ES2933174T3 - Expresión génica exógena en adenovirus terapéutico para mínimo impacto sobre la cinética viral - Google Patents

Abstract

Se describen genomas de adenovirus recombinantes que incluyen un marco de lectura abierto (ORF) exógeno y una secuencia codificante de péptido autoescindible. Se describe adicionalmente la ubicación óptima de los genes exógenos para un impacto mínimo en la cinética viral. También se describen las aplicaciones terapéuticas de los adenovirus recombinantes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Expresión génica exógena en adenovirus terapéutico para mínimo impacto sobre la cinética viral

Campo

Esta divulgación se refiere a la colocación óptima de marcos de lectura abiertos exógenos en construcciones de adenovirus recombinantes y aplicaciones terapéuticas de los virus recombinantes.

Antecedentes

El adenovirus serotipo 5 (Ad5) es el vector de elección en aplicaciones de investigación básica, modelos de cáncer de pulmón murino y ensayos de terapia génica humana. Los adenovirus tienen un genoma de ADN de doble cadena estable de 36 kb protegido por una cápside de proteína decorada con picos de proteína de fibra Ad que dirigen la infección a los receptores sobre tipos de células específicos. Los adenovirus no se integran en el ADN del huésped, se pueden producir en títulos altos utilizando protocolos establecidos y tienen seguridad comprobada en aplicaciones de cáncer y terapia génica humana. Por lo tanto, los vectores basados en Ad son muy prometedores para el diagnóstico y la terapia del cáncer. El documento WO2016/049201 divulga ejemplos de vectores de adenovirus recombinantes útiles en el tratamiento del cáncer, tales como la secuencia divulgada en la Figura 10. La secuencia de la Figura 10 no forma parte de la presente divulgación y es solo para información de antecedentes. Funston et al (2008), volumen 89, p. 389 a 396, divulgan adenovirus recombinantes que incluyen la secuencia de péptidos 2A picornavirales en marcos de lectura abiertos adenovirales.

Resumen

La presente invención, en sus diversos aspectos, se establece en las reivindicaciones adjuntas.

En el presente documento se divulgan genomas de adenovirus recombinantes que incluyen un marco de lectura abierto heterólogo (ORF) y una secuencia de codificación del péptido autoescindible. El ORF heterólogo puede codificar, por ejemplo, una proteína terapéutica. Los genomas de adenovirus recombinantes y los adenovirus recombinantes producidos por los genomas descritos se pueden utilizar, por ejemplo, en aplicaciones terapéuticas, como para el tratamiento del cáncer.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un genoma del adenovirus recombinante, que comprende un marco de lectura abierto heterólogo (ORF) y una secuencia de codificación del péptido autoescindible, ambos ligados operativamente y en el mismo marco de lectura que un ORF de adenovirus endógeno, en el que la secuencia de codificación del péptido autoescindible está ubicada entre el ORF heterólogo y el ORF endógeno, en el que el péptido autoescindible es un péptido 2A o un péptido 2A que se ha modificado para incluir Gly-Ser-Gly en el terminal N para mejorar eficiencia de escisión, y en el que:

el ORF endógeno es E1B-55k y el ORF heterólogo es 3' de E1B-55k, en el que dicho ORF heterólogo no es una proteína de fusión de ligando a FKBP dirigida cuando el péptido autoescindible es P2A;

el ORF endógeno es polimerasa de ADN y el ORF heterólogo es 5' de polimerasa de ADN;

el ORF endógeno es proteína de muerte de adenovirus (ADP) y el ORF heterólogo es 5' de ADP en el que dicho ORF heterólogo no es una proteína de fusión de ligando a FKBP dirigida cuando el péptido autoescindible es P2A, y en el que dicho genoma de adenovirus no es AdSyn-CO4440 definido por la secuencia de la Figura 10 que comprende EGFRVHH-GS-FKBP y P2A 5' de ADP;

el ORF endógeno es E4-ORF2 y el ORF heterólogo es 5' de E4-ORF2; o

el ORF endógeno es fibra y el ORF heterólogo es 3' de fibra,

en el que el ORF heterólogo codifica una proteína terapéutica

En una realización preferida de la invención, dicho péptido 2A es un péptido 2A (P2A) del teschovirus-1 de porcino (PTV1), un péptido 2A (F2A) del virus de la fiebre aftosa (FMDV), un péptido 2A (E2A) del virus A de rinitis equina (ERAV) o un péptido 2A (T2A) del virus de Thosea asigna (TaV).

En una realización preferida de la invención, dicha secuencia de aminoácidos del péptido autoescindible es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO.: 14-21 o en el que el péptido autoescindible comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 14-21.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición que comprende el genoma del adenovirus recombinante de acuerdo con la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un adenovirus recombinante que comprende el genoma del adenovirus recombinante de acuerdo con la invención.

En una realización preferida de la invención, se proporciona una composición que comprende el adenovirus recombinante de acuerdo con la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un genoma del adenovirus recombinante o una composición de acuerdo con la invención para uso como un medicamento.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona el genoma del adenovirus recombinante, el adenovirus recombinante o la composición de acuerdo con la invención para uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz del genoma del adenovirus recombinante, el adenovirus recombinante o la composición de acuerdo con la invención, comprende adicionalmente un agente terapéutico adicional para uso en el tratamiento del cáncer.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un kit que comprende:

(i) el genoma del adenovirus recombinante, el adenovirus recombinante o la composición de acuerdo con la invención; y

(ii) uno o más agentes terapéuticos adicionales y/o uno o más agentes de diagnóstico.

En una realización preferida de la invención, dichos uno o más agentes terapéuticos adicionales comprenden un producto quimioterapéutico, un biológico o combinaciones de los mismos, o en el que uno o más agentes de diagnóstico comprenden uno o más anticuerpos específicos para un marcador tumoral.

En una realización preferida de la invención, dichos uno o más agentes de diagnóstico comprenden una o más moléculas de ácido nucleico específicas para un marcador tumoral.

En el presente documento se proporcionan genomas de adenovirus recombinantes que incluyen un ORF heterólogo y una secuencia de codificación del péptido autoescindible, ambos ligados operativamente y en el mismo marco de lectura que un ORF de adenovirus endógeno. La secuencia de codificación del péptido autoescindible se localiza entre el ORF heterólogo y el ORF endógeno. En algunas realizaciones, el ORF endógeno es E1B-55k y el ORF heterólogo es 3' de E1B-55k en el que dicho ORF heterólogo no es una proteína de fusión de ligando a FKBP dirigida cuando el péptido autoescindible es P2A; el ORF endógeno es polimerasa de ADN y el ORF heterólogo es 5' de polimerasa de ADN; el ORF endógeno es proteína de muerte de adenovirus (ADP) y el ORF heterólogo es 5' de ADP en el que dicho ORF heterólogo no es una proteína de fusión de ligando a FKBP dirigida cuando el péptido autoescindible es P2A, y en el que dicho genoma de adenovirus no es AdSyn- CO4440 definido por la secuencia de la Figura 10 que comprende EGFRVHH-GS-FKBP y P2A 5' de ADP; el ORF endógeno es E4-ORF2 y el ORF heterólogo es 5' de E4-ORF2; o el ORF endógeno es fibra y el ORF heterólogo es 3' de fibra. En algunos ejemplos, el ORF heterólogo codifica una proteína terapéutica.

Además, en el presente documento se proporcionan adenovirus recombinantes que incluyen un genoma del adenovirus recombinante divulgado en el presente documento. También se proporcionan composiciones que incluyen un genoma del adenovirus recombinante o un adenovirus recombinante divulgado en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable.

Divulgamos, pero no reivindicamos, un método para suministrar una proteína terapéutica a un sujeto al administrar al sujeto de un genoma del adenovirus recombinante o un adenovirus recombinante (o una composición del mismo) divulgado en el presente documento. En estos métodos, el ORF heterólogo del genoma del adenovirus recombinante o del adenovirus recombinante codifica la proteína terapéutica.

Además, se divulgan, pero no se reivindican, métodos para inhibir la viabilidad de las células tumorales, inhibir el crecimiento de las células tumorales, inhibir la progresión del tumor, reducir el volumen del tumor y tratar a un sujeto con cáncer al administrar un genoma del adenovirus recombinante o un adenovirus recombinante (o una composición del mismo) divulgado en el presente documento. En estos métodos, el ORF heterólogo del genoma del adenovirus recombinante o del adenovirus recombinante codifica una proteína terapéutica adecuada para el tratamiento del cáncer.

Lo anterior y otros objetos y características de la divulgación se harán más evidentes a partir de la siguiente divulgación detallada, que procede con referencia a las figuras acompañantes.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es un esquema de un flujo de trabajo de ejemplo para probar construcciones adenovirales. El plásmido del genoma del virus completo se produce y se transfecta en células adecuadas, tales como las células 293-E4, en una placa de múltiples pocillos. A medida que las células transfectadas se expanden, se someten a congelación/descongelación para liberar partículas virales, seguidas de centrifugación para sedimentar los restos celulares. El sobrenadante (que contiene las partículas virales) se transfiere a varias placas de cultivo más grandes. Las partículas virales se recogen de las células transfectadas, se purifican con CsCl y se mide el título del virus infeccioso mediante ELISA. A continuación, el tipo de célula de interés se infecta con una MOI conocida de virus purificado. A las 48 o 72 horas después de la infección, las proteínas tardías de adenovirus, los genomas de adenovirus o las placas se miden mediante electrotransferencia de Western, q-PCR o ensayo de placas, respectivamente.

La FIG. 2 es un esquema que muestra un crecimiento viral exponencial. La destrucción oncolítica de todas las células dentro de un tumor requiere un crecimiento viral exponencial. Sin embargo, en la mayoría de los casos, solo un pequeño porcentaje de células tumorales se infectan inicialmente. Por lo tanto, una pequeña diferencia en el número de progenie por ronda de replicación conduce a grandes diferencias en el número total de partículas después de unas pocas rondas de replicación. Se muestra una comparación entre un virus que produce 3 viriones por ciclo y un virus que produce 5 viriones por ciclo. Como se muestra en el gráfico, después de 5 a 6 rondas de replicación, los títulos virales de los dos virus son significativamente diferentes.

La FIG. 3 es un esquema que muestra un flujo de trabajo de ejemplo de un ensayo cinético viral basado en fluorescencia (FBVK). Se produce el plásmido del genoma del virus completo (tal como, mediante Adsembly o AdSLIC) y se utiliza para transfectar un tipo de célula de interés en una placa de múltiples pocillos. Alternativamente, las células se infectan con partículas de adenovirus recombinantes. El genoma del adenovirus comprende al menos un marco de lectura abierto (ORF) que codifica una proteína fluorescente en una ubicación dentro del genoma viral que no altera sustancialmente la cinética de replicación viral. La fluorescencia se monitoriza a lo largo del tiempo para calcular la cinética de replicación viral. Los candidatos a virus oncolíticos son aquellos que exhiben el mayor diferencial en la cinética del virus entre las células tumorales y las células normales.

Las FIG. 4A-4B Bosquejan la configuración del ensayo cinético al comenzar con plásmidos de genoma de adenovirus. Este ensayo no requiere un conocimiento preciso de la eficiencia de la transfección inicial. Las condiciones de transfección se seleccionan para dar como resultado aproximadamente un 5-10% de células transfectadas inicialmente. En el ejemplo mostrado, se utiliza una placa de 48 pocillos, lo que permite analizar 14 construcciones de virus diferentes por triplicado, junto con tres pocillos con infección simulada y tres pocillos con microesferas de FLUORESBRITE™ para compensar la deriva de la sensibilidad de la herramienta. (FIG. 4A) Los pocillos de la mitad superior de la placa de 48 pocillos contienen células transfectadas con plásmidos del genoma de 6 virus diferentes, células con infección simulada y blancos (microesferas de FLUORESBRITE™), cada uno por triplicado. (FIG. 4B) Los pocillos de la mitad inferior de la placa de 48 pocillos contienen células transfectadas con los plásmidos del genoma de 8 virus diferentes por triplicado. La placa de múltiples pocillos se coloca sobre un lector de placas (tal como un lector de placas TECAⁿ ) para la monitorización continua de fluorescencia.

La FIG. 5 bosqueja la configuración del ensayo cinético al comenzar con el virus recombinante. Este ensayo no requiere un conocimiento preciso del título del virus. El virus recombinante se diluye en serie y se utiliza para infectar células sembradas en una placa de múltiples pocillos. En el ejemplo mostrado, se utiliza una placa de 96 pozos y cada virus se diluye 1:100, 1:300, 1:900, 1:2700, 1:8100, 1:24,300, 1:72,900 y 1:218,700, lo que permite la prueba de 11 virus simultáneamente. Cuatro pocillos están infectados de forma simulada y las microesferas de FLUORESBRITE™ se colocan en cuatro pocillos para compensar la sensibilidad y la deriva de la herramienta. La placa de múltiples pocillos se coloca sobre un lector de placas (tal como un lector de placas TECAN) para la monitorización continua de la fluorescencia.

