ES2750530T3 - Medios y procedimientos para producir rendimiento en plantas - Google Patents

Abstract

Un constructo de gen quimérico que comprende los elementos de ADN unidos operativamente siguientes: a) la región promotora de un gen GA2-oxidasa vegetal que es activa en la zona de crecimiento de la hoja de una planta monocotiledónea, b) una región de ADN que codifica una proteína CYP78A5 vegetal o un ortólogo funcional con una identidad de aminoácidos de al menos el 55% con respecto a la proteína codificada por la SEQ ID NO: 2 y c) una región del extremo 3' que comprende señales de terminación de la transcripción y de poliadenilación que opera en células de una planta monocotiledónea.

Description

DESCRIPCIÓN

Medios y procedimientos para producir rendimiento en plantas

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular de las plantas, más particularmente al campo de la agricultura, incluso más particularmente al campo de mejora del rendimiento de las plantas. La presente invención proporciona genes y constructos quiméricos que pueden utilizarse para mejorar el rendimiento en plantas y cultivos. Introducción a la invención

Desde el comienzo de la agricultura y la horticultura ha existido la necesidad de mejorar los rasgos de las plantas de cultivo. Las estrategias de cultivo potencian las propiedades de los cultivos para que resistan estreses bióticos y abióticos, para mejorar la eficacia del uso de nutrientes y para alterar otros parámetros intrínsecos específicos del cultivo, es decir, producir un aumento del rendimiento mediante la aplicación de avances técnicos. En los próximos decenios, un desafío crucial para la humanidad será satisfacer las futuras demandas de alimentos sin socavar aún más la integridad de los sistemas ambientales de la Tierra. Los sistemas agrícolas son ya los principales factores de degradación ambiental global, pero se espera que el crecimiento de la población y el aumento del consumo de dietas intensivas en calorías y carne dupliquen aproximadamente la demanda de alimentos para el año 2050. Respondiendo a estas presiones, existe un enfoque creciente sobre una "intensificación sostenible" como medio para aumentar los rendimientos en entornos de bajo rendimiento y al mismo tiempo reducir el impacto ambiental de los sistemas agrícolas. Los medios convencionales para mejorar los cultivos y la horticultura en la actualidad utilizan técnicas de mejora selectiva para identificar plantas con características deseables. Los avances en biología molecular han permitido modificar el germoplasma de plantas de una forma específica. Por ejemplo, la modificación de un único gen dio como resultado en varios casos un aumento significativo en el rendimiento o en los rasgos relacionados con el rendimiento.

Las monooxigenasas del citocromo P450 son una superfamilia de enzimas dependientes de hemo que participan en la biosíntesis y la desintoxicación de una amplia diversidad de moléculas. Una serie de reacciones mediadas por el citocromo P450 dan lugar a productos necesarios para el control de la expansión celular en las plantas. El gen CYP78A5 es una monooxigenasa del citocromo P450 (Zondlo SC e Irish ^v F (1999) The Plant Journal 19 (3), 259­ 268) que se expresa intensamente en las regiones periféricas de los meristemos apicales de los brotes vegetativos y reproductivos. La sobreexpresión de CYP78A5 afecta a múltiples tipos de células, causando torsiones y retorcimientos del tallo y defectos en el desarrollo floral. Además, la sobreexpresión constitutiva de CYP78A5 conduce a hojas más pequeñas en plantas transformadas. En la presente invención, sorprendentemente, demostramos que un constructo de gen quimérico en el que el CYP78A5 de maíz está controlado por un promotor de GA2-oxidasa del maíz conduce a un aumento del tamaño de la hoja de maíz de más del 30%. Este nuevo rasgo puede utilizarse para aumentar el rendimiento en plantas, en particular en cultivos tales como, por ejemplo, cereales. Figuras

Figura 1: Secuencia del promotor de GA2-oxidasa derivado de GRMZM2G031724; los sitios attB1 y attB2 están subrayados (SEQ ID NO: 1)

Figura 2: Secuencia del gen KLUH (GRMZM2G167986); los sitios attB1 y attB2 unidos están subrayados (SEQ ID NO: 2).

Figura 3: Estructura del vector pBb42GW7

Figura 4 : Estructura del clon de expresión que contiene el promotor de GA2-oxidasa y el gen KLUH.

Figura 5: Secuencia del gen quimérico resultante "promotor de GA2-oxidasa (GRMZM2G031724) unido operativamente al gen KLUH (GRMZM2G167986)" que se incorporó en el vector de expresión de la planta (SEQ ID NO: 3).

Figura 6: Tasa de alargamiento de la hoja en 140_04. R representa plantas transgénicas (resistentes), S representa plantas no transgénicas (sensibles).

Figura 7: Tasa de alargamiento de la hoja en 140_05. R representa plantas transgénicas (resistentes), S representa plantas no transgénicas (sensibles).

Figura 8: Resultados comparativos de la expresión de KLUH de la hoja 4 de 140_01. R representa plantas transgénicas, S representa plantas no transgénicas.

Figura 9: Resultados comparativos de la expresión de KLUH de la hoja 4 de 139_01. R representa plantas transgénicas, S representa plantas no transgénicas.

Figura 10: Cronología del tamaño de la zona de división en GA2ox::KLUH. El gráfico de barras muestra cómo ha cambiado el tamaño de la zona de división durante el crecimiento de la hoja 4. El gráfico lineal muestra la tasa de alargamiento de la hoja 4 en los mismos puntos temporales. S indica tipo silvestre (barras de la izquierda); R indica plantas resistentes de GA2ox::KLUH transgénico (barras de la derecha). Los asteriscos indican p < 0,01

Figura 11: Fenotipos del cruce GA2OX::KLUH x UBIL::GA20Ox y sus respectivos progenitores. A. plántulas de 30 días después de la siembra. Las flechas indican la hoja 4; B. plantas completamente desarrolladas a los 115 días; C. tasa de crecimiento o LER (eje Y: mm/h y eje X: días de crecimiento de la hoja 4).

Figura 12: Crecimiento de las plantas de maíz transgénico que albergan el gen quimérico GA2ox::KLUH sometidas a estrés por sequía leve. W indica plantas en condiciones de buena irrigación; D indica plantas sometidas a estrés por sequía leve. R y S se refieren a plantas resistentes y sensibles.

Descripción detallada de la invención

La hoja de maíz en crecimiento proporciona un excelente sistema modelo para estudiar el papel de la división celular y la expansión celular en el control del tamaño de los órganos, dado que estos dos procesos tienen lugar de forma espacialmente separada dentro de la zona de crecimiento. En una plántula de maíz, la cuarta hoja crece a un ritmo máximo justo después de su emergencia a partir de la vaina de hojas más viejas que la rodean. Su zona de crecimiento se ubica en la base de la hoja, lo que significa que la hoja debe diseccionarse de la vaina para acceder a la zona de crecimiento. De esta forma, se pueden tomar muestras de la zona de crecimiento de la cuarta hoja fácilmente con una alta resolución espacial debido al tamaño relativamente grande de la hoja de maíz en crecimiento.

En la presente invención, hemos demostrado que numerosos transcritos muestran una expresión diferencial dentro de las diferentes muestras que constituyen una zona, lo que indica las distinciones dentro de la zona de crecimiento. De forma similar, las hormonas reguladoras del crecimiento auxinas y citoquininas son más numerosas en la parte basal de la zona de división en comparación con la parte más distal (Nelissen et al., 2012, Curr. Biol). El estudio del transcriptoma de alta resolución que se realizó nos permitió identificar genes con perfiles de expresión muy distintos a lo largo de la zona de crecimiento. En la presente invención construimos un gen quimérico que comprende el promotor de un gen GA2-oxidasa vegetal acoplado operativamente a la secuencia de nucleótidos del gen KLUH. En nuestra forma de realización ejemplificada demostramos que este gen quimérico, cuando se expresa en una planta, conduce a un aumento del tamaño de la hoja del 30%. Sin limitar la invención a un mecanismo particular, una forma en que creemos que este gen quimérico ejerce su acción beneficiosa, cuando se expresa en una planta, es que la expresión del gen KLUH o un homólogo funcional con al menos un 55% de identidad de aminoácidos se prolonga durante la zona de crecimiento (es decir, la expresión del gen KLUH se mantiene activa durante más tiempo que la expresión del gen KLUH bajo el control de su propio promotor en células en división). Además, según nuestra hipótesis no limitante, se cree que la expresión ampliada (o prolongada) de KLUH dentro de la zona de crecimiento (en comparación con la expresión del gen KLUH bajo el control de su propio promotor) da como resultado la estimulación de divisiones adicionales y en consecuencia un mayor rendimiento del cultivo.

