8002 exibe mortalidade significativamente maior de insetos testados e pontuação total de traço resistente do que o NGM, indicando que o evento transgênico de soja DBN8002 tem boa resistência contra Helicoverpa armigera, Spodoptera litura, Spodoptera exigua e Clanis bilineata.
[000243] 6.2 Teste de campo do evento transgênico de soja DBN8002 na China
[000244] O evento transgênico de soja DBN8002 e a planta de soja de tipo selvagem (não transgênica, NGM) foram plantados em um campo. Foi empregado o desenho de blocos randomizados com 3 replicatas. A zona possuía uma área de 30 m2 (5 m × 6 m), espaçamento entre fileiras de 60 cm e espaçamento entre plantas de 10 cm. As plantas foram cultivadas e manejadas de maneira convencional, evitando-se a pulverização de inseticidas durante todo o período de propagação.
[000245] (1) Helicoverpa armigera
[000246] A soja foi apenas sujeita a infestação natural na área com ocorrência natural grave de Helicoverpa armigera (as condições para ocorrência de dano natural por inseto: o dano mais severo ocorre de junho a julho e a temperatura ótima para o crescimento da praga varia de 20 a 30 ° C). Quando as plantas de soja atingiram o estágio V3 (trifoliata), elas foram rastreadas para investigar as folhas de NGM alimentadas por larvas de Helicoverpa armi-gera. Quando a segunda e terceira folhas superiores do NGM não foram consumidas, a taxa de área de dano (a taxa de área de dano = a soma da área de dano foliar em cada planta / a área total de folhas da planta × 100%) de Helicoverpa armigera nas plantas de soja foram investigadas uma a uma. O resultado da resistência do evento transgênico de soja DBN8002 contra Heli-coverpa armigera é mostrado na Tabela 9.
[000247] Tabela 9: Resultado da resistência do evento transgênico de soja DBN8002 contra Helicoverpa armigera em condições de infestação natural Programa/planta DBN8002 NGM Taxa de área de dano 5±3 24±7 (%)
[000248] Os resultados mostram que nas condições de ocorrência natural de Helicoverpa armigera, em comparação com o NGM, o evento transgênico de soja DBN8002 exibe uma taxa de área de dano significativamente reduzida de Helicoverpa armigera, indicando assim que o evento transgênico de soja DBN8002 tem uma boa resistência contra Helicoverpa armigera. O efeito de campo do evento transgênico de soja DBN8002 sob as condições de ocorrência natural de Helicoverpa armigera é mostrado na figura 7.
[000249] (2) Spodoptera exigua
[000250] A soja foi submetida apenas a infestação natural na área com ocorrência natural grave de Spodoptera exigua (as condições para ocorrência de dano natural por inseto: o dano mais severo ocorre de junho a julho e a temperatura ótima para o crescimento da praga varia de 20 a 30 ° C). Quando as plantas de soja atingiram o estágio V3, elas foram rastreadas para investigar as folhas de NGM alimentadas por larvas de Spodoptera exigua. Quando a segunda e terceira folhas superiores do NGM não foram consumidas, a taxa de área de dano (a taxa de área de dano = a soma da área de dano foliar em cada planta / a área total da folha da planta × 100%) de Spodoptera exigua nas plantas de soja foram investigadas uma a uma. O resultado da resistência do evento transgênico de soja DBN8002 contra Spodoptera exigua é mostrado na Tabela
10.
[000251] Tabela 10: Resultado da resistência da soja transgênica evento DBN8002 contra Spodoptera exigua em condições de infestação natural.
Programa/planta DBN8002 NGM Taxa de área de dano 2±1 22±4 (%)
[000252] Os resultados mostram que nas condições de ocorrência natural de Spodoptera exigua, em comparação com o NGM, o evento transgênico de soja DBN8002 exibe taxa de área de dano significativamente reduzida de Spodoptera exigua, indicando assim que o evento transgênico de soja DBN8002 tem boa resistência contra Spodoptera exigua. O efeito de campo do evento transgênico de soja DBN8002 nas condições de ocorrência natural de Spodoptera exigua é mostrado na Fig. 8.