Las FIG. 6A-6C proporcionan una descripción general esquemática de las técnicas Adsembly y AdSLIC para el ensamble combinatorio de adenovirus recombinantes. (FIG. 6A) El genoma del adenovirus se separa en cuatro módulos: E1, Núcleo, E3 y E4. (FIG. 6B) Adsembly implica el reensamble del genoma mediante reacciones de Pasarela de múltiples sitios. (FIG. 6C) AdSLIC utiliza clonación independiente de secuencia y ligamiento (SLIC) para ensamblar módulos de adenovirus.

La FIG. 7 es un gráfico de barras que muestra valores de pendiente ln para adenovirus recombinantes que codifican una proteína fluorescente en la región E1. Se muestran los valores para la construcción de fusión directa YPet-E1A y las construcciones YPet-P2A-E1A, E1A-P2A-mCherry y E1B-55k-P2A-YPet, cada una de las cuales contiene un sitio P2A. La construcción YPet-P2A-ADP se muestra para comparación.

La FIG. 8 es un esquema del análisis e interpretación de datos cinéticos para el ensayo cinético viral basado en fluorescencia.

Las FIGS. 9A-9C son gráficos de barras que muestran valores de pendiente ln para adenovirus recombinantes derivados de Ad5, Ad9 o Ad34 y que contienen un ORF heterólogo 3' del ORF E3-14.7k (o equivalente del mismo en Ad9 y Ad34). Se muestran los valores para Ad5 (E3-14.7k-P2A-YPet; PCMN-887), Ad9 (E3-15k-P2A-YPet; PCMN-888) y Ad34 (E3-14.8k-P2A-YPet; PCMN-889) en células 293 (FIG. 9A), células A549 (FIG. 9B) y células U2OS (FIG.

9C). En cada figura también se muestran valores para virus quiméricos que comprenden un núcleo Ad5 (que incluye E3-14.7k-P2A-YPet) y un eje/nudo de fibra de cualquiera de Ad9 (Ad5/Ad9) o Ad34 (Ad5/Ad34).

Las FIG. 10 secuencias de genomas de adenovirus AdSyn-CO4440 que corresponden a la SEQ ID NO: 68 del documento WO 2016/409201.

Listado de secuencias

La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos del genoma del adenovirus sintético CMBT-379 (YPet-P2A-E1A). La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de nucleótidos del genoma del adenovirus sintético CMBT-432 (E1A-P2A-YPet). La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de nucleótidos del genoma del adenovirus sintético CMBT-456 (E1B-55k-P2A-YPet).

La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de nucleótidos del genoma del adenovirus sintético CMBT-499 (E1B-55k-P2A-mCherry).

La SEQ ID NO: 5 es la secuencia de nucleótidos del genoma del adenovirus sintético CMBT-530 (YPet-P2A-(ADN Poli)).

La SEQ ID NO: 6 es la secuencia de nucleótidos del genoma del adenovirus sintético CMBT-886 (DBP-P2A-YPet). La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de nucleótidos del genoma del adenovirus sintético CMBT-403 (YPet-P2A-ADP). La SEQ ID NO: 8 es la secuencia de nucleótidos del genoma del adenovirus sintético CMBT-429 (ADP-P2A-YPet). La SEQ ID NO: 9 es la secuencia de nucleótidos del genoma del adenovirus sintético PCMN-887 (E3-14.7k-P2A-YPet).

La SEQ ID NO: 10 es la secuencia de nucleótidos del genoma del adenovirus sintético CMBT-457 (YPet-P2A-E4-ORF2).

La SEQ ID NO: 11 es la secuencia de nucleótidos del genoma del adenovirus sintético CMBT-633 (mCherry-P2A-E4-ORF2).

La SEQ ID NO: 12 es la secuencia de nucleótidos del genoma del adenovirus sintético CMBT-407 (YPet-P2A-Fibra). La SEQ ID NO: 13 es la secuencia de nucleótidos del genoma del adenovirus sintético CMBT-445 (Fibra-P2A-YPet). La SEQ ID NO: 14 es la secuencia de aminoácidos de P2A.

La SEQ ID NO: 15 es la secuencia de aminoácidos de F2A.

La SEQ ID NO: 16 es la secuencia de aminoácidos de E2A.

La SEQ ID NO: 17 es la secuencia de aminoácidos de T2A.

La SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoácidos de un P2A modificado que comprende GSG en el terminal N. La SEQ ID NO: 19 es la secuencia de aminoácidos de un F2A modificado que comprende GSG en el terminal N. La SEQ ID NO: 20 es la secuencia de aminoácidos de un E2A modificado que comprende GSG en el terminal N. La SEQ ID NO: 21 es la secuencia de aminoácidos de un T2A modificado que comprende GSG en el terminal N. La SEQ ID NO: 22 es la secuencia de nucleótidos del genoma del adenovirus sintético PCMN-888 (Ad9 E3-15k-P2A-YPet).

La SEQ ID NO: 23 es la secuencia de nucleótidos del genoma del adenovirus sintético PCMN-889 (Ad34 E3-14.8k-P2AYPet).

Descripción detallada

I. Abreviaturas

Ad adenovirus

ADP Proteína de muerte de adenovirus

BFP Proteína fluorescente azul

E2A Virus 2A de rinitis equina A

ELISA Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

ERAV Virus A de la rinitis equina

F2A Virus 2A de fiebre aftosa

FACS Clasificación de células activadas por fluorescencia

FMDV Virus de la fiebre aftosa

GFP Proteína fluorescente verde

MOI multiplicidad de infección

OD Densidad óptica

ORF Marco de lectura abierto

P2A teschovirus-1 2A de porcino

pIX proteína IX

PTV1 teschovirus-1 de porcino

RFP Proteína fluorescente roja

SLIC Clonación independiente de ligamiento y secuencia

T2A Virus 2Ade Thosea asigna

TaV Virus de Thosea asigna

YFP Proteína fluorescente amarilla

II. Términos y métodos

A menos que se indique lo contrario, los términos técnicos se utilizan de acuerdo con el uso convencional. Las definiciones de términos comunes en biología molecular se pueden encontrar en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Para facilitar la revisión de las diversas realizaciones de la divulgación, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos específicos:

Péptido 2A: Un tipo de péptido autoescindible codificado por algunos virus de ARN, tales como los picornavirus. Los péptidos 2A funcionan al hacer que el ribosoma omita la síntesis de un enlace peptídico en el terminal C de un elemento 2A, lo que lleva a la separación entre el extremo de la secuencia 2A y el péptido en dirección descendente (Kim et al., PLoS One 6(4):e18556, 2011). La “escisión” se produce entre los residuos de glicina y prolina que se encuentran en el terminal C del péptido 2A. Péptidos 2A de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, los péptidos 2A codificados por el virus de Thosea asigna (TaV), el virus de la rinitis A equina (ERAV), el teschovirus-1 de porcino (PTV1) y el virus de la fiebre aftosa (FMDV), que son establecidos en el presente documento como las SEQ ID NO: 14-17). En algunas realizaciones, el péptido 2^a comprende Gly-Ser-Gly en el terminal N para mejorar la eficiencia de escisión (SEQ ID NO: 18-21).

Adenovirus: Un virus sin envoltura con un genoma de ADN lineal de doble cadena y una cápside icosaédrica. Actualmente hay 68 serotipos conocidos de adenovirus humanos, que se dividen en siete especies (especies A, B, C, D, E, F y G). Diferentes serotipos de adenovirus están asociados con diferentes tipos de enfermedad, algunos serotipos causan enfermedades respiratorias (principalmente especies B y C), conjuntivitis (especies B y D) y/o gastroenteritis (especies F y G).

Proteína de muerte por adenovirus (ADP): Una proteína sintetizada en las últimas etapas de la infección por adenovirus que media la lisis de las células y la liberación de adenovirus para infectar otras células. La ADP es una glicoproteína de membrana integral de 101 aminoácidos que se localiza en la membrana nuclear, el retículo endoplásmico y Golgi. La ADP se llamaba anteriormente E3-11.6K).

Administración: Para proporcionar o dar a un sujeto un agente, tal como un agente terapéutico (por ejemplo, un virus recombinante), por cualquier ruta eficaz. Rutas de administración de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, inyección (tal como subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intratumoral e intravenosa), rutas oral, intraductal, sublingual, rectal, transdérmica, intranasal, vaginal y de inhalación.

Quimérico: Compuesto por al menos dos partes que tienen diferentes orígenes. En el contexto de la presente divulgación, un “adenovirus quimérico” es un adenovirus que tiene material genético y/o proteínas derivadas de al menos dos serotipos diferentes (tal como Ad5 y un segundo serotipo de adenovirus). En este contexto, un adenovirus de “cápsida intercambiada” se refiere a un adenovirus quimérico en el que las proteínas de la cápside se derivan de un serotipo de adenovirus y las proteínas restantes se derivan de otro serotipo de adenovirus. Del mismo modo, un “fibra quimérica” es una proteína de fibra que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de al menos dos serotipos diferentes de adenovirus. Por ejemplo, una fibra quimérica puede estar compuesta por un eje de fibra de Ad5 y un nudo de fibra de un segundo serotipo de adenovirus. En otro ejemplo, una fibra quimérica se compone de una cola Ad5 y un eje y un nudo de fibra de un segundo serotipo de adenovirus (tal como Ad9 o Ad34).

Contacto: Colocación en asociación física directa; incluye tanto en forma sólida como líquida.

Variante degenerada: En el contexto de la presente divulgación, una “variante degenerada” se refiere a un polinucleótido que codifica un péptido que incluye una secuencia que está degenerada como resultado del código genético. Hay 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales están especificados por más de un codón. Por lo tanto, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas que codifican un péptido se incluyen siempre que no cambie la secuencia de aminoácidos del péptido codificado por la secuencia de nucleótidos.

Suprimido: Un genoma de adenovirus que codifica una proteína “suprimida” (tal como la proteína E4orf1 o E4orf6/7) se refiere a un adenovirus que tiene una supresión completa de la secuencia de codificación de proteínas, o una supresión parcial que da como resultado la ausencia de expresión de proteína.

Desregulación de E2F: Se refiere a un aumento en la actividad del factor de transcripción E2F y los genes diana en dirección descendente, que ocurre en casi todos los tipos de cáncer humano. La desregulación de la actividad y la transcripción de la ruta E2F puede resultar de una variedad de mutaciones diferentes en cualquier componente en dirección ascendente de la ruta, tales como mutaciones y supresiones de pérdida de función en los supresores de tumores Rb, p107 y p130. Rb fue el primer supresor de tumores que se identificó y está ausente o mutado en al menos un tercio de los tumores humanos. Además, las mutaciones de p16 y/o el silenciamiento epigenético pueden activar E2F en células tumorales. Las mutaciones de ciclina D y CDK4, las amplificaciones de genes o sobreexpresión también pueden dar como resultado una actividad de E2F desregulada en tumores humanos. Además, E2F se activa por mutaciones en la ruta del receptor del factor de crecimiento, que incluye EGFR, RTK, RAS, RAF, PI-3K, PTEN, ^r A^f , MYC. Las mutaciones en la ruta p16TINTA4a - ciclina D:cdk4/6-RB-E2F generalmente ocurre de manera mutuamente excluyente, de modo que un “acierto” (por ejemplo, p16) no va acompañado de otros (por ejemplo, mutación Rb o sobreexpresión de ciclina D:cdk). ). Sin embargo, la mayoría de las quimioterapias actuales son venenos proliferativos que inhiben las dianas transcripcionales de E2F, pero también son tóxicos para las células normales y, a menudo, tienen complicaciones iatrogénicas devastadoras. Como se divulga en el presente documento, un enfoque terapéutico alternativo es utilizar un virus que experimenta una replicación lítica selectiva en lesiones de células cancerosas que han desregulado la ruta de p16-ciclina D:cdk4-RB-E2F.

Proteína de unión a ADN (DBP): Esta proteína de adenovirus se une a ADN y ARN de cadena sencilla, así como a ADN de doble cadena. DBP, una proteína de 72 kilodalton, es esencial para la replicación del ADN adenoviral.

E1A: El gen de la región temprana 1A (E1A) del adenovirus y los polipéptidos expresados a partir del gen. La proteína E1A desempeña una función en la replicación del genoma viral al impulsar a las células al ciclo celular. Como se utiliza en el presente documento, el término “proteína E1A” se refiere a las proteínas expresadas a partir del gen E1A y el término incluye las proteínas E1A producidas por cualquier serotipo de adenovirus.

E3-RIDa/RIDp y E3-14.7k: Proteínas de expresión temprana producidas a partir del gen E3. Las proteínas E3-RIDa, E3-RIDp y E3-l4.7k forman el complejo de internalización y degradación del receptor (RID), que se localiza en la membrana nuclear y provoca la endocitosis y la degradación de una variedad de receptores, que incluyen el CD95 (receptor FasL), y TNFR1 y 2 (receptores TNF/TRAIL) para proteger a las células infectadas de las respuestas antivirales del huésped. Las secuencias de codificación E3-RIDa, E3-RIDp y E3-14.7k están una al lado de la otra, en este orden.

