CN112592388A

CN112592388A - 一种2a肽、双顺反子表达载体、重组蛋白表达***及应用

Info

Publication number: CN112592388A
Application number: CN202011476275.4A
Authority: CN
Inventors: 王天云; 林艳; 张俊河; 张继红; 樊振林; 米春柳; 杨献军
Original assignee: Henan Punuoyi Biological Product Research Institute Co ltd; Xinxiang Medical University
Current assignee: Henan Punuoyi Biological Product Research Institute Co ltd; Xinxiang Medical University
Priority date: 2020-12-14
Filing date: 2020-12-14
Publication date: 2021-04-02

Abstract

本发明涉及一种2A肽、双顺反子表达载体、重组蛋白表达***及应用。本发明提供了一种2A肽(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3)，提供了含有所述2A肽编码基因的双顺反子表达载体及其构建方法，并通过构建含有所述2A肽的重组蛋白表达***，将其应用于重组蛋白的表达，可以实现2个目的基因在哺乳动物细胞的高效表达。试验证明，在同等条件下，与其他2A肽比较，本发明提供的基于E2A和F2A的重组蛋白表达***能够显著提高哺乳动物细胞重组蛋白的稳定表达水平，可广泛应用于制备各种目的蛋白，特别是抗体的制备。为改善哺乳动物细胞表达***，进一步提高重组蛋白的表达量、增强细胞株的稳定性、降低生产成本奠定了基础。

Description

一种2A肽、双顺反子表达载体、重组蛋白表达***及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种2A肽、双顺反子表达载体、重组蛋白表达***及应用。

背景技术

重组蛋白是应用基因工程技术产生的蛋白质，近年来，重组蛋白已经成为生物制品的重要组成部分，在生物制药、临床诊断、科学研究中发挥着重要作用。重组蛋白的生产主要包括四大***：原核蛋白表达，酵母蛋白表达、昆虫细胞蛋白表达及哺乳动物细胞蛋白表达。哺乳动物细胞生产的重组蛋白质能够进行正确折叠、装配和翻译后修饰，具有与人源蛋白分子结构更为接近的优势，因此哺乳动物细胞已经成为蛋白药物的主要表达宿主。目前近80％批准上市的重组蛋白药物均来自于哺乳动物细胞，其中应用最广泛的是人胚胎肾细胞293(human embryonic kidney cells 293)细胞和中国仓鼠卵巢细胞(Chinesehamster ovary cells，CHO)。但与大肠杆菌等表达***相比，哺乳动物细胞的表达水平仍较低、获得高表达工程细胞株所需的时间长、细胞大规模培养的成本高等导致哺乳动物细胞生产蛋白质类药物的成本较高。这就需要改善哺乳动物细胞表达***，进一步提高重组蛋白的表达量、增强细胞株的稳定性、降低生产成本的同时确保产品的质量和安全。

目前，常用的表达载体主要有单顺反子载体、核糖体进入位点(internalribosome entry site,IRES，IRES)或2A肽介导的双顺反子载体或多顺反子载体。在生产抗体或多个蛋白时，如果使用单顺反子载体，由于抗体含有重链、轻链多个基因，载体需要多个表达框，造成载体片段过大，构建困难，另外由于不同表达框的表达的蛋白的不平衡，导致抗体产生聚体，影响抗体的质量，选择IRES或2A肽介导的双顺反子载体可以避免这一问题。和IRES相比，2A肽介导的二个基因表达量更高。2A肽是存在2个蛋白之间的寡肽，通常为18-22个氨基酸，当核糖体到达2A的C端最后两个氨基酸Gly-Pro时，由于核糖体酰胺中心内部结构的改变导致无法翻译下游基因，此时上游初生肽被水解释放出核糖体，然后核糖体再翻译下游基因，理论上可以实现两个基因的等量表达，因此2A肽更适合用于构建双顺反子载体，但目前报道的2A肽介导的双顺反子载体的目的基因表达水平较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种2A肽，该2A肽能用于提高哺乳动物细胞重组蛋白表达水平。