[000253] (3) Spodoptera litura
[000254] A inoculação artificial foi realizada duas vezes no estágio V3 de plantas de soja. Foram selecionadas 100 plantas nas proximidades da região central de cada zona e submetidas à inoculação artificial. A segunda folha superior de cada planta de soja foi inoculada com cerca de 10 larvas recém- eclodidas por meio de alimentação artificial. 3 dias após a inoculação, uma segunda inoculação foi realizada com a mesma densidade de larvas da primeira inoculação. 5-21 dias após a inoculação, as áreas das folhas alimentadas pelas larvas da planta foram investigadas uma a uma. A investigação foi geralmente realizada 14 dias após a inoculação. Se a taxa de área de dano (a taxa de área de dano = a soma da área de dano foliar em cada planta / a área total da folha da planta × 100%) das folhas no NGM atingiu 15%, ela foi considerada válida. Se a taxa de área danificada não alcançasse 15%, a investigação poderia ser atrasada adequadamente; entretanto, se a taxa de área danificada ainda não atingisse 15% após 21 dias, esta inoculação foi considerada inválida. Foi calculado o valor médio da taxa de área danificada de Spodoptera litura em folhas de soja durante o estágio V3 de plantas de soja em cada zona. O resultado da resistência do evento transgênico de soja DBN8002 contra Spodoptera litura é mostrado na Tabela 11.
[000255] Tabela 11: Resultado da resistência do evento transgênico de soja DBN8002 contra Spodoptera litura na condição de inoculação artificial.
Programa/planta DBN8002 NGM Taxa de área de dano 3±2 26±5 (%)
[000256] Os resultados mostram que sob a condição de inoculação artificial, o evento transgênico de soja DBN8002 exibe taxa de área de dano significativamente menor do que o NGM, indicando assim que o evento transgênico de soja DBN8002 tem boa resistência contra Spodoptera litura. O efeito de campo do evento transgênico de soja DBN8002 inoculado com Spodoptera litura é mostrado na figura 9.
[000257] 6.3 Bioensaio da planta de soja DBN8002 na Argentina
[000258] Dois tipos de plantas, o evento transgênico de soja DBN8002 e a planta de soja de tipo selvagem (não transgênica, NGM), foram testados usando Chrysodeixis includens (SBL), Rachiplusia nu, (SFL), Spodoptera frugiperda (FAW) e Spodoptera cosmioides (BLAW) através dos seguintes bioensaios:
[000259] As segundas folhas superiores no estágio V3 de dois tipos de plantas, o evento transgênico de soja DBN8002 e a planta de soja de tipo selvagem (não transgênica, NGM), foram preparadas respectivamente. Elas foram enxaguadas com água esterilizada e aspiradas à secura com uma gaze. Em seguida, com a retirada das nervuras, as folhas da soja foram cortadas em formas circulares com diâmetro de cerca de 1 cm. 1 a 3 pedaços (o número da folha foi determinado com base no consumo de folhas do inseto) da folha circular foram colocados em papel de filtro umedecido com água destilada nos poços das placas de bioensaio (como mostrado na figura 10). Uma larva recém- eclodida foi colocada em cada poço. Em seguida, as placas foram cobertas com tampas e mantidas por 5 dias sob as condições de temperatura de 26-28 ° C, umidade relativa de 70% -80% e fotoperíodo (claro / escuro) de 16: 8 antes de obter um resultado estatístico. A mortalidade dos insetos testados e a taxa de dano foliar (a taxa de dano foliar refere-se à proporção da área foliar alimentada por insetos na área total da folha) foram analisadas estatisticamente. Para cada inseto, foram testadas 6 plantas com vigor de crescimento equivalente do evento transgênico de soja DBN8002 e planta de soja de tipo selvagem (não transgênica, NGM), com 32 poços de bioensaio por planta. Os resultados são apresentados na Tabela 12 e Figura 10 (Spodoptera frugiperda).
[000260] Tabela 12: Os resultados do bioensaio do evento transgênico de soja DBN8002 na Argentina.
