KR100723009B1 - 인간 ｐ３１ 유전자를 함유하는 악성 종양 치료용 약학적조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 3 또는 4로 표시되는 단백질을 코딩하는 인간 p31^comet 유전자를 유효성분으로 함유하는 악성 종양 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 본 발명의 p31^comet를 고형악성 종양 세포에 발현시켜 세포 성장 억제 및 세포자살 효과를 향상시켜, 별다른 부작용 없이 고형악성 종양을 효과적으로 사멸시킬 수 있으며, 다양한 종류의 암세포를 죽이므로, 암 환자의 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

p31 유전자, 악성 종양, 약학적 조성물, 마이크로 어레이, 진단 키트

Description

인간 ｐ３１ 유전자를 함유하는 악성 종양 치료용 약학적 조성물{A pharmaceutical composition for treating malignant tumors containing human p31 genes}

도 1은 재조합 아데노바이러스 벡터인 pAdeno-CMV/p31^comet-IRES/GFP의 개열 지도를 보여준다.

도 2는 시간에 따른 pAdeno-CMV/p31^comet-IRES/GFP 벡터의 발현양을 웨스턴 블롯을 이용하여 측정한 것이다.

도 3은 재조합 레트로바이러스 벡터인 Retro-IRES/p31^comet 의 개열 지도를 보여준다.

도 4는 시간에 따른 Retro-IRES/p31^comet 벡터의 발현양을 웨스턴 블롯을 이용하여 측정한 것이다.

도 5는 A549와 Calu-1의 p31^comet 에 의한 성장 억제를 분석한 것이다. a: p31^comet 와 대조군의 세포 모양 비교, b: p31^comet 와 대조군에 의해 감염된 세포의 증식 분석, c: p31^comet 와 대조군을 감염시킨 후 세포의 콜로니 형성을 분석한 것.

도 6은 폐암, 자궁경부암, 간암, 뼈암, 신장암, 유방암에서 기원한 다양한 고형암세포주에 p31^comet 을 과발현시켰을 경우 성장에 관한 분석을 한 것이다.

도 7은 A549에 p31^comet 과 대조군을 감염시켜 노화 현상을 관찰한 것이다. a: A549에 p31^comet 과 대조군을 감염시켜 SA-β-gal 검사를 한 것, b: 이를 유세포분석기에 의해 분석한 결과.

도 8은 A549, U-2OS, HeLa, HepG2에 p31^comet 과 대조군을 감염시켜 세포사를 MTT 분석을 통해 측정한 것이다.

본 발명은 p31^comet을 다양한 악성 종양 세포에 발현시켜 암을 치료하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 서열번호 3 또는 4로 표시되는 단백질을 코딩하는 인간 p31^comet 유전자를 유효성분으로 함유하는 악성 종양 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. p31^comet 유전자를 포함하는 아데노바이러스 혹은 레트로바이러스를 악성 종양 세포에 감염시켜 p31^comet 단백질을 발현시킴으로써 암세포의 괴사 및 성장 억제를 통해 암을 치료할 수 있다.

일반적으로, 암은 자발적으로 계속해서 증식하는 세포의 덩어리를 말하며, 개체의 죽음을 이끄는 악성 종양과 그렇지 않은 양성 종양으로 구분된다. 그러나, 이들을 정확하게 분류하는 것은 간혹 어려울 수도 있다. 대부분의 암은 암 촉발 유전자나 암 억제 유전자 등에서 변이가 세포 내에서 일어나는 경우 발생된다. 암 촉발 단백질의 경우 세포의 증식이 분화, 세포 주기에 관여하는 신호 전달 체계 및 세포간 신호 전달을 조절한다. 이러한 그들의 조절이 비정상적으로 바뀌었을 때, 세포는 더 분화하지 못하고 오히려 무제한 증식을 하게 되는데 이러한 현상을 발암화라고 한다. 만약 이러한 암 촉발 단백질의 비정상적인 관여를 정상적인 상태로 바꿀 수 있는 방법을 발견할 수 있다면 비특이적 영향이 없는 가장 효과적인 항암제로서 사용될 수 있을 것이다.

현재, 암은 외과적 절제, 화학적 요법, 방사선 요법 등 세 종류의 방법으로 치료되고 있다. 실질적으로는 이들 세 가지 치료 방법 또는 이들과 더불어 레이저 수술 등과 같이 복합적으로 이용되고 있다. 그러나 화학적 요법은 고통이 수반되는 치료나 전이가 의심되는 상황일 때 다른 치료 요법보다 우선적으로 사용되고 있다. 많은 항암제가 개발되어 왔고 이들의 대부분은 왕성하게 분열하는 세포를 선택적으로 죽이는데 초점을 두고 있다. 그러나 이러한 항암제들은 면역세포나 모낭세포 등과 같은 정상 세포 또한 죽이는 부작용 때문에 장기간 지속적으로 사용할 수가 없다.

대부분의 항암제는 세포 내 유전자의 본체인 핵산의 합성을 억제하거나 핵산에 직접 결합하여 세포의 물질대사를 방해함으로써 암세포를 파괴한다. 일반적으로 항암제는 암세포만을 선택적으로 공격하지 못하고 살아있는 모든 정상세포, 특히 머리카락, 골수의 조혈 세포, 위장관 점막세포 등 세포분열이 활발한 정상세포에 치명적인 손상을 입혀, 탈모, 빈혈, 백혈구 감소, 혈소판 감소, 위장점막손상 등 부작용이 나타난다. 그러나 기존의 항암제가 갖고 있는 문제는 이러한 부작용뿐만 아니라 암이 전이되었을 경우 광범위하게 잔류하는 다른 조직의 암에 다 효과가 있지 않다는 것이다.

일반적으로, 항암제는 세포독성 항암제와 호르몬성 항암제로 구분한다. 각각의 대표적인 약물은 세포독성 항암제로서 알트레타민(Altretamine), 부술판(Busulfan)이 있고, 호르몬성 항암제로서 타목시판(Tamoxipan), 토레미펜(Toremifene)이 있다. 세포독성 항암제는 반응성이 높은 양전하를 띄는 물질로 변환하여 전자이온이 풍부한 핵산, 단백질, 아미노산과 공유결합하여 DNA, RNA 합성을 억제하고, 호르몬성 항암제는 에스트로겐 수용체와 결합하여 에스트로겐에 의존적으로 성장하는 유방암 세포의 증식을 억제한다.

유전자 치료(gene therapy)는 유전자 이상에 의하여 유발되는 각종 유전병과 암 등을 치료하기 위하여, 질병과 관련이 있는 유전자를 환자의 체내에 직접적으로 주입하고 상기 유전자를 세포 내에서 발현시켜 그의 기능을 정상화시키는 방법이다. 이러한 유전자 치료는 특정 유전자를 체내에 주입하여 신체 내에 새로운 기능을 부여할 수 있으므로 치료 이외에 각종 질병을 예방하거나 치료 효과를 강화하는데도 널리 이용될 수 있다.

유전자 치료로 질병을 치료하는데 있어서 가장 중요한 요건은 주입된 유전자가 성공적으로 목표 세포의 핵에 전달되어 이로부터 유전자가 다량으로 발현되는 것이다. 이때 사용된 유전자는 목표 세포에 도달하여 엔도사이토시스(endocytosis)라는 과정을 거쳐 세포 내부로 들어간 다음 핵 내로 전달되어 발현된다. DNA 자체로 이루어진 유전자는 세포를 통과하는 효율이 극히 떨어지므로 리포좀(liposome)과 같은 운반체를 사용하여 유전자를 주입할 수도 있는데 이 경우에도 핵으로 전달되는 과정에 리포좀이 대부분 파괴되어 그 효율이 떨어진다.

