JP2002525065A - 選択的にターゲッティングされるアデノウイルス - Google Patents
選択的にターゲッティングされるアデノウイルスInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、アデノウイルスファイバー蛋白質のアミノ末端を有し、且つ三量化ドメインを有する組換え蛋白質を提供する。このような蛋白質を組み込んだファイバーは、天然の基質に対する親和性が、野生型アデノウイルスファイバー三量体よりも低下している。本発明はさらに、本発明の組換え蛋白質を組み込んだアデノウイルスを提供する。
Description
【０００１】 発明の技術分野 本発明は選択的にターゲッティングされるアデノウイルスに関し、このような
ウイルスの産生および精製方法、並びに選択的ターゲッティングを仲介する蛋白
質の修飾を含む。
ウイルスの産生および精製方法、並びに選択的ターゲッティングを仲介する蛋白
質の修飾を含む。
【０００２】 発明の背景 ウイルスの存在に対する宿主動物の種々の生理学的応答は、このようなウイル
スが宿主動物と異なった様式で相互作用することに依存し、これらの相互作用は
それぞれ、まずウイルスの表面（「ビリオン」）によって仲介される。アデノウ
イルスビリオンは、直径約６５〜８０ｎｍのエンベロープのない正二十面体であ
る（Horneら、J. Mol. Biol., 1, 84-86 (1959)）。それは２５２のキャプソメ
ア、すなわち２４０のヘキソンと１２のペントンを含み（Ginsbergら、Virology
, 28, 782-83 (1966)）、３つのウイルス蛋白質（蛋白質II、IIIおよびIV）に由
来する（Maizelら、Virology, 36, 115-25 (1968)）。蛋白質IX、VIおよびIIIa
もまた存在し、ビリオンを安定化する（Stewartら、Cell, 67, 145-54 (1991);
Stewartら、EMBO J., 12(7), 2589-99 (1993)）。
スが宿主動物と異なった様式で相互作用することに依存し、これらの相互作用は
それぞれ、まずウイルスの表面（「ビリオン」）によって仲介される。アデノウ
イルスビリオンは、直径約６５〜８０ｎｍのエンベロープのない正二十面体であ
る（Horneら、J. Mol. Biol., 1, 84-86 (1959)）。それは２５２のキャプソメ
ア、すなわち２４０のヘキソンと１２のペントンを含み（Ginsbergら、Virology
, 28, 782-83 (1966)）、３つのウイルス蛋白質（蛋白質II、IIIおよびIV）に由
来する（Maizelら、Virology, 36, 115-25 (1968)）。蛋白質IX、VIおよびIIIa
もまた存在し、ビリオンを安定化する（Stewartら、Cell, 67, 145-54 (1991);
Stewartら、EMBO J., 12(7), 2589-99 (1993)）。
【０００３】 ヘキソンはキャプシドに構造と形態を与えるものであり（Pettersson, The Ad
enoviruses、205-270頁、Ginsberg編（Plenum Press, New York, NY, 1984））
、蛋白質IIのホモトリマーである（Robertsら、Science, 232, 1148-1151 (1986
)）。ヘキソンはウイルスの主たる抗原決定基を提供し、ウイルスの血清型特異
性にも寄与する（Watsonら、J. Gen. Virol., 69, 525-35 (1988):Wolfortら、J
. Virol., 62, 2321-28 (1988): Wolfortら、J. Virol., 56, 896-903 (1985);
Crawford-Mikszaら、J. Virol., 70, 1836-44 (1996)）。
enoviruses、205-270頁、Ginsberg編（Plenum Press, New York, NY, 1984））
、蛋白質IIのホモトリマーである（Robertsら、Science, 232, 1148-1151 (1986
)）。ヘキソンはウイルスの主たる抗原決定基を提供し、ウイルスの血清型特異
性にも寄与する（Watsonら、J. Gen. Virol., 69, 525-35 (1988):Wolfortら、J
. Virol., 62, 2321-28 (1988): Wolfortら、J. Virol., 56, 896-903 (1985);
Crawford-Mikszaら、J. Virol., 70, 1836-44 (1996)）。
【０００４】 ヘキソン三量体は、擬六角形の底面と三角形の頂点からなり３つの塔を形成す
る（Robertsら、前出；Athappillyら、J. Mol. Biol., 242, 430-455 (1994)）
。底面の台は、内部ループによって安定化された、しっかりと束ねられた２つの
８本撚り逆平行βバレルからなる。ヘキソンの主たる抗原領域および血清型特異
的領域は、ループ１および２（すなわち、それぞれＬＩまたはｌ１およびＬIIま
たはｌ２）内に存在するようであり、その中には、アデノウイルス血清型間で長
さおよび配列が変化する７つの別個な超可変領域（ＨＶＲ１〜ＨＶＲ７）がある
（Crawford-Mikszaら、前出）。
る（Robertsら、前出；Athappillyら、J. Mol. Biol., 242, 430-455 (1994)）
。底面の台は、内部ループによって安定化された、しっかりと束ねられた２つの
８本撚り逆平行βバレルからなる。ヘキソンの主たる抗原領域および血清型特異
的領域は、ループ１および２（すなわち、それぞれＬＩまたはｌ１およびＬIIま
たはｌ２）内に存在するようであり、その中には、アデノウイルス血清型間で長
さおよび配列が変化する７つの別個な超可変領域（ＨＶＲ１〜ＨＶＲ７）がある
（Crawford-Mikszaら、前出）。
【０００５】 ペントンは、キャプシドに結合しているベースと、ペントンベースに非共有結
合しかつそこから突出しているファイバーとを含む。蛋白質IIIからなるペント
ンベースは、アデノウイルスの血清型の間で高度に保存されており、（腸アデノ
ウイルスＡｄ４０およびＡｄ４１を除いて）５つのＲＧＤトリペプチドモチーフ
を有する（Neumannら、Gene, 69, 153-57 (1988)）。これらのＲＧＤトリペプチ
ドは、細胞外マトリクスとも相互作用し、細胞シグナル伝達に重要な役割を果た
すヘテロダイマー細胞表面レセプターのファミリーの１つである、αvインテグ
リンへのアデノウイルスの結合を、みかけ上仲介する（Hynes, Cell, 69, 11-25
(1992)）。これらのＲＧＤトリペプチドは、ビリオンのエンドサイトーシスに
おいても役割を果たしている（Wickhamら、(1993) 前出；Baiら、J. Virol., 67
, 5198-3205 (1993)）。
合しかつそこから突出しているファイバーとを含む。蛋白質IIIからなるペント
ンベースは、アデノウイルスの血清型の間で高度に保存されており、（腸アデノ
ウイルスＡｄ４０およびＡｄ４１を除いて）５つのＲＧＤトリペプチドモチーフ
を有する（Neumannら、Gene, 69, 153-57 (1988)）。これらのＲＧＤトリペプチ
ドは、細胞外マトリクスとも相互作用し、細胞シグナル伝達に重要な役割を果た
すヘテロダイマー細胞表面レセプターのファミリーの１つである、αvインテグ
リンへのアデノウイルスの結合を、みかけ上仲介する（Hynes, Cell, 69, 11-25
(1992)）。これらのＲＧＤトリペプチドは、ビリオンのエンドサイトーシスに
おいても役割を果たしている（Wickhamら、(1993) 前出；Baiら、J. Virol., 67
, 5198-3205 (1993)）。
【０００６】 アデノウイルスファイバーは、３つの別個のドメインを有するアデノウイルス
ポリペプチドIVのホモトリマーであり（Devauxら、J. Molec. Biol., 215, 567-
88 (1990)）、アミノ末端の「テール」ドメインはペントンベースに非共有結合
している。可変数の反復する１５残基βシートモチーフを含む比較的長い「シャ
フト」ドメインは、ウイルス粒子の頂点から外側に伸びている（Yehら、Virus R
es., 33, 179-98 (1991)）。最後に、カルボキシ末端の約２００の残基が「ノブ
」ドメインを形成する。機能的には、ノブは、細胞蛋白質へのウイルスの最初の
結合とファイバー三量化の両方を仲介する（Henryら、J. Virol., 68(8), 5239-
46 (1994)）。三量化は、ファイバーのアミノ末端がペントンベースと正しく結
合するのにも必要であるらしい（Novelliら、Virology, 185, 365-76 (1991)）
。細胞レセプターの認識およびペントンベースとの結合に加えて、ファイバーは
血清型の保全に寄与し、また核局在化を仲介する。さらに、幾つかの血清型由来
のアデノウイルスファイバーはグリコシル化されている（例えば、Mullisら、J.
Virol., 64(11), 5317-23 (1990): Hongら、J. Virol., 70(10), 7071-78 (199
6): Chroboczekら、Adenovirus Fiber, 163-200頁、「The Molecular Repertoir
e of Adenoviruses I. Virion Structure and Function」、W. DoerflerおよびP
. Bohm編（Springer, NY 1995）を参照）。
ポリペプチドIVのホモトリマーであり（Devauxら、J. Molec. Biol., 215, 567-
88 (1990)）、アミノ末端の「テール」ドメインはペントンベースに非共有結合
している。可変数の反復する１５残基βシートモチーフを含む比較的長い「シャ
フト」ドメインは、ウイルス粒子の頂点から外側に伸びている（Yehら、Virus R
es., 33, 179-98 (1991)）。最後に、カルボキシ末端の約２００の残基が「ノブ
」ドメインを形成する。機能的には、ノブは、細胞蛋白質へのウイルスの最初の
結合とファイバー三量化の両方を仲介する（Henryら、J. Virol., 68(8), 5239-
46 (1994)）。三量化は、ファイバーのアミノ末端がペントンベースと正しく結
合するのにも必要であるらしい（Novelliら、Virology, 185, 365-76 (1991)）
。細胞レセプターの認識およびペントンベースとの結合に加えて、ファイバーは
血清型の保全に寄与し、また核局在化を仲介する。さらに、幾つかの血清型由来
のアデノウイルスファイバーはグリコシル化されている（例えば、Mullisら、J.
Virol., 64(11), 5317-23 (1990): Hongら、J. Virol., 70(10), 7071-78 (199
6): Chroboczekら、Adenovirus Fiber, 163-200頁、「The Molecular Repertoir
e of Adenoviruses I. Virion Structure and Function」、W. DoerflerおよびP
. Bohm編（Springer, NY 1995）を参照）。
【０００７】 異なるアデノウイルス血清型由来のファイバー蛋白質はかなり異なる。例えば
、シャフトリピートの数はアデノウイルス血清型間で異なる（Greenら、EMBO J.
, 2, 1357-65 (1983)）。さらに、密接に関連するＡｄ２およびＡｄ５血清型由
来のノブ領域は、アミノ酸レベルで６３％しか類似しておらず（Chroboczekら、
Virology, 186, 280-85 (1992)）、Ａｄ２およびＡｄ３ファイバーノブは２０％
同一でしかない（Signasら、J. Virol., 53, 672-78 (1985)）。対照的に、Ａｄ
５およびＡｄ２のペントンベース配列は９９％同一である。ノブ領域におけるこ
のような相違にも関わらず、Ａｄ２およびＡｄ３ファイバー遺伝子の配列比較で
さえも目立って保存されている領域のあることが示され、これらの大部分は他の
ヒトアデノウイルスファイバーの間でも保存されている（例えば、図１Ａ〜２Ｂ
を参照）。
、シャフトリピートの数はアデノウイルス血清型間で異なる（Greenら、EMBO J.
, 2, 1357-65 (1983)）。さらに、密接に関連するＡｄ２およびＡｄ５血清型由
来のノブ領域は、アミノ酸レベルで６３％しか類似しておらず（Chroboczekら、
Virology, 186, 280-85 (1992)）、Ａｄ２およびＡｄ３ファイバーノブは２０％
同一でしかない（Signasら、J. Virol., 53, 672-78 (1985)）。対照的に、Ａｄ
５およびＡｄ２のペントンベース配列は９９％同一である。ノブ領域におけるこ
のような相違にも関わらず、Ａｄ２およびＡｄ３ファイバー遺伝子の配列比較で
さえも目立って保存されている領域のあることが示され、これらの大部分は他の
ヒトアデノウイルスファイバーの間でも保存されている（例えば、図１Ａ〜２Ｂ
を参照）。
【０００８】 アデノウイルスビリオンと宿主動物との間の１つの相互作用は、細胞感染のプ
ロセスであり、この間、野生型ビリオンはまず、細胞のアデノウイルスレセプタ
ー（ＡＲ）（例えば、コクサッキーウイルスおよびアデノウイルスレセプター（
ＣＡＲ）、ＭＨＣクラスＩレセプターなど）によって細胞表面に結合する（Berg
elsonら、Science, 275, 1320-23 (1997): Tanakoら、Proc. Nat. Acad. Sci. (
USA), 94, 3352-56 (1997), Hongら、EMBO J., 16(9), 2294-06 (1997)）。ＡＲ
に接着した後、ウイルスはαvインテグリンに結合する。これらの細胞表面蛋白
質への接着後に、レセプターを仲介したエンドサイトーシス小胞中へのウイルス
のインターナリゼーションによって感染が進行する（Svenssonら、J. Virol., 5
1, 687-94 (1984): Chardonnetら、Virology, 40, 462-77 (1970)）。細胞内で
ビリオンは分解し（Greberら、Cell, 75, 477-86 (1993)）、エンドソームは破
壊され（Fitzgeraldら、Cell, 32, 607-17 (1983)）、ウイルス粒子は核孔複合
体を介して核に輸送される（Dalesら、Virology, 56, 465-83 (1973)）。大部分
のアデノウイルス血清型は広く散在した細胞表面蛋白質を通じて細胞と相互作用
するので、アデノウイルスに感染する天然の宿主細胞域は広範である。
ロセスであり、この間、野生型ビリオンはまず、細胞のアデノウイルスレセプタ
ー（ＡＲ）（例えば、コクサッキーウイルスおよびアデノウイルスレセプター（
ＣＡＲ）、ＭＨＣクラスＩレセプターなど）によって細胞表面に結合する（Berg
elsonら、Science, 275, 1320-23 (1997): Tanakoら、Proc. Nat. Acad. Sci. (
USA), 94, 3352-56 (1997), Hongら、EMBO J., 16(9), 2294-06 (1997)）。ＡＲ
に接着した後、ウイルスはαvインテグリンに結合する。これらの細胞表面蛋白
質への接着後に、レセプターを仲介したエンドサイトーシス小胞中へのウイルス
のインターナリゼーションによって感染が進行する（Svenssonら、J. Virol., 5
1, 687-94 (1984): Chardonnetら、Virology, 40, 462-77 (1970)）。細胞内で
ビリオンは分解し（Greberら、Cell, 75, 477-86 (1993)）、エンドソームは破
壊され（Fitzgeraldら、Cell, 32, 607-17 (1983)）、ウイルス粒子は核孔複合
体を介して核に輸送される（Dalesら、Virology, 56, 465-83 (1973)）。大部分
のアデノウイルス血清型は広く散在した細胞表面蛋白質を通じて細胞と相互作用
するので、アデノウイルスに感染する天然の宿主細胞域は広範である。
【０００９】 細胞感染に加えて、宿主動物は、ウイルスの有効自由力価(free titer)を減少
させる機構によって、アデノウイルスビリオンの存在に対して防御的に反応する
。例えば、宿主免疫系は、所定のアデノウイルス血清型に曝されると、中和抗体
を効率よく発生することができ、反復投与によりウイルスの有効自由力価を大い
に減少させる（例えば、Setoguchiら、Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 10,
369-77 (1994); Kass-Eislerら、Gene Ther., 1, 395-402 (1994); Kass-Eisler
ら、Gene Ther., 3, 154-62 (1996)を参照）。興味深いことには、このような抗
体は、通常、アデノウイルス血清型特異性の同一の決定基を指向し、主として超
可変ヘキソン領域に、また幾分はファイバーおよびペントンベースドメインを指
向する（Watsonら、前出; Wolfortら、(1988)、前出; Wolfortら、(1985)、前出
; Crawford-Mikszaら、前出）。もちろん、アデノウイルスの存在は、血清型に
依存するかたちでヒトの赤血球を凝集させる（Hierholzer, J. Infect. Disease
s, 123(4), 541-50 (1973)）。さらに、アデノウイルスビリオンは、細網内皮系
（ＲＥＳ）の細胞によって循環から活発に捕捉される（例えば、Worgallら、Hum
Gene Ther., 8, 1675-84 (1997); Wolffら、J. Virol., 71(1), 624-29 (1997)
を参照）。このような応答では、クッパー細胞、内皮肝細胞、または他のRES細
胞は、循環からウイルスを捕捉する（一般に、Moghiniら、Crit. Rev. Ther. Dr
ug Carrier Sys., 11(1), 31-59 (1994); Van Rooijenら、J. Leuk. Biol., 62,
702-09 (1997)を参照）。例えば、おそらくコレクチンとグリコシル化ウイルス
蛋白質との間に相互作用はあるが、ビリオンがオプソニン化され、このようなＲ
ＥＳ細胞による認識が誘発され得る。あるいは、このような細胞は、ビリオン表
面上の荷電したアミノ酸残基を認識するのかもしれない（Hansenら、Immunobiol
., 199(2), 165-89 (1998);Jahrlingら、J. Med. Virol., 12(1), 1-16 (1983)