Razão de dano à folha Inseto Planta Mortalidade (%) (%) DBN8002 84.8±4.3 0.3±0.0
SBL NGM 10.6±3.2 2.7±0.8 DBN8002 77.6±7.6 0.9±0.2
SFL NGM 8.9±3.1 8.0±1.2 DBN8002 97.4±2.7 0.1±0.0
FAW NGM 2.1±0.5 10.3±3.2 DBN8002 86.5±4.3 0.3±0.0
BLAW NGM 10.1±5.2 9.6±2.8
[000261] Os resultados mostram que o evento transgênico de soja DBN8002 exibe mortalidade significativamente maior de insetos testados das espécies de inseto acima mencionadas do que o NGM, indicando que o evento transgênico de soja DBN8002 tem boa resistência contra Chrysodeixis includens (SBL), Rachiplusia nu (SFL), Spodoptera frugiperda (FAW) e Spodoptera cosmioides
(BLAW) (pragas típicas encontradas em soja na América do Sul).
[000262] 6.4 Teste de campo do evento transgênico de soja DBN8002 na Argentina
[000263] Dois tipos de plantas, o evento transgênico de soja DBN8002 e a planta de soja de tipo selvagem (não transgênica, NGM), foram plantados em um campo; e bioensaios in vivo em campo foram realizados usando Chrysodeixis includens (SBL), Rachiplusia nu (SFL), Anticarsia gemmatalis (VBC) e Spodoptera frugiperda (FAW) de acordo com o seguinte método.
[000264] Grandes gaiolas de bioensaio (tipo malha de tela) foram preparadas em um campo. Cada gaiola de bioensaio foi usada para testar apenas um inseto. As gaiolas de bioensaio individuais não estavam dispostas em comunicação e foram separadas fisicamente por milho plantado artificialmente e ervas daninhas que crescem naturalmente no campo. O evento transgênico de soja DBN8002 e a planta de soja de tipo selvagem (não transgênica, NGM) foram plantados aleatoriamente em cada gaiola de bioensaio individual, com 3 réplicas por tipo de planta e cada réplica plantada em uma linha (comprimento da linha: 3 m, 30 plantas por linha, espaçamento entre linhas: 50 cm). As plantas foram cultivadas e manejadas de maneira convencional, evitando-se a pulverização de inseticidas durante todo o período de propagação. Quando as plantas cresceram em torno do estágio V5 (pentafoliata), uma quantidade adequada de insetos adultos das espécies acima mencionadas foi liberada na gaiola. Após 10 dias, a taxa de dano foliar (que se refere à proporção da área foliar alimentada por insetos na área total da folha) foi investigada. Os resultados são mostrados na Tabela 13.
[000265] Tabeola 13: Os resultados da resistência da soja transgênica evento DBN8002 contra pragas sob condição de inoculação artificial na Argentina.
Inseto Planta Razão de dano à folha (%) DBN8002 2.0±0.2
SBL NGM 10.2±2.1 DBN8002 5.3±2.5
SFL NGM 35.4±7.9 VBC DBN8002 0.3±0.0
NGM 11.7±2.3 DBN8002 0.1±0.0
FAW NGM 9.5±3.1
[000266] Os resultados mostram que, sob a condição de inoculação artificial, o evento transgênico de soja DBN8002 exibe menor taxa de dano foliar do que NGM, indicando que o evento transgênico de soja DBN8002 tem boa resistência contra Chrysodeixis includens (SBL), Rachiplusia nu (SFL), Anticarsia gemmatalis (VBC) e Spodoptera frugiperda (FAW) (pragas típicas da soja na América do Sul).
[000267] Exemplo 7: Detecção de tolerância ao herbicida do evento
[000268] O herbicida Basta (em que o princípio ativo é uma solução aquosa de glufosinato a 18%) foi selecionado para aplicação por pulverização no experimento. A configuração em blocos randomizados com três replicatas foi utilizada. A zona possuía área de 15 m2 (5 m x 3 m), espaçamento entre fileiras de 60 cm e espaçamento entre plantas de 25 cm. As plantas eram cultivadas e manejadas de maneira convencional, com intervalo de um metro entre as zonas. O evento transgênico de soja DBN8002 foi submetido aos seguintes dois tratamentos: (1) nenhuma aplicação de pulverização, mas pulverizando um volume igual de água limpa ao pulverizar o herbicida durante o tratamento (2); e (2) aplicação por pulverização do herbicida Basta no estágio de folha V2-V3 (bi ou trifoliata) a uma dose de 800 g a.i./ha (a.i./ha significa “princípio ativo por hectare”). Deve-se notar que o herbicida glufosinato (como Basta) é um herbicida do tipo de contato; se o herbicida for manipulado inadequadamente no campo, por exemplo, acumulando muita solução de herbicida localmente, o sintoma de fitotoxicidade poderá ocorrer; isso não significa que o evento transgênico de soja DBN8002 tenha tolerância diminuída; e herbicidas de glufosinato de várias concentrações e formulações também são aplicáveis à seguinte conclusão se eles forem convertidos na quantidade equivalente acima do princípio ativo glufosinato.