하지만 인체에 감염성이 있는 바이러스를 이용하면 세포 내에 외래 유전자를 효과적으로 주입할 수 있으므로 바이러스를 유전자 치료에 응용하는 것이 매우 바람직하다. 구체적으로, 치료에 사용될 수 있는 유전자를 유전자 재조합 방법으로 바이러스 DNA에 삽입하고 이를 자신의 게놈으로 하는 바이러스를 생체 외에서 대량 생산하여 인체에 직접적으로 감염시킴으로써 세포 내에 효율적으로 원하는 유전자를 전달하여 발현시킬 수 있다. 특히, 아데노바이러스는 세포의 핵 내에 그의 유전자를 전달하는 특별한 기전을 가지고 있어 다른 바이러스보다 그의 DNA를 핵 내에 전달하는 효율이 높으므로 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 전세계적으로 허가를 받은 유전자 요법 중 임상 시험의 50% 이상에서 레트로바이러스가 이용되고 있다(Wiley-The Journal of Gene Medicine Website: http://www.wiley.co.uk/genetherapy). 레트로바이러스의 경우는 세포의 염색체에 삽입되어 장기간 원하는 단백질의 발현을 가능하게 하기 때문에 효과적이라 할 수 있다.

종양세포 특징 중의 하나가 염색체의 구조 불안정성에 기인한 홀배수체(aneuploid) 또는 네배수체(tetraploid) 형성과 같은 염색체 이상 또는 다핵화 현 상이며, 이와 같은 현상은 세포분열 과정 중 중요한 단계인 방추사 체크포인트의 조절 능력이 상실될 경우 DNA의 합성이 endoreduplication 등의 과정에 의하여 발생되는 것으로 알려지고 있다 (Jallepalli PV and Lengauer C. (2001). Nat. Rev. Cancer, 1, 109-117). Mad2는 방추사가 동원체에 모두 정상적으로 붙을 때까지 지연시키는 역할을 하는 중요한 단백질이다 (Hardwick KG, Johnston RC, Smith DL, Murray AW. J Cell Biol. 2000 Mar 6;148(5):871-82). 최근 논문에서 Mad2의 일부분만 기능상실이 됐을 때는 세포의 다핵화를 촉진시켜 암을 발생시키지만 (Dobles M, Liberal V, Scott ML, Benezra R and Sorger PK. 2000. Cell, 101, 635-645), siRNA를 이용한 세포내 Mad2 단백질의 완벽한 제거는 암세포주에서 죽음을 유도하는 신호를 일으킨다는 내용이 보고 되었다(Michel L, Diaz-Rodriguez E, Narayan G, Hernando E, Murty VV, Benezra R. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 1001:4459-64; Kops GJ, Foltz DR, Cleveland DW., Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Jun 8;101:8699-704). p31^comet는 중기(metaphase) 동안 유사분열 체크포인트가 활성화되어 APC/C^Cdc20에 결합한 Mad2와 직접 상호작용을 통해 그 기능을 조절하는 단백질이다( Habu T, Kim SH, Weinstein J and Matsumoto T. 2002. EMBO J., 21; 6419-6428). p31^comet의 또 다른 기능은 Mad2에 의해 억제되어 있는 APC/C의 활성을 촉진시켜 준다는 것이다. 이러한 점은 p31^comet이 Mad2의 기능에 반하는 역할을 담당한다는 것을 보여주고 있다(Xia G, Luo X, Habu T, Rizo J, Matsumoto T, Yu H., EMBO J. 2004 Aug 4;23(15):3133-43).

이에 본 발명자들은 p31^comet을 암세포 내에 과발현하면 Mad2의 기능을 완벽히 저해시켜 세포를 죽일 수 있다는 생각을 바탕으로 실험을 수행하였다. p31^comet를 암세포 내에 효과적으로 발현시키기 위하여 아데노바이러스 및 레트로바이러스 벡터에 p31^comet 유전자를 도입하였으며 p31^comet이 포함된 각각의 바이러스를 생산하였다. 이렇게 생산된 바이러스를 다양한 암세포에 감염시켜 p31^comet의 발현을 모두 확인하였다. 발현된 암세포와 그렇지 않은 암세포를 구분하기 위하여 p31^comet이 발현되는 세포는 동시에 형광 단백질이 발현되도록 고안하였다. p31^comet가 포함된 레트로바이러스 혹은 아데노바이러스가 감염된 세포에서는 일정 시간이 지난 후 형광을 띤 세포가 모두 죽거나 성장이 멈춰 있는 것을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 서열번호 3 또는 4로 표시되는 단백질을 코딩하는 인간 p31^comet 유전자를 유효성분으로 함유하는 악성 종양 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 p31^comet 를 발현하는 재조합 바이러스 벡터 pAdeno- CMV/p31^comet-IRES/GFP 또는 Retro-IRES/p31^comet 및 상기 벡터로 형질전환된 미생물에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 재조합 바이러스 벡터를 포유동물 세포에 감염시킨 후 이를 배양함으로써 재조합 p31^comet 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 재조합 바이러스 벡터를 유효성분으로 함유하는 악성 종양 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 p31^comet 유전자로부터 전사된 p31^comet RNA를 유효성분으로 함유하는 악성 종양 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 서열번호 3 또는 4로 표시되는 단백질을 유효성분으로 함유하는 악성 종양 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 재조합 바이러스 벡터가 각각 형질도입된 증식성 변이 바이러스를 포함하지 않는 아데노바이러스 또는 레트로바이러스에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 지지체에 부착된 악성 종양을 진단하기 위한 서열번호 1 또는 2로 표시되는 p31^comet 유전자 또는 서열번호 3 또는 4로 표시되는 p31^comet 단백질에 대한 항체의 전부 또는 일부 프로브를 포함하는 마이크로어레이 및 이를 포함하는 진단 키트에 관한 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3 또는 4로 표시되는 단백질을 코딩하는 인간 p31^comet 유전자를 유효성분으로 함유하는 악성 종양 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 인간 p31^comet 유전자는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 것일 수 있다. 상기 악성 종양은 자궁경부암, 난소암, 간암, 유방암, 폐암, 뼈암, 신장암, 췌장암, 위암, 및 대장암 등 일반적인 고형 악성 종양일 수 있다.

본 발명은 고형 악성 종양 세포에 p31^comet 을 과잉 발현시켜 암세포의 성장을 억제시키고, 세포자살을 유도하여 세포를 사멸시킨다. p31^comet 는 대표적으로 2가지 종류가 있으며, 각각 274개 및 306개 아미노산을 갖고 있으며 분자량은 34kDa 및 37 kDa 이며, 세포 주기 중 핵 분열기에 발현량이 증가하며 다시 DNA 합성 전기에 감소한다(Habu T, Kim SH, Weinstein J and Matsumoto T. 2002. EMBO J. 21; 6419-6428). p31^comet 의 세포 내에서의 역할은 염색체가 정상적으로 분리될 수 있도록 비정상적인 상태일 때 세포 분열 조절기구에 의해 분열의 진행이 멈추게 되는데 이러한 진행에 관여하는 Mad2의 기능을 조절하고 있다. 하지만 본 발명자들은 이러한 세포 분열을 조절하는 기능 이외에 p31^comet 의 암세포의 성장을 저해하고 또한 자살할 수 있도록 유도하는 새로운 능력을 밝혀 내었다. p31^comet 을 간, 자궁경부, 폐, 뼈, 신장, 유방 등과 같은 조직의 암에서 기원한 20여 종의 암세포에 바이 러스를 이용하여 과발현시킨 결과, p31^comet 이 발현된 세포는 모두 죽거나 성장이 멈춘 사실을 확인할 수 있었다(도 6 참고).