En consecuencia, en una primera forma de realización, la invención proporciona un constructo de gen quimérico que comprende los elementos de ADN unidos operativamente siguientes: a) la región promotora de un gen GA2-oxidasa vegetal que es activa en la zona de crecimiento de la hoja de una planta monocotiledónea, b) una región de ADN que codifica una proteína CYP78A5 vegetal o un ortólogo funcional con una identidad de aminoácidos de al menos el 55% con respecto a la proteína codificada por la SEQ ID NO: 2 y c) una región de extremo 3' que comprende señales de terminación de la transcripción y de poliadenilación que opera en células de una planta monocotiledónea. En un aspecto particular, la región promotora del gen GA2-oxidasa vegetal es activa en células en división. En otro aspecto particular, la región promotora de un gen GA2-oxidasa vegetal es activa en la zona de crecimiento de un órgano de la planta, tal como por ejemplo la hoja. En otra forma de realización particular más, el promotor del gen GA2-oxidasa vegetal es activo en la zona de crecimiento de la hoja monocotiledónea.

Se entiende que el promotor del gen GA2-oxidasa vegetal (por ejemplo, un órgano específico (tal como en una hoja, una mazorca, un embrión o un SAM)) es un fragmento aguas arriba del codón de inicio del gen que está constituido por aproximadamente 1000-2500 pb, preferentemente 1000-2000 pb, de forma más preferida 1000-1500 pb. La GA2-oxidasa se conoce en la técnica como la giberelina 2-oxidasa. Un ejemplo no limitante representativo de un promotor de GA2-oxidasa se representa en la figura 1. Otros ejemplos de promotores de GA2-oxidasa se representan en el ejemplo 7 de la invención.

El gen KLUH vegetal se designa en la técnica también como CYP78A5. CYP78A5 es una oxidasa del citocromo P450. En la figura 2 se representa un miembro representativo no limitante de CYP78A5 de maíz. En el ejemplo 8 de la invención se representan otros ejemplos de genes ortólogos de CYP78A5.

En la presente invención, las palabras "KLUH" o "CYP78A5" se utilizan indistintamente. Las expresiones "similar a KLUH" o "similar a CYP78A5" se utilizan para definir un ortólogo funcional de KLUH (o CYP78A5). Según la técnica (Nelson DR (2006), Methods Mol Biol, 320: 1-10), los ortólogos de KLUH (o CYP78A5) con una identidad de aminoácidos de al menos el 55% pertenecen al mismo grupo funcional de oxidasas del citocromo P450 y, en consecuencia, tienen la misma función en las plantas. Así, en una forma de realización particular, una región de ADN que codifica una proteína CYP78A5 de la planta o un ortólogo funcional con una identidad de aminoácidos de al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, puede utilizarse en la presente invención para construir el gen quimérico.

Se entiende que puede utilizarse un gen quimérico particular como un rasgo en diferentes especies de plantas monocotiledóneas y que un promotor de GA2-oxidasa específico vegetal es activo en más de una especie de plantas.

En la presente invención, el "promotor de GA2-oxidasa vegetal" comprende elementos reguladores, que median la expresión del segmento de secuencia de codificación de KLUH, o un ortólogo funcional con al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% de identidad en células vegetales. Para la expresión en plantas, la molécula de ácido nucleico debe estar unida operativamente a un promotor de GA2-oxidasa vegetal adecuado que exprese el gen KLUH o un ortólogo funcional con al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% en el punto temporal correcto y con el patrón de expresión espacial requerido en la zona de crecimiento (o la zona de división celular).

Para la identificación de promotores de GA2-oxidasa vegetal funcionalmente equivalentes (por ejemplo, en otros géneros de plantas u otras especies de plantas), se pueden analizar la fuerza del promotor y/o el patrón de expresión de un promotor de GA2-oxidasa experimental, por ejemplo, uniendo operativamente el promotor a un gen reportero y analizando el nivel y el patrón de expresión del gen reportero en la planta. Los genes reporteros bien conocidos adecuados incluyen, por ejemplo, beta-glucuronidasa; beta-galactosidasa o cualquier proteína fluorescente. La actividad del promotor se analiza midiendo la actividad enzimática de la beta-glucuronidasa o la beta-galactosidasa. Alternativamente, la fuerza del promotor también puede evaluarse cuantificando los niveles de ARNm o comparando los niveles de ARNm del ácido nucleico con niveles de ARNm de genes constitutivos tales como ARNr 18S, utilizando procedimientos conocidos en la técnica, tales como inmunotransferencia Northern con análisis densitométrico de autorradiogramas, PCR cuantitativa en tiempo real o RT-PCR (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986-994).

La expresión "unido operativamente", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un enlace funcional entre la secuencia del promotor (en este caso el promotor de GA2-oxidasa) y el gen de interés (en este caso el gen KLUH o un homólogo funcional del mismo tal como se ha definido en el presente documento anteriormente), de forma que la secuencia del promotor de GA2-oxidasa pueda iniciar la transcripción del gen KLUH (o un homólogo funcional del mismo) de interés.

Un "gen quimérico" o "constructo quimérico" es una secuencia de ácido nucleico recombinante en la que un promotor o secuencia reguladora de ácido nucleico se encuentra unida o asociada operativamente con una secuencia de ácido nucleico que codifica un ARNm, de forma que la secuencia reguladora de ácido nucleico sea capaz de regular la transcripción o la expresión de la secuencia de codificación de ácido nucleico asociada. La secuencia reguladora de ácido nucleico del gen quimérico normalmente no se encuentra unida operativamente a la secuencia de ácido nucleico asociada como se encuentra en la naturaleza.

El término "terminador" abarca una secuencia de control que es una secuencia de ADN al final de una unidad transcripcional que señala el procesamiento 3' y la poliadenilación de un transcrito primario y la terminación de la transcripción. El terminador puede derivarse del gen natural, de una diversidad de otros genes vegetales o de ADN-T. El terminador que se va a añadir puede derivarse, por ejemplo, de los genes nopalina sintasa o octopina sintasa, o alternativamente de otro gen vegetal, o de forma menos preferida de cualquier otro gen eucariota.

En otra forma de realización más, la invención proporciona un vector recombinante que comprende un constructo de gen quimérico que comprende los elementos de ADN unidos operativamente siguientes: a) la región promotora de un gen GA2-oxidasa de una planta que es activa en la zona de crecimiento de la hoja de una planta monocotiledónea, b) una región de ADN que codifica una proteína CYP78A5 vegetal o un ortólogo funcional con una identidad de aminoácidos de al menos el 55% con respecto a la proteína codificada por SEQ ID NO: 2 y c) una región del extremo 3' que comprende señales de terminación de la transcripción y de poliadenilación que opera en células de un planta monocotiledónea.

En otra forma de realización más, la invención proporciona una planta monocotiledónea, una célula vegetal monocotiledónea o una semilla de una planta monocotiledónea que comprende un constructo de gen quimérico que comprende los elementos de ADN unidos operativamente siguientes: a) la región promotora de un gen GA2-oxidasa de una planta que es activa en la zona de crecimiento de la hoja de la planta monocotiledónea, b) una región de ADN que codifica una proteína CYP78A5 vegetal o un ortólogo funcional con una identidad de aminoácidos de al menos el 55% con respecto a la proteína codificada por la SEQ ID NO: 2 y c) una región del extremo 3' que comprende señales de terminación de la transcripción y de poliadenilación que opera en células de una planta monocotiledónea o un vector recombinante que comprende un constructo de gen quimérico que comprende los elementos de ADN unidos operativamente siguientes: a) la región promotora de un gen GA2-oxidasa de una planta que es activa en la zona de crecimiento de la hoja de la planta monocotiledónea, b) una región de ADN que codifica una proteína CYP78A5 de la planta o un ortólogo funcional con una identidad de aminoácidos de al menos el 55% con respecto a la proteína codificada por la SEQ ID NO: 2 y c) una región del extremo 3' que comprende señales de terminación de la transcripción y de poliadenilación que opera en las células de una planta monocotiledónea.