本发明的第二个目的在于提供上述2A肽介导的双顺反子表达载体。

本发明的第三个目的在于提供上述2A肽、重组表达载体的应用。

本发明的第四个目的在于提供一种重组蛋白表达***，包含上述表达载体，能够提高哺乳动物细胞目的蛋白表达水平。

本发明的第五个目的在于提供上述重组蛋白表达***的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种2A肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的，所述2A肽编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明第二方面提供包含上述2A肽编码基因的双顺反子表达载体。

优选的，所述双顺反子表达载体的出发载体为pIRES-neo、pIRES-neo2、pIRES-neo3、pRC/CMV、pEE6.4、pEE12.4、pEGFP-C1、pcDNA 3.1中的任意一种。

优选的，所述双顺反子表达载体的启动子为CMV、SV40、PGK、EF1α中的任意一种。

所述双顺反子表达载体可以通过本领域常规方法将SEQ ID NO:2所示基因序列***出发载体的多克隆位点构建获得。具体的，人工合成如SEQ ID NO:2所示的2A肽基因序列，用克隆技术将2A肽序列连接至出发载体，通过序列鉴定筛选，获得重组表达载体。

本发明第三方面提供上述2A肽、双顺反子表达载体在提高重组蛋白表达水平方面的应用。优选的，所述重组蛋白通过哺乳动物重组蛋白表达***制备而成。

本发明第四方面提供一种重组蛋白表达***，由上述双顺反子表达载体转染宿主细胞构建而成。

优选的，所述宿主细胞为CHO、HEK293、BHK或C127中的任意一种；进一步优选的，所述宿主细胞为CHO。

上述重组蛋白表达***可以采用任何已知的方法构建而成，通过将目的基因克隆到上述2A肽介导的双顺反子表达载体，转染宿主细胞构建而成。其中，目的基因来自人及其他哺乳动物、植物、昆虫或微生物。

本发明第五方面提供上述重组蛋白表达***在在制备目的蛋白方面的应用。

本发明取得的有益效果：

本发明提供了一种2A肽(氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示)，提供了含有所述2A肽编码基因的双顺反子表达载体及其构建方法，并通过构建含有所述2A肽的重组蛋白表达***，将其应用于重组蛋白的表达，可以实现2个目的基因在哺乳动物细胞的高效表达。试验证明，在同等条件下，与其他2A肽进行比较，本发明提供的基于E2A和F2A的重组蛋白表达***能够显著提高哺乳动物细胞重组蛋白的稳定表达水平，可广泛应用于制备各种含目的蛋白的药物制剂、诊断试剂，特别是抗体的制备。为改善哺乳动物细胞表达***，进一步提高重组蛋白的表达量、增强细胞株的稳定性、降低生产成本奠定了基础。

附图说明

图1为本发明2A肽介导的载体EGFP基因与RLuc瞬时表达水平；

图中，(A)转染48h后荧光图片；(B)eGFP转染效率；(C)RLuc瞬时表达水平。

图2为本发明2A肽介导的载体EGFP基因与RLuc稳定表达水平；

图中，(A)20代稳定细胞株eGFP荧光图；(B,C)20代稳定细胞株eGFP表达水平；(D)RLuc稳定表达水平。

图3为本发明2A肽介导的载体在CHO细胞阿达木抗体瞬时表达水平；

图4为本发明2A肽介导的载体在HEK293细胞阿达木抗体瞬时表达水平；

图5为本发明2A肽介导的载体在CHO细胞阿达木抗体稳定表达水平；

图6为本发明2A肽介导的载体在HEK293细胞阿达木抗体稳定表达水平。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；实施例及试验例中所用的各类培养基、试剂、大肠杆菌(E.coli JM109)pIRES-Neo质粒、细胞系试剂、工具酶等均为市售商品。pIRES-neo、pIRES-neo2、pIRES-neo3、pRC/CMV、pEE6.4、pEE12.4、pEGFP-C1、pcDNA3.1、pCHO1.0质粒等均为市售商品。未特别指明的，实施例及试验例中相关操作均为领域内常规技术手段，比如参照Sambrook等编著的分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW.Molecular cloning:a laboratory manual.2001)，或者产品制造厂商提供的说明书等。

