TW202011977A - 溶瘤病毒療法及免疫療法 - Google Patents

Abstract

本揭示有關癌症的組合療法，其使用(i)一溶瘤病毒；(ii)一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒；及(iii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。在特定實施例中，該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，包含編碼IL-12和/或拮抗性抗PD-L1抗體之核酸。

Description

溶瘤病毒療法及免疫療法

此申請案主張2018年4月20日提申的US 62/660305之優先權，出於所有目的，其內容及要素在此併入本案以為參考。 技術領域

本揭示至少有關細胞生物學、分子生物學、免疫學、病毒學及醫學之領域，包括癌症療法。在特定實施例中，本揭示有關涉及使用溶瘤病毒療法及免疫療法之組合治療。

發明背景頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC) 之溶瘤病毒療法 HNSCC是全球第六大發病率的癌症。局部晚期、復發及轉移HNSCC之治療，時常受限於不利的藥效對毒性比，且罹患轉移疾病之病患的中位數存活仍小於1年(Zandberg and Strome, Oral Oncology (2014) 50: 627-632)。因為HNSCC是一種出現在身體表面或附近之局部區域疾病，所以其適合原始腫瘤內注射腺病毒載體(Ad)，以便激起局部區域，甚至全身性抗腫瘤免疫反應(Liuet al., Nature Clinical Practice Oncology (2007) 4: 101-117)。許多編碼治療性轉基因之條件性複製Ad (OncAd)或複製缺陷型Ad之臨床試驗已證實是HNSCC之安全且可行的Ad基因療法，但未能表現出整體存活率的改善，因為密集的局部治療，即使結合化學/放射療法，無法防止轉移至遠端部位(Liuet al. ，同上)。OncAd一般是腫瘤內投與，很難重新標向轉移的腫瘤(Koksiet al., Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy (2015) 23:1641-1652)。OncAd 與表達免疫調節分子之輔助依頼型Ad (HDAd)

基于腺病毒的載體(Ad)可以感染一系列的惡性細胞及表達高位準的溶解性抗原及免疫原性轉基因，使得其等有作為癌症基因療法試劑的吸引力(Cerulloet al., Advances in Cancer Research (2012) 115, 265-318)。OncAd會在癌細胞中選擇性地複製，且是臨床試驗中常用於癌症基因療法之基于Ad的載體。然而，OncAd對轉基因(~1.5 kb)之編碼能力有限。輔助依賴型Ad (HDAd)沒有病毒編碼序列，容許在單一載體中***多個轉基因，裝載量高達34kb (Suzukiet al., Human Gene Therapy (2010) 21; 120-126)。因為HDAd載體DNA編碼包裝訊息，所以OncAd複製機制反過來複製及包裝受感染的腫瘤細胞內的OncAd及HDAd，引起多個生產與釋放溶瘤病毒及HDAd編碼的轉基因二者之周期(組合腺病毒載體：CAd-VEC；Farzadet al. , Molecular Therapy - Oncolytics (2014) 1, 14008)。CAR T 細胞療法

近來，癌細胞抗原定向的嵌合抗原受體(CARs；在Kershaw et al., Nature (2013) 13: 525-541之評論中)之表達，促進了T細胞作為癌症治療劑的用途。CAR修飾的T細胞已顯示出用於治療血液惡性腫瘤的希望(Garfallet al., The New England Journal of Medicine (2015) 373:1040-1047)，但在治療實體腫瘤方面效果較低，其部分可能是實體腫瘤微環境之高度免疫抑制本質的結果(Quailet al., Nature Medicine (2013) 19:1423-1437)。由於在腫瘤部位之免疫抑制機制，所以儘管表達了一個或兩個共同刺激的內部結構域(endodomain)，CAR T細胞仍無法長期擴張及持續。

本揭示提供解決長期以來對有效的癌症療法，包括組合癌症療法之需求的解決方法。

發明概要 在一態樣中，本揭示提供一種治療癌症之方法，其包含對一個體投與： (i) 一溶瘤病毒； (ii) 一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒；及 (iii) 至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

亦提供一種用於治療癌症之方法之組合，其包含(i)一溶瘤病毒，(ii)一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒；及(iii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

亦提供一種製造用於治療癌症之方法之藥劑的用途，其使用(i)一溶瘤病毒，(ii)一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒；及(iii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

亦提供一種治療癌症之方法，其包含對一個體投與： (i) 一溶瘤病毒；及 (ii) 至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

亦提供一種用於治療癌症之方法之組合，其包含(i)一溶瘤病毒，及(ii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

亦提供一種製造用於治療癌症之方法之藥劑的用途，其使用(i)一溶瘤病毒，及(ii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

亦提供一種用於治療癌症之方法之溶瘤病毒，該方法包含對一個體個別或同時投與： (i) 一溶瘤病毒；及 (ii) 至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

亦提供的是一種用於治療癌症之方法之至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞，該方法包含對一個體個別或同時投與： (i) 一溶瘤病毒；及 (ii) 至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

亦提供的是溶瘤病毒於製造藥劑之用途，該藥劑可用於包含對一個體個別或同時投與下列之方法： (i) 一溶瘤病毒；及 (ii) 至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

亦提供的是至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞於製造藥劑之用途，該藥劑可用於包含對一個體個別或同時投與下列之方法： (i)一溶瘤病毒；及 (ii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

在一些實施例中，該包含CAR之細胞對該溶瘤病毒具專一性。

亦提供的是一種治療癌症之方法，其包含對一個體投與： (i) 一溶瘤病毒；及 (ii) 至少一種對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。

亦提供的是一種用於治療癌症之方法之組合，其包含(i)一溶瘤病毒；及(ii)至少一種對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。

亦提供的是一種製造用於治療癌症之方法之藥劑之用途，其使用(i)一溶瘤病毒；及(ii)至少一種對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。

亦提供的是一種用於治療癌症的方法之溶瘤病毒，該方法包含對一個體個別或同時投與： (i) 一溶瘤病毒；及 (ii) 至少一種具對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。

亦提供的是一種用於治療癌症之方法之至少一種對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞，該方法包含對一個體個別或同時投與： (i) 一溶瘤病毒；及 (ii) 至少一種對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。

亦提供的是溶瘤病毒於製造藥劑之用途，該藥劑用於包含對一個體個別或同時投與下列之方法： (i) 一溶瘤病毒；及 (ii) 至少一種對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。

亦提供的是至少一種對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞於製造藥劑之用途，該藥劑用於包含對一個體個別或同時投與下列之方法： (i) 一溶瘤病毒；及 (ii) 至少一種對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。

在一些實施例中，該溶瘤病毒是溶瘤腺病毒(OncAd)。在一些實施例中，該溶瘤病毒源於腺病毒5 (Ad5)。在一些實施例中，該溶瘤病毒編碼E1A蛋白，其相較於由Ad5編碼之E1A蛋白，表現出較少結合至Rb蛋白。在一些實施例中，該溶瘤病毒編碼缺少胺基酸序列LTCHEACF (序列辨識編號52)之E1A蛋白。在一些實施例中，該溶瘤病毒編碼包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成之E1A蛋白：序列辨識編號34之胺基酸序列。在一些實施例中，該溶瘤病毒包含具有一或多個供一或多個轉錄因子用的結合位點之核酸。在一些實施例中，該溶瘤病毒包含具有一或多個供STAT1用之結合位點之核酸。

在一些實施例中，該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒是一輔助依賴型腺病毒(helper-dependent adenovirus，HDAd)。在一些實施例中，該免疫調節因子係選自：效應免疫反應(effector immune response)的促效劑或免疫調節反應的拮抗劑。在一些實施例中，該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，包含編碼IL-12和/或拮抗性抗PD-L1抗體(antagonist anti-PD-L1 antibody)之核酸。在一些實施例中，該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，包含編碼能夠將無毒性因子催化轉換成細胞毒性形式之酵素之核酸。在一些實施例中，該酵素係選自：胸苷激酶、胞嘧啶去胺酶、硝基還原酶、細胞色素P450、羧肽酶G2、嘌呤核苷磷酸化酶、辣根過氧化酶及羧酸酯酶。在一些實施例中，該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，包含編碼胸苷激酶之核酸。

在一些實施例中，該至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的CAR之細胞是一T細胞。在一些實施例中，該CAR包含能夠專一性結合HER2之抗原結合域。在一些實施例中，該CAR包含一抗原結合域，其含有： 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號10； LC-CRD2：序列辨識編號11； LC-CRD3：序列辨識編號12； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號13； HC-CRD2：序列辨識編號14； HC-CRD3：序列辨識編號15； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號18； LC-CRD2：序列辨識編號19； LC-CRD3：序列辨識編號20； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號21； HC-CRD2：序列辨識編號22； HC-CRD3：序列辨識編號23； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號26； LC-CRD2：序列辨識編號27； LC-CRD3：序列辨識編號28； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號29； HC-CRD2：序列辨識編號30； HC-CRD3：序列辨識編號31； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號57； LC-CRD2：序列辨識編號58； LC-CRD3：序列辨識編號59； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號60； HC-CRD2：序列辨識編號61； HC-CRD3：序列辨識編號62。

在一些實施例中，該CAR包含一抗原結合域，其包含： 一VL，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號16具有至少75%、80%、85%、90%、95%或更多序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號17具有至少75%、80%、85%、90%、95%或更多序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號24具有至少75%、80%、85%、90%、95%或更多序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號25具有至少75%、80%、85%、90%、95%或更多序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號32具有至少75%、80%、85%、90%、95%或更多序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號33具有至少75%、80%、85%、90%、95%或更多序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號63具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號64具有至少75%序列一致性之胺基酸序列。

在一些實施例中，該方法額外包含： (a)從一個體單離出至少一種細胞，且在一具體實施例中，該細胞是一免疫細胞； (b)修飾該至少一種細胞以表達或包含對癌細胞抗原具專一性的一CAR，或編碼對癌細胞抗原具專一性的CAR之一核酸， (c)可選擇地擴增該修飾的至少一種細胞，及； (d)對一個體投與該經修飾的至少一種細胞；在具體實施例中，投與時，該經修飾的細胞與一或多種其他癌症治療劑一起提供給該個體。

在一些實施例中，該治療癌症之方法包含： (a)從一個體單離出至少一種細胞； (b)修飾該至少一種細胞以表達或包含對癌細胞抗原具專一性的一CAR，或編碼對癌細胞抗原具專一性的CAR之一核酸， (c)可選擇地擴增該經修飾的至少一種細胞，及； (d)對一個體投與該經修飾的至少一種細胞。

在一些實施例中，該治療癌症之方法包含： (a)從一個體單離出至少一種免疫細胞； (b)利用包含下列之方法產生或擴增對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞群：通過在呈現該溶瘤病毒胜肽之抗原呈現細胞(APC)的存在下培養，刺激該免疫細胞，及； (c)對一個體投與至少一種對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。

在一些實施例中，該癌症係選自頭頸癌、鼻咽癌(NPC)、子宮頸癌(CC)、口咽癌(OPC)、胃癌(GC)、肝細胞癌(HCC)及肺癌。

本揭示亦提供一種溶瘤腺病毒(OncAd)，其編碼包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成之E1A蛋白：序列辨識編號34之胺基酸序列。

本揭示亦提供一種溶瘤腺病毒(OncAd)，其包含具有一或多個供STAT1用之結合位點之核酸。在一些實施例中，該OncAd包含與序列辨識編號51具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%,、90%、95%或更多序列一致性之核酸序列，或密碼子簡併(codon degeneracy)所導致之同等序列。

亦提供的是一種OncAd，其包含與序列辨識編號55具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%,、90%、95%或更多序列一致性之核酸序列，或密碼子簡併所導致之同等序列。在一些實施例中，該OncAd編碼包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成之E1A蛋白：序列辨識編號34之胺基酸序列。

本揭示亦提供一種輔助依賴型腺病毒(HDAd)，其包含編碼IL-12和/或拮抗性抗PD-L1抗體之核酸。在一些實施例中，該HDAd額外地包含編碼能夠將無毒性因子催化轉換成細胞毒性形式之酵素之核酸。在一些實施例中，該酵素係選自：胸苷激酶、胞嘧啶去胺酶、硝基還原酶、細胞色素P450、羧肽酶G2、嘌呤核苷磷酸化酶、辣根過氧化酶及羧酸酯酶。

在一些實施例中，該HDAd額外地包含編碼胸苷激酶之核酸。在其中該HDAd核酸編碼IL-12及抗PD-L1抗體之情況下，該各自的表達序列可由或不由相同的調節序列調節。在其中該HDAd核酸編碼IL-12及抗PD-L1抗體二者之情況下，該HDAd核酸上之定位可具有任何適合的構型，諸如在5’至3’之方向上，編碼IL-12之核酸區域在編碼抗PD-L1抗體之核酸區域的上游或下游。

本揭示亦提供一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含一抗原結合域，其包含： 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號10； LC-CRD2：序列辨識編號11； LC-CRD3：序列辨識編號12； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號13； HC-CRD2：序列辨識編號14； HC-CRD3：序列辨識編號15； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號18； LC-CRD2：序列辨識編號19； LC-CRD3：序列辨識編號20； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號21； HC-CRD2：序列辨識編號22； HC-CRD3：序列辨識編號23； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號26； LC-CRD2：序列辨識編號27； LC-CRD3：序列辨識編號28； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號29； HC-CRD2：序列辨識編號30； HC-CRD3：序列辨識編號31； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號57； LC-CRD2：序列辨識編號58； LC-CRD3：序列辨識編號59； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號60； HC-CRD2：序列辨識編號61； HC-CRD3：序列辨識編號62。

在一些實施例中，該CAR包含一抗原結合域，其包含： 一VL，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號16具有至少75%、80%、85%、90%、95%或更多序列一致性之胺基酸序列，及一VH，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號17具有至少75%、80%、85%、90%、95%或更多序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號24具有至少75%、80%、85%、90%、95%或更多序列一致性之胺基酸序列，及一VH，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號25具有至少75%、80%、85%、90%、95%或更多序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號32具有至少75%、80%、85%、90%、95%或更多序列一致性之胺基酸序列，及一VH，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號33具有至少75%、80%、85%、90%、95%序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號63具有至少75%、80%、85%、90%、95%或更多序列一致性之胺基酸序列，及一VH，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號64具有至少75%、80%、85%、90%、95%序列一致性之胺基酸序列。

本揭示亦提供一種可選擇地單離的核酸或多個核酸，其編碼根據本揭示之溶瘤腺病毒(OncAd)、輔助依賴型腺病毒(HDAd)和/或嵌合抗原受體(CAR)。

本揭示亦提供一種細胞，其包含根據本揭示之溶瘤腺病毒(OncAd)、輔助依賴型腺病毒(HDAd)、嵌合抗原受體(CAR)和/或核酸或多個核酸。

本揭示亦提供一種可選擇地單離的核酸或多個核酸，其編碼根據本揭示之溶瘤腺病毒(OncAd)和/或嵌合抗原受體(CAR)。本揭示亦提供一種細胞，其包含根據本揭示之溶瘤腺病毒(OncAd)、嵌合抗原受體(CAR)和/或核酸或多個核酸。亦提供的是一種細胞，其包含根據本揭示之溶瘤腺病毒(OncAd)及嵌合抗原受體(CAR)。

本揭示亦提供一種藥學組成物，其包含根據本揭示之溶瘤腺病毒(OncAd)、輔助依賴型腺病毒(HDAd)、嵌合抗原受體(CAR)；核酸或多個核酸或細胞，且可與一藥學上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑結合或包含於其中。

本揭示亦提供一種治療癌症之方法，其包含對一個體投與根據本揭示之溶瘤腺病毒(OncAd)、輔助依賴型腺病毒(HDAd)、嵌合抗原受體(CAR)、核酸或多個核酸、細胞或藥學組成物。

本揭示亦提供一種用於治療癌症之方法之根據本揭示之溶瘤腺病毒(OncAd)、輔助依賴型腺病毒(HDAd)、嵌合抗原受體(CAR)、核酸或多個核酸、細胞或藥學組成物。

本揭示亦提供一種製造用於治療癌症之藥劑的用途，其使用根據本揭示之溶瘤腺病毒(OncAd)、輔助依賴型腺病毒(HDAd)、嵌合抗原受體(CAR)、核酸或多個核酸、細胞或藥學組成物。

在依照本揭示之各態樣之某些實施例中，該癌症係選自頭頸癌、鼻咽癌(NPC)、子宮頸癌(CC)、口咽癌(OPC)、胃癌(GC)、肝細胞癌(HCC)及肺癌。

本揭示亦提供一種組件式套組，其包含一預定量的根據本揭示之溶瘤腺病毒(OncAd)、輔助依賴型腺病毒(HDAd)、嵌合抗原受體(CAR)、核酸或多個核酸、細胞和/或藥學組成物。

詳細說明 本揭示有關結合使用多個治療劑來治療癌症。特別是，使用(i)溶瘤病毒、(ii)提供免疫調節因子之病毒及(iii)對癌細胞抗原具專一性的CAR攜帶型免疫細胞(諸如T細胞)之組合作為癌症療法。相較於該試劑中任一個單獨使用時可見到的效果，該治療劑之組合提供改良的治療效果。在某些實施例中，該等三種治療劑中之至少二個以加成之作用方式治療癌症，而在其它實施例中，該等三種不同治療劑中之至少二個以協同之作用方式治療癌症。

不欲受到任何特定理論之約束，但治療效果之改善被認為是因結合溶瘤病毒療法(如，有效的治療實體腫瘤)與CAR-T細胞療法(如，有效的治療瀰漫性/轉移癌)之有利特徵，合併提供對CAR-T細胞之增生及活性有利的免疫環境而達致。溶瘤病毒

本揭示使用溶瘤病毒。溶瘤病毒及其等治療癌症之用途於例如Chiocca and Rabkin Cancer Immunol Res (2014) 2(4): 295-300之評論中，其完整地在此併入本案以為參考。

溶瘤病毒會在癌細胞中複製並導致細胞的溶解。通常其等會選擇癌細胞，而不是非癌細胞。例如，溶瘤病毒通常偏好在***細胞中複製，而不是在非***細胞中。因此溶瘤病毒可在不會對正常、非癌細胞/組織產生實質性損害之情況下，選擇性地殺傷癌細胞及摧毀腫瘤。

溶瘤病毒療法具有許多的優點。溶瘤病毒通常會靶向許多致癌途徑及使用多種細胞毒殺機制，使產生抗性之機會最小。如上所述，因為溶瘤病毒選擇性地在腫瘤中複製且為非病原性的，所以其等表現出最小的毒性。且由於病毒的複製，腫瘤中病毒的劑量會隨著時間而增加，以及亦可以基因方式改善溶瘤病毒的安全性，如通過基因工程修飾對藥物之敏感性。

主要的溶瘤病毒類型有二種： (i)優先在癌細胞中自然複製的病毒，且時常因對先天抗病毒信號的敏感性升高或對致癌信號途徑的依賴性，其在人體中為非致病性的，包括自發性小病毒、粘液瘤病毒(MYXV；痘病毒)、新城疫病毒(NDV；副粘病毒)、里奥病毒和塞內卡谷病毒(Seneca valley virus　(SVV)；小核糖核酸病毒)；及 (ii)在正常而非癌細胞中複製所需的基因上進行如突變/缺失之基因操作的病毒，包括腺病毒(Ad)、單純皰疹病毒(HSV)、痘瘡病毒(VV)和水皰性口炎病毒(VSV；棒狀病毒)；或經基因操作而作為疫苗載體的病毒，包括麻疹病毒(MV；副粘病毒）、脊髓灰質炎病毒(PV；小核糖核酸病毒)及VV(痘病毒)。

基因操作可包括功能序列之***/改變，以提供增強的癌細胞選擇性、安全性和/或修飾病毒向性。

例如，溶瘤病毒可通過基因工程引入僅容許病毒在標靶細胞中轉譯之組織專一性內部核糖體進入位點(IRESs)，和/或引進miRNAs/miRNA反應元件(MREs)；健康細胞或某些組織與腫瘤細胞間不同的miRNA表達，使得病毒不被健康細胞/組織瞄準。溶瘤病毒亦可通過工程改造而將病毒基因組之轉錄置於細胞或組織專一性調節區，諸如啟動子/強化子(如，腫瘤細胞專一性啟動子)的控制下。在一些實施例中，根據本揭示之溶瘤病毒可包含一或多個為此目的之修飾。

亦可針對轉導靶向來修飾病毒，如透過修飾病毒受體/外殼蛋白，以便靶向腫瘤細胞和/或不靶向健康細胞/組織。

溶瘤病毒可用如上Chiocca及Rabkin中所述的方式投與，即在個體中引起最小的抗溶瘤病毒反應(如，利用抗病毒抗體中和)且之後封存在肝中，及使腫瘤傳遞最大化。例如，溶瘤病毒可於細胞載體中投與，如間質基質細胞、髓源性抑制細胞(MDSCs)、神經幹細胞、T細胞、細胞激素誘導的殺手細胞或照射的腫瘤細胞，或可塗覆在奈米粒子上。

在一些實施例中，本揭示之溶瘤病毒是，或源自腺病毒(Ad)、單純皰疹病毒(HSV)、痘瘡病毒(VV)、水皰性口炎病毒(VSV)；自發性小病毒、粘液瘤病毒(MYXV)、新城疫病毒(NDV)、里奥病毒、塞內卡谷病毒(SVV)、麻疹病毒、反轉錄病毒、流感病毒、辛德畢斯病毒(SINV)或痘病毒。在一些實施例中，該溶瘤病毒不是痘瘡病毒。在一些實施例中，該溶瘤病毒不是痘瘡病毒JX-594。

在此使用之“源自”一參考病毒之溶瘤病毒，包含該參考病毒所擁有的核酸序列或胺基酸序列。在一些實施例中，“源自”一參考病毒之溶瘤病毒，包含該參考病毒所擁有的一或多個基因。在一些實施例中，“源自”一參考病毒之溶瘤病毒，編碼由該參考病毒編碼的一或多種蛋白。