E4orfl: Una proteína de adenovirus producida a partir del gen E4. El término “proteína E4orf1” incluye proteínas E4orf1 producidas por el gen E4 de cualquier serotipo de adenovirus.

E4orf6/7: Proteína codificada por el gen E4 del adenovirus. El término “proteína E4orf6/7” incluye proteínas E4orf6/7 producidas por el gen E4 de cualquier serotipo de adenovirus.

Fibra: La proteína de fibra de adenovirus es una proteína trimérica que media en la unión a los receptores de la superficie celular. La proteína de fibra se compone de un eje de terminal N largo y un nudo de terminal C globular.

Proteína fluorescente: Una proteína que emite luz de cierta longitud de onda cuando se expone a una longitud de onda de luz particular. Las proteínas fluorescentes incluyen, pero no se limitan a, proteínas fluorescentes verdes (tales como GFP, EGFP, AcGFPI, Emerald, Superfolder GFP, Azami Green, mWasabi, TagGFP, TurboGFP y ZsGreen), proteínas fluorescentes azules (tales como EBFP, EBFP2, Sapphire, T-Sapphire, Azurite y mTagBFP), proteínas fluorescentes cian (tales como ECFP, mECFP, Cerulean, CyPet, AmCyanl, Midori-Ishi Cyan, mTurquoise y mTFPI), proteínas fluorescentes amarillas (EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, YPet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellowl y mBanana), proteínas fluorescentes naranjas (Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2 y mTangerine), proteínas fluorescentes rojas (mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2, mRFPI, JRed, mCherry, HcRedl, mRaspberry, dKeima-Tandem, HcRed-Tandem, mPlum, AQ143, tdTomato y E2-Crimson), proteínas de fluorescencia naranja/roja (dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express (T1) y DsRed-Monómero) y versiones modificadas de las mismas.

Proteína de fusión: Una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos de al menos dos proteínas o péptidos diferentes (heterólogos). Las proteínas de fusión se pueden generar, por ejemplo, mediante la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos manipulada por ingeniería a partir de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican al menos una porción de dos proteínas diferentes (heterólogas). Para crear una proteína de fusión, las secuencias de ácidos nucleicos deben estar en el mismo marco de lectura y no contener codones de terminación internos. Las proteínas de fusión, particularmente las proteínas de fusión cortas, también se pueden generar mediante síntesis química.

Heterólogo: Una proteína o polipéptido heterólogo se refiere a una proteína o polipéptido derivado de una fuente o especie diferente.

Hexón: Una de las principales proteínas de la cápside de adenovirus.

Inmunomodulador: Un agente que altera (por ejemplo, activa, potencia o suprime) el sistema inmunológico. Los inmunomoduladores incluyen, entre otros, citocinas (tales como interleucina 2 (IL-2), IL-7, IL-12, GM-CSF, ligando FLT3 o interferones), quimiocinas (tales como CCL3, CCL26, CXCL7, CXCL9 y CXCL10), ligandos activadores de células T (tales como anticuerpos anti-CD3 o aloantígenos), moléculas coestimuladoras (tales como B7.1/B7.2, OX40L, 4-1-BBL o CD40L), inhibidores del bloqueo de puntos de control (tales como como anti-PD-1 o anti-CTLA4 Abs), e inmunomoduladores de molécula pequeña.

Aislado: Un componente biológico “aislado” (tal como una molécula de ácido nucleico, una proteína, un virus o una célula) se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biológicos en la célula o tejido del organismo, o en el propio organismo, en el que se produce el componente de forma natural, tal como otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, proteínas y células. Las moléculas de ácido nucleico y las proteínas que se han “aislado” incluyen aquellas purificadas mediante métodos de purificación estándar. El término también abarca moléculas de ácido nucleico y proteínas preparadas por expresión recombinante en una célula huésped, así como moléculas de ácido nucleico y proteínas sintetizadas químicamente.

Modificación: Un cambio en la secuencia de un ácido nucleico o secuencia de proteínas. Por ejemplo, las modificaciones de la secuencia de aminoácidos incluyen, por ejemplo, sustituciones, inserciones y supresiones, o combinaciones de las mismas. Las inserciones incluyen fusiones de terminal amino y/o carboxilo, así como inserciones intrasecuenciales de residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Las supresiones se caracterizan por la eliminación de uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de la proteína. En algunas realizaciones del presente documento, la modificación (tal como una sustitución, inserción o supresión) da como resultado un cambio en la función, como una reducción o potenciación de una actividad particular de una proteína. Como se utiliza en el presente documento, “A” o “delta” se refieren a una supresión. Las modificaciones sustitutivas son aquellas en las que se ha eliminado al menos un residuo y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Las sustituciones de aminoácidos son normalmente de residuos únicos, pero pueden ocurrir en varios lugares diferentes a la vez. Se pueden combinar sustituciones, supresiones, inserciones o cualquier combinación de las mismas para llegar a una secuencia mutante final. Estas modificaciones se pueden preparar mediante la modificación de nucleótidos en el ADN que codifica la proteína, produciendo así ADN que codifica la modificación. Las técnicas para realizar mutaciones de inserción, supresión y sustitución en sitios predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas en la técnica. Una proteína, ácido nucleico o virus “modificado” es uno que tiene una o más modificaciones como se señaló anteriormente.

Neoplasia, malignidad, cáncer y tumor: Una neoplasia es un crecimiento anormal de tejido o células que resulta de una división celular excesiva. El crecimiento neoplásico puede producir un tumor. La cantidad de un tumor en un individuo es la “carga tumoral” que se puede medir como el número, volumen o peso del tumor. Un tumor que no hace metástasis se denomina “benigno”. Un tumor que invade el tejido circundante y/o puede hacer metástasis se denomina “maligno”. Los tumores malignos también se denominan “cáncer”.

Los cánceres hematológicos son cánceres de la sangre o de la médula ósea. Ejemplos de cánceres hematológicos (o hematógenos) incluyen leucemias, que incluyen las leucemias agudas (tales como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda y mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucémica), leucemias crónicas (tales como leucemia mielocítica crónica (granulocítica), leucemia mielógena crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (formas indolentes y de alto grado), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas, síndrome mielodisplásico, leucemia de células pilosas y mielodisplasia. En algunos casos, los linfomas se consideran tumores sólidos.

Los tumores sólidos son masas anormales de tejido que generalmente no contienen quistes ni áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. Los diferentes tipos de tumores sólidos se denominan según el tipo de células que los forman (tales como sarcomas, carcinomas y linfomas). Los ejemplos de tumores sólidos, tales como sarcomas y carcinomas, incluyen fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, osteosarcoma y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, malignidad linfoide, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cánceres de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células epidermoides, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, feocromocitomas carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, neoplasias infectadas por el virus del papiloma humano (VPH), adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, seminoma, carcinoma de vejiga, melanoma y tumores del SNC (tales como un glioma (tal como glioma del tronco encefálico y gliomas mixtos), glioblastoma (también conocido como glioblastoma multiforme) ast rocitoma, linfoma del SNC, germinoma, meduloblastoma, craneofaryogioma de Schwannoma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma y metástasis cerebral).

Virus oncolítico: Un virus que destruye selectivamente células de un trastorno proliferativo, por ejemplo, células cancerosas/tumorales. La muerte de las células cancerosas se puede detectar mediante cualquier método establecido en la técnica, como determinar el recuento de células viables o detectar el efecto citopático, la apoptosis o la síntesis de proteínas virales en las células cancerosas, (por ejemplo, mediante marcado metabólico, inmunotransferencia o RT-PCR de genes virales necesarios para la replicación), o reducción del tamaño de un tumor.

Ligado operativamente: Una primera secuencia de ácidos nucleicos se liga operativamente con una segunda secuencia de ácidos nucleicos cuando la primera secuencia de ácidos nucleicos se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor se liga operativamente a una secuencia de codificación si el promotor afecta la transcripción o expresión de la secuencia de codificación. Generalmente, las secuencias de ADN ligadas operativamente son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, en el mismo marco de lectura.

Portador farmacéuticamente aceptable: Los portadores (vehículos) farmacéuticamente aceptables útiles en esta divulgación son convencionales Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para el suministro farmacéutico de uno o más compuestos, moléculas o agentes terapéuticos (por ejemplo, un virus recombinante divulgado en el presente documento).

En general, la naturaleza del portador dependerá del modo particular de administración que se emplee. Por ejemplo, las formulaciones parenterales usualmente comprenden fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como vehículo. Para composiciones sólidas (por ejemplo, formas de polvo, píldora, comprimido o cápsula), los portadores sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de los portadores biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas a administrar pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes tamponadores del pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.

Polipéptido, péptido o proteína: Un polímero en el que los monómeros son residuos de aminoácidos que se unen mediante enlaces amida. Cuando los aminoácidos son alfa-aminoácidos, se puede utilizar el isómero L-óptico o el isómero D-óptico. Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se utilizan indistintamente en el presente documento. Estos términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural. El término “residuo” o “residuo de aminoácido” incluye la referencia a un aminoácido que se incorpora a una proteína, polipéptido o péptido.

Una sustitución conservadora en un polipéptido es una sustitución de un residuo de aminoácido en una secuencia de proteínas por un residuo de aminoácido diferente que tiene propiedades bioquímicas similares. Normalmente, las sustituciones conservadoras tienen poco o ningún impacto sobre la actividad de un polipéptido resultante. Por ejemplo, una proteína o péptido que incluye una o más sustituciones conservadoras (por ejemplo, no más de 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones) retiene la estructura y función de la proteína o péptido de tipo silvestre. Se puede producir un polipéptido para que contenga una o más sustituciones conservadoras al manipular la secuencia de nucleótidos que codifica ese polipéptido utilizando, por ejemplo, procedimientos estándar tales como mutagénesis dirigida al sitio o PCR. En un ejemplo, dichas variantes se pueden seleccionar fácilmente al probar la reactividad cruzada del anticuerpo o su capacidad para inducir una respuesta inmunitaria. A continuación, se muestran ejemplos de sustituciones conservadoras.

Residuo Original Sustituciones Conservadoras

Ala Ser

Arg Lys

Asn Gln, His

Asp Glu

Cys Ser

Gln Asn

Glu Asp

Residuo Original Sustituciones Conservadoras

His Asn; Gln

Ile Leu, Val

Leu Ile; Val

Lys Arg; Gln; Glu

Met Leu; Ile

Phe Met; Leu; Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp; Phe

Val Ile; Leu

Las sustituciones conservadoras generalmente mantienen (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una hoja o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) la mayor parte de la cadena lateral.

Las sustituciones que en general se espera que produzcan los mayores cambios en las propiedades de las proteínas serán no conservadoras, por ejemplo cambios en los que (a) un residuo hidrofílico, por ejemplo, serilo o treonilo, se sustituye por (o mediante) un residuo hidrofóbico, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o prolina se sustituye por (o mediante) cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo o histadilo, se sustituye por (o mediante) un residuo electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por (o mediante) uno que no tiene una cadena lateral, por ejemplo, glicina.

Prevenir, tratar o mejorar una enfermedad: “Prevenir” una enfermedad se refiere a inhibir el pleno desarrollo de una enfermedad. “Tratar” se refiere a una intervención terapéutica que mejora un signo o síntoma de una enfermedad o afección patológica después de que ha comenzado a desarrollarse. “Mejorar” se refiere a la reducción en el número o la gravedad de los signos o síntomas de una enfermedad.

Promotor: Una región de ADN que dirige/inicia la transcripción de un ácido nucleico (por ejemplo, un gen). Un promotor incluye secuencias de ácidos nucleicos necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripción. Normalmente, los promotores se ubican cerca de los genes que transcriben. Un promotor también incluye opcionalmente elementos potenciadores o represores distales que se pueden ubicar hasta varios miles de pares de bases desde el sitio de inicio de la transcripción. Un “promotor constitutivo” es un promotor que está continuamente activo y no está sujeto a regulación por señales o moléculas externas. Por el contrario, la actividad de un “promotor inducible” está regulada por una señal o molécula externa (por ejemplo, un factor de transcripción o tetraciclina).

Proteína IX (pIX): Un componente menor de la cápside del adenovirus que se asocia con la proteína hexón.

Purificado: El término “purificado” no requiere pureza absoluta; más bien, se entiende como un término relativo. Por lo tanto, por ejemplo, un péptido, proteína, virus u otro compuesto activo purificado es aquel que se aísla en su totalidad o en parte a partir de proteínas asociadas de forma natural y otros contaminantes. En ciertas realizaciones, el término “sustancialmente purificado” se refiere a un péptido, proteína, virus u otro compuesto activo que se ha aislado de una célula, medio de cultivo celular u otra preparación cruda y sometido a fraccionamiento para eliminar varios componentes de la preparación inicial, tal como proteínas, desechos celulares y otros componentes.