を参照）。
させる機構によって、アデノウイルスビリオンの存在に対して防御的に反応する
。例えば、宿主免疫系は、所定のアデノウイルス血清型に曝されると、中和抗体
を効率よく発生することができ、反復投与によりウイルスの有効自由力価を大い
に減少させる（例えば、Setoguchiら、Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 10,
369-77 (1994); Kass-Eislerら、Gene Ther., 1, 395-402 (1994); Kass-Eisler
ら、Gene Ther., 3, 154-62 (1996)を参照）。興味深いことには、このような抗
体は、通常、アデノウイルス血清型特異性の同一の決定基を指向し、主として超
可変ヘキソン領域に、また幾分はファイバーおよびペントンベースドメインを指
向する（Watsonら、前出; Wolfortら、(1988)、前出; Wolfortら、(1985)、前出
; Crawford-Mikszaら、前出）。もちろん、アデノウイルスの存在は、血清型に
依存するかたちでヒトの赤血球を凝集させる（Hierholzer, J. Infect. Disease
s, 123(4), 541-50 (1973)）。さらに、アデノウイルスビリオンは、細網内皮系
（ＲＥＳ）の細胞によって循環から活発に捕捉される（例えば、Worgallら、Hum
Gene Ther., 8, 1675-84 (1997); Wolffら、J. Virol., 71(1), 624-29 (1997)
を参照）。このような応答では、クッパー細胞、内皮肝細胞、または他のRES細
胞は、循環からウイルスを捕捉する（一般に、Moghiniら、Crit. Rev. Ther. Dr
ug Carrier Sys., 11(1), 31-59 (1994); Van Rooijenら、J. Leuk. Biol., 62,
702-09 (1997)を参照）。例えば、おそらくコレクチンとグリコシル化ウイルス
蛋白質との間に相互作用はあるが、ビリオンがオプソニン化され、このようなＲ
ＥＳ細胞による認識が誘発され得る。あるいは、このような細胞は、ビリオン表
面上の荷電したアミノ酸残基を認識するのかもしれない（Hansenら、Immunobiol
., 199(2), 165-89 (1998);Jahrlingら、J. Med. Virol., 12(1), 1-16 (1983)
を参照）。
【００１０】 遺伝子導入ベクターとしてのアデノウイルスのポピュラーさに基づいて、ある
特定の細胞（例えば、アデノウイルスが感染しないいくつかの細胞）にアデノウ
イルスが侵入する能力を増大させる試み（このアプローチを「ターゲッティング
」という）がなされている（例えば、国際特許出願WO 95/26412（Curielら）、
国際特許出願WO 94/10323（Spoonerら）、米国特許第5,543,328号（McClelland
ら）、国際特許出願WO 94/24299（Cottonら）を参照）。もちろん、アデノウイ
ルスをある特定の細胞種にターゲッティングできることは重要な目的であるが、
所望の細胞種のみを感染させるアデノウイルスがよりいっそう望ましく、このア
プローチを「選択的ターゲッティング」という。しかし、ウイルスを独占的にタ
ーゲッティングさせるためには、まず、天然のアデノウイルス標的細胞の完全な
セットに増殖的に感染し得ない組換えアデノウイルスを産生させて、宿主細胞Ａ
Ｒに対するウイルスのネイティブな親和性を阻害しなければならない。アデノウ
イルスのネイティブな細胞親和性の阻害を目的とした試みは、論理的にはファイ
バーノブを変化させることに集中してきた。これらの試みは、主として安定な三
量化およびペントンベースとの結合という重要なファイバー蛋白質の機能を保持
させることができなかったために、期待外れのものであった（Spoonerら、前出
）。さらに、ファイバーノブを細胞表面リガンドで置換すると（McClellandら、
前出）、そのリガンドを有する細胞種の感染にのみ適したウイルスが産生される
。このような戦略は、野生型アデノウイルスに付随するのと同じターゲッティン
グに関する問題の多くを有するウイルスを産生するので（ファイバー三量化と細
胞指向性は、同じ蛋白質ドメインによって仲介される）、ベクターのフレキシビ
リティーを減じさせる。さらに、増殖させる細胞株を保有する必要性、およびフ
ァイバー三量化と標的化機能との間の一体不可分な関係のせいで、ターゲッティ
ングが置換された変異体ウイルスを得ることは困難である。例えば、ファイバー
ノブを除去し、それを非三量化リガンドで置換すると（例えば、Spoonerら、McC
lellandら、前出）、かなりの程度のファイバー蛋白質を欠くウイルスが得られ
る。
特定の細胞（例えば、アデノウイルスが感染しないいくつかの細胞）にアデノウ
イルスが侵入する能力を増大させる試み（このアプローチを「ターゲッティング
」という）がなされている（例えば、国際特許出願WO 95/26412（Curielら）、
国際特許出願WO 94/10323（Spoonerら）、米国特許第5,543,328号（McClelland
ら）、国際特許出願WO 94/24299（Cottonら）を参照）。もちろん、アデノウイ
ルスをある特定の細胞種にターゲッティングできることは重要な目的であるが、
所望の細胞種のみを感染させるアデノウイルスがよりいっそう望ましく、このア
プローチを「選択的ターゲッティング」という。しかし、ウイルスを独占的にタ
ーゲッティングさせるためには、まず、天然のアデノウイルス標的細胞の完全な
セットに増殖的に感染し得ない組換えアデノウイルスを産生させて、宿主細胞Ａ
Ｒに対するウイルスのネイティブな親和性を阻害しなければならない。アデノウ
イルスのネイティブな細胞親和性の阻害を目的とした試みは、論理的にはファイ
バーノブを変化させることに集中してきた。これらの試みは、主として安定な三
量化およびペントンベースとの結合という重要なファイバー蛋白質の機能を保持
させることができなかったために、期待外れのものであった（Spoonerら、前出
）。さらに、ファイバーノブを細胞表面リガンドで置換すると（McClellandら、
前出）、そのリガンドを有する細胞種の感染にのみ適したウイルスが産生される
。このような戦略は、野生型アデノウイルスに付随するのと同じターゲッティン
グに関する問題の多くを有するウイルスを産生するので（ファイバー三量化と細
胞指向性は、同じ蛋白質ドメインによって仲介される）、ベクターのフレキシビ
リティーを減じさせる。さらに、増殖させる細胞株を保有する必要性、およびフ
ァイバー三量化と標的化機能との間の一体不可分な関係のせいで、ターゲッティ
ングが置換された変異体ウイルスを得ることは困難である。例えば、ファイバー
ノブを除去し、それを非三量化リガンドで置換すると（例えば、Spoonerら、McC
lellandら、前出）、かなりの程度のファイバー蛋白質を欠くウイルスが得られ
る。
【００１１】 上述したウイルスの広い天然の指向異性に加えて、アデノウイルスと宿主との
間の非感染性の相互作用もまた、遺伝子導入ベクターとしてアデノウイルスを使
用するのに問題を持ち込む。このような相互作用は、所定用量のアデノウイルス
の自由力価を、臨床的に有効である力価よりも低い値に効果的に減少させる。そ
のようなことから、現在、宿主動物とのこのような生来の相互作用に対して、親
和性が低下した（例えば、標的細胞親和性、先天性または後天性免疫サーベイラ
ンスなど）を示すアデノウイルスの必要性がある。さらに、予め決められた組織
内に所望の導入遺伝子を送達し、発現させ得るウイルス（選択的にターゲッティ
ングされるウイルス）の必要性がある。
間の非感染性の相互作用もまた、遺伝子導入ベクターとしてアデノウイルスを使
用するのに問題を持ち込む。このような相互作用は、所定用量のアデノウイルス
の自由力価を、臨床的に有効である力価よりも低い値に効果的に減少させる。そ
のようなことから、現在、宿主動物とのこのような生来の相互作用に対して、親
和性が低下した（例えば、標的細胞親和性、先天性または後天性免疫サーベイラ
ンスなど）を示すアデノウイルスの必要性がある。さらに、予め決められた組織
内に所望の導入遺伝子を送達し、発現させ得るウイルス（選択的にターゲッティ
ングされるウイルス）の必要性がある。
【００１２】 発明の簡単な要約 本発明は、アデノウイルスファイバー蛋白質のアミノ末端を有し且つ三量化ド
メインを有する組換え蛋白質を提供する。このような蛋白質を組み込んだファイ
バーは、天然の基質に対する親和性が、野生型アデノウイルスファイバー三量体
よりも低下している。本発明はさらに、本発明の組換え蛋白質を組み込んだアデ
ノウイルスを提供する。
メインを有する組換え蛋白質を提供する。このような蛋白質を組み込んだファイ
バーは、天然の基質に対する親和性が、野生型アデノウイルスファイバー三量体
よりも低下している。本発明はさらに、本発明の組換え蛋白質を組み込んだアデ
ノウイルスを提供する。
【００１３】 本発明は、最少の異所性（ectopic）感染で所望の遺伝子を細胞に送達するた
めのベクターとして、インビトロおよびインビボでの種々の遺伝子導入用途に有
用である。特に、本発明は、遺伝子導入用途のためのより安全なベクターのより
効率的な産生および構築を可能にする。本発明はまた、細胞のアデノウイルス接
着および感染の研究のための方法および試薬を提供することによる研究ツールと
して、およびレセプター−リガンド相互作用のアッセイ方法において有用である
。同様に、組換えファイバー蛋白質は、レセプター−リガンドアッセイにおいて
、およびインビトロまたはインビボでの接着蛋白質として使用することができる
。さらに、本発明は、生物学者がウイルスの増殖および感染の細胞生物学を研究
するのを可能にする試薬および方法を提供する。従って、本発明のベクターは生
物学的研究において非常に有用である。
めのベクターとして、インビトロおよびインビボでの種々の遺伝子導入用途に有
用である。特に、本発明は、遺伝子導入用途のためのより安全なベクターのより
効率的な産生および構築を可能にする。本発明はまた、細胞のアデノウイルス接
着および感染の研究のための方法および試薬を提供することによる研究ツールと
して、およびレセプター−リガンド相互作用のアッセイ方法において有用である
。同様に、組換えファイバー蛋白質は、レセプター−リガンドアッセイにおいて
、およびインビトロまたはインビボでの接着蛋白質として使用することができる
。さらに、本発明は、生物学者がウイルスの増殖および感染の細胞生物学を研究
するのを可能にする試薬および方法を提供する。従って、本発明のベクターは生
物学的研究において非常に有用である。
【００１４】 発明の詳細な説明 組換え蛋白質 本発明は、アデノウイルスファイバー蛋白質由来のアミノ末端を有し且つ三量
化ドメインを有する組換えアデノウイルスファイバー蛋白質を提供する。このよ
うな組換え蛋白質を含む三量体は、天然アデノウイルスファイバー三量体と比較
して、天然の基質（例えば、抗体、コレクチン、オプシン、細胞結合部位など）
（すなわち、シャフトおよび特にアミノ末端がはっきり相違する血清型に対して
天然）に対する親和性が低下している。三量体は、ホモトリマーであっても異な
るファイバーモノマーのヘテロトリマーであってもよい。得られる三量体の、天
然の細胞表面結合部位（すなわち、天然ＡＲ）に対する親和性を低下させるいか
なるモノマー単位の改変も、本発明の範囲内である。好ましくは、親和性の低下
は、対応する非改変ファイバーに対して、実質的な親和性の低下（例えば、少な
くとも１桁、好ましくはそれ以上）である。
化ドメインを有する組換えアデノウイルスファイバー蛋白質を提供する。このよ
うな組換え蛋白質を含む三量体は、天然アデノウイルスファイバー三量体と比較
して、天然の基質（例えば、抗体、コレクチン、オプシン、細胞結合部位など）
（すなわち、シャフトおよび特にアミノ末端がはっきり相違する血清型に対して
天然）に対する親和性が低下している。三量体は、ホモトリマーであっても異な
るファイバーモノマーのヘテロトリマーであってもよい。得られる三量体の、天
然の細胞表面結合部位（すなわち、天然ＡＲ）に対する親和性を低下させるいか
なるモノマー単位の改変も、本発明の範囲内である。好ましくは、親和性の低下
は、対応する非改変ファイバーに対して、実質的な親和性の低下（例えば、少な
くとも１桁、好ましくはそれ以上）である。
【００１５】 述べたように、三量化ドメインがそれ自体天然の細胞表面結合部位に対するリ
ガンドである場合、このような三量化ドメインを有するファイバー蛋白質は、天
然のアデノウイルスファイバー三量化ドメインと同じいくつかのターゲッティン
グに関する問題を生じさせる。従って、本発明の蛋白質の三量化ドメインは、Ｃ
ＡＲやＭＨＣ−１細胞表面蛋白質に対するリガンドでないことが好ましい。最も
好ましくは、非天然の三量化ドメインは、この部位がＡＲであろうと他の細胞表
面結合部位であろうと、いずれの天然アデノウイルス細胞表面結合部位に対する
リガンドでもない。本明細書中で論じるように、このような蛋白質を組み込んだ
アデノウイルスは、天然のＡＲ蛋白質を介して細胞を感染させる能力がかなりの
程度低下しており、選択的にターゲッティングされるベクターを工作するための
効率的なソースベクターとして役立ち得る。従って、三量化ドメインは細胞表面
結合部位に対するリガンドでないことが好ましいが、三量体全体としてはそのよ
うなリガンドであってもよい（例えば、本明細書中で論じるような非天然リガン
ドに基づいて）。さらに、三量化ドメインは、天然の細胞表面結合部位以外の基
質に対するリガンドであってもよく、そのようなことから、三量化リガンドは、
細胞表面結合部位に対するリガンドである三量化ドメインと同じ細胞ターゲッテ
ィングに関する問題を生じない。従って、例えば、非天然の三量化ドメインは、
アフィニティーカラム上、血液に運搬される分子上の基質に対するリガンドであ
ってよく、あるいは天然の細胞表面結合部位でなければ、細胞表面上（例えば、
改変されていない細胞種に生来のものでない基質細胞表面蛋白質を発現するよう
に工作された細胞上）の基質に対するリガンドですらあってよい。
ガンドである場合、このような三量化ドメインを有するファイバー蛋白質は、天
然のアデノウイルスファイバー三量化ドメインと同じいくつかのターゲッティン
グに関する問題を生じさせる。従って、本発明の蛋白質の三量化ドメインは、Ｃ
ＡＲやＭＨＣ−１細胞表面蛋白質に対するリガンドでないことが好ましい。最も
好ましくは、非天然の三量化ドメインは、この部位がＡＲであろうと他の細胞表
面結合部位であろうと、いずれの天然アデノウイルス細胞表面結合部位に対する
リガンドでもない。本明細書中で論じるように、このような蛋白質を組み込んだ
アデノウイルスは、天然のＡＲ蛋白質を介して細胞を感染させる能力がかなりの
程度低下しており、選択的にターゲッティングされるベクターを工作するための
効率的なソースベクターとして役立ち得る。従って、三量化ドメインは細胞表面
結合部位に対するリガンドでないことが好ましいが、三量体全体としてはそのよ
うなリガンドであってもよい（例えば、本明細書中で論じるような非天然リガン
ドに基づいて）。さらに、三量化ドメインは、天然の細胞表面結合部位以外の基
質に対するリガンドであってもよく、そのようなことから、三量化リガンドは、
細胞表面結合部位に対するリガンドである三量化ドメインと同じ細胞ターゲッテ
ィングに関する問題を生じない。従って、例えば、非天然の三量化ドメインは、
アフィニティーカラム上、血液に運搬される分子上の基質に対するリガンドであ
ってよく、あるいは天然の細胞表面結合部位でなければ、細胞表面上（例えば、
改変されていない細胞種に生来のものでない基質細胞表面蛋白質を発現するよう
に工作された細胞上）の基質に対するリガンドですらあってよい。
【００１６】 組換えファイバー蛋白質は、本明細書中に記載するように、かなり多数の残基
、または同定可能なドメインでさえ欠いてよい。例えば、該蛋白質は、天然のノ
ブドメインを欠いてもよいし、１または２以上の天然シャフトβシートの反復を
欠いてもよいし、そうでなければ末端を切断してもよい。従って、組換えファイ
バー蛋白質は、真核細胞によって産生された際に三量化する限り、いかなる所望
の改変も有することができる。さらに、組換えファイバー蛋白質は、組換えファ
イバー蛋白質を組み込んだファイバーがペントンベースと正しく相互作用するこ
とを確実にするために、アミノ末端ではあまり改変しないことが好ましい（例え
ば、単量体のアミノ末端は、実質的に天然のファイバーアミノ末端からなること
が好ましい）。従って、本発明はまた、本発明の組換えファイバー蛋白質および
アデノウイルスペントンベースを含む組成物を提供する。好ましくは、組換えフ
ァイバー蛋白質およびペントンベースは、野生型ファイバーおよびペントンベー
スと同じ様式で結合する。もちろん、ペントンベースも、例えば、非天然リガン
ド（例えば、米国特許第5,559,099（Wickhamら）に記載のようなもの）を含むよ
うに改変することができる。
、または同定可能なドメインでさえ欠いてよい。例えば、該蛋白質は、天然のノ
ブドメインを欠いてもよいし、１または２以上の天然シャフトβシートの反復を
欠いてもよいし、そうでなければ末端を切断してもよい。従って、組換えファイ
バー蛋白質は、真核細胞によって産生された際に三量化する限り、いかなる所望
の改変も有することができる。さらに、組換えファイバー蛋白質は、組換えファ
イバー蛋白質を組み込んだファイバーがペントンベースと正しく相互作用するこ
とを確実にするために、アミノ末端ではあまり改変しないことが好ましい（例え
ば、単量体のアミノ末端は、実質的に天然のファイバーアミノ末端からなること
が好ましい）。従って、本発明はまた、本発明の組換えファイバー蛋白質および
アデノウイルスペントンベースを含む組成物を提供する。好ましくは、組換えフ
ァイバー蛋白質およびペントンベースは、野生型ファイバーおよびペントンベー
スと同じ様式で結合する。もちろん、ペントンベースも、例えば、非天然リガン
ド（例えば、米国特許第5,559,099（Wickhamら）に記載のようなもの）を含むよ
うに改変することができる。
【００１７】 １つの実施態様においては、ファイバーを改変して、先天性または後天性宿主
免疫系とあまり相互作用できないようにする。例えば、天然ファイバー蛋白質の
１または２以上のアミノ酸を変異させて、組換えファイバー蛋白質が野生型ファ
イバーよりも中和抗体によって認識されにくいようにすることができる（例えば
、国際特許出願WO 98/40509（Crystalら）を参照）。ファイバーはまた、ＲＥＳ
との相互作用を仲介する１または２以上のアミノ酸を欠くように改変することも