En otra forma de realización más, la invención proporciona el uso de un gen quimérico o un vector recombinante según la invención para aumentar el rendimiento de plantas monocotiledóneas.

En otra forma de realización más, la invención proporciona el uso de un gen quimérico o un vector recombinante según la invención para aumentar el vigor de las plántulas de plantas monocotiledóneas.

En otra forma de realización más, la invención proporciona el uso de un gen quimérico o un vector recombinante según la invención para aumentar la tolerancia a la sequía de plantas monocotiledóneas. En una forma de realización específica, el gen quimérico o el vector recombinante que comprende el gen quimérico de la invención se utiliza para aumentar la tolerancia a la sequía de maíz.

En una forma de realización específica, los genes quiméricos o el vector recombinante que comprende los genes quiméricos se utilizan en cultivos monocotiledóneos.

En otra forma de realización específica, los cultivos son cereales.

En otra forma de realización específica, los cultivos son pastos.

En otra forma de realización más, la invención proporciona un procedimiento para producir una planta monocotiledónea con un rendimiento aumentado en comparación con una planta monocotiledónea de tipo silvestre correspondiente, procedimiento que comprende introducir o transformar un gen quimérico o un vector recombinante según la invención.

En otra forma de realización particular más, el gen quimérico de la invención se combina con otros genes quiméricos que aumentan favorablemente el rendimiento de plantas monocotiledóneas. Un ejemplo particular es la combinación del gen quimérico promotor de GA2ox-KLU y el gen quimérico promotor de UBIL-gen GA20 oxidasa en la misma planta de maíz. Un ejemplo específico de esta combinación favorable se describe en el ejemplo 5.

El término "rendimiento" tal como se utiliza en el presente documento generalmente se refiere a un producto medible de una planta monocotiledónea, en particular un cultivo. El rendimiento y el aumento del rendimiento (en comparación con una planta de partida no transformada o de tipo silvestre) se pueden medir de diversas formas, y se entiende que un experto será capaz de aplicar el significado correcto en vista de las formas de realización particulares, el cultivo particular en cuestión y el propósito específico o aplicación específica en cuestión. Las expresiones "rendimiento mejorado" o "rendimiento aumentado" se pueden utilizar indistintamente. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "rendimiento mejorado" o la expresión "rendimiento aumentado" significan cualquier mejora en el rendimiento de cualquier producto vegetal medido, tal como grano, fruta, hoja, raíz, mazorca o fibra. Según la invención, los cambios en diferentes rasgos fenotípicos pueden mejorar el rendimiento. Por ejemplo, y sin limitación, parámetros tales como el desarrollo de órganos florales, iniciación de raíces, biomasa de raíces, número de semillas, peso de semillas, índice de cosecha, formación de hojas, fototropismo, dominancia apical y desarrollo de frutos son medidas adecuadas de un rendimiento mejorado. El rendimiento aumentado incluye mayores rendimientos de frutas, mayores rendimientos de semillas, mayor producción de materia fresca y/o mayor producción de materia seca. Cualquier aumento en el rendimiento es un rendimiento mejorado según la invención. Por ejemplo, la mejora en el rendimiento puede comprender un aumento del 0,1%, 0,5%, 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o superior en cualquier parámetro medido. Por ejemplo, un aumento en el rendimiento de fanega/acre de soja o maíz derivados de un cultivo que comprende plantas que son transgénicas para los genes quiméricos de la invención, en comparación con el rendimiento de fanega/acre de soja o maíz sin transformar cultivados en las mismas condiciones es un rendimiento mejorado según la invención. El rendimiento aumentado o mejorado se puede lograr en ausencia o en presencia de condiciones de estrés. Por ejemplo, "rendimiento" mejorado o aumentado se refiere a uno o más parámetros de rendimiento seleccionados del grupo que consiste en rendimiento de biomasa, rendimiento de biomasa seca, rendimiento de biomasa seca aérea, rendimiento de biomasa seca subterránea, rendimiento de biomasa en peso fresco, rendimiento de biomasa aérea en peso fresco, rendimiento de biomasa subterránea en peso fresco; rendimiento mejorado de partes cosechables, ya sea en peso seco o en peso fresco o ambos, ya sean aéreas o subterráneas o ambas; y rendimiento mejorado del fruto del cultivo, ya sea en peso seco o en peso fresco o ambos, ya seas aéreos o subterráneos o ambos; y rendimiento mejorado de semillas, ya sea en peso seco o en peso fresco o ambos, ya sean aéreas o subterráneas o ambas. El "rendimiento de cosecha" se define en el presente documento como el número de fanegas de producto agrícola relevante (tal como grano, forraje o semilla) cosechado por acre. El rendimiento de los cultivos se ve afectado por estreses abióticos, tales como el estrés por sequía, por calor, por salinidad y por frío, y por el tamaño (biomasa) de la planta. El rendimiento de una planta puede depender de la planta/cultivo específico de interés, así como de su aplicación prevista (tal como la producción de alimentos, la producción de piensos, la producción de alimentos procesados, la producción de biocombustibles, biogás o alcohol o similares) de interés en cada caso particular. Por lo tanto, en una forma de realización, el rendimiento puede calcularse como el índice de cosecha (expresado como la relación del peso de las partes cosechables respectivas dividido por la biomasa total), el peso de las partes cosechables por unidad de área (acre, metro cuadrado o similar); y similares. El índice de cosecha es la relación entre el rendimiento de biomasa y la biomasa acumulada total en la cosecha. El índice de cosecha es relativamente estable en muchas condiciones ambientales, por lo que es posible una correlación sólida entre el tamaño de la planta y el rendimiento de grano. Las mediciones del tamaño de la planta en el desarrollo temprano, en condiciones normalizadas en una cámara de crecimiento o un invernadero, son prácticas estándar para medir las posibles ventajas de rendimiento conferidas por la presencia de un transgén. En consecuencia, el rendimiento de una planta puede aumentarse mejorando uno o más de los fenotipos o rasgos relacionados con el rendimiento. Dichos fenotipos o rasgos relacionados con el rendimiento de una planta cuya mejora da como resultado un rendimiento aumentado comprenden, sin limitación, el aumento de la capacidad de rendimiento intrínseco de una planta, una eficacia del uso de nutrientes mejorada y/o una tolerancia al estrés aumentada. Por ejemplo, rendimiento se refiere al rendimiento de biomasa, por ejemplo al rendimiento de biomasa en peso seco y/o el rendimiento de biomasa en peso fresco. El rendimiento de biomasa se refiere a las partes aéreas o subterráneas de una planta, dependiendo de las circunstancias específicas (condiciones de ensayo, cultivo específico de interés, aplicación de interés y similares). En una forma de realización, el rendimiento de biomasa se refiere a las partes aéreas y subterráneas. El rendimiento de biomasa se puede calcular como peso fresco, peso seco o sobre una base ajustada a la humedad. El rendimiento de biomasa puede calcularse sobre la base de una planta o con respecto a un área específica (por ejemplo, rendimiento de biomasa por acre/metro cuadrado/o similar). "Rendimiento" también puede referirse al rendimiento de semillas que puede medirse mediante uno o más de los parámetros siguientes: número de semillas o número de semillas llenas (por planta o por área (acre/metro cuadrado/o similar)); tasa de llenado de semillas (relación entre el número de semillas llenas y el número total de semillas); número de flores por planta; biomasa de semillas o peso total de semillas (por planta o por unidad de área (acre/metro cuadrado/o similar); peso de mil granos (PMG; extrapolado a partir del número de semillas llenas contadas y su peso total; un aumento en el PMG puede venir provocado por un aumento en el tamaño de la semilla, un aumento en el peso de la semilla, un aumento en el tamaño del embrión y/o un aumento en el endospermo). También se conocen en la técnica otros parámetros que permiten medir el rendimiento de la semilla. El rendimiento de la semilla se puede determinar sobre la base del peso seco o del peso fresco, o generalmente sobre una base ajustada a la humedad, por ejemplo, al 15,5 por ciento de humedad. Por ejemplo, la expresión "rendimiento aumentado" significa que una planta muestra una mayor tasa de crecimiento, por ejemplo, en ausencia o en presencia de estrés ambiental abiótico, en comparación con la planta de tipo silvestre correspondiente. Una tasa de crecimiento aumentada puede reflejarse entre otras cosas por, o confiere, un aumento de la producción de biomasa de la totalidad de la planta, o un aumento de la producción de biomasa de las partes aéreas de una planta, o un aumento de la producción de biomasa del partes subterráneas de una planta, o por un aumento de la producción de biomasa de partes de una planta, tales como tallos, hojas, flores, frutas y/o semillas. Un crecimiento prolongado comprende la supervivencia y/o el crecimiento continuo de la planta, en el momento en que el organismo de tipo silvestre no transformado muestra síntomas visuales de deficiencia y/o muerte. Cuando la planta de la invención es una planta de maíz, un rendimiento aumentado para las plantas de maíz significa, por ejemplo, un rendimiento aumentado de las semillas, en particular para las variedades de maíz utilizadas para piensos o para alimentación. El rendimiento aumentado de semillas de maíz se refiere a un aumento del tamaño o del peso del grano, un aumento de granos por mazorca o un aumento de mazorcas por planta. Alternativamente o adicionalmente, se puede aumentar el rendimiento de la mazorca, o se aumenta la longitud o el tamaño de la mazorca, o se mejora la relación de granos por mazorca.