Recombinante: Una molécula de ácido nucleico recombinante, una proteína o un virus es uno que tiene una secuencia que no se produce de forma natural o tiene una secuencia que se produce mediante una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo. Esta combinación artificial se puede lograr mediante síntesis química o mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de moléculas de ácido nucleico, como por ejemplo mediante técnicas de ingeniería genética. El término “recombinante” también incluye ácidos nucleicos, proteínas y virus que han sido alterados únicamente por adición, sustitución o supresión de una porción de la molécula de ácido nucleico, proteína o virus natural.

Defectos de replicación: Un adenovirus que exhibe “defectos de replicación” en una célula no tumoral (en comparación con una célula tumoral) se refiere a un adenovirus que exhibe una replicación viral reducida en células normales en comparación con las células tumorales. Los defectos de replicación se evidencian, por ejemplo, por la falta de expresión tardía de proteínas virales, una reducción en la síntesis de ADN viral, una capacidad reducida para inducir genes diana E2F (por ejemplo, ciclina A y B), una capacidad reducida para provocar la entrada en la fase S y/o una capacidad reducida para inducir la destrucción celular en células normales en comparación con las células tumorales.

Virus de replicación deficiente: Un virus que inhibe preferentemente la proliferación celular, provoca la lisis celular o induce la apoptosis (considerada colectivamente como destrucción) en una población celular predeterminada con un fenotipo determinado (por ejemplo, células tumorales con una ruta de E2F desregulada). Dichos virus no pueden o tienen una capacidad limitada para reducir o inhibir la proliferación celular, causar lisis celular, inducir apoptosis o replicarse de otro modo en células que no tienen el fenotipo celular predeterminado (tales como células normales no tumorales).

Péptidos autoescindibles: Péptidos que inducen al ribosoma a omitir la síntesis de un enlace peptídico en el terminal C, lo que lleva a la separación de la secuencia de péptidos y un polipéptido en dirección descendente. Los péptidos 2A codificados viralmente son un tipo de péptido autoescindible. Los péptidos 2A codificados viralmente incluyen, por ejemplo, péptidos 2A del teschovirus-1 de porcino (PTV1), virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la rinitis A equina (ERAV) y virus de Thosea asigna (TaV).

Identidad de secuencia: La identidad o similitud entre dos o más secuencias de ácidos nucleicos, o dos o más secuencias de aminoácidos, se expresa en términos de identidad o similitud entre las secuencias. La identidad de secuencia se puede medir en términos de identidad porcentual; cuanto mayor es el porcentaje, más idénticas son las secuencias. La similitud de secuencia se puede medir en términos de similitud porcentual (que tiene en cuenta las sustituciones de aminoácidos conservadoras); cuanto mayor es el porcentaje, más similares son las secuencias. Los homólogos u ortólogos de secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos poseen un grado relativamente alto de identidad/similitud de secuencias cuando se alinean utilizando métodos estándar. Esta homología es más significativa cuando las proteínas ortólogas o los ADNc se derivan de especies que están más estrechamente relacionadas (tales como las secuencias humanas y de ratón), en comparación con las especies más distantes (tales como las secuencias humanas y de C. elegantes).

Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Varios programas y algoritmos de alineación se describen en: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al, Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; and Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990, presentan una consideración detallada de los métodos de alineación de secuencias y los cálculos de homología.

La Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica (BLAST) del NCBI (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990) está disponible en varias fuentes, que incluyen el Centro Nacional de Información Biológica (NCBI) y en Internet, para uso en relación con los programas de análisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Se puede encontrar información adicional en el sitio web del NCBI.

Serotipo: Grupo de microorganismos estrechamente relacionados (tales como los virus) que se distinguen por un conjunto característico de antígenos.

Sujeto: Organismos vertebrados multicelulares vivos, una categoría que incluye mamíferos humanos y no humanos.

Sintético: Producido por medios artificiales en un laboratorio, por ejemplo, un ácido nucleico sintético o una proteína se pueden sintetizar químicamente en un laboratorio.

Agente terapéutico: Cualquier agente capaz de inducir un efecto terapéutico o profiláctico deseado cuando se administra adecuadamente a un sujeto. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, compuestos químicos, moléculas pequeñas, virus recombinantes, compuestos antisentido, anticuerpos (o fragmentos de unión a antígeno de los mismos), péptidos o moléculas de ácido nucleico. Por ejemplo, los agentes terapéuticos para tratar el cáncer incluyen agentes que previenen o inhiben el crecimiento tumoral, el desarrollo tumoral o la metástasis tumoral. “Proteínas terapéuticas” son agentes terapéuticos que son proteínas o péptidos, que incluyen anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunas realizaciones del presente documento, la proteína terapéutica es un inmunomodulador. En otras realizaciones, la proteína terapéutica comprende una toxina, Fas o FasL, un factor de muerte soluble, un mediador de la destrucción inespécifica, un antígeno tumoral, un neoantígeno o un aloantígeno.

Cantidad terapéuticamente eficaz: Una cantidad de un agente farmacéutico o terapéutico especificado (por ejemplo, un virus recombinante) suficiente para lograr un efecto deseado en un sujeto, o en una célula, que se está tratando con el agente. La cantidad eficaz del agente puede depender de varios factores, que incluyen, pero no se limitan a, el sujeto o las células que se tratan y la forma de administración de la composición terapéutica.

Whexon: Un marco de lectura abierto ubicado sobre la hebra / (transcripción hacia la izquierda) entre la región E3 temprana y el gen de la fibra (Tollefson et al., J Virol 81(23):12918-12926).

A menos que se explique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos con conocimientos básicos en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Los términos singulares “un”, “una” y “el” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. “Que comprende A o B” significa que incluye A, o B, o A y B. Además, se debe entender que todos los tamaños de bases o tamaños de aminoácidos, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, proporcionados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados., y se proporcionan para la descripción. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o prueba de la presente divulgación, a continuación, se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente especificación, que incluye las explicaciones de los términos. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos.

III. Descripción general de las realizaciones

En el presente documento se describen genomas de adenovirus recombinantes que incluyen un marco de lectura abierto heterólogo (ORF) y una secuencia de codificación del péptido autoescindible. El ORF heterólogo puede codificar, por ejemplo, una proteína terapéutica (tal como un inmunomodulador). Los genomas de adenovirus recombinantes y los adenovirus recombinantes producidos por los genomas divulgadosse pueden utilizar, por ejemplo, en una variedad de aplicaciones terapéuticas diferentes, tales como el tratamiento del cáncer.

En el presente documento se proporcionan genomas de adenovirus recombinantes que incluyen un ORF heterólogo y una secuencia de codificación del péptido autoescindible, ambos ligados operativamente y en el mismo marco de lectura que un ORF de adenovirus endógeno. La secuencia de codificación del péptido autoescindible se localiza entre el ORF heterólogo y el ORF endógeno. En algunas realizaciones, el ORF endógeno es E1B-55k y el ORF heterólogo es 3' de E1B-55k en el que dicho ORF heterólogo no es una proteína de fusión de ligando a FKBP dirigida cuando el péptido autoescindible es P2A; el ORF endógeno es polimerasa de ADN y el ORF heterólogo es 5' de polimerasa de ADN; el ORF endógeno es proteína de muerte de adenovirus (ADP) y el ORF heterólogo es 5' de ADP en el que dicho ORF heterólogo no es una proteína de fusión de ligando a FKBP dirigida cuando el péptido autoescindible es P2A, y en el que dicho genoma de adenovirus no es AdSyn-CO4440 definido por la secuencia de la Figura 10 que comprende EGFRVHH-GS-FKBP y P2A 5' de ADP; el ORF endógeno es E4-ORF2 y el ORF heterólogo es 5' de E4-ORF2; o el ORF endógeno es fibra y el ORF heterólogo es 3' de fibra. El ORF heterólogo codifica una proteína terapéutica. El péptido autoescindible es un péptido 2A o una variante del mismo, como se define en las reivindicaciones. En algunos ejemplos, el péptido 2A incluye un péptido 2A (P2A) del teschovirus-1 de porcino (PTV1), un péptido 2A (F2A) del virus de la fiebre aftosa (FMDV), un péptido 2A (E2A) del virus de la rinitis A equina (ERAV) o un péptido (TaV) 2A (T2A) del virus Thosea asigna, o una variante del mismo. En ejemplos particulares, la secuencia de péptidos P2A es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 18. En algunos ejemplos, la variante del péptido 2A comprende una secuencia de aminoácidos adicional (tal como GSG) en el terminal N.

En ejemplos particulares, la secuencia de péptidos F2A es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 19. En ejemplos particulares, la secuencia de péptidos E2A es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 20. En ejemplos particulares, la secuencia de péptidos T2A es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 21. En ejemplos específicos no limitantes, el péptido autoescindible comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 14-21.

En algunos ejemplos, el adenovirus es un adenovirus tipo 5 (Ad5). En otros ejemplos, el adenovirus es un Ad2, Ad3, Ad9, Ad11, Ad12 o Ad34. En todavía otros ejemplos, el adenovirus es un adenovirus quimérico, tal como, pero no limitado a, un adenovirus quimérico Ad5/Ad9 o Ad5/Ad34.

Además, en el presente documento se proporcionan adenovirus recombinantes que incluyen un genoma del adenovirus recombinante descrito en el presente documento.

Los adenovirus recombinantes (y los genomas de adenovirus recombinantes) proporcionados en el presente documento incluyen opcionalmente modificaciones adicionales, como dirigir el virus a tipos de células específicos, inhibir la orientación y la replicación en el hígado, permitir la replicación selectiva en células tumorales y evadir anticuerpos neutralizantes preexistentes contra los serotipos comunes de adenovirus. Las modificaciones adicionales pueden variar dependiendo del uso deseado del adenovirus recombinante. Las modificaciones de adenovirus se describen, por ejemplo, en los documentos WO 2016/049201 WO 2012/024350, WO 2013/138505 y WO 2014/153204.

La presente divulgación también proporciona composiciones que incluyen un genoma del adenovirus recombinante, o un adenovirus recombinante, y un portador farmacéuticamente aceptable.

También se divulgan en el presente documento, pero no se reivindican, métodos para suministrar una proteína terapéutica a un sujeto. En algunos ejemplos, el método incluye administrar al sujeto un genoma del adenovirus recombinante, un adenovirus recombinante o una composición divulgada en el presente documento. En estos métodos, el ORF heterólogo del adenovirus recombinante o del genoma del adenovirus recombinante codifica la proteína terapéutica.

La solicitud divulga, pero no reivindica, métodos para reducir o inhibir la viabilidad de las células tumorales y/o el crecimiento de las células tumorales (por ejemplo, una reducción de al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 75 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 98 %, en comparación con la ausencia de la terapia divulgada). En algunos ejemplos, el método incluye poner en contacto la célula tumoral con un genoma del adenovirus recombinante, un adenovirus recombinante o una composición divulgada en el presente documento. En estos métodos, el ORF heterólogo codifica una proteína terapéutica. En algunos ejemplos, el método es un método in vitro. En otros ejemplos, el método es un método in vivo y el contacto con la célula tumoral incluye administrar el genoma del adenovirus recombinante, el adenovirus recombinante o la composición a un sujeto con un tumor.

Los métodos para reducir o inhibir la progresión del tumor, tal como reducir el número y/o el tamaño de una metástasis, o reducir el volumen del tumor en un sujeto, se divulgan adicionalmente en el presente documento (por ejemplo, una reducción de al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 75 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 98 %, en comparación con la ausencia de la terapia divulgada). En algunos ejemplos, el método incluye administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un genoma del adenovirus recombinante, un adenovirus recombinante o una composición divulgada en el presente documento. En estos métodos, el ORF heterólogo codifica una proteína terapéutica.

Además, se divulgan, pero no se reivindican, métodos para tratar el cáncer en un sujeto. En algunos ejemplos, el método incluye administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un genoma del adenovirus recombinante, un adenovirus recombinante o una composición divulgada en el presente documento. En estos métodos, el ORF heterólogo codifica una proteína terapéutica.

En algunos ejemplos del presente documento, el método incluye además la administración de un agente terapéutico adicional al sujeto. Por ejemplo, el agente terapéutico adicional puede incluir un agente anticancerígeno, tal como un agente quimioterapéutico, un biológico (tal como un anticuerpo o fragmento del mismo, tal como un anticuerpo monoclonal) o una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula de ácido nucleico inhibidora) u otro tratamiento terapéutico, tal como la resección quirúrgica de un tumor o la irradiación de un tumor.