[000269] A investigação dos sintomas de fitotoxicidade foi realizada respectivamente 1 semana e 2 semanas após a aplicação, e os rendimentos dos distritos foram determinados no momento da colheita. A graduação dos sintomas de fitotoxicidade é mostrada na Tabela 14. A tolerância ao herbicida do evento de transformação foi avaliada usando a taxa de dano pelo herbicida como um indicador. Em particular, a taxa de dano pelo herbicida (%) = Σ (número de plantas do mesmo nível de dano × número do nível) / (número total de plantas × nível mais alto), em que a taxa de dano pelo herbicida se refere à taxa de dano do glufosinato , que foi determinada de acordo com o resultado da investigação de fitotoxicidade duas semanas após o tratamento com glufosinato; e o nível de tolerância da soja ao herbicida foi avaliado com base na taxa de dano pelo herbicida (glufosinato). O rendimento de soja de cada zona foi obtido pesando o rendimento total (em peso) de grãos de soja de 3 linhagens no meio de cada zona. A diferença de rendimento entre os diferentes tratamentos foi medida como porcentagem de rendimento. A porcentagem de rendimento (%) = rendimento com aplicação por pulverização / rendimento sem aplicação por pulverização. Os resultados da tolerância ao herbicida do evento transgênico de soja DBN8002 e o rendimento da soja são mostrados na Tabela 15.
[000270] Tabela 14: Padrão de classificação do grau de fitotoxicidade do herbicida glufosinato em soja.
Nível de Descrição de sintomas fitotoxicidade 1 Crescendo regularmente sem qualquer sintoma de dano 2 Ligeira fitotoxicidade de menos de 10% Fitotoxicidade moderada, que pode ser recuperada posteriormente 3 sem afetar o rendimento Fitotoxicidade grave, que é difícil de recuperar e resulta em 4 rendimento reduzido Fitotoxicidade grave, que não pode ser recuperada e resulta em 5 rendimento significativamente reduzido ou nenhum rendimento
[000271] Tabela 15: Resultados da tolerância ao herbicida glufosinato do evento transgênico de soja DBN8002 e o rendimento da soja Programa / planta DBN8002 Taxa de danos por% de glufosinato (controle) 0±0 Taxa de danos por% de glufosinato (800 g i.a./ha) 0±0 porcentagem de rendimento% (800 g i.a./ha) 99.1±0.3
[000272] Os resultados mostram que, em termos de taxa de dano pelo herbicida glufosinato: a taxa de dano do evento transgênico de soja DBN8002 tratado com herbicida glufosinato (800 g ia / ha) é 0. Portanto, o evento transgênico de soja DBN8002 tem boa tolerância ao herbicida glufosinato.
[000273] Em relação ao rendimento, não há diferença significativa nos rendimentos do evento transgênico de soja DBN8002 entre o tratamento sem aplicação por pulverização e o tratamento com aplicação por pulverização de 800 g i.a./ha de glufosinato. Portanto, isso mostra ainda que o evento transgênico de soja DBN8002 tem boa tolerância ao herbicida glufosinato e o rendimento não está comprometido.