Cuando la planta de la invención es una planta que pertenece a pastos, un aumento de la hoja puede significar un aumento de la biomasa de la hoja. Dicho aumento del rendimiento puede lograrse generalmente potenciando o mejorando uno o más rasgos de la planta relacionados con el rendimiento. Dichos rasgos relacionados con el rendimiento de una planta comprenden, sin limitación, el aumento de la capacidad de rendimiento intrínseco de una planta, la eficacia mejorada del uso de nutrientes y/o una tolerancia aumentada al estrés, en particular una tolerancia aumentada al estrés abiótico. La capacidad de rendimiento intrínseco de una planta puede manifestarse, por ejemplo, mediante la mejora del rendimiento de semilla específico (intrínseco) (por ejemplo, en términos de aumento del tamaño de semilla/grano, aumento del número de mazorcas, aumento del número de semillas por mazorca, mejora en el llenado de semillas, mejora de la composición de semillas, mejoras del embrión y/o endospermo, o similares); la modificación y la mejora de los mecanismos inherentes de crecimiento y desarrollo de una planta (tales como altura de la planta, tasa de crecimiento de la planta, número de vainas, posición de la vaina en la planta, número de entrenudos, incidencia de rotura de vaina, eficacia de nodulación y fijación de nitrógeno, eficacia de asimilación de carbono, mejora del vigor de las plántulas/vigor temprano, mayor eficacia de germinación (en condiciones de estrés o no estrés), mejora en la arquitectura de la planta, modificaciones del ciclo celular, modificaciones de la fotosíntesis, diversas modificaciones de la ruta de señalización, modificación de la regulación transcripcional, modificación de la regulación traduccional, modificación de actividades enzimáticas, y similares); y/o similares.

"Marcador seleccionable", "gen marcador seleccionable" o "gen reportero" incluye cualquier gen que confiera un fenotipo a una célula en la que se expresa para facilitar la identificación y/o selección de células que se transfectan o se transforman con un constructo de ácido nucleico de la invención. Estos genes marcadores permiten la identificación de una transferencia exitosa de las moléculas de ácido nucleico a través de una serie de principios diferentes. Se pueden seleccionar marcadores adecuados a partir de marcadores que confieren resistencia a antibióticos o herbicidas, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten la selección visual. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen genes que confieren resistencia a los antibióticos (tales como nptll que fosforila la neomicina y la kanamicina, o hpt, que fosforila la higromicina, o genes que confieren resistencia a, por ejemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina), a herbicidas (por ejemplo, bar que proporciona resistencia a Basta®; aroA o gox que proporcionan resistencia contra el glifosato, o los genes que confieren resistencia a, por ejemplo, imidazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea), o genes que proporcionan un rasgo metabólico (tales como manA que permite a las plantas utilizar manosa como única fuente de carbono o xilosa isomerasa para la utilización de xilosa, o marcadores antinutritivos tales como la resistencia a 2-desoxiglucosa). La expresión de genes marcadores visuales da como resultado la formación de color (por ejemplo, p-glucuronidasa, GUS o p-galactosidasa con sus sustratos coloreados, por ejemplo X-Gal), luminiscencia (como el sistema luciferina/luciferasa) o fluorescencia (proteína fluorescente verde), GFP y sus derivados). Esta lista representa solo un pequeño número de marcadores posibles. El experto está familiarizado con dichos marcadores. Se prefieren diferentes marcadores según el organismo y el procedimiento de selección.

Se sabe que tras la integración estable o transitoria de los ácidos nucleicos en células vegetales, solo una minoría de las células absorbe el ADN extraño y, si lo desea, lo integra en su genoma, dependiendo del vector de expresión utilizado y la técnica de transfección utilizada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, generalmente se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (tal como los descritos anteriormente) en las células huésped junto con el gen de interés. Estos marcadores pueden utilizarse, por ejemplo, en mutantes en los que estos genes no son funcionales mediante, por ejemplo, la eliminación por medio de procedimientos convencionales. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador seleccionable pueden introducirse en una célula huésped en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención o utilizarse en los procedimientos de la invención, o bien en un vector separado. Las células que se han transfectado de forma estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse, por ejemplo, mediante selección (por ejemplo, las células que han integrado el marcador seleccionable sobreviven mientras que las otras células mueren).

Dado que los genes marcadores, particularmente los genes de resistencia a antibióticos y herbicidas, ya no son necesarios o no son deseados en la célula huésped transgénica una vez que los ácidos nucleicos se han introducido con éxito, el proceso según la invención para introducir los ácidos nucleicos emplea ventajosamente técnicas que permitir la eliminación o la escisión de estos genes marcadores. Uno de esos procedimientos es lo que se conoce como cotransformación. El procedimiento de cotransformación emplea simultáneamente dos vectores para la transformación, un vector que porta el ácido nucleico según la invención y un segundo que porta el o los genes marcadores. Una gran proporción de transformantes recibe o, en el caso de las plantas, comprende (hasta el 40% o más de los transformantes), ambos vectores. En caso de transformación con agrobacterias, los transformantes generalmente reciben solo una parte del vector, es decir, la secuencia flanqueada por el ADN-T, que generalmente representa el casete de expresión. Los genes marcadores pueden eliminarse subsiguientemente de la planta transformada realizando cruces. En otro procedimiento, los genes marcadores integrados en un transposón se utilizan para la transformación junto con el ácido nucleico deseado (conocido como la tecnología Ac/Ds). Los transformantes pueden cruzarse con una fuente de transposasa o los transformantes se transforman con un constructo de ácido nucleico que confiere expresión de una transposasa, transitoriamente o de forma estable. En algunos casos (aproximadamente el 10%), el transposón salta fuera del genoma de la célula huésped una vez que la transformación ha tenido éxito y se pierde. En un número adicional de casos, el transposón salta a una ubicación diferente. En estos casos, el gen marcador debe eliminarse realizando cruces. En microbiología se han desarrollado técnicas que posibilitan o facilitan la detección de dichos eventos. Otro procedimiento ventajoso se basa en lo que se conoce como sistemas de recombinación; la ventaja de los mismos es que se puede prescindir de la eliminación por cruce. El sistema más conocido de este tipo es el que se conoce como el sistema Cre/lox. Cre1 es una recombinasa que elimina las secuencias ubicadas entre las secuencias loxP. Si el gen marcador se integra entre las secuencias loxP, se elimina una vez que la transformación se ha realizado con éxito mediante la expresión de la recombinasa. Otros sistemas de recombinación son los sistemas HIN/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Es posible una integración específica del sitio en el genoma de la planta de las secuencias de ácido nucleico según la invención.

Para los fines de la invención, "transgénico", "transgén" o "recombinante" significa, con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico, un casete de expresión, un constructo génico o un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico o un organismo transformado con las secuencias de ácido nucleico, casetes de expresión o vectores según la invención.

Por lo tanto, una planta transgénica para los fines de la invención significa, como anteriormente, que los ácidos nucleicos utilizados en el procedimiento de la invención no están presentes en el genoma de dicha planta, ni se originan en el mismo, o están presentes en el genoma de dicha planta pero no en su locus natural en el genoma de dicha planta, siendo posible que los ácidos nucleicos se expresen de forma homologa o heteróloga. Sin embargo, tal como se ha mencionado, transgénico también significa que, aunque los ácidos nucleicos según la invención o que se utilizan en el procedimiento de la invención se encuentran en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia se ha modificado con respecto a la secuencia natural, y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales se han modificado. Preferentemente, por transgénico se entiende la expresión de los ácidos nucleicos según la invención en un locus no natural en el genoma, es decir, tiene lugar una expresión homóloga o heteróloga de los ácidos nucleicos. En el presente documento se mencionan plantas transgénicas preferidas.