できる。例えば、１または２以上のグリコシル化またはリン酸化部位を欠くよう
にファイバーを変異させることができ、あるいはファイバー（またはファイバー
を含むウイルス）を、グリコシル化またはリン酸化のインヒビターの存在下で産
生させることができる。同様に、ファイバー（またはウイルス内の他の蛋白質）
を１級アミン基、エポキシ基、またはジアシルグリセロール基を含むポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）の脂質誘導体に結合させて（例えば、Kilbanovら、FEBS
Lett., 268, 235 (1990); Seniorら、Biochem. Biophys. Acta., 1062, 11 (19
91); Allenら、Biochem. Biophys. Acta., 1066, 29 (1991); Moriら、FEBS Let
t., 284, 263 (1991)を参照）、コレクチンおよび／またはオプソニンとの結合
あるいはクッパー（または他のＲＥＳ）細胞による捕捉を回避することができる
。
免疫系とあまり相互作用できないようにする。例えば、天然ファイバー蛋白質の
１または２以上のアミノ酸を変異させて、組換えファイバー蛋白質が野生型ファ
イバーよりも中和抗体によって認識されにくいようにすることができる（例えば
、国際特許出願WO 98/40509（Crystalら）を参照）。ファイバーはまた、ＲＥＳ
との相互作用を仲介する１または２以上のアミノ酸を欠くように改変することも
できる。例えば、１または２以上のグリコシル化またはリン酸化部位を欠くよう
にファイバーを変異させることができ、あるいはファイバー（またはファイバー
を含むウイルス）を、グリコシル化またはリン酸化のインヒビターの存在下で産
生させることができる。同様に、ファイバー（またはウイルス内の他の蛋白質）
を１級アミン基、エポキシ基、またはジアシルグリセロール基を含むポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）の脂質誘導体に結合させて（例えば、Kilbanovら、FEBS
Lett., 268, 235 (1990); Seniorら、Biochem. Biophys. Acta., 1062, 11 (19
91); Allenら、Biochem. Biophys. Acta., 1066, 29 (1991); Moriら、FEBS Let
t., 284, 263 (1991)を参照）、コレクチンおよび／またはオプソニンとの結合
あるいはクッパー（または他のＲＥＳ）細胞による捕捉を回避することができる
。
【００１８】 本明細書中に記載するように、１または２以上のアミノ酸を欠く組換えファイ
バー蛋白質は、任意で、欠失した天然アミノ酸に加えて（すなわち、挿入）、あ
るいはその代わりに（すなわち、置換）非天然残基（例えば、数個の非天然のア
ミノ酸）を含むことができる。あるいは、もちろん、天然アミノ酸をノブから欠
失させてもよい。好ましくは、アミノ酸は、トポロジー、特に三量化を保存する
ために別の非天然アミノ酸で置換される。さらに、置換される場合、置換アミノ
酸は組換えファイバー蛋白質に新規な性質を与えることが好ましい。例えば、天
然の基質への結合を最大限除去するために、天然のアミノ酸を異なる電荷を有す
る残基（または複数の残基）で置換することができる。このような置換は、天然
アデノウイルスノブドメインと細胞ＡＲとの間の静電相互作用を最大限妨害する
か、あるいはＡＲまたはＲＥＳのエレメントと効率よく結合するのに必要なコン
フォメーション変化を妨害する。同様に、天然アミノ酸を、可能であれば、異な
る重量の残基（または複数の残基）で置換することができる。例えば、より重量
の重い残基での置換は、そのようなより重量の重い残基上のより長い側鎖によっ
て、アデノウイルスドメインと天然基質との間の立体相互作用を最大限妨害する
。
バー蛋白質は、任意で、欠失した天然アミノ酸に加えて（すなわち、挿入）、あ
るいはその代わりに（すなわち、置換）非天然残基（例えば、数個の非天然のア
ミノ酸）を含むことができる。あるいは、もちろん、天然アミノ酸をノブから欠
失させてもよい。好ましくは、アミノ酸は、トポロジー、特に三量化を保存する
ために別の非天然アミノ酸で置換される。さらに、置換される場合、置換アミノ
酸は組換えファイバー蛋白質に新規な性質を与えることが好ましい。例えば、天
然の基質への結合を最大限除去するために、天然のアミノ酸を異なる電荷を有す
る残基（または複数の残基）で置換することができる。このような置換は、天然
アデノウイルスノブドメインと細胞ＡＲとの間の静電相互作用を最大限妨害する
か、あるいはＡＲまたはＲＥＳのエレメントと効率よく結合するのに必要なコン
フォメーション変化を妨害する。同様に、天然アミノ酸を、可能であれば、異な
る重量の残基（または複数の残基）で置換することができる。例えば、より重量
の重い残基での置換は、そのようなより重量の重い残基上のより長い側鎖によっ
て、アデノウイルスドメインと天然基質との間の立体相互作用を最大限妨害する
。
【００１９】 ノブと天然の細胞ＡＲとの間の相互作用を仲介または援助するいずれのアミノ
酸残基も、組換えファイバー蛋白質からの変異または欠失に適したアミノ酸であ
る。このようなアミノ酸は、それ自体ファイバーとレセプターとの間の接触部位
である必要はない。例えば、天然のアミノ酸は、レセプターとの結合に関係する
コンフォメーション変化に関与してもよい。本発明のファイバー蛋白質は、凝集
体において組換えファイバー蛋白質が会合して三量体を形成することができる限
り、このような天然アミノ酸をいくら欠いてもよい。アミノ酸は、ノブのβシー
ト内、または２つのβシートを連結するループ（例えば、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、Ｄ
Ｅ、ＥＦ、ＦＧ、ＧＨ、ＨＩ、またはＩＪループ）内にあり得る。実際、アミノ
酸は、βシートまたはループの１０残基内（例えば、５残基内）にあり得る。本
発明の成熟折り畳み三量体では、アミノ酸は、βシートまたはループの約１０ｎ
ｍ内（例えば、約５ｎｍ内または約２ｎｍ内）にあり得る。
酸残基も、組換えファイバー蛋白質からの変異または欠失に適したアミノ酸であ
る。このようなアミノ酸は、それ自体ファイバーとレセプターとの間の接触部位
である必要はない。例えば、天然のアミノ酸は、レセプターとの結合に関係する
コンフォメーション変化に関与してもよい。本発明のファイバー蛋白質は、凝集
体において組換えファイバー蛋白質が会合して三量体を形成することができる限
り、このような天然アミノ酸をいくら欠いてもよい。アミノ酸は、ノブのβシー
ト内、または２つのβシートを連結するループ（例えば、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、Ｄ
Ｅ、ＥＦ、ＦＧ、ＧＨ、ＨＩ、またはＩＪループ）内にあり得る。実際、アミノ
酸は、βシートまたはループの１０残基内（例えば、５残基内）にあり得る。本
発明の成熟折り畳み三量体では、アミノ酸は、βシートまたはループの約１０ｎ
ｍ内（例えば、約５ｎｍ内または約２ｎｍ内）にあり得る。
【００２０】 改変または欠失のための天然のアミノ酸残基は、任意の方法によって選択する
ことができる。例えば、異なるアデノウイルス血清型由来の配列（当該分野で公
知である）を比較して、おそらくＡＲとの結合を仲介するであろう保存残基を推
定することができる。その代わりに、あるいは組み合わせて、配列を蛋白質の３
次元的表現（例えば、結晶構造）上にマッピングして、ＡＲとの結合を担う可能
性が最も高い残基を推定することができる。蛋白質の構造的・機能的相互作用を
推定するための任意の一般的なアルゴリズムまたはプログラムを用いることによ
ってこれらの分析を支援することができる。あるいは、クローン化したアデノウ
イルスファイバー発現カセット中にランダムな変異を導入することができる。蛋
白質にランダム変異を導入する１つの方法は、Ｔａｑポリメラーゼによるもので
ある。例えば、ファイバーノブをコードするクローン（例えば、Roelvinkら、J.
Virol., 70 7614-21 (1996)）を、アデノウイルスファイバーノブまたはその一
部分のＰＣＲ増幅用のテンプレートとして役立てることができる。ＰＣＲ反応に
おける２価カチオンの濃度を変化させることによって、転写産物のエラー率を概
ね前もって決定することができる（例えば、Weissら、J. Virol., 71, 4385-94
(1997); Zhouら、Nucl. Acid. Res., 19, 6052 (1991)を参照）。次いで、ＰＣ
Ｒ産物をテンプレートベクター中にサブクローニングし直して、ＰＣＲ反応用の
ソースとして使用したファイバーコード配列内の配列を置換することができる。
そのようにしてファイバーのライブラリーを作製すると、それらのいくつかは、
三量化する能力を保持しつつ、天然のＡＲとの結合を減じさせる変異を有してい
るだろう。
ことができる。例えば、異なるアデノウイルス血清型由来の配列（当該分野で公
知である）を比較して、おそらくＡＲとの結合を仲介するであろう保存残基を推
定することができる。その代わりに、あるいは組み合わせて、配列を蛋白質の３
次元的表現（例えば、結晶構造）上にマッピングして、ＡＲとの結合を担う可能
性が最も高い残基を推定することができる。蛋白質の構造的・機能的相互作用を
推定するための任意の一般的なアルゴリズムまたはプログラムを用いることによ
ってこれらの分析を支援することができる。あるいは、クローン化したアデノウ
イルスファイバー発現カセット中にランダムな変異を導入することができる。蛋
白質にランダム変異を導入する１つの方法は、Ｔａｑポリメラーゼによるもので
ある。例えば、ファイバーノブをコードするクローン（例えば、Roelvinkら、J.
Virol., 70 7614-21 (1996)）を、アデノウイルスファイバーノブまたはその一
部分のＰＣＲ増幅用のテンプレートとして役立てることができる。ＰＣＲ反応に
おける２価カチオンの濃度を変化させることによって、転写産物のエラー率を概
ね前もって決定することができる（例えば、Weissら、J. Virol., 71, 4385-94
(1997); Zhouら、Nucl. Acid. Res., 19, 6052 (1991)を参照）。次いで、ＰＣ
Ｒ産物をテンプレートベクター中にサブクローニングし直して、ＰＣＲ反応用の
ソースとして使用したファイバーコード配列内の配列を置換することができる。
そのようにしてファイバーのライブラリーを作製すると、それらのいくつかは、
三量化する能力を保持しつつ、天然のＡＲとの結合を減じさせる変異を有してい
るだろう。
【００２１】 列挙したこれらの残基に対応するＡｄ５以外の株由来のノブのアミノ酸は、異
なるアデノウイルス株のファイバー配列間の比較によって明らかであり、このよ
うな対応を決定する任意の適切な方法を使用することができる（例えば、ＰＡＭ
１００残基重量表を用いるClusal法、ＰＡＭ２５０残基重量表を用いるJ. Hain
法など）。このようなＡｄファイバー蛋白質のノブの配列比較の例（配列番号５
〜２５）を図１Ａ〜２Ｂに示す。このような比較によって、記載のように変異し
た結果ＡＲとの結合が減じたファイバー三量体を生じる他の血清型由来の残基（
例えば、保存された残基）を同定することができる（例えば、配列番号２９〜３
２を参照）。従って、例えば、ＣＡＲ結合ファイバーについては、好ましくは変
異させるべきアミノ酸は、天然Ａｄ５ファイバー蛋白質（配列番号１）の残基４
０４〜４０６、４０８、４０９、４１２〜４１７、４２０、４３９、４４１、４
４２、４４９〜４５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６６、４６７、４
６９〜４７２、４７４〜４７７、４８２、４８５、４８７〜４９２、５０５〜５
１２、５１５、５１７、５１９、５２１〜５２８、５３３、５３５、５３７〜５
４９、５５１、５５３、５５５、５５９〜５６８、５８０または５８１に対応す
るアミノ酸の１０アミノ酸以内（例えば、約５アミノ酸以内）または約１０ｎｍ
以内（例えば、約５ｎｍ以内）にある。より好ましくは、変異させるべきアミノ
酸は、これらの残基の少なくとも１つ、例えば、天然Ａｄ９ファイバー蛋白質（
配列番号３）のアミノ酸１８９、１９０、１９８、２０１、または２６２、ある
いは天然Ａｄ４１長ファイバー蛋白質（配列番号２）のアミノ酸３９５、３９６
、４０４、４０７、または４７０に対応する。いっそう好ましくは、変異体ファ
イバー蛋白質は、天然Ａｄ５ファイバー蛋白質の残基４０８、４０９、４１２〜
４１７、４２０、４７７、または４８７〜４９１に対応する残基の少なくとも１
つの置換変異、あるいは天然Ａｄ５ファイバー蛋白質の残基４７４〜４７７また
は４８９〜４９２に対応する残基の少なくとも１つの欠失変異を含む。同様に、
Ｂ群ファイバーについては、変異させるべきアミノ酸は、天然Ａｄ３ファイバー
蛋白質（配列番号４）の残基１３６、１５５、１７７、１８１、１９８、２１０
、２１１、２１５、２３３、２３４、２３６、２３８、２４８、２５７、２６０
、２６１、２７６、２８４、３０２、３０３、３１７、または３１８に対応する
アミノ酸の１０アミノ酸以内（例えば、約５アミノ酸以内）または約１０ｎｍ以
内（例えば、約５ｎｍ以内）にある。
なるアデノウイルス株のファイバー配列間の比較によって明らかであり、このよ
うな対応を決定する任意の適切な方法を使用することができる（例えば、ＰＡＭ
１００残基重量表を用いるClusal法、ＰＡＭ２５０残基重量表を用いるJ. Hain
法など）。このようなＡｄファイバー蛋白質のノブの配列比較の例（配列番号５
〜２５）を図１Ａ〜２Ｂに示す。このような比較によって、記載のように変異し
た結果ＡＲとの結合が減じたファイバー三量体を生じる他の血清型由来の残基（
例えば、保存された残基）を同定することができる（例えば、配列番号２９〜３
２を参照）。従って、例えば、ＣＡＲ結合ファイバーについては、好ましくは変
異させるべきアミノ酸は、天然Ａｄ５ファイバー蛋白質（配列番号１）の残基４
０４〜４０６、４０８、４０９、４１２〜４１７、４２０、４３９、４４１、４
４２、４４９〜４５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６６、４６７、４
６９〜４７２、４７４〜４７７、４８２、４８５、４８７〜４９２、５０５〜５
１２、５１５、５１７、５１９、５２１〜５２８、５３３、５３５、５３７〜５
４９、５５１、５５３、５５５、５５９〜５６８、５８０または５８１に対応す
るアミノ酸の１０アミノ酸以内（例えば、約５アミノ酸以内）または約１０ｎｍ
以内（例えば、約５ｎｍ以内）にある。より好ましくは、変異させるべきアミノ
酸は、これらの残基の少なくとも１つ、例えば、天然Ａｄ９ファイバー蛋白質（
配列番号３）のアミノ酸１８９、１９０、１９８、２０１、または２６２、ある
いは天然Ａｄ４１長ファイバー蛋白質（配列番号２）のアミノ酸３９５、３９６
、４０４、４０７、または４７０に対応する。いっそう好ましくは、変異体ファ
イバー蛋白質は、天然Ａｄ５ファイバー蛋白質の残基４０８、４０９、４１２〜
４１７、４２０、４７７、または４８７〜４９１に対応する残基の少なくとも１
つの置換変異、あるいは天然Ａｄ５ファイバー蛋白質の残基４７４〜４７７また
は４８９〜４９２に対応する残基の少なくとも１つの欠失変異を含む。同様に、
Ｂ群ファイバーについては、変異させるべきアミノ酸は、天然Ａｄ３ファイバー
蛋白質（配列番号４）の残基１３６、１５５、１７７、１８１、１９８、２１０
、２１１、２１５、２３３、２３４、２３６、２３８、２４８、２５７、２６０
、２６１、２７６、２８４、３０２、３０３、３１７、または３１８に対応する
アミノ酸の１０アミノ酸以内（例えば、約５アミノ酸以内）または約１０ｎｍ以
内（例えば、約５ｎｍ以内）にある。
【００２２】 本発明の組換えファイバー蛋白質は、任意の適切な方法によって産生すること
ができる。例えば、変異体ファイバー蛋白質は、標準的な直接ペプチド合成技術
（例えば、Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, H
eidelberg: 1984に要約されている)、例えば、固相合成（例えば、Merrifield,
J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-54 (1963): およびBaranyら、Int. J. Peptide P
rotein Res., 30, 705-739 (1987)を参照）を用いて合成することができる。あ
るいは、改変部位を含む合成オリゴヌクレオチドを発現ベクターに連結すること
によって、部位特異的変異を組換えファイバー蛋白質中に導入することができる
。あるいは、プラスミド、オリゴヌクレオチド、または所望の変異をコードする
他のベクターを、アデノウイルスゲノム、または組換えファイバー蛋白質をコー
ドする発現ベクターと組み換えて、所望の変異を導入することができる。オリゴ
ヌクレオチド指向部位特異的変異誘発法もまた適している（例えば、Walderら、
Gene, 42, 133 (1986): Bauerら、Gene, 37, 73 (1985): Craik, Biotechniques
, 12-19 (1995): 米国特許第4,518,584号（Markら）および同第4,737,462号（Ma
rkら）。いかに操作されても、組換えファイバー蛋白質をコードするＤＮＡフラ
グメントは、周知の分子遺伝学的技術を用いて適当なベクター中にサブクローニ
ングすることができる。次いで、フラグメントを転写させ、続いて宿主細胞内で
インビトロにペプチドを翻訳させる。任意の適切な発現ベクター（例えば、Pouw
elsら、Cloning Vectors: A Laboratory Manual (Elsevior, NY:1985)）および
対応する適切な宿主細胞を、組換えペプチドの産生に使用することができる。発
現宿主としては、細菌種、酵母、哺乳動物または昆虫宿主細胞系（バキュロウイ
ルス系を含む）（例えば、Luckowら、Bio/Technology, 6, 47 (1988)）、および
樹立細胞株（例えば、ＨＥＫ−２９３、ＣＯＳ−７、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ
、ＨｅＬａ、ＢＨＫなど）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の改
変ファイバーを調製するのに特に好ましい発現系は、高レベルの組換え蛋白質産
生を可能にするので、バキュロウイルス発現系（Wickhamら、J. Virol., 70, 68
31-38 (1995)）である。もちろん、発現宿主の選択は、主として翻訳後修飾のせ