상기 유전자는 p31^comet (이전 이름은 CMT2)로 명명되었으며, 서열번호 1로 표시되는 1,550 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다. 서열번호 1의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 209 내지 1,129 부위 (1,127-1,129: 정지 코돈)에 해당하는 전사 해독 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시되는 306개의 아미노산으로 이루어져 있다(이하, 'p31^comet-1 단백질'이라고 약칭함). 또한, 상기 p31^comet 유전자는 서열번호 2로 표시되는 1,283 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다. 서열번호 2의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 37 내지 861 부위 (859-861: 정지 코돈)에 해당하는 전사 해독 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호 4로 표시되는 274개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이하, 'p31^comet-2 단백질'이라고 약칭함). 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 p31^comet-1과 2 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 발암 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위 내에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 1과 2의 p31^comet-1과 2 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다. 본 발명의 p31^comet-1과 2 유전자로부터 발현되는 p31^comet-1과 2 단백질은 각각 306, 247개의 아미노산으로 이루어져 있고, 서열번호 3 및 4와 같은 서열을 가지며 크기는 각각 약 34, 37 kDa이다. 그러나, 상기 p31^comet-1과 2 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있으며 이와 같이 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위 내에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 p31^comet-1과 2 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다. 본 발명의 p31^comet-1과 2 유전자 및 단백질은 사람의 암 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 도입시킬 수 있다. 이와 같이 형질전환된 숙주를 이용하여 본 발명의 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 본 발명에서는 바람직한 실시예로서 p31^comet-1과 2 유전자를 포함하는 벡터를 대장균 DH5α에 형질감염 (transfection)시켰다. 벡터의 제작시에는, 상기 p31^comet-1과 2 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터 (promoter), 종결자 (terminator) 등과 같은 발현 조절 서열, 자가-복제 서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 p31^comet 단백질을 코딩하는 핵산 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 비히클을 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 특히 유전자 요법용 생물학적 물질의 제조에 적합하다.

본 발명에 개시된 바이러스성 또는 비바이러스성의 모든 벡터는 약학적으로 허용되는 담체 또는 비히클 중에서 생체 내 도입할 수 있는 것이 바람직하다. 용어 "약학적으로 허용되는"이란 생리적으로 허용되며 사람에게 투여했을 때 구토, 현기증 등과 같은 알레르기 또는 유사한 바람직하지 않은 반응을 일반적으로 야기하지 않는 조성물 및 분자 실체를 의미한다. 용어 "담체"는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 비히클 또는 운반체를 의미한다. 이러한 약학적 담체는 멸균 액체, 예를 들면 물 및 오일, 예를 들면 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 그 예로는 낙화생유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함한다. 물 또는 수용액, 식염수 용액 및 수성 덱스트로스와 글리세롤 용액은 특히 주사용 용액의 담체로서 바람직하게 사용된다. 적합한 약학적 담체에 대해서는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 개시되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 경피 등의 투여용으로 제조할 수 있다. 약학 조성물은 주사용 제제의 약학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 조성물은 특히 멸균된 등장성 식염수 용액(인산일나트륨, 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등이나 또는 이의 혼합물)이거나 또는 적당한 때 멸균수 또는 생리식염수를 첨가하면 주사용 용액이 만들어질 수 있는 무수, 특히 동결건조된 조성물일 수 있다. 바람직한 멸균 주사용 제제는 비독성의 비경구적으로 허용성인 용매 또는 희석제 중의 용액 또는 현탁액일 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체 또는 비히클의 예로는 식염수, 완충 식염수, 등장성 식염수(예, 인산일나트륨, 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등이나 또는 이의 혼합물), 링거액, 덱스트로스, 물, 멸균수, 글리세롤, 에탄올 및 이의 혼합물이 있다. 바람직하게는, 1,3-부탄디올 및 멸균 고정화 오일이 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 합성 모노글리세리드 또는 디글리세리드를 비롯하여 임의 상표의 고정화 오일이 사용될 수 있다. 올레산과 같은 지방산 역시 주사제의 제조에 사용될 수 있다.

투여시 사용되는 단독물 또는 벡터에 혼입된 상태의 본 발명에 개시된 핵산의 투여량은 여러 매개 변수, 특히 사용되는 투여 방식, 해당하는 병리상태, 발현시키고자 하는 유전자 또는 원하는 치료 기간에 따라 조정될 수 있다. 일반적으로 말하면, 본 발명에 개시된 재조합 바이러스의 경우에 10⁴ 내지 10¹⁴ pfu 사이의 투여량, 바람직하게는 10⁶ 내지 10¹⁰ pfu 사이의 투여량 형태로 조제 및 투여한다. 용어 pfu(플라크 형성 단위)는 바이러스 용액의 감염력에 해당하는 것으로, 적합한 세포 배양물을 감염시키고, 일반적으로 48시간 후 감염된 세포 플라크의 수를 측정하여 결정한다. 바이러스 용액의 pfu 역가의 측정 기법은 문헌에 잘 개시되어 있다.

본 발명의 조성물은 비경구 또는 경점막, 예를 들면 경구, 비측 또는 직장 또는 경피적으로 투여될 수 있다. 바람직한 투여는 비경구, 예를 들면 정맥내 주사이며, 예를 들면, 소동맥내, 근육내, 피내, 경피, 복강내, 심실내 및 두개내 투여를 포함하고, 이에 국한되는 것은 아니다.

또 다른 구체적인 예에서, 인간 p31^comet 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 함유하는 조성물은 조절방출형 시스템으로 전달될 수 있다. 예를 들면, 상기 핵산 또는 단백질은 정맥내 주입, 이식된 삼투 펌프, 경피형 패치, 리포좀 또는 다른 투여 방식으로 투여할 수 있다.

따라서, 본 발명의 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내 또는 경피성 투여 경로로 전달할 수 있다. 또는, 적당하게 조제된 조성물은 비측 또는 경구 투여로 투여할 수 있다. 생물학적 물질의 일정 공급은 일정한 간격, 예를 들면 1일, 매 12시간 등으로 치료적 유효 투여량(즉, 피검체의 대사적 변화를 유도하기에 효과적인 투여량)을 제공함으로써 얻을 수 있다. 이 매개 변수는 치료받는 질병 상 태의 정도, 실시되는 다른 작용, 예를 들면 식이 변화, 체중, 연령 및 피검체의 성별, 및 다른 기준에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 표준 우수 의약 처방에 따라 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 범위 내에서 생물학적 물질이 투여되는 유기체는, 사람인 것이 바람직하나, 모든 동물일 수도 있다. 즉, 당업자라면 용이하게 인식할 수 있는 바와 같이 본 발명의 방법 및 약학적 조성물은 특히 포유동물, 비제한적으로 가축, 예를 들면 고양이과, 개과 피검체, 사육 동물, 예를 들면 비제한적으로 소, 말, 염소, 양 및 돼지 피검체, 야생 동물(야생 또는 동물원 동물에 관계없음), 연구용 동물, 예를 들면 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양, 돼지, 개, 고양이 등, 조류 종, 예를 들면 병아리, 칠면조, 명금류 등, 즉 수의용의 모든 동물에 투여하기에 특히 적합하다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 p31^comet 유전자는 레트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus), AAV (adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus) 등과의 복합체의 벡터를 이용하여 전달될 수 있으며, 바람직하게는 상기 벡터는 재조합 아데노바이러스 벡터인 pAdeno-CMV/p31^comet-IRES/GFP 또는 재조합 레트로바이러스 벡터인 Retro-IRES/p31^comet 이다.