Para los fines de la presente invención, los genes relacionados u ortólogos del gen KLUH tal como se han descrito anteriormente en el presente documento pueden aislarse de las bases de datos de secuencias (públicamente) disponibles. La "identidad de secuencia" de dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos relacionadas, expresada como un porcentaje, se refiere al número de posiciones en las dos secuencias alineadas óptimamente que tienen residuos idénticos (x 100) dividido por el número de posiciones comparadas. Un hueco, es decir, una posición en un alineamiento en la que un residuo está presente en una secuencia pero no en la otra, se considera una posición con residuos no idénticos. El alineamiento de las dos secuencias se realiza mediante el algoritmo Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch (1970) J Mol Biol. 48: 443-453). El alineamiento de secuencias asistido informáticamente anterior se puede realizar convenientemente utilizando un programa informático estándar tal como GAP, que forma parte del paquete Wisconsin Versión 10.1 (Genetics Computer Group, Madision, Wisconsin, Estados Unidos). Utilizando la matriz de puntuación predeterminada con una penalización por creación de huecos de 50 y una penalización de extensión de hueco de 3. Las secuencias se indican como "esencialmente similares" cuando dicha secuencia tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 75%, particularmente al menos aproximadamente el 80%, más particularmente al menos aproximadamente 85%, bastante particularmente aproximadamente el 90%, especialmente aproximadamente el 95%, más especialmente aproximadamente el 100%, siendo muy especialmente idénticas.

Alternativamente, el experto puede aislar genes de plantas KLUH ortólogos por medio de procedimientos de hibridación genética. Dichos procedimientos son bien conocidos por el biólogo molecular experto (en plantas).

El término "expresión" o la expresión "expresión génica" significan la transcripción de un gen específico o genes específicos o constructo genético específico. El término "expresión" o la expresión "expresión génica" en particular significan la transcripción de un gen o genes o constructo genético para dar ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARNm con o sin traducción posterior de este último en una proteína. El proceso incluye la transcripción de ADN y el procesamiento del producto de ARNm resultante.

El término "introducción" o "transformación" al que se hace referencia en el presente documento abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno a una célula huésped, independientemente del procedimiento utilizado para la transferencia. El tejido vegetal capaz de realizar una propagación clonal subsiguiente, ya sea por organogénesis o embriogénesis, puede transformarse con un constructo genético de la presente invención y una planta completa regenerada a partir del mismo. El tejido particular elegido variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles y más adecuados para la especie particular que se está transformando. Los ejemplos de tejidos objetivo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, megagametofitos, tejido calloso, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemo apical, yemas axilares y meristemos de raíz) y tejido del meristemo inducido (por ejemplo, meristemo del cotiledón e meristemo hipocotílico). El polinucleótido puede introducirse de forma transitoria o estable en una célula huésped y puede mantenerse no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, puede integrarse en el genoma del huésped. La célula vegetal transformada resultante puede utilizarse después para regenerar una planta transformada de una forma conocida por los expertos en la técnica.

La transferencia de genes extraños al genoma de una planta se denomina transformación. La transformación de especies de plantas es actualmente una técnica bastante rutinaria. Ventajosamente, puede utilizarse cualquiera de diversos procedimientos de transformación para introducir el gen de interés en una célula progenitora adecuada. Los procedimientos descritos para la transformación y regeneración de plantas a partir de tejidos vegetales o células vegetales pueden utilizarse para una transformación transitoria o estable. Los procedimientos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que aumentan la absorción de ADN libre, inyección del ADN directamente a la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación con virus o polen y microproyección. Los procedimientos se pueden seleccionar del procedimiento de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1 102); microinyección en material vegetal (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeo de partículas recubiertas con ADN o ARN (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70) infección con virus (no integrativos) y similares. Las plantas transgénicas, incluidas las plantas de cultivo transgénicas, se producen preferentemente mediante transformación mediada por Agrobacterium. Un procedimiento de transformación ventajoso es la transformación in planta. Con este fin, es posible, por ejemplo, permitir que las agrobacterias actúen sobre las semillas de las plantas o inocular agrobacterias al meristemo de las plantas. Se ha demostrado que es particularmente conveniente según la invención permitir que una suspensión de agrobacterias transformadas actúe sobre la planta intacta o al menos sobre los primordios florales. La planta se cultiva subsiguientemente hasta que se obtienen las semillas de la planta tratada (Clough y Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Los procedimientos para la transformación de arroz mediada por Agrobacterium incluyen procedimientos bien conocidos para la transformación de arroz, tales como los descritos en cualquiera de los documentos siguientes: solicitud de patente europea EP1198985, Aldemita y Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491 -506, 1993), Hiei et al. (Planta J 6 (2): 271 -282, 1994), cuyas divulgaciones se incorporan al presente documento por referencia como si se establecieran en su totalidad. En el caso de la transformación de maíz, el procedimiento preferido es tal como se describe por Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14 (6): 745-50, 1996) o Frame et al. (Plant Physiol 129 (1): 13-22, 2002), cuyas divulgaciones se incorporan al presente documento por referencia como si se establecieran en su totalidad. Dichos procedimientos se describen adicionalmente a modo de ejemplo por B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) Los ácidos nucleicos o el constructo que se van a expresar se clonan preferentemente en un vector que es adecuado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBin19 (Bevan et al. (1984) Nucl. Acidos Res. 12-8711). Las agrobacterias transformadas por dicho vector pueden utilizarse después de forma conocida para la transformación de plantas, tales como plantas utilizadas como modelo, tales como Arabidopsis (Arabidopsis thaliana se encuentra dentro del alcance de la presente invención no considerada como planta de cultivo), o plantas de cultivo tales como, por ejemplo, plantas de tabaco, por ejemplo sumergiendo hojas golpeadas u hojas trituradas en una solución agrobacteriana y cultivándolas después en medios adecuados. La transformación de plantas por medio de Agrobacterium tumefaciens se describe, por ejemplo, por Hofgen y Willmitzer en Nucl. Acid Res (1988) 16, 9877 o se conoce por, entre otros, F.F. Blanco, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, páginas 15-38.

Además de la transformación de las células somáticas, que después deben regenerarse para dar plantas intactas, también es posible transformar las células de meristemos vegetales y, en particular, las células que se desarrollan dando gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, dando lugar a plantas transgénicas. Así, por ejemplo, las semillas de Arabidopsis se tratan con agrobacterias y las semillas se obtienen de las plantas en desarrollo, de las cuales se transforma una determinada proporción y, por lo tanto, son transgénicas [Feldman, KA y Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208: 1-9; Feldmann K (1992). En: C Koncz, N-H Chua y J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, páginas 274-289]. Algunos procedimientos alternativos se basan en la eliminación repetida de las inflorescencias y la incubación del sitio de escisión en el centro de la roseta con agrobacterias transformadas, por lo que las semillas transformadas también se pueden obtener en un punto temporal posterior (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). No obstante, un procedimiento especialmente eficaz es el procedimiento de infiltración al vacío con sus modificaciones, tal como el procedimiento de "inmersión floral". En el caso de infiltración al vacío de Arabidopsis, las plantas intactas se tratan bajo presión reducida con una suspensión agrobacteriana [Bechthold, N (1993). CR Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1194-1199], mientras que en el caso del procedimiento de "inmersión floral", el tejido floral en desarrollo se incuba brevemente con una suspensión agrobacteriana tratada con tensioactivo [Clough, SJ y Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743]. En ambos casos se cosecha una determinada proporción de semillas transgénicas, y estas semillas se pueden distinguir de las semillas no transgénicas mediante cultivo en las condiciones selectivas descritas anteriormente. Además, la transformación estable de plastidios es una ventaja porque los plastidios se heredan por vía materna, ya que la mayor parte de los cultivos reducen o eliminan el riesgo de flujo transgénico a través del polen. La transformación del genoma del cloroplasto generalmente se logra mediante un proceso que se ha mostrado esquemáticamente por Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. Brevemente, las secuencias que se van a transformar se clonan junto con un gen marcador seleccionable entre secuencias flanqueantes homólogas al genoma del cloroplasto. Estas secuencias flanqueantes homólogas dirigen la integración específica del sitio en el plastoma. La transformación plastidial se ha descrito para muchas especies de plantas diferentes y se ofrece una descripción general en Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol., 21 de septiembre de 2001; 312 (3): 425-38 o Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20-28. Recientemente se ha informado sobre nuevos avances biotecnológicos en forma de transformantes de plástidos desprovistos de marcadores que pueden producirse por un gen marcador cointegrado transitorio (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22 (2), 225-229).