[000274] Exemplo 8
[000275] Produtos agrícolas ou commodities podem ser produzidos a partir do evento transgênico de soja DBN8002. Se for detectada expressão suficiente nos produtos agrícolas ou commodities, espera-se que eles contenham as sequências de nucleotídeos que podem ser diagnósticas para a presença de materiais do evento transgênico de soja DBN8002 nos produtos agrícolas ou commodities. Os produtos agrícolas ou commodities incluem, mas não estão limitados a, farelos, pós e óleos de soja, especificamente lecitina, ácidos graxos, glicerol, esteróis, óleos comestíveis, flocos de soja desengordurada, farinhas de soja desengordurada e cozida, coágulos de leite de soja, tofu, concentrados de proteína de soja, proteínas de soja isoladas, proteínas vegetais hidrolisadas, proteínas de soja organizadas, fibras de proteína de soja e quaisquer outros alimentos destinados ao consumo como fonte de alimento por um animal, etc. Métodos e/ou kits de detecção de ácido nucleico baseados em pares de sondas ou iniciadores podem ser desenvolvidos para detectar as sequências de nucleotídeos derivadas do evento transgênico de soja DBN8002 em uma amostra biológica, tal como aqueles mostrados em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, em que a sequência de sonda ou sequência de iniciador é selecionado a partir das sequências como mostrado na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5 ou porções das mesmas, de modo a diagnosticar a presença do evento transgênico de soja DBN8002.
[000276] Em conclusão, o evento transgênico de soja DBN8002 da presente invenção tem boa resistência contra insetos lepidópteros e alta tolerância ao herbicida glufosinato sem comprometer o rendimento, e os métodos de detecção da presente invenção podem identificar com precisão e rapidamente se uma amostra biológica contém Moléculas de DNA do evento transgênico de soja DBN8002.
[000277] As sementes correspondentes ao evento transgênico de soja DBN8002 foram depositadas sob o Tratado de Budapeste no Comitê de Gerenciamento de Coleção de Culturas Microbiológicas do Centro Geral Microbiológico da China (forma abreviada: CGMCC, Endereço: No.3, No.1 Delegacia, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing, Institute of Microbiology, Academy of Sciences da China, CEP 100101) em 19 de fevereiro de 2019, cuja classificação e nomenclatura são soja (Glycine max), a posição do depósito é viável, e o número de acesso é CGMCC No. 17299. O depósito de microorganismos será depositado junto à Autoridade de Depósito Internacional por 30 anos.
[000278] Por último, deve ser notado que os Exemplos acima são usados apenas para ilustrar as soluções técnicas da presente invenção ao invés de limitar a presente invenção. Embora a presente invenção seja descrita em detalhes com referência aos Exemplos preferidos, aqueles versados na técnica devem entender que as soluções técnicas da presente invenção podem ser modificadas ou substituídas de forma equivalente, sem se afastar do espírito e escopo das soluções técnicas da presente invenção.

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES
1. Sequência de ácido nucleico, caracterizada por compreender pelo menos 11 nucleotídeos consecutivos nas posições 1-642 da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência complementar da mesma, e pelo menos 11 nucleotídeos consecutivos nas posições 643-1524 da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência complementar da mesma; e / ou pelo menos 11 nucleotídeos consecutivos nas posições 1-347 da SEQ ID NO: 4 ou uma sequência complementar da mesma, e pelo menos 11 nucleotídeos consecutivos nas posições 348-656 da SEQ ID NO: 4 ou uma sequência complementar da mesma; preferivelmente, a sequência de ácido nucleico compreende 22-25 nucleotídeos consecutivos nas posições 1-642 da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência complementar da mesma, e 22-25 nucleotídeos consecutivos nas posições 643-1524 da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência complementar da mesma; e / ou 22-25 nucleotídeos consecutivos nas posições 1-347 da SEQ ID NO: 4 ou uma sequência complementar da mesma, e 22-25 nucleotídeos consecutivos nas posições 348-656 da SEQ ID NO: 4 ou uma sequência complementar da mesma; preferivelmente, a sequência de ácido nucleico compreende SEQ ID NO: 1 ou uma sequência complementar da mesma, e / ou SEQ ID NO: 2 ou uma sequência complementar da mesma; preferivelmente, a sequência de ácido nucleico compreende SEQ ID NO: 3 ou uma sequência complementar da mesma, e / ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência complementar da mesma.
2. Sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a sequência de ácido nucleico compreender a SEQ ID NO: 5 ou uma sequência complementar da mesma.