생체내 및 생체외 표적화 및 치료법 절차에 일반적으로 사용되는 바이러스 벡터는 DNA 기초 벡터 및 레트로바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터를 작제하여 사 용하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다 [예를 들면, Miller and Rosman, Biotechniques 7:980-990 (1992)]. 바이러스 벡터는 복제 결손형, 즉 표적 세포에서 자발적으로 복제할 수 없는 것이 바람직하다. 일반적으로, 본 발명의 범위 내에 사용되는 복제 결손형 바이러스 벡터의 게놈은 감염된 세포 내에서 바이러스의 복제에 필요한 영역 하나 이상이 결실된 것이다. 이 영역은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 기법에 의해 비기능성화되거나 또는 제거(전체 또는 부분적으로)될 수 있다. 이러한 기법으로는 필수(복제에 필요한) 영역에 대한 하나 이상의 염기의 부가, 전체 제거, 치환(다른 서열로의 치환, 특히 삽입된 핵산에 의한 치환) 또는 부분적 결실을 포함한다. 이러한 기법은 유전자 조작 기법을 사용하거나 또는 돌연변이유발제로 처리하여 시험관 내(분리된 DNA에 대하여) 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 복제 결손형 바이러스는 바이러스 입자를 캡슐화하는데 필요한 게놈 서열을 보유하는 것이 바람직하다.

DNA 바이러스 벡터로는 약독화된 또는 결손형 DNA 바이러스, 예를 들면 비제한적으로 단순 포진 바이러스(HSV), 파필로마바이러스, 엡스타인 바르 바이러스(EBV), 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스(AAV), 백시니아 바이러스 등을 포함한다. 바이러스 유전자가 전부 또는 거의 전부 결실된 결손형 바이러스가 바람직하다. 결손형 바이러스는 세포에 도입된 후에는 복제능이 없어 생산적인 바이러스 감염을 유도하지 못한다. 따라서, 결손형 바이러스 벡터를 사용하면 벡터가 다른 세포를 감염시킬 수도 있다는 우려 없이 특정한 일부 영역에 있는 세포에 투여할 수 있다. 따라서, 특정 조직은 특이적으로 표적화할 수 있다. 특정 벡터의 예로 는 결손형 헤르페스 바이러스 1(HSV1) 벡터, 당단백질 L 유전자를 결실시킨 결손형 헤르페스 바이러스 벡터 또는 기타 결손형 헤르페스 바이러스 벡터; 약독화된 아데노바이러스 벡터; 및 결손형 아데노관련 바이러스 벡터가 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.

바람직한 구체적인 예에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 본 발명의 핵산을 다양한 세포 종류에 효율적으로 전달하기 위하여 변형시킬 수 있는 진핵성 DNA 바이러스이다. 아데노바이러스에는 다양한 혈청형이 존재한다. 이 혈청형 중에서 타입 2 또는 타입 5의 사람 아데노바이러스(Ad2 또는 Ad5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스를 사용하는 것이 본 발명의 범위 내에서 바람직하다. 본 발명의 범위 내에서 사용할 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스로는 개, 소, 쥐, 양, 돼지, 조류 및 원숭이 기원의 아데노바이러스를 포함한다. 바람직하게는 동물 기원의 아데노바이러스는 개의 아데노바이러스이고, 보다 바람직하게는 CAV2 아데노바이러스이다. 바람직하게는, 본 발명의 복제 결손형 아데노바이러스 벡터는 ITR, 캡시드화 서열 및 해당하는 핵산을 포함한다. 보다 바람직하게는, 아데노바이러스 벡터의 적어도 E1 영역이 비기능적인 것이다. E1 영역 중의 결실부는 Ad5 아데노바이러스의 서열 중 뉴클레오타이드 455 내지 3329(PvuII-BglII 단편) 또는 382 내지 3446 (HinfII-Sau3A 단편)인 것이 바람직하다. 또한, 다른 영역, 특히 E3 영역, E2 영역, E4 영역, 또는 후기 유전자 L1 내지 L5 중 임의의 유전자도 변형시킬 수 있다.

바람직한 구체적인 예에서, 아데노바이러스 벡터는 E1 영역에 결실부를 갖고 있다(Ad1.0). E1 결실된 아데노바이러스의 예는 문헌 [EP 제185,573호]에 개시되어 있고, 그 내용은 본 발명에 참고로 인용된다. 또 다른 바람직한 구체적인 예에 있어서, 아데노바이러스 벡터는 E1 영역 및 E4 영역에 결실부를 갖고 있다(Ad3.0). E1/E4 결실된 아데노바이러스의 예는 본 발명에 참고로 인용되는 문헌 [WO 제95/02697호 및 WO 제96/22378호]에 개시되어 있다. 또 다른 바람직한 구체적인 예에서, 아데노바이러스 벡터는 E4 영역과 상기 핵산 서열이 삽입된 E1 영역에 결실부를 갖고 있다 [본 발명에 참고로 인용되는 FR 제94-13355호 참조].

본 발명에 개시된 복제 결손형 재조합 아데노바이러스는 당업자에게 공지된 임의의 기법으로 제조할 수 있다. 구체적으로, 특히 해당하는 DNA 서열을 보유하는 플라스미드와 아데노바이러스 간의 상동성 재조합에 의해 제조할 수 있다. 이 상동성 재조합은 상기 아데노바이러스와 플라스미드로 적당한 세포주를 동시형질감염시킨 후 실시한다. 사용되는 세포주는 바람직하게는, (i) 상기 성분들로 형질전환될 수 있어야 하고, (ii) 복제 결손형 아데노바이러스의 게놈 일부와 상보적일 수 있고, 바람직하게는 재조합의 위험을 피할 수 있도록 통합 형태인 서열을 포함해야 한다. 사용할 수 있는 세포주의 예는 Ad5 아데노바이러스의 좌측부(12%)가 게놈에 통합되어 있는 사람 배 신장 세포주 293, 및 문헌 [WO 제94/26914호 및 WO 제95/02697호]에 개시된 E1 및 E4 기능에 상보할 수 있는 세포주이다. 재조합 아데노바이러스는 당업자에게 잘 알려진 표준 분자 생물학적 기법을 사용하여 회수 및 정제한다.

다른 구체적인 예에서는 상기 유전자가 레트로바이러스 벡터에 도입될 수도 있다. 레트로바이러스는 분열 세포를 감염시키는 통합 바이러스이다. 레트로바이러스 게놈은 2개의 LTR, 캡슐화 서열 및 3개의 암호 영역(gag, pol 및 env)을 포함한다. 재조합 레트로바이러스 벡터에서 gag, pol 및 env 유전자는 일반적으로 그 전체 또는 일부가 결실되고, 해당하는 이종성 핵산 서열로 대체된다. 이 벡터는 여러 종류의 레트로바이러스, 예를 들면 HIV, MoMuLV(쥐 몰로니 백혈병 바이러스), MSV(쥐 몰로니 육종 바이러스), HaSV(하베이 육종 바이러스); SNV(비장 괴사 바이러스); RSV(라우스 육종 바이러스) 및 Friend 바이러스로부터 제조할 수 있다. 결손형 레트로바이러스 벡터는 문헌 [WO 제95/02697호]에 개시되어 있다.