いで、産生されるペプチドのタイプに応じて細分化される。
ができる。例えば、変異体ファイバー蛋白質は、標準的な直接ペプチド合成技術
（例えば、Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, H
eidelberg: 1984に要約されている)、例えば、固相合成（例えば、Merrifield,
J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-54 (1963): およびBaranyら、Int. J. Peptide P
rotein Res., 30, 705-739 (1987)を参照）を用いて合成することができる。あ
るいは、改変部位を含む合成オリゴヌクレオチドを発現ベクターに連結すること
によって、部位特異的変異を組換えファイバー蛋白質中に導入することができる
。あるいは、プラスミド、オリゴヌクレオチド、または所望の変異をコードする
他のベクターを、アデノウイルスゲノム、または組換えファイバー蛋白質をコー
ドする発現ベクターと組み換えて、所望の変異を導入することができる。オリゴ
ヌクレオチド指向部位特異的変異誘発法もまた適している（例えば、Walderら、
Gene, 42, 133 (1986): Bauerら、Gene, 37, 73 (1985): Craik, Biotechniques
, 12-19 (1995): 米国特許第4,518,584号（Markら）および同第4,737,462号（Ma
rkら）。いかに操作されても、組換えファイバー蛋白質をコードするＤＮＡフラ
グメントは、周知の分子遺伝学的技術を用いて適当なベクター中にサブクローニ
ングすることができる。次いで、フラグメントを転写させ、続いて宿主細胞内で
インビトロにペプチドを翻訳させる。任意の適切な発現ベクター（例えば、Pouw
elsら、Cloning Vectors: A Laboratory Manual (Elsevior, NY:1985)）および
対応する適切な宿主細胞を、組換えペプチドの産生に使用することができる。発
現宿主としては、細菌種、酵母、哺乳動物または昆虫宿主細胞系（バキュロウイ
ルス系を含む）（例えば、Luckowら、Bio/Technology, 6, 47 (1988)）、および
樹立細胞株（例えば、ＨＥＫ−２９３、ＣＯＳ−７、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ
、ＨｅＬａ、ＢＨＫなど）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の改
変ファイバーを調製するのに特に好ましい発現系は、高レベルの組換え蛋白質産
生を可能にするので、バキュロウイルス発現系（Wickhamら、J. Virol., 70, 68
31-38 (1995)）である。もちろん、発現宿主の選択は、主として翻訳後修飾のせ
いで、産生されるペプチドのタイプに応じて細分化される。
【００２３】 産生されると、組換えファイバー蛋白質をファイバー蛋白質活性についてアッ
セイする。特に、組換えファイバー蛋白質の三量体形成能力、ペントンベースと
相互作用する能力、および天然の基質（例えば、抗体、ＡＲ、オプソニン、コレ
クチン、ＲＥＳ細胞など）と相互作用する能力をアッセイする。これらのパラメ
ーターを測定するのに任意の適切なアッセイを使用することができる。例えば、
不適切に折り畳まれた単量体は一般的に不溶性であるので（Scopes, 「Protein
Purification」（第３版、1994）、第９章、270〜82頁(Springer-Verlag, New Y
ork)）、三量化の１つのアッセイは、組換えファイバーが可溶性であるかどうか
である。ある量の放射性アミノ酸が合成中に蛋白質に組み込まれるかは、ファイ
バーの溶解性測定の助けとなる。組換えファイバー蛋白質を発現する宿主細胞由
来のライセートを遠心分離し、シンチレーションカウンターまたはウエスタン分
析によって上清およびペレットをアッセイすることができる。続いて、ペレット
および上清中の蛋白質を分離して（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で）、さら
なるアッセイ用にファイバー蛋白質を単離する。上清から単離されたファイバー
蛋白質の量に対するペレットから単離されたファイバー蛋白質の量の比較は、変
異体蛋白質が可溶性であるかどうかを示す。あるいは、ファイバーの三量体形態
のアミノ部分のみを認識するモノクローナル抗体を用いることによって、三量化
をアッセイすることができる（例えば、免疫沈降、ウエスタンブロッティングな
ど）。ファイバー三量体のみがそのように相互作用することができるので、三量
化の別の測定は、組換えファイバーがペントンベースと複合体を形成できること
である（NovelliおよびBoulanger, Virology, 185, 1189 (1995)）。この傾向は
、共免疫沈降、ゲル移動度シフトアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（煮沸したサンプ
ルは単量体として移動するが。そうでなければ、それらはより大きな蛋白質とし
て移動する）などによってアッセイすることができる。三量化のさらに別の測定
は、単量体に対する三量体の分子量の差を検出することである。例えば、煮沸し
変性させた三量体は、安定な非変性の三量体よりも、より低分子量として移動す
る（HongおよびAngler, J. Virol., 70, 7071-78 (1996)）。三量体組換えファ
イバーはまた、その天然の基質との結合能力についてアッセイすることができる
。例えば、宿主の先天性または後天性免疫系とのその相互作用を妨害するファイ
バーの改変は、ウイルスの自由力価を経時的に測定することによって達成するこ
とができる。これは、血清半減期、ＲＥＳに関連する器官（例えば、マウスおよ
びヒトの肝臓、ブタの肺など）への指向性を測定することによって、赤血球の凝
集によって、または細胞サンプル中のアデノウイルス遺伝物質を検出することに
よって調べることができる。
セイする。特に、組換えファイバー蛋白質の三量体形成能力、ペントンベースと
相互作用する能力、および天然の基質（例えば、抗体、ＡＲ、オプソニン、コレ
クチン、ＲＥＳ細胞など）と相互作用する能力をアッセイする。これらのパラメ
ーターを測定するのに任意の適切なアッセイを使用することができる。例えば、
不適切に折り畳まれた単量体は一般的に不溶性であるので（Scopes, 「Protein
Purification」（第３版、1994）、第９章、270〜82頁(Springer-Verlag, New Y
ork)）、三量化の１つのアッセイは、組換えファイバーが可溶性であるかどうか
である。ある量の放射性アミノ酸が合成中に蛋白質に組み込まれるかは、ファイ
バーの溶解性測定の助けとなる。組換えファイバー蛋白質を発現する宿主細胞由
来のライセートを遠心分離し、シンチレーションカウンターまたはウエスタン分
析によって上清およびペレットをアッセイすることができる。続いて、ペレット
および上清中の蛋白質を分離して（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で）、さら
なるアッセイ用にファイバー蛋白質を単離する。上清から単離されたファイバー
蛋白質の量に対するペレットから単離されたファイバー蛋白質の量の比較は、変
異体蛋白質が可溶性であるかどうかを示す。あるいは、ファイバーの三量体形態
のアミノ部分のみを認識するモノクローナル抗体を用いることによって、三量化
をアッセイすることができる（例えば、免疫沈降、ウエスタンブロッティングな
ど）。ファイバー三量体のみがそのように相互作用することができるので、三量
化の別の測定は、組換えファイバーがペントンベースと複合体を形成できること
である（NovelliおよびBoulanger, Virology, 185, 1189 (1995)）。この傾向は
、共免疫沈降、ゲル移動度シフトアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（煮沸したサンプ
ルは単量体として移動するが。そうでなければ、それらはより大きな蛋白質とし
て移動する）などによってアッセイすることができる。三量化のさらに別の測定
は、単量体に対する三量体の分子量の差を検出することである。例えば、煮沸し
変性させた三量体は、安定な非変性の三量体よりも、より低分子量として移動す
る（HongおよびAngler, J. Virol., 70, 7071-78 (1996)）。三量体組換えファ
イバーはまた、その天然の基質との結合能力についてアッセイすることができる
。例えば、宿主の先天性または後天性免疫系とのその相互作用を妨害するファイ
バーの改変は、ウイルスの自由力価を経時的に測定することによって達成するこ
とができる。これは、血清半減期、ＲＥＳに関連する器官（例えば、マウスおよ
びヒトの肝臓、ブタの肺など）への指向性を測定することによって、赤血球の凝
集によって、または細胞サンプル中のアデノウイルス遺伝物質を検出することに
よって調べることができる。
【００２４】 三量体組換えファイバーはまた、天然のＡＲと結合できるかにつきアッセイす
ることができる。この特徴を検出することができるいかなる適切なアッセイも、
本発明における使用に十分である。好ましいアッセイは、天然のＡＲを発現する
細胞（例えば、ＨＥＫ−２９３細胞）を、標準感染条件下で組換えファイバー三
量体に曝露することを含む。続いて、細胞を天然アデノウイルスに曝露し、ウイ
ルスのこの細胞への結合能力をモニターする。モニタリングは、オートラジオグ
ラフィー（例えば、放射性ウイルスを用いて）、免疫細胞化学によって、あるい
は感染または遺伝子送達のレベルを測定する（例えば、レポーター遺伝子を用い
て）ことによって行うことができる。ＨＥＫ−２９３細胞へのその後のウイルス
の結合を減少させるかまたは実質的に除去する天然の三量体とは対照的に、天然
アデノウイルスがその後に細胞に結合する能力を実質的に低下させない三量体が
本発明の三量体である。その後のウイルス結合の妨害が減少することは、三量体
がそれ自体その天然の哺乳動物ＡＲに対するリガンドではないか、または少なく
とも結合親和性が低下した状態であることを示す。
ることができる。この特徴を検出することができるいかなる適切なアッセイも、
本発明における使用に十分である。好ましいアッセイは、天然のＡＲを発現する
細胞（例えば、ＨＥＫ−２９３細胞）を、標準感染条件下で組換えファイバー三
量体に曝露することを含む。続いて、細胞を天然アデノウイルスに曝露し、ウイ
ルスのこの細胞への結合能力をモニターする。モニタリングは、オートラジオグ
ラフィー（例えば、放射性ウイルスを用いて）、免疫細胞化学によって、あるい
は感染または遺伝子送達のレベルを測定する（例えば、レポーター遺伝子を用い
て）ことによって行うことができる。ＨＥＫ−２９３細胞へのその後のウイルス
の結合を減少させるかまたは実質的に除去する天然の三量体とは対照的に、天然
アデノウイルスがその後に細胞に結合する能力を実質的に低下させない三量体が
本発明の三量体である。その後のウイルス結合の妨害が減少することは、三量体
がそれ自体その天然の哺乳動物ＡＲに対するリガンドではないか、または少なく
とも結合親和性が低下した状態であることを示す。
【００２５】 あるいは、変異したファイバーをコードする配列を含むベクター（または本明
細書中に記載のような推定変異ファイバーのライブラリー）を、適切な宿主細胞
株中に導入してファイバー蛋白質を発現させ、可溶性ＣＡＲ蛋白質との結合能が
ないことをアッセイすることによって（例えば、レプリカリフトを放射性標識し
たＣＡＲでプロービングすることによって、または他の適切な方法によって）変
異体を同定することができる。ＣＡＲとの結合が減じることは、リガンドの選択
的除去または三量化に影響を与える構造的改変のいずれのせいでもあり得るので
、このようなライブラリースクリーニングによってＣＡＲと結合しないと同定さ
れた変異体ファイバーは、上記のように三量化能力についてアッセイしなければ
ならない。
細書中に記載のような推定変異ファイバーのライブラリー）を、適切な宿主細胞
株中に導入してファイバー蛋白質を発現させ、可溶性ＣＡＲ蛋白質との結合能が
ないことをアッセイすることによって（例えば、レプリカリフトを放射性標識し
たＣＡＲでプロービングすることによって、または他の適切な方法によって）変
異体を同定することができる。ＣＡＲとの結合が減じることは、リガンドの選択
的除去または三量化に影響を与える構造的改変のいずれのせいでもあり得るので
、このようなライブラリースクリーニングによってＣＡＲと結合しないと同定さ
れた変異体ファイバーは、上記のように三量化能力についてアッセイしなければ
ならない。
【００２６】 ビリオンおよびウイルス 本発明は、本発明の組換えファイバー蛋白質を組み込んだアデノウイルスビリ
オンを提供する。該ビリオンは、ビリオン中に存在するファイバーの上述した親
和性の低下のせいで、野生型血清型ほど容易には天然の基質（例えば、先天性お
よび後天性免疫系、細胞表面蛋白質など）と相互作用しない。さらに、他の組換
え蛋白質を含ませることによって天然の基質との相互作用を低下させるべく、ビ
リオンをさらに改変することができる。従って、例えば、αvインテグリンを介
した細胞との結合を減じさせるために、ビリオンは、天然ＲＧＤ配列を欠く１ま
たは２以上の組換えペントンベース蛋白質を含むことができる（例えば、米国特
許第5,559,099号（Wickhamら）および同第5,731,190号（Wickhamら）を参照）。
同様に、中和抗体によって認識される能力を低下させるために、ビリオンは、天
然の配列（例えば、ＨＶＲ）を欠く１または２以上の組換えヘキソンを含むこと
ができる（例えば、国際特許出願WO 98/40509（Crystalら）を参照）。また、Ｒ
ＥＳと相互作用する能力を低下させるためにビリオンを改変することができる。
例えば、ビリオン蛋白質を、１または２以上のグリコシル化またはリン酸化部位
を欠くように変異させることができ、あるいはグリコシル化またはリン酸化のイ
ンヒビターの存在下で産生させることができる。同様に、ビリオン蛋白質を、上
記のように、１級アミン基、エポキシ基、またはジアシルグリセロール基を含む
ＰＥＧの脂質誘導体に結合して、コレクチンおよび／またはオプソニン親和性、
あるいはクッパー細胞またはＲＥＳの他の細胞による捕捉を減じさせることがで
きる。このような改変は、宿主動物がビリオンに対する中和抗体を作り出す能力
を低下させ、それによってビリオンの反復投与が可能になる。
オンを提供する。該ビリオンは、ビリオン中に存在するファイバーの上述した親
和性の低下のせいで、野生型血清型ほど容易には天然の基質（例えば、先天性お
よび後天性免疫系、細胞表面蛋白質など）と相互作用しない。さらに、他の組換
え蛋白質を含ませることによって天然の基質との相互作用を低下させるべく、ビ
リオンをさらに改変することができる。従って、例えば、αvインテグリンを介
した細胞との結合を減じさせるために、ビリオンは、天然ＲＧＤ配列を欠く１ま
たは２以上の組換えペントンベース蛋白質を含むことができる（例えば、米国特
許第5,559,099号（Wickhamら）および同第5,731,190号（Wickhamら）を参照）。
同様に、中和抗体によって認識される能力を低下させるために、ビリオンは、天
然の配列（例えば、ＨＶＲ）を欠く１または２以上の組換えヘキソンを含むこと
ができる（例えば、国際特許出願WO 98/40509（Crystalら）を参照）。また、Ｒ
ＥＳと相互作用する能力を低下させるためにビリオンを改変することができる。
例えば、ビリオン蛋白質を、１または２以上のグリコシル化またはリン酸化部位
を欠くように変異させることができ、あるいはグリコシル化またはリン酸化のイ
ンヒビターの存在下で産生させることができる。同様に、ビリオン蛋白質を、上
記のように、１級アミン基、エポキシ基、またはジアシルグリセロール基を含む
ＰＥＧの脂質誘導体に結合して、コレクチンおよび／またはオプソニン親和性、
あるいはクッパー細胞またはＲＥＳの他の細胞による捕捉を減じさせることがで
きる。このような改変は、宿主動物がビリオンに対する中和抗体を作り出す能力
を低下させ、それによってビリオンの反復投与が可能になる。
【００２７】 ビリオンは天然アデノウイルス基質に対して低下した親和性を示すが、例えば
、アデノウイルスが生来的に親和性である細胞以外の細胞の母集団の標的化感染
を達成するために、１つ以上の非アデノウイルスリガンドを含むことができる。
さらに、ウイルスを精製するため、ウイルスを不活化するため（例えば、リガン
ドに対する基質に吸着させることによって）、または非天然リガンドを認識する
レセプターを有する細胞株上でウイルスを増殖させるため（例えば、国際特許出
願WO 98/54346（Wickhamら）に記載のように）、非天然リガンドを使用すること
ができる。
、アデノウイルスが生来的に親和性である細胞以外の細胞の母集団の標的化感染
を達成するために、１つ以上の非アデノウイルスリガンドを含むことができる。
さらに、ウイルスを精製するため、ウイルスを不活化するため（例えば、リガン
ドに対する基質に吸着させることによって）、または非天然リガンドを認識する
レセプターを有する細胞株上でウイルスを増殖させるため（例えば、国際特許出
願WO 98/54346（Wickhamら）に記載のように）、非天然リガンドを使用すること
ができる。
【００２８】 ウイルスは、任意の適切なリガンド（例えば、基質に特異的に結合するペプチ
ド）を含むことができる。例えば、生来的に感染する細胞種以外の細胞種（すな
わち天然の宿主細胞域または宿主細胞セット以外の細胞種の群）にアデノウイル
スをターゲッティングするために、リガンドを、細胞表面結合部位（例えば、ア
デノウイルスが相互作用して細胞に結合し、それによって細胞侵入を促進するこ
とができる細胞表面上に存在する任意の部位）に結合させることができる。細胞
表面結合部位は、いかなる適切な分子種であってもよいが、通常は、蛋白質（糖
蛋白質、ムコ蛋白質などのような改変蛋白質を含む）、炭水化物、プリテオグリ
カン、脂質、ムチン分子、または他の類似の分子である。可能性のある細胞表面
結合部位の例としては、グリコサミノグリカン上で見出されるヘパリンおよびコ
ンドロイチン硫酸部分；ムチン、糖蛋白質およびガングリオシド上で見出される
シアル酸部分；膜糖蛋白質中で見出される共通の炭水化物分子（マンノース、Ｎ
−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、フコースおよびガ