3. Método para detectar a presença do DNA correspondente ao evento transgênico de soja DBN8002 em uma amostra, caracterizado por ele compreender: - colocação em contato de uma amostra a ser detectada com pelo menos dois iniciadores para amplificar um produto de amplificação alvo em uma reação de amplificação de ácido nucleico; - realização da reação de amplificação do ácido nucleico; e
- detecção da presença do produto de amplificação alvo; em que o produto de amplificação alvo compreende a sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou 2; preferivelmente, o produto de amplificação alvo compreende SEQ ID NO: 1 ou uma sequência complementar da mesma, SEQ ID NO: 2 ou uma sequência complementar dda mesma, SEQ ID NO: 6 ou uma sequência complementar da mesma, e / ou SEQ ID NO: 7 ou um sequência complementar da mesma.
4. Método para detectar a presença do DNA correspondente ao evento transgênico de soja DBN8002 em uma amostra, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por os iniciadores compreenderem um primeiro iniciador e um segundo iniciador, em que o primeiro iniciador é selecionado de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10; e o segundo iniciador é selecionado a partir de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11.
5. Método para detectar a presença do DNA correspondente ao evento transgênico de soja DBN8002 em uma amostra, caracterizado por ele compreender: - colocação em contato de uma amostra a ser detectada com uma sonda, em que a sonda compreende a sequência de ácido nucleico como definido na reivindicação 1; preferivelmente, a sonda compreende SEQ ID NO: 1 ou uma sequência complementar da mesma, SEQ ID NO: 2 ou uma sequência complementar da mesma, SEQ ID NO: 6 ou uma sequência complementar da mesma, e / ou SEQ ID NO: 7 ou um sequência complementar da mesma; - colocação da amostra a ser detectada e da sonda sob condições de hibridização rigorosas; e - detecção da hibridização da amostra a ser detectada com a sonda.
6. Método para detectar a presença do DNA correspondente ao evento transgênico de soja DBN8002 em uma amostra, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por pelo menos uma sonda é marcada com pelo menos um fluoróforo.
7. Método para detectar a presença do DNA correspondente ao evento transgênico de soja DBN8002 em uma amostra, caracterizado por ele compreender:
- colocação em contato de uma amostra a ser detectada com uma molécula de ácido nucleico marcadora, em que a molécula de ácido nucleico marcadora compreende a sequência de ácido nucleico como definido na reivindicação 1; preferivelmente, a molécula de ácido nucleico marcadora compreende pelo menos uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 ou uma sequência complementar da mesma, SEQ ID NO: 2 ou uma sequência complementar da mesma, e / ou SEQ ID NOs: 6 -11 ou sequências complementares das mesmas; - colocação da amostra a ser detectada e da molécula de ácido nucleico marcadora sob condições de hibridação rigorosas; - detecção da hibridização da amostra a ser detectada com a molécula de ácido nucleico marcadora, e ainda realização de uma análise de reprodução assistida por marcador para determinar se a resistência a insetos e / ou tolerância a herbicidas está geneticamente ligada à molécula de ácido nucleico marcadora.
8. Kit de detecção de DNA, caracterizado por ele compreender pelo menos uma molécula de DNA, em que a molécula de DNA compreende a sequência de ácido nucleico como definido na reivindicação 1, e a molécula de DNA pode atuar como um iniciador de DNA ou uma sonda específica para o evento transgênico de soja DBN8002 ou sua progênie; preferivelmente, a molécula de DNA compreende SEQ ID NO: 1 ou uma sequência complementar da mesma, SEQ ID NO: 2 ou uma sequência complementar da mesma, SEQ ID NO: 6 ou uma sequência complementar da mesma, e / ou SEQ ID NO: 7 ou uma sequência complementar da mesma.
9. Método para proteger uma planta de soja contra a invasão de insetos, caracterizado por ele compreender o fornecimento de pelo menos uma célula de planta de soja transgênica na dieta do inseto alvo, em que a célula de planta de soja transgênica compreende em seu genoma a sequência conforme estabelecido em SEQ ID NO: 1 e / ou SEQ ID NO: 2; e a ingestão da célula da planta de soja transgênica inibe o inseto alvo de se alimentar mais da planta de soja transgênica; preferivelmente, a célula da planta de soja transgênica compreende em seu genoma a sequência apresentada em SEQ ID NO: 3 e / ou SEQ ID NO: 4;
preferivelmente, a célula de planta de soja transgênica compreende sucessivamente em seu genoma SEQ ID NO: 1, a sequência de ácido nucleico nas posições 1032-6444 de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 2, ou compreende a sequência conforme estabelecido em SEQ ID NÚMERO 5.