También se proporcionan en el presente documento kits que incluyen un genoma del adenovirus recombinante, un adenovirus recombinante o una composición divulgada en el presente documento; y uno o más agentes terapéuticos adicionales y/o uno o más agentes de diagnóstico. En algunas realizaciones, uno o más agentes terapéuticos adicionales incluyen un agente quimioterapéutico, biológico o combinaciones de los mismos. En algunos ejemplos, uno o más agentes de diagnóstico incluyen uno o más anticuerpos o moléculas de ácido nucleico específicas para un marcador tumoral, o una sonda de imagen que se puede utilizar para rastrear el virus o las células tumorales in vitro o in vivo.

IV. Colocación óptima de ORF exógenos

El genoma del adenovirus de 36 kb es compacto y utiliza tanto la hebra superior como la inferior para la codificación de varios genes. En muchos lugares dentro del genoma del adenovirus, tanto la hebra superior como la inferior se utilizan simultáneamente para codificar genes separados. El tamaño del genoma ha evolucionado para ser óptimo para la inserción en su cápside. Como resultado, la inserción de genes exógenos está limitada por la capacidad de tamaño de la cápside, ya que la adición excesiva de ácido nucleico exógeno conduce a una carga genómica incompleta en la cápside y una cinética viral reducida.

Una solución al desafío presentado por el espacio disponible limitado en el genoma del adenovirus es localizar marcos de lectura abiertos (ORF) exógenos como productos de fusión dentro de los ORF de adenovirus nativos. Esta estrategia utiliza promotores de adenovirus, 5'UTR y colas poliA ya codificadas en el genoma. Sin embargo, la expresión de una fusión entre una proteína de adenovirus nativa y una proteína exógena puede ser perjudicial para una o ambas funciones de la proteína y conducir a una disminución significativa en la cinética de replicación de adenovirus.

La presente divulgación proporciona una solución a este problema al utilizar una secuencia de péptidos autoescindibles colocada entre el ORF nativo (endógeno) y el ORF exógeno (heterólogo). Cuando se coloca entre los dos ORF en un solo ARNm, la presencia de la secuencia de péptidos autoescindibles conduce a la omisión del ribosoma y la liberación de la primera proteína separada de la segunda proteína. En algunas realizaciones divulgadas en el presente documento, el péptido autoescindible es un péptido 2A (P2A).

También se divulga en el presente documento la identificación de sitios de ubicación óptimos para ORF heterólogos dentro del genoma del adenovirus. La combinación de la secuencia de péptidos autoescindibles y la colocación juiciosa del ORF heterólogo conduce a una alta expresión y un impacto mínimo o nulo en la cinética viral.

Como se describe en el Ejemplo 1 a continuación, se identificaron varios sitios dentro del genoma del adenovirus que tras la inserción de un ORF heterólogo no inhibían la cinética de replicación del adenovirus. En particular, se determinó que un ORF heterólogo podría insertar el terminal C en el ORF de E1B-55k, el terminal N en el ORF de la polimerasa de ADN, el terminal C en el ORF de DBP, el terminal N en el ORF de ADP, el terminal C en el ORF de E3-14.7k o el terminal N en E4-ORF2. En cada caso, se insertó una secuencia de péptidos autoescindibles (sitio P2A) entre el ORF del adenovirus y el ORF heterólogo. Se divulga además en el presente documento que la inserción de un terminal C en el ORF heterólogo en la fibra produjo un adenovirus defectuoso en la replicación; sin embargo, el virus recombinante fue capaz de producir niveles extraordinariamente altos de proteína heteróloga en células infectadas, lo que podría resultar útil en varias aplicaciones terapéuticas.

Por lo tanto, la presente divulgación contempla el uso de los siguientes adenovirus recombinantes para aplicaciones terapéuticas (donde “SC” se refiere a una secuencia que codifica un péptido autoescindible, tal como P2A):

E1B-55k-SC-ORF heterólogo

ORF-SC- heterólogo (polimerasa de ADN)

DBP-SC-ORF heterólogo

ORF heterólogo -SC-ADP

E3-14.7k-SC-ORF heterólogo

ORF heterólogo -SC-E4-ORF2

fibra-SC-ORF heterólogo

El péptido autoescindible es un péptido 2A codificado viralmente, o una versión modificada del mismo, como se describe adicionalmente a continuación.

V. Secuencias de péptidos autoescindibles

Los péptidos autoescindibles son péptidos que inducen al ribosoma a omitir la síntesis de un enlace peptídico en el terminal C, lo que conduce a la separación de la secuencia de péptidos y un polipéptido en dirección descendente. El uso de péptidos autoescindibles permite la expresión de múltiples proteínas que flanquean el péptido autoescindible a partir de un único ORF. Los péptidos 2A codificados viralmente son un tipo de péptido autoescindible.

Al igual que con otros péptidos autoescindibles, los péptidos 2A funcionan al hacer que el ribosoma omita la síntesis de un enlace peptídico en el terminal C de un elemento 2a , lo que lleva a la separación entre el extremo de la secuencia 2A y el péptido en dirección descendente (Kim et al., PLoS One 6(4):e18556, 2011). La “escisión” se produce entre los residuos de glicina y prolina encontrados en el terminal C del péptido 2A. Péptidos 2A de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, los péptidos 2A codificados por el virus de Thosea asigna (TaV), el virus de la rinitis A equina (ERAV), el teschovirus-1 de porcino (PTV1) y el virus de la fiebre aftosa (FMDV), o versiones modificadas de los mismos

En ejemplos particulares en el presente documento, el péptido 2A comprende PTV1 2A (P2A), FMDV 2A (F2A), ERAV 2A (E2A) o TaV 2A (T2A), cuyas secuencias se muestran a continuación y se exponen en el presente documento como las SEQ ID NO: 14-17.

P2A: ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 14)

F2A: VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 15)

E2A: QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 16)

T2A: EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 17)

En algunos ejemplos, el péptido 2A se modifica para incluir Gly-Ser-Gly en el terminal N para mejorar la eficacia de la escisión. Las secuencias de P2A, F2A, E2A y T2A modificadas se muestran a continuación y se exponen en el presente documento como las SEQ ID NO: 14-17.

P2A modificado: GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18)

F2A modificado: GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 19)

E2A modificado: GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 20)

T2A modificado: GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 21)

En algunas realizaciones, el polipéptido 2A es una variante de un polipéptido 2A divulgado en el presente documento. Las variantes pueden incluir secuencias de polipéptidos que tienen al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o más, de identidad de secuencia con un polipéptido 2A de tipo silvestre o modificado divulgado en el presente documento. Las variantes pueden incluir, por ejemplo, una supresión de al menos un aminoácido de terminal N desde el polipéptido 2A de una cualquiera de las SEQ ID NO: 14-21, por ejemplo, una supresión de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, que incluyen rangos entre cualquiera de los dos valores enumerados. Las variantes pueden incluir una supresión de al menos un aminoácido de terminal C desde el polipéptido 2A de una cualquiera de las SEQ ID NO: 14-21, por ejemplo, una supresión de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, que incluyen rangos entre cualquiera de los dos valores enumerados. Las variantes también pueden incluir, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones de aminoácidos conservadoras.

VI. Composiciones farmacéuticas

En el presente documento se proporcionan composiciones que comprenden un adenovirus recombinante o un genoma del adenovirus recombinante. Las composiciones son, opcionalmente, adecuadas para la formulación y administración in vitro o in vivo. Opcionalmente, las composiciones comprenden uno o más de los agentes proporcionados y un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores adecuados y sus formulaciones se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd edición, Loyd V. Allen et al., editors, Pharmaceutical Press (2012). Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen materiales que no son indeseables desde el punto de vista biológico o de otro tipo, es decir, el material se administra a un sujeto sin causar efectos biológicos indeseables o interactuar de manera perjudicial con los otros componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido. Si se administra a un sujeto, el portador se selecciona opcionalmente para minimizar la degradación del ingrediente activo y minimizar los efectos secundarios adversos en el sujeto.

Los virus recombinantes (o uno o más ácidos nucleicos o vectores que codifican el adenovirus recombinante) se administran de acuerdo con métodos conocidos, tal como la administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o por infusión continua durante un período de tiempo, por ruta intramuscular, intraperitoneal, vías intracerobroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, intratumoral o por inhalación. La administración puede ser local o sistémica. Las composiciones se pueden administrar a través de cualquiera de varias rutas de administración, que incluyen por vía tópica, oral, parenteral, intravenosa, intraarticular, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavitaria, transdérmica, intrahepática, intracraneal, nebulización/inhalación o mediante instalación a través de broncoscopia. Por lo tanto, las composiciones se administran de varias formas dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área que se va a tratar.

En algunas realizaciones, las composiciones incluirán un adenovirus recombinante (o genoma recombinante) como se describe en el presente documento disuelto en un portador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un portador acuoso. Se puede utilizar una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, solución salina tamponada y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de materia indeseable. Estas composiciones se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes tamponadores y reguladores del pH, agentes reguladores de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración de agente activo en estas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionará principalmente en base a los volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del sujeto.

Las formulaciones farmacéuticas, en particular, de los virus recombinantes se pueden preparar al mezclar el adenovirus recombinante (o uno o más ácidos nucleicos que codifican el adenovirus recombinante) que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales. Dichas formulaciones pueden ser formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas.

Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones utilizadas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables pueden ser acetato, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico), conservantes, polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas, tales como albúmina sérica o gelatina, o polímeros hidrofílicos tales como polivinilpillidona; y aminoácidos, monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes; y tensioactivos iónicos y no iónicos (por ejemplo, polisorbato); contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos. El adenovirus recombinante (o uno o más ácidos nucleicos que codifican el adenovirus recombinante) se puede formular en cualquier concentración apropiada de unidades infecciosas.

Las formulaciones adecuadas para la administración oral pueden consistir en (a) soluciones líquidas, tales como una cantidad eficaz del adenovirus recombinante suspendido en diluyentes, tales como agua, solución salina o PEG 400; (b) cápsulas, bolsitas o comprimidos, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo, como líquidos, sólidos, gránulos o gelatina; (c) suspensiones en un líquido apropiado; y (d) emulsiones adecuadas. Las formas de comprimidos pueden incluir uno o más de lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, fosfatos de calcio, almidón de maíz, almidón de patata, celulosa microcristalina, gelatina, dióxido de silicio coloidal, talco, estearato de magnesio, ácido esteárico y otros excipientes, colorantes, rellenos, aglutinantes, diluyentes, agentes amortiguadores, agentes humectantes, conservantes, agentes aromatizantes, tintes, agentes disgregantes y portadores farmacéuticamente compatibles. Las formas de pastillas para chupar pueden comprender el ingrediente activo en un sabor, por ejemplo, sacarosa, así como pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte, tal como gelatina y glicerina o sacarosa y emulsiones de acacia, geles y similares que contienen, además del ingrediente activo, portadores conocidos en la técnica.

El adenovirus recombinante (o uno o más ácidos nucleicos que codifican el adenovirus recombinante), solo o en combinación con otros componentes adecuados, se puede convertir en formulaciones de aerosol. (es decir, pueden “nebulizarse”) para administrarse por inhalación. Las formulaciones de aerosol se pueden colocar en propelentes aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral, como, por ejemplo, por ruta intraarticular (en las articulaciones), intravenosa, intramuscular, intratumoral, intradérmica, intraperitoneal y subcutánea, incluyen soluciones inyectables isotónicas estériles, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes., tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, espesantes, estabilizadores y conservantes. En los métodos proporcionados, las composiciones se pueden administrar, por ejemplo, por infusión intravenosa, por vía oral, tópica, intraperitoneal, intravesical, intratumoral o intratecal. La administración parenteral, la administración intratumoral y la administración intravenosa son los métodos de administración preferidos. Las formulaciones de los compuestos se pueden presentar en recipientes de dosis única o múltiples dosis sellados, tales como ampollas y viales.

Las soluciones y suspensiones para inyección se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente. Las células transducidas o infectadas por adenovirus o transfectadas con ácidos nucleicos para la terapia ex-vivo también se puede administrar por vía intravenosa o parenteral como se describió anteriormente.

En algunos ejemplos, la preparación farmacéutica está en forma de dosificación unitaria. En dicha forma, la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en una variedad de formas de dosificación unitaria dependiendo del método de administración. Por ejemplo, las formas de dosificación unitaria adecuadas para administración oral incluyen, pero no se limitan a, polvo, tabletas, píldoras, comprimidos y pastillas para chupar.

VIII. Métodos de tratamiento

Los adenovirus recombinantes, los genomas de adenovirus recombinantes y las composiciones divulgadas en el presente documento se pueden administrar para tratamiento terapéutico o profiláctico. En particular, se proporcionan métodos para reducir o inhibir la viabilidad o el crecimiento de células tumorales en un sujeto, reducir o inhibir la progresión del tumor en un sujeto, reducir el número de metástasis, reducir el tamaño y/o el volumen de una metástasis, reducir el tamaño del tumor y/o o volumen en un sujeto y/o tratar el cáncer en un sujeto. La solicitud divulga, pero no reivindica, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un adenovirus recombinante o genoma del adenovirus recombinante (o composición del mismo) al sujeto. Como se describe a lo largo de todo el documento, el adenovirus o la composición farmacéutica se administra en cualquier serie de formas, que incluyen, entre otras, por vía intravenosa, intravascular, intratecal, intramuscular, subcutánea, intratumoral, intraperitoneal u oral. Opcionalmente, la solicitud divulga, además, pero no reclama, la administración al sujeto de uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como un agente quimioterapéutico, biológico y/o radiación.