ラクトースを含む）；細胞接着分子（ＣＡＭ）（例えば、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡ
Ｍ−２、ＩＣＡＭ−３、ＶＣＡＭ−１、ＮＣＡＭ）、セレクチン（例えば、Ｅ−
セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチンなど）、ＣＤ、カドヘリン、ＴＮ
Ｆファミリーレセプター、ＧＰＩ結合レセプター、効率的に内在化されるレセプ
ター（例えば、内皮細胞上のＣＤ４４、ＣＤ３１、高内皮小静脈上のＣＤ３４）
、エンドクリン、成長因子レセプター、ＰＳＡ、アンドロゲンレセプター、グル
ココルチコイドレセプター、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＭＵＣ１、ＭＵ
Ｃ２３４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＫＳＡ癌胎児抗原（ＣＥＡ）
、ＨＥＲ２／ＮＥＵ（ｅｒｂＢ２）、葉酸レセプター、絨毛性ゴナドトロピンβ
（Zhangら、Clin. Cancer Res., 4, 2669-76 (1998);Cancer Res., 58, 4055 (1
988)）のような糖蛋白質が挙げられるがこれらに限定されず、他のものも当該分
野で公知である。
ド）を含むことができる。例えば、生来的に感染する細胞種以外の細胞種（すな
わち天然の宿主細胞域または宿主細胞セット以外の細胞種の群）にアデノウイル
スをターゲッティングするために、リガンドを、細胞表面結合部位（例えば、ア
デノウイルスが相互作用して細胞に結合し、それによって細胞侵入を促進するこ
とができる細胞表面上に存在する任意の部位）に結合させることができる。細胞
表面結合部位は、いかなる適切な分子種であってもよいが、通常は、蛋白質（糖
蛋白質、ムコ蛋白質などのような改変蛋白質を含む）、炭水化物、プリテオグリ
カン、脂質、ムチン分子、または他の類似の分子である。可能性のある細胞表面
結合部位の例としては、グリコサミノグリカン上で見出されるヘパリンおよびコ
ンドロイチン硫酸部分；ムチン、糖蛋白質およびガングリオシド上で見出される
シアル酸部分；膜糖蛋白質中で見出される共通の炭水化物分子（マンノース、Ｎ
−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、フコースおよびガ
ラクトースを含む）；細胞接着分子（ＣＡＭ）（例えば、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡ
Ｍ−２、ＩＣＡＭ−３、ＶＣＡＭ−１、ＮＣＡＭ）、セレクチン（例えば、Ｅ−
セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチンなど）、ＣＤ、カドヘリン、ＴＮ
Ｆファミリーレセプター、ＧＰＩ結合レセプター、効率的に内在化されるレセプ
ター（例えば、内皮細胞上のＣＤ４４、ＣＤ３１、高内皮小静脈上のＣＤ３４）
、エンドクリン、成長因子レセプター、ＰＳＡ、アンドロゲンレセプター、グル
ココルチコイドレセプター、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＭＵＣ１、ＭＵ
Ｃ２３４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＫＳＡ癌胎児抗原（ＣＥＡ）
、ＨＥＲ２／ＮＥＵ（ｅｒｂＢ２）、葉酸レセプター、絨毛性ゴナドトロピンβ
（Zhangら、Clin. Cancer Res., 4, 2669-76 (1998);Cancer Res., 58, 4055 (1
988)）のような糖蛋白質が挙げられるがこれらに限定されず、他のものも当該分
野で公知である。
【００２９】 特定の細胞表面結合部位は、狭いクラスの細胞種（例えば、心筋、骨格筋、平
滑筋など）上に存在しても、幾つかの細胞種を含むより広い群上に存在してもよ
い。適切な細胞特異的リガンドを組み込むことによって、ビリオンを任意の所望
の細胞種（例えば、以下のもの）にターゲッティングさせるために使用すること
ができる；神経細胞、グリア細胞、内皮細胞（例えば、組織因子レセプター、Ｆ
ＬＴ−１、ＣＤ３１；ＣＤ３６；ＣＤ３４；ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＩＣＡＭ−
１（McCormickら、J. Biol. Chem., 273, 26323-29 (1998)）；トロンボモジュ
リンレセプター（Lupusら、Suppl., 2, S120 (1998)）；ＶＥＧＦＲ−３（Lymbo
ussakiら、Am. J. Pathol., 153(2), 395-403 (1998)；マンノースレセプター；
ＶＣＡＭ−１（Schwarzacherら、Atherocsclerosis, 122, 59-67 (1996)）また
は他のレセプターを介して）；血餅（例えば、フィブリノーゲンまたはａＩＩｂ
ｂ３ペプチドを介して）、上皮細胞（例えば、セレクチン類、ＶＣＡＭ−１、Ｉ
ＣＡＭ−１などを介する炎症性組織）、ケラチノサイト、濾胞細胞、脂肪細胞、
ファイバー芽細胞、造血または他の幹細胞、筋芽細胞、筋原線維、心筋細胞、平
滑筋、体細胞、破骨細胞、骨芽細胞、歯芽細胞(tooth blast)、軟骨細胞、メラ
ノサイト、造血細胞など、ならびに上記細胞型のいずれか由来の癌細胞（例えば
、前立腺（例えば、PSMAレセプターを介して（例えば、Schuurら、J. Biol. Che
m., 271, 7043 (1998);Cancer Res., 58, 4055 (1998)））、***、肺、脳（例
えば、グリア芽細胞腫）、白血病／リンパ腫、肝臓、肉腫、骨、結腸、精巣、卵
巣、膀胱、咽喉、胃、膵臓、直腸、皮膚（例えば、メラノーマ）、腎臓など）。
従って、本発明のビリオンは、任意の器官または系（例えば、呼吸器系（例えば
、気管、上気道、下気道、肺胞）、神経系および知覚器官（例えば、皮膚、耳、
鼻、舌、目）、消化器系（例えば、口腔上皮および知覚器官、唾液腺、胃、小腸
／十二指腸、結腸、胆嚢、膵臓、直腸）、筋系（例えば、骨格筋、結合組織、腱
）、骨格系（例えば、関節（滑膜細胞）、破骨細胞、骨芽細胞など）、免疫系（
例えば、骨髄、幹細胞、脾臓、胸腺、リンパ系など）、循環器系（例えば、筋結
合組織、および／または動脈、静脈、毛細血管の内皮など）、生殖器系（例えば
、精巣、前立腺、子宮、卵巣）、泌尿器系（例えば、膀胱、腎臓、尿道）、内分
泌腺または外分泌腺（例えば、***、副腎、下垂体）などを含む）内の細胞に対
してターゲッティングすることができる。
滑筋など）上に存在しても、幾つかの細胞種を含むより広い群上に存在してもよ
い。適切な細胞特異的リガンドを組み込むことによって、ビリオンを任意の所望
の細胞種（例えば、以下のもの）にターゲッティングさせるために使用すること
ができる；神経細胞、グリア細胞、内皮細胞（例えば、組織因子レセプター、Ｆ
ＬＴ−１、ＣＤ３１；ＣＤ３６；ＣＤ３４；ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＩＣＡＭ−
１（McCormickら、J. Biol. Chem., 273, 26323-29 (1998)）；トロンボモジュ
リンレセプター（Lupusら、Suppl., 2, S120 (1998)）；ＶＥＧＦＲ−３（Lymbo
ussakiら、Am. J. Pathol., 153(2), 395-403 (1998)；マンノースレセプター；
ＶＣＡＭ−１（Schwarzacherら、Atherocsclerosis, 122, 59-67 (1996)）また
は他のレセプターを介して）；血餅（例えば、フィブリノーゲンまたはａＩＩｂ
ｂ３ペプチドを介して）、上皮細胞（例えば、セレクチン類、ＶＣＡＭ−１、Ｉ
ＣＡＭ−１などを介する炎症性組織）、ケラチノサイト、濾胞細胞、脂肪細胞、
ファイバー芽細胞、造血または他の幹細胞、筋芽細胞、筋原線維、心筋細胞、平
滑筋、体細胞、破骨細胞、骨芽細胞、歯芽細胞(tooth blast)、軟骨細胞、メラ
ノサイト、造血細胞など、ならびに上記細胞型のいずれか由来の癌細胞（例えば
、前立腺（例えば、PSMAレセプターを介して（例えば、Schuurら、J. Biol. Che
m., 271, 7043 (1998);Cancer Res., 58, 4055 (1998)））、***、肺、脳（例
えば、グリア芽細胞腫）、白血病／リンパ腫、肝臓、肉腫、骨、結腸、精巣、卵
巣、膀胱、咽喉、胃、膵臓、直腸、皮膚（例えば、メラノーマ）、腎臓など）。
従って、本発明のビリオンは、任意の器官または系（例えば、呼吸器系（例えば
、気管、上気道、下気道、肺胞）、神経系および知覚器官（例えば、皮膚、耳、
鼻、舌、目）、消化器系（例えば、口腔上皮および知覚器官、唾液腺、胃、小腸
／十二指腸、結腸、胆嚢、膵臓、直腸）、筋系（例えば、骨格筋、結合組織、腱
）、骨格系（例えば、関節（滑膜細胞）、破骨細胞、骨芽細胞など）、免疫系（
例えば、骨髄、幹細胞、脾臓、胸腺、リンパ系など）、循環器系（例えば、筋結
合組織、および／または動脈、静脈、毛細血管の内皮など）、生殖器系（例えば
、精巣、前立腺、子宮、卵巣）、泌尿器系（例えば、膀胱、腎臓、尿道）、内分
泌腺または外分泌腺（例えば、***、副腎、下垂体）などを含む）内の細胞に対
してターゲッティングすることができる。
【００３０】 他の実施態様（例えば、特異的に操作された細胞型内での精製または増殖を容
易にするため）では、非天然リガンドは細胞表面蛋白質以外の化合物を結合する
ことができる。従って、リガンドは、血液および／またはリンパが運搬する蛋白
質（例えば、アルブミン）、ポリアミノ酸のような合成ペプチド配列（例えば、
ポリリジン、ポリヒスチジンなど）、人工ペプチド配列（例えば、ＦＬＡＧ）お
よびＲＧＤペプチドフラグメント（Pasqualiniら、J. Cell. Biol., 130, 1189
(1995)）を結合することができる。リガンドは、非ペプチド基質、例えば、プラ
スチック（例えば、Adeyら、Gene, 156, 27 (1995)）、ビオチン（Saggioら、Bi
ochem. J., 293, 613 (1993)）、ＤＮＡ配列（Chengら、Gene, 171, 1 (1996);
Krookら、Biochem. Biophys., Res. Commun., 204, 849 (1994)）、ストレプト
アビジン（Geibelら、Biochemistry, 34, 15430 (1995); Katz, Biochemistry,
34, 15421 (1995)）、ニトロストレプトアビジン（Balassら、Anal. Biochem.,
243, 264 (1996)）、ヘパリン（Wickhamら、Nature Biotechnol., 14, 1570-73
(1996)）、カチオン性支持体、ニッケルおよび亜鉛のような金属（例えば、Reba
rら、Science, 263, 671 (1994); Quiら、Biochemistry, 33, 8319 (1994)）、
または他の可能性のある基質でさえ結合することができる。
易にするため）では、非天然リガンドは細胞表面蛋白質以外の化合物を結合する
ことができる。従って、リガンドは、血液および／またはリンパが運搬する蛋白
質（例えば、アルブミン）、ポリアミノ酸のような合成ペプチド配列（例えば、
ポリリジン、ポリヒスチジンなど）、人工ペプチド配列（例えば、ＦＬＡＧ）お
よびＲＧＤペプチドフラグメント（Pasqualiniら、J. Cell. Biol., 130, 1189
(1995)）を結合することができる。リガンドは、非ペプチド基質、例えば、プラ
スチック（例えば、Adeyら、Gene, 156, 27 (1995)）、ビオチン（Saggioら、Bi
ochem. J., 293, 613 (1993)）、ＤＮＡ配列（Chengら、Gene, 171, 1 (1996);
Krookら、Biochem. Biophys., Res. Commun., 204, 849 (1994)）、ストレプト
アビジン（Geibelら、Biochemistry, 34, 15430 (1995); Katz, Biochemistry,
34, 15421 (1995)）、ニトロストレプトアビジン（Balassら、Anal. Biochem.,
243, 264 (1996)）、ヘパリン（Wickhamら、Nature Biotechnol., 14, 1570-73
(1996)）、カチオン性支持体、ニッケルおよび亜鉛のような金属（例えば、Reba
rら、Science, 263, 671 (1994); Quiら、Biochemistry, 33, 8319 (1994)）、
または他の可能性のある基質でさえ結合することができる。
【００３１】 本発明の方法に使用するのに適したリガンドおよびそれらの基質の例としては
、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノ酸残基結合配列を結合す
るＣＲ２レセプター、ＨＩＶ ｇｐ１２０のＶ３ループを認識するＣＤ４レセプ
ター、トランスフェリンレセプターおよびそのリガンド（トランスフェリン）、
低密度リポ蛋白質レセプターおよびそのリガンド、肺中の上皮および内皮細胞上
のＩＣＡＭ−１レセプターおよびそのリガンド、ストレプトアビジンまたはニト
ロストレプトアビジンに対する直線状または環状ペプチドリガンド（Katz, Bioc
hemistry, 34, 15421 (1995)）、ラクトース、ガラクトースおよび他のガラクト
ース含有化合物を結合するガラクチン配列、および脱グリコシル化蛋白質リガン
ドを認識するアシアロ糖蛋白質。さらに、追加のリガンドおよびそれらの結合部
位としては、好ましくは、インテグリンによって認識されるアミノ酸の短い（例
えば、６アミノ酸以下）直線状ストレッチ(stretch)、ならびにポリアミノ酸配
列（例えば、ポリリジン、ポリアルギニンなど）が挙げられる（がこれらに限定
されない）。複数のリジンおよび／またはアルギニンの挿入は、ヘパリンおよび
ＤＮＡの認識を提供する。また、リガンドは、一般的に使用されるペプチドタグ
（例えば、入手可能な抗血清によって認識されることが知られている短いアミノ
酸配列）を含むことができ、例えば、Shistosoma manosi由来のグルタチオン-S-
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシンβ-ガラクトシダーゼ、またはE
. coli由来のマルトース結合蛋白質（ＭＰＢ）、ヒトアルカリホスファターゼ、
ＦＬＡＧオクタペプチド、血球凝集素（ＨＡ）（Wickhamら、(1996)、前出）、
ポリオーマウイルスペプチド、SV40ラージＴ抗原ペプチド、ＢＰＶペプチド、Ｃ
型肝炎ウイルスコアおよびエンベロープＥ２ペプチドならびにそれらを認識する
単鎖抗体（Chan, J. Gen. Virol., 77, 2531 (1996)）、ｃ−ｍｙｃペプチド、
アデノウイルスペントンベースエピトープ（Stuartら、EMBO J., 16, 1189-98 (
1997)）、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２エンベロープ中に存在するエピトープ（例え
ば、Chanら、(1996)、前出を参照）由来の配列、および他の一般的に使用される
タグである。タグリガンドにとって好ましい基質は、そのタグリガンドに指向さ
れる抗体またはそのような抗体の誘導体である（例えば、ＦＡＢフラグメント、
単鎖抗体（ＳｃＡｂ））。
、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノ酸残基結合配列を結合す
るＣＲ２レセプター、ＨＩＶ ｇｐ１２０のＶ３ループを認識するＣＤ４レセプ
ター、トランスフェリンレセプターおよびそのリガンド（トランスフェリン）、
低密度リポ蛋白質レセプターおよびそのリガンド、肺中の上皮および内皮細胞上
のＩＣＡＭ−１レセプターおよびそのリガンド、ストレプトアビジンまたはニト
ロストレプトアビジンに対する直線状または環状ペプチドリガンド（Katz, Bioc
hemistry, 34, 15421 (1995)）、ラクトース、ガラクトースおよび他のガラクト
ース含有化合物を結合するガラクチン配列、および脱グリコシル化蛋白質リガン
ドを認識するアシアロ糖蛋白質。さらに、追加のリガンドおよびそれらの結合部
位としては、好ましくは、インテグリンによって認識されるアミノ酸の短い（例
えば、６アミノ酸以下）直線状ストレッチ(stretch)、ならびにポリアミノ酸配
列（例えば、ポリリジン、ポリアルギニンなど）が挙げられる（がこれらに限定
されない）。複数のリジンおよび／またはアルギニンの挿入は、ヘパリンおよび
ＤＮＡの認識を提供する。また、リガンドは、一般的に使用されるペプチドタグ
（例えば、入手可能な抗血清によって認識されることが知られている短いアミノ
酸配列）を含むことができ、例えば、Shistosoma manosi由来のグルタチオン-S-
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシンβ-ガラクトシダーゼ、またはE
. coli由来のマルトース結合蛋白質（ＭＰＢ）、ヒトアルカリホスファターゼ、
ＦＬＡＧオクタペプチド、血球凝集素（ＨＡ）（Wickhamら、(1996)、前出）、
ポリオーマウイルスペプチド、SV40ラージＴ抗原ペプチド、ＢＰＶペプチド、Ｃ
型肝炎ウイルスコアおよびエンベロープＥ２ペプチドならびにそれらを認識する
単鎖抗体（Chan, J. Gen. Virol., 77, 2531 (1996)）、ｃ−ｍｙｃペプチド、
アデノウイルスペントンベースエピトープ（Stuartら、EMBO J., 16, 1189-98 (
1997)）、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２エンベロープ中に存在するエピトープ（例え
ば、Chanら、(1996)、前出を参照）由来の配列、および他の一般的に使用される
タグである。タグリガンドにとって好ましい基質は、そのタグリガンドに指向さ
れる抗体またはそのような抗体の誘導体である（例えば、ＦＡＢフラグメント、
単鎖抗体（ＳｃＡｂ））。
【００３２】 述べたように、適切なリガンドは、任意の所望の基質、例えば、本明細書中で
引用したものまたはそうでなければ当該分野で公知のものに対して特異的であり
得る。しかしながら、アデノウイルスベクターはまた、ペプチドが所定の基質と
相互作用する能力についてまずアッセイすることによって、新規のリガンド（例
えば、蛋白質II、III、IIIa、IV、IV、VIおよび／またはIX中）を含むように操
作することができる。一般的に、潜在的リガンドを含むランダムまたはセミラン