10. Método para proteger uma planta de soja contra danos causados por um herbicida ou controlar ervas daninhas em um campo no qual uma planta de soja é plantada, caracterizado por ele compreender a aplicação de uma quantidade eficaz de herbicida glufosinato no campo em que pelo menos uma planta de soja transgênica é plantada, em que a planta de soja transgênica compreende em seu genoma a sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1 e / ou SEQ ID NO: 2, e a planta de soja transgênica tem tolerância ao herbicida glufosinato; preferivelmente , a planta de soja transgênica compreende em seu genoma a sequência apresentada em SEQ ID NO: 3 e / ou SEQ ID NO: 4. preferivelmente, a planta de soja transgênica compreende sucessivamente em seu genoma SEQ ID NO: 1, a sequência de ácido nucleico nas posições 1032-6444 de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 2, ou compreende a sequência conforme estabelecido em SEQ ID NO : 5.
11. Método para criar uma planta de soja resistente a insetos e / ou tolerante a herbicida glufosinato, caracterizado por ele compreende: - plantio de pelo menos uma semente de soja, em que a semente de soja compreende em seu genoma uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína Vip3Aa resistente a insetos e / ou uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína PAT tolerante a herbicida glufosinato e uma sequência de ácido nucleico de um região específica, ou a semente de soja compreende em seu genoma a sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na SEQ ID NO: 5; - crescimento da semente de soja em uma planta de soja; e - invasão da planta de soja com um inseto alvo e / ou pulverização da planta de soja com uma quantidade eficaz de herbicida glufosinato e, em seguida, colheita da planta com danos à planta reduzidos em comparação com outras plantas que não compreendem a sequência de ácido nucleico da região específica;
em que a sequência de ácido nucleico da região específica é a sequência apresentada em SEQ ID NO: 1 e / ou SEQ ID NO: 2; preferivelmente, a sequência de ácido nucleico da região específica é a sequência apresentada em SEQ ID NO: 3 e / ou SEQ ID NO: 4.
12. Método para produzir uma planta de soja resistente a insetos e / ou tolerante a herbicida glufosinato, caracterizado por ele compreende: - introdução de uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína Vip3Aa resistente a insetos e / ou uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína PAT tolerante a herbicida glufosinato e uma sequência de ácido nucleico de uma região específica no genoma de uma primeira planta de soja, ou a sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na SEQ ID NO: 5 no genoma da primeira planta de soja, em uma segunda planta de soja, produzindo assim uma pluralidade de plantas descendentes; e - seleção das plantas descendentes que compreendem a sequência de ácido nucleico da região específica, que também são resistentes a insetos e / ou tolerantes a herbicida glufosinato; em que a sequência de ácido nucleico da região específica é a sequência apresentada em SEQ ID NO: 1 e / ou SEQ ID NO: 2; preferivelmente, a sequência de ácido nucleico da região específica é a sequência apresentada em SEQ ID NO: 3 e / ou SEQ ID NO: 4; preferivelmente, o método compreende - cruzamento sexual do evento transgênico de soja DBN8002, com uma planta de soja que carece de resistência a insetos e / ou tolerância ao glufosinato, produzindo assim uma pluralidade de plantas descendentes; - seleção das plantas descendentes que compreendem a sequência de ácido nucleico da região específica; - invasão das plantas descendentes com um inseto alvo e / ou tratamento das plantas descendentes com glufosinato; e - seleção das plantas descendentes que são resistentes a insetos e / ou tolerantes a herbicida glufosinato.
13. Produto agrícola ou commodity derivado do evento transgênico de soja DBN8002, caracterizado por o produto agrícola ou commodity ser lecitina, ácidos graxos, glicerol, esteróis, flocos de soja, farinhas de soja, proteínas de soja ou seus concentrados, óleos de soja, fibras de proteína de soja, coágulos de leite de soja ou tofu.
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