일반적으로, 핵산 서열을 함유하는 재조합 레트로바이러스를 제조하기 위해서는, LTR, 캡슐화 서열 및 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 제조한다. 이 구축물을 사용하여 플라스미드에 결손된 레트로바이러스 기능을 자동적으로 공급할 수 있는 패키징 세포주를 형질감염시킨다. 일반적으로, 패키징 세포주는 gag, pol 및 env 유전자를 발현할 수 있다. 이러한 패키징 세포주에 대해서는 종래 기술에 개시되어 있고, 그 예로는 세포주 PA317, PsiCRIP 세포주 및 GP⁺envAm^-12 세포주가 있다. 또한, 재조합 레트로바이러스 벡터는 일부 gag 유전자를 포함할 수 있는 확장된 캡슐화 서열뿐만 아니라 전사 활성을 억제하기 위해 LTR 내에 변형을 포함할 수 있다. 재조합 레트로바이러스 벡터는 당업자에게 공지된 표준 기법으로 정제한다.

레트로바이러스 벡터는 감염성 입자로서 작용하거나 1회의 형질감염을 수행 하도록 제조할 수 있다. 전자의 경우에는 바이러스를 종양원의 형질전환 성질에 중요한 유전자를 제외한 모든 유전자를 보유하고 이종성 유전자를 발현하도록 변형시킨다. 비감염성 바이러스 벡터는 바이러스 패키징 시그날은 파괴하지만 이종성 유전자와 패키징 시그날을 함유하도록 제조된 동시 도입형 바이러스를 패키징하는데 필요한 구조 유전자는 보유하도록 제조한다. 따라서, 생산된 바이러스 입자는 또 다른 바이러스를 생산할 수 없게 된다. 표적형 유전자 전달에 대해서는 문헌 [국제 특허 공개 WO 제95/28494호]에 개시되어 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 p31^comet 를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터 pAdeno-CMV/p31^comet-IRES/GFP를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus)의 프로모터 부위, 다클로닝 부위(multiple cloning site), 시미언 바이러스 40(Simian virus 40, SV40)의 후 아데닌다중화(late polyadenylation) 신호 부위 및 녹색 형광 단백질(Green fluorescence protein; 이하 'GFP'라 약칭한다)을 코딩하는 부위로 구성되는 발현 카세트를 이용하여 p31^comet 단백질을 생산할 수 있는 아데노바이러스 발현벡터를 제공한다. 본 발명의 녹색 형광 단백질은 상기 아데노바이러스 발현 벡터를 암세포에 감염시켰을 때 녹색 형광을 나타내기 때문에, 상기 벡터가 세포에 제대로 침투되었는지 확인할 수 있다. 본 발명에서는 인간 사이토메갈로바이러스의 프로모터 부위, 다클로닝 부위, 시미언바이러스 40의 후 아데닌다중화 신호 부위 및 녹색 형광 단백질을 코딩하는 부위로 구성되는 발현 카세트를 포함하는 pAdenoVator-CMV5- IRES-GFP 벡터를 사용하였다. p31^comet 유전자를 정상 조직으로부터 분리한 RNA를 주형으로하여 RT-PCR 반응을 수행하여 정상적인 인간 p31^comet 유전자를 얻었다. 상기 수득된 p31^comet cDNA를 이용하여 p31^comet 단백질을 발현할 수 있는 재조합 아데노바이러스 발현벡터 pAdeno-CMV/p31^comet-IRES/GFP를 완성하였다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 p31^comet 를 발현하는 재조합 레트로바이러스 벡터 Retro-IRES/p31^comet 를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 바이러스의 5'LTR(Long Terminal Repeat) 프로모터 부위, 다클로닝 부위(multiple cloning site), IRES(internal ribosomal entry site), 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 선택 단백질(퓨로마이신, 이하 'puro'라 약칭함)을 발현시킬 수 있는 유전자, 그리고 3'LTR(Long Terminal Repeat) 내의 후 아데닌다중화(late polyadenylation) 신호 부위로 구성되는 발현카세트를 이용하여 p31^comet 단백질을 생산할 수 있는 레트로바이러스 발현벡터를 제공한다. 본 발명의 녹색 형광 단백질은 상기 레트로바이러스 발현벡터를 암세포에 감염시켰을 때 녹색 형광을 나타내기 때문에, 상기 벡터가 세포에 제대로 침투되었는지 확인할 수 있다. 본 발명에서는 LTR 프로모터 부위, 다클로닝 부위, IRES, puro 혹은 GFP 유전자, 후 아데닌다중화 신호 부위로 구성되는 발현 카세트를 포함하는 MFG-IRES-Puro 혹은 MFG-IRES-GFP 벡터를 사용하였다. p31^comet 유전자를 정상 조직으로부터 분리한 RNA를 주형으로하여 RT-PCR 반응을 수행하여 정상적인 인간 p31^comet 유전자를 얻었다. 상기 수득된 p31^comet cDNA를 상기 MFG-IRES-Puro과 MFG-IRES-GFP 벡터의 다클로닝 부위에 삽입하여 p31^comet 단백질을 발현할 수 있는 레트로바이러스 발현벡터 Retro-IRES/p31^comet 를 완성하였다.