ダムペプチドライブラリーを製造することができ、このライブラリーは本質的に
は発現ベクター系内のライブラリーである。このようなライブラリーは、発現し
た蛋白質（すなわち、推定リガンド）を所望の基質に曝すことによってスクリー
ニングすることができる。ライブラリー内のある種がその基質にポジティブに選
択的結合することは、少なくともアッセイ条件下でその基質に対するリガンドで
あることを示している。このようなペプチドライブラリーのスクリーニングにつ
いて、蛋白質と基質との間の相互作用を検出することができるいずれのアッセイ
も適当であり、その多くは当該分野で公知である。しかしながら、蛋白質ライブ
ラリーをスクリーニングするための１つの好ましいアッセイは、ディスプレイ系
（例えば、アデノウイルスまたはバクテリオファージを用いる）であり、これは
ライブラリーを発現するウイルスを使用する（例えば、Koivunenら、Bio/Techno
logy, 13, 265-70 (1995):Yanofskyら、Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A., 93, 7
381-86 (1996):Barryら、Nature Med., 2(3), 299-305 (1996)）。基質へのウイ
ルスの結合は、ウイルスを基質に曝し、基質をすすぎ、そして基質に結合したま
まのウイルスを選択することによってアッセイされる。続いて、限界希釈により
、推定リガンドを発現する個々のクローンを同定することができる。その後、リ
ガンドの同一性を決定するために、このようなクローンに存在するインサートを
配列決定することができる。
引用したものまたはそうでなければ当該分野で公知のものに対して特異的であり
得る。しかしながら、アデノウイルスベクターはまた、ペプチドが所定の基質と
相互作用する能力についてまずアッセイすることによって、新規のリガンド（例
えば、蛋白質II、III、IIIa、IV、IV、VIおよび／またはIX中）を含むように操
作することができる。一般的に、潜在的リガンドを含むランダムまたはセミラン
ダムペプチドライブラリーを製造することができ、このライブラリーは本質的に
は発現ベクター系内のライブラリーである。このようなライブラリーは、発現し
た蛋白質（すなわち、推定リガンド）を所望の基質に曝すことによってスクリー
ニングすることができる。ライブラリー内のある種がその基質にポジティブに選
択的結合することは、少なくともアッセイ条件下でその基質に対するリガンドで
あることを示している。このようなペプチドライブラリーのスクリーニングにつ
いて、蛋白質と基質との間の相互作用を検出することができるいずれのアッセイ
も適当であり、その多くは当該分野で公知である。しかしながら、蛋白質ライブ
ラリーをスクリーニングするための１つの好ましいアッセイは、ディスプレイ系
（例えば、アデノウイルスまたはバクテリオファージを用いる）であり、これは
ライブラリーを発現するウイルスを使用する（例えば、Koivunenら、Bio/Techno
logy, 13, 265-70 (1995):Yanofskyら、Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A., 93, 7
381-86 (1996):Barryら、Nature Med., 2(3), 299-305 (1996)）。基質へのウイ
ルスの結合は、ウイルスを基質に曝し、基質をすすぎ、そして基質に結合したま
まのウイルスを選択することによってアッセイされる。続いて、限界希釈により
、推定リガンドを発現する個々のクローンを同定することができる。その後、リ
ガンドの同一性を決定するために、このようなクローンに存在するインサートを
配列決定することができる。
【００３３】 所定のリガンドが同定されると、基質と相互作用できるウイルスの任意の位置
（すなわち、ウイルス表面）にそのリガンドを組み込むことができる。例えば、
ファイバー、ペントンベース、ヘキソン、蛋白質IX、VIまたはIIIa、あるいは他
の適切な位置にリガンドを組み込むことができる。リガンドがファイバー蛋白質
に結合している場合、好ましくは、リガンドはウイルス蛋白質間または単量体間
の相互作用を妨害しない。従って、リガンドは、好ましくは、それ自体オリゴマ
ー化ドメインではない（そのようなものは上記のように三量化ドメインと不都合
に相互作用し得る）。好ましくは、基質にリガンドを最大限与えるために、リガ
ンドはビリオン蛋白質に添加され、容易に基質に曝されるようなやり方で組み込
まれる（例えば、基質と接触するために、蛋白質の末端で、基質に面する残基に
結合して、ペプチドスペーサー上に位置してなど）。リガンドがペントンベース
の一部分に結合しているかまたはそれを置換する場合、好ましくは、リガンドが
基質と接触することを確実にするために、リガンドは超可変領域内にある。さら
に、リガンドがペントンベースに結合している場合、好ましくは、基質にリガン
ドを最大限与えるために、組換えファイバーは切断されるかまたは短い（例えば
、０〜約１０のシャフトリピート）（例えば、米国特許第5,559,099号（Wickham
ら）を参照）。リガンドがヘキソンに結合している場合、好ましくは、リガンド
は超可変領域内にある（Mikszaら、J. Virol., 70(3), 1836-44 (1996)）。
（すなわち、ウイルス表面）にそのリガンドを組み込むことができる。例えば、
ファイバー、ペントンベース、ヘキソン、蛋白質IX、VIまたはIIIa、あるいは他
の適切な位置にリガンドを組み込むことができる。リガンドがファイバー蛋白質
に結合している場合、好ましくは、リガンドはウイルス蛋白質間または単量体間
の相互作用を妨害しない。従って、リガンドは、好ましくは、それ自体オリゴマ
ー化ドメインではない（そのようなものは上記のように三量化ドメインと不都合
に相互作用し得る）。好ましくは、基質にリガンドを最大限与えるために、リガ
ンドはビリオン蛋白質に添加され、容易に基質に曝されるようなやり方で組み込
まれる（例えば、基質と接触するために、蛋白質の末端で、基質に面する残基に
結合して、ペプチドスペーサー上に位置してなど）。リガンドがペントンベース
の一部分に結合しているかまたはそれを置換する場合、好ましくは、リガンドが
基質と接触することを確実にするために、リガンドは超可変領域内にある。さら
に、リガンドがペントンベースに結合している場合、好ましくは、基質にリガン
ドを最大限与えるために、組換えファイバーは切断されるかまたは短い（例えば
、０〜約１０のシャフトリピート）（例えば、米国特許第5,559,099号（Wickham
ら）を参照）。リガンドがヘキソンに結合している場合、好ましくは、リガンド
は超可変領域内にある（Mikszaら、J. Virol., 70(3), 1836-44 (1996)）。
【００３４】 リガンドは、アデノウイルス蛋白質中に操作される場合、部分的に天然配列の
一部および部分的に非天然配列の一部を含むことができる。同様に、蛋白質中で
リガンドを形成する配列（天然および／または非天然のいずれか）は、必ずしも
蛋白質を形成するアミノ酸鎖中で近接している必要はない。換言すれば、リガン
ドは蛋白質の特定のコンフォメーションによって（例えば、近接および／または
非近接配列を互いに近接させるような蛋白質の折り畳みによって）産生すること
ができる。もちろん、本発明のアデノウイルス（またはブロッキング蛋白質）は
、複数のリガンドを含むことができ、各リガンドは異なる基質に結合する。例え
ば、ウイルスは、本明細書中で記載のような親和性精製を可能にする第１のリガ
ンド、本明細書中で記載のような細胞表面部位を特異的に結合する第２のリガン
ド、および／またはやはり本明細書中で記載のようなウイルスを不活化するため
の第３のリガンドを含むことができる。
一部および部分的に非天然配列の一部を含むことができる。同様に、蛋白質中で
リガンドを形成する配列（天然および／または非天然のいずれか）は、必ずしも
蛋白質を形成するアミノ酸鎖中で近接している必要はない。換言すれば、リガン
ドは蛋白質の特定のコンフォメーションによって（例えば、近接および／または
非近接配列を互いに近接させるような蛋白質の折り畳みによって）産生すること
ができる。もちろん、本発明のアデノウイルス（またはブロッキング蛋白質）は
、複数のリガンドを含むことができ、各リガンドは異なる基質に結合する。例え
ば、ウイルスは、本明細書中で記載のような親和性精製を可能にする第１のリガ
ンド、本明細書中で記載のような細胞表面部位を特異的に結合する第２のリガン
ド、および／またはやはり本明細書中で記載のようなウイルスを不活化するため
の第３のリガンドを含むことができる。
【００３５】 リガンドを含む蛋白質は、他の非天然要素もまた含むことができる。例えば、
非天然ユニークプロテアーゼ部位をまた、アミノ酸配列中に挿入することができ
る。プロテアーゼ部位は、好ましくはファイバー三量化またはファイバーリガン
ドの基質特異性に影響を与えない。多くのこのようなプロテアーゼ部位は、当該
分野で公知である。例えば、トロンビンは、公知のアミノ酸配列を認識し、この
配列で切断する（Stenfloら、J. Biol. Chem., 257, 12280-90 (1982)）。この
ようなプロテアーゼ認識配列の存在により、いくつかのプロトコルにおいてウイ
ルスの精製が容易になる。蛋白質は、任意の適切な方法、例えば、蛋白質に変異
を導入するための上記の方法によってリガンドを含むように操作することができ
る。
非天然ユニークプロテアーゼ部位をまた、アミノ酸配列中に挿入することができ
る。プロテアーゼ部位は、好ましくはファイバー三量化またはファイバーリガン
ドの基質特異性に影響を与えない。多くのこのようなプロテアーゼ部位は、当該
分野で公知である。例えば、トロンビンは、公知のアミノ酸配列を認識し、この
配列で切断する（Stenfloら、J. Biol. Chem., 257, 12280-90 (1982)）。この
ようなプロテアーゼ認識配列の存在により、いくつかのプロトコルにおいてウイ
ルスの精製が容易になる。蛋白質は、任意の適切な方法、例えば、蛋白質に変異
を導入するための上記の方法によってリガンドを含むように操作することができ
る。
【００３６】 ビリオンは、単独で、例えば、ウイルス親和性または結合速度論の研究に使用
することができる。他の実施態様では、ビリオンは遺伝子ベクターとして使用す
ることができる。例えば、ビリオンは、十分に実証された方法に従って外因性遺
伝物質を標的細胞に送達するために、脂質および／またはリポソームと共に使用
することができる。他の実施態様では、ビリオンは、アデノウイルス由来のゲノ
ムを含み：従って、本発明は、本発明のビリオンおよびアデノウイルスゲノムを
含むアデノウイルスベクターを提供する。
することができる。他の実施態様では、ビリオンは遺伝子ベクターとして使用す
ることができる。例えば、ビリオンは、十分に実証された方法に従って外因性遺
伝物質を標的細胞に送達するために、脂質および／またはリポソームと共に使用
することができる。他の実施態様では、ビリオンは、アデノウイルス由来のゲノ
ムを含み：従って、本発明は、本発明のビリオンおよびアデノウイルスゲノムを
含むアデノウイルスベクターを提供する。
【００３７】 本発明のアデノウイルスベクターは、発現のための１つ以上の非天然アミノ酸
配列（例えば、「発現カセット」または「遺伝子」）もまた含むことができる。
好ましくは、非天然アミノ酸は、ベクターが内在化されている細胞中で転写する
ことができる。非天然アミノ酸は、細胞レベルでまたは全身的のいずれかで生物
学的（例えば、治療的）応答をもたらす産物をコードすることができ：あるいは
、非天然核酸配列は、ある様式で細胞中に検出することができる産物をコードす
ることができる（例えば、「レポーター遺伝子」）。非天然アミノ酸は、ＲＮＡ
または蛋白質のレベルでその効果を発揮することができる。例えば嚢胞性線維症
の治療のための嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーターｃＤＮＡのよ
うに、例えば非天然アミノ酸によってコードされた蛋白質を遺伝性疾患の治療に
使用することができる。あるいは、非天然アミノ酸によってコードされた蛋白質
は、細胞死をもたらすことによってその治療効果を発揮することができる。例え
ば、非天然アミノ酸の発現は、それ自体、ジフテリア毒素の発現を伴うので、細
胞死滅を導き得る。あるいは、非天然アミノ酸の発現は、細胞を特定の薬物の作
用に対して選択的に感受性にすることができ、例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ
遺伝子の発現は、細胞を抗ウイルス化合物（アシクロビル、ガンシクロビル、お
よびＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシ
ル）−５−ヨードウラシル）を含む）に対して感受性にする。さらに、非天然ア
ミノ酸は、例えば、アンチセンスメッセージまたはリボザイム、スプライシング
または３’プロセシング（例えば、ポリアデニル化）に影響を与える蛋白質、ま
たは細胞内の別の遺伝子の発現のレベルに影響を与える蛋白質（すなわち、遺伝
子発現が、転写の開始からプロセシングした蛋白質の産生までのすべての工程を
含むように広範囲に考慮される場合）をコードすることによって、おそらくはそ
のなかでもとりわけ、変化したｍＲＮＡ蓄積速度、ｍＲＮＡ輸送の変化、および
／または転写後調節の変化を仲介することによって、ＲＮＡのレベルでその効果
を発揮することができる。もちろん、所定の非天然アミノ酸を送達するために遺
伝子導入技術を使用することが所望である場合、その配列は当該分野で公知であ
る。
配列（例えば、「発現カセット」または「遺伝子」）もまた含むことができる。
好ましくは、非天然アミノ酸は、ベクターが内在化されている細胞中で転写する
ことができる。非天然アミノ酸は、細胞レベルでまたは全身的のいずれかで生物
学的（例えば、治療的）応答をもたらす産物をコードすることができ：あるいは
、非天然核酸配列は、ある様式で細胞中に検出することができる産物をコードす
ることができる（例えば、「レポーター遺伝子」）。非天然アミノ酸は、ＲＮＡ
または蛋白質のレベルでその効果を発揮することができる。例えば嚢胞性線維症
の治療のための嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーターｃＤＮＡのよ
うに、例えば非天然アミノ酸によってコードされた蛋白質を遺伝性疾患の治療に
使用することができる。あるいは、非天然アミノ酸によってコードされた蛋白質
は、細胞死をもたらすことによってその治療効果を発揮することができる。例え
ば、非天然アミノ酸の発現は、それ自体、ジフテリア毒素の発現を伴うので、細
胞死滅を導き得る。あるいは、非天然アミノ酸の発現は、細胞を特定の薬物の作
用に対して選択的に感受性にすることができ、例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ
遺伝子の発現は、細胞を抗ウイルス化合物（アシクロビル、ガンシクロビル、お
よびＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシ
ル）−５−ヨードウラシル）を含む）に対して感受性にする。さらに、非天然ア
ミノ酸は、例えば、アンチセンスメッセージまたはリボザイム、スプライシング
または３’プロセシング（例えば、ポリアデニル化）に影響を与える蛋白質、ま
たは細胞内の別の遺伝子の発現のレベルに影響を与える蛋白質（すなわち、遺伝
子発現が、転写の開始からプロセシングした蛋白質の産生までのすべての工程を
含むように広範囲に考慮される場合）をコードすることによって、おそらくはそ
のなかでもとりわけ、変化したｍＲＮＡ蓄積速度、ｍＲＮＡ輸送の変化、および
／または転写後調節の変化を仲介することによって、ＲＮＡのレベルでその効果
を発揮することができる。もちろん、所定の非天然アミノ酸を送達するために遺
伝子導入技術を使用することが所望である場合、その配列は当該分野で公知であ
る。
【００３８】 本発明のアデノウイルスベクターがそのビリオン中に非天然アミノ酸および非
アデノウイルスリガンドを含む場合、非天然アミノ酸は、任意の適切なプロモー
ター、例えば、アデノウイルスゲノムまたは非アデノウイルスプロモーターに対
してネイティブであるプロモーターに機能的に連結させることができる。リガン
ドが所望の細胞種にベクターを送達するために使用される場合、好ましくは、非
アデノウイルスプロモーターは、その細胞種内で活性であり、より好ましくは、
その非アデノウイルスプロモーターは、組織特異的プロモーター（例えば、リガ
ンドが結合する細胞種に対して特異的）であり、例えば、そのような細胞種は上
述のものである。例えば、ターゲッティングされる内皮細胞における発現は、Ｅ
−セレクチンプロモーターを用いて仲介することができる（例えば、Whelanら、
TIBS, 21, 65-69 (1996)を参照）：ターゲッティングされる前立腺癌細胞におけ
るパッセンジャー遺伝子の発現は、ＰＳＡプロモーター（例えば、Schuurら、J.
Cell Biol., 271, 7043 (1996)、Pangら、Cancer Res., 57, 495 (1997)を参照
）またはＥ２Ｆプロモーターを用いて仲介することができる。さらに、プロモー
ターは、組織特異的レセプター、例えば、本明細書中で述べるレセプターに対す
るプロモーターであり得、さらに他の組織特異的プロモーター系が当該分野で公
知である。あるいは、非天然アミノ酸は、調節可能なプロモーター（例えば、メ
タロチオネインプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、ＲＵ４８
６応答性プロモーターなど）の制御下に置くことができる。
アデノウイルスリガンドを含む場合、非天然アミノ酸は、任意の適切なプロモー
ター、例えば、アデノウイルスゲノムまたは非アデノウイルスプロモーターに対
してネイティブであるプロモーターに機能的に連結させることができる。リガン
ドが所望の細胞種にベクターを送達するために使用される場合、好ましくは、非
アデノウイルスプロモーターは、その細胞種内で活性であり、より好ましくは、
その非アデノウイルスプロモーターは、組織特異的プロモーター（例えば、リガ
ンドが結合する細胞種に対して特異的）であり、例えば、そのような細胞種は上
述のものである。例えば、ターゲッティングされる内皮細胞における発現は、Ｅ
−セレクチンプロモーターを用いて仲介することができる（例えば、Whelanら、
TIBS, 21, 65-69 (1996)を参照）：ターゲッティングされる前立腺癌細胞におけ
るパッセンジャー遺伝子の発現は、ＰＳＡプロモーター（例えば、Schuurら、J.