Las células vegetales genéticamente modificadas se pueden regenerar mediante todos los procedimientos con los que el experto está familiarizado. Se pueden encontrar procedimientos adecuados en las publicaciones por S.D. Kung y R. Wu, Potrykus o Hofgen y Willmitzer mencionadas anteriormente.

Generalmente después de la transformación, las células o agrupaciones celulares vegetales se seleccionan mediante la presencia de uno o más marcadores que están codificados por genes que se expresan en la planta cotransferidos con el gen de interés, después de lo cual el material transformado se regenera dando una planta completa. Para seleccionar plantas transformadas, el material vegetal obtenido en la transformación se somete, generalmente, a condiciones selectivas para que las plantas transformadas puedan distinguirse de las plantas no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas de la forma descrita anteriormente pueden plantarse y, después de un período de crecimiento inicial, someterse a una selección adecuada mediante pulverización. Una posibilidad adicional consiste en cultivar las semillas, si es apropiado después de esterilización, en placas de agar utilizando un agente de selección adecuado para que solo las semillas transformadas puedan crecer dando plantas.

Alternativamente, las plantas transformadas se seleccionan para detectar la presencia de un marcador seleccionable tal como los descritos anteriormente.

Después de la transferencia y la regeneración de ADN, las plantas supuestamente transformadas también se pueden evaluar, por ejemplo utilizando análisis Southern, para determinar la presencia del gen de interés, el número de copias y/o la organización genómica. Alternativamente o adicionalmente, los niveles de expresión del ADN recién introducido se pueden controlar utilizando análisis Northern y/u Western, siendo ambas técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica.

Las plantas transformadas generadas pueden propagarse mediante una diversidad de medios, tales como por propagación clonal o técnicas de reproducción clásicas. Por ejemplo, una planta transformada de primera generación (o T1) puede ser autofertilizable y se pueden seleccionar transformantes homocigóticos de segunda generación (o T2), y las plantas T2 pueden propagarse después a través de técnicas de cultivo clásicas. Los organismos transformados generados pueden adquirir una diversidad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes clonales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un portainjerto transformado injertado en un vástago no transformado).

Los términos "aumentar", "mejorar" o "potenciar" se utilizan indistintamente y significarán en el contexto de la solicitud al menos el 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o 10%, preferentemente al menos el 15% o 20%, de forma más preferida el 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de rendimiento y/o crecimiento en comparación con plantas de control tal como se definen en el presente documento.

El término "planta", tal como se utiliza en el presente documento, abarca plantas monocotiledóneas enteras, los ancestros y la progenie de las plantas y partes de plantas, incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluidos tubérculos), flores y tejidos y órganos, comprendiendo cada uno de los mencionados anteriormente el gen/ácido nucleico de interés. El término "planta" también abarca células vegetales monocotiledóneas, cultivos en suspensión, tejido calloso, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, polen y microesporas, comprendiendo de nuevo cada uno de los mencionados anteriormente el gen/ácido nucleico de interés.

Las plantas monocotiledóneas que son particularmente útiles en los procedimientos de la invención incluyen forraje o cultivos forrajeros, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Asparagus officinalis, Avena spp. (por ejemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Bambusa sp., Carex elata, Cocos spp., Colocasia esculenta, Crocus sativus, Dioscorea spp., Echinochloa spp., Elaeis (por ejemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleífera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Festuca arundinacea, Hemerocallis fulva, Hordeum spp. (por ejemplo, Hordeum vulgare), Musa spp., Oryza spp. (por ejemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Pennisetum sp., Phalaris arundinacea, Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Sorghum bicolor, Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por ejemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum o Triticum vulgare), Zea mays, Zizania palustres, entre otros.

La elección de plantas de control adecuadas es una parte rutinaria de una configuración experimental y puede incluir plantas de tipo silvestre correspondientes o plantas correspondientes sin el gen de interés. La planta de control es normalmente de la misma especie de planta o incluso de la misma variedad que la planta que se va a evaluar. La planta de control también puede ser un nulicigoto de la planta que se va a evaluar. Los nulicigotos son individuos que pierden el transgén por segregación. Una "planta de control", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere no solo a plantas enteras, sino también a partes de plantas, incluidas semillas y partes de semillas.

La expresión "casete de expresión" se refiere a cualquier sistema de expresión recombinante que tiene el fin de expresar una secuencia de ácido nucleico de la invención in vitro o in vivo, constitutivamente o de forma inducible, en cualquier célula, incluyendo, además de células vegetales, células procariotas, de levadura, fúngicas, de insectos o de mamíferos. La expresión incluye sistemas de expresión lineal y circular. La expresión incluye todos los vectores. Los casetes pueden permanecer episomales o integrarse en el genoma de la célula huésped. Los casetes de expresión pueden tener la capacidad de autorreplicarse o no (es decir, controlar solo la expresión transitoria en una célula). La expresión incluye casetes de expresión recombinante que contienen solo los elementos mínimos necesarios para la transcripción del ácido nucleico recombinante.

Los ejemplos no limitantes siguientes describen procedimientos y medios según la invención. A menos que se indique lo contrario en los ejemplos, todas las técnicas se llevan a cabo según protocolos estándar en la técnica. Los ejemplos siguientes se incluyen para ilustrar formas de realización de la invención. Los expertos en la técnica deberían apreciar, a la luz de la presente descripción, que se pueden realizar muchos cambios en las formas de realización específicas que se divulgan y obtener aún un resultado parecido o similar sin apartarse del concepto, el espíritu y el alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que determinados agentes que están relacionados químicamente y fisiológicamente pueden sustituirse por los agentes descritos en el presente documento, obteniéndose también los mismos resultados o resultados similares.

EJEMPLOS

1. Construcción de un gen quimérico: promotor de GA2-oxidasa unido operativamente a una secuencia de codificación de KLUH

El promotor de GA2-oxidasa de maíz derivado del gen GRMZM2G031724 de Zea mays se aisló (2046 pb) y se fusionó con los sitios attB4 y attB1r, y se combinó con el vector de entrada pDONR P4-P1r mediante reacción BP (véase la figura 1).

También se aisló un gen representativo de maíz KLUH (GRMZM2G167986). El gen tiene un intrón y conduce a dos patrones de transcripción en maíz. Aislamos la secuencia del genoma (1834 pb) que incluye el intrón y la secuencia de codificación (CDS). La secuencia KLUH se fusionó con los sitios attB1 y attB2, y se combinó con el vector de entrada pDONR 221 mediante reacción BP (véase la figura 2). El vector de expresión pBb42GW7 es un vector intermediario de MultiSite Gateway diseñado para monocotiledóneas ((Karimi et al., 2013); véase la figura 3). El promotor de GA2-oxidasa unido operativamente al gen KLUH se insertó en el vector de expresión pBb42GW7 por medio de reacción LR entre attR4 y attR2. El gen bar dirigido por el promotor 35S se utilizó para seleccionar plantas transgénicas durante el proceso de transformación (véase la figura 4). La secuencia del gen quimérico del promotor de GA2-oxidasa unido operativamente al gen KLUH en el vector de expresión pBb42GW7 se muestra en la figura 5.

La transformación del maíz se realizó según (Coussens et al., 2012).

En total, se obtuvieron 10 líneas T0 independientes después de la transformación. Aproximadamente 35 semillas T1 generadas a partir de T0 retrocruzadas con B104 de tipo silvestre se sembraron en el suelo para el análisis de segregación y el fenotipado. El ensayo de amonio (De Block et al., 1995) se utilizó para detectar plantas transgénicas, se utilizó una pintura de hoja para confirmar determinadas plantas para la ampliación.

Se seleccionaron cuatro líneas independientes, 139_01, 140_01, 140_04, 140_05, que tenían una inserción de ADN-T y mostraron un fenotipo para su posterior análisis (véase la tabla 1).