본 발명을 실시하는데 유용한 일부 프로모터로는, 편재적 프로모터(예, HPRT, 비멘틴, 액틴, 튜불린), 중재적 필라멘트 프로모터(예, 데스민, 뉴로필라멘트, 케라틴, GFAP), 치료적 유전자 프로모터(예, MDR형, CFTR, 제VIII 인자), 조직 특이적 프로모터(예, 평활근 세포 내의 액틴 프로모터), 분열 세포 내에서 주로 활성화되는 프로모터, 자극에 반응하는 프로모터(예, 스테로이드 호르몬 수용체, 레틴산 수용체), 테트라사이클린이 조절하는 전사 조절인자, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 초기 발현 프로모터, 레트로바이러스 LTR, 메탈로티오네인, SV-40, 아데노바이러스 E1a 및 아데노바이러스 주요 후기(MLP) 프로모터가 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 재조합 바이러스 벡터 pAdeno-CMV/p31^comet-IRES/GFP 또는 Retro-IRES/p31^comet 로 형질전환된 미생물을 제공한다. 본 발명의 재조합 바이러스 벡터를 형질전환하기 위한 미생물로는 세균 세포, 효모 세포 또는 포유동물 세포 등일 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 바이러 스 벡터 pAdeno-CMV/p31^comet-IRES/GFP 또는 Retro-IRES/p31^comet 를 포유동물 세포에 감염시킨 후 이를 배양함으로써 재조합 p31^comet 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 재조합 바이러스 벡터 pAdeno-CMV/p31^comet-IRES/GFP 또는 Retro-IRES/p31^comet, p31^comet 유전자로부터 전사된 p31^comet RNA, 서열번호 3 또는 4로 표시되는 단백질을 유효성분으로 함유할 수 있다. 이때 상기 약학적 조성물의 유효성분으로는 상기 재조합 바이러스 벡터로 형질감염된 세포에서 대량으로 생산된 p31^comet 단백질 또는 상기 p31^comet 유전자로부터 전사된 RNA를 사용할 수도 있으며, 보다 바람직하게는 그 발현 벡터 자체를 사용하는 것이 좋은데 이는 발현 벡터를 투여하면 그로부터 지속적으로 재조합 단백질이 생산될 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 발현 벡터는 유전자 요법에 사용되는 약학적 조성물의 유효성분으로서 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 바이러스 벡터 pAdeno-CMV/p31^comet-IRES/GFP 가 형질도입된 증식성 변이 바이러스를 포함하지 않는 아데노바이러스를 제공한다. 아데노바이러스(Adenovirus)는 DNA 바이러스로서, 그 게놈에 바이러스가 증식하는데 필수적인 유전자인 E1A 유전자 부위와 바이러스가 패키징되는데 필수적인 유전자 등이 포함되어 있다. 이러한 아데노바이러스가 유전자 요법에 이용되기 위해서는 바이러스가 체내에서 스스로 증식하여 온 몸에 감염됨으로써 또 다른 질병이 유발되지 않도록 바이러스 증식에 사용되는 유전자를 제거하여야 한다. 따라서, 아데노바이러스 게놈 중에 바이러스가 증식하는데 관여하는 E1A 유전자 부위를 제거하면 바이러스가 스스로 정상세포에서 증식할 수 없어 아데노바이러스를 유전자 요법에 이용할 수 있다. 본 발명은 상기 아데노바이러스 발현벡터를 이용하여 아데노바이러스를 대량으로 얻기 위하여, 아데노바이러스가 패키징될 수 있는 세포주를 상기 발현 벡터로 형질감염(transfection)시킨다. 패키징 세포주로 293 세포를 이용하는데, 293 세포는 그의 염색체 DNA에 아데노바이러스의 E1 유전자 부위를 포함하고 있어 E1A 유전자를 계속적으로 발현하고 세포에 E1A 단백질을 제공한다. 본 발명은 상기 아데노바이러스 발현벡터 pAdeno-CMV/p31^comet-IRES/GFP를 패키징 세포 293 세포에 아데노바이러스 모체 벡터를 함께 주입하여 아데노바이러스를 증식시키고, 증식성 재조합 변이 바이러스(RCV)를 포함하지 않는 아데노바이러스 클론을 선별하여 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 바이러스 벡터 Retro-IRES/p31^comet 가 형질도입된 증식성 변이 바이러스를 포함하지 않는 레트로바이러스를 제공한다. 현재까지 암 및 유전성 대사 질환 등의 유전자 요법에 사용된 레트로바이러스 벡터로는 더스티 밀러 (Dusty Miller) 박사에 의하여 고안된 LN 계통의 플라스미드가 있는데 이는 PA317 이라는 패키징 세포주에 형질감염 (transfection) 또는 형질도입 (transduction)하여 바이러스 입자로 제조될 수 있다. 또한, 최근에 임상적으로 사용되는 레트로바이러스 벡터로는 멀리간 (R. Mulligan) 팀들이 제작한 MFG 계통의 플라스미드가 있는데, 이것도 LN 계열의 플라스미드와 마찬가지로 MLV (Moloney Leukemia virus)에 기초한 것이나 유전자 삽입 장소가 제한효소 NcoI 부위로서 이것이 삽입된 유전자의 시작 코돈 (start codon)이 되도록 조작되어 있어 효소의 발현에 유용하다. 본 발명은 상기 발현 벡터를 H29D 패키징 세포주에 형질도입하여 바이러스 입자로 제조하였으며, 발현 벡터 자체가 세포내에서 증식성 변이 바이러스를 생산하지 않는 것을 선별하여 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지지체에 부착된 악성 종양을 진단하기 위한 서열번호 1 또는 2로 표시되는 p31^comet 유전자 또는 서열번호 3 또는 4로 표시되는 p31^comet 단백질에 대한 항체의 전부 또는 일부 프로브를 포함하는 마이크로어레이를 제공한다. 본 발명의 마이크로어레이에서, 상기 지지체는 마이크로어레이의 제작에 통상적으로 사용되는 슬라이드 글라스, 멤브레인, 반도체 칩, 실리콘 또는 겔 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 프로브는 마이크로어레이의 종류에 따라 악성 종양을 검출할 수 있는 어떤 바이오 물질도 포함할 수 있으나, 바람직하게는 cDNA, 올리고뉴클레오티드, PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), HNA (hexitol nucleic acid) 등의 DNA 유사체, 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 상기 검출 표적인 악성 종양은 자궁경부암, 난소암, 간암, 유방암, 폐암, 뼈암, 신장암, 췌장암, 위암, 및 대장암 등과 같은 일반적인 고형암일 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 마이크로어레이 를 포함하는 악성 종양을 진단하기 위한 진단 키트를 제공한다. 본 발명의 진단 키트에는 프로브를 포함하는 본 발명의 마이크로어레이 외에 혼성화 반응용액, 표적 산물을 증폭하기 위한 프라이머가 포함된 PCR 키트, 비혼성화 반응 DNA 세척용 용액, 커버슬립, 염료, 비염료 결합 세척용 용액 및 사용설명서 등을 추가로 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

일반적인 분자 생물학 기법

분자생물학에 통상적으로 사용되는 방법, 예를 들면 정제용 플라스미드 추출, 염화세슘 구배에서의 플라스미드 DNA의 원심분리, 아가로오스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동, 전기용출에 의한 DNA 단편의 정제, 페놀 또는 페놀/클로로포름에 의한 단백질 추출, 식염수 용액에서의 DNA의 에탄올 또는 이소프로판올 침전, 대장균의 형질전환 등은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 문헌 [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1982 (2nd Ed., 1989); Ausubel F.M.et al., (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]에 충분히 설명되어 있다.

통상적인 클로닝 운반체로는 pBR322 및 pUC형의 플라스미드, M13 시리즈의 파아지를 포함한다. 이것은 시판(제조원: Bethestha Research Laboratories)되므로 입수용이하다. 라이게이션을 위하여, DNA 단편은 아가로오스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동으로 크기별로 분리한 뒤, 페놀 또는 페놀/클로로포름 혼합물로 추출하고, 에탄올로 침전시킨 다음 제조업자의 추천에 따라 파아지 T4 DNA 리가제(Biolabs)의 존재하에 항온처리하였다.

5' 돌출 말단의 충전(filling)은 제조업자의 지시에 따라 대장균 DNA 폴리머라제 I(제조원: Biolabs)의 클레나우 단편을 사용하여 실시할 수 있다. 3' 돌출 말단의 제거는 제조업자의 추천에 따라 사용된 파아지 T4 DNA 폴리머라제(제조원: Biolabs)의 존재하에 실시하였다. 5' 돌출 말단의 제거는 S1 뉴클레아제로 조절 처리하여 실시하였다.

PCR 기법에 의한 DNA 단편의 효소적 증폭은 "DNA 가열 순환기"(제조원: Perkin Elmer Cetus)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 실시하였다. 염기서열의 확인은 제조원(Amersham)에서 공급하는 키트를 사용하여 생거 등에 의한 개발된 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74(1977) 5463-5467]에 따라 실시하였다.

플라스미드 DNA는 퀴아젠 플라스미드 정제 시스템(제조원: Qiagen)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 정제하였다.