En algunos ejemplos, el cáncer o tumor es un cáncer o tumor de pulmón, próstata, colorrectal, mama, tiroides, riñón, páncreas, hueso, cabeza y cuello o hígado, o es un tipo de leucemia. En algunos casos, el cáncer es metastásico. En algunos ejemplos, el tumor es un tumor de la glándula mamaria, pituitaria, tiroides o próstata; un tumor del cerebro, hígado, meninges, hueso, ovario, útero o cuello uterino; leucemia monocítica o mielógena; adenocarcinoma, adenoma, astrocitoma, tumor de vejiga, tumor cerebral, linfoma de Burkitt, carcinoma de mama, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de colon, carcinoma de riñón, carcinoma de hígado, carcinoma de pulmón, carcinoma de ovario, carcinoma de páncreas, carcinoma de próstata, carcinoma rectal, carcinoma de piel, carcinoma de estómago, carcinoma de testículo, carcinoma de tiroides, condrosarcoma, coriocarcinoma, fibroma, fibrosarcoma, glioblastoma, glioma, hepatoma, histiocitoma, leiomioblastoma, leiomiosarcoma, linfoma, células de liposarcoma, tumor mamario, meduloblastoma, mieloma, plasmacitoma, neuroblastoma, neuroglioma, sarcoma osteogénico, tumor pancreático, tumor hipofisario, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma, tumor testicular, timoma o tumor de Wilms. Los tumores incluyen tumores sólidos tanto primarios como metastásicos, que incluyen carcinomas de mama, colon, recto, pulmón, orofaringe, hipofaringe, esófago, estómago, páncreas, hígado, vesícula biliar y conductos biliares, intestino delgado, tracto urinario (que incluyen riñón, vejiga y urotelio), tracto genital femenino (que incluyen el cuello uterino, útero y ovarios, así como el coriocarcinoma y la enfermedad trofoblástica gestacional), el tracto genital masculino (que incluyen los tumores de próstata, vesículas seminales, testículos y células germinales), las glándulas endocrinas (que incluyen la glándula de tiroides, suprarrenales e hipófisis) y piel, así como hemangiomas, melanomas, sarcomas (que incluyen aquellos derivados de huesos y tejidos blandos, así como el sarcoma de Kaposi) y tumores del cerebro, nervios, ojos y meninges (que incluyen astrocitomas, gliomas, glioblastomas, retinoblastomas, neuromas, neuroblastomas, Schwannomas y meningiomas). En algunos aspectos, se pueden tratar tumores sólidos que surgen de neoplasias malignas hematopoyéticas tales como las leucemias. (es decir cloromas, plasmocitomas y las placas y tumores de micosis fungoide y linfoma/leucemia de células T cutáneo), así como en el tratamiento de linfomas (tanto linfomas de Hodgkin como no Hodgkin). Además, los tratamientos pueden ser útiles en la prevención de metástasis de los tumores descritos en el presente documento.

En aplicaciones terapéuticas, los adenovirus recombinantes o composiciones de los mismos se administran a un sujeto en una cantidad o dosis terapéuticamente eficaz. Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general de salud del paciente. Se pueden administrar administraciones únicas o múltiples de las composiciones dependiendo de la dosificación y la frecuencia según lo requiera y tolere el paciente.

Un “paciente” o “sujeto” incluye tanto humanos como otros animales, particularmente mamíferos. Por lo tanto, los métodos son aplicables tanto a la terapia humana como a aplicaciones veterinarias, tales como ratones, ratas, conejos, gatos, perros, vacas, caballos, cerdos, pollos y similares.

Una cantidad eficaz de un adenovirus que tiene una secuencia modificada se determina de forma individual y se basa, al menos en parte, en el adenovirus recombinante particular utilizado; el tamaño, edad, género del individuo; y el tamaño y otras características de las células en proliferación. Por ejemplo, para el tratamiento de un humano, al menos se utilizan 103 unidades formadoras de placa (PFU) de un virus recombinante, tal como al menos 104, al menos 105, al menos 106, al menos 107, al menos 108, al menos 109, al menos 1010, al menos 1011, o al menos 1012 PFU, por ejemplo se utiliza aproximadamente 103 a 1012 PFU de un virus recombinante, dependiendo del tipo, tamaño y número de células proliferantes o neoplasmas presentes. La cantidad eficaz puede ser de aproximadamente 1.0 pfu/kg de peso corporal a aproximadamente 1015 pfu/kg de peso corporal (por ejemplo, de aproximadamente 102 pfu/kg de peso corporal a aproximadamente 1013 pfu/kg de peso corporal). Un adenovirus recombinante se administra en una dosis única o en dosis múltiples (por ejemplo, dos, tres, cuatro, seis o más dosis). Se pueden administrar dosis múltiples simultáneamente o consecutivamente (por ejemplo, durante un período de días o semanas).

En algunos ejemplos, la solicitud divulga, pero no reivindica, la administración al sujeto de uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como un agente contra el cáncer u otro tratamiento terapéutico (tal como la resección quirúrgica del tumor). Agentes contra el cáncer de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, agentes quimioterapéuticos, tales como, por ejemplo, inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos intercalantes, inhibidores del factor de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de la topoisomerasa, agentes de antisupervivencia, modificadores de la respuesta biológica, antihormonas (por ejemplo, antiandrógenos), agentes antiangiogénesis e inhibidores de CDK. Otros tratamientos contra el cáncer incluyen la radioterapia y otros anticuerpos que se dirigen específicamente a las células cancerosas.

Los ejemplos no limitativos de agentes alquilantes incluyen mostazas de nitrógeno (tales como mecloretamina, ciclofosfamida, melfalán, mostaza de uracilo o clorambucilo), sulfonatos de alquilo (tales como busulfano), nitrosoureas (tales como carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina o dacarbazina).

Los ejemplos no limitantes de antimetabolitos incluyen análogos de ácido fólico (tales como metotrexato), análogos de pirimidina (tales como 5-FU o citarabina) y análogos de purina, tales como mercaptopurina o tioguanina.

Los ejemplos no limitativos de productos naturales incluyen alcaloides de la vinca (tales como vinblastina, vincristina o vindesina), epipodofilotoxinas (tales como etopósido o tenipósido), antibióticos (tales como dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicamicina o mitomicina C) y enzimas (tales como la L-asparaginasa).

Los ejemplos no limitantes de agentes diversos incluyen complejos de coordinación de platino (como cis-diaminadicloroplatino II, también conocido como cisplatino), ureas sustituidas (tales como hidroxiurea), derivados de metilhidracina (como procarbazina) y supresores adrenocróticos (tales como mitotano y aminoglutetimida).

Los ejemplos no limitantes de hormonas y antagonistas incluyen adrenocorticosteroides (tales como prednisona), progestágenos (tales como caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona y acetato de magestrol), estrógenos (tales como dietilestilbestrol y etinilestradiol), antiestrógenos (tales como tamoxifeno) y andrógenos. (como propionato de testerona y fluoximesterona).

Los ejemplos de los medicamentos de quimioterapia más utilizados incluyen Adriamicina, Alkeran, Ara-C, BiCNU, Busulfan, CCNU, Carboplatino, Cisplatino, Citoxan, Daunorubicina, DTIC, 5-FU, Fludarabina, Hydrea, Idarubicina, Ifosfamida, Metotrexato, Mitramicina, Mitomicina, mitoxantrona, Mostaza de Nitrógeno, Taxol (u otros taxanos, tales como docetaxel), Velban, Vincristina, VP-16, mientras que algunos fármacos más nuevos Incluyen Gemcitabina (Gemzar), Herceptina, Irinotecán (Camptosar, CPT-11), leustatina, Navelbina, Rituxan STI-571, Taxotere, Topotecan (Hycamtin), Xeloda (Capecitabina), Zevelin y calcitriol.

Los ejemplos no limitantes de inmunomoduladores que se pueden utilizar incluyen AS-101 (Wyeth-Ayerst Labs.), bropirimina (Upjohn), interferón gamma (Genentech), GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos; Genetics Institute), IL-2 (Cetus o Hoffman-LaRoche), inmunoglobulina humana (Cutter Biological), IMREG (de Imreg of New Orleans, La.), SK&F 106528 y TNF (factor de necrosis tumoral; Genentech).

Los inhibidores de CDK (quinasa dependiente de ciclina) son agentes que inhiben la función de las CDK. Los ejemplos no limitantes de inhibidores de CDK para utilizar en los métodos proporcionados incluyen AG-024322, AT7519, AZD5438, flavopiridol, indisulam, P1446A-05, PD-0332991 y P276-00 (véase, por ejemplo, Lapenna et al., Nature Reviews, 8:547-566, 2009). Otros inhibidores de CDK incluyen LY2835219, Palbociclib, LEE011 (Novartis), inhibidor de pan-CDK AT7519, seliciclib, CYC065, butirolactona I, himenialdisina, SU9516, CINK4, PD0183812 o fascaplysin.

En algunos ejemplos, el inhibidor de CDK es un inhibidor de amplio rango (tal como flavopiridol, olomucina, roscovitina, kenpaulona, SnS-032, AT7519, AG-024322, (S)-roscovitina o R547). En otros ejemplos, el inhibidor de CDK es un inhibidor específico (tal como fascaplisin, riuidina, purvalanol A, NU2058, BML-259, SU 9516, PD0332991 o P-276-00).

En algunos ejemplos, la solicitud divulga, pero no reivindica, métodos que incluyen adicionalmente administrar al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de una inmunoterapia. Los ejemplos no limitantes de inmunomoduladores que se pueden utilizar incluyen AS-101 (Wyeth-Ayerst Labs.), bropirimina (Upjohn), interferón gamma (Genentech), GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos; Genetics Institute), IL-2 (Cetus o Hoffman-LaRoche), inmunoglobulina humana (Cutter Biological), IMREG (de Imreg of New Orleans, La.), SK&F 106528 y TNF (factor de necrosis tumoral; Genentech). El agente inmunoterapéutico puede ser un antagonista de PD-1 o un antagonista de PD-L1, tal como un anticuerpo que se une específicamente a PD-1 o PD-L1, tal como Atezolizumab, MPDL3280A, BNS-936558 (Nivolumab), Pembrolizumab, Pidilizumab, CT011, AMP-224, AMP-514, MEDI-0680, BMS-936559, BMS935559, MEDI-4736, MPDL-3280A, MSB-0010718C. El agente inmunoterapéutico también puede ser un antagonista de CTLA-4, LAG-3 o B7-H3, tal como Tremelimumab, BMS-986016 y MGA271.

En algunos ejemplos, la solicitud proporciona, pero no reivindica métodos que incluyen adicionalmente administrar al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más agentes antiangiogénicos, tales como proteínas, enzimas, polisacáridos, oligonucleótidos, ADN, ARN y vectores recombinantes. y moléculas pequeñas que funcionan para reducir o incluso inhibir el crecimiento de los vasos sanguíneos. Los ejemplos de inhibidores de angiogénesis adecuados incluyen, sin limitación, angiostatina K1-3, estaurosporina, genisteína, fumagilina, medroxiprogesterona, suramina, interferón-alfa, inhibidores de metaloproteinasa, factor plaquetario 4, somatostatina, trombospondina, endostatina, talidomida y derivados y análogos de los mismos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el agente antiangiogénico es un anticuerpo que se une específicamente a VEGF. (por ejemplo, AVASTÍN®, Roche) o un receptor de VEGF (por ejemplo, un anticuerpo VEGFR2). En un ejemplo, el agente antiangiogénico incluye un anticuerpo VEGFR2 o DMXAA (también conocido como Vadimezan o ASA404; disponible comercialmente, por ejemplo, de Sigma Corp., St. Louis, MO) o ambos. El agente antiangiogénico puede ser bevacizumab, sunitinib, un inhibidor de la tirosina quinasa (TKI) antiangiogénico, tal como sunitinib, xitinib y dasatinib. Estos se pueden utilizar individualmente o en cualquier combinación.

En algunos ejemplos, los métodos proporcionados incluyen adicionalmente administrar al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más inhibidores de la cinasa, tal como GLEEVAC®, IRESSA®y TARCEVA®, sunitinib, sorafenib, anitinib y dasatinib que previenen la fosforilación y activación de factores de crecimiento. Los anticuerpos que se pueden utilizar incluyen HERCEPTIN® y AVASTIN® que bloquean los factores de crecimiento y la ruta angiogénica. Estos se pueden utilizar individualmente o en combinación.