Tabla 1: Ensayo de Chi cuadrado y resultados del fenotipado de plantas T1. * indica líneas de locus individuales. Las plantas NA no pudieron genotiparse debido a una germinación tardía o a un crecimiento retardado.

Plantas de Plantas Plantas Valor de

resistencia sensibles NA _Chi2 Fenotipo

139_01 14 13 8 0,037* Sí

139_04 20 10 5 3,33

139_05 17 13 5 0,53*

139_07 19 9 7 3,57 Sí

140_01 15 12 8 0,33* Sí

140_04 19 10 3 2,79* Sí

140_05 11 19 2 2,13* Sí

140_07 20 12 0 2*

140_09 13 8 9 1,19*

140_11 22 6 2 9,14 Sí

2. Análisis fenotípico y molecular de los transformantes de maíz que comprenden el gen quimérico

La longitud de las hojas de las plantas se midió desde la parte superior del suelo hasta la punta de la hoja. La longitud de la hoja y el área de la hoja 2 se midieron cuando crecieron completamente (dos días después de aparecer la hoja 4). La longitud de la hoja 4 se midió diariamente desde la aparición de la hoja 4 hasta que crecieron completamente (aproximadamente 10 días). A partir de los datos registrados de la hoja 4, se calcular la LER como la diferencia en la longitud de la hoja en dos puntos temporales sucesivos divididos por el intervalo de tiempo entre los mismos (en mm/h). El área de la hoja 4 se midió cuando la hoja creció completamente. Se escaneó el limbo de la hoja y se calculó el área de la hoja utilizando Image J. El análisis cinemático se realizó tal como se describe por (Nelissen et al., 2013).

Por ahora, parte de las mediciones de las hojas se han realizado en cuatro líneas seleccionadas. La longitud final de la hoja y el área foliar de la hoja 2 se calcularon en 140_01 y 139_01 (Tabla 2). La tasa de alargamiento de la hoja y parámetros más detallados de la hoja 4 se calcularon en 140_04 y 140_05 (figura 6, tabla 3, figura 7, tabla 4).

2.1 Los parámetros de la hoja 2 para las líneas 140 01 y 139 01 muestran mayor longitud y área de la hoja Para la línea 140_01 y 139_01, hasta ahora solo se realizaron mediciones en la hoja 2 completamente desarrollada. Sin embargo, estas muestran que el área y la longitud final de la hoja aumentan significativamente en las dos líneas independientes. Ahora se miden en estas dos líneas los parámetros de la hoja 4.

Tabla 2: Parámetros de la hoja 2 de dos líneas T1 140_01 y 139_01. R representa plantas transgénicas (resistentes), S representa plantas no transgénicas (sensibles).

140-01 139-01

R S A% Valor de P R S A% Valor de P área de la hoja (mmA2) 1807,7 1276,9 29,4 0 1932,9 1236,3 36 0,006 entrenudo (mm) 105 90,5 13,8 0,003 105 97,5 7,1 0,19 longitud de hoja (mm) 293,8 223,5 23,9 0,0008 298,3 234,8 21,3 0,021 anchura de hoja (mm) 13,8 12,5 9,2 0,006 13 11,7 10 0,11

2.2 Los parámetros de la hoja 4 para las líneas 14004 y 14005 muestran un aumento de LER, longitud de la hoja y tamaño de la zona de división

Para las líneas 140_04 y 140_05, se realizó un seguimiento de la longitud de la hoja 4 durante su crecimiento, lo que demuestra que la tasa de alargamiento de la hoja (LER) fue mayor durante el estado estacionario en las plantas transgénicas frente a las plantas de control y que la duración del crecimiento aumentó en la línea transgénica (figuras 6 y 7).

Además, cuando se realizaron mediciones en 2 plantas por línea se evidenció que el área aumentó en un 34 - 45% (tablas 3 y 4). Para determinar la longitud de la hoja y el tamaño de la zona de división se analizaron más plantas, lo que permitió un análisis estadístico: la longitud foliar final de la hoja 4 aumentó significativamente en ambas líneas transgénicas (variando del 15,3 al 24,2%). Para la línea 140_04, se realizó una medición preliminar del tamaño de la zona de división que muestra que el aumento en la longitud foliar en esa línea se debió, al menos en parte, a un mayor tamaño de la zona de división (15,7%) y, por lo tanto, al número de células en división (tabla 3).

Tabla 3: Parámetros de la hoja 4 de 140_04. R representa plantas transgénicas (resistentes), S representa plantas no transgénicas (sensibles).

Área de Longitud de Anchura de

140_04 la hoja 4 la hoja 4 la hoja 4 Tamaño de la ZD

R 53,6 65,3 2,3 1,8

S 35,5 49,5 1,9 1,5

A% 33,9 24,2 17,2 15,7

Valor de p

0,005 0,02

Tabla 4: Parámetros de la hoja 4 de 140_05. R representa plantas transgénicas (resistentes), S representa plantas no transgénicas (sensibles).

140_05 Área de Longitud de Anchura de

la hoja 4 la hoja 4 la hoja 4

R 77,1 64,5 2,3

S 41,9 54,6 1,8

A% 45,6 15,3 22,4

Valor de p 0,04

2.3 El análisis qPCR muestra una mayor expresión de KLUH en la zona de crecimiento de la hoja de maíz

La hoja 4 se cosechó dos días después de que aparecieran para analizar el nivel de sobreexpresión de KLUH bajo el promotor de GA2-oxidasa. La hoja 4 se cortó en 10 piezas desde la base de la hoja hacia la punta de la hoja a una escala de 0,5 cm. Del análisis qPCR, dos líneas mostraron un fenotipo de hoja 2 más grande, 140_01 y 139_01, y tienen un mayor nivel de expresión de KLUH en comparación con cualquier planta transgénica (figura 8, figura 9).

2.4 Conclusión

De los 10 eventos de transformación, se eligieron 4 líneas en las que se insertó el ADN-T en un único locus en el genoma. Las cuatro líneas muestran una mejora en el crecimiento de las hojas, lo que da como resultado hojas más largas con una mayor área del limbo. Esta mayor área del limbo foliar permite capturar más luz solar, lo que puede dar lugar, como resultado, a una mayor fotosíntesis neta. El análisis celular de una línea mostró que el aumento de la longitud de la hoja se debe, al menos en parte, a un aumento en el tamaño de la zona de división, por lo tanto más células en división. Si bien no se pretende limitar la invención a un mecanismo particular, una hipótesis es que, dado que se demostró que KLUH estimula la división celular en las plantas y, por lo tanto, extiende la expresión de KLUH dentro de la zona de crecimiento, se obtiene como resultado la estimulación de divisiones adicionales (en un órgano vegetal particular).

Las cuatro líneas se cultivan ahora una al lado de la otra y se realizarán cuatro mediciones detalladas de la hoja. En el mismo experimento, tomamos muestras para comparar los niveles de "sobreexpresión" de KLUH en la zona de crecimiento. Las plantas también se cultivan hasta la madurez para evaluar la altura final de la planta, el tiempo de floración, el intervalo entre antesis y floración femenina (ASI), el rendimiento de semilla, la biomasa y la longitud del entrenudo.

3. Las plantas de maíz genéticamente transformadas con el gen quimérico GA2ox::KLUH tienen una zona de división estable durante al menos un día adicional

Se aplicó un análisis cinemático detallado a lo largo del tiempo sobre la hoja 4. De varias plantas transformadas independientes, la hoja 4 se cosechó todos los días desde que emergió de la hoja 3 hasta que creció por completo. El tamaño de la zona de división se determinó por tinción DAPI. El ANOVA mostró una interacción significativa entre el tamaño de la zona de división y el tiempo de crecimiento de la hoja, mostrando que el tamaño de la zona de división en GA2ox::KLUH permaneció un día más en el tamaño máximo que el tipo silvestre (véase el día 5 en la figura 10).

4. Las plantas de maíz transgénico que albergan el gen quimérico GA2ox::KLUH tienen un intervalo entre antesis y floración femenina más corto que el tipo silvestre

Se observó un intervalo promedio entre antesis y floración femenina (ASI) 3 días más corto en las plantas de maíz transgénicas que albergan el gen quimérico GA2ox::KLUH en comparación con las plantas de maíz de tipo silvestre. ASI es el tiempo entre el desprendimiento de polen y la aparición de las flores femeninas. El ASI más corto permite que el polen más viable entre en las flores femeninas para facilitar la eficacia de la polinización y también está documentado en la técnica que puede ayudar a las plantas a mantener el rendimiento en condiciones de estrés por sequía.