在一些實施例中，源自一參考病毒之溶瘤病毒，可包含編碼該參考病毒之一或多個功能元件之核酸序列。“功能元件”可為如轉錄調節子(如，啟動子/強化子)、後轉錄加工之調節子、轉譯調節子、後轉錄加工之調節子、反應元件、重複序列或病毒蛋白。在一些實施例中，源自一參考病毒之溶瘤病毒，可包含該參考病毒之一或多個基因或其所編碼之蛋白。

在一些實施例中，本揭示之溶瘤病毒是或源自腺病毒(OncAd)。OncAds綜述於如Larsonet al. , Oncotarget. (2015) 6(24): 19976–19989中，其完整地在此併入本案以為參考。

在一些實施例中，該OncAd是或源自物種A、B、C、D、E、F或G人腺病毒(如，HAdV-A、HAdV-B、HAdV-C、HAdV-D、HAdV-E、HAdV-F或HAdV-G)。在一些實施例中，該OncAd是或源自物種C人腺病毒。在一些實施例中，該OncAd是或源自Ad5、Ad2、Ad1、Ad6或Ad57。

在一些實施例中，該OncAd是條件複製型腺病毒(或CRAd)。

在一些實施例中，該OncAd具有減低感染非癌細胞、於非癌細胞中複製和/或溶解非癌細胞之能力(相較於感染相當的癌細胞/於相當的癌細胞中複製和/或溶解相當的癌細胞之能力)，例如基因修飾該OncAd之來源腺病毒的結果。

在一些實施例中，該溶瘤病毒包含對一或多個蛋白編碼序列之修飾。在一些實施例中，該修飾改變該編碼的蛋白之產率或活性。在一些實施例中，該修飾是該蛋白之截短或缺失。

在一些實施例中，該OncAd包含對腺病毒早期蛋白之修飾。在一些實施例中，該修飾是針對編碼E1A蛋白之區域。在一些實施例中，該OncAd編碼一E1A蛋白，其與野生型E1A蛋白(如，由該OncAd之來源腺病毒編碼的E1A)相比，具有較少結合至Rb蛋白之能力。在一些實施例中，該OncAd編碼缺少胺基酸序列LTCHEACF (序列辨識編碼52)之E1A蛋白。包含編碼缺少胺基序列LTCHEACF (序列辨識編號52)之E1A蛋白之OncAd的例子，是序列辨識編號55中所示的Onc5/3Ad2E1Δ24。

在一些實施例中，該溶瘤病毒編碼一E1A蛋白，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號34具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或具有100%序列一致性之胺基酸序列。

在一些實施例中，該溶瘤病毒包含為一或多個轉錄因子提供一或多個結合位點之核酸序列。在一些實施例中，該轉錄因子是活化轉錄因子(即，轉錄活化蛋白)。為一或多個轉錄因子提供的一或多個結合位點，較佳地提供在編碼一或多個功能元件(如，病毒蛋白)之核酸序列的上游(即，5’至)。

在一些實施例中，該轉錄因子是與在相當的非癌細胞(如，源自相同組織/細胞類型之非癌細胞)中相比，在癌細胞中具有增加表達或增加活性之轉錄因子。

本文中之“表達”可意指基因表達或蛋白表達。基因表達可通過熟悉此技藝之人士已知之各種方法測量，例如使用定量即時PCR (qRT-PCR)測量mRNA位準或通過基於報告基因之方法。相似地，蛋白表達可通過熟悉此技藝之人士熟知之各種方法測量，如通過基於抗體的方法，例如通過西方墨點法、免疫組織化學法、免疫細胞化學法、流動式細胞測量術、ELISA、ELISPOT或基於報告基因的方法。

包含一或多個供一或多個轉錄因子用的結合位點之OncAd的例子，為Rojaset al. 2010 Mol Ther 18 1960-1971中所述的ICOVIR15，其完整地在此併入本案以為參考。ICOVIR15包含8個供轉錄因子E2F用的結合位點。

在一些實施例中，該溶瘤病毒包含一或多個供轉錄因子用的結合位點，其在細胞中之基因或蛋白表達或活性，會因應免疫細胞所產生或表達的因子而上調。在一些實施例中，免疫細胞所產生或表達的因子，可為效應免疫細胞(effector immune cell)，如CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)、CD4+ T輔助1 (TH1)細胞、自然殺手(NK)細胞或自然殺手T (NKT)細胞所產生的至少一種細胞激素/趨化激素，或其等之細胞表面表達的蛋白。

在一些實施例中，本揭示之溶瘤病毒包含一或多個供STAT轉錄因子用的結合位點。在一些實施例中，該溶瘤病毒包含一或多個供STAT1用的結合位點。本文中所述的ICOSTAT OncAd擁有8個供STAT1用的結合位點，且已知STAT1可被IFNγ上調。在一特定實施例中，ICOSTAT對癌症治療特別有效，因為宿主對癌細胞的免疫反應會促進該溶瘤病毒在原位的複製。

在一些實施例中，該溶瘤病毒包含超過一個供STAT1用的結合位點，如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個供STAT1用的結合位點。在一些實施例中，供STAT1用的結合位點，可包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：序列TTCCGGGAA (序列辨識編號53)或TTCTCGGAA (序列辨識編號54)。在一些實施例中，本揭示之溶瘤病毒包含該序列TTCCGGGAA (序列辨識編號53)或TTCTCGGAA (序列辨識編號54)之一或多個複本。

在一些實施例中，根據本揭示之溶瘤病毒包含下列或由下列構成或基本上由下列所構成：與序列辨識編號51具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或具有100%序列一致性之核酸序列，或密碼子簡併所導致的同等序列。

在一些實施例中，根據本揭示之溶瘤病毒包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：與序列辨識編號55具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或具有100%序列一致性之核酸序列，或密碼子簡併所導致的同等序列。

在一些實施例中，根據本揭示之溶瘤病毒編碼與包含下列、由下列構成或基本上由下列構成之溶瘤病毒所編碼的蛋白相同的蛋白：序列辨識編號55所示之核酸。在一些實施例中，根據本揭示之溶瘤病毒編碼與包含下列、由下列構成或基本上由下列構成之溶瘤病毒所編碼的蛋白相同的蛋白：序列辨識編號51所示之核酸。包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒

本揭示使用包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒。該病毒作用為傳遞該免疫調節因子之載體。在某些實施例中，該病毒包含編碼超過一個免疫調節因子之核酸。

任何能夠將編碼免疫調節因子之核酸導入細胞(如，人原代免疫細胞)之病毒均可使用。適合的病毒包括γ反轉錄病毒(如，小鼠白血病病毒(MLV)來源載體)、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒、痘瘡病毒及疱疹病毒，如Mauset al. , Annu Rev Immunol (2014) 32:189-225或Morgan and Boyerinas, Biomedicines 2016 4, 9所述的，其等完整地在此併入本案以為參考。在一些實施例中，該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒是，或源自腺病毒、慢病毒、反轉錄病毒或疱疹病毒。

在一些實施例中，該包含編碼至少一個免疫調節因子之核酸的病毒，是包含編碼至少一個免疫調節因子之核酸的溶瘤病毒。

由根據本發明之包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒所編碼之免疫調節因子，優先選擇可促進對個體之癌症的免疫反應，特別是細胞介導的免疫反應。在一實施例中，該免疫調節因子提供有利於效應免疫細胞(如，CTLs、T_H 1細胞、NK細胞或NKT細胞)之活化、募集、增生、活性和/或存活的條件。

在一些實施例中，該免疫調節因子可為效應免疫反應的促效劑，如促進效應免疫細胞之活化、募集、增生、活性和/或存活之細胞激素或趨化激素(如，IL-2、IL-7、IL-17、IL-12、IL-21、IL-15、MIP-1α或RANTES)，共同刺激受體(如，4-1BB、OX40、CD28、CD27、ICOS、CD30或GITR)之促效性抗體，或共同刺激受體(如，4-1BBL、OX40L、CD80、CD86、CD70、ICOSL、CD30L或GITRL)之配位子。在一些實施例中，效應免疫反應之促效劑可為免疫檢查點抑制劑的拮抗劑，或免疫檢查點抑制劑之配位子的拮抗劑，如針對PD-L1、PD-L2、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、Gal-9、TIGIT、VISTA或BTLA之拮抗性抗體，或細胞激素/趨化激素(效應免疫反應之拮抗劑；如TGFβ)之拮抗劑(即，拮抗性抗TGFβ抗體或可溶性/誘餌TGFβ受體)。在一些實施例中，效應免疫反應之促效劑可為用於吸引及收編旁觀者效應免疫細胞如T細胞及NK細胞之分子。

在一些實施例中，該免疫調節因子可為免疫調節反應的拮抗劑，如促進免疫調節細胞，如調節性T細胞(Tregs)和/或髓源抑制細胞(MDSCs)之活化、募集、增生、活性和/或存活的細胞激素/趨化激素，如CCL9、CXCL10、CCL20、CCL22之拮抗劑。

在一些實施例中，該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，可額外包含編碼另外的功能序列之核酸。例如，該病毒可包含編碼用於降低感染細胞的生長/增生/存活之蛋白，或用於使感染細胞對指定治療劑敏感之蛋白，或用於破壞腫瘤結構以促進免疫細胞浸潤之蛋白(如，消化腫瘤基質之酵素)之核酸。

在一些實施例中，該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，額外地包含編碼能夠將無毒性因子催化轉換成細胞毒性形式之酵素之核酸。該酵素可將無毒性前驅藥轉換成其活性細胞毒性形式。

酵素/前驅藥系統是業界熟悉的，包括Malekshah et al. Curr Pharmacol Rep. (2016) 2(6): 299–308中所述的，其完整地在此併入本案以為參考。無毒性前驅藥、其等之活性細胞毒性形式及能夠將該無毒性前驅藥轉換成其等之活性細胞毒性形式之例子，示於Malekshah等人之圖2中。

在一些實施例中，該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，額外地包含編碼胸苷激酶、胞嘧啶去胺酶、硝基還原酶、細胞色素P450、羧肽酶G2、嘌呤核苷磷酸化酶、辣根過氧化酶和/或羧酸酯酶之核酸。

例如，該病毒可包含編碼胸苷激酶之核酸，用於使表達該病毒之細胞對更昔洛韋(ganciclovir；GCV)、阿昔洛韋(aciclovir；ACV)和/或代昔洛韋(valaciclovir)之治療敏感。該病毒可包含編碼胞嘧啶去胺酶之核酸，用於使表達該病毒之細胞對5-氟胞嘧啶(5-FC)，其會被胞嘧啶去胺酶轉換成5-氟脲嘧啶(5-FU)，之治療敏感。該病毒可包含編碼硝基還原酶之核酸，用於使表達該病毒之細胞對CB1954、硝基-CBI-DEI和/或PR-104A之治療敏感。該病毒可包含編碼細胞色素P450之核酸，用於使表達該病毒之細胞對氧氮磷環類(如，環磷醯胺或異環磷醯胺)之治療敏感。該病毒可包含編碼羧肽酶G2之核酸，用於使表達該病毒之細胞對氮芥子氣類藥物(如，CMDA或ZD2767P)之治療敏感。該病毒可包含編碼嘌呤核苷磷酸化酶之核酸，用於使表達該病毒之細胞對6-甲基嘌呤2-去氧核糖苷和/或氟達拉濱(fludarabine) (如，6-甲基嘌呤-2’-去氧核糖苷(MeP-dR)、2-F-2’-去氧腺苷(F-dAdo)或***呋喃糖基-2-F-腺嘌呤單磷酸酯(F-araAMP)之治療敏感。該病毒可包含編碼辣根過氧化酶之核酸，用於使表達該病毒之細胞對吲哚-3-醋酸(IAA)之治療敏感。該病毒可包含編碼羧酸酯酶之核酸，用於使表達該病毒之細胞對伊立替康(irinotecan)之治療敏感。

在一些實施例中，該病毒可包含編碼生長因子之拮抗劑之核酸。

在一些實施例中，該病毒可為輔助依賴型腺 病毒(HDAd)。HDAds綜述於例如Rosewellet al. , J Genet Syndr Gene Ther (2011) Suppl 5:001中，其完整地在此併入本案以為參考。

HDAds缺乏病毒蛋白編碼序列，因此具有很大的容量(高達37Kb)供轉導所關注的編碼序列。HDAds為非嵌入型的，能夠獨立於細胞週期有效地轉導多種細胞類型，及介導長期轉基因表達而無慢性毒性。

HDAds僅包含基因組複製(倒轉末端重複(ITRs))及衣殼化(ψ)所需之順式作用病毒元件，因此依賴輔助病毒進行增殖。當以輔助病毒及HDAd二者感染細胞時，該輔助病毒複製機制會以反式之方式複製及包裝HDAd。

在本揭示之特定實施例中，該溶瘤病毒是OncAd，及該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒是HDAd，且該OncAd與HDAd能夠共同感染並在癌細胞中複製。

HDAd對OncAd之輔助的依賴，提供免疫調節因子之高度局部的表達。即，因為HDAd僅能夠在與OncAd共同感染之細胞中增殖，接著因為OncAd對於在癌細胞中之複製具有選擇性，所以由HDAd編碼之因子的表達侷限於癌細胞/組織，使副作用最小化。

此外，因為OncAd與HDAd能有效地靶向及感染腫瘤細胞，所以該等細胞中免疫調節因子之表達會改變正常的免疫抑制性腫瘤微環境，而提供促進效應免疫細胞的活化、募集(即，腫瘤穿透/浸潤)、增生、活性和/或存活之條件。

特別是，在本揭示中之治療方法使用CAR-T細胞之情況下，由該HDAd編碼之免疫調節因子的表達，提供該CAR-T細胞增強的活化、募集、增生、活性和/或存活。

在本文的特定實施例中，該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，是包含編碼IL-12p70、HSV-1胸苷激酶及拮抗性抗PD-L1微抗體之核酸的HDAd。

在一些實施例中，根據本揭示之包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，編碼IL-12。在一些實施例中，該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，包含編碼與序列辨識編號35具有至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列之核酸。

在一些實施例中，根據本揭示之包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，編碼PD-1/PD-L1之訊息的拮抗劑。在一些實施例中，該PD-1/PD-L1訊息的拮抗劑是抗PD-L1抗體。

在一些實施例中，該抗PD-L1抗體包含一抗原結合域，其包含一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號39； LC-CRD2：序列辨識編號40； LC-CRD3：序列辨識編號41； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號42； HC-CRD2：序列辨識編號43； HC-CRD3：序列辨識編號44。

在一些實施例中，該抗PD-L1抗體包含一VL，其包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：與序列辨識編號45具有至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或具有100%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：與序列辨識編號46具有至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或具有100%序列一致性之胺基酸序列。

在一些實施例中，該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，包含編碼與序列辨識編號38具有至少75%, 76%, 77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列之核酸。

在一些實施例中，根據本揭示之包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，包含編碼胸苷激酶之胺基酸序列。在一些實施例中， 該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，包含編碼與序列辨識編號36具有至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列之核酸。

在一些實施例中，根據本揭示之包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：與序列辨識編號50具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或具有100%序列一致性之核酸序列，或密碼子簡併所導致之同等序列。嵌合抗原受體(CARs) 及CAR 表達細胞

本揭示使用包含嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞。

嵌合抗原受體(CARs)是重組受體，其提供抗原結合及免疫細胞活化功能二者。CAR結構及工程綜述於例如Dottiet al. , Immunol Rev (2014) 257(1)中，其完整地在此併入本案以為參考。CARs包含連接至細胞膜錨定區之抗原結合區及訊息傳導區。任擇的鉸鏈區可提供該抗原結合區及細胞膜錨定區間之區隔，且可作為一可撓性連接子。

CAR之抗原結合區可以抗體(其對CAR所靶向之抗原具專一性)之抗原結合區，或其它能夠結合至該標靶之劑為基礎。例如，CAR之抗原結合域可包含會專一性結合至標靶蛋白之抗體的互補決定區(CDRs)之胺基酸序列或完整的輕鏈及重鏈可變區胺基酸序列。CARs之抗原結合域可基於其它蛋白：蛋白交互反應靶向抗原，諸如配位子：受體結合；例如使用以IL-13為基礎之抗原結合域，開發靶向IL-13Rα2的CAR (見如Kahlonet al . 2004 Cancer Res 64(24): 9160-9166)。

本揭示之CAR包含對癌細胞抗原具專一性的抗原結合區。該CAR之抗原結合區可以任何適合的格式提供，如scFv、Fab等等。在一些實施例中，該CAR之抗原結合區包含癌細胞抗原結合性scFv或由其構成。

癌細胞抗原是一種由癌細胞表達之抗原。癌細胞抗原可為任何的胜肽/多肽、糖蛋白、脂蛋白、聚醣、醣脂、脂質或其片段。癌細胞抗原的表達可能與癌症有關。癌細胞抗原可能為癌細胞異常的表達(如，癌細胞抗原可能在異常的位置表達)或可能為癌細胞表達的不正常結構。癌細胞抗原可能能夠引發免疫反應。

在一些實施例中，該抗原表達在癌細胞的細胞表面上(即，該癌細胞抗原是癌細胞表面抗原)。在一些實施例中，該抗原中被本揭示之雙專一性抗原結合性多肽結合之部分，表現在癌細胞的外表面上(即，是胞外的)。在一些實施例中，該抗原透過如跨膜域或其它膜錨(如，脂質錨，諸如GPI錨)而錨定在細胞膜上。在一些實施例中，該癌細胞抗原表達在癌細胞之細胞表面上(即，表達在細胞膜中或上)，但可能表達在細胞內部(即，表達在相當的非癌細胞內部)。

該癌細胞抗原可為癌症相關抗原。在一些實施例中，該癌細胞抗原是一種其表達與癌症之發展、進展和/或症狀嚴重程度相關的抗原。該癌症相關的抗原可能與癌症之病因或病理相關，或可能由於癌症而異常表達。在一些實施例中，該抗原是一種相較於相當的非癌細胞(如，源自相同組織/細胞類型之非癌細胞)的表達位準，其表達(如，RNA和/或蛋白位準)被癌細胞上調之抗原。

在一些實施例中，該癌症相關的抗原可優先由癌細胞表達，而不是由相當的非癌細胞(如，源自相同組織/細胞類型之非癌細胞)表達。在一些實施例中，該癌症相關的抗原可為突變的致癌基因或突變的腫瘤抑制基因之產物。在一些實施例中，該癌症相關的抗原可為過度表達的細胞蛋白之產物、致癌病毒產生的癌抗原、癌胚胎抗原或細胞表面糖脂質或糖蛋白。

癌細胞抗原綜述於Zarour HM, DeLeo A, Finn OJ,et al. Categories of Tumor Antigens. In: Kufe DW, Pollock RE, Weichselbaum RR,et al. , editors. Holland-Frei Cancer Medicine. 6th edition. Hamilton (ON): BC Decker; 2003中。癌細胞抗原包括癌胚胎抗原：CEA、未成熟層粘連蛋白受體、TAG-72；致癌病毒抗原，如HPV E6及E7；過度表達的蛋白：BING-4、鈣活化氯離子通道2、周期蛋白-B1、9D7、Ep-CAM、EphA3、HER2/neu、端粒酶、間皮素(mesothelin)、SAP-1、存活蛋白(surviving)；癌-睪丸抗原：BAGE、CAGE、GAGE、MAGE、SAGE、XAGE、CT9、CT10、NY-ESO-1、PRAME、SSX-2；譜系限制抗原：MART1、Gp100、酪胺酸酶、TRP-1/2、MC1R、***專一性抗原；突變抗原：β-連環蛋白、RCA1/2、CDK4、CML66、纖維接合素、MART-2、p53、Ras、TGF-βRII；轉譯後改變的抗原： MUC1、獨特型抗原：Ig、TCR。其它癌細胞抗原包括熱休克蛋白70 (HSP70)、熱休克蛋白90 (HSP90)、葡萄糖調節蛋白78 (GRP78)、波形蛋白(vimentin)、核仁素、胎兒-腺泡胰蛋白(FAPP)、鹼性磷酸酶胎盤樣型2 (ALPPL-2)、唾液酸凝集素5 (siglec-5)、壓力誘導磷酸化蛋白1 (STIP1)、蛋白酪胺酸激酶7 (PTK7)及親環素B。

在一些實施例中，該癌細胞抗原是HER2。在一些實施例中，本揭示之CAR包含能夠專一性結合HER2之抗原結合域。在一些實施例中，該CAR包含一抗原結合域，其包含能夠專一性結合HER2之抗體的CDRs。在一些實施例中，該CAR包含一抗原結合域，其包含能夠專一性結合HER2之抗體的VL及VH區。

在一特定實施例中，該CAR表達性細胞包含二個單獨的CARs，各靶向不同的癌細胞抗原，在一特定態樣中，該CARs中之至少一個靶向HER2。在一些情況下，該CAR對二種不同的癌細胞抗原具雙專一性，其中之一可為HER2。

在一些實施例中，該CAR包含一抗原結合域，其包含一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號10、序列辨識編號18、序列辨識編號26或序列辨識編號57； LC-CRD2：序列辨識編號11、序列辨識編號19、序列辨識編號27或序列辨識編號58； LC-CRD3：序列辨識編號12、序列辨識編號20、序列辨識編號28或序列辨識編號59； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號13、序列辨識編號21、序列辨識編號29或序列辨識編號60； HC-CRD2：序列辨識編號14、序列辨識編號22、序列辨識編號30或序列辨識編號61； HC-CRD3：序列辨識編號15、序列辨識編號23、序列辨識編號31或序列辨識編號62。

在一些實施例中，該CAR包含一抗原結合域，其包含一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號10； LC-CRD2：序列辨識編號11； LC-CRD3：序列辨識編號12； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號13； HC-CRD2：序列辨識編號14； HC-CRD3：序列辨識編號15。

在一些實施例中，該CAR包含一抗原結合域，其包含一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號18； LC-CRD2：序列辨識編號19； LC-CRD3：序列辨識編號20； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號21； HC-CRD2：序列辨識編號22； HC-CRD3：序列辨識編號23。

在一些實施例中，該CAR包含一抗原結合域，其包含一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號26； LC-CRD2：序列辨識編號27； LC-CRD3：序列辨識編號28； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號29； HC-CRD2：序列辨識編號30； HC-CRD3：序列辨識編號31。

在一些實施例中，該CAR包含一抗原結合域，其包含一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號57； LC-CRD2：序列辨識編號58； LC-CRD3：序列辨識編號59； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號60； HC-CRD2：序列辨識編號61； HC-CRD3：序列辨識編號62。

在一些實施例中，該CAR包含一抗原結合域，其包含一輕鏈可變區(VL)，該區包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：與序列辨識編號16、24、32或63具有至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或具有100%序列一致性之胺基酸序列。

在一些實施例中，該CAR包含一抗原結合域，其包含一重鏈可變區(VH)，該區包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：與序列辨識編號17、25、33或64具有至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或具有100%序列一致性之胺基酸序列。

在一些實施例中，該CAR包含一抗原結合域，其包含一VL，其包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：與序列辨識編號16具有至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或具有100%序列一致性之胺基酸序列，及一VH，其包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：與序列辨識編號17具有至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或具有100%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，該CAR包含一抗原結合域，其包含一VL，其包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：與序列辨識編號24具有至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或具有100%序列一致性之胺基酸序列，及一VH，其包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：與序列辨識編號25具有至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或具有100%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，該CAR包含一抗原結合域，其包含一VL，其包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：與序列辨識編號32具有至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或具有100%序列一致性之胺基酸序列，及一VH，其包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：與序列辨識編號33具有至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或具有100%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，該CAR包含一抗原結合域，其包含一VL，其包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：與序列辨識編號63具有至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或具有100%序列一致性之胺基酸序列，及一VH，其包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：與序列辨識編號64具有至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或具有100%序列一致性之胺基酸序列。

在一些實施例中，本揭示之CAR包含一抗原結合區，其包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：根據本揭示之抗體/抗原結合片段。

該細胞膜錨區提供在該CAR之抗原結合區與訊息傳導區之間。該細胞膜錨區提供該CAR錨定至CAR表達性細胞的細胞膜上，具有抗原結合區在胞外空間中，而訊息傳導區在該細胞之內部。適合的跨膜域包括源自CD28、CD3-ζ、CD4或CD8之跨膜區。

在一些實施例中，該細胞膜錨區包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：與序列辨識編號4具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。

CAR之訊息傳導區允許活化T細胞。該CAR訊息傳導區可包含CD3-ζ胞內域之胺基酸序列，其提供免疫受體酪胺酸活化基序(ITAMs)進行磷酸化及活化CAR表達性T細胞。在CARs中亦使用包含其它含ITAM蛋白之序列之訊息傳導區，諸如包含FcγRI之含ITAM區的結構域(Hayneset al. , 2001 J Immunol 166(1):182-187)。包含源自CD3-ζ胞內域之訊息傳導區之CARs一般稱作第一代CARs。

在一些實施例中，該細胞膜錨區包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：與序列辨識編號6具有至少80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%序列一致性之胺基酸序列。

CARs之訊息傳導區亦可包含源自共同刺激分子之訊息傳導區之共同刺激序列，以便在結合至標靶蛋白時，促進CAR表達性T細胞之活化。適合的共同刺激分子包括至少CD28、OX40、4-1BB、ICOS及CD27。具有包括額外共同刺激序列之訊息傳導區之CARs，一般稱作第二代CARs。

在一些情況下，CARs被設計為可提供共同刺激不同的胞內訊息傳導途徑。例如，與CD28共刺激相關之訊息傳導會優先活化磷脂酸肌醇3-激酶(P13K)途徑，而4-1BB介導的訊息傳導是透過TNF受體相關因子(TRAF)轉接蛋白。因此CARs之訊息傳遞區有時含有源自超過一種共同刺激分子之訊息傳遞區之共同刺激序列。包含多個共同刺激序列之訊息傳遞區之CARs，一般稱作第三代CARs。

在一些實施例中，本揭示之CAR包含一或多個共同刺激序列，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列構成或基本上由一胺基酸序列構成，該胺基酸序列包含下列或由下列構成或基本上由下列構成或源自下列：CD28、OX40、4-1BB、ICOS及CD27中一或多個之胞內域之胺基酸序列。

在一些實施例中，該細胞膜錨區包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：與序列辨識編號5具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。

任擇的鉸鏈區可提供該抗原結合域與該跨膜域間之分隔，且可作為可撓性連接子。鉸鏈區可為容許該結合基序朝向不同方向之可撓性結構域。鉸鏈區可源自IgG1或免疫球蛋白之CH₂ CH₃ 區。在一些實施例中，本揭示之CAR包含一鉸鏈區，其包含一胺基酸序列或由一胺基酸序列構成或基本上由一胺基酸序列構成，該胺基酸序列包含下列由下列構成或基本上由下列構成或源自下列：IgG1之鉸鏈區或免疫球蛋白之CH₂ CH₃ 之胺基酸序列。

在一些實施例中，該細胞膜錨區包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：與序列辨識編號9具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。

在一些實施例中，該CAR包含下列或由下列構成或基本上由下列構成：與序列辨識編號1、2、3或56具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或具有100%序列一致性之胺基酸序列。

本揭示亦提供一種包含或表達根據本揭示之CAR之細胞。亦提供的是一種包含或表達編碼根據本揭示之CAR的核酸之細胞。使CAR進入T細胞之工程，可在試管內用於轉導的培養期間進行，而擴增發生在諸如過繼性T細胞療法之T細胞擴張期間。用於建構免疫細胞以表達CARs之方法是熟悉此技藝之人士已知的，且述於如Wang and Rivière Mol Ther Oncolytics. (2016) 3:16015中，其完整地在此併入本案以為參考。可以理解的是“至少一個細胞”包含複數個細胞，如細胞群。

該包含或表達根據本發明之CAR之細胞可為真核細胞，如哺乳動物細胞。哺乳動物可為人或非人哺乳動物(如，兔子、天竺鼠、大鼠、小鼠或其它嚙齒動物(包括任何嚙齒目之動物)、貓、狗、豬、綿羊、山羊、牛(包括母牛，如乳用母牛或任何牛屬之動物)、馬(包括任何馬科之動物)、驢及非人靈長類)。

在一些實施例中，該細胞可來自，或可獲自人個體。當使用CAR表達性細胞來治療一個體時，該細胞可來自待用該CAR表達性細胞治療之個體(即，該細胞可為自體的)或該細胞可來自不同的個體(即，該細胞可為異體的)。

該細胞可為免疫細胞。該細胞可為造血來源細胞，如，中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、樹突細胞、淋巴細胞或單核球。淋巴細胞可為如T細胞、B細胞、NK細胞NKT細胞或先天性淋巴細胞(ILC)或其前驅物。該細胞可表達如CD3多肽(如，CD3γ CD3ε CD3ζ或CD3δ)、TCR多肽(TCRα或TCRβ)、CD27、CD28、CD4或CD8。

在一些實施例中，該細胞是T細胞。在一些實施例中，該T細胞是CD3+ T細胞。在一些實施例中，該T細胞是CD3+、CD8+ T細胞。在一些實施例中，該T細胞是細胞毒性T細胞(如，細胞毒性T淋巴細胞(CTL))。

使用CAR T細胞，具有可全身投與且會指向原發及轉移腫瘤二者之相關的優點(Manzoet al. , Human Molecular Genetics (2015) R67-73)。

在一些實施例中，該細胞是抗原專一性T細胞。在本文之實施例中，“抗原專一性”T細胞是一種響應T細胞所專一的抗原或表達該抗原之細胞，而表現出T細胞的某些功能特性之細胞。在一些實施例中，該特性是與效應T細胞，如細胞毒性T細胞，相關之功能特性。

在一些實施例中，抗原專一性T細胞可表現下列特性中之一或多個：針對如包含/表達T細胞所專一的抗原之細胞的細胞毒性；因應如T細胞所專一的抗原或包含/表達T細胞所專一的抗原之細胞的增生、IFNγ表達、CD107a表達、IL-2表達、TNFα表達、穿孔素表達、顆粒酶表達、顆粒溶素表達和/或FAS配位子(FASL)表達。抗原專一性T細胞包含一TCR，其能夠辨識在適當的MHC分子呈現時T細胞所專一的抗原之胜肽。抗原專一性T細胞可為CD4+ T細胞和/或CD8+ T細胞。

在一些實施例中，T細胞所專一的抗原可為病毒，如腺病毒、巨細胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、人類乳突病毒(HPV)、流感病毒、麻疹病毒、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)或單純疱疹病毒(HSV)，之胜肽或多肽。

對病毒抗原具專一性的T細胞，在本文中可稱作病毒專一性T細胞(VST)。VSTs可為CD4+ T細胞(如，T_H 細胞)和/或CD8+ T細胞(如，CTLs)。對特定病毒抗原具專一性的T細胞，可描述為相關病毒專一性T細胞；例如，對腺病毒抗原具專一性的T細胞，可稱作腺病毒專一性T細胞，或“AdVST”。使用病毒專一性T細胞來產生CAR-T細胞具有以下優點：儘管原始T細胞在輸注後具有限的長期持久性，但源自記憶區間之病毒專一性T細胞(VSTs)及基因修飾的VSTs已顯示出，在輸注於幹細胞移植受體後持續超過10年(Cruzet al. , Cytotherapy (2010) 12:743-749)。例如，表達GD2.CARs之VST已顯示出輸注後的長期持續性，且在低腫瘤負荷的病人中產生完全腫瘤反應(Sunet al., Journal for Immunotherapy of Cancer (2015) 3:5及Puleet al. , Nature Medicine (2008) 14: 1264-1270)。

在一些實施例中，該包含/表達CAR之細胞是病毒專一性T細胞(VST，如病毒專一性CD4+ T細胞(如T_H 細胞)和/或病毒專一性CD8+ T細胞(如，CTL)。在一些實施例中，該CAR表達性細胞是腺病毒專一性T細胞(AdVST)、巨細胞病毒專一性T細胞(CMVST)、EB病毒專一性T細胞(EBVST)、流感病毒專一性T細胞、麻疹病毒專一性T細胞、B型肝炎病毒專一性T細胞(HBVST)、C型肝炎病毒專一性T細胞(HCVST)、人類免疫缺陷病毒專一性T細胞(HIVST)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒專一性T細胞(LCMVST)、單純疱疹病毒專一性T細胞(HSVST)或人類乳突病毒(HPVST)。

在一些實施例中，該包含/表達CAR之細胞是溶瘤病毒專一性免疫細胞(如，溶瘤病毒專一性T細胞)，如在本文中所述的。

本揭示的任何細胞可以包含在是或不是同質的單離細胞群中。在具體實施例中，該細胞群中大部分的細胞是對溶瘤病毒具專一性和/或CAR表達性免疫細胞。該細胞群中之細胞可包含溶瘤腺病毒(OncAd)、輔助依賴型腺病毒(HDAd)、嵌合抗原受體(CAR)和/或編碼該OncAd、HDAd和/或CAR中一或多個之核酸或多個核酸。在特定實施例中，該細胞群具有至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的細胞包含溶瘤腺病毒(OncAd)、輔助依賴型腺病毒(HDAd)、嵌合抗原受體(CAR)和/或編碼該OncAd、HDAd和/或CAR中一或多個之核酸或多個核酸。溶瘤病毒專一性免疫細胞

本揭示之態樣提供溶瘤病毒專一性免疫細胞(在本文中亦稱作對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞)。溶瘤病毒專一性細胞會表達/包含能夠辨識溶瘤病毒抗原胜肽(如，當由MHC分子呈現時)之受體。該免疫細胞可表達/包含此一受體，這是由於編碼此抗原受體之內源性核酸的表達或由於已經過工程化而表達此一受體之結果。

在一些實施例中，溶瘤病毒專一性免疫細胞可為造血來源之細胞，如中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、樹突細胞、淋巴細胞或單核球。該淋巴細胞可為如T細胞、B細胞、NK細胞、NKT細胞或先天性淋巴細胞(ILC)或其前驅物。該細胞可表達如CD3多肽(如，CD3γ CD3ε CD3ζ或CD3δ)、TCR多肽(TCRα或TCRβ)、CD27、CD28、CD4或CD8。在一些實施例中，該溶瘤病毒專一性免疫細胞是T細胞，如CD3+ T細胞。在一些實施例中，該T細胞是CD3+、CD4+ T細胞。在一些實施例中，該T細胞是CD3+、CD8+ T細胞。在一些實施例中，該T細胞是T輔助細胞(T_H 細胞))。在一些實施例中，該T細胞是細胞毒性T細胞(如，細胞毒性T淋巴細胞(CTL))。

如本文所述的，該溶瘤病毒專一性免疫細胞(如，溶瘤病毒專一性T細胞)可對溶瘤病毒具專一性。也就是說，該溶瘤病毒專一性免疫細胞可對一或多種如本文所述的溶瘤病毒抗原具專一性。

用於產生/擴張對所關注的抗原和/或所關注的病毒具專一性的免疫細胞群之方法，是業界已知的，且述於Wang and Rivière Cancer Gene Ther. (2015) 22(2):85–94中，其完整地在此併入本案以為參考。

此方法可涉及使異質免疫細胞群(如，周邊血液單核細胞(PBMCs)、周邊血液淋巴細胞(PBLs)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs))，與一或多種所關注的抗原之多肽或包含/表達該抗原/胜肽之細胞接觸。包含/表達該抗原/胜肽之細胞，可以是以包含/編碼該抗原之病毒感染、該細胞吸收其抗原/胜肽或表達其抗原/胜肽的結果。該呈現通常是在抗原呈現細胞的細胞表面處之MHC分子之背景下。

包含/表達該抗原/胜肽之細胞可經過熟悉此技藝之人士熟知之方法，與抗原之胜肽接觸(“衝擊”)。抗原肽可以在胜肽混合物庫中提供(相應於一或多種抗原)，其可稱性肽混物。肽混物中之胜肽可為如8-20個胺基酸長度的重疊肽，且可涵蓋相關抗原之全部或部分的胺基酸序列。

在辨識於適當共同刺激訊息背景下由抗原呈現細胞(APCs)呈現之抗原的胜肽後，可活化包含對該胜肽具專一性的受體之免疫細胞群內的細胞(及刺激增生)。應可理解，“對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞”包含多個細胞，如此等細胞之群。此群可在體外和/或離體產生/擴張。

在一些實施例中，對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞，對溶瘤腺病毒(OncAd)，如本文中所述的OncAd，具專一性。在一些實施例中，對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞，對OncAd之抗原具專一性。在一些實施例中，該抗原是，或源自OncAd蛋白，如早期基因編碼之蛋白(如，E1 (如E1A，E1B)、E2 (如E2A，E2B)、E3或E4)、由晚期基因編碼之蛋白(如，L1、L2、L3、L4或L5)、由IX編碼之蛋白或由IVa2編碼之蛋白。在一些實施例中，該抗原是，或源自OncAd hexon和/或penton。

在一些實施例中，根據本揭示之各態樣，可利用包含下列之方法產生/擴張(或已經產生/擴張)對病毒具專一性的免疫細胞：通過在呈現該病胜肽之抗原呈現細胞(APCs)的存在下培養，刺激免疫細胞群。

在一些實施例中，根據本揭示之對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞，是通過使用包含對應於人腺病毒3 hexon之重疊肽混合物之PepMix和/或包含對應於人腺5 penton之重疊肽混合物之PepMix的方法製備。

在一些實施例中， 該溶瘤病毒專一性免疫細胞會表達/包含CAR，如本文中所述的CAR。以編碼CAR之核酸轉染/轉導該溶瘤病毒專一性免疫細胞，可將該溶瘤病毒專一性免疫細胞工程化而表達CAR。本揭示之組合

本發明之態樣包括組成物及方法，其包含/使用(i)一溶瘤病毒；(ii)一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒；及(iii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

亦提供的是一種使於治療癌症之方法之溶瘤病毒，該方法包含對一個體分開、同時或依序投與： (i ) 一溶瘤病毒； (ii) 一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒；及 (iii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

亦提供的是一種用於治療癌症之方法之包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，該方法包含對一個體分開、同時或依序投與： (i) 一溶瘤病毒； (ii) 一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒；及 (iii) 至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

亦提供的是一種用於治療癌症之方法之至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞，該方法包含對一個體分開、同時或依序投與： (i) 一溶瘤病毒； (ii) 一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒；及 (iii) 至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

亦提供的是一種溶瘤病毒於製造藥劑之用途，該藥劑用於包含對一個體分開、同時或依序投與下列之方法： (i) 一溶瘤病毒； (ii) 一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒；及 (iii) 至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

亦提供的是一種包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒於製造藥劑之用途，該藥劑用於包含對一個體分開、同時或依序投與下列之方法： (i) 一溶瘤病毒； (ii) 一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒；及 (iii) 至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

亦提供的是一種至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞於製造藥劑之用途，該藥劑用於包含對一個體分開、同時或依序投與下列之方法： (i) 一溶瘤病毒； (ii) 一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒；及 (iii) 至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

亦提供的是組成物及方法，其包含/表達(i)一溶瘤病毒；及(ii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞(即，沒有必要也使用一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒)。

亦提供的是組成物及方法，其包含/表達：(i) 一溶瘤病毒；及(ii)一對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。在一些實施例中，該組成物及方法可包含/使用一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，如本文所述。

在一些實施例中，本文提供之組成物及方法不含一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒(或對一個體投與病毒之步驟)，如本文所述。例如，該組成物及方法包含/使用(i)一溶瘤病毒；及(ii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞或對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞；不含一包含編碼免疫調節子之核酸的病毒(或對一個體投與病毒之步驟)。

在根據本文所述之各種態樣之一些實施例中，該包含/表達CAR之細胞，對所使用的溶瘤病毒具專一性(如，包含對該溶瘤病毒之抗原具專一性的抗原受體(如，TCR))。也就是說，在一些實施例中，該溶瘤病毒與該包含/表達CAR之細胞的專一性是相符的。舉例而言，在一些實施例中，該溶瘤病毒是腺病毒，而該包含/表達CAR之CAR表達性細胞是腺病毒專一性T細胞。

相似地，在本文之各態樣中，溶瘤病毒與對該溶瘤病毒(即，相同的溶瘤病毒)具專一性的免疫細胞組合在一起使用。

本文中所指的“組合”涵蓋包含該組合之組份之產物及組成物(如，藥學組成物)。“組合”亦涵蓋使用該組合之組份的治療方案。

在一些實施例中，組合中之組份以個別組成物之方式提供。在一些實施例中，該組合中超過一個組份以組成物之方式提供。在一些實施例中，組合中之組份以一個組成物之方式提供。

相似地，在一些實施例中，組合中之組份個別投與。在一些實施例中，組合中之組份與該組合中之另一組份一起投與。在一些實施例中，組合中之組份一起投與。

舉例說明，在包含一溶瘤病毒、一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒及至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的CAR之細胞之組合例子中，該溶瘤病毒及該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒可一起投與，而該至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的CAR之細胞個別投與(如，之後)。

當組合中之組份一起投與時，投與可以是同時投與，如下文所述。當組合中之組份個別投與時，投與可以是同時投與或依序投與，如下文所述。在其中組合中之組份是個別投與之情況下，該個別組份的投與可以或可以不必透過相同的投與途徑投與。功能特性

本揭示之劑可通過參考一或多個功能特性來定義。該劑之功能可通過例如實驗範例中所述之分析法評估。相似地，本揭示之組合及方法可通過參考一或多個功能特性和/或效果來定義，而此特性/效果可藉由如實驗範例中所述之分析法評估。

在一些實施例中，根據本揭示之溶瘤病毒可具有一或多個下列之功能特性： •在癌細胞中複製和/或引起細胞殺傷癌細胞之能力； •相較於在癌細胞中複製和/或引起細胞殺傷癌細胞之能力，具有降低在非癌細胞中複製和/或引起細胞殺傷非癌細胞之能力； •相較於業界已知的一或多種溶瘤病毒之能力，具有相當或改善引起細胞殺傷癌細胞之能力； •幫助輔助依賴型腺病毒(HDAd)之複製的能力； •相較於業界已知的一或多種溶瘤病毒之能力，具有相當或改善在癌細胞中複製之能力。

在一些實施例中，根據本揭示之包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞，可具有一或多個下列之功能特性： •結合HER2之能力； •結合HER2表達性細胞之能力； •引起細胞殺傷HER2表達性細胞之能力； •相較於引起細胞殺傷HER2表達細胞之能力，具有降低引起細胞殺傷不表達HER2的細胞之能力。

在一些實施例中，一溶瘤病毒、一包含編碼免疫調節物之核酸的病毒及至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的CAR之細胞之組合，可具有一或多個下列之功能特性： •相較於單獨使用任一個組份或組合使用任二個組份引起細胞殺傷癌細胞之能力，具有改善引起細胞殺傷癌細胞之能力。 •相較於單獨使用組份引起細胞殺傷癌細胞之能力，具有協同(即，超加性)引起細胞殺傷癌細胞之能力。

在一些實施例中，一溶瘤病毒與至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的CAR之細胞之組合，可具有一或多個下列之功能特性： •相較於單獨使用各組份引起細胞殺傷癌細胞之能力，具有改善引起細胞殺傷癌細胞之能力。 •相較於單獨使用組份引起細胞殺傷癌細胞之能力，具有協同(即，超加性)引起細胞殺傷癌細胞之能力。

在一些實施例中，一溶瘤病毒及一對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞之組合，可具有一或多個下列之功能特性： •相較於單獨使用各組份引起細胞殺傷癌細胞之能力，具有改善引起細胞殺傷癌細胞之能力。 •相較於單獨使用組份引起細胞殺傷癌細胞之能力，具有協同(即，超加性)引起細胞殺傷癌細胞之能力。

引起細胞殺傷癌細胞之能力的分析，可藉由體外分析癌細胞之數量/存活率進行評估。引起細胞殺傷癌細胞之能力的分析，亦可在適當的模型中活體內分析，如藉由分析癌細胞之數量、腫瘤大小/體積和/或癌細胞數量之一些其它相關性(如，疾病進程、癌症症狀之嚴重度等等)。治療應用

本揭示之態樣特別有關在一個體之癌症治療中，使用一溶瘤病毒、一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒及至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之T細胞。

據此，本揭示提供一種治療癌症之方法，其包含對一個體投與：一溶瘤病毒；一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒；及至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之T細胞。

本揭示亦提供一種用於治療癌症之方法之一溶瘤病毒；一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒；及至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之T細胞。亦提供一種製造用於治療癌症之藥劑的用途，其使用一溶瘤病毒；一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒；及至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之T細胞。

本揭示亦提供一種治療癌症之方法，其包含對一個體投與：(i)一溶瘤病毒；及(ii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。亦提供的是一種用於治療癌症之方法之(i)一溶瘤病毒；及(ii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。亦提供的是一種製造用於治療癌症之方法之藥劑的用途，其使用(i)一溶瘤病毒；及(ii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

本揭示亦提供一種治療癌症之方法，其包含對一個體投與：(i)一溶瘤病毒；及(ii)一對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。亦提供的是一種用於治療癌症之方法之(i)一溶瘤病毒；及(ii)一對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。亦提供的一種製造用於治療癌症之方法之藥劑的用途，其使用(i)一溶瘤病毒；及(ii)一對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。

亦提供的是用於治療癌症之方法，其包含對一個體投與本揭示之OncAds、HDAds、CARs、核酸/多個核酸、細胞及藥學組成物。亦提供的使用於治療癌症之方法之本揭示之OncAds、HDAds、CARs、核酸/多個核酸、細胞及藥學組成物。亦提供的是製造用於治療癌症之藥劑的用途，其使用本揭示之OncAds、HDAds、CARs、核酸/多個核酸、細胞及藥學組成物。

‘治療’可為例如減少癌症的發展或進展、緩和癌症之病狀或減少癌症之病理。癌症之治療或緩和可有效的阻止癌症之進展，如阻止病況變糟或減緩發展成更嚴重的疾病狀態之速率。在一些實施例中，治療或緩和可能導致癌症之改善，如減少癌症的症狀或減少一些其它與癌症的嚴重程度/活動相關的因素。癌症之預防意指預防癌症之病況變糟或預防癌症之發展，如預防早期階段的癌症發展成晚期階段。

在一些實施例中，該治療可著重在減少該個體中癌細胞的數量或包含癌細胞之組織量。在一些實施例中，該治療可著重在減少該個體中至少一個腫瘤的大小和/或防止其之生長。

在一些實施例中，該治療包含對該個體投與根據本揭示之溶瘤病毒。在一些實施例中，該治療可包含對一個體投與一包含或編碼根據本揭示之溶瘤病毒之細胞或細胞群。在一些實施例中，該治療包含對該個體投與根據本揭示之一溶瘤病毒及一編碼免疫調節因子的病毒。在一些實施例中，該治療可包含對一個體投與一包含或編碼根據本揭示之溶瘤病毒和/或編碼免疫調節因子的病毒之細胞或細胞群。

在一些實施例中，該治療可包含將一細胞或細胞群修飾成包含/表達根據本揭示之CAR。在一些實施例中，該治療可包含對一個體投與修飾成包含/表達本揭示之CAR之細胞或細胞群。在一些實施例中，該治療著重在提供該個體一對癌細胞抗原具專一性的免疫細胞或免疫細胞群，如藉由投與根據本揭示之CAR表達性細胞，或產生根據本揭示之CAR表達性細胞。

在一些實施例中，該治療可包含對一個體投與根據本揭示之對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞/免疫細胞群。在一些實施例中，該治療著重在提供該個體一對溶瘤病毒具有專一性的免疫細胞/免疫細胞群。在一些實施例中，該治療可包含產生/擴張根據本揭示之對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞群。

在一些實施例中，該治療可包含對一個體投與根據本揭示之對溶瘤病毒具專一性、經修飾而包含/表達根據本揭示之CAR的免疫細胞/免疫細胞群。在一些實施例中，該治療著重在提供該個體一對溶瘤病毒具專一性亦對癌細胞抗原具專一性的免疫細胞/免疫細胞群。在一些實施例中，該治療可包含產生/擴張根據本揭示之對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞群，及將該群之細胞或細胞們修飾成包含/表達根據本揭示之CAR。

接受治療的個體可為任何的動物或人。該個體較佳地為哺乳動物，更佳地人。該個體可為非人哺乳動物，但更佳地為人。該個體可為雄性或雌性或任何性別。該個體可為病患。個體可能已被診斷患有需要治療的癌症，可能被懷疑患有此一癌症或可能發展成此一癌病之風險。

在一些實施例中，待進行治療之癌症包含表達癌細胞抗原，如本文所述的癌細胞抗原(如，HER2)之細胞。在一些實施例中，該細胞在細胞表面上表達癌細胞抗原(如，HER2)。

在一些實施例中，待進行治療之癌症包含表達CAR所專一的癌細胞抗原之細胞。在一些實施例中，該CAR包含癌細胞抗原結合域，且待進行治療之癌症包含表達該癌細胞抗原之細胞，如在細胞表面上表達該癌細胞抗原之細胞。

在一些實施例中，該癌症過度表達該癌細胞抗原。藉由檢測該癌細胞抗原之表達位準大於相當的非癌細胞/非腫瘤組織之表達位準，可確定癌細胞抗原過度表達。

在一些實施例中，該癌症是表達HER2之癌症，如在細胞表面上表達HER2之癌症。在一些實施例中，該癌症過度表達HER2。藉由檢測HER2之表達位準大於相當的非癌細胞/非腫瘤組織之HER2表達位準，可確定HER2之過度表達。

在一些實施例中，基於在從個體獲得之癌細胞或腫瘤上檢測到癌細胞抗原的表達/過度表達，來選擇待根據本揭示治療之個體。

指定癌細胞抗原之表達，可藉由任何適合的方法測定。表達可為基因表達或蛋白表達。基因表達可通過如檢測編碼該癌細胞抗原之mRNA來測定，例如利用定量即時PCR (qRT-PCR)。蛋白表達可通過如檢測該細胞抗原來測定，例如利用基于抗體的方法，例如利用西方墨點法、免疫組織化學、免疫細胞化學、流動式細胞測量術或ELISA。

根據本發明之待治療/預防的癌症可為任何有害的細胞增生(或任何本身由有害的細胞增生表現出來的疾病)、贅生物或腫瘤。該癌症可為良性或惡性的，且可為原發或繼發的(轉移的)。該癌症可為抗性的(原始或治療後)和/或該癌症可為復發的。贅生物或腫瘤可為任何不正常的細胞生長或增生，且可位在任何組織中。該癌症可為源自如腎上腺、腎上腺髓質、肛門、闌尾、膀胱、血液、骨、骨髓、腦、***、盲腸、中樞神經系統(包括或排除大腦)、小腦、子宮頸、結腸、十二指腸、子宮內膜、上皮細胞(如，腎上皮細胞)、膽囊、食道、膠質細胞、心臟、迴腸、空腸、腎、淚腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴結、淋巴母細胞、上頜骨、縱膈、腸繫膜、子宮肌層、鼻咽、網膜、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、周圍神經系統、腹膜、胸膜，***、唾液腺、乙狀結腸、皮膚、小腸、軟組織、脾、胃、睾丸、胸腺、甲狀腺、舌、扁桃體、氣管、子宮、外陰、白血球之組織/細胞。

待治療/預防之癌症可為任何類型的癌症，包括急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、腎上腺皮質癌、AIDS相關癌症(即，卡波西氏肉瘤、AIDS相關淋巴瘤、原發性CNS淋巴瘤)、肛門癌、闌尾癌、星狀細胞瘤、皮膚基底細胞癌、膽管癌(如，膽管癌)、膀胱癌、骨癌(如，Ewing氏肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤)、腦瘤、乳癌、支氣管腫瘤、伯奇氏淋巴瘤、類癌瘤、原發灶不明癌、心臟腫瘤、中樞神經系統癌症(如，非典型類畸胎瘤/類橫紋肌細胞瘤、胚胎細胞瘤、生殖細胞瘤、原發性CNS淋巴瘤)、子宮頸癌、脊索瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓增生性腫瘤、結直腸癌、顱咽管瘤、皮膚T細胞淋巴瘤(如，蕈狀肉芽腫、Sézary氏症候群)、乳管原位癌(DCIS)、子宮內膜癌(子宮癌)、室管膜瘤、食道癌、嗅神經母細胞瘤、顱外生殖細胞瘤、性腺外生殖細胞瘤、眼癌(如，眼內黑色素瘤、視網膜母細胞瘤)、輸卵管癌、骨惡性纖維組織細胞瘤、膽囊癌、胃(胃)癌、胃腸道類癌、胃腸道間質瘤(GIST)、卵巢生殖細胞腫瘤、睾丸癌、妊娠滋養細胞疾病、毛細胞白血病、頭頸癌、心臟腫瘤、肝細胞(肝)癌、組織細胞增生症、Langerhans氏細胞、何杰金氏淋巴瘤、下咽癌、胰島細胞瘤(胰腺神經內分泌腫瘤)、腎(腎細胞)癌、喉癌、乳突瘤病、白血病、唇和口腔癌、肺癌(非小細胞肺癌(NSCLC)及小細胞肺癌(SCLC))、淋巴瘤、男性乳癌、黑色素瘤、Merkel細胞癌、間皮瘤、轉移癌、隱匿性原發性轉移鱗狀細胞頸癌、牽涉NUT基因之中線道癌、口腔癌、多發性內分泌腫瘤症候群、多發性骨髓瘤/漿細胞腫瘤、蕈狀肉芽腫、骨髓增生異常症候群、骨髓增生異常/骨髓增生瘤、骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病(AML)、鼻腔及副鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非何杰金氏淋巴瘤、口腔癌、唇和口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳突瘤病、副神經節瘤、副鼻竇癌、鼻腔癌、副甲狀腺癌、陰莖癌、咽癌、嗜鉻細胞瘤、腦下垂體瘤、漿細胞腫瘤/多發性骨髓瘤、胸膜肺母細胞瘤、妊娠乳癌、原發性腹膜癌、***癌、直腸癌、復發性癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾腺癌、血管瘤、子宮肉瘤、皮膚癌、小腸癌、皮膚鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲狀腺癌、腎盂和輸尿管移行細胞癌、尿道癌、***癌、外陰癌或Wilms氏腫瘤中之任一個。

在一些實施例中，待治療之癌症是鼻咽癌(NPC；如EB病毒(EBV)陽性NPC)、子宮頸癌(CC；如人類乳突病毒(HPV)陽性CC)、口咽癌(OPC；如HPV陽性OPC)、胃癌(GC；如EBV陽性GC)、肝細胞癌(HCC；如B型肝炎病毒(HBV)陽性HCC)、肺癌(如，非小細胞肺癌(NSCLC))及頭頸癌(如，源自唇、嘴巴、鼻子、鼻竇、咽或喉組織之癌症，如頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))中之一或多種。

在一些實施例中，該癌症與病毒相關或由病毒引起。在一些實施例中，該癌症是EBV陽性癌症。在一些實施例中，該癌症是HPV陽性癌症。

在一些實施例中，該癌症是頭頸癌、鼻咽癌(NPC)、口咽癌(OPC)、子宮頸癌(CC)、胃/胃癌、胃癌或肺癌中之一種。

醫療方法亦涉及活體內、離體及過繼性免疫療法，包括該等使用自體和/或異源細胞或永生細胞株者。藥物投與

藥物投與最好是以"治療有效量"投與，此足夠顯示對個體的效果。實際的投與量以及投與的速率與時程，取決於待治療之疾病的本質及嚴重度。治療處方，如劑量之決定等，在全科醫生及其它醫生負責之範圍內，且通常考慮到待治療之病況、個別病患的病況、遞輸位置、投藥方法及從業人員已知之其它因素。以上提及之技術及計劃之例子可在Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins中找到。

根據本揭示之病毒、CARs、核酸及細胞可配製成供臨床使用之藥學組成物或藥劑，且可包含一藥學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑。該組成物可配製成供局部、腸胃外、全身、腔內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內、眼內、結膜內、腫瘤內、皮下、皮內、鞘內、口服或經皮投藥途徑，其可包括注射或輸注。適合的配方可包含配製於無菌或等張介質中之病毒、CARs、核酸或細胞。藥劑及藥學組成物可配製成流體形式，包括凝膠。流體配方可配製成供注射或輸注投與(如，透過導管)至人或動物體之選定區域。

該包含編碼免疫調節因子之核酸的溶瘤病毒和/或病毒，可配製成供腫瘤內投與。在一些實施例中，該方法可包含腫瘤內投與該包含編碼免疫調節因子之核酸的溶瘤病毒和/或病毒。

該包含CAR之細胞和/或該對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞，可配製成供靜脈投與。在一些實施例中，該方法可包含靜脈投與該包含CAR之細胞和/或該對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。

本揭示之組合中之組份(如，根據本揭示之溶瘤病毒、包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒；至少一種對癌細胞抗原具專一性的CAR之T細胞；對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞)可同時或依序投與。本揭示亦設想同時或依序投與本揭示之OncAds、HDAds、CARs、核酸/多個核酸、細胞及藥學組成物。

同時投與亦指該等劑一起投與，例如以含該等劑之藥學組成物之形式(即，組合製劑)或緊接著彼此且可選擇地透過相同途徑投與至如相同的動脈、靜脈或其它血管。在特定實施例中，該溶瘤病毒及包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒可在一組合製劑中同時投與。在某些實施例中，同時投與時，該等劑中之二或多個可透過不同的投與途徑投與。在一些實施例中，同時投與意指在相同的時間或在如1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、8小時、12小時、24小時、36小時或48小時內投與。

依序投與意指投與該等劑中之一或多個，接著在一指定時間間隔後個別投與該等劑中之另一個。該二種劑不必然以相同途徑投與，雖然在一些實施例之情況下係如此。該時間間隔可為任一時間間隔，包括小時、天、周、月或年。在一些實施例中，依序投與意指以至少10分鐘、30分鐘、1小時、6小時、8小時、12小時、24小時、36小時、48小時、3天、4天、5天、6天、1周、 2周、3周、1個月、6周、2個月、3個月、4個月、5個月或6個月中之一者的時間間隔個別投與。

在一些實施例中，該治療可進一步包含其它治療或預防性干預，如化學療法、免疫療法、放射療法、手術、疫苗和/或荷爾蒙療法。此其它治療或預防性干預可在本揭示所包含之療法前、期間和/或後進行，且其它治療或預防性干預之遞輸可透過與本揭示之療法不同的投與途徑進行。化學療法及放射療法分別意指用藥物或離子化輻射(如，使用X射線或γ射線之放射療法)治療癌症。該藥物可為化學實體，如，小分子藥學、抗生素、DNA嵌入劑、蛋白抑制劑(如，激酶抑制劑)或生物試劑，如抗體、抗體片段、核酸或胜肽適配體、核酸(如，DNA、RNA)、胜肽、多肽或蛋白。該藥物可配製成藥學組成物或藥劑。該配方可包含一或多種藥物(如，一或多種活性劑)以及一或多種藥學上可接受之稀釋劑、賦形劑或載劑。

化學療法可經由一或多種投與途徑投與，如胃腸外、靜脈注射、口服、皮下、皮內或腫瘤內。

化學療法可依照一治療方案投與。該治療方案可為臨床醫師或醫療從業人員所製作之化學療法投藥預定時間表、計畫、方案或行程，且可定做以適合需要治療之病患。

該治療方案可意指下列中之一或多個：投與至病患之化學療法的種類；各藥物或輻射之劑量；投藥之間的時間間隔；若有的話，任何治療假期的次數和性質等等。在共同療法方面，可提供單一治療方案，其指示如何投與各藥物。

化學療法藥及生物製劑可選自：鹼化劑，諸如順鉑、卡鉑、甲基二(氯乙基)胺、環磷醯胺、氮芥苯丁酸、異環磷醯胺；嘌呤或嘧啶抗代謝物，如硫唑嘌呤或巰嘌呤；生物鹼及萜類，如長春花屬生物鹼(如，長春新鹼、長春鹼、長春瑞濱(vinorelbine)、長春地辛(vindesine))、鬼臼毒素、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、紫杉醇類，如太平洋紫杉醇(TaxolTM)、歐洲紫材醇；拓樸異構酶抑制劑，如第I型拓樸異構酶抑制劑喜樹鹼依利替康(camptothecins irinotecan)及托普樂肯(topotecan)，或第II型拓樸異構酶抑制劑安吖定(amsacrine)、依託泊苷、依託泊苷磷酸鹽、替尼泊苷；抗腫瘤抗生素(如，蒽環類抗生素)，如放射菌素、多柔比星(doxorubicin；Adriamycin^TM )、表柔比星(epirubicin)、博萊黴素、雷帕黴素(rapamycin)；抗體基劑，如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗TIM-3抗體、抗CTLA-4、抗4-1BB、抗GITR、抗CD27、抗BLTA、抗OX43、抗VEGF、抗TNFα、抗IL-2、抗GpIIb/IIIa、抗CD-52、抗CD20、抗RSV、抗HER2/neu (erbB2) 、抗TNF受體、抗EGFR抗體、單株抗體或抗體片段，例子包括：西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、巴利昔單抗(basiliximab)、貝代單抗(bevacizumab；Avastin®)、阿昔單抗(abciximab)、達利珠單抗(daclizumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、利妥昔單抗(rituximab；Mabthera®)、帕利珠單抗(palivizumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、依那西普(etanercept)、阿達木單抗(adalimumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)； EGFR抑制劑，如厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔單抗及吉非替尼(gefitinib)；抗血管新生劑，如貝代單抗(Avastin®)；癌症疫苗，如Sipuleucel-T (Provenge®)。

另外的化學療法藥可選自：13-順式-維生素A酸、2-氯去氧腺苷、5-阿扎胞苷(5-Azacitidine)、5-氟脲嘧啶、6-巰嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、白蛋白結合紫杉醇(Abraxane)、Accutane®、放射菌素-D Adriamycin®、Adrucil®、Afinitor®、Agrylin®、Ala-Cort®、Aldesleukin、阿侖單抗、ALIMTA、阿利維A酸(Alitretinoin)、Alkaban-AQ®、Alkeran®、全反式維生素A酸、α干擾素、六甲蜜胺、胺甲喋呤、阿米福汀(Amifostine)、胺麩精、阿那格雷(Anagrelide)、Anandron®、安那曲唑(Anastrozole)、胞嘧啶***糖苷、Aranesp®、Aredia®、Arimidex®、Aromasin®、Arranon®、三氧化二砷、天冬醯胺酸酶、ATRA Avastin®、阿扎胞苷、BCG、BCNU、苯達莫司汀(Bendamustine)、貝代單抗、貝沙羅汀(Bexarotene)、BEXXAR®、比卡魯胺(Bicalutamide)、BiCNU、Blenoxane®、博萊黴素、硼替佐米(Bortezomib)、硫酸布他卡因、Busulfex®、鈣甲醯四氫葉酸、Campath®、Camptosar®、喜樹鹼-11、卡培他濱(Capecitabine)、Carac™、卡鉑、卡莫司汀(Carmustine)、Casodex®、CC-5013、CCI-779、CCNU、CDDP、CeeNU、Cerubidine®、西妥昔單抗(Cetuximab)、氮芥苯丁酸、順鉑、醛葉酸、克拉屈濱(Cladribine)、可體松、Cosmegen®、CPT-11、環磷醯胺、Cytadren®、阿糖胞苷Cytosar-U®、Cytoxan®、Dacogen、放射菌素、阿法達貝泊汀(Darbepoetin Alfa)、達沙替尼(Dasatinib)、道諾黴素(Daunomycin；Daunorubicin)、道諾黴素鹽酸鹽、道諾黴素脂質體、DaunoXome®、迪皮質醇(Decadron)、地西他濱(Decitabine)、Delta-Cortef®、Deltasone®、地尼白介素(Denileukin)、白喉毒素(Diftitox)、DepoCyt™、***、醋酸***、***磷酸鈉、Dexasone、右雷佐生(Dexrazoxane)、DHAD、DIC、Diodex、歐洲紫杉醇、Doxil®、多柔比星、多柔比星脂質體、Droxia™、DTIC、DTIC-Dome®、Duralone®、Eligard™、Ellence™、Eloxatin™、Elspar®、Emcyt®、表柔比星、阿法依泊汀(Epoetin Alfa)、爾必得舒(Erbitux)、厄洛替尼(Erlotinib)、歐文氏菌L-天冬醯胺酶(Erwinia L-asparaginase)、雌莫司汀(Estramustine)、氨磷汀(Ethyol)、Etopophos®、依託泊苷(Etoposide)、磷酸依託泊苷、Eulexin®、依維莫司(Everolimus)、Evista®、依西美坦(Exemestane)、Faslodex®、Femara®、非格司亭(Filgrastim)、氟尿苷(Floxuridine)、Fludara®、氟達拉濱、Fluoroplex®、氟尿嘧啶、氟羥甲基睪酮、氟他胺(Flutamide)、醛葉酸、FUDR®、氟維司群(Fulvestrant)、吉非替尼(Gefitinib)、吉西他濱(Gemcitabine)、吉妥珠單抗奥唑米星(Gemtuzumab ozogamicin)、Gleevec™、Gliadel® Wafer、戈舍瑞林(Goserelin)、顆粒性白血球聚落刺激因子、顆粒性白血球巨噬細胞聚落刺激因子、Herceptin®、Hexadrol、Hexalen®、六甲三聚氰胺、HMM、Hycamtin®、Hydrea®、Hydrocort Acetate®、氫化可體松、氫化可體松磷酸鈉、氫化可體松丁二酸鈉、氫化可體松磷酸鹽、羥基脲、替伊莫單抗(Ibritumomab；Ibritumomab Tiuxetan)、Idamycin®、艾達黴素(Idarubicin)、Ifex®、IFN-α、異環磷醯胺(Ifosfamide)、IL-11、IL-2、甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate)、咪唑羧醯胺、α干擾素、干擾素α-2b (PEG綴合物)、白介素- 2、白介素-11、Intron A® (干擾素α-2b)、Iressa®、伊立替康、異維A酸(Isotretinoin)、伊沙匹隆(Ixabepilone)、Ixempra™、天冬醯胺酶(Kidrolase)、Lanacort®、拉帕替尼(Lapatinib)、L-天冬醯胺酶、LCR、來那度胺(Lenalidomide)、來曲唑(Letrozole)、亞葉酸(Leucovorin)、Leukeran、Leukine™、亮丙瑞林(Leuprolide)、長春新鹼(Leurocristine)、Leustatin™、脂質體阿糖胞苷、Pred®液、洛莫司汀(Lomustine)、L-PAM、左旋溶肉瘤素(L-Sarcolysin)、Lupron®、Lupron Depot®、Matulane®、Maxidex、甲基二(氯乙基)胺、氮芥鹽酸鹽(Mechlorethamine Hydrochloride)、Medralone®、Medrol®、Megace®、甲地羥孕酮(Megestrol)、醋酸甲地羥孕酮、美法侖(Melphalan)、巰嘌呤、美司鈉(Mesna)、Mesnex™、氨甲蝶呤、氨甲蝶呤 鈉、甲基潑尼松龍(Methylprednisolone)、Meticorten®、絲裂黴素、絲裂黴素-C、米托蒽醌(Mitoxantrone)、M-Prednisol®、MTC、MTX、Mustargen®、氮芥、Mutamycin®、Myleran®、Mylocel™、Mylotarg®、Navelbine®、奈拉濱(Nelarabine)、Neosar®、Neulasta™、Neumega®、Neupogen®、Nexavar®、Nilandron®、尼魯米特(Nilutamide)、Nipent®、氮芥子氣(Nitrogen Mustard)、Novaldex®、Novantrone®、奥曲肽(Octreotide)、醋酸奥曲肽、Oncospar®、Oncovin®、Ontak®、Onxal™、奥普瑞白介素(Oprevelkin)、Orapred®、Orasone®、奥沙利鉑(Oxaliplatin)、太平洋紫杉醇、白蛋白結合型太平洋紫杉醇、裴米卓耐特(Pamidronate)、帕尼單抗、Panretin®、Paraplatin®、Pediapred®、PEG干擾素、培門冬酶(Pegaspargase)、培非格司亭(Pegfilgrastim)、PEG-INTRON™、PEG-L-天冬醯胺酶、PEMETREXED、噴司他汀(Pentostatin)、苯丙氨酸氮芥、Platinol®、Platinol-AQ®、潑尼松龍(Prednisolone)、強體松(Prednisone)、Prelone®、丙卡巴肼(Procarbazine)、PROCRIT®、Proleukin®、具有卡莫司汀植入物的Prolifeprospan 20、Purinethol®、雷洛昔芬(Raloxifene)、Revlimid®、Rheumatrex®、Rituxan®、利妥昔單抗、Roferon-A® (干擾素α-2a)、Rubex®、紅比黴素鹽酸鹽(Rubidomycin hydrochloride)、Sandostatin® Sandostatin LAR®、沙格司亭(Sargramostim)、Solu-Cortef®、Solu-Medrol®、索拉非尼(Sorafenib)、SPRYCEL™、STI-571、鏈脲佐菌素、SU11248、舒尼替尼(Sunitinib)、Sutent®、泰莫西芬(Tamoxifen)、Tarceva®、Targretin®、Taxol®、Taxotere®、Temodar®、替莫唑胺(Temozolomide)、替西羅莫司(Temsirolimus)、替尼泊苷、TESPA、沙利度胺(Thalidomide)、Thalomid®、TheraCys®、硫鳥嘌呤、硫鳥嘌呤Tabloid®、硫代磷醯胺、Thioplex®、噻替哌(Thiotepa)、TICE®、Toposar®、托普樂肯、托瑞米芬(Toremifene)、Torisel®、托西莫單抗(Tositumomab)、曲妥珠單抗、Treanda®、維A酸、Trexall™、Trisenox®、TSPA、TYKERB®、VCR、Vectibix™、Velban®、Velcade®、VePesid®、Vesanoid®、Viadur™、Vidaza®、長春鹼、硫酸長春鹼、Vincasar Pfs®、長春新鹼、長春瑞濱(Vinorelbine)、酒石酸長春瑞濱、VLB、VM-26、伏立诺他(Vorinostat)、VP-16、Vumon®、Xeloda®、Zanosar®、Zevalin™、Zinecard®、Zoladex®、唑來膦酸(Zoledronic acid)、Zolinza、Zometa®。

在其中使用編碼能夠將無毒性因子催化轉換成細胞毒性形式之酵素之核酸/病毒之本揭示實施例中，該方法可進一步包含投與該酵素之前驅藥物基質。該前驅藥物可與該編碼能夠將無毒性因子催化轉換成細胞毒性形式之酵素之核酸/病毒同時或依序投與。

在一些實施例中，該前驅藥物選自更昔洛韋(GCV)、阿昔洛韋(ACV)和/或代昔洛韋，其中該核酸/病毒編碼胸苷激酶。在一些實施例中，該前驅藥物是5-氟胞嘧啶(5-FC)，如其中該核酸/病毒編碼胞嘧啶去胺酶。在一些實施例中，該前驅藥物選自CB1954、硝基-CBI-DEI和/或PR-104A，如其中該核酸/病毒編碼硝基還原酶。在一些實施例中，該前驅藥物是氧氮磷環類(如，環磷醯胺或異環磷醯胺)，如其中該核酸/病毒編碼細胞色素P450。在一些實施例中，該前驅藥物是氮芥子氣類藥物(如，CMDA或ZD2767P)，如其中該核酸/病毒編碼羧肽酶G2。在一些實施例中，該前驅藥物是6-甲基嘌呤2-去氧核糖苷和/或氟達拉濱(如，6-甲基嘌呤-2’-去氧核糖苷(MeP-dR)、2-F-2’-去氧腺苷(F-dAdo)或***呋喃糖基-2-F-腺嘌呤單磷酸酯(F-araAMP)，如其中該核酸/病毒編碼嘌呤核苷磷酸化酶。在一些實施例中，該前驅藥物是吲哚-3-醋酸(IAA)，如其中該核酸/病毒編碼辣根過氧化酶。在一些實施例中，該前驅藥物是伊立替康，如其中該核酸/病毒編碼羧酸酯酶。

可提供多劑量的本揭示之劑(如，病毒(OncAds、HdAds)、CARs、核酸/多個核酸、載體、細胞、組成物、組合物、前驅藥物)。該等劑量中之一或多個或每一個，可與另一治療劑一起同時投與或依序投與。

多個劑量可以一預定的時間間隔分開，其可選擇為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或更多個小時或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天或1、2、3、4、5或6個月中之一個。舉例而言，可每7、14、21或28天(加上或減去3、2或1天)投與一劑。過繼性轉移

在本揭示之實施例中，治療之方法包含過繼性免疫細胞轉移。過繼細胞轉移(ACT)通常是指從個體獲得細胞(例如免疫細胞)的過程，通常通過抽取從中單離細胞的血液樣品。之後通常用一些方法處理或改變該細胞，然後將其投與至相同的個體(過繼性轉移是自體細胞)或不同的個體(過繼性轉移是異源細胞)。該治療之目的通常著重在提供一個體具有某些所需特徵之細胞，或增加具此特徵之細胞在該個體中之頻率。在本揭示中，進行過繼性轉移之目的在於將細胞或細胞群導入一個體中，和/或增加細胞或細胞群在一個體中之頻率。

在一些實施例中，單離出該細胞之個體，是投與該修飾細胞之個體(即，過繼性轉移是自體細胞)。在一些實施例中，單離出該細胞之個體與投與該修飾細胞之個體是不同的個體(即，過繼性轉移是異源細胞)。

過繼性T細胞轉移述於例如Kalos and June 2013, Immunity 39(1): 49-60中，其完整地在此併入本案以為參考。過繼性NK細胞轉移述於例如Daviset al . 2015, Cancer J. 21(6): 486–491中，其完整地在此併入本案以為參考。

該細胞可為如中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、樹突細胞、淋巴細胞或單核球。該淋巴細胞可為如T細胞、B細胞、NK細胞NKT細胞或先天性淋巴細胞(ILC)或其前驅物。在一些實施例中，該細胞是T細胞。在一些實施例中，該T細胞是CD3+ T細胞。在一些實施例中，該T細胞是CD3+、CD4+ T細胞。在一些實施例中，該T細胞是CD3+、CD8+ T細胞。在一些實施例中，該T細胞是T輔助細胞(T_H 細胞)。在一些實施例中，該T細胞是細胞毒性T細胞(如，細胞毒性T淋巴細胞(CTL))。在一些實施例中，該T細胞是病毒專一性T細胞。在一些實施例中，該T細胞對EBV、HPV、HBV、HCV或sHIV具專一性。

在一些實施例中，該細胞是對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞，本文中所述。據此，在一些實施例中，該方法包含對一個體投與至少一種對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。在一些實施例中，本揭示之方法包含產生/擴張對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞群，及對一個體投與至少一種對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。

在一些實施例中，該方法包含： (a)從一個體單離出免疫細胞； (b)利用包含下列之方法產生或擴張對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞群：通過在呈現該溶瘤病毒胜肽之抗原呈現細胞(APCs)的存在下培養，刺激該免疫細胞，及； (c)對一個體投與至少一種對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。

在一些實施例中，用於產生對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞之方法步驟，可包含下列中之一或多個：從一個體採取血液樣本；從該血液樣本中單離出PBMCs；產生/擴張對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞群(如，通過在包含/表達溶瘤病毒抗原/胜肽之細胞(如，APCs)的存在下培養PBMCs)；在體外或離體細胞培養中培養對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞；收集對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞；將對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞與佐劑、稀釋劑或載劑混合；對一個體投與該修飾的細胞。

本揭示亦提供治療一個體之癌症之方法，其包含投與至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。結合本揭示之此特徵，在一些實施例中，該方法額外地包含用於產生該至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞之步驟。該CAR可為第一代、第二代或第三代或後續代之CAR。該CAR可包含例如一個、二個、三個或更多個共刺激結構域。

在一些實施例中，該方法包含修飾至少一種來自一個體之細胞，以表達或包含根據本揭示之CAR，可選擇地擴張該經修飾的至少一種細胞，及對一個體投與該經修飾的至少一種細胞。

在一些實施例中，該方法包含： (a)從一個體單離出至少一種細胞； (b)修飾該至少一種細胞，以表達或包含根據本揭示之CAR，或編碼根據本揭示之CAR之核酸， (c)可選擇地擴張該修飾的至少一種細胞，及； (d)對一個體投與該修飾的至少一種細胞。

在一些實施例中，該包含/表達對癌細胞抗原具專一性的CAR之細胞，是對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞，如本文所述。在一些實施例中，該方法包含修飾對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞，以表達或包含根據本揭示之CAR，可選擇地擴張該對溶瘤病毒具專一性的修飾免疫細胞，及對一個體投與該對溶瘤病毒具專一性的修飾免疫細胞。

在一些實施例中，該方法包含： (a)從一個體單離出免疫細胞； (b)利用包含下列之方法來產生或擴張對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞群：刺激免疫細胞，其係藉由在呈現該溶瘤病毒之胜肽的抗原呈現細胞(APCs)存在下來培養； (c)修飾至少一種對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞，以表達或包含根據本揭示之CAR，或編碼根據本揭示之CAR之核酸， (d)可選擇地擴張該修飾的至少一種對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞，及； (e)對一個體投與該修飾的至少一種對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。

根據本揭示修飾的至少一種細胞，可依照熟悉此技藝之人士熟知的方法修飾成包含/表達CAR。該修飾可包含供永久或暫時表達轉移的核酸之核酸轉移。任何適合的基因工程平台均可用於修飾根據本揭示之細胞。適合用於修飾細胞之方法，包括使用諸如γ反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、DNA轉染、基於轉位子的基因傳遞和RNA轉染之基因工程平台，例如Mauset al ., Annu Rev Immunol (2014) 32:189-225中所述的，在此併入本案以為參考。

在一些實施例中，用於產生該至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞之方法步驟，可包含下列中之一或多個：從一個體採取血液樣本；從該血液樣本中單離和/或擴張至少一種細胞；在體外或離體細胞培養中培養該至少一種細胞；於該至少一種細胞中引入本文所述的CAR，或編碼本文所述的CAR之核酸，從而修飾該至少一種細胞；擴張該至少一種修飾的細胞；收集該至少一種修飾的細胞；將該修飾的細胞與一佐劑、稀釋劑或載劑混合；對一個體投與該修飾的細胞。

在一些實施例中，該方法可額外地包含處理該細胞，使引起/提高CAR或編碼CAR之核酸的表達。例如，該核酸可包含一控制元件，用於因應一特定劑之處理誘導上調從核酸中該CAR的表達。在一些實施例中，該處理可藉由投與該劑至已投與根據本揭示之修飾的細胞之個體而在活體內進行。在一些實施例中，該處理可藉由投與該劑至離體或體外培養的細胞中而在離體或體外進行。

熟悉此技藝之人士能決定用於根據本揭示之過繼性細胞轉移之適當的試劑及程序，例如參考Daiet al. , 2016 J Nat Cancer Inst 108(7): djv439，其完整地在此併入本案以為參考。

在一相關態樣中，本揭示提供一種製備修飾細胞的方法，該方法包含於一細胞中引入根據本揭示之CAR或編碼根據本揭示之CAR之核酸，從而修飾該至少一種細胞。該方法較佳地在體外或離體進行。組成物/ 產品/ 套組

本揭示亦提供一種如本文所述的溶瘤病毒(可選擇地單離的)。亦提供的是一種編碼該溶瘤病毒之核酸(可選擇地單離的)。亦提供的是包含該溶瘤病毒，或包含編碼該溶瘤病毒之核酸之細胞(可選擇地單離的)。

本揭示亦提供一種如本文所述的包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒(可選擇地單離的)。亦提供的是一種編碼該病毒之核酸(可選擇地單離的)。亦提供的是一種包含該病毒，或包含編碼該病毒之核酸之細胞(可選擇地單離的)。

本揭示亦提供一種如本文所述的嵌合抗原受體(CAR)　(可選擇地單離的)。亦提供的是一種編碼該CAR　之核酸(可選擇地單離的)。亦提供的是一種包含該CAR，或包含編碼該CAR之核酸之細胞(可選擇地單離的)。

本揭示亦提供一種組成物，其包含根據本揭示之溶瘤病毒、包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒、嵌合抗原受體、核酸/多個核酸或細胞。

根據本揭示之溶瘤病毒、包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒、嵌合抗原受體、核酸/多個核酸或細胞，可配製成供臨床使用之藥學組成物，且可包含一藥學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑。本揭示之組合可以單一組成物之形式提供，或以包含該組合之組份之多個組成物之形式提供。

根據本發明，亦提供用於生產藥學上有用的組成物之方法，此生產方法可包含一或多個選自下列之步驟：單離本文所述的溶瘤病毒、包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒、嵌合抗原受體、核酸/多個核酸或細胞；和/或將本文所述的溶瘤病毒、包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒、嵌合抗原受體、核酸/多個核酸或細胞與一藥學上可接受的載劑、佐劑、賦形劑或稀釋劑混合。

例如，本揭示之進一步態樣有關一種配製或生產用於治療癌症之藥劑或藥學組成物之方法，該方法包含藉由混合本文所述的溶瘤病毒、編碼免疫調節因子之核酸的病毒、嵌合抗原受體、核酸/多個核酸或細胞與一藥學上可接受之載劑、佐劑、賦形劑或稀釋劑，配製一藥學組成物或藥劑。

本揭示亦提供一種組件式套組，其包含根據本揭示之溶瘤病毒、編碼免疫調節因子之核酸的病毒、嵌合抗原受體、核酸、細胞或組成物中一或多個。

在一些實施例中，該套組可具有至少一個容器，其具有一預定量的根據本揭示之溶瘤病毒、編碼免疫調節因子之核酸的病毒、嵌合抗原受體、核酸/多個核酸、或細胞，或根據本揭示之組成物。該套組可具有含本揭示組合中之個別組份的容器，或可具有含本揭示組合中之組份的組合之容器。

該套組可提供該溶瘤病毒、包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒、CAR、核酸、細胞或組成物，以及為治療特定癌症用於投與至病患的說明書。可將該溶瘤病毒、包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒、CAR、核酸/多個核酸、細胞或組成物配製成適合注射或輸注至腫瘤或血液。

在一些實施例中，該套組可包含用於生產根據本揭示之細胞之材料。例如，該套組可包含用於修飾細胞以表達或包含根據本揭示之病毒或其抗原/胜肽、CAR或核酸/多個核酸之材料，或用於將根據本揭示之病毒或其抗原/胜肽或核酸/多個核酸引入細胞之材料。該套組可包含用於生產對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞之材料；例如，該套組可包含一或多種溶瘤病毒抗原之肽混物。

在一些實施例中，該套組可進一步包含至少一個具有一預定量的另一治療劑(如，抗感染劑或化學療法劑)之容器。在此實施例中，該套組亦可包含一第二藥劑或藥學組成物，使得該二種藥劑或藥學組成物可同時或個別投與，使得其等提供該癌症之組合治療。亦可將該治療劑配製成適合注射或輸注至腫瘤或血液。序列一致性

為了測定二或多個胺基酸或核酸序列間之一致性百分比，可以熟悉此技藝之人士已知之各種方式實現成對和多重序列比對，例如，使用公開的電腦軟體，諸如ClustalOmega (Söding, J. 2005, Bioinformatics 21, 951-960)、T-coffee (Notredameet al . 2000, J. Mol. Biol. (2000) 302, 205-217)、Kalign (Lassmann and Sonnhammer 2005, BMC Bioinformatics, 6(298))及MAFFT (Katoh and Standley 2013, Molecular Biology and Evolution, 30(4) 772–780軟體。使用此軟體時，較佳地使用預設參數，例如空格罰分及延伸罰分。序列 ***

本揭示包括所述的態樣及較佳特徵之組合，除非這種組合明顯不允許或明確避免。

本文中所使用之章節標題僅供組織之目的，不應解釋為所述標的之限制。

現在將參照附圖舉例說明本揭示之態樣及實施例。進一步的態樣及實施例對熟悉此技藝之人士而言將為顯而易見的。本文中所提及之所有的文件均在此併入本案以為參考。

在整個說明書中，包括隨後的申請專利範圍，除非上下文另有要求，否則字詞“包含”及其變體將被理解為包含所述整數或步驟，或整數或步驟組，但不排除任何其他整數或步驟，或整數或步驟組。

應注意，在本說明書及所附申請專利範圍中所使用之單數形式“一”、“一個”、“一種”及“該”包括複數指稱物，除非上下文另有明確規定。在本文中之範圍可表示為從“約”一特定值和/或至“約”另一特定值。當以此範圍表示時，另一個實施例包括從該一特定值和/或到該另一個特定值。相似地，當值以近似值表示時，透過使用前置“約”，可理解該特定值形成另一實施例。

亦明確考慮所揭示的核酸序列之反向互補序列。本揭示之編號說明

下列編號項次(paras)說明本揭示之特定態樣及實施例：

1.一種治療癌症之方法，其包含對一個體投與： (i)一溶瘤病毒； (ii)一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒；及 (iii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

2.如項次1之方法，其中該溶瘤病毒是溶瘤腺病毒(OncAd)。

3.如項次1或項次2之方法，其中該溶瘤病毒源自腺病毒5 (Ad5)。

4.如項次1至3中任一項之方法，其中該溶瘤病毒編碼E1A蛋白，其與由Ad5編碼的E1A蛋白相比，顯示出較少結合至Rb蛋白。

5.如項次1至4中任一項之方法，其中該溶瘤病毒編碼缺少胺基酸序列LTCHEACF (序列辨識編號52)之E1A蛋白。

6.如項次1至5中任一項之方法，其中該溶瘤病毒編碼包含下列或由下列構成之E1A蛋白：序列辨識編號34之胺基酸序列。

7.如項次1至6中任一項之方法，其中該溶瘤病毒包含具有一或多個供一或多個轉錄因子用之結合位點之核酸。

8.如項次1至7中任一項之方法，其中該溶瘤病毒包含具有一或多個供STAT1用之結合位點之核酸。

9.如項次1至8中任一項之方法，其中該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，是一輔助依賴型腺病毒(HDAd)。

10.如項次1至9中任一項之方法，其中該免疫調節因子係選自：效應免疫反應的促效劑或免疫調節反應的拮抗劑。

11.如項次1至10中任一項之方法，其中該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，包含編碼IL-12和/或拮抗性抗PD-L1抗體之核酸。

12.如項次1至11中任一項之方法，其中該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒，包含編碼胸苷激酶之核酸。

13.如項次1至12中任一項之方法， 其中該至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的CAR之細胞，是一T細胞。

14.如項次1至13中任一項之方法，其中該CAR包含能夠專一性結合HER2之抗原結合域。

15.如項次1至14中任一項之方法，其中該CAR包含一抗原結合域，其含有： 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號10； LC-CRD2：序列辨識編號11； LC-CRD3：序列辨識編號12； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號13； HC-CRD2：序列辨識編號14； HC-CRD3：序列辨識編號15； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號18； LC-CRD2：序列辨識編號19； LC-CRD3：序列辨識編號20； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號21； HC-CRD2：序列辨識編號22； HC-CRD3：序列辨識編號23； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號26； LC-CRD2：序列辨識編號27； LC-CRD3：序列辨識編號28； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號29； HC-CRD2：序列辨識編號30； HC-CRD3：序列辨識編號31。

16.如項次1至15中任一項之方法，其中該CAR包含一抗原結合域，其包含： 一VL，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號16具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號17具有至少75%序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號24具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號25具有至少75%多序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號32具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號33具有至少75%序列一致性之胺基酸序列。

17. 如項次1至16中任一項之方法，該方法額外包含： (a)從一個體單離出至少一種細胞； (b)修飾該至少一種細胞以表達或包含對癌細胞抗原具專一性的一CAR，或編碼對癌細胞抗原具專一性的CAR之一核酸， (c)可選擇地擴增該經修飾的至少一種細胞，及； (d)對一個體投與該經修飾的至少一種細胞。

18.如項次1至17中任一項之方法，其中癌症係選自頭頸癌、鼻咽癌(NPC)、子宮頸癌(CC)、口咽癌(OPC)、胃癌(GC)、肝細胞癌(HCC)及肺癌。

19.一種溶瘤腺病毒(OncAd)，其編碼包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成之E1A蛋白：序列辨識編號34之胺基酸序列。

20.一種溶瘤腺病毒(OncAd)，其包含具有一或多個供STAT1用之結合位點之核酸。

21.如項次20之OncAd，其中該OncAd包含與序列辨識編號51具有至少60%序列一致性之核酸序列，或密碼子簡併所導致之同等序列。

22.一種輔助依賴型腺病毒(HDAd)，其包含編碼IL-12和/或拮抗性抗PD-L1抗體之核酸。

23.如項次22之HDAd，其中該HDAd額外地包含編碼胸苷激酶之核酸。

24.一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含一抗原結合域，其包含： 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號10； LC-CRD2：序列辨識編號11； LC-CRD3：序列辨識編號12; 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號13； HC-CRD2：序列辨識編號14； HC-CRD3：序列辨識編號15； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號18； LC-CRD2：序列辨識編號19； LC-CRD3：序列辨識編號20； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號21； HC-CRD2：序列辨識編號22； HC-CRD3：序列辨識編號23； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號26； LC-CRD2：序列辨識編號27； LC-CRD3：序列辨識編號28； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號29； HC-CRD2：序列辨識編號30； HC-CRD3：序列辨識編號31。

25.如項次24之CAR，其中該CAR包含一抗原結合域，其包含： 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號16具有至少75%序列一致性之胺基酸序列，及一VH，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號17具有至少75%序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號24具有至少75%序列一致性之胺基酸序列，及一VH，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號25具有至少75%序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號32具有至少75%序列一致性之胺基酸序列，及一VH，其包含下列，或由下列構成，或基本上由下列構成：與序列辨識編號33具有至少75%一致性之胺基酸序列。

26.一種可選擇地單離或人造的核酸，其編碼如項次19至21中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如項次22或項次23之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、或如項次24或項次25之嵌合抗原受體(CAR)。

27.一種細胞，其包含如項次19至21中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如項次22或項次23之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、如項次24或項次25之嵌合抗原受體(CAR)、或如項次26之核酸，可選擇地其中該細胞是人造且在自然中找不到的。

28.一種藥學組成物，其包含如項次19至21中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如項次22或項次23之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、如項次24或項次25之嵌合抗原受體(CAR)、如項次26之核酸、或如項次27之細胞，及一藥學上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑。

29.一種治療癌症之方法，其包含對一個體投與如項次19至21中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如項次22或項次23之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、如項次24或項次25之嵌合抗原受體(CAR)、如項次26之核酸、如項次27之細胞、或如項次28之藥學組成物。

30.如項次19至21中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如項次22或項次23之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、如項次24或項次25之嵌合抗原受體(CAR)、如項次26之核酸、如項次27之細胞、或如項次28之藥學組成物，其係供用於治療癌症之方法中。

31. 一種如項次19至21中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如項次22或項次23之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、如項次24或項次25之嵌合抗原受體(CAR)、如項次26之核酸、如項次27之細胞、或如項次28之藥學組成物在製備一藥劑之用途，該藥劑係供用於治療癌症。

32.如項次29至31中任一項之方法、使用或用途，其中該癌症係選自頭頸癌、鼻咽癌(NPC)、子宮頸癌(CC)、口咽癌(OPC)、胃癌(GC)、肝細胞癌(HCC)及肺癌。

33.一種組件式套組，其包含一預定量的如項次19至21中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如項次22或項次23之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、如項次24或項次25之嵌合抗原受體(CAR)、如項次26之核酸、如項次27之細胞、或如項次28之藥學組成物。

1A. 一種治療癌症之方法，其包含對一個體投與： (i)一溶瘤病毒； (ii)一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒；及 (iii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

2A.一種用於治療癌症之方法之組合，其具有(i)一溶瘤病毒；(ii)一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒；及(iii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

3A.一種(i)一溶瘤病毒(ii)一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒及(iii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞在製備一藥劑之用途，該藥劑係供用於治療癌症之方法中。

4A.一種治療癌症之方法，其包含對一個體投與： (i)一溶瘤病毒；及 (ii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

5A.一種用於治療癌症之方法之組合，其具有(i)一溶瘤病毒；及(ii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。

6A.一種(i)一溶瘤病毒及(ii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞在製備一藥劑之用途，該藥劑係供用於治療癌症之方法中。

7A.如項次1A或項次4A之方法，如項次2A或項次5A之組合、或如項次3A或項次6A之用途，其中該包含CAR之細胞對該溶瘤病毒具專一性。

8A.一種治療癌症之方法，其包含對一個體投與： (i)一溶瘤病毒；及 (ii)至少一種對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。

9A.一種用於治療癌症之方法之組合，其具有(i)一溶瘤病毒，及(ii)至少一種對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。

10A.一種(i)一溶瘤病毒及(ii)至少一種對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞在製備一藥劑之用途，該藥劑係供用於治療癌症之方法中。

11A.如項次1A至10A中任一項之方法、組合或用途，其中該溶瘤病毒是溶瘤腺病毒(OncAd)。

12A.如項次1A至11A中任一項之方法、組合或用途，其中該溶瘤病毒源自腺病毒5 (Ad5)。

13A.如項次1A至12A中任一項之方法、組合或用途，其中該溶瘤病毒編碼E1A蛋白，其相較於由Ad5編碼之E1A蛋白，表現出較少結合至Rb蛋白。

14A.如項次1A至13A中任一項之方法、組合或用途，其中該溶瘤病毒編碼缺少胺基酸序列LTCHEACF (序列辨識編號52)之E1A蛋白。

15A.如項次1A至14A中任一項之方法、組合或用途，其中該溶瘤病毒編碼包含下列或由下列構成之E1A蛋白：序列辨識編號34之胺基酸序列。

16A.如項次1A至15A中任一項之方法、組合或用途，其中該溶瘤病毒包含具有一或多個供一或多個轉錄因子用之結合位點之核酸。

17A.如項次1A至16A中任一項之方法、組合或用途，其中該溶瘤病毒包含具有一或多個供STAT1用之結合位點之核酸。

18A.如項次1A至7A或11A至17A中任一項之方法、組合或用途，其中該至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的CAR之細胞，是一T細胞。

19A.如項次1A至7A或11A至18A中任一項之方法、組合或用途，其中該CAR包含能夠專一性結合HER2之抗原結合域。

20A.如項次1A至7A或11A至19A中任一項之方法、組合或用途，其中該CAR包含一抗原結合域，其包含： 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號10； LC-CRD2：序列辨識編號11； LC-CRD3：序列辨識編號12； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號13； HC-CRD2：序列辨識編號14； HC-CRD3：序列辨識編號15； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號18； LC-CRD2：序列辨識編號19； LC-CRD3：序列辨識編號20； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號21； HC-CRD2：序列辨識編號22； HC-CRD3：序列辨識編號23； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號26； LC-CRD2：序列辨識編號27； LC-CRD3：序列辨識編號28； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號29； HC-CRD2：序列辨識編號30； HC-CRD3：序列辨識編號31； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號57； LC-CRD2：序列辨識編號58； LC-CRD3：序列辨識編號59； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號60； HC-CRD2：序列辨識編號61； HC-CRD3：序列辨識編號62。

21A. 如項次1A至7A或11A至20A中任一項之方法、組合或用途，其中該CAR包含一抗原結合域，其包含： 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號16具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號17具有至少75%序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號24具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號25具有至少75%序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號32具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號33具有至少75%序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號63具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號64具有至少75%序列一致性之胺基酸序列。

22A.如項次1A至3A或11A至21A中任一項之方法、組合或用途，其中該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒是輔助依賴型腺病毒(HDAd)。

23A. 如項次1A至3A或11A至22A中任一項之方法、組合或用途，其中該免疫調節因子係選自：效應免疫反應的促效劑或免疫調節反應的拮抗劑。

24A.如項次1A至3A或11A至23A中任一項之方法、組合或用途，其中該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒包含編碼IL-12和/或拮抗性抗PD-L1抗體之核酸。

25A.如項次1A至3A或11A至24A中任一項之方法、組合或用途，其中該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒包含編碼能夠將無毒性因子催化轉換成細胞毒性形式之酵素之核酸。

26A.如項次25A之方法、組合或用途，其中該酵素係選自：胸苷激酶、胞嘧啶去胺酶、硝基還原酶、細胞色素P450、羧肽酶G2、嘌呤核苷磷酸化酶、辣根過氧化酶及羧酸酯酶。

27A. 如項次1A至26A中任一項之方法、組合或用途，其中該治療癌症的方法包含： (a)從一個體單離出至少一種細胞； (b)修飾該至少一種細胞以表達或包含對癌細胞抗原具專一性的一CAR，或編碼對癌細胞抗原具專一性的CAR之一核酸， (c)可選擇地擴增該經修飾的至少一種細胞，及； (d)對一個體投與該經修飾的至少一種細胞。

28A.如項次1A至27A中任一項之方法、組合或用途，其中該治療癌症之方法包含： (a)從一個體單離出免疫細胞； (b)利用包含下列之方法產生或擴張對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞群：刺激該免疫細胞，其係藉由在呈現該溶瘤病毒之胜肽的抗原呈現細胞(APCs)存在下來培養，及； (c)對一個體投與至少一種對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。

29A.如項次1A至28A中任一項之方法、組合或用途，其中該癌症係選自頭頸癌、鼻咽癌(NPC)、子宮頸癌(CC)、口咽癌(OPC)、胃癌(GC)、肝細胞癌(HCC)及肺癌。

30A.一種溶瘤腺病毒(OncAd)，其編碼包含下列或由下列構成之E1A蛋白：序列辨識編號34之胺基酸序列。

31A.一種溶瘤腺病毒(OncAd)，其包含具有一或多個供STAT1用之結合位點之核酸。

32A.一種溶瘤腺病毒(OncAd)，其包含與序列辨識編號51具有至少60%序列一致性之核酸序列，或密碼子簡併所導致之同等序列。

33A.一種溶瘤腺病毒(OncAd)，其包含與序列辨識編號55具有至少60%序列一致性之核酸序列，或密碼子簡併所導致之同等序列。

34A.一種輔助依賴型腺病毒(HDAd)，其包含編碼IL-12和/或拮抗性抗PD-L1抗體之核酸。

35A.如項次34A之HDAd，其中該HDAd額外地包含編碼能夠將無毒性因子催化轉換成細胞毒性形式之酵素之核酸。

36A.如項次34A或項次35A之HDAd，其中該酵素係選自：胸苷激酶、胞嘧啶去胺酶、硝基還原酶、細胞色素P450、羧肽酶G2、嘌呤核苷磷酸化酶、辣根過氧化酶及羧酸酯酶。

37A.一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含一抗原結合域，其包含： 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號10； LC-CRD2：序列辨識編號11； LC-CRD3：序列辨識編號12； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號13； HC-CRD2：序列辨識編號14； HC-CRD3：序列辨識編號15； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號18； LC-CRD2：序列辨識編號19； LC-CRD3：序列辨識編號20； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號21； HC-CRD2：序列辨識編號22； HC-CRD3：序列辨識編號23； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號26； LC-CRD2：序列辨識編號27； LC-CRD3：序列辨識編號28； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號29； HC-CRD2：序列辨識編號30； HC-CRD3：序列辨識編號31； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號57； LC-CRD2：序列辨識編號58； LC-CRD3：序列辨識編號59； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號60； HC-CRD2：序列辨識編號61； HC-CRD3：序列辨識編號62。

38A.如項次37A之CAR，其中該CAR包含一抗原結合域，其包含： 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號16具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號17具有至少75%序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號24具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號25具有至少75%序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號32具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號33具有至少75%序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號63具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號64具有至少75%序列一致性之胺基酸序列。

39A.一種可選擇地單離或人造的核酸或多個核酸，其編碼如項次30A至33A中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如項次34A至36A中任一項之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、或如項次37A或項次38A之嵌合抗原受體(CAR)。

40A.一種細胞，其包含如項次30A至33A中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如項次34A至項次36A中任一項之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、如項次37A或項次38A之嵌合抗原受體(CAR)、或如項次39A之核酸或多個核酸。

41A.一種藥學組成物，其包含如項次30A至33A中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如項次34A至項次36A中任一項之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、如項次37A或項次38A之嵌合抗原受體(CAR)、如項次39A之核酸或多個核酸、或如項次40A之細胞，及一藥學上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑。

42A.一種治療癌症之方法，其包含對一個體投與如項次30A至33A中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如項次34A至項次36A中任一項之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、如項次37A或項次38A之嵌合抗原受體(CAR)、如項次39A之核酸或多個核酸、如項次40A之細胞、或如項次41A之藥學組成物。

43A.如項次30A至33A中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如項次34A至項次36A中任一項之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、如項次37A或項次38A之嵌合抗原受體(CAR)、如項次39A之核酸或多個核酸、如項次40A之細胞、或如項次41A之藥學組成物，其係供用於治療癌症之方法中。

44A.一種如項次30A至33A中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如項次34A至項次36A中任一項之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、如項次37A或項次38A之嵌合抗原受體(CAR)、如項次39A之核酸或多個核酸、如項次40A之細胞或、如項次41A之藥學組成物在製備一藥劑之用途，該藥劑係供用於治療癌症。

45A.如項次42A之方法、如項次43所供用之OncAd、HDAd、CAR、核酸或多個核酸、細胞或藥學組成物、或如項次44A之用途，其中該癌症係選自頭頸癌、鼻咽癌 (NPC)、子宮頸癌(CC)、口咽癌(OPC)、胃癌(GC)、肝細胞癌(HCC)及肺癌。

46A.一種組件式套組，其具有包含一預定量的如項次30A至33A中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如項次34A至項次36A中任一項之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、如項次37A或項次38A之嵌合抗原受體(CAR)、如項次39A之核酸或多個核酸、如項次40A之細胞或、如項次41A之藥學組成物。範例

在下列範例中，本發明人說明新穎的HER-2 專一性CARs及CAR-T細胞、溶瘤腺病毒及輔助依賴型腺病毒之產生功能特徵。範例1 ：HER2 專一性CAR-T 細胞 1.1 HER2 專一性CAR 建構體及CAR-T 細胞之產生

製備HER2結合性CAR建構體。簡言之，將編碼抗HER2抗體殖株C5、E4、F1或A3之scFv (即，由一連接子序列接合之VL域及VH域)的DNA，選殖進入包含5’訊息肽(SP)及CD28跨膜(TM)及胞內域序列，以及3’CD3ζ胞內域序列之CAR建構體主鏈中。三種HER2結合性CAR建構體示意於圖1A中。

如圖1B圖解表示的產生HER2專一性CAR-T細胞。簡言之，利用Ficoll密度梯度離心，從血液樣本中單離出PBMC。在IL-2之存在下，用抗CD3(OKT3)/抗CD28刺激處理細胞，以促進T細胞活化及增生，然後以編碼HER2 CAR建構體之反轉錄病毒轉導細胞。藉由在100 IU/mL重組人IL-2之存在下培養來擴增T細胞，然後在轉導後6天，將其冷凍。該HER2專一性CAR建構體轉導的T細胞，很容易通過體外培養進行擴增(見如圖14)。

解凍T細胞，並在100IU/mL的重組人IL-2之存在下擴增5天，然後用於體外/活體內實驗及表型分析。1.2 HER2 專一性CAR-T 細胞之表徵 1.2.1 表面標記及HER2 CAR 之表達

利用流動式細胞測量術，表徵以編碼抗HER2抗體殖株E4之scFv之HER2 CAR建構體轉導的T細胞之不同細胞表面分子的表達。用螢光標識的單株抗體，在4ºC下對擴增的HER2專一性CAR T細胞染色30分鐘。藉由在染色時包含7AAD (BD Pharmingen)來達到活/死細胞的區分。使用Gallios流動式細胞測量儀及Kaluza軟體(BD Bioscience)，依照製造商的說明書，分析染色的細胞。

結果示於2及3中。在轉導的細胞上檢測到很強的HER2-CARs之表面表達(圖2)。

圖3顯示以HER2(E4)-CAR轉導的T細胞之表徵結果。相較於非轉導的細胞，表達HER2(E4)-CAR之CD3+細胞、CD4+細胞及CD8+細胞，顯示出PD-1、LAG-3及TIM-3之表達增加，而CCR7之表達位準降低(圖3)。1.2.2 細胞殺傷活性

在細胞殺傷分析中，分析HER2-CAR-T細胞在體外殺傷HER2表達性癌細胞之能力。

在第一實驗中，用鉻-51 (⁵¹ Cr)標識HER2陰性MDA細胞株(陰性對照組)、穩定表達HER2之MDA細胞(MDA-HER2；陽性對照組)、咽部鱗狀細胞癌細胞株FaDu或頭頸鱗狀細胞癌細胞株SCC47細胞之細胞，且與非轉導的T細胞(NT)或表達指定的CARs之HER2-CAR-T細胞在效應細胞：標靶細胞之比為20：1之條件下共培養4個小時。離心後，使用液體閃爍計數器計算細胞培養基中⁵¹ Cr之位準。結果示於圖4A中；顯示HER2-CAR-T細胞會殺傷HER2表達性癌細胞。當使用效應細胞：標靶細胞比為10：1之條件進行實驗時，獲得相似的結果。

利用流動式細胞測量術來確認HER2在MDA-HER2、FaDu及SCC47上的表達。簡言之，用螢光標識的單株抗HER2抗體或同型對照抗體，在4ºC下對細胞染色30分鐘。藉由在染色時包含7AAD (BD Pharmingen)來達到活/死細胞的區分。使用Gallios流動式細胞測量儀及Kaluza軟體(BD Bioscience)，依照製造商的說明書分析染色的細胞。結果示於圖4B中；確認了MDA細胞沒有表達HER2，而MDA-HER2、FaDu及SCC47有表達HER2。

在另一個實驗中，將基因修飾而可表達螢火蟲螢光素酶(ffLuc)之FaDu及SCC47細胞接種到24孔盤之孔中，並與HER2(C5)-CAR-T細胞、HER2(E4)-CAR-T細胞或HER2(F1)-CAR-T細胞在效應細胞：標靶細胞之比為1：5之條件下共培養3天，然後使用盤讀取器(Life Technologies)測量ffLuc活性。結果示於圖5中；由ffLuc活性之減少證明(相對的光單位，RLU)，顯示HER2-CAR-T細胞會殺傷HER2表達性癌細胞。當使用效應細胞：標靶細胞比為1：20之條件進行實驗時，獲得相似的結果。範例2 ：OncAd 建構體 2.1 OncAd 建構體之產生

使用重組DNA技術製備編碼溶瘤腺病毒之新穎的建構體。

在特定實施例中，藉由修飾已知的病毒產生OncAd。例如，將編碼來自腺病毒5之E1A蛋白之區域，如缺少涉及Rb蛋白之結合的序列LTCHEACF (序列辨識編號52)之區域，以編碼來自腺病毒2之E1A蛋白，同樣缺少序列LTCHEACF (序列辨識編號52)之序列取代。

圖6中所示之ICOSTAT，是由如Rojaset al. 2010 Mol Ther 18 1960-1971中所揭示的ICOVIR15產生。簡言之，將ICOVIR15中編碼8個供轉錄因子E2F用之結合位點複本的區域，以編碼8個供轉錄因子STAT1用之結合位點串聯複本的區域取代。ICOSTAT之序列示於序列辦識編號51中。

亦使用重組DNA技術製備序列辨識編號55 中所示及圖12中示意的Onc5/3Ad2E1Δ24 (在本文中亦稱作“Onc5/2E1Δ24”)。Onc5/3Ad2E1Δ24具有與在如Fueyo et al. 2000 Oncogene 19:2-12 (其完整地在此併入本案以為參考；在Fueyo et al.中，Onc5Δ24亦稱作“Δ24”)中所揭示的Onc5Δ24相似的結構，但不同的是，Onc5/3Ad2E1Δ24編碼來自腺病毒第2型(Ad2)之缺少序列LTCHEACF (序列辨識編號52)的E1A蛋白，而不是來自腺病毒第5型(Ad5)之缺少序列LTCHEACF (序列辨識編號52)的E1A蛋白。2.2 細胞殺傷活性

可使用例如MTS，分析首選的溶瘤腺病毒或範例2.1中產生的ICOSTAT殺傷癌細胞的能力。簡言之，將人肺泡基底上皮腺癌細胞株A549細胞、FaDu細胞、SCC47細胞或非癌WI-38人肺纖維母細胞或ARPE-19人視網膜色素上皮細胞之細胞，接種在96孔盤之孔中，然後用不同數量的輔助依賴型、非複製性腺病毒(HDAd；陰性對照組)、首選的溶瘤腺病毒(如，範例2.1中所述的Onc5/3Ad2E1Δ24)或以上範例2.1中所述的ICOSTAT感染。

培養細胞例如4天，然後於各孔中加入MTS試劑(Promega)，細胞在37°C下培育2個小時。藉由使用盤讀取器測量在490nm下的吸收度來分析活細胞。可使用各類未處理的細胞之讀數(即，未處理的細胞=100%細胞生存率)正規化讀數，沒有細胞的孔視為0%。

在特定實施例中，首選的溶瘤病毒能夠以劑量依賴的方式殺傷癌細胞。在具體實施例中，首選的溶瘤病毒在殺傷非癌細胞如WI-38及ARPE-19細胞方面，相較於該病毒殺傷癌細胞的位準，亦展現較低的位準。

圖7A至7F顯示，ICOSTAT能以劑量依賴的方式殺傷癌細胞(即，A549、FaDu及SCC47細胞) (圖7A至7C及7F)，及相較於殺傷癌細胞之位準，在殺傷非癌細胞WI-38及ARPE-19細胞上表現出較低的位準(圖7D及7E)。

圖13A至13D顯示Onc5/3Ad2E1Δ24能以劑量依賴的方式殺傷癌細胞(即，FaDu及SCC47細胞) (圖13A及13B)，且相較於殺傷癌細胞之位準，在殺傷非癌細胞WI-38及ARPE-19細胞上表現出較低的位準(圖13C及13D)。2.3 幫助輔助依賴型腺病毒(HDAd) 之能力

首選的溶瘤腺病毒或範例2.1中產生的ICOSTAT幫助輔助依賴型腺病毒(HDAd)複製之能力，可藉由以OncoAd與HDAd共感染癌細胞，而後測定病毒複本數來分析。簡言之，將FaDu或SCC47細胞接種到24孔盤中，並單獨以10病毒粒子/細胞之HDAd，或OncAd+HDAd (OncAd：HDAd之比為1：10)感染。感染後48個小時收集細胞，提取DNA並藉由使用Bio-Rad iQ5即時PCR檢測系統(Bio-Rad)之定量即時PCR以及Applied Biosystems SYBR green PCR master mix (Life Technologies)分析HDAd及Onc.Ad載體二者之複本數(在95℃下10分鐘，然後45個在95℃下10秒的循環、在60℃下15秒及在72℃下30秒)。使用針對GAPDH測得的複本數正規化複本數。

在特定實施例中，首選的溶瘤病毒能充分地複製自己與HDAd。

圖8A及8B顯示發現ICOSTAT (在圖中命名為“Onc5/3AdicoSTAT”)能夠複製自己(圖8A)及HDAd (圖8B)。2.4 IFNγ 對癌細胞中ICOSTAT 之複製的作用

分析IFNγ處理對ICOSTAT OncAd複製的影響。簡言之，將FaDu及SCC47細胞接種到24孔盤中，並以10vp/細胞之首選的溶瘤病毒或icoSTAT感染該細胞，感染後3個小時，以含有或不含10ng/mL重組IFNγ之培養基取代感染3小時後的細胞培養基，然後在感染後24及48小時，再次以有/無10ng/mL重組IFNγ之新的培養基取代細胞培養基。收集感染後3、24、48 及72小時之細胞，從細胞中提取DNA，利用定量即時PCR分析病毒複本數及使用對GAPDH測得之複本數正規化。

圖9A及9B顯示ICOSTAT能夠在有或無IFNγ之情況下於FaDu細胞及SCC47細胞中複製。範例3 ：輔助依賴型Ad (HDAd) 建構體 3.1 HDAd 建構體及產生

使用重組DNA技術製備編碼輔助依賴型腺病毒之新穎建構體。所產生命名為HDAdIL-12_TK_PD-L1 之建構體的編碼序列示意於圖10A中。HDAdIL-12_TK_PD-L1含有編碼(i)人IL-12p70 (編碼α及β鏈之序列)、(ii) HSV-1胸苷激酶及(iii)抗PD-L1微體(包含如WO 2016111645 A1中所述的抗PD-L1殖株H12_gl之CDRs)，包括HA標籤之表達盒的序列。三個編碼序列各具有其等自己的多聚腺苷酸(polyA)訊息序列。

以如Farzadet al . Oncolytics 2014 1: 14008中所述的產生含有由CMV啟動子(HDAdeGFP)驅動的EGFP轉基因之HDAd HDΔ28E4EGFP建構體。

該HDAd “HDIL12_PDL1”含有編碼人IL-12p70蛋白及源自YW243.55.S70之抗PD-L1微體 (atezolizumab)之序列。此建構體中之抗PD-L1微體包含YW243.55.S70之以鉸鏈融合的scFv、人IgG1之CH2及CH3區及C端HA標籤(如Tanoueet al. Cancer Res. (2017) 77(8):2040-2051中所述)。3.2 編碼蛋白之表達

以質體HDAd載體轉染癌細胞，收集轉染後48小時之培養基樣本，以分析該轉染細胞之細胞培養基中的IL-12p70及抗PD-L1微體位準。

使用BD細胞激素多重珠陣列系統(BD Biosciences)，依照製造商之說明書，測量培養基中IL-12p70之位準。結果示於圖10B中。發現以HDAdIL-12_TK_PD-L1 建構體轉染的細胞產生比以HDIL-12_PD-L1建構體轉染的細胞高位準的IL-12p70。

利用西方墨點法，使用抗HA抗體(用於檢測HA標籤的微體)檢測分泌至細胞培養基中的抗PD-L1微體。圖10C顯示以HDAdIL-12_TK_PD-L1 建構體轉染的細胞會分泌抗PD-L1微體至細胞培養基中。

在另一實施例中，以不同建構體轉染細胞，及在轉染後8小時以含有10ng/ml更昔洛韋(GCV)之培養基取代該細胞培養基。之後每24小時以含有10ng/ml之培養基取代細胞培養基，且在7天後，用結晶紫溶液對孔染色以便顯示出活細胞。

結果示於圖10D中，並且確認了以HDAdIL-12_TK_PD-L1 建構體轉染的細胞會表達胞苷激酶。

在另外的實施例中，在體外以HDAdIL-12_TK_PD-L1 、HDAd_PD-L1 (見如以上Tanoueet al .)或編碼eGFP之對照HDAd (見以上Farzadet al. )感染A549、FaDu或SCC47細胞(n=4孔/條件)。將該細胞培養在無更昔洛韋之條件下48個小時，或在感染後8個小時及之後的每24個小時，以含有10ng/ml更昔洛韋之培養基更換該培養基。

利用ELISA分析分泌至細胞培養上清液中的IL-12，且利用西方墨點法，使用抗HA抗體(抗PD-L1微體包含C端HA標籤)分析抗PD-L1微體的分泌。實驗結束時，用結晶紫對孔染色以顯示出活細胞。

結果示於圖21A至21C中，並且確認了在所分析的不同癌細胞株中由HDAd編碼的轉基因的表達。3.3 抗PD-L 微體結合至PD-L1 的確認

利用ELISA分析由HDAdIL-12_TK_PD-L1 編碼之抗PD-L1微體結合至PD-L1之能力。

簡言之，以500ng/孔之重組人PD-L1 (BioVision)塗覆Immulon 2高結合性96孔盤(VWR)。在以含3% BSA之PBS-T封閉盤後，加入已經過編碼GFP之質體(pGFP；陰性對照組)、編碼同上Tanoueet al. 所述的抗PD-L1微體之質體(pPDL1 mini Tanoue)或編碼抗pPDL1微體(由HDAdIL-12_TK_PD-L1 編碼的)之質體(pPDL1 mini)轉染的A549細胞之連續稀釋的細胞培養基，並在4ºC下培育24個小時。使用從10µg/孔開始連續稀釋的抗人PD-L1抗體(BioLegend)作為陽性對照組(PDL1 IgG)。在用PBS-T清洗盤後，添加HRP標識的抗人IgG (用於PD-L1 mini及PDL1 mini Tanoue)或HRP標識的抗小鼠IgG (BioRad；用於PD-L1 IgG及Iso IgG)供檢測用，且在室溫下培育1個小時。之後使該盤顯影，使用Tecan讀取器(TECAN)測量在450nm下之吸光度。

結果示於圖11中。發現包含抗PD-L1抗體殖株H12之CDRs之抗PD-L1抗體，以劑量依賴性之方式結合至人PD-L1，與同上Tanoueet al. 中所述的抗PD-L1微體之結合力相比，具有相當(或更高)的結合力。範例4 ：活體內癌症治療之分析

在小鼠異種移植腫瘤模型中證明以(1)首選的溶瘤病毒+HDAdIL-12_TK_PD-L1 + HER2-CAR-T及(2) ICOSTAT+HDAdIL-12_TK_PD-L1 + HER2-CAR-T之組合治療於活體內的抗癌效果。

在第一實驗中，將1x10⁶ 個配製於PBS中之FaDu細胞皮下注射於NSG雄性小鼠中。12天後，於腫瘤內注射1x10⁸ 個病毒粒子(1)溶瘤病毒與HDAdIL-12_TK_PD-L1 或(2) ICOSTAT + HDAdIL-12_TK_PD-L1 ，OncAd：HDAd之比為1：20。

在第二實驗中，將0.5x10⁶ 個FaDu細胞原位注射入NSG雄性小鼠中。6天後，腫瘤內注射1x10⁸ 個病毒粒子(1)溶瘤病毒與HDAdIL-12_TK_PD-L1或(2) ICOSTAT+HDAdIL-12_TK_PD-L1 ，OncAd：HDAd之比為1：20。

在二個實驗中，在投與病毒粒子後3天，靜脈投與1x10⁶ 個HER2-CAR T細胞。

在二個實驗中，對照條件包含如下：

監控腫瘤尺寸，且使用方程式：寬² x長x0.5計算腫瘤體積。

發現相較於單獨使用任一劑(條件8、10或11)，或相較於使用三劑中之二劑(條件3、4及6)，使用溶瘤病毒、HDAdIL-12_TK_PD-L1及HER2 CAR-T之組合(測試條件1)具有改善的抗腫瘤作用。

相似地，發現相較於單獨使用任一劑(條件9、10或11)，或相較於使用三劑中之二劑(條件3、5及7)，使用ICOSTAT、HDAdIL-12_TK_PD-L1及HER2 CAR-T之組合(測試條件2)具有改善的抗腫瘤作用。

使用SCC47細胞及A549細胞建立異種移植腫瘤時觀察到相似的結果。範例5 ：HER2 專一性CAR-T 細胞活體內抗癌活性之分析

在鱗狀細胞頭頸癌FaDu細胞來源異種移植模型中，研究HER2專一性CAR-T細胞(見以上範列1)活體內之抗癌活性。

簡言之，將0.5x10⁶ 個FaDu細胞原位注射入NSG雄性小鼠中。9天後，透過尾靜脈於小鼠中注射1x10⁶ 個未以HER2-CAR建構體轉導之基因修飾可表達螢火蟲螢光素酶之T細胞，或1x10⁶ 個以C5、F1或A3 CAR建構體轉導之螢火蟲螢光素酶表達性T細胞。在該實驗中包括在第9天沒有於小鼠身上注射T細胞之對照條件。

監控螢光素酶活性(因此為投與的T細胞之數量及分佈)、體重、小鼠存活率隨時間之變化。藉由腹膜內注射D-螢光素(1.5mg/小鼠)，且10分鐘後使用IVIS顯像儀(Xenogen)對小鼠進行成像來監測螢光素酶活性。

圖15A及15B顯示在注射螢光素酶表達性T細胞(即，非轉導T細胞或HER2專一性CAR-T細胞)後第0天、第4天、第7天、第14天、第28天、第42天、第56及第70天(天數意指在ffLuc T細胞注射後之天數)所獲得的影像。全身性輸注的T細胞顯示出移動至原位腫瘤位置。7天後，檢測不到沒有經過修飾以表達HER2專一性CAR之T細胞。相反的，整個實驗過程中，持續可檢測到HER2專一性CAR-T細胞。

圖15C顯示接受不同治療之小鼠，經過整個實驗後之存活率百分比。發現投與HER2專一性CAR-T細胞的存活率增加。

在另外的實驗中，透過尾靜脈於NOD scid γ (NSG)小鼠中注射1x10⁶ 個沒有以HER2-CAR建構體轉導之螢火蟲螢光素酶表達性T細胞，或1x10⁶ 個已經過C5、F1或A3 CAR建構體轉導之螢火蟲螢光素酶表達性T細胞。如上所述監測螢光素酶活性，亦監測小鼠之體重隨時間之變化。

實驗結果示於圖16A至16C中。發現C5 CAR-T細胞在NSG小鼠中非專一性地擴張(圖16A)。在投與HER2專一性CAR-T細胞之小鼠中沒有觀察到顯著的重量損失(圖16C)。範例6 ：溶瘤病毒、HDAd 病毒與HER2 專一性CAR-T 細胞之組合，在活體內抗癌活性之分析

在鱗狀細胞頭頸癌FaDu細胞來源異種移植模型中，研究溶瘤病毒、HDAd與HER專一性CAR-T細胞之組合療法於活體內的抗癌活性。

簡言之，將0.5x10⁶ 個FaDu細胞原位注射進入NSG雄性小鼠中。6天後，於一群小鼠之腫瘤內注射Onc5/3Ad2E1Δ24之組合(述於範例2.1)及範例3.1中所述的HDAdIL-12_TK_PD-L1 (OncAd與HdAd這樣的結合在本文中稱作“CAdtrio ”)。以Onc5/3Ad2E1Δ24：HDAdIL-12_TK_PD-L1 為1：10之比，投與全部1x10⁷ 個病毒粒子。

三天後，透過尾靜脈於小鼠中投與1x10⁶ 個已經過HER2專一性CAR建構體轉導(對應於殖株F1)且經過基因工程而表達螢火蟲螢光素酶之T細胞。在沒投與CAdtrio 之對照小鼠群中，透過尾靜脈注射1x10⁶ 個沒有經過HER2-CAR建構體轉導之螢火蟲螢光素酶表達性T細胞，而在另一對照小鼠群中不投與CAdtrio 亦不注射T細胞。監測小鼠之螢光素酶活性、體重及存活率隨著時間之變化。

在其等用於實驗之前，先以流動式細胞測量術表徵F1.CART細胞，結果示於圖17A至17C中。發現該等細胞包含72.5%的CD4+細胞及CD8+細胞。確定有87%的細胞在細胞表面上表達HER2 CAR。39%的細胞是CCDR7+CD45RO+，而59.2%的細胞是CCR7-CD45RO+。

分析溶瘤病毒、HDAd病毒與HER2專一性CAR-T細胞之組合於活體內治療癌症之治療效果的實驗結果，示於圖18A至18D中。發現Onc5/3Ad2E1Δ24、HDAdIL-12_TK_PD-L1 與F1.CART之組合，可改善僅用F1.CART細胞治療之存活率。

在另外的實驗中，研究Onc5/3Ad2E1Δ24對HDAdIL-12_TK_PD-L1 之二個不同的比。

簡言之，將0.5x10⁶ 個經修飾以表達螢火蟲螢光素酶之FaDu細胞原位注射進入NSG雄性小鼠中。6天後，於小鼠之腫瘤內注射： (i) 1x10⁷ 個CAdtrio 病毒粒子，Onc5/3Ad2E1Δ24：HDAdIL-12_TK_PD-L1 之比為1：10； (ii) 1x10⁷ 個CAdtrio 病毒粒子，Onc5/3Ad2E1Δ24：HDAdIL-12_TK_PD-L1 之比為1：20； (iii) 1x10⁸ 個CAdtrio 病毒粒子，Onc5/3Ad2E1Δ24：HDAdIL-12_TK_PD-L1 之比為1：10；或 (iv) 1x10⁸ 個CAdtrio 病毒粒子，Onc5/3Ad2E1Δ24：HDAdIL-12_TK_PD-L1 之比為1：20。

三天後，透過尾靜脈注射1x10⁶ 個經過F1 CAR建構體轉導的T細胞(不表達螢火蟲螢光素酶)。如上所述藉由分析螢光素酶活性，監測該癌症隨時間之變化，亦監測小鼠之體重。

實驗之結果示於圖19A至19C中。投與Onc5/3Ad2E1Δ24：HDAdIL-12_TK_PD-L1 之比為1：10之小鼠，通常比投與Onc5/3Ad2E1Δ24：HDAdIL-12_TK_PD-L1 之比為1：20之小鼠具有較少的螢光素酶表達性FaDu細胞，以及投與1x10⁸ 個CAdtrio 病毒粒子之小鼠通常具有比投與1x10⁷ 個CAdtrio 病毒粒子之小鼠具有較少的螢光素酶表達性FaDu細胞(圖19B)。範例7 ：溶瘤病毒、HDAd 病毒與更昔洛韋(GCV) 之組合於活體內抗癌活性之分析

在鱗狀細胞頭頸癌FaDu細胞來源異種移植模型中，研究溶瘤病毒及HdAd (編碼胸苷激酶) (即，CAdtrio )與更昔洛韋(GCV)之組合的活體內抗癌活性。

藉由於小鼠的翼側皮下注射FaDu細胞，建立異位FaDu腫瘤。之後於小鼠的腫瘤內注射1x10⁸ 個CAdtrio 病毒粒子，Onc5/3Ad2E1Δ24：HDAdIL-12_TK_PD-L1 之比為1：10。在CAdtrio 注射後第2天、第 3天、第4天、第5天、第7天、第10天、第14天、第17天及第21天，於一群小鼠(n=5)之腹腔中注射10mg/kg之更昔洛韋。

在第2天、第7天、第14天及第21天從小鼠身上採集血液樣本，然後利用ELISA分析IL-12之表達。在整個實驗過程中監測腫瘤體積。第22天，利用定量即時PCR分析測定從腫瘤提取的DNA中之Onc.Ad及HDAd載體的複本數，且使用針對GAPDH檢測得之複本數進行正規化。

實驗結果示於圖20A至20D中。更昔洛韋(GCV)處理不會顯著地影響第22天的Onc.Ad載體複本數(圖20A)，但會顯著地減少HDAd載體複本數(圖20B)。亦發現GCV處理會改善腫瘤控制(圖20C)，但不會顯著地影響血液中IL-12的位準(圖20D)。範例8 ：溶瘤病毒專一性T 細胞及HER 專一性CAR 表達性溶瘤病毒專一性T 細胞之產生 8.1 溶瘤病毒專一性T 細胞之產生及表徵

溶瘤病毒專一性T細胞(AdVST)及活化的T細胞(ATCs)製備如下。

藉由添加0.5ml之1mg/ml以1：1000稀釋的抗體，然後在37°C下培育2-4個小時或在4°C下一整夜，使抗CD3 (殖株OKT3)及抗CD28促效性抗體塗覆在組織培養盤之孔上。

依照標準Ficoll-Paque方法，從健康捐贈者獲得之血液樣本中單離出PBMCs。ATCs ：

藉由在抗CD3/CD28促效性抗體塗覆盤上，於補充有10ng/ml IL-7及5ng/ml IL-15之CTL細胞培養基(含有50% Advanced RPMI、50% Click培養基、10% FBS、1% GlutaMax、1%青黴素/鏈黴素)中培養，刺激1x10⁶ 個PBMCs (在2ml的細胞培養基中)。將細胞保持在37°C、5% CO₂ 之環境下。隔天，以含有20ng/ml IL-7及10ng/ml IL-15之新的CTL培養基取代1ml之該細胞培養基。

保持培養ATCs，之後5-7天之間收集並用於實驗或冷凍保存。AdVSTs ：

藉由在抗CD3/CD28促效性抗體塗覆盤上，於補充有10ng/ml IL-7及100ng/ml IL-15之CTL細胞培養基中培養，刺激1x10⁶ 個PBMCs (在2ml的細胞培養基中)。

將20μl之200倍稀釋的腺病毒專一性Hexon Pepmix (JPT Cat# PM-HAdV3)或Penton PepMix (JPT Cat# PM-HAdV5)加至孔中。將細胞保持在37°C、5% CO₂ 環境下。48個小時後，餵給細胞CTL培養基，添加IL-7及IL-15至最終濃度為10ng/ml的IL-7及100ng/ml的IL-15。8.2 CAR 表達性溶瘤病毒專一性T 細胞之產生

第3天，將AdVSTs以0.125 x 10⁶ 細胞/ml之濃度懸浮於含有10ng/ml IL-7及100ng/ml IL-15之CTL細胞培養基中。

藉由使於PBS中稀釋1：100之RetroNectin (Clontech)在37°C下培育2-4個小時，或4°C下培育一整夜，製備Retronectin塗覆盤。用CTL培養基清洗孔，於孔中加入1ml之HER2專一性CAR反轉錄病毒之反轉錄病毒上清液，然後令該盤在2000g下離心1.5個小時。離心步驟結束時，吸取反轉錄病毒上清液，然後於該盤之孔中加入2ml的AdVST懸浮液(即，0.25x10⁶ 個細胞)。令該盤在400g下離心5分鐘，然後在37°C、5%CO₂ 環境下培育。

48個小時後(即，第6天)，吸出細胞培養基並以含有10ng/ml IL-7及100ng/ml IL-15之CTL細胞培養基取代。

第9天，收集細胞供實驗用或冷凍保存，或進行第二次刺激以便擴增CAR表達性AdVSTs (見範例8.3)。8.3 AdVSTs 及CAR-AdVSTs 之擴增

如下，根據需要進一步刺激擴增AdVSTs及CAR表達性AdVSTs。

使用Pepmix衝擊的自體ATCs作為APCs，而使用K562c細胞(見如Ngo et al., J Immunother. (2014) 37(4):193-203)作為共刺激細胞。刺激培養基中AdVSTs或CAR-AdVSTs：ATCs：K562cs最後的比為1：1：3-5。

將AdVSTs或CAR-AdVSTs於CTL培養基中重新懸浮至濃度為0.2x10⁶ 細胞/ml。

在37°C下以10μl 200倍稀釋的腺病毒專一性Hexon Pepmix (JPT Cat# PM-HAdV3)或Penton PepMix (JPT Cat# PM-HAdV5)培育1x10⁶ 個ATCs 30分鐘。之後以30Gy照射該ATCs並收集。以100Gy照射3-5x10⁶ 個K562cs細胞。

之後將ATCs及K562cs細胞混合於總體積為5ml之CTL培養基中，並添加20ng/ml之IL-7及200ng/ml之IL-15，將1ml之此混合物加至24孔盤之孔中，且於孔中加入1ml之AdVST懸浮液或CAR-AdVST懸浮液。

將細胞維持在37°C、5% CO₂ 環境中。3-4天後，需要時添加細胞培養基，6-7天後，收集擴增的AdVSTs或CAR-AdVSTs細胞供用於實驗。範例9 ：溶瘤病毒、HDAd 、溶瘤病毒專一性T 細胞與CAR 表達性溶瘤病毒專一性T 細胞之組合，於活體內抗癌活性之分析

在鱗狀細胞頭頸癌FaDu細胞來源異種移植模型中，研究溶瘤病毒、HDAd、溶瘤病毒專一性T細胞與CAR表達性溶瘤病毒專一性T細胞之不同組合的活體內抗癌活性。

簡言之，將0.5x10⁶ 個經加工而表達螢火蟲螢光素酶之FaDu細胞，原位注射入NSG雄性小鼠中。6天後，於小鼠群之腫瘤中注射： (i) 1x10⁷ 個CAdtrio 病毒粒子，Onc5/3Ad2E1Δ24：HDAdIL-12_TK_PD-L1 之比為1：10；或 (ii) 1x10⁷ 個Onc5/3Ad2E1Δ24病毒粒子。 三天後，透過小鼠之尾靜脈注射： (a) 1x10⁶ 個AdVSTs，或 (b) 1x10⁶ 個抗HER2 CAR殖株F1轉導的AdVSTs (如範例8中所述的製備)。

在其等用於實驗之前，先利用流動式細胞測量術表徵AdVSTs及F1.CAR-AdVSTs，分析結果示於圖22A及22B及圖23A至23C中。

藉由如上所述的分析螢光素酶活性，監測癌症隨時間之變化，亦監控該小鼠之體重。

實驗結果示於圖24A至24D中。在以CAdtrio + HER2專一性CAR表達性AdVSTs之組合治療的小鼠中(即，治療群(i)(b))，觀察到最高位準的腫瘤控制及存活率。

現在將參考附圖來討論描述本揭示原理之實施例及研究。

圖1A 及1B ，圖1A顯示HER2專一性CAR建構體之例子的示意圖。圖1B顯示用於轉導T細胞以產生HER2專一性CAR-T之計劃例子的示意圖。

圖2 ，顯示通過流動式細胞測量術測定，在以指定HER2-CAR建構體轉導的T細胞上，HER2-CARs、CCR7、CD45RO及PD-1之表達圖表。

圖3 ，顯示通過流動式細胞測量術測定，在以抗HER2殖株E4 CAR建構體轉導後的CD4與CD8 T細胞上，HER2-CAR、CCR7、CD45RO、PD-1、LAG-3及TIM-3之表達圖表。

圖4A 及4B ，圖4A是顯示通過⁵¹ Cr釋出分析測定，抗HER2殖株C5、E4及F1 CAR-T細胞(或非轉導的(NT)細胞)在體外細胞殺傷MDA細胞(其不會在細胞表面表達HER2；陰性對照組)、MDA-HER2細胞(其會在細胞表面表達HER2；陽性對照組)、FaDu及SCC47細胞之長條圖。圖4B顯示通過流動式細胞測量術測定，指出HER2在MDA-HER2細胞、FaDu及SCC47細胞上表達，但不會在MDA細胞上表達之圖表。

圖5 ，顯示通過ffLuc活性分析測定，抗HER2殖株C5、E4及F1 CAR-T細胞(或非轉導的(NT)細胞)在體外細胞殺傷基因修飾以表達螢火蟲螢光素酶(ffLuc)之FaDu及SCC47細胞的圖表。數據表示為平均值±SD (n=4)。*P > 0.001。

圖6 。圖6顯示ICOSTAT溶瘤腺病毒建構體之範例序列的示意圖。

圖7A 至7F 。顯示通過MTS生存率分析測定，在以指示濃度的病毒粒子(Vp)感染後，ICOSTAT溶瘤腺病毒殺傷A549細胞(圖7A及7F)、FaDu細胞(圖7B)、SCC47細胞(圖7C)、WI-38細胞(圖7D)及ARPE-19細胞(圖7E)之能力圖表。輔助依賴型腺病毒(HDAd)包括作為對照條件。

圖8A 及8B 。顯示通過定量即時PCR之複本數分析測定，ICOSTAT溶瘤腺病毒複製及作為輔助依賴型腺病毒(HDAd)之複製的輔助者之能力長條圖。命名為“Onc5/3AdicoSTAT”之病毒為ICOSTAT。“+HD”指的是ICOSTAT與HDAd之共同感染。

圖9A 及9B 。顯示在細胞培養基中存在或缺少10ng/ml IFNγ之情況下，FaDu細胞(圖9A)及SCC47細胞(圖9B)中ICOSTAT溶瘤腺病毒之複製的圖表。

圖10A 至10D 。圖10A是HDAdIL-12_TK_PDL1 建構體之示意圖。圖10B是顯示以指定輔助依賴型腺病毒(HDAd)建構體轉染的細胞所產生的IL-12p70之長條圖。圖10C是顯示以HDAd建構體轉染的細胞所產生的抗PD-L1微體之西方墨點法照片。圖10D是顯示以HDAd構建體轉染的細胞所產生的HSV胸苷激酶之孔的照片。

圖11 。顯示PD-L1微體對重組人PD-L1結合性之ELISA分析圖表，其使用已經過編碼GFP之質體(pGFP；陰性對照組)、編碼Tanoueet al. 同上所述的抗PD-L1微體之質體(pPDL1 mini Tanoue)或編碼抗pPDL1微體(由HDAdIL-12_TK_PD-L1 編碼的)之質體(pPDL1 mini)轉染之A549細胞之連續稀釋細胞培養基。連續稀釋的抗人PD-L1抗體用作為陽性對照組(PDL1 IgG)。

圖12A 及12B 。Onc5/2E1Δ24溶瘤腺病毒建構體範例(圖12A)及編碼Onc5/2E1Δ24溶瘤腺病毒建構體之質體(圖12B)的序列示意圖。

圖13A 至13D 。顯示通過MTS生存率分析測定，在以指示濃度的病毒粒子(Vp)感染後，Onc5/3Ad2E1A溶瘤腺病毒殺傷FaDu細胞(圖13A)、SCC47細胞(圖13B)、WI-38細胞(圖13C)及ARPE-19細胞(圖13D)之能力圖表。輔助依賴型腺病毒(HDAd)包括作為對照條件。

圖14 ，顯示在以指定的CAR建構體轉導後，在指定的體外細胞培養天數後，HER2專一性CAR T細胞之數量圖表。

圖15A 至15C 。顯示過繼性轉移的螢光素酶表達性T細胞，在鱗狀細胞頭頸癌原位FaDu細胞來源模型中之活體內抗癌活性分析結果的影像與圖表。圖15A及15B顯示在輸注細胞後的指定天數時，小鼠內螢光素酶表達性非轉導T細胞(NT)及表達C5、F1或A3 HER2專一性CAR之螢光素酶表達性T細胞的數量及位置。圖15C顯示在輸注該細胞後的指定天數時，不同治療群中存活個體的百分比。亦顯示其中沒有投與T細胞之陰性對照組條件(-)。

圖16A 至16C 。顯示過繼性轉移的T細胞在NSG小鼠中之活體內分析結果的影像及圖表。圖16A顯示在輸注該細胞後的指定天數時，小鼠內螢光素酶表達性非轉導T細胞(NT)及表達C5、F1或A3 HER2專一性CAR之螢光素酶表達性T細胞的數量及位置。圖16B顯示在輸注該細胞後的指定天數時，不同群的小鼠之腹面總通量之測量值(光子/秒；p/s)。圖16C顯示在輸注該細胞後的指定天數時，不同治療群中小鼠的重量，以第0天之體量的百分比表示。

圖17A 至17C 。顯示利用流動式細胞測量術表徵在CAdtrio 與過繼性轉移的T細胞之組合的活體內抗癌活性分析實驗中所使用的F1 HER2專一性CAR T細胞之結果散點圖及直方圖。圖17A顯示F1.CAR-T群內CD4+ T細胞及CD8+ T之百分比。圖17B顯示細胞表面上表達HER2 CAR之細胞的百分比。圖17C顯示該F1.CAR-T群內表達CCR7和/或CD45RO之細胞的百分比。

圖18A 至18D 。顯示CAdtrio 與過繼性轉移的T細胞之組合，在鱗狀細胞頭頸癌原位FaDu細胞來源模型中之活體內抗癌活性分析結果的影像及圖表。圖18A顯示在輸注該細胞後的指定天數時，小鼠內螢光素酶表達性非轉導T細胞(NT)及表達F1 HER2專一性CAR之螢光素酶表達性T細胞的數量及位置。右上圖(Y軸標示為總通量)是“注射CAR T細胞後之天數”。底下2圖是“注射CAdtrio 後之天數。圖18B顯示投與CAdtrio 後的指定天數時，不同群的小鼠腹面的總通量之測量值(光子/秒；p/s)。圖18C顯示投與CAdtrio 後的指定天數時，不同治療群中小鼠的重量，以第0天之體重的百分比表示。圖18D顯示投與CAdtrio 後的指定天數時，不同治療群中存活個體之百分比。其中亦顯示沒有投與CAdtrio 或T細胞之陰性對照條件(-)。

圖19A 至19C 。顯示不同比率的Onc5/3Ad2E1Δ24：HDAdIL-12_TK_PD-L1 與過繼性轉移的HER2專一性CAR T細胞之組合，在鱗狀細胞頭頸癌原位FaDu細胞來源模型中之活體內抗癌活性分析結果的影像與圖表。圖19A顯示在投與CAdtrio 後的指定天數時，小鼠內螢光素酶表達性FaDu細胞的數量及位置。圖19B顯示在投與CAdtrio 後的指定天數時，不同群的小鼠腹面的總通量之測量值(光子/秒；p/s)。圖19C顯示在投與CAdtrio 後的指定天數時，不同治療群中小鼠的重量，以第0天之體重的百分比表示。

圖20A 至20D 。顯示Onc5/3Ad2E1Δ24及HDAdIL-12_TK_PD-L1 與更昔洛韋(GCV)之組合，在鱗狀細胞頭頸癌異位FaDu細胞來源模型中之活體內分析結果的長條圖及圖表。圖20A及20B顯示在感染後第22天，有或無GCV之處理下，在投與Onc5/3Ad2E1Δ24與HDAdIL-12_TK_PD-L1 (CAdtrio )之組合之小鼠腫瘤中Onc5/3Ad2E1Δ24 (圖20A)及HDAdIL-12_TK_PD-L1 (圖20B)之GAPDH正規化複本數。圖20C顯示在注射CAdtrio 後的指定天數時，有或無GCV之處理下，投與Onc5/3Ad2E1Δ24與HDAdIL-12_TK_PD-L1 (CAdtrio )之組合的小鼠之腫瘤體積(mm³ )。圖20D顯示利用ELISA 分析在注射CAdtrio 後的指定天數時，有或無GCV之處理下取得的血液樣本所測得的IL-12位準。

圖21A 至21C 。顯示以不同的HDAd病毒感染，培養在有或無更昔洛韋(GCV)中之癌細胞株的轉基因之表達分析結果的長條圖及影像。圖21A顯示通過ELISA測定的細胞培養上清液中IL-12的位準。圖21B顯示通過西方墨點法在細胞培養上清液中檢測到的抗PD-L1微體。圖21C顯示在實驗結束時，使用結晶紫染色檢測到的活細胞。

圖22A 及22B 。顯示通過流動式細胞測量術表徵範例9實驗中所使用的腺病毒專一性T細胞(AdVSTs)之結果散點圖。圖22A顯示AdVST群內CD4+ T細胞及CD8+ T細胞之百分比。圖22B顯示AdVST群內，表達CCR7和/或CD45RO之細胞的百分比。

圖23A 至23C 。顯示通過流動式細胞測量術表徵範例9實驗中所使用的F1.CAR轉導的AdVSTs之結果散點圖及直方圖。圖23A顯示該轉導群內CD4+ T細胞及CD8+ T細胞之百分比。圖23B顯示在細胞表面表達HER2 CAR之細胞的百分比。圖23C顯示該F1.CAR-AdVST群內，表達CCR7和/或CD45RO之細胞的百分比。

圖24A 至24D 。顯示腺病毒專一性T細胞(AdVSTs)、F1.CAR轉導的AdVSTs、F1.CAR轉導的AdVSTs與Onc5/3Ad2E1Δ24之組合、F1.CAR轉導的AdVSTs與Onc5/3Ad2E1Δ24 + HDAdIL-12_TK_PD-L1 (“CAdtrio ”)之組合，於活體內抗癌活性分析之結果的影像及圖表。圖24A顯示在投與CAdtrio 後的指定天數時，小鼠內螢光素酶表達性FaDu細胞的數量及位置。圖24B顯示在投與CAdtrio 後的指定天數時，不同群的小鼠的腹面總通量之測量值(光子/秒；p/s)。圖24C顯示在投與CAdtrio 後的指定天數時，不同治療群中小鼠的重量，以第0天之體量的百分比表示。圖24D顯示在投與CAdtrio 後的指定天數時，不同處理群中存活個體之百分比。

(無)

Claims (44)

1. 一種治療癌症之方法，其包含對一個體投與： (i)一溶瘤病毒；及 (ii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。
2. 一種用於治療癌症之方法之組合，其具有(i)一溶瘤病毒；及(ii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞。
3. 一種(i)一溶瘤病毒及(ii)至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的嵌合抗原受體(CAR)之細胞在製備一藥劑之用途，該藥劑係供用於治療癌症之方法中。
4. 如請求項1之方法、如請求項2之組合或如請求項3之用途，其中該包含CAR之細胞對該溶瘤病毒具專一性。
5. 一種治療癌症之方法，其包含對一個體投與： (i)一溶瘤病毒；及 (ii)至少一種對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。
6. 一種用於治療癌症之方法之組合，其具有(i)一溶瘤病毒，及(ii)至少一種對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。
7. 一種(i)一溶瘤病毒及(ii)至少一種對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞在製備一藥劑之用途，該藥劑係供用於治療癌症之方法中。
8. 如請求項1至7中任一項之方法、組合或用途，其中該溶瘤病毒是溶瘤腺病毒(OncAd)。
9. 如請求項1至8中任一項之方法、組合或用途，其中該溶瘤病毒源自腺病毒5 (Ad5)。
10. 如請求項1至9中任一項之方法、組合或用途，其中該溶瘤病毒編碼E1A蛋白，其相較於由Ad5編碼之E1A蛋白，表現出較少結合至Rb蛋白。
11. 如請求項1至10中任一項之方法、組合或用途，其中該溶瘤病毒編碼缺少胺基酸序列LTCHEACF (序列辨識編號52)之E1A蛋白。
12. 如請求項1至11中任一項之方法、組合或用途，其中該溶瘤病毒編碼包含下列或由下列構成之E1A蛋白：序列辨識編號34之胺基酸序列。
13. 如請求項1至12中任一項之方法、組合或用途，其中該溶瘤病毒包含具有一或多個供一或多個轉錄因子用之結合位點之核酸。
14. 如請求項1至13中任一項之方法、組合或用途，其中該溶瘤病毒包含具有一或多個供STAT1用之結合位點之核酸。
15. 如請求項1至4或8至14中任一項之方法、組合或用途，其中該至少一種包含對癌細胞抗原具專一性的CAR之細胞是一T細胞。
16. 如請求項1至4或8至15中任一項之方法、組合或用途，其中該CAR包含能夠專一性結合HER2之抗原結合域。
17. 如請求項1至4或8至16中任一項之方法、組合或用途，其中該CAR包含一抗原結合域，其包含： 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號10； LC-CRD2：序列辨識編號11； LC-CRD3：序列辨識編號12； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號13； HC-CRD2：序列辨識編號14； HC-CRD3：序列辨識編號15； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號18； LC-CRD2：序列辨識編號19； LC-CRD3：序列辨識編號20； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號21； HC-CRD2：序列辨識編號22； HC-CRD3：序列辨識編號23； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號26； LC-CRD2：序列辨識編號27； LC-CRD3：序列辨識編號28； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號29； HC-CRD2：序列辨識編號30； HC-CRD3：序列辨識編號31； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號57； LC-CRD2：序列辨識編號58； LC-CRD3：序列辨識編號59； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號60； HC-CRD2：序列辨識編號61； HC-CRD3：序列辨識編號62。
18. 如請求項1至4或8至17中任一項之方法、組合或用途，其中該CAR包含一抗原結合域，其包含： 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號16具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號17具有至少75%序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號24具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號25具有至少75%序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號32具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號33具有至少75%序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號63具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號64具有至少75%序列一致性之胺基酸序列。
19. 如請求項1至18中任一項之方法、組合或用途，其中該方法、組合或用途進一步包含一包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒。
20. 如請求項19之方法、組合或用途，其中該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒是一輔助依賴型腺病毒(helper-dependent adenovirus，HDAd)。
21. 如請求項19或20之方法、組合或用途，其中該免疫調節因子係選自：效應免疫反應(effector immune response)的促效劑或免疫調節反應的拮抗劑。
22. 如請求項19至21中任一項之方法、組合或用途，其中該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒包含編碼IL-12和/或拮抗性抗PD-L1抗體(antagonist anti-PD-L1 antibody)之核酸。
23. 如請求項19至22中任一項之方法、組合或用途，其中該包含編碼免疫調節因子之核酸的病毒包含編碼能夠將無毒性因子催化轉換成細胞毒性形式之酵素之核酸。
24. 如請求項23之方法、組合或用途，其中該酵素係選自：胸苷激酶、胞嘧啶去胺酶、硝基還原酶、細胞色素P450、羧肽酶G2、嘌呤核苷磷酸化酶、辣根過氧化酶及羧酸酯酶。
25. 如請求項1至24中任一項之方法、組合或用途，其中該治療癌症之方法包含： (a)從一個體單離出至少一種細胞； (b)修飾該至少一種細胞以表達或包含對癌細胞抗原具專一性的一CAR，或編碼對癌細胞抗原具專一性的CAR之一核酸， (c)可選擇地擴增該經修飾的至少一種細胞，及； (d)對一個體投與該經修飾的至少一種細胞。
26. 如請求項1至25中任一項之方法、組合或用途，其中該治療癌症之方法包含： (a)從一個體單離出免疫細胞； (b)利用包含下列之方法來產生或擴張對溶瘤病毒具專一性的免疫細胞群：刺激該免疫細胞，其係藉由在呈現該溶瘤病毒之胜肽的抗原呈現細胞(APCs)存在下來培養，及； (c)對一個體投與至少一種對該溶瘤病毒具專一性的免疫細胞。
27. 如請求項1至26中任一項之方法、組合或用途，其中該癌症係選自頭頸癌、鼻咽癌(NPC)、子宮頸癌(CC)、口咽癌(OPC)、胃癌(GC)、肝細胞癌(HCC)及肺癌。
28. 一種溶瘤腺病毒(OncAd)，其編碼包含下列或由下列構成之E1A蛋白：序列辨識編號34之胺基酸序列。
29. 一種溶瘤腺病毒(OncAd)，其包含具有一或多個供STAT1用之結合位點之核酸。
30. 一種溶瘤腺病毒(OncAd)，其包含與序列辨識編號51具有至少60%序列一致性之核酸序列或密碼子簡併(codon degeneracy)所導致之同等序列。
31. 一種溶瘤腺病毒(OncAd)，其包含與序列辨識編號55具有至少60%序列一致性之核酸序列或密碼子簡併所導致之同等序列。
32. 一種輔助依賴型腺病毒(HDAd)，其包含編碼IL-12和/或拮抗性抗PD-L1抗體之核酸。
33. 如請求項32之HDAd，其中該HDAd額外地包含編碼能夠將無毒性因子催化轉換成細胞毒性形式之酵素之核酸。
34. 如請求項32或請求項33之HDAd，其中該酵素係選自：胸苷激酶、胞嘧啶去胺酶、硝基還原酶、細胞色素P450、羧肽酶G2、嘌呤核苷磷酸化酶、辣根過氧化酶及羧酸酯酶。
35. 一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含一抗原結合域，其包含： 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號10； LC-CRD2：序列辨識編號11； LC-CRD3：序列辨識編號12； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號13； HC-CRD2：序列辨識編號14； HC-CRD3：序列辨識編號15； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號18； LC-CRD2：序列辨識編號19； LC-CRD3：序列辨識編號20； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號21； HC-CRD2：序列辨識編號22； HC-CRD3：序列辨識編號23； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號26； LC-CRD2：序列辨識編號27； LC-CRD3：序列辨識編號28； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號29； HC-CRD2：序列辨識編號30； HC-CRD3：序列辨識編號31； 或 一VL域，其包含： LC-CRD1：序列辨識編號57； LC-CRD2：序列辨識編號58； LC-CRD3：序列辨識編號59； 及一VH域，其包含： HC-CRD1：序列辨識編號60； HC-CRD2：序列辨識編號61； HC-CRD3：序列辨識編號62。
36. 如請求項35之CAR，其中該CAR包含一抗原結合域，其包含： 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號16具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號17具有至少75%序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號24具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號25具有至少75%序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號32具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號33具有至少75%序列一致性之胺基酸序列； 或 一VL，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號63具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及一VH，其包含下列或由下列構成：與序列辨識編號64具有至少75%序列一致性之胺基酸序列。
37. 一種可選擇地單離或人造的核酸或多個核酸，其編碼如請求項28至31中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如請求項32至24中任一項之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、或如請求項35或請求項36之嵌合抗原受體(CAR)。
38. 一種細胞，其包含如請求項28至31中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如請求項32至34中任一項之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、如請求項35或請求項36之嵌合抗原受體(CAR)、或如請求項37之核酸或多個核酸。
39. 一種藥學組成物，其包含如請求項28至31中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如請求項32至34中任一項之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、如請求項35或請求項36之嵌合抗原受體(CAR)、如請求項37之核酸或多個核酸、或如請求項38之細胞，及一藥學上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑。
40. 一種治療癌症之方法，其包含對一個體投與如請求項28至31中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如請求項32至34中任一項之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、如請求項35或請求項36之嵌合抗原受體(CAR)、如請求項37之核酸或多個核酸、如請求項38之細胞、或如請求項39之藥學組成物。
41. 如請求項28至31中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如請求項32至34中任一項之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、如請求項35或請求項36之嵌合抗原受體(CAR)、如請求項37之核酸或多個核酸、如請求項38之細胞、或如請求項39之藥學組成物，其係供用於治療癌症之方法中。
42. 一種如請求項28至31中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如請求項32至34中任一項之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、如請求項35或請求項36之嵌合抗原受體(CAR)、如請求項37之核酸或多個核酸、如請求項38之細胞、或如請求項39之藥學組成物在製備一藥劑之用途，該藥劑係供用於治療癌症。
43. 如請求項40之方法、如請求項41所供用之OncAd、HDAd、CAR、核酸或多個核酸、細胞或藥學組成物、或如請求項42之用途，其中該癌症係選自頭頸癌、鼻咽癌(NPC)、子宮頸癌(CC)、口咽癌(OPC)、胃癌(GC)、肝細胞癌(HCC)及肺癌。
44. 一種組件式套組，其包含一預定量的如請求項28至31中任一項之溶瘤腺病毒(OncAd)、如請求項32至34中任一項之輔助依賴型腺病毒(HDAd)、如請求項35或請求項36之嵌合抗原受體(CAR)、如請求項37之核酸或多個核酸、如請求項38之細胞、或如請求項39之藥學組成物。

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