실시예 1: p31 ^comet -1과 2를 발현하는 아데노바이러스 벡터 제조

p31^comet 유전자를 분리하기 위해, 정방향 프라이머(서열번호 5)와 역방향 프 라이머(서열번호 6)를 사용하여 인간의 흉선 라이브러리(Human Thymus library, Clontech)로부터 PCR 반응을 수행하여 정상적인 인간 p31^comet cDNA를 얻었다. PCR 반응은 0.1㎍의 라이브러리, 10pmol의 정방향 및 역방향 프라이머, Tag 중합효소(Takara) 10 유닛, 1X 완충액, dNTP 2.5mM 의 혼합물에 50㎕가 되게 물을 맞추었다. 95℃에서 5분간 주형 DNA를 변성시켰으며, 95℃ 45초, 56℃ 45 초, 72℃ 1분을 30 사이클을 수행하여 p31^comet cDNA를 증폭시킨 후, 여분의 증폭 시간을 72℃에서 10분간 유지하였다. 이렇게 증폭된 p31^comet cDNA을 컬럼을 통해 분리하였다. 상기 p31^comet cDNA를 상기 pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP 벡터의 다클로닝 부위에 삽입하기 위하여 BglII 제한효소로 벡터 및 p31^comet cDNA를 절단하여 분리하였다. 분리된 cDNA는 서열번호 2의 37∼861 위치에 해당한다. 이렇게 분리된 p31^comet 을 상기 벡터에 라이게이션한 후 형질전환 숙주인 DH-5α에 형질전환시켰으며, 이 중에서 정상적으로 제조된 pAdeno-CMV/p31^comet-IRES/GFP를 선별하였으며, 이를 대량 생산하였다. p31^comet-1과 2 유전자는 동일하게 제조되었다. 도 1은 재조합 아데노바이러스 벡터인 pAdeno-CMV/p31^comet-IRES/GFP의 개열 지도를 보여준다.

또한 바이러스를 생산하기 위하여 293 세포를 이용하였으며, 증식성 변이 바이러스가 포함되지 않는 아데노바이러스 클론을 동정하였다. 이렇게 제조된 pAdeno-CMV/p31^comet-IRES/GFP가 정상적으로 발현되는지 확인하기 위하여 우리는 제조된 아데노바이러스를 HeLa 세포에 감염시켰으며, 시간에 따라 발현 차이를 확인하였다. 도 2는 시간에 따른 pAdeno-CMV/p31^comet-IRES/GFP 벡터의 발현양을 웨스턴 블롯을 이용하여 측정한 것이다. 웨스턴 블롯은 당업계에 공지된 통상적인 방법을 이용하였다. 도 2에서 좌측 패널은 p31^comet 유전자가 삽입되지 않은 음성 대조군을 나타내며, 액틴은 양성 대조군으로서 음성 대조군에서 분리한 단백질의 양과 본원 발명의 단백질의 양이 거의 동일하게 이용되었다는 것을 나타낸다. 도 2에서 보여주는 바와 같이, 시간이 지날수록 음성 대조군에 비해 본원 발명의 아데노바이러스 벡터는 p31^comet 단백질을 현저하게 많이 발현하는 것을 알 수 있었다.

실시예 2: p31 ^comet -1과 2를 발현하는 레트로바이러스 벡터 제조

p31^comet 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터 제조는 아데노바이러스 벡터 제조와 유사한 방법으로 수행하였다. 도 3은 재조합 레트로바이러스 벡터인 Retro-IRES/p31^comet 의 개열 지도를 보여준다. 단지 이 유전자를 포함하는 바이러스를 생산하기 위하여 발명자들은 H29D 팩테이징 세포를 사용하여 증식성 변이가 없는 바이러스를 생산하였다. p31^comet 단백질의 발현을 보기 위하며 HeLa 세포에 감염시켰으며 감염된 세포에 대해 시간에 따른 발현 차이를 확인하였다. 도 4는 시 간에 따른 Retro-IRES/p31^comet 벡터의 발현양을 웨스턴 블롯을 이용하여 측정한 것이다. 도 4에서 좌측 패널은 p31^comet 유전자가 삽입되지 않은 음성 대조군을 나타내며, 액틴은 양성 대조군으로서 음성 대조군에서 분리한 단백질의 양과 본원 발명의 단백질의 양이 거의 동일하게 이용되었다는 것을 나타낸다. 도 4에서 보여주는 바와 같이, 시간이 지날수록 음성 대조군에 비해 본원 발명의 레트로바이러스 벡터는 p31^comet 단백질을 현저하게 많이 발현하는 것을 알 수 있었다.

실시예 3: 암세포에 대한 p31 ^comet 의 성장억제 효과

p31^comet 이 암세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 자궁경부암 세포 5종(HeLa, SW756, SiHa, MS751, Caski), 폐암 세포 5종(A549, Calu-1, Sk-Lu-1, H460, H446), 간암 세포 5종(Sk-Hep-1, Chang, HepG2, Huh-7, Hep3B), 뼈암 세포 2종(SaOs-2, U-2OS), 유방암 세포 2종(MCF-7, T47D), 신장암 세포 1종(293) 등 총 20종의 암세포주를 사용하였다.

20가지 인간 암세포주 중 HeLa, SW756, SiHa, MS751, Sk-Lu-1, Sk-Hep-1, HepG2, Hep3B, MCF-7, T47D, 293은 10% FBS(JRH Biosciences Inc. Kansas, USA), 스트렙토마이신 및 페니실린 G가 포함된 MEM(WelGENE Inc. Daegu, South Korea)에서 37℃, 5% CO₂의 습한 조건으로 배양하였다. Caski, A549, H460, H446, Huh-7 등은 10% FBS(JRH Biosciences Inc. Kansas, USA), 스트렙토마이신 및 페니실린 G가 포함된 RPMI(WelGENE Inc. Daegu, South Korea)에서 37℃, 5% CO₂의 습한 조건으로 배양하였다. Calu-1, SaOs-2, U-2OS는 10% FBS(JRH Biosciences Inc. Kansas, USA), 스트렙토마이신 및 페니실린 G가 포함된 McCoy(WelGENE Inc. Daegu, South Korea)에서, Chang은 10% FBS(JRH Biosciences Inc. Kansas, USA), 스트렙토마이신 및 페니실린 G가 포함된 DMEM(WelGENE Inc. Daegu, South Korea)에서 37℃, 5% CO₂의 습한 조건으로 배양하였다. p31^comet 이 암세포 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 암세포들을 6웰 플레이트(Nalge Nunc, Naperville, IL)에 2×10⁵ 세포/웰의 농도로 하여 하루 동안 배양하였다. Retro-IRES/p31^comet 을 포함하는 레트로바이러스를 각각의 세포에 맞는 엠오아이(moi) 정도를 정하여 이 용액을 배지가 제거된 웰에 넣어 주고 15분 간격으로 2시간 동안 플레이트를 흔들었다. 2시간이 지난 후 바이러스가 포함된 웰에 배지를 2㎖ 씩 첨가한 후 배양시켰다. 12~24시간이 지난 후 배지를 교환하며, 다시 하루가 지난 후 세포를 700에서 1000개 정도를 100mm 플레이트에 깔았다. 9~12일이 지난 후 카운팅할 수 있는 적당한 크기의 콜로니(colony)가 형성되면 형광 현미경을 이용하여 녹색 형광이 있는 콜로니와 그렇지 않은 콜로니 모두를 카운팅하였다. 대표적으로 A549를 살펴보면, 도 5의 패널 c에서 보는 것처럼 p31이 과발현된 세포는 콜로니의 형성이 대조군에 비해 월등히 저하된 것을 알 수 있으며, 다른 모든 암세포에서도 동일한 현상을 관찰하였다(도 6 참고). 간암세포주인 HepG2 (콜로니 형성 억제능력 : 75%)와 자궁암세포주인 H460 (콜로니 형성 억제능력 : 84%)를 제외하고 모든 종류의 암세포주에서 100% 콜로니 형성 억제 현상을 관찰할 수 있었다. 즉 p31이 과발현된 세포는 콜로니를 형성할 수 없음을 보여주고 있으며, 이는 세포가 전혀 증식을 하지 못하는 것을 의미하고 있다. 비록 100%는 아니지만 HepG2, H460 세포에서도 높은 콜로니 형성 억제를 보여주는 점으로 보아 p31은 암세포의 증식을 완벽하게 억제하고 있다는 사실을 확인하였다.