5. Las plantas de maíz transgénicas híbridas que albergan un gen quimérico GA2ox::KLUH y un gen quimérico UBIL::GA20ox tienen un mayor rendimiento de biomasa que sus progenitores

Anteriormente se ha demostrado que en las plantas de maíz transgénicas que albergan el gen quimérico UBIL::GA20Ox, los altos niveles de GA afectan principalmente a los niveles máximos de tasa de crecimiento (LER), pero no a la cronología de crecimiento (véase Nelissen et al., 2012). En la presente invención, mostramos ahora que las plantas de maíz que albergan el gen quimérico GA2OX::KLUH afectan mínimamente a la tasa de crecimiento máxima, pero que la presencia de este gen quimérico mantiene la tasa de crecimiento máxima durante un día adicional, es decir, manteniendo el tamaño de la zona de división máximo durante un período más largo. Para examinar si los dos genes quiméricos se influyen sinérgicamente entre sí y si la combinación de ambos genes quiméricos aumenta aún más la longitud de la hoja, realizamos un cruce entre las dos líneas transgénicas.

El LER de la hoja 4 del cruce resultante GA2ox::KLUH x UBIL::GA20ox mostró una tasa de crecimiento igual de elevada que UBIL::GA20ox; y en el día 7 del crecimiento de la hoja 4, el cruce mostró la misma tasa de crecimiento que GA2ox::KLUH, cuando la tasa de crecimiento de UBIL::GA20ox ya había disminuido a un nivel más bajo. Esta combinación de genes quiméricos en el híbrido conduce al aumento aditivo de la longitud final de la hoja y el área de la hoja. Además, también medimos la longitud foliar final y el área de la hoja 2, que es similar a lo que vemos de la hoja 4. No se observó heterosis significativa del fenotipo de plantas maduras GA2ox::KLUH x UBIL::GA20ox, aunque la combinación mostró una mayor altura y un mayor peso de la planta (véase la figura 11B; tabla 5). En conclusión, mostramos que la combinación de genes quiméricos (GA2ox::KLUH x UBIL::GA20ox) tomó el fenotipo mejorado de cada planta progenitora, es decir, la altura de UBIL::GA2ox y el área foliar más grande de GA2ox::KLUH.

Tabla 5. Parámetros de planta del cruce GA2OX::KLUH x UBIL::GA20Ox y sus respectivos progenitores

Tipo silvestre GA2ox::KLUH UBIL::GA20ox ^{GA2ox::KLUH x} _UBIL::GA20ox Área de la hoja 2 11,01 * 15,75 * 14,09 * 20,11

Longitud de la hoja 4 551,3 * 636 * 733,7 840

Área de la hoja 4 73,4 * 93,28 * 87,93 * 129,76

Altura de planta 218,3 * 23,6 * 283,9 341,6

Peso de la planta 530 537,3 438,2 552,6

Longitud de la raíz 12,3 7,07 40,1 * 10,3

N° de raíces de la corona 2,3 2 3,25 * 2,3

Longitud de la flor 25,3 * 26,6 33,5 34,35

Ramas de la panícula 10 * 12 13,6 13

Los asteriscos indican diferencias significativas en comparación con GA2ox::KLUH x UBIL::GA20ox con p < 0,05. 6. Crecimiento de las plantas de maíz transgénicas que albergan el gen quimérico GA2ox::KLUH en condiciones de estrés

Cuando las plantas de maíz transgénicas que albergan el gen quimérico GA2ox::KLUH se sometieron a un estrés por sequía leve, no observamos diferencias significativas en la longitud final de la hoja (valor de P = 0,95), sino una mayor reducción de la LER (valor de P = 0,035) y un período de crecimiento más largo (valor de P = 0) se han encontrado en plantas resistentes bajo sequía leve (veáse la figura 12).

7. Ejemplos no limitantes de promotores de GA2-oxidasa adecuados (derivados de Zea mays) que pueden utilizarse para construir genes quiméricos de la invención

• SEQ ID NO: 4: promotor ZmGA2ox1 (GRMZM2G127757; 2489 pb), este promotor es activo en la hoja en crecimiento

• SEQ ID NO: 5: promotor ZmGA2ox2.1 (GRMZM2G078798_T01; GRMZM2G078798_T02; GRMZM2G078798_T04; 2505 pb); tres patrones de transcripción GRMZM2G078798_T01; GRMZM2G078798_T02; GRMZM2G078798_T04 comienzan en la misma posición. Por lo tanto, se puede utilizar el mismo promotor. Este promotor es activo en hojas en crecimiento.

• SEQ ID NO: 6: promotor ZmGA2ox2.1 (GRMZM2G078798_T03; 2404 pb); GRMZM2G078798_T03 comienza más tarde en el genoma que las tres transcripciones anteriores (tres patrones de transcripción GRMZM2G078798_T01; GRMZM2G078798_T02; GRMZM2G078798_T04). Este promotor es activo en hojas en crecimiento.

• SEQ ID NO: 7: promotor ZmGA2ox2.2 (GRMZM2G176963_T01; 2500 pb). Este promotor es activo en la mazorca de maíz.

• SEQ ID NO: 8: promotor ZmGA2ox3.1 (GRMZM2G022679_T01; 2494 pb). Este promotor es activo en hojas en crecimiento.

• SEQ ID NO: 9: promotor ZmGA2ox3.2 (GRMZM2G031724; 2046 pb). Este promotor es activo en hojas en crecimiento y se usó en el ejemplo 1.

• SEQ ID NO: 10: promotor ZmGA2ox4 (GRMZM2G427618_T01; 2120 pb). Este promotor es activo en hojas en crecimiento.

• SEQ ID NO: 11: promotor ZmGA2ox6.2 (GRMZM2G153359_T01; 2467 pb). Este promotor es activo en hojas en crecimiento.

• SEQ ID NO: 12: promotor ZmGA2ox7.1 (GRMZM2G051619_T01; 2456 pb). Este promotor es activo en hojas en crecimiento y en el embrión.

• SEQ ID NO: 13: promotor ZmGA2ox7.2 (GRMZM2G152354_T01; 2500 pb). Este promotor es activo en la mazorca.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un constructo de gen quimérico que comprende los elementos de ADN unidos operativamente siguientes: a) la región promotora de un gen GA2-oxidasa vegetal que es activa en la zona de crecimiento de la hoja de una planta monocotiledónea, b) una región de ADN que codifica una proteína CYP78A5 vegetal o un ortólogo funcional con una identidad de aminoácidos de al menos el 55% con respecto a la proteína codificada por la SEQ ID NO: 2 y c) una región del extremo 3' que comprende señales de terminación de la transcripción y de poliadenilación que opera en células de una planta monocotiledónea.

2. Un vector recombinante que comprende el gen quimérico de la reivindicación 1.

3. Una planta, una célula de una planta o una semilla de una planta monocotiledónea que comprende un gen quimérico según la reivindicación 1 o un vector recombinante según la reivindicación 2.

4. Uso de un gen quimérico según la reivindicación 1 o un vector recombinante según la reivindicación 2 para aumentar el rendimiento de plantas monocotiledóneas.

5. Uso de un gen quimérico según la reivindicación 1 o un vector recombinante según la reivindicación 2 para aumentar el vigor de plántulas de plantas monocotiledóneas.

6. Uso de un gen quimérico según la reivindicación 1 o un vector recombinante según la reivindicación 2 para aumentar la tolerancia a la sequía de plantas monocotiledóneas.

7. Uso según las reivindicaciones 5 o 6 en el que las plantas son de cultivos.

8. Uso según la reivindicación 7 en el que los cultivos son de cereales.

9. Uso según la reivindicación 7 en donde los cultivos son de pastos.

10. Un procedimiento para producir una planta monocotiledónea con un mayor rendimiento en comparación con una planta monocotiledónea de tipo silvestre correspondiente, comprendiendo el procedimiento transformar una planta monocotiledónea con un gen quimérico según la reivindicación 1 o un vector recombinante según la reivindicación 2 y seleccionar una planta monocotiledónea con una expresión estable de dicho gen quimérico.