实施例1 2A肽基因的合成

该实施例提供了2A肽的基因序列。

根据SEQ ID NO.1所示的***病毒(Foot-and-mouth disease virus，F2A)氨基酸序列，以及如SEQ ID NO.3所示的马鼻炎A病毒(equine rhinitis A virus,E2A)、如SEQID NO.5所示的点褐翅蛾病毒(Thosea asigna virus,T2A)和如SEQ ID NO.7所示的猪特斯琴病毒(porcine teschovirus,P2A)氨基酸序列；根据CHO细胞密码子偏爱性，设计2A肽基因序列，如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8所示。

实施例2含2A肽基因重组表达载体的构建

该实施例提供包含2A肽编码基因的重组表达载体的构建方法，包括如下步骤：

人工合成SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8，为实现定向克隆，在合成序列的5′端、3′端分别引入StuI(AGGCCT)、AgeI(ACCGGT)酶切位点。

用AgeI/StuI分别双酶切合成的2A序列，同时用AgeI/StuI双酶切pIRES-Neo质粒DNA载体。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的2A序列片段和pIRES-Neo线形质粒DNA。

2A序列的双酶切体系为：2A序列10μL(1μg/μL)，10×CutSmart Buffer 3.0μL，AgeI/StuI(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL；酶切条件为：37℃，酶切3h。

pIRES-Neo质粒的双酶切体系为：pIRES-Neo质粒5μL(1μg/μL)，10×CutSmartBuffer2.0μL，AgeI/StuI(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3h。

取酶切后的2A序列片段和pIRES-Neo线形质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司^TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到大肠杆菌(E.coli)JM109菌株感受态细胞悬液中转化，取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养。提取重组质粒并进行双酶切(AgeI/StuI)验证，取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒分别命名为pIRES-F2A、pIRES-E2A、pIRES-T2A、pIRES-P2A。

实施例3 EGFP重组表达载体的构建

本实施例提供含有重组表达载体的工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1)PCR扩增EGFP基因

参照pEGFP-C1载体的Enhanced green fluorescent protein(EGFP)基因序列(GenBank：U55763.1，第613～1332位碱基)设计引物P1和P2(用于扩增720bp的EGFP基因DNA)，引物的5′端分别引入EcoRV、NheI酶切位点，引物序列如下所示(下划线处为酶切位点)：

P1：5′-CCGGATATCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′；

P2：5′-CTAACCGGTGGACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′。

以pEGFP-C1质粒(购自美国Clontech公司)为模板，使用引物P1、P2扩增EGFP基因，反应体系见下表1。

表1 PCR扩增体系

反应程序：95℃3min，94℃40s，56～60℃30s，72℃40s，每个退火温度4个循环，最后55℃1min，30个循环，72℃3min。

琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，纯化后送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank公开的EGFP序列完全一致。

2)构建含EGFP序列的表达载体

用EcoRV、NheI双酶切EGFP的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用EcoRV、NheI双酶切pIRES-F2A、pIRES-E2A、pIRES-T2A、pIRES-P2A。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的EGFP序列片段和pIRES-F2A、pIRES-E2A、pIRES-T2A、pIRES-P2A线性质粒DNA。

EGFP序列的酶切体系为：1μL 10×NEB Buffer 2.1，10U/μL EcoRV、NheI酶各0.5μL，1.3μg/μL EGFP扩增产物0.78μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。

质粒的酶切体系为：1μL 10×NEB Buffer 2.1，10U/μL EcoRV、NheI酶各0.5μL，1.0μL质粒pIRES-F2A、pIRES-E2A、pIRES-T2A、pIRES-P2A(1.0μg/μL)，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。

取酶切后的EGFP序列片段和pIRES-F2A、pIRES-E2A、pIRES-T2A、pIRES-P2A线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-F2A、pIRES-E2A、pIRES-T2A、pIRES-P2A线性质粒DNA 200ng，酶切后的EGFP序列片段87.2ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜。将连接产物加入E.coli JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES-EGFP-F2A、pIRES-EGFP-E2A、pIRES-EGFP-T2A、pIRES-EGFP-P2A。