실시예 4: p31 ^comet 에 의한 암세포 증식 억제 현상 분석

실시예 3에서 보여준 p31^comet 에 의한 암세포의 증식 억제가 어떠한 현상으로 나타나는지를 분석하기 위하여 A549, Calu-1 등에 Retro-IRES/p31^comet 을 포함하는 레트로바이러스를 감염시켰다.

<4-1> p31^comet 가 과발현된 세포의 성장 측정

Retro-IRES/p31^comet 을 포함하는 레트로바이러스를 감염시킨 후 하루 간격으로 세포의 개수를 측정한 결과 대조군의 세포는 정상적으로 성장하는 반면, p31^comet 가 과발현된 세포는 그 증가하는 현상이 거의 일어나지 않고 있다(도 5의 패널 b 참고). 또한 세포의 형태를 현미경으로 관찰한 결과 8일 이 지난 후 p31^comet 가 감염된 세포의 크기는 대조군의 세포보다 10~30배 정도 커져 있는 것을 확인할 수 있었다(도 5의 패널 a 참고).

<4-2> 노화관련 베타 갈락토시데이즈 염색(Senescence Associated-β-galactosidase, SA-β-gal) 검사

실시예 4-1에서 p31^comet 가 감염된 세포의 크기가 커진 것이 노화(senescence)와 관련이 있는지를 살펴보기 위하여 SA-β-gal 검사를 수행하였다. 60mm 디쉬(dish)에 있는 감염된 세포와 대조군 세포를 날짜별로 모아서 PBS(phosphate buffered saline)로 3번 세척을 한 후 고정액(2% 포름알데하이드, 0.2% 글루타르알데히드가 포함된 PBS)으로 10분간 처리한 후 다시 PBS로 3회 세척하였다. 세척 후 염색액 (5 mM 포타슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide), 5 mM 페로시아나이드(ferrocyanide), 및 디메틸 포름아미드 중의 1 mg/ml X-gal (4% (v/v) 디메틸 포름아미드 최종농도)가 포함된 PBS)에 37℃ 배양기에서 12시간 동안 반응시킨 후 PBS로 다시 세척을 하였다. 염색이 완료된 시료에 핵을 염색할 수 있는 대피(DAPI) 염색액(50ng DAPI가 포함된 PBS)을 넣고 1시간 가량 상온에서 반응시킨 후 광학 현미경 및 형광 현미경을 통해 시료를 관찰하였다. 그 결과, p31^comet 가 감염된 세포에서 SA-β-gal 염색이 된 세포의 수는 80% 가까이 관찰되었으며, 대조군의 경우는 대략 2~6% 정도였다. 또한 p31^comet 가 감염된 세포의 핵은 다핵화 및 그 크기가 커졌으며 비정상적인 핵의 형태를 보였다(도 7의 패널 a). 이러한 특징들은 전형적인 노화 현상이라고 할 수 있다. 즉, p31^comet 가 감염된 암세포는 급격히 노화 현상이 발생해 세포가 더 이상 성장을 할 수 없는 상태로 바뀌는 것을 의미한다.

<4-3> 유세포분석기(Fluorescent Activated Cell Sorter, FACS)를 이용한 세포 노화측정

실시예 4-2에서 나온 세포의 노화 현상을 좀 더 확실히 증명하기 위하여, 본 발명자들은 유세포분석기를 이용하여 세포의 노화 정도를 측정하였다. 유세포분석기의 특징은 레이저를 이용하여 세포의 크기 및 세포 내의 소립자의 양을 측정할 수 있다. p31^comet 이 감염된 자궁경부암 세포에서 세포 소립자를 표시하는 SSC의 값이 대조군과 비교하여 현저히 증가된 것을 알 수 있다 (도 7의 패널 b).

<4-4> MTT 분석을 통한 세포 증식 및 사멸 측정

실시예 4-2 및 4-3에서 나타난 자궁경부암 세포에서의 노화 현상 이외에 다른 암세포에서 나타나는 현상을 확인하기 위하여 MTT 분석을 수행하였다. MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디-페닐테트라졸리움 브로마이드)는 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 특정 효소와 반응하여 푸른색의 결정을 형성하는데, 그 푸른 정도에 따라 세포의 생존 정도를 확인하였다. A549, HeLa, U-2OS, HepG2 세포를 6웰 플레이트에 1~3×10⁵/웰의 농도로 하여 pAdeno-CMV/p31^comet-IRES/GFP 가 포함된 아데노바이러스를 40, 16, 25, 50 moi 값으로 감염시켰다. 감염된 세포는 날짜별로 대조군과 비교하여 푸른색의 정도를 ELISA로 분석하였다(도 8). 특히 HeLa와 U-2OS는 감염 후 2일이 지난 후부터 세포의 개체수가 급격히 줄어드는 반면에, 대조군은 정상적으로 증가하는 것을 볼 수 있었다. 또한 A549의 경우도 살아있는 세포의 수가 완만하게 감소한 것을 볼 수 있으며, 이러한 현상은 A549 세포의 노화에 의한 성장 억제에 의한 것이라고 생각된다(도 5 및 7 참고). HepG2의 경우는 살아 있는 세포의 수 증가가 대조군에 비해 현저히 낮으며, 이것은 p31^comet의 과발현에 의해 성장이 억제된다는 것을 알 수 있었다.

본 발명에 따르면 본 발명의 p31^comet를 고형악성 종양 세포에 발현시켜 세포 성장 억제 및 세포자살 효과를 향상시켜, 별다른 부작용 없이 고형악성 종양을 효과적으로 사멸시킬 수 있으며, 다양한 종류의 암세포를 죽이므로, 암 환자의 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

1. 서열번호 3 또는 4로 표시되는 단백질을 코딩하는 인간 p31^comet 유전자를 유효성분으로 함유하는 악성 종양 치료용 약학적 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 인간 p31^comet 유전자는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 p31^comet 유전자는 레트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus), AAV (adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus), 및 렌티바이러스 (lentivirus)와의 복합체로 구성된 군으로부터 선택되는 벡터를 이용하여 전달되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
4. 제 3 항에 있어서,

   상기 벡터는 재조합 아데노바이러스 벡터인 pAdeno-CMV/p31^comet-IRES-GFP(Adeno는 아데노바이러스, CMV는 사이토메갈로바이러스, IRES는 내부 리보좀 결합부위, GFP는 녹색형광단백질임) 또는 재조합 레트로바이러스 벡터인 Retro-IRES/p31^comet(Retro는 레트로바이러스, IRES는 내부 리보좀 결합부위임)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. p31^comet 를 발현하는 재조합 바이러스 벡터 pAdeno-CMV/p31^comet-IRES-GFP(Adeno는 아데노바이러스, CMV는 사이토메갈로바이러스, IRES는 내부 리보좀 결합부위, GFP는 녹색형광단백질임) 또는 Retro-IRES/p31^comet(Retro는 레트로바이러스, IRES는 내부 리보좀 결합부위임)를 유효성분으로 함유하는 악성 종양 치료용 약학적 조성물.
9. 제 1 항의 p31^comet 유전자로부터 전사된 p31^comet RNA를 유효성분으로 함유하 는 악성 종양 치료용 약학적 조성물.
10. 서열번호 3 또는 4로 표시되는 단백질을 유효성분으로 함유하는 악성 종양 치료용 약학적 조성물.
11. 제 1 항 내지 제 4 항, 또는 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 악성 종양은 자궁경부암, 난소암, 간암, 유방암, 폐암, 뼈암, 신장암, 췌장암, 위암, 및 대장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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