En algunos ejemplos, los métodos proporcionados incluyen adicionalmente administrar al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más anticuerpos monoclonales terapéuticos, por ejemplo, 3F8, Abagovomab, Adecatumumab, Afutuzumab, Alacizumab , Alemtuzumab, Altumomab pentetate, Anatumomab mafenatox, Apolizumab, Arcitumomab, Bavituximab, Bectumomab, Belimumab, Besilesomab, Bevacizumab, Bivatuzumab mertansine, Blinatumomab, Brentuximab vedotin, Cantuzumab mertansina, Capromab pendetida, Catumaxomab, CC49, Cetuximab, Citatuzumab bogatox, Cixutumumab, Clivatuzumab tetraxetano, Conatumumab, Dacetuzumab, Detumomab, Ecromeximab, Eculizumab, Edrecolomab, Epratuzumab, Ertumaxomab, Etaracizumab, Farletuzumab, Figitumumab, Galiximab, Gemtuzumab ozogamicina, Girentuximab, Glembatumumab vedotina, Ibritumomab tiuxetan, Igovomab, Imciromab, Intetumumab, Inotuzumab ozogamicina, Ipilimumab, Iratumumab, Labetuzumab, Lexatumumab, Lintuzumab, Lorvotuzumab mertansina, Lucatumumab, Lumiliximab, Mapatumumab, Matuzumab, Mepolizumab, Metelimumab, Milatuzumab, Mitumomab, Morolimumab, Nacolomab tafenatox, Naptumomab estafenatox, Necitumumab, Nimotuzumab, Nofetumomab merpentan, Ofatumumab, Olaratumab, Oportuzumab monatox, Oregovomab, Panitumumab, Pemtumomab, Pertuzumab, Pintumomab, Pritumumab, Ramucirumab, Rilotumumab, Rituximab, Robatumumab, Satumomab pendetide, Sibrotuzumab, Sonepcizumab, Tacatuzumab tetraxetano, Taplitumomab paptox, Tenatumomab, TGN1412, Ticilimumab (tremelimumab), Tigatuzumab, TNX-650, Trastuzumab, Tremelimumab, Tucotuzumab celmoleucina, Veltuzumab, Volociximab, Votumumab, o Zalutumumab. En algunos ejemplos, el ORF heterólogo codifica uno de estos anticuerpos terapéuticos.

Otro tratamiento habitual para algunos tipos de cáncer es el tratamiento quirúrgico, por ejemplo, la resección quirúrgica del cáncer o de una porción del mismo. Otro ejemplo de un tratamiento es la radioterapia, por ejemplo, la administración de energía o material radiactivo (tal como una terapia de haz externo) en el sitio del tumor para ayudar a erradicar el tumor o reducirlo antes de la resección quirúrgica.

La elección del agente y la dosificación se pueden determinar fácilmente por un experto en la técnica basándose en la enfermedad dada que se está tratando. Las combinaciones de agentes o composiciones se pueden administrar de forma concomitante (por ejemplo, como una mezcla), por separado, pero simultáneamente (por ejemplo, a través de líneas intravenosas separadas) o secuencialmente (por ejemplo, primero se administra un agente seguido de la administración del segundo agente). Por lo tanto, el término combinación se utiliza para referirse a la administración concomitante, simultánea o secuencial de dos o más agentes o composiciones.

La solicitud divulga, pero no reivindica, la administración de una cantidad eficaz de uno o más de los agentes proporcionados en el presente documento al sujeto. La cantidad eficaz se define como cualquier cantidad necesaria para producir una respuesta fisiológica deseada (por ejemplo, destrucción de una célula cancerosa). Los agentes terapéuticos se administran normalmente a la dosificación inicial de aproximadamente 0.001 mg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg al día. Se puede utilizar un rango de dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg, o de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, o de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, o de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg. Sin embargo, las dosificaciones pueden variar dependiendo de los requisitos del sujeto, la gravedad de la afección que se está tratando y el compuesto que se está empleando. Por ejemplo, las dosificaciones se pueden determinar empíricamente considerando el tipo y estadio de cáncer diagnosticado en un sujeto particular. La dosis administrada a un sujeto, en el contexto de los métodos proporcionados, debe ser suficiente para afectar una respuesta terapéutica beneficiosa en el paciente a lo largo del tiempo. La determinación de la dosificación apropiada para una situación particular está dentro de la habilidad del médico. Por lo tanto, un experto en la técnica puede determinar empíricamente las cantidades y los programas efectivos para administrar el agente. La dosificación no debe ser tan grande como para causar efectos secundarios adversos sustanciales, tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilácticas y similares. La dosificación se puede ajustar por el médico individual en caso de contraindicaciones. En la bibliografía se puede encontrar orientación sobre las dosificaciones apropiadas para determinadas clases de productos farmacéuticos.

En el presente documento se proporciona un método para inhibir la viabilidad o el crecimiento de células tumorales al poner en contacto la célula tumoral con un genoma del adenovirus recombinante, o una composición del mismo, como se divulga en el presente documento. En algunas realizaciones, el método es un método in vitro. En otras realizaciones, el método es un método in vivo pero no se reivindica y el contacto con la célula tumoral comprende administrar el adenovirus recombinante, el genoma del adenovirus recombinante o la composición a un sujeto con un tumor.

También se proporciona, pero no se reivindica, un método para inhibir la progresión tumoral o reducir el volumen tumoral en un sujeto, al administrar al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de un adenovirus recombinante o genoma del adenovirus recombinante (o composición del mismo) divulgado en el presente documento.

También se proporciona, pero no se reivindica, un método para tratar el cáncer en un sujeto, al administrar administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de un adenovirus recombinante o un genoma del adenovirus recombinante (o una composición del mismo) divulgado en el presente documento.

VIII. Adsemblyy AdSLIC

El genoma del adenovirus está organizado en varios grupos funcionales, marcados E1, E2, E3, E4 y LI-5. La región E1 codifica proteínas que controlan la transcripción de todos los demás genes virales e induce la fase S en la célula huésped. La región ^e2 codifica proteínas que impulsan la replicación del ADN viral. Las proteínas de la región E3 modulan la respuesta inmunitaria de la célula huésped y son prescindibles en cultivos celulares. La región E4 contiene genes para un conjunto dispar de funciones. Y la región LI-5 codifica las proteínas estructurales de partículas virales.

Aprovechando esta segregación natural de la funcionalidad, los inventores desarrollaron previamente un método de ensamble de adenovirus recombinantes que permite una manipulación rápida y fácil del genoma de Ad de 36 kb al separarlo en 4 plásmidos, E1, E3, E4 y Núcleo, como se muestra en la FIG. 6A (Adsembly y AdSLIC; véase documento WO 2012/024351). Debido a su tamaño más razonable, la manipulación de estos plásmidos más pequeños es sencilla utilizando técnicas estándar.

Adsembly y AdSLIC permiten el ensamble in vitro combinatorio de adenovirus con propiedades novedosas a partir de partes de la biblioteca genómica compatibles en 4 horas. Adsembly y AdSLIC proporcionan una plataforma de diseño de genoma común que permite ensamblar virus sintéticos con propiedades novedosas utilizando cuatro bibliotecas de partes funcionales (FIG. 6A). Estas bibliotecas de partes se pueden volver a ensamblar en todas las combinaciones posibles utilizando sitios de recombinación específicos de múltiples sitios (Adsembly; FIG. 6B) o clonación continua independiente de secuencia (AdSLIC; FIG. 6C).

Las tecnologías Adsembly y AdSLIC permiten el diseño modular y la producción de adenovirus con capacidades únicas. El desarrollo de la capacidad para diseñar, fabricar y probar virus de manera automatizada y de alto rendimiento acelerará y expandirá el desarrollo de nuevos virus para estudios terapéuticos, de diagnóstico e investigación.

Si bien la etapa de la clonación alguna vez fue el cuello de botella para producir nuevas construcciones virales, la llegada de Adsembly y AdSLIC ha hecho que la capacidad de construir genomas virales haya superado la capacidad de probarlos. Un ensayo cinético de rendimiento igualmente alto es fundamental para explotar todo el potencial y el ensamble de alto contenido de terapias y diagnósticos virales sintéticos y personalizados utilizando los métodos Adsembly y AdSLIC.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar ciertas características y/o realizaciones particulares.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación de ubicaciones óptimas en el genoma del adenovirus para ORF exógenos

Este ejemplo describe la identificación de ubicaciones específicas dentro del genoma del adenovirus donde se pueden insertar ORF exógenos, junto con una secuencia de péptidos autoescindibles, sin interrumpir la cinética del virus.

La inserción de genes exógenos en vectores de adenovirus está limitada por la capacidad de tamaño de la cápside del adenovirus. La adición excesiva de ácido nucleico exógeno conduce a una carga genómica incompleta en la cápside y a una cinética viral reducida. Una solución al desafío presentado por el espacio disponible limitado en el genoma del adenovirus es localizar marcos de lectura abiertos (ORF) exógenos como productos de fusión dentro de los ORF de adenovirus nativos. Esta estrategia utiliza promotores de adenovirus, 5'UTR y colas poliA ya codificadas en el genoma. Sin embargo, la expresión de una fusión entre una proteína de adenovirus nativa y una proteína exógena puede ser perjudicial para una o ambas funciones de la proteína y conducir a una disminución significativa en la cinética de replicación de adenovirus. De hecho, los estudios divulgados en el presente documento demuestran que la fusión directa de un ORF exógeno con los ORF de adenovirus E1A, polimerasa de ADN o ADP inhibe significativamente la cinética de replicación del adenovirus. Además, los inventores intentaron previamente utilizar un sitio de entrada ribosomal interno (IRES) para insertar ORF exógenos, que tampoco produjeron virus recombinantes con cinética de tipo silvestre.

Este ejemplo describe una solución a este problema al utilizar una secuencia de péptidos autoescindibles colocada entre el ORF del adenovirus nativo y el ORF exógeno. Cuando se coloca entre los dos ORF sobre un solo ARNm, la presencia de la secuencia de péptidos autoescindibles conduce a la omisión del ribosoma y la liberación de la primera proteína separada de la segunda proteína. Las construcciones de adenovirus generadas en este ejemplo utilizan el péptido autoescindible P2A y una proteína fluorescente (por ejemplo, YPet, mCherry) como el ORF heterólogo.

La siguiente tabla proporciona una lista de las construcciones que se generaron e indica el nivel de expresión del ORF exógeno (bajo, medio o alto) y el nivel de cinética de replicación del virus (bajo, medio o alto) en dos estirpes celulares diferentes (células 293-E4 y células A549).

Las construcciones que exhiben una cinética de replicación “alta” (es decir cinética de replicación que es comparable con el adenovirus de tipo silvestre) en ambos tipos de células se consideran candidatas para generar construcciones de adenovirus terapéuticos (mostrado en negrita). Además, las construcciones ORF heterólogas de fibra-P2A exhibieron defectos significativos en la replicación viral, pero generaron niveles extraordinariamente altos de expresión de la proteína heteróloga. Por lo tanto, estas construcciones de fibra también se pueden utilizar en aplicaciones terapéuticas para la producción de altos niveles de una proteína terapéutica en el contexto de un adenovirus defectuoso en la replicación.

Comparación de fusión directa e inserción de un sitio P2A

Se generaron varias construcciones en las que una proteína fluorescente se fusionó directamente con un ORF de adenovirus. En particular, se generaron las siguientes fusiones directas: YPet-E1A, YPet-(polimerasa de ADN) y mCherry-ADP.

El adenovirus YPet-E1A exhibió un deterioro significativo en la cinética del virus. La inserción del sitio P2A entre YPet y E1A (YPet-P2A-E1A) mejoró la cinética del virus, pero no restauró la cinética del virus al nivel de tipo silvestre. Luego se generó otra construcción para probar la fusión de P2A e YPet al extremo del terminal C de E1A (E1A-P2A-YPet). Esta construcción mejoró aún más la cinética del virus, pero de nuevo no restauró la cinética al nivel del adenovirus de tipo silvestre.

Múltiples intentos de transfectar el plásmido del genoma YPet-(ADN-poli) no lograron producir un virus viable (no se formaron placas). Sin embargo, la fusión de YPet-P2A con el terminal N de la polimerasa de ADN (YPet-P2A-(ADN poli)) produjo un virus con una cinética de tipo silvestre, como se muestra en la tabla anterior.

Además, la fusión directa de mCherry a ADP (mCherry-ADP) produjo un virus con una cinética significativamente alterada. Sin embargo, la inserción del sitio P2A entre el ORF de mCherry y el ORF de ADP dio como resultado un virus con cinética de tipo silvestre (mCherry-P2A-ADP). Se obtuvo el mismo resultado utilizando una proteína fluorescente diferente; la construcción YPet-P2A-ADP mostró una cinética de virus de tipo silvestre. Sin embargo, la colocación de P2A y el ORF heterólogo sobre el lado terminal C de ADP produjo un virus que no se replicó. Por tanto, para ADP, el ORF heterólogo se debe colocar en el terminal N.