Cell Biol., 271, 7043 (1996)、Pangら、Cancer Res., 57, 495 (1997)を参照
）またはＥ２Ｆプロモーターを用いて仲介することができる。さらに、プロモー
ターは、組織特異的レセプター、例えば、本明細書中で述べるレセプターに対す
るプロモーターであり得、さらに他の組織特異的プロモーター系が当該分野で公
知である。あるいは、非天然アミノ酸は、調節可能なプロモーター（例えば、メ
タロチオネインプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、ＲＵ４８
６応答性プロモーターなど）の制御下に置くことができる。
【００３９】 改変蛋白質（例えば、組換えファイバー蛋白質またはリガンドを有するコート
蛋白質）および存在する場合には非天然アミノ酸）は、任意の適切な方法によっ
てアデノウイルスに組み込むことができ、これらの方法の多くは当該分野で公知
である。本明細書中で述べるように、蛋白質は、好ましくは発現ベクター（例え
ば、バキュロウイルスベクター）内の遺伝子から大量に産生された産物をアッセ
イすることによって同定される。所望の変異を有するベクター由来の遺伝子は、
容易にプラスミドにサブクローニングすることができ、次いでこれは適切なパッ
ケージング細胞（例えば、ＨＥＫ−２９３細胞）にトランスフェクトされる。ト
ランスフェクトされた細胞は、次いで感染に適した条件下でアデノウイルスとイ
ンキュベートされる。細胞内で特定の頻度で、ベクターとウイルスとの間の相同
組換えは、所望の変異を有するアデノウイルスゲノムを産生するであろう。
蛋白質）および存在する場合には非天然アミノ酸）は、任意の適切な方法によっ
てアデノウイルスに組み込むことができ、これらの方法の多くは当該分野で公知
である。本明細書中で述べるように、蛋白質は、好ましくは発現ベクター（例え
ば、バキュロウイルスベクター）内の遺伝子から大量に産生された産物をアッセ
イすることによって同定される。所望の変異を有するベクター由来の遺伝子は、
容易にプラスミドにサブクローニングすることができ、次いでこれは適切なパッ
ケージング細胞（例えば、ＨＥＫ−２９３細胞）にトランスフェクトされる。ト
ランスフェクトされた細胞は、次いで感染に適した条件下でアデノウイルスとイ
ンキュベートされる。細胞内で特定の頻度で、ベクターとウイルスとの間の相同
組換えは、所望の変異を有するアデノウイルスゲノムを産生するであろう。
【００４０】 本発明のアデノウイルスは、複製能力があるかまたは複製能力がないかのいず
れかであり得る。好ましくは、アデノウイルスベクターは、少なくとも１つの改
変を有するゲノムを含み、ウイルスを複製不能にする（例えば、国際特許出願WO
95/34671（Kovesdiら）を参照）。アデノウイルスゲノムに対する改変としては
、ＤＮＡセグメントの付加、ＤＮＡセグメントの再配列、ＤＮＡセグメントの欠
失、ＤＮＡセグメントの置換、またはＤＮＡ損傷の導入が挙げられるが、これら
に限定されない。ＤＮＡセグメントは、１つのヌクレオチドほど小さくても、ア
デノウイルスゲノムほど大きくても（例えば、３６ｋｂ）よく、あるいは、アデ
ノウイルスビリオン中にパッケージングすることができる最大量と等しくてもよ
い（すなわち、約３８ｋｂ）。アデノウイルスゲノムに対する好ましい改変とし
ては、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、および／またはＥ４領域における改変が挙げられる。
アデノウイルスはまた、好ましくはコインテグレート、すなわち、アデノウイル
スゲノム配列と他の配列（例えば、他のウイルス、ファージまたはプラスミドの
配列）との連結であり得る。
れかであり得る。好ましくは、アデノウイルスベクターは、少なくとも１つの改
変を有するゲノムを含み、ウイルスを複製不能にする（例えば、国際特許出願WO
95/34671（Kovesdiら）を参照）。アデノウイルスゲノムに対する改変としては
、ＤＮＡセグメントの付加、ＤＮＡセグメントの再配列、ＤＮＡセグメントの欠
失、ＤＮＡセグメントの置換、またはＤＮＡ損傷の導入が挙げられるが、これら
に限定されない。ＤＮＡセグメントは、１つのヌクレオチドほど小さくても、ア
デノウイルスゲノムほど大きくても（例えば、３６ｋｂ）よく、あるいは、アデ
ノウイルスビリオン中にパッケージングすることができる最大量と等しくてもよ
い（すなわち、約３８ｋｂ）。アデノウイルスゲノムに対する好ましい改変とし
ては、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、および／またはＥ４領域における改変が挙げられる。
アデノウイルスはまた、好ましくはコインテグレート、すなわち、アデノウイル
スゲノム配列と他の配列（例えば、他のウイルス、ファージまたはプラスミドの
配列）との連結であり得る。
【００４１】 本発明のビリオンおよびアデノウイルスベクターは、それらを遺伝子導入なら
びに他の用途における使用にとって魅力的な選択とする多くの特性を有する。例
えば、多くの実施態様では、該アデノウイルスは、組換えファイバー蛋白質のせ
いで、野生型アデノウイルスほど容易にその天然宿主細胞に感染しない。さらに
、追加の改変のおかげで、このようなビリオンおよびベクターは、先天性または
後天性免疫応答によって宿主からそれほど容易には取り除かれず、従って有効自
由力価(effective free titer)を引き上げ、かつ血清半減期を延長する。さらに
、ビリオンおよびベクターは、本明細書中で議論したように、ウイルス増殖、タ
ーゲッティング、精製、および／または不活化を容易にする、基質に対して特異
的な少なくとも１つの非天然リガンドを有する。このようなリガンドの存在によ
り、予め規定した細胞種または組織内での非天然アミノ酸の発現を効果的に制限
することができる。組織特異的または調節可能プロモーターに対する非天然アミ
ノ酸の結合はさらに、標的とする組織外での非天然アミノ酸の発現を最小限にす
る。リガンドおよび三量化ドメインは、別個のドメインであり得、従って、ファ
イバーの三量化を乱すことなく異なるリガンドを取り込むためにウイルスを容易
に再操作することが可能となる。
びに他の用途における使用にとって魅力的な選択とする多くの特性を有する。例
えば、多くの実施態様では、該アデノウイルスは、組換えファイバー蛋白質のせ
いで、野生型アデノウイルスほど容易にその天然宿主細胞に感染しない。さらに
、追加の改変のおかげで、このようなビリオンおよびベクターは、先天性または
後天性免疫応答によって宿主からそれほど容易には取り除かれず、従って有効自
由力価(effective free titer)を引き上げ、かつ血清半減期を延長する。さらに
、ビリオンおよびベクターは、本明細書中で議論したように、ウイルス増殖、タ
ーゲッティング、精製、および／または不活化を容易にする、基質に対して特異
的な少なくとも１つの非天然リガンドを有する。このようなリガンドの存在によ
り、予め規定した細胞種または組織内での非天然アミノ酸の発現を効果的に制限
することができる。組織特異的または調節可能プロモーターに対する非天然アミ
ノ酸の結合はさらに、標的とする組織外での非天然アミノ酸の発現を最小限にす
る。リガンドおよび三量化ドメインは、別個のドメインであり得、従って、ファ
イバーの三量化を乱すことなく異なるリガンドを取り込むためにウイルスを容易
に再操作することが可能となる。
【００４２】 もちろん、本発明のウイルスは、宿主（例えば、動物）に送達するために、適
切なキャリアに組み込むことができる。そのようなものとして、本発明は、本発
明のアデノウイルスおよび薬理学的に許容できる担体（例えば、薬学的に許容で
きる担体）を含む組成物を提供する。いずれの適切な製剤も本発明の範囲内であ
る。もちろん、正確な処方は、所望の用途の性質（例えば、細胞型、投与様式な
ど）に依存し、多くの適切な製剤は、米国特許第5,559,099号（Wickhamら）に記
載されている。
切なキャリアに組み込むことができる。そのようなものとして、本発明は、本発
明のアデノウイルスおよび薬理学的に許容できる担体（例えば、薬学的に許容で
きる担体）を含む組成物を提供する。いずれの適切な製剤も本発明の範囲内であ
る。もちろん、正確な処方は、所望の用途の性質（例えば、細胞型、投与様式な
ど）に依存し、多くの適切な製剤は、米国特許第5,559,099号（Wickhamら）に記
載されている。
【００４３】 細胞株 本明細書中で述べるように、本発明のアデノウイルスは、ＡＲを結合するその
能力が顕著に低下している（本発明の組換えファイバー蛋白質を含むせいで）の
で、天然ＡＲによって容易にその天然宿主細胞に感染しない。従って、本発明は
、本発明のアデノウイルスを増殖させることができる細胞株を提供する。好まし
くは、細胞株は、少なくとも約１０継代（例えば、約１５継代）、より好ましく
は少なくとも約２０継代（例えば、約２５継代）、または３０継代以上でさえ、
ウイルス増殖を支持することができる。
能力が顕著に低下している（本発明の組換えファイバー蛋白質を含むせいで）の
で、天然ＡＲによって容易にその天然宿主細胞に感染しない。従って、本発明は
、本発明のアデノウイルスを増殖させることができる細胞株を提供する。好まし
くは、細胞株は、少なくとも約１０継代（例えば、約１５継代）、より好ましく
は少なくとも約２０継代（例えば、約２５継代）、または３０継代以上でさえ、
ウイルス増殖を支持することができる。
【００４４】 例えば、アデノウイルスは、最初に、天然ファイバー蛋白質遺伝子を発現する
パッケージング細胞株中で増殖させることができる。従って、得られるウイルス
粒子は、相補細胞株によってコードされた天然ファイバーおよびアデノウイルス
ゲノムによってコードされた非天然ファイバー（例えば、本明細書中で記載のフ
ァイバー）の両方を含むようであり：よって、このような得られるウイルスの母
集団は両方のファイバー型を含む。このような粒子は、天然ファイバー分子を欠
く粒子よりも効率的に天然ファイバーを介してパッケージング細胞株に結合しそ
して侵入することができる。従って、このようなファイバーをコードしている細
胞株の使用により、キメラのターゲッティングされたアデノウイルスファイバー
をコードするアデノウイルスゲノムが適切に高い力価まで増殖しかつ増幅するこ
とが可能となる。結果として得られる天然ファイバー分子をコードする細胞株か
ら産生されたアデノウイルスの「混合」ストックは、天然アデノウイルスファイ
バー分子およびキメラアデノウイルスファイバー分子の両方を含み：しかしなが
ら、粒子は、キメラアデノウイルスファイバーのみをコードするゲノムを含む。
従って、キメラアデノウイルスファイバー分子のみを有するアデノウイルスの純
粋なストックを産生するために、「混合」ストックを使用して、天然ファイバー
を産生しないパッケージング細胞株（例えば、Ｅ１欠失非Ｂ群ウイルス用のＨＥ
Ｋ−２９３）を感染させる。得られるアデノウイルスは、ゲノムによってコード
されるファイバー分子（すなわち、キメラファイバー分子）のみを含む。
パッケージング細胞株中で増殖させることができる。従って、得られるウイルス
粒子は、相補細胞株によってコードされた天然ファイバーおよびアデノウイルス
ゲノムによってコードされた非天然ファイバー（例えば、本明細書中で記載のフ
ァイバー）の両方を含むようであり：よって、このような得られるウイルスの母
集団は両方のファイバー型を含む。このような粒子は、天然ファイバー分子を欠
く粒子よりも効率的に天然ファイバーを介してパッケージング細胞株に結合しそ
して侵入することができる。従って、このようなファイバーをコードしている細
胞株の使用により、キメラのターゲッティングされたアデノウイルスファイバー
をコードするアデノウイルスゲノムが適切に高い力価まで増殖しかつ増幅するこ
とが可能となる。結果として得られる天然ファイバー分子をコードする細胞株か
ら産生されたアデノウイルスの「混合」ストックは、天然アデノウイルスファイ
バー分子およびキメラアデノウイルスファイバー分子の両方を含み：しかしなが
ら、粒子は、キメラアデノウイルスファイバーのみをコードするゲノムを含む。
従って、キメラアデノウイルスファイバー分子のみを有するアデノウイルスの純
粋なストックを産生するために、「混合」ストックを使用して、天然ファイバー
を産生しないパッケージング細胞株（例えば、Ｅ１欠失非Ｂ群ウイルス用のＨＥ
Ｋ−２９３）を感染させる。得られるアデノウイルスは、ゲノムによってコード
されるファイバー分子（すなわち、キメラファイバー分子）のみを含む。
【００４５】 類似のファイバー相補細胞株が産生されており、ファイバー遺伝子を欠く変異
アデノウイルスを増殖させるために使用されている。しかしながら、これらの細
胞株の産生速度は、一般に、ファイバーを発現するアデノウイルス粒子の力価に
匹敵するファイバー欠失アデノウイルスのアデノウイルス力価を産生するに十分
なほど大きくなかった。このような変異体によって産生される力価が低いことは
、変異アデノウイルスゲノムをより十分に相補するために天然ファイバーの発現
を一時的に調節することによって改善することができる。このような改善された
細胞株を産生するための１つの戦略は、細胞がアデノウイルスに感染するとファ
イバー産生が制御されかつ活性化されるように調節可能プロモーターを使用する
ことである。あるいは、相補細胞株中のファイバー遺伝子に導入された有効ｍＲ
ＮＡスプライシング部位は、細胞株中でのファイバー蛋白質産生のレベルを改善
する。
アデノウイルスを増殖させるために使用されている。しかしながら、これらの細
胞株の産生速度は、一般に、ファイバーを発現するアデノウイルス粒子の力価に
匹敵するファイバー欠失アデノウイルスのアデノウイルス力価を産生するに十分
なほど大きくなかった。このような変異体によって産生される力価が低いことは
、変異アデノウイルスゲノムをより十分に相補するために天然ファイバーの発現
を一時的に調節することによって改善することができる。このような改善された
細胞株を産生するための１つの戦略は、細胞がアデノウイルスに感染するとファ
イバー産生が制御されかつ活性化されるように調節可能プロモーターを使用する
ことである。あるいは、相補細胞株中のファイバー遺伝子に導入された有効ｍＲ
ＮＡスプライシング部位は、細胞株中でのファイバー蛋白質産生のレベルを改善
する。
【００４６】 所定の細胞表面結合部位に対して特異的なリガンドを含むようにアデノウイル
スが操作される場合、そのレセプターを発現しかつアデノウイルス増殖を支持す
ることができるいずれの細胞株も、適切な宿主細胞株である。しかしながら、多
くのリガンドが細胞表面結合部位を結合しないので（特に本明細書中で議論する
新規リガンドのいくつか）、細胞株はリガンドに対する基質を発現するように操
作することができる。
スが操作される場合、そのレセプターを発現しかつアデノウイルス増殖を支持す
ることができるいずれの細胞株も、適切な宿主細胞株である。しかしながら、多
くのリガンドが細胞表面結合部位を結合しないので（特に本明細書中で議論する
新規リガンドのいくつか）、細胞株はリガンドに対する基質を発現するように操
作することができる。
【００４７】 本発明は、非天然細胞表面レセプター（擬レセプター）を発現する細胞株を提
供し、このレセプターに、当該レセプターに対するリガンドを有するウイルスが
結合する。ウイルス増殖を支持することができるいずれの細胞株も、本発明にお
ける使用に適した細胞株である。ウイルスがウイルス複製に不可欠な遺伝子を欠
く場合、好ましくは、細胞株は相補的なレベルでこのような遺伝子産物を発現す
る（例えば、国際特許出願WO 95/34671（Kovesdiら）、米国特許第5,658,724号
（DeLuca）および同第5,804,413号（DeLuca）を参照）。ウイルスがアデノウイ
ルスである場合、好ましくは本発明の細胞株はＨＥＫ−２９３細胞由来である。
ウイルスがヘルペスウイルスである場合、好ましくは本発明の細胞株はＶＥＲＯ
細胞由来である。
供し、このレセプターに、当該レセプターに対するリガンドを有するウイルスが
結合する。ウイルス増殖を支持することができるいずれの細胞株も、本発明にお
ける使用に適した細胞株である。ウイルスがウイルス複製に不可欠な遺伝子を欠
く場合、好ましくは、細胞株は相補的なレベルでこのような遺伝子産物を発現す
る（例えば、国際特許出願WO 95/34671（Kovesdiら）、米国特許第5,658,724号
（DeLuca）および同第5,804,413号（DeLuca）を参照）。ウイルスがアデノウイ
ルスである場合、好ましくは本発明の細胞株はＨＥＫ−２９３細胞由来である。
ウイルスがヘルペスウイルスである場合、好ましくは本発明の細胞株はＶＥＲＯ
細胞由来である。
【００４８】 非天然細胞表面結合部位は基質分子（例えば、本明細書中で記載のもの）であ
り、その基質に選択的に結合するリガンドを有するアデノウイルスは、細胞に結
合することができ、それによって細胞侵入を促進する。結合部位は、アデノウイ
ルスコートに取り込まれた非天然リガンドまたはウイルスに対してネイティブな
リガンドを認識することができる。例えば、非天然ウイルスリガンドがタグペプ
チドである場合、結合部位は、タグを認識する単鎖抗体（ＳｃＡｂ）レセプター
であり得る。あるいは、ＳｃＡｂは、変異したファイバーノブの領域に存在する
エピトープ（存在する場合）、または天然アデノウイルスコート蛋白質上（例え
ば、ファイバー、ペントン、ヘキソンなどの上）に存在するエピトープでさえ認
識することができる。あるいは、非天然リガンドが細胞表面基質（例えば、膜結
合蛋白質）を認識する場合、結合部位はその基質を含むことができる。基質結合
部位が細胞表面レセプターに対してネイティブである場合、細胞株は、細胞シグ
ナル伝達経路と相互作用する能力が低下した変異体レセプター（例えば、ＮＭＤ
Ａ（Liら、Nat. Biotech., 14, 989 (1996)等の切り詰められたレセプター、）
、イオンチャネルとして作用する能力が低下した変異レセプター、または他の改
変を有する変異レセプターを発現することができる。このような改変蛋白質を介
する感染は、細胞内伝達経路およびそれらの種々の応答要素の活性化を低減する
ことによって、宿主細胞代謝に対するウイルス感染の二次的影響を最小限にする
。結合部位の選択は、アデノウイルスの性質に大いに依存する。しかしながら、
特定の細胞種に対するウイルスの特異性を促進するために、結合部位は好ましく
は天然哺乳動物ＡＲではない。さらに、結合部位は、ウイルスに接近可能な細胞
の表面上で発現されなければならない。従って、結合部位が蛋白質である場合、
結合部位は、好ましくは、膜への適切な組み込みを促進するために、リーダー配
列および膜結合配列(membrane tethering sequence)を有する（例えば、Davitz
ら、J. Exp. Med., 163, 1150 (1986) を参照）。
り、その基質に選択的に結合するリガンドを有するアデノウイルスは、細胞に結
合することができ、それによって細胞侵入を促進する。結合部位は、アデノウイ
ルスコートに取り込まれた非天然リガンドまたはウイルスに対してネイティブな
リガンドを認識することができる。例えば、非天然ウイルスリガンドがタグペプ
チドである場合、結合部位は、タグを認識する単鎖抗体（ＳｃＡｂ）レセプター
であり得る。あるいは、ＳｃＡｂは、変異したファイバーノブの領域に存在する
エピトープ（存在する場合）、または天然アデノウイルスコート蛋白質上（例え
ば、ファイバー、ペントン、ヘキソンなどの上）に存在するエピトープでさえ認
識することができる。あるいは、非天然リガンドが細胞表面基質（例えば、膜結
合蛋白質）を認識する場合、結合部位はその基質を含むことができる。基質結合
部位が細胞表面レセプターに対してネイティブである場合、細胞株は、細胞シグ
ナル伝達経路と相互作用する能力が低下した変異体レセプター（例えば、ＮＭＤ
Ａ（Liら、Nat. Biotech., 14, 989 (1996)等の切り詰められたレセプター、）
、イオンチャネルとして作用する能力が低下した変異レセプター、または他の改
変を有する変異レセプターを発現することができる。このような改変蛋白質を介
する感染は、細胞内伝達経路およびそれらの種々の応答要素の活性化を低減する
ことによって、宿主細胞代謝に対するウイルス感染の二次的影響を最小限にする
。結合部位の選択は、アデノウイルスの性質に大いに依存する。しかしながら、
特定の細胞種に対するウイルスの特異性を促進するために、結合部位は好ましく
は天然哺乳動物ＡＲではない。さらに、結合部位は、ウイルスに接近可能な細胞
の表面上で発現されなければならない。従って、結合部位が蛋白質である場合、
結合部位は、好ましくは、膜への適切な組み込みを促進するために、リーダー配
列および膜結合配列(membrane tethering sequence)を有する（例えば、Davitz
ら、J. Exp. Med., 163, 1150 (1986) を参照）。