实施例4含EGFP及RLuc双顺反子表达载体构建

根据海肾荧光素酶基因(RLuc)序列、如SEQ ID NO.9所示，人工合成RLuc基因，为实现定向克隆，在合成序列的5′端、3′端分别引入EcoRI(GAATTC)、BamHI(GGATCC)酶切位点。克隆到pIRES-EGFP-F2A、pIRES-EGFP-E2A、pIRES-EGFP-T2A、pIRES-EGFP-P2A载体上。

用EcoRI/BamHI分别双酶切合成的RLuc基因序列，同时用EcoRI/BamHI双酶切pIRES-EGFP-F2A、pIRES-EGFP-E2A、pIRES-EGFP-T2A、pIRES-EGFP-P2A质粒DNA载体。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的RLuc基因序列片段和线形质粒DNA。

RLuc基因序列的双酶切体系为：RLuc基因序列10μL(1μg/μL)，10×NEBuffer 2.12.0μL，EcoRI/BamHI(10U/μL)各1.0μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3h。

质粒双酶切体系为：质粒5μL(1μg/μL)，10×NEBuffer 2.1 2.0μL，EcoRI/BamHI(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3h。

取酶切后的RLuc基因序列片段和线形质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司^TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到大肠杆菌(E.coli)JM109菌株感受态细胞悬液中转化，取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养。提取重组质粒并进行双酶切(EcoRI/BamHI)验证，取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒分别命名为pIRES-EGFP-F2A-RLuc、pIRES-EGFP-E2A-RLuc、pIRES-EGFP-T2A-RLuc、pIRES-EGFP-P2A-RLuc。

实施例5重组抗体表达载体的构建

根据阿达木抗体序列，如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示，人工合成阿达木抗体重链和轻链，采用无缝克隆技术分别替换pIRES-EGFP-F2A-RLuc、pIRES-EGFP-E2A-RLuc、pIRES-EGFP-T2A-RLuc、pIRES-EGFP-P2A-RLuc的RLuc和EGFP序列，构建的载体分别命名为pIRES-LC-F2A-HC、pIRES-LC-E2A-HC、pIRES-LC-T2A-HC、pIRES-LC-P2A-HC。具体由通用生物基因(安徽)有限公司完成。

本发明实施例1提供的2A肽能够应用于哺乳动物重组蛋白的表达，提高重组蛋白的表达量水平，具体的应用方式包括将含有2A肽序列的表达载体，转染至哺乳动物宿主细胞，例如CHO细胞、HEK293细胞等，获得外源目的基因重组蛋白表达***，培养细胞，即可得到外源目的基因蛋白。下面分别以试验例1～4验证本发明2A肽对哺乳动物重组蛋白表达***的目的基因表达量水平的影响。

试验例1 eGFP、RLuc瞬时表达结果

为了观察报告基因eGFP和RLuc的瞬时表达效率，对瞬时转染的细胞进行了分析。用含10％胎牛血清的完全培养基培养CHO细胞，待细胞处于对数生长期时，收集细胞以15万/ml接种到24孔板。次日细胞快长满时用1μl脂质体转染试剂

转染含有P2A、T2A、E2A、F2A的载体1μg。每种载体转染3个复孔，设置空白对照。将上述细胞放置于培养箱培养48h后置于倒置荧光显微镜下观察eGFP的瞬时转染情况(图1A和B)，用海肾荧光素酶检测试剂盒根据说明书进行裂解细胞后用化学发光仪检测RLuc的瞬时表达(图1C)。实验结果显示，eGFP转染效率E2A(87％)、F2A(91％)高于P2A(83％)、T2A(75％)并且E2A、F2A的RLuc的瞬时表达均高于P2A、T2A。

试验例2 eGFP、RLuc细胞稳定表达水平分析

转染过载体的CHO细胞用含有杀稻瘟菌素(15μg/ml)的DMEM/F12培养基进行加压筛选。待未转染的对照细胞用杀稻瘟菌素完全杀死后，实验组存活的细胞为稳定转染的细胞株，降低培养基杀稻瘟菌素浓度为10μg/ml进行传代扩大培养，培养到20代。用流式细胞仪和化学发光仪分别检测eGFP平均荧光强度(MFI)和RLuc的稳定表达量。

结果如图2所示。转染含有E2A载体的细胞eGFP和RLuc表达量最高，其次是含有F2A、P2A、T2A的载体。E2A和F2A的eGFP、RLuc稳定表达水平高于P2A和T2A。

试验例3阿达木抗体瞬时表达结果

1. 2A肽介导的载体在CHO细胞阿达木抗体瞬时表达水平

按照上述试验例1进行pIRES-LC-F2A-HC、pIRES-LC-E2A-HC、pIRES-LC-T2A-HC、pIRES-LC-P2A-HC转染进入CHO细胞，进行瞬时表达实验，每天细胞计数，培养至第七天收集细胞上清，ELISA检测各组阿达木抗体的表达量，试验结果见图3。

由图3可知，转染pIRES-LC-F2A-HC、pIRES-LC-E2A-HC、pIRES-LC-T2A-HC、pIRES-LC-P2A-HC的CHO细胞阿达木抗体产量分别为66.23mg/L、89.88mg/L、31.88mg/L、46.06mg/L，和试验例1一致，E2A表达量最高，其次是F2A。

2. 2A肽介导的载体在HEK293细胞阿达木抗体瞬时表达水平

按照上述试验例1进行pIRES-LC-F2A-HC、pIRES-LC-E2A-HC、pIRES-LC-T2A-HC、pIRES-LC-P2A-HC转染进入HEK293细胞，进行瞬时表达实验，每天细胞计数，培养至第七天收集细胞上清，ELISA检测各组阿达木抗体的表达量，试验结果见图4。

由图4可知，转染pIRES-LC-F2A-HC、pIRES-LC-E2A-HC、pIRES-LC-T2A-HC、pIRES-LC-P2A-HC的HEK293细胞阿达木抗体产量分别为64.15mg/L、109.56mg/L、41.09mg/L、36.78mg/L，和试验例1一致，E2A表达量最高，其次是F2A。

试验例4阿达木抗体稳定表达结果

1. 2A肽介导的载体在CHO细胞阿达木抗体稳定表达水平

用含浓度为800μg/mL G418的培养基培养细胞，正常CHO细胞(未转染细胞)全部死亡时，换用含500μg/mL G418培养基维持多克隆细胞生长，两周后得到稳定转染的多克隆CHO细胞株。将稳定转染阿达木的多克隆细胞株转入125mL悬浮培养瓶中，初始细胞量为5～6×10⁶个/mL，加入30ml无血清培养基，120rpm悬浮培养。每天细胞计数，并收集细胞上清，用ELISA检测试剂盒测定各组阿达木抗体的表达量，试验结果见图5。

由图5可知，转染pIRES-LC-F2A-HC、pIRES-LC-E2A-HC、pIRES-LC-T2A-HC、pIRES-LC-P2A-HC的CHO细胞阿达木抗体产量分别为177.60mg/L，259.35mg/L、89.52mg/L、105.82mg/L，和试验例2一致，E2A表达量最高，其次是F2A。

2. 2A肽介导的载体在HEK293细胞阿达木抗体稳定表达水平

用含浓度为600μg/mL G418的培养基培养细胞，正常HEK293细胞(未转染细胞)全部死亡时，换用含400μg/mL G418培养基维持多克隆细胞生长，两周后得到稳定转染的多克隆HEK293细胞株。将稳定转染阿达木的多克隆细胞株转入125mL悬浮培养瓶中，加入30ml无血清培养基，120rpm悬浮培养。每天细胞计数，并收集细胞上清，用ELISA检测试剂盒测定各组阿达木抗体的表达量，试验结果见图6。

由图6可知，转染pIRES-LC-F2A-HC、pIRES-LC-E2A-HC、pIRES-LC-T2A-HC、pIRES-LC-P2A-HC的HEK293细胞阿达木抗体产量分别为164.15mg/L，209.56mg/L、76.61mg/L、105.36mg/L，和试验例2一致，E2A表达量最高，其次是F2A。综上所述，实施例1提供了四种2A肽(F2A、E2A、T2A、P2A)，实施例2提供了含有2A肽基因的重组表达载体的构建方法，实施例3-4分别构建了基于F2A、E2A、T2A、P2A的EGFP及Rluc双顺反子表达载体；并通过试验例1-2证明，E2A和F2A能够促进EGFP、Rluc在哺乳动物细胞中稳定的高水平表达，显著提高其表达水平；实施例5分别构建了基于F2A、E2A、T2A、P2A的阿达木抗体重组蛋白表达***，并通过试验例3-4证明，E2A和F2A能够促进阿达木抗体在哺乳动物细胞中稳定高水平表达，显著提高抗体表达量。由此可知，在哺乳动物细胞中，并非任意2A肽均可提高重组蛋白表达水平，本发明通过试验验证了E2A和F2A的功能，为改善哺乳动物细胞表达***，进一步提高重组蛋白的表达量、增强细胞株的稳定性、降低生产成本奠定了基础。

<110> 新乡医学院

<120> 一种2A肽、双顺反子表达载体、重组蛋白表达***及应用

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> ***病毒（Foot-and-mouth disease virus）

<221> F2A

<400> 1

Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala

1 5 10 15

Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 2

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> F2A

<400> 2

ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60

tccaaccctg gacct 75

<210> 3

<211> 22

<212> PRT

<213> 马鼻炎A病毒（Equine rhinitis A virus）

<221> E2A

<400> 3

Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp

1 5 10 15

Val Glu Ala Thr Leu Asp

20

<210> 4

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> E2A

<400> 4

ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgaagcaacc 60

ctggacct 68

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 点褐翅蛾病毒（Thosea asigna virus）

<221> T2A

<400> 3

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 6

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> T2A

<400> 6

ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctgga 60

cct 63

<210> 7

<211> 22

<212> PRT

<213> 猪特斯琴病毒（Porcine teschovirus）

<221> P2A

<400> 7

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 8

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> P2A

<400> 8

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物P1

<400> 9

ccggatatca tggtgagcaa gggcgaggag 30

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物P2

<400> 10

ctaaccggtg gacttgtaca gctcgtccat gc 32

<210> 11

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Rluc基因

<400> 11

atgacttcga aagtttatga tccagaacaa aggaaacgga tgataactgg tccgcagtgg 60

tgggccagat gtaaacaaat gaatgttctt gattcattta ttaattatta tgattcagaa 120

aaacatgcag aaaatgctgt tattttttta catggtaacg cggcctcttc ttatttatgg 180

cgacatgttg tgccacatat tgagccagta gcgcggtgta ttataccaga ccttattggt 240

atgggcaaat caggcaaatc tggtaatggt tcttataggt tacttgatca ttacaaatat 300

cttactgcat ggtttgaact tcttaattta ccaaagaaga tcatttttgt cggccatgat 360

tggggtgctg tttggcattt cattatagct atgagcatca agataagatc aaagcaatag 420

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gtaaaaggtc ttcatttttc gcaagaagat gcacctgatg aaatgggaaa atatatcaaa 900

tcgttcgttg agcgagttct caaaaatgaa caataa 936

Claims

1.一种2A肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的2A肽，其特征在于，所述2A肽的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO：2或SEQ ID NO:4所示。

3.一种双顺反子表达载体，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的2A肽的编码基因。

4.如权利要求1或2所述的2A肽、如权利要求3所述的双顺反子表达载体在提高重组蛋白表达水平方面的应用，其特征在于，所述重组蛋白通过哺乳动物重组蛋白表达***制备而成。

5.构建如权利要求3所述的双顺反子表达载体的方法，其特征在于，包括将SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示基因序列***出发载体的多克隆位点，获得重组表达载体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述出发载体为pIRES-neo、pIRES-neo2、pIRES-neo3、pRC/CMV、pEE6.4、pEE12.4、pEGFP-C1、pcDNA 3.1中的任意一种。

7.一种重组蛋白表达***，其特征在于，通过将目的基因克隆到如权利要求3所述的双顺反子表达载体，转染宿主细胞构建而成。

8.根据权利要求7所述的重组蛋白表达***，其特征在于，所述目的基因来自人、其他哺乳动物、植物、昆虫或微生物。

9.根据权利要求8所述的重组蛋白表达***，其特征在于，所述宿主细胞为CHO、HEK293、BHK或C127中的任意一种。

10.如权利要求7-9任一项所述的重组蛋白表达***在制备目的蛋白方面的应用。