Tanto la fusión directa con la fibra como la inserción de un sitio P2A entre la fibra y un ORF heterólogo produjeron virus con una cinética de replicación significativamente alterada. Sin embargo, los adenovirus recombinantes que comprenden fibra-P2A-ORF heterólogo exhibieron niveles de expresión extraordinariamente altos de la proteína heteróloga (YPet o proteína fluorescente azul (BFP) en este ejemplo).

Construcciones adicionales con cinética de virus de tipo silvestre

La FIG. 7 muestra una comparación de la Pendiente Ln de seis construcciones diferentes: YPet-E1A, YPet-P2A-E1A, E1A-P2A-mCherry, E1B-55k-P2A-YPet, YPet-P2A-ADP y Fibra-P2A-YPet. Como se discutió anteriormente, la fusión directa de YPet a E1A produjo un virus con una cinética significativamente alterada, y la adición del sitio P2A en ya sea el terminal N (YPet-P2A-E1A) o el terminal C (E1A-P2A-mCherry) mejoró la cinética del virus, pero no a los niveles de tipo silvestre. Sin embargo, la inserción del sitio P2A y un ORF heterólogo en el terminal C de E1B-55k (E1B-55k-P2A-YPet) o el terminal N de ADP (YPet-P2A-ADP) generó un virus recombinante con cinética de virus del tipo silvestre.

La evaluación de la cinética viral para construcciones que tienen un sitio P2A y ORF heterólogo en el terminal C de DBP (DBP-P2A-YPet) o el terminal C de E3-14.7k (E3-14.7k-P2A-YPet), o que tienen un sitio P2A y un ORF heterólogo en el terminal N de E4-ORF2 (YPet-P2A-E4-ORF2 y mCherry-P2A-E4-ORF2) produjo virus con cinética de replicación de tipo silvestre.

Los resultados de estos datos demuestran que al menos las siguientes construcciones genómicas de adenovirus se pueden utilizar para desarrollar construcciones de adenovirus terapéuticos:

E1B-55k-P2A-ORF heterólogo

ORF heterólogo-P2A-(polimerasa de ADN)

DBP-SC-ORF heterólogo

ORF heterólogo-SC-ADP

E3-14.7k-SC-ORF heterólogo

ORF heterólogo -P2A-E4-ORF2

fibra-P2A-ORF heterólogo

Para aplicaciones terapéuticas, el ORF heterólogo codifica una proteína terapéutica.

Otros serotipos de adenovirus

Los métodos descritos anteriormente para medir la cinética viral dependen en gran medida de los ensayos específicos del tipo celular y, por lo tanto, son específicos del serotipo debido al tropismo divergente de cada serotipo de adenovirus. El ensayo cinético de adenovirus divulgado en el presente documento no depende de ningún tipo de célula y, por lo tanto, se puede extender a serotipos distintos de Ad5. Todos los serotipos de adenovirus contienen un ORF equivalente a Ad5 E3-14.7k. Por lo tanto, los virus equivalentes a Ad5 E3-14.7k-P2A-YPet (PCMN-887; SEQ ID NO: 9) se generaron utilizando Ad9 (que contenía E3-15k) y Ad34 (que contenía E3-14,8k): PCMN-888 (Ad9 E3-15k-P2A-YPet; SEQ ID NO: 22) y PCMN-889 (Ad34 E3-14.8k-P2A-YPet; SEQ ID NO: 23). También se generaron virus quiméricos que contenían el núcleo Ad5 y un eje de fibra y un nudo de Ad9 o Ad34. A continuación, los cuatro virus recombinantes se probaron en el ensayo FBVK utilizando células 293 (FIG. 9A), células A549 (Fig. 9B) y celdas U2OS (FIG. 9C). Los cuatro virus recombinantes exhibieron altos niveles de expresión de YPet con un impacto mínimo sobre la cinética viral resultante de la inserción del ORF exógeno.

Ejemplo 2: Métodos para evaluar la cinética de replicación de adenovirus

Los métodos Adsembly y AdSLIC para ensamblar adenovirus recombinantes proporcionan un medio para generar grandes cantidades de virus y genomas de virus recombinantes en un corto período de tiempo. Sin embargo, subsiste la necesidad de un método rápido y de alto rendimiento para evaluar la cinética de replicación de adenovirus recombinantes diseñados para uso clínico y terapéutico. Este ejemplo describe un ensayo de cinética viral basado en fluorescencia que se puede utilizar para probar la cinética de replicación de virus de adenovirus recombinantes (FIG.

3). El ensayo se puede realizar con plásmidos de genoma del adenovirus recombinante o partículas de adenovirus recombinantes como material de partida.

Cuando se comienza con un genoma del adenovirus recombinante, el ensayo incluye transfectar células con plásmidos de genoma de adenovirus (tales como los descritos anteriormente en el Ejemplo 1) y monitorizar la expresión de fluoróforo a lo largo del tiempo (FIGS. 4A-4B). Las condiciones de transfección se seleccionan de tal manera que se transfectan inicialmente aproximadamente 5-10 % de las células. Las células que no se transfectan inicialmente están disponibles para la infección secundaria por partículas de virus producidas a partir de la transfección inicial. La pendiente logarítmica se utiliza como una medida de la cinética basada en infecciones secundarias, terciarias y cuaternarias (etc.), por lo que no es necesario conocer el porcentaje de células que se transfectan inicialmente. Las FIG. 4A y 4B muestran un ensayo de cinética basado en virus de ejemplo que comienza con plásmidos de genoma del adenovirus recombinante. En este ejemplo, se utiliza una placa de 48 pocillos, lo que permite probar 14 construcciones de virus diferentes (por triplicado) simultáneamente. La mitad superior de la placa de 48 pocillos (FIG.

4A) incluye pocillos triplicados de seis virus diferentes, 3 pocillos con infección simulada y 3 pocillos “en blanco” con microesferas de FLUORESBRITE™, que compensan la deriva de la sensibilidad de la herramienta. La mitad inferior de la placa de 48 pocillos (FIG. 4B) incluye pocillos triplicados de ocho construcciones de virus diferentes. Una vez transfectadas las células, la placa se coloca en un lector de placas TECAN™ para la monitorización continua de fluorescencia. Los datos recopilados se utilizan para calcular la pendiente ln para cada construcción (FIG. 8).

El ensayo también se puede llevar a cabo al infectar células con partículas de virus recombinantes. En esta versión del ensayo, las células se infectan con partículas de virus recombinantes y la expresión de fluoróforos se monitoriza a 10 largo del tiempo (FIG. 5). Al igual que con la versión de plásmido del genoma del ensayo, no es necesario conocer el título exacto de la reserva de virus inicial. Normalmente, se utiliza una serie de diluciones para la infección inicial, tal como una serie de diluciones que va desde 1:100 hasta 1:218,700, como se muestra en la FIG. 5. Una dilución de 1:100 generalmente conduce a la infección de todas las células, mientras que una dilución de 1:218,700 generalmente conduce a la infección inicial de muy pocas células. En este ejemplo, se utiliza una placa de 96 pocillos y se prueban 11 construcciones de virus diferentes simultáneamente en ocho diluciones diferentes (1:100, 1:300, 1:900, 1:2700, 1:8100, 1:24,300, 1: 72,900 y 1:218,700). La placa también incluye cuatro pocillos de células con infección simulada y cuatro pocillos de microesferas de FLUORESBRITE™. Una vez que las células están infectadas, la placa se coloca en un lector de placas TECAN™ para monitorización continua de fluorescencia. Los datos recolectados se utilizan para calcular la pendiente ln para cada construcción (FIG. 8).

Los lectores de placas TECAN™ también proporcionan funciones de incubación (mantienen una temperatura adecuada y niveles de CO² y O²). Se toman puntos de datos cada 15 minutos para calcular la pendiente ln. Utilizando estos métodos, es posible comparar rápida y eficientemente la cinética entre una serie de virus diferentes y entre diferentes tipos de células. Por ejemplo, para evaluar si los adenovirus recombinantes particulares se podrían utilizar terapéuticamente como virus oncolíticos, este ensayo se podría emplear para encontrar virus que muestren una cinética de replicación alta en células tumorales, pero una cinética de virus lenta en células no tumorales. Además, la cinética viral de los virus recombinantes se puede evaluar al infectar o transfectar el tipo de célula tumoral de interés en este ensayo.

Cálculo de la pendiente logarítmica

Para medir la pendiente logarítmica, el gráfico lineal de la intensidad de fluorescencia frente al tiempo se convierte en un gráfico semilogarítmico al tomar el logaritmo natural de la intensidad de fluorescencia medida en cada momento. Dado que la intensidad de fluorescencia exhibe un crecimiento exponencial durante la replicación viral, esta conversión da como resultado una línea recta cuando se representa gráficamente ln (intensidad de fluorescencia) frente al tiempo. Luego, esta línea recta se ajusta utilizando métodos estándar de mínimos cuadrados. La pendiente resultante producida por este ajuste es la pendiente ln de la fluorescencia frente al tiempo y, por lo tanto, la pendiente ln del crecimiento viral frente al tiempo. Las ecuaciones se muestran a continuación.

FI(t) = Foa(t-t0); dónde FI es la intensidad de fluorescencia medida, t es tiempo, Fo es la intensidad de fluorescencia inicial en el tiempo = to, y a es la pendiente ln.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un genoma del adenovirus recombinante, que comprende un marco de lectura abierto (ORF) heterólogo y una secuencia de codificación del péptido autoescindible, ambos ligados operativamente y en el mismo marco de lectura como un ORF de adenovirus endógeno, en el que la secuencia de codificación del péptido autoescindible está ubicada entre el ORF heterólogo y el ORF endógeno, en el que el péptido autoescindible es un péptido 2A o un péptido 2A que se ha modificado para incluir Gly-Ser-Gly en el terminal N para mejorar la eficiencia de la escisión, y en el que: el ORF endógeno es E1B-55k y el ORF heterólogo es 3' de E1B-55k, en el que dicho ORF heterólogo no es una proteína de fusión de ligando a FKBP dirigida cuando el péptido autoescindible es P2A;

el ORF endógeno es polimerasa de ADN y el ORF heterólogo es 5' de polimerasa de ADN;

el ORF endógeno es proteína de muerte de adenovirus (ADP) y el ORF heterólogo es 5' de ADP en el que dicho ORF heterólogo no es una proteína de fusión de ligando a FKBP dirigida cuando el péptido autoescindible es P2A, y en el que dicho genoma de adenovirus no es AdSyn-CO4440 definido por la secuencia de la Figura 10 que comprende EGFRVHH-GS-FKBP y P2A 5' de ADP;

el ORF endógeno es E4-ORF2 y el ORF heterólogo es 5' de E4-ORF2; o

el ORF endógeno es fibra y el ORF heterólogo es 3' de fibra,

en el que el ORF heterólogo codifica una proteína terapéutica.

2. El genoma del adenovirus recombinante de la reivindicación 1, en el que el péptido 2A es un péptido 2A (P2A) de teschovirus-1 de porcino (PTV1), un péptido 2A (F2A) del virus de la fiebre aftosa (FMDV), un péptido 2A (E2A) del virus A de la rinitis equina (ERAV) o un péptido 2A (T2A) del virus de Thesea asigna (TaV).

3. El genoma del adenovirus recombinante de la reivindicación 2, en el que la secuencia de aminoácidos del péptido autoescindible es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 14-21 o en el que el péptido autoescindible comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 14-21.

4. Una composición que comprende el genoma del adenovirus recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un portador farmacéuticamente aceptable.

5. Un adenovirus recombinante que comprende el genoma del adenovirus recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

6. Una composición que comprende el adenovirus recombinante de la reivindicación 5 y un portador farmacéuticamente aceptable.

7. El genoma del adenovirus recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el adenovirus recombinante de la reivindicación 5 o la composición de la reivindicación 4 o 6 para uso como un medicamento.

8. El genoma del adenovirus recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el adenovirus recombinante de la reivindicación 5 o la composición de la reivindicación 4 o 6 para uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto.

9. Una cantidad terapéuticamente eficaz del genoma del adenovirus recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el adenovirus recombinante de la reivindicación 5 o la composición de la reivindicación 4 o 6, comprende adicionalmente un agente terapéutico adicional para utilizar en el tratamiento del cáncer.

10. Un kit que comprende:

(i) el genoma del adenovirus recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, el adenovirus recombinante de la reivindicación 5, o la composición de la reivindicación 4 o la reivindicación 6; y

(ii) uno o más agentes terapéuticos adicionales y/o uno o más agentes de diagnóstico.

11. El kit de la reivindicación 10, en el que uno o más agentes terapéuticos adicionales comprenden un producto quimioterapéutico, biológico o combinaciones de los mismos, o

en el que uno o más agentes de diagnóstico comprenden uno o más anticuerpos específicos para un marcador tumoral.

12. El kit de la reivindicación 10 u 11, en el que uno o más agentes de diagnóstico comprenden una o más moléculas de ácido nucleico específicas para un marcador tumoral.