JP5975352B2 - 癌幹細胞を標的とするウイルスベクター - Google Patents
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Description
(1) 所望の遺伝子に作動可能に連結させたCD133プロモーターを有する、癌幹細胞特異的に当該所望の遺伝子を発現可能なウイルスベクター。
(2) 前記所望の遺伝子がウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子であって、癌幹細胞特異的に増殖可能である(1)に記載のウイルスベクター。
(3) 腫瘍溶解性である(2)に記載のウイルスベクター。
(4) アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ミキソーマウイルス、レオウイルス、ベジキュラー・ストマタイティスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、RSウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、又はセネカ・ヴァレイ・ウイルスである(2)又は(3)に記載のウイルスベクター。
(5) アデノウイルスである(2)又は(3)に記載のウイルスベクター。
(6) 前記所望の遺伝子がアデノウイルスのE1A又はE1B遺伝子である、(5)に記載のアデノウイルスベクター。
(7) E1Aが、Rb結合領域が欠損したE1A(E1AΔ24)である、又は、E1Bが、p53結合領域が欠損したE1B(E1BΔ55)である、(6)に記載のアデノウイルスベクター。
(8) 更に、標識遺伝子、又は細胞毒性遺伝子を備える(2)〜(7)のいずれか1項に記載のアデノウイルスベクター。
(9) 更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える(2)〜(8)のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
(10) 以下の(a)〜(c)から選択される1のアデノウイルスベクターである、(6)又は(7)に記載のアデノウイルスベクター:
(a)以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター:
(a1)CD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1A遺伝子又はE1AΔ24遺伝子からなるCD133転写ユニット
(a2)真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1B遺伝子又はE1BΔ55K遺伝子からなる転写ユニット、あるいは、癌特異的プロモーターの下流に作動可能に連結されたE1BΔ19K遺伝子からなる転写ユニット
(a3)任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット;
(b)以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター:
(b1)真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1A遺伝子又はE1AΔ24遺伝子からなる転写ユニット、
(b2)CD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1B遺伝子又はE1BΔ55K遺伝子からなるCD133転写ユニット、
(b3)任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット;
(c)以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター:
(c1)真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1A遺伝子又はE1AΔ24遺伝子からなる転写ユニット、
(c2)真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1B遺伝子又はE1BΔ55K遺伝子からなる転写ユニット、
(c3)CD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなるCD133転写ユニット。
(11) 前記所望の遺伝子が標識遺伝子である(1)に記載のウイルスベクター。
(12) 更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える(11)に記載のウイルスベクター。
(13) 更に、細胞毒性遺伝子を備える(11)又は(12)に記載のウイルスベクター。
(14) 前記所望の遺伝子が、細胞毒性遺伝子である請求項1に記載のウイルスベクター。
(15) 更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える(14)に記載のウイルスベクター。
(16) 更に、標識遺伝子を備える(14)又は(15)のいずれか1項に記載のアデノウイルスベクター。
(17) 腫瘍溶解性ウイルスである(11)〜(16)のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
(18) アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ミキソーマウイルス、レオウイルス、ベジキュラー・ストマタイティスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、RSウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、又はセネカ・ヴァレイ・ウイルスである(11)〜(17)のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
(19) CD133プロモーターが、以下の(i)〜(iv)から選択されるいずれか1項に記載の核酸分子である、(1)〜(18)のいずれか1項に記載のウイルスベクター:
(i)配列番号1〜5のいずれか1つの配列番号に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子、
(ii)配列番号1〜5のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列と85%の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子、
(iii)配列番号1〜5のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子又はそれと相補的な配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、
(iv)配列番号1〜5のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列の一部の核酸が置換、欠失し、又は、配列番号1〜5のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列に追加の核酸が付加、挿入された核酸分子。
(20) (1)〜(19)のいずれか1項に記載のウイルスベクターを含有する癌の治療薬、転移抑制剤、若しくは予防薬又は診断薬。
(21) (1)〜(19)のいずれか1項に記載のウイルスベクターを含有する癌幹細胞の標識剤。
(22) 更に、同時に、連続的に又は時間をおいて別々に投与される以下の(i)〜(ii)から選択される1以上の薬剤を含有する(20)に記載の治療薬若しくは予防薬又は診断薬:
(i)抗ウイルス作用を低下させる薬剤、
(ii)抗癌剤。
(23) (1)〜(19)のいずれか1項に記載のウイルスベクターをそれを必要とする患者に投与するステップを備える癌幹細胞の標識方法。
(24) (1)〜(19)のいずれか1項に記載のウイルスベクターをそれを必要とする患者に投与するステップを備える癌の診断方法。
(25) ウイルスベクターが標識遺伝子を有する、(23)又は(24)に記載の方法。
(26) (1)〜(20)のいずれか1項に記載のウイルスベクターをそれを必要とする患者に投与するステップを備える癌の予防方法、転移抑制方法、又は治療方法。
(27) 更に、前記ウイルスベクターを患者の癌幹細胞に感染させるステップを備える(26)に記載の予防方法、転移抑制方法、又は治療方法。
(28) ウイルスベクターが細胞毒性遺伝子を有する、(26)又は(27)に記載の方法。
(29) 前記所望の遺伝子がウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子であって、前記ウイルスベクターが癌幹細胞特異的に増殖可能である(23)〜(28)のいずれか1項に記載の方法。
(a)以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター:
(a1)CD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1A遺伝子又はE1AΔ24遺伝子からなるCD133転写ユニット
(a2)真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1B遺伝子又はE1BΔ55K遺伝子からなる転写ユニット、あるいは、癌特異的プロモーターの下流に作動可能に連結されたE1BΔ19K遺伝子からなる転写ユニット
(a3)任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット;
(b)以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター:
(b1)真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1A遺伝子又はE1AΔ24遺伝子からなる転写ユニット、
(b2)CD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1B遺伝子又はE1BΔ55K遺伝子からなるCD133転写ユニット、
(b3)任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット;
(c)以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター:
(c1)真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1A遺伝子又はE1AΔ24遺伝子からなる転写ユニット、
(c2)真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1B遺伝子又はE1BΔ55K遺伝子からなる転写ユニット、
(c3)CD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなるCD133転写ユニット。
本明細書において「癌幹細胞」とは、腫瘍内の細胞であって自己複製能力及び腫瘍を含む癌細胞の異種系列をもたらす能力を有する細胞(Clarke MFら、Cancer Res.(2006)66:9339−9344)を意味する。即ち、癌幹細胞は、自己と同一の性質を有する娘細胞を産生する能力と癌組織を形成する細胞(特に悪性腫瘍)への分化能の両方を有する。但し、これは幹細胞様(Stem−like)の性質をある程度持っているという意味であり、正常の幹細胞のような厳密な幹細胞の性格を持つ必要はなく(その条件に限定されるものではなく)、むしろ癌の悪性化の主原因という点が重要である。少数の癌幹細胞が、分化により癌組織を形成する多数の癌細胞となることから、Tumor−Initiating Cell又はCancer Initiating Cell(癌始原細胞あるいは腫瘍又は癌の創始細胞)と呼ばれることもある。本発明における癌幹細胞は、これらの癌始原細胞あるいは腫瘍又は癌の創始細胞をも含むものである(Neuzil J,et al.Biochem Biophys Res Comm.355;855−859,2007)。例えば、癌幹細胞は、数個〜数万個(好ましくは数十個〜数千個)の細胞を免疫不全マウスに移植した場合に癌を形成することができる細胞であってもよい。また、本明細書における癌幹細胞がこれに限定されるものではないが、固形癌における癌幹細胞は、CD24、CD44、CD90、CD133、ABCB5等のマーカーを発現することが知られている。例えば、本発明の癌幹細胞は、脳腫瘍、グリア芽腫、頭頚部癌、胃癌、肺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、上咽頭癌、咽頭癌、食道癌、膀胱がん、膵臓癌、前立腺癌、大腸癌、骨肉腫、皮膚癌、メラノーマ、甲状腺癌、副甲状腺癌、尿管癌、子宮頸癌等の固形癌及び肉腫、並びに造血器や血液の悪性腫瘍(例えば、急性リンパ性白血病等の白血病、悪性リンパ腫)の癌幹細胞を含む。好ましくは、癌幹細胞は脳腫瘍幹細胞又はグリア芽腫幹細胞である。
本発明のウイルスベクターは、当業者に知られたウイルスベクター作製方法を適宜採用して作製することができる。例えば、ウイルスベクターは、ほぼ完全なウイルスゲノムのコピーを有するウイルスバックボーンプラスミドとCD133転写ユニットを有するシャトルベクタープラスミドを遺伝子組み換えの技術を利用して組替えることにより作製することができる。遺伝子組み換えは、相同的組換、制限酵素サイト(好ましくは、l−CeuI及びPl−SceI等の特殊制限酵素サイト)を利用した組換、又は、リコンビネーション反応(例えば、Cre−LoxP)を利用した組換により行うこともできる。
本発明は、本発明のウイルスベクターのうち、ウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結させたCD133プロモーターを有する、癌幹細胞特異的に増殖可能なウイルスベクター及び/又は細胞毒性遺伝子を有するウイルスベクター(以下、総称して「治療用ウイルスベクター」という)を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌の治療方法、予防方法、転移抑制方法に関する。本発明の治療用ウイルスベクターは、癌細胞を生み出す元である癌幹細胞に傷害を与えることができるため、そのようなウイルスベクターを癌患者又は癌になることが予想される患者に投与することにより癌を治療し又は予防し、あるいは癌の転移を抑制することができる。よって、本発明の一例は、治療用ウイルスベクターを、それを必要とする患者に投与し、それにより該患者の癌幹細胞内において該ウイルスベクターを増殖させ、又は細胞毒性遺伝子を発現させることを含む、癌の治療方法、予防方法、又は転移抑制方法である。
本発明は、本発明のウイルスベクターのうち、標識遺伝子を有するウイルスベクター(以下、「標識用ウイルスベクター」という)を、対象患者に投与することを含む、癌の診断方法、又は癌幹細胞の標識方法に関する。本発明の標識用ウイルスベクターは、癌幹細胞で特異的に標識遺伝子を発現することができるため、そのようなウイルスベクターを癌患者又は癌になることが予想される患者に投与することにより癌幹細胞を同定又は識別することができる。癌幹細胞は癌細胞内に数〜十数%存在することが知られていることから、癌幹細胞の存在を指標に癌を診断することができる。また、癌の切除等の場面においては癌の増殖の根源である癌幹細胞の除去が重要であると考えられており、癌幹細胞を特異的に標識して可視化することにより、癌幹細胞の確実な切除を助けて手術の成功率を高め、手術後の患者の予後を改善することができる。具体的には、本発明は、標識用ウイルスベクターを対象患者に投与し、標識遺伝子の発現産物を検出することを含む、癌の診断方法、又は癌幹細胞の標識方法に関する。標識遺伝子の発現産物の検出は、使用する標識遺伝子の種類と使用目的により適宜選択することができ、例えば、外科手術中に色素又は蛍光色素を目視で確認してもよいし、画像診断により検出してもよい。また、癌の診断又は癌幹細胞の標識は、癌幹細胞を可視化することにより行ってもよいし、視覚以外の手段で検知可能な手法により行ってもよい。例えば、本発明の癌の診断方法、又は癌幹細胞の標識方法は、標識用ウイルスベクターを、対象患者に投与することを含む、癌幹細胞の可視化方法であってもよい。
本発明のウイルスベクターを有効成分として包含する医薬組成物(癌の治療薬、予防薬、転移抑制剤及び診断薬、並びに癌幹細胞の標識剤、及び傷害剤を含む)は、有効成分に加えて1以上の薬学的に許容可能な担体を含む組成物であってもよい。医薬組成物が溶液製剤の場合、このような薬学的に許容可能な担体は、滅菌可能でヒトに投与可能な一般的に知られている担体であればよく、限定されない例として、生理食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝生理食塩水、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。また、必要に応じて、医薬組成物は、更に抗酸化剤、緩衝剤及び静菌剤を含有していてもよい。また、医薬組成物は用事調整可能な注射用製剤としてもよい。この場合、医薬組成物(医薬組成物キット)は、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤を含んでいてもよい。
(1)細胞
ヒト神経癌幹細胞として、Soeda A, et al. J Biol Chem 2008;283;10958−66に記載されたヒト神経癌幹細胞(human glioblastoma stem cells)を使用した。X01GBS細胞は、X01GB細胞の癌幹細胞分画であり、未分化条件の培地とSphere培養法で癌幹細胞分画を「濃縮」した細胞群である。よって、以下、特に明記が無い限りにおいて、ヒト神経癌幹細胞X01GBSとはSoeda A, et al. J Biol Chem 2008;283;10958−66に記載されたヒト神経癌幹細胞(human glioblastoma stem cells)(又はX01GB−CSC)を意味するものとする。培養条件:神経癌幹細胞X01GBSをB−27(Invitrogen),recombinante human FGF−2(20 ng/ml;R&D Systems, Minneapolis, MN)とrecombinant human EGF (20 ng/ml;R&D Systems)添加した10%FBSとpenicillin G, stretomycinsulfateを含有するDulbecco‘s modified Eagle’s medium/F−12(D6421,Sigma)培地で5%CO2、37℃で培養した。以下の実験に特に説明しなければ同じ条件でX01GBS細胞培養を行った。
また、X01GBD細胞は、このヒト神経癌幹細胞(神経膠芽腫由来の癌幹細胞;human glioblastom stem cell)が濃縮された細胞群であるX01GBS細胞から、以下の方法で樹立された、「分化したヒト神経癌細胞」(分化した神経膠芽腫(human glioblastoma))が濃縮した細胞群として作製した。X01GBD細胞は、Inagaki A, et al. Biochem Biopys Res Commun 2007;361;586−592に記載された樹立法及び分化した状態での維持培養法に従って樹立、維持された。つまり、X01GBS細胞を10%のウシ胎児血清Fetal bovine serumを加えてFGF−2を除いたDulbecco’s modified Eagle’s medium/F−12培地中、通常の接着可能な培養ディッシュで接着単層培養し、これを長期(50継代以上繰り返し)培養し維持することで、癌幹細胞分画が劇的に減少し、ほとんどが分化した癌細胞分画に置き換わった細胞群であるX01GBD細胞を得た。X01GBD細胞の特性は、Inagaki A, et al. Biochem Biopys Res Commun 2007;361;586−592に記載された通りであった。
つまり同一患者の同一組織であるヒト脳神経悪性腫瘍から、悪性度の強い未分化性が高い癌幹細胞分画のX01GBS細胞群と、分化した悪性度の低いX01GBD細胞群が樹立された。
第一抗体として、以下の抗体を使用した:
抗ネスチン(nestin)ウサギポリクローナル抗体(Chemicon,Temecula,CA)
抗ビメンチン(Vimentin)ウサギポリクローナル抗体(Ab45939、Abcam,UK)
抗CD133ウサギポリクローナル抗体(Ab19898,Abcam,UK)
抗βIIIチューブリン(tubulin)(Tuj1)マウスモノクローナル抗体TU20(Ab7751、Abcam,UK)
第二抗体として、波長488nmの緑色蛍光色素と結合した以下の抗体を使用した:
Alexa fluorophore−conjugated 488(mouse/rabbit,Molecular Probes,Invitrogen)
ヒト神経癌幹細胞X01GBSの細胞塊(spheres)を、0.1%ゼラチンコートしたカバーガラス上に播種し、B−27(Invitrogen),recombinante human FGF−2(20 ng/ml;R&D Systems, Minneapolis, MN)とrecombinant human EGF (20 ng/ml;R&D Systems)添加した10%FBSとpenicillin G, stretomycinsulfateを含有するDulbecco‘s modified Eagle’s medium/F−12(D6421,Sigma)培地に5%CO2、37℃で4時間培養した。その後、細胞を1×PBSで洗浄し、400μLの4%PFA/PBSで、室温に15分間固定した。固定後の細胞を1×PBSで洗浄後、第一抗体を細胞に添加し室温に1時間で反応をさせた。反応後1×PBSで洗浄し、第二抗体を上述の希釈率となるように添加し、室温で30分間反応後、PBSで洗浄した。
室温で細胞免疫染色を行った細胞にMounting Medium with DAPI(H−1500, Vector laboratories, Inc., USA)1滴を添加すると、細胞核をすぐ染色された。
(1)細胞
ヒト神経癌幹細胞X01GBS、陽性コントロールとして大腸癌細胞(Caco−2)及びヒトiPS細胞(201B7,理化学研究所より購入)を使用した。
(2)抗体
第一抗体として、抗CD133ウサギポリクローナル抗体(Ab19898,Abcam,UK)(希釈率1:1000)を使用し、第二抗体として、ヤギ抗ウサギポリクローナル抗体IgG/HRP(Dako,Cytomation)(希釈率1:2000)を使用した。
(3)ウエスタンブロッティング
培養した細胞を含む10cmディッシュの培養液を捨てて、PBSで洗浄後、たんぱく質保護剤0.5mM PMSFとProtease inhibitor cocktail(直前に加える)含む可溶化RIPAバッファー(0.5% NP40,0.1% SDS,0.5% Sodium deoxycholate,150mM NaClと50mM Tris(pH7.5))を1mL加え細胞を溶解させた。細胞可溶化溶液と等量の2×サンプルバッファー(4% SDS、20%グリセロール、0.06% β−メルカプトエタノール、100mM Tris(pH6.8)、0.1% ブロモフェノブルー)を加え、95℃で5分煮沸した。10%ポリアクリルアミドゲル(196−12921、Wako)にサンプルを20μgアプライして、電気泳動を行った。メンブレンを転写装置から取り除き、ブロッキングバッファー(5% non−fat dry milk、10mM Tris(pH7.5)、100mM NaCl、0.1% Tween20)に浸して、室温で1時間振とうしてブロッキングした。ブロッキングバッファーを除去後、ブロッキングバッファーで1:1000に希釈した一次抗体反応液を加え、メンブレンを室温で1時間振とうで反応させた。その後、一次抗体液を除去し、ウォッシュバッファー(10mM Tris(pH7.5)、100mM NaCl、0.1% Tween20)を加えて、メンブレンを振とうしながら、室温で15分間、3回洗浄した。ウォッシュバッファーを除去し、2000倍に希釈した二次抗体反応液を加え、メンブレンを振とうしながら、室温で1時間反応させた。二次抗体反応液を除去して、ウォッシュバッファーを添加し、メンブレンを振とうしながら、室温で15分間3回洗浄した。ウォッシュバッファーを除去後、0.125mL/cm2の化学発光反応液Chemi−Lumi One(05027−20,Wako)をメンブレンに加えて1分間反応させてから、露光してタンパク質の発現を検出した。
(1)FCM(1回目)
FCM解析は使用する抗体の製造者Miltenyi Biotec社の添付のプロトコールに従って行った。ヒト神経癌幹細胞X01GBSを使用際にCD133(+)細胞含量を確認した。
図中、楕円で囲んだ範囲に含まれる細胞を全細胞として解析を行った。
(2)FCM(2回目)
一回目と同様にFACSを行った。抗体として、マウス抗ヒトCD133/2(293C3)−PE、及び、マウスIgG−PE(共にMiltenyi Biotec社)を使用した。BD FACSAriaTM II Flow Cytometerを用いて検出した。
ヒト神経癌幹細胞の濃縮分画であるX01GBS細胞と、それから分化した癌細胞を濃縮した分画のX01GBD細胞において、CD133発現の陽性細胞株であるCaco−2細胞(大腸がん)とCD133陰性の細胞である正常細胞のWI−38細胞(線維芽細胞)とともに、同時にフローサイトメトリを行った。
ヒト神経癌幹細胞の濃縮分画であるX01GBS細胞、それから分化した癌細胞を濃縮した分画のX01GBD細胞、及び正常細胞であるWI−38細胞におけるCD133のmRNAの発現レベルを、RT−PCR法後の電気泳動、ならびに定量的RT−PCR法で調べた。ハウスキーピング遺伝子であるHPRTを、RT−PCRのコントロール遺伝子として用いた。
さらにヒト神経癌幹細胞の濃縮分画であるX01GBS細胞をセルソーターにてCD133発現の陽性細胞と陰性細胞に分けて分取し、それぞれの分画において、同様にCD133 mRNA発現レベルを、RT−PCRならびに定量的RT−PCR法で調べた。
(1)CD133プロモーター活性解析用のアデノウイルスベクターの構築
ヒトCD133については、5種類のプロモーターが知られており、それぞれ、プロモーター1(pr1;配列番号1)、プロモーター2(pr2;配列番号2)、プロモーター3(pr3;配列番号3)、プロモーター4(pr4;配列番号4)、及びプロモーター5(pr5;配列番号5)と呼ばれている(Sergey V.Shmelkovら,BLOOD,15 MARCH 2004,Vol.103,No.6)。ヒト神経癌幹細胞X01GBSにおける各プロモーター活性を測定するため、図7に示すように、5つのヒトCD133プロモーターの下流にLacZを連結して、E1領域欠損する非増殖型アデノウイルスベクターに組み込み、レポータアッセイ用アデノウイルスベクターを構築した。以下、pr1の下流にLacZを連結したものをアデノウイルスベクターに組み込んだベクターを「Ad.hCD133pr1−LacZ」といい、同様にpr2〜pr5の下流にLacZを連結したものをアデノウイルスベクターのΔE1に組み込んだベクターを、それぞれ「Ad.hCD133pr2−LacZ」、「Ad.hCD133pr3−LacZ」、「Ad.hCD133pr4−LacZ」、「Ad.hCD133pr5−LacZ」という。また、これらのベクターを総称して「Ad.hCD133pr1−5−LacZ」という。
ベクターの構築方法はChen SH, et al.(1995)PNAS 92 (7):2577−2581記載の方法に参考して構築した。
(2)ヒト神経癌幹細胞X01GBSにおけるCD133プロモーター活性測定
神経癌幹細胞X01GBS細胞の培養条件が実施例1の(1)と同じ。ウイルスの感染方法は感染する予定の細胞を1.5mlチューブに集めて、一回遠心してから、上清を除いて、ウイルス入りの培養液で細胞pptに加え、1時間、37℃でウイルス感染を行った。感染途中、15分毎にtappingかpipettingを行って、ウイルスと細胞の接触回数を増やし感染効率を上げるようにした。
上述の通り構築したレポータアッセイ用アデノウイルスベクター(Ad.hCD133pr1−5−LacZ)を細胞1個に対するウイルスの数MOI (multiplicity of infrction)数で感染を行った。MOI 30でヒト神経癌幹細胞X01GBSに感染させた。感染二日後にBeta−galactosidase enzyme assay system(Promega,USA)を用いて、製造者添付のプロトコールに従って、ヒトCD133の各プロモーターの活性を測定した。
さらに、CD133プロモーターの特性をより詳細に調べるため、ヒト神経癌幹細胞の濃縮分画であるX01GBS細胞と、それから分化した癌細胞を濃縮した分画のX01GBD細胞において、同様のCD133プロモーターアッセイの実験を行った。各グループはN=3で行った。陽性コントロールとしてRSVプロモーターを、陰性コントロールとしてはプロモーターの挿入されていないアデノウイルス(ΔPr)、ならびにアデノウイルスを加えていない細胞(NC)を用いた。活性の感度を上げて詳細に比較できるように、アデノウイルスの感染方法やβ−gala activityの活性測定の感度が上昇できるような各実験ステップでの小さな工夫を除いては、基本的な実験方法は実施例7と同一であった。
CD133プロモーター活性解析用のアデノウイルスベクターは、実施例4と同様の方法により構築し、ヒト神経癌幹細胞X01GBSに導入した。感染二日後にフローサイトメトリにより、FluoReporter lacZ Flow Cytometry Kit(Molecular Probes, Inc.)を用いて、製造者添付のプロトコールに従いLacZの発現を検出することで、CD133プロモーターの活性を測定した。また、抗CD133抗体(マウス抗ヒトCD133/2(293C3)−PE(Miltenyi Biotec社))を用いてCD133(+)細胞を標識して、測定した。
さらにヒト神経癌幹細胞を濃縮分画のX01GBSと、分化した癌細胞を濃縮した分画のX01GBDにおいて、CD133の各プロモーター活性をフローサイトメトリで確認した。
(1)癌幹細胞特異的増殖型アデノウイルスベクターの構築
国際公開第WO2005/012536号パンフレット記載の方法に準じて、図14に示すように5つのCD133プロモーターをアデノウイルスの増殖に必須な初期遺伝子であるE1A領域の前に組み込むことにより、CD133発現腫瘍に特異的に殺傷することのできる癌幹細胞特異的な増殖制御型アデノウイルスベクター(CD133反応性m−CRA)を構築した。以下、CD133プロモーター1を組み込んだCD133反応性m−CRAを「hCD133pr1−m−CRA」という。プロモーター2〜5についても同様に命名する。また、5種類のCD133プロモーターを組み込んだCD133反応性m−CRAを総称して「hCD133pr1−5−m−CRA」という。
神経癌幹細胞X01GBS細胞の培養条件は実施例1の(1)と同じとした。またウイルスの感染方法は実施例4の(2)と同様に行った。
ベクターの構築方法はChen SH, et al.(1995)PNAS 92 (7):2577−2581記載の方法に参考して構築した。
上述の通り構築した非増殖型アデノウイルスベクター(Ad.CA−EGFP)を用いて、MOI 30でヒト神経癌幹細胞X01GBSに感染させた。感染から24時間後にAd.CA−EGFPのヒト神経癌幹細胞X01GBSへの導入効率を測定した。具体的には、Ad.CA−EGFPは、CAプロモーターの下流にEGFP蛍光たんぱく質遺伝子が導入している。ことから、Ad.CA−EGFPの感染によりEGFPの発現が確認できた。
神経癌幹細胞X01GBS細胞の培養条件が実施例1の(1)と同じとした。ウイルスの感染方法は実施例4の(2)と同様に行った。
上述の通り構築したhCD133pr5−m−CRAをMOI 3でヒト神経癌幹細胞X01GBSに感染させた。感染から1,2,3,4及び5日後にhCD133pr5−m−CRAを導入したヒト神経癌幹細胞X01GBSを顕微鏡で観察した。
神経癌幹細胞X01GBS細胞の培養条件が実施例1の(1)と同じ。ウイルスの感染方法は実施例4の(2)と同じ。
上述の通り構築したhCD133pr5−m−CRA、並びにネガティブコントロールとして、Ad.CA−EGFP及びAd.RSV−dE1.3をMOI 1、3、及び10でヒト神経癌幹細胞X01GBSに感染させた。非増殖型アデノウイルスベクター(Ad.RSV−dE1.3)はRSVプロモーターをE1とE3領域欠損する非増殖型アデノウイルスベクターに組み込んだベクターで、アデノウイルスの感染実験にウイルスの感染によるウイルス自身の毒性(治療効果と違い)を評価するため使う。感染から5日後にWST−8 cell proliferation assay kit(Nakarai社)を用いて、生存細胞数を測定した。
さらにhCD133pr−m−CRAの殺傷治療効果が、癌幹細胞特異的であることを示すため、同様の実験をヒト神経癌幹細胞を濃縮分画のX01GBSだけでなく、分化した癌細胞を濃縮した分画のX01GBDでも行い、比較した。
またヒト神経癌幹細胞を濃縮分画のX01GBSと、分化した癌細胞を濃縮した分画のX01GBDが、その通りの特性を持つことを確証するため、NOD/SCID免疫不全マウスへのそれぞれの分画細胞の移植実験を行い、腫瘍形成能を調べた。1×106と1×105のX01GBS細胞をNOD/SCID免疫不全マウスの4ヶ所に、1×106の分化X01GBD細胞をNOD/SCID免疫不全マウスの3ヶ所に皮下移植した。その10週間後、肉眼的に認識できる腫瘍結節の形成の割合を評価した。
Claims (17)
- 腫瘍溶解性ウイルスベクターを有効成分として含有し、前記ウイルスベクターが当該ウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結させたCD133プロモーターを有する、神経癌の癌幹細胞特異的に傷害を与える医薬組成物。
- 前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ミキソーマウイルス、レオウイルス、ベジキュラー・ストマタイティスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、RSウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、又はセネカ・ヴァレイ・ウイルスである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子がアデノウイルスのE1A又はE1B遺伝子である、請求項3に記載の医薬組成物。
- E1Aが、Rb結合領域が欠損したE1A(E1AΔ24)である、又は、E1Bが、p53結合領域が欠損したE1B(E1BΔ55K)である、請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスベクターが、標識遺伝子、又は細胞毒性遺伝子を備える、請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスベクターが、外来性の癌特異的プロモーターを備える、請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスベクターが、以下の(a)〜(e)から選択される1のアデノウイルスベクターである、請求項4又は請求項5に記載の医薬組成物:
(a)以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター:
(a1)CD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1A遺伝子又はE1AΔ24遺伝子からなるCD133転写ユニット
(a2)真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1B遺伝子又はE1BΔ55K遺伝子からなる転写ユニット、あるいは、癌特異的プロモーターの下流に作動可能に連結されたE1BΔ19K遺伝子からなる転写ユニット
(a3)真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット;
(b)以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター:
(b1)真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1A遺伝子又はE1AΔ24遺伝子からなる転写ユニット、
(b2)CD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1B遺伝子又はE1BΔ55K遺伝子からなるCD133転写ユニット、
(b3)真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット;
(c)以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター:
(c1)真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1A遺伝子又はE1AΔ24遺伝子からなる転写ユニット、
(c2)真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1B遺伝子又はE1BΔ55K遺伝子からなる転写ユニット、
(c3)CD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなるCD133転写ユニット;
(d)以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター:
(d1)CD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1A遺伝子又はE1AΔ24遺伝子からなるCD133転写ユニット
(d2)真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1B遺伝子又はE1BΔ55K遺伝子からなる転写ユニット、あるいは、癌特異的プロモーターの下流に作動可能に連結されたE1BΔ19K遺伝子からなる転写ユニット;
(e)以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター:
(e1)真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はCD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1A遺伝子又はE1AΔ24遺伝子からなる転写ユニット、
(e2)CD133プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたE1B遺伝子又はE1BΔ55K遺伝子からなるCD133転写ユニット。 - 標識遺伝子に作動可能に連結させたCD133プロモーターを有するウイルスベクターを含有する、神経癌の癌幹細胞を特異的に標識するための組成物。
- 前記ウイルスベクターが、外来性の癌特異的プロモーターを備える、請求項9に記載の組成物。
- 前記ウイルスベクターが、細胞毒性遺伝子を備える、請求項9又は請求項10に記載の組成物。
- 前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ミキソーマウイルス、レオウイルス、ベジキュラー・ストマタイティスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、RSウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、又はセネカ・ヴァレイ・ウイルスである、請求項9〜請求項11のいずれか1項に記載の組成物。
- CD133プロモーターが、配列番号1〜5のいずれか1つの配列番号に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子である、請求項1〜請求項12のいずれか1項に記載の組成物。
- CD133プロモーターが、CD133のプロモータ5である、請求項1〜請求項12のいずれか1項に記載の組成物。
- 更に、同時に、連続的に又は時間をおいて別々に投与される以下の(i)〜(ii)から選択される1以上の薬剤を含有する、請求項1〜請求項14のいずれか1項に記載の組成物:
(i)抗ウイルス作用を低下させる薬剤、
(ii)抗癌剤。 - 前記神経癌が、神経膠腫である、請求項1〜請求項15のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記神経癌が、グリア芽腫である、請求項16に記載の組成物。
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