【００４９】 細胞株は、任意の適切な方法によって産生することができる。例えば、非天然
レセプターをコードする核酸を含むベクター（例えば、オリゴヌクレオチドベク
ター、プラスミドベクター、ウイルスベクターまたは他のベクター）は、従来の
手段によってもととなる細胞株に導入することができる。好ましくは、ベクター
はまた、それを有する細胞が選択されるのを可能にする試薬をコードする（例え
ば、ベクターは、該プラスミドを有していない細胞を殺す抗生物質に対する耐性
をコードすることができる）。特定の頻度で、ベクターは、非天然レセプターを
発現する形質転換細胞株を産生するために、細胞ゲノムと組換えを起こすであろ
う。
レセプターをコードする核酸を含むベクター（例えば、オリゴヌクレオチドベク
ター、プラスミドベクター、ウイルスベクターまたは他のベクター）は、従来の
手段によってもととなる細胞株に導入することができる。好ましくは、ベクター
はまた、それを有する細胞が選択されるのを可能にする試薬をコードする（例え
ば、ベクターは、該プラスミドを有していない細胞を殺す抗生物質に対する耐性
をコードすることができる）。特定の頻度で、ベクターは、非天然レセプターを
発現する形質転換細胞株を産生するために、細胞ゲノムと組換えを起こすであろ
う。
【００５０】 実施例 当業者は、前述の記載を読んだ後に本発明を十分に実施することができると考
えられるが、以下の実施例は、その特徴のいくつかをさらに説明する。特に、実
施例は、いくつかの組換えファイバー蛋白質の構築を示し、これらの各蛋白質は
天然アデノウイルス基質に対して低下した親和性を示す。実施例はさらに、この
ような組換えファイバー蛋白質のアデノウイルスベクターへの含有、および非天
然リガンドを用いるこのようなベクターの再ターゲッティングを示す。実施例は
また、選択的にターゲッティングされたウイルスを増殖させることができる擬レ
セプター細胞株の成功した構築を示す。これらの実施例は、純粋に例示目的で包
含されるので、いかようにも本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
えられるが、以下の実施例は、その特徴のいくつかをさらに説明する。特に、実
施例は、いくつかの組換えファイバー蛋白質の構築を示し、これらの各蛋白質は
天然アデノウイルス基質に対して低下した親和性を示す。実施例はさらに、この
ような組換えファイバー蛋白質のアデノウイルスベクターへの含有、および非天
然リガンドを用いるこのようなベクターの再ターゲッティングを示す。実施例は
また、選択的にターゲッティングされたウイルスを増殖させることができる擬レ
セプター細胞株の成功した構築を示す。これらの実施例は、純粋に例示目的で包
含されるので、いかようにも本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【００５１】 これらの実施例で使用した手順、例えば、アフィニティークロマトグラフィー
、サザンブロット、PCR、DNA配列決定、ベクター構築（DNA抽出、単離、制限消
化、ライゲーションなどを含む）、細胞培養（抗生物質選択を含む）、細胞のト
ランスフェクション、蛋白質アッセイ（ウエスタンブロッティング、免疫沈降、
免疫蛍光）などは、当業者によって慣例的に実施される技術である（一般的にSa
mbrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab
oratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)を参照）。従って、簡潔のために、実
験プロトコルは詳細に議論しない。
、サザンブロット、PCR、DNA配列決定、ベクター構築（DNA抽出、単離、制限消
化、ライゲーションなどを含む）、細胞培養（抗生物質選択を含む）、細胞のト
ランスフェクション、蛋白質アッセイ（ウエスタンブロッティング、免疫沈降、
免疫蛍光）などは、当業者によって慣例的に実施される技術である（一般的にSa
mbrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab
oratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)を参照）。従って、簡潔のために、実
験プロトコルは詳細に議論しない。
【００５２】 （実施例１） 本実施例は、CAR蛋白質に対して低下した親和性を示す変異ファイバー三量体
を記載する。
を記載する。
【００５３】 標準的な部位特異的(site-directed)突然変異誘発を用いて、天然Ad5ファイバ
ーノブ配列（配列番号１）におけるほぼすべての主要なシートおよびループに変
異を導入した。変異誘発の第１シリーズでは、ループ内の３〜６の隣接アミノ酸
を同じ数のグリシン残基で置換するという置換変異を設計し、変異誘発の第２シ
リーズでは、１〜４のアミノ酸を天然配列から欠失させるという変異を設計した
。広範囲の点変異(extensive point mutation)もまた行った。12アミノ酸を欠失
させ、テトラペプチド配列で置換する１つの追加の変異体を設計した。
ーノブ配列（配列番号１）におけるほぼすべての主要なシートおよびループに変
異を導入した。変異誘発の第１シリーズでは、ループ内の３〜６の隣接アミノ酸
を同じ数のグリシン残基で置換するという置換変異を設計し、変異誘発の第２シ
リーズでは、１〜４のアミノ酸を天然配列から欠失させるという変異を設計した
。広範囲の点変異(extensive point mutation)もまた行った。12アミノ酸を欠失
させ、テトラペプチド配列で置換する１つの追加の変異体を設計した。
【００５４】 それぞれのバキュロウイルスクローン（それぞれ組換え変異蛋白質遺伝子の１
つを含む）を作製し、これを使用して昆虫細胞において組換え変異ノブ蛋白質を
産生した。バキュロウイルス感染昆虫細胞を、感染３日後に凍結融解し、いずれ
の可溶性組換え変異蛋白質も放出した（PBS１mlあたり約107細胞）。凍結融解し
たライセートを遠心分離し、可溶性画分および不溶性ペレットを収集した。可溶
性および不溶性画分のウエスタン分析により、可溶性画分中に変異および天然フ
ァイバーノブが同様のレベルで存在したことが明らかになった。溶解性を保持し
ていた変異体は、適切に折り畳まれかつ三量化した蛋白質を表し、これらを表１
に示す。表では、Ad5ファイバーの変異した残基（単数または複数）の位置を括
弧内に記述することによって、変異を示す。天然残基（単数または複数）の同一
性は括弧の左に示し、任意の置換残基（単数または複数）の同一性は括弧の右に
示す。欠失は記号「Δ」を用いてさらに表す。
つを含む）を作製し、これを使用して昆虫細胞において組換え変異ノブ蛋白質を
産生した。バキュロウイルス感染昆虫細胞を、感染３日後に凍結融解し、いずれ
の可溶性組換え変異蛋白質も放出した（PBS１mlあたり約107細胞）。凍結融解し
たライセートを遠心分離し、可溶性画分および不溶性ペレットを収集した。可溶
性および不溶性画分のウエスタン分析により、可溶性画分中に変異および天然フ
ァイバーノブが同様のレベルで存在したことが明らかになった。溶解性を保持し
ていた変異体は、適切に折り畳まれかつ三量化した蛋白質を表し、これらを表１
に示す。表では、Ad5ファイバーの変異した残基（単数または複数）の位置を括
弧内に記述することによって、変異を示す。天然残基（単数または複数）の同一
性は括弧の左に示し、任意の置換残基（単数または複数）の同一性は括弧の右に
示す。欠失は記号「Δ」を用いてさらに表す。
【００５５】
【表１】
【００５６】 所定の変異ファイバーがCARに対して低下した親和性を有するかどうかを決定
するために、A549細胞を三量体変異体または天然ファイバーノブのいずれかと予
備インキュベートし、続いて放射性標識化Ad5ウイルスとインキュベートするこ
とによって、競合実験を行った。A549細胞と予備インキュベートした天然ノブの
１μl容量または10μl容量のいずれも、コンペティター(competitor)の不在下で
測定して、細胞に対する標識化Ad5の結合を90％以上遮断した。このアッセイで
は、ファイバーが仲介するAd5細胞結合または遺伝子形質導入を遮断するにあた
り、天然ノブよりも効果的でなかったいずれの可溶性三量体変異体も、CARに対
して親和性が低下していると考えられた。このアッセイにおいてCARに対して低
下した親和性を示すこれらの三量体変異ファイバーを表２に示す。
するために、A549細胞を三量体変異体または天然ファイバーノブのいずれかと予
備インキュベートし、続いて放射性標識化Ad5ウイルスとインキュベートするこ
とによって、競合実験を行った。A549細胞と予備インキュベートした天然ノブの
１μl容量または10μl容量のいずれも、コンペティター(competitor)の不在下で
測定して、細胞に対する標識化Ad5の結合を90％以上遮断した。このアッセイで
は、ファイバーが仲介するAd5細胞結合または遺伝子形質導入を遮断するにあた
り、天然ノブよりも効果的でなかったいずれの可溶性三量体変異体も、CARに対
して親和性が低下していると考えられた。このアッセイにおいてCARに対して低
下した親和性を示すこれらの三量体変異ファイバーを表２に示す。
【００５７】 おおよそ1500万の昆虫細胞をそれぞれバキュロウイルスベクター（MOI=10）に
感染させ、それらを３日間培養することによって、三量体変異ファイバー蛋白質
を大量に産生した。細胞を採取し、凍結融解し、遠心分離によって細胞デブリス
を除去した。上澄みにNaClを加えて最終濃度750mlにし、次いで500μlのTALONTM 樹脂に上澄みを加えた。25℃で１時間後、2,500で２分間樹脂を遠心分離した。
上澄みを除去し、樹脂を10mlの750mMのNaCl中に再懸濁させた。30分間のインキ
ュベーション後、樹脂懸濁液をカラムに通した。２mlの溶出液（20mMのTRIS、pH
8.0、100mMのNaCl、150mMのイミダゾール）を用いて変異体蛋白質を溶出した。
750mMのNaClを含むPBSに対して１回、500mMのNaClを含むPBSに対して１回、250m
MのNaClを含むPBSに対して１回、溶出液を透析した。標準的方法によって蛋白質
濃度を決定し、ウエスタン分析によって蛋白質の完全性を確認した。
感染させ、それらを３日間培養することによって、三量体変異ファイバー蛋白質
を大量に産生した。細胞を採取し、凍結融解し、遠心分離によって細胞デブリス
を除去した。上澄みにNaClを加えて最終濃度750mlにし、次いで500μlのTALONTM 樹脂に上澄みを加えた。25℃で１時間後、2,500で２分間樹脂を遠心分離した。
上澄みを除去し、樹脂を10mlの750mMのNaCl中に再懸濁させた。30分間のインキ
ュベーション後、樹脂懸濁液をカラムに通した。２mlの溶出液（20mMのTRIS、pH
8.0、100mMのNaCl、150mMのイミダゾール）を用いて変異体蛋白質を溶出した。
750mMのNaClを含むPBSに対して１回、500mMのNaClを含むPBSに対して１回、250m
MのNaClを含むPBSに対して１回、溶出液を透析した。標準的方法によって蛋白質
濃度を決定し、ウエスタン分析によって蛋白質の完全性を確認した。
【００５８】 精製した蛋白質をAd5キャプシドとの競合アッセイに供して、各変異体のCARと
の相互作用の低下の程度を評価した。各変異蛋白質、ならびに野生型Ad5ファイ
バーの連続希釈物を、24ウェルプレートのA549細胞（105細胞／ウェル）に加え
た。この予備インキュベーション後、lacZ遺伝子を含むAd5ベクターを各ウェル
に加えた（MOI=10）。37℃で１時間のインキュベーション後、接種物を除去し、
細胞を培地で洗浄し、次いで培地（５％FCSを含むDMEM）を加えた。細胞を一晩
インキュベートし、感染18時間後に溶解し、標準的方法によってβ-ガラクトシ
ダーゼ活性についてアッセイした。予備インキュベーション蛋白質の濃度に対し
てβ-ガラクトシダーゼ活性の程度をプロットすることにより、各蛋白質のIC50
値（50％レベルでの競合蛋白質の濃度）の評価が可能となった。この方法によっ
て計算した、各変異が低下させたCAR結合の程度を表２に示す。
の相互作用の低下の程度を評価した。各変異蛋白質、ならびに野生型Ad5ファイ
バーの連続希釈物を、24ウェルプレートのA549細胞（105細胞／ウェル）に加え
た。この予備インキュベーション後、lacZ遺伝子を含むAd5ベクターを各ウェル
に加えた（MOI=10）。37℃で１時間のインキュベーション後、接種物を除去し、
細胞を培地で洗浄し、次いで培地（５％FCSを含むDMEM）を加えた。細胞を一晩
インキュベートし、感染18時間後に溶解し、標準的方法によってβ-ガラクトシ
ダーゼ活性についてアッセイした。予備インキュベーション蛋白質の濃度に対し
てβ-ガラクトシダーゼ活性の程度をプロットすることにより、各蛋白質のIC50
値（50％レベルでの競合蛋白質の濃度）の評価が可能となった。この方法によっ
て計算した、各変異が低下させたCAR結合の程度を表２に示す。
【００５９】
【表２】
【００６０】 （実施例２） 本実施例は、CAR蛋白質に対して低下した親和性を示す組換えファイバー蛋白
質を記載する。
質を記載する。
【００６１】 変異Ad5-1、Ad5-2、Ad5-4、Ad5-5およびAd5-9に対応するAd9および長Ad41ファ
イバー蛋白質（図1Aおよび1Bを参照）を作製した。得られた変異蛋白質は可溶性
であり、それぞれを実施例１に記載のように野生型Ad5に対する競合アッセイに
使用し、変異がCAR結合に影響を与えたかどうかを評価した。これらの実験の結
果（表３に示す）は、CAR結合にとって重要な残基がアデノウイルス血清型の間
で保存されていることを明らかにする。
イバー蛋白質（図1Aおよび1Bを参照）を作製した。得られた変異蛋白質は可溶性
であり、それぞれを実施例１に記載のように野生型Ad5に対する競合アッセイに
使用し、変異がCAR結合に影響を与えたかどうかを評価した。これらの実験の結
果（表３に示す）は、CAR結合にとって重要な残基がアデノウイルス血清型の間
で保存されていることを明らかにする。
【００６２】
【表３】
【００６３】 （実施例３） 本実施例は、天然細胞結合機能を欠く（しかし擬レセプターに対してはターゲ
ッティングされる）アデノウイルスを複製することができる細胞株を構築するた
めの擬レセプターの作製を記載する。特に、例示の擬レセプターは、HAを認識す
る単鎖抗体由来の結合ドメインを含む。
ッティングされる）アデノウイルスを複製することができる細胞株を構築するた
めの擬レセプターの作製を記載する。特に、例示の擬レセプターは、HAを認識す
る単鎖抗体由来の結合ドメインを含む。
【００６４】 N-Term-VL-VH融合蛋白質として抗HA ScFvを構築した。VLおよびVH遺伝子のκ-
またはγ２β-およびC-末端に対して特異的なプライマーを用いて、HA抗体を産
生するハイブリドーマから得たRNA上でRT-PCRを行った（Gillilandら、Tissue A
ntigens, 47, 1-20 (1996)を参照）。得られたPCR産物の配列決定後、特異的オ
リゴヌクレオチドを設計して、PCRの第２ラウンドでVL-VH融合を増幅した。最終
PCR産物をクローニングして、E. coli中で抗HA ScFvを産生するためのプラスミ
ドを作製した。発現した蛋白質は、ELISAアッセイのウエスタン分析によってHA
タグ化ペントンベースに対する結合を検出するためのC-末端Eペプチドを有する
。プラスミドで細菌細胞を形質転換して、Eペプチドを認識する抗体を用いたウ
エスタン分析により、予想したサイズの蛋白質が明らかになった。
またはγ２β-およびC-末端に対して特異的なプライマーを用いて、HA抗体を産
生するハイブリドーマから得たRNA上でRT-PCRを行った（Gillilandら、Tissue A
ntigens, 47, 1-20 (1996)を参照）。得られたPCR産物の配列決定後、特異的オ
リゴヌクレオチドを設計して、PCRの第２ラウンドでVL-VH融合を増幅した。最終
PCR産物をクローニングして、E. coli中で抗HA ScFvを産生するためのプラスミ
ドを作製した。発現した蛋白質は、ELISAアッセイのウエスタン分析によってHA
タグ化ペントンベースに対する結合を検出するためのC-末端Eペプチドを有する
。プラスミドで細菌細胞を形質転換して、Eペプチドを認識する抗体を用いたウ
エスタン分析により、予想したサイズの蛋白質が明らかになった。
【００６５】 抗HA ScFvが機能的であったかどうかを決定するために、それをHAエピトープ
を含むアデノウイルスコート蛋白質（組換えペントンベース）を用いるプロテイ
ンＡ免疫沈降アッセイに使用した。抗HA ScFvはHA含有ペントンベース蛋白質を
沈殿させることができた。これらの結果は、非天然リガンドを有するアデノウイ
ルス（すなわちHA）を結合するための擬レセプターの細胞外部分の構築に成功し
たことを示す。
を含むアデノウイルスコート蛋白質（組換えペントンベース）を用いるプロテイ
ンＡ免疫沈降アッセイに使用した。抗HA ScFvはHA含有ペントンベース蛋白質を
沈殿させることができた。これらの結果は、非天然リガンドを有するアデノウイ
ルス（すなわちHA）を結合するための擬レセプターの細胞外部分の構築に成功し
たことを示す。
【００６６】 抗HA擬レセプター全体を作製するために、mycエピトープのC-末端対をコード
する配列、続いてPDGFレセプター膜貫通アンカーを用いて抗HA ScFvをフレーム
中にクローニングした。この擬レセプターの全体配列は、配列番号28で示す。こ
の配列を含む真核細胞発現プラスミド、pSc(HA)をHEK-293細胞にトランスフェク
トした。次の日、pSc(HA)トランスフェクト細胞またはコントロールScFv構築物
でトランスフェクトした細胞を、フルオレセインタグ化HAペプチド（HA*）また
はフルオレセインタグ化スクランブル(scrambled)HAペプチド(scrHA*)と氷上で3
0分間インキュベートした。HA*とpSc(HA)トランスフェクト細胞とのインキュベ
ーション後、別個の細胞母集団が特に細胞膜の周りで明るく蛍光を発していたこ
とを見出した。scrHA*ペプチドとインキュベートしたpSc(HA)トランスフェクト
細胞はこの蛍光パターンを示さなかったし、コントロールプラスミドでトランス
フェクトし、次いでHA*とインキュベートした細胞もこの蛍光パターンを示さな
かった。HA*とインキュベートしたpSc(HA)トランスフェクト細胞の増強された蛍
光は、FACS分析によっても示された。さらに、非標識化FLAGペプチドではなく過
剰の非標識化HAペプチドと抗HA擬レセプター細胞とを予備インキュベーションす
ると、HA*のみとインキュベートした細胞上で観察された蛍光パターンが遮断さ
れた。
する配列、続いてPDGFレセプター膜貫通アンカーを用いて抗HA ScFvをフレーム
中にクローニングした。この擬レセプターの全体配列は、配列番号28で示す。こ
の配列を含む真核細胞発現プラスミド、pSc(HA)をHEK-293細胞にトランスフェク
トした。次の日、pSc(HA)トランスフェクト細胞またはコントロールScFv構築物
でトランスフェクトした細胞を、フルオレセインタグ化HAペプチド（HA*）また
はフルオレセインタグ化スクランブル(scrambled)HAペプチド(scrHA*)と氷上で3
0分間インキュベートした。HA*とpSc(HA)トランスフェクト細胞とのインキュベ
ーション後、別個の細胞母集団が特に細胞膜の周りで明るく蛍光を発していたこ
とを見出した。scrHA*ペプチドとインキュベートしたpSc(HA)トランスフェクト
細胞はこの蛍光パターンを示さなかったし、コントロールプラスミドでトランス
フェクトし、次いでHA*とインキュベートした細胞もこの蛍光パターンを示さな
かった。HA*とインキュベートしたpSc(HA)トランスフェクト細胞の増強された蛍
光は、FACS分析によっても示された。さらに、非標識化FLAGペプチドではなく過
剰の非標識化HAペプチドと抗HA擬レセプター細胞とを予備インキュベーションす
ると、HA*のみとインキュベートした細胞上で観察された蛍光パターンが遮断さ
れた。
【００６７】 これらの結果は、本質的に機能的擬レセプターを発現する細胞からなる細胞株
の構築および発現の成功を示している。
の構築および発現の成功を示している。
【００６８】 （実施例４） 本実施例は、CAR蛋白質に対して低下した親和性を示す組換えファイバー蛋白
質を有し、かつ非天然リガンドを有する選択的にターゲッティングされたアデノ
ウイルスを記載する。
質を有し、かつ非天然リガンドを有する選択的にターゲッティングされたアデノ
ウイルスを記載する。
【００６９】 実施例１に記載のAd5-10変異体を、さらに部位特異的突然変異誘発に供して、
HAエピトープを含むポリペプチドをファイバーノブのHIループ（配列番号１のア
ミノ酸543と544との間）に導入した。得られたファイバーは、FGループ中にTAYT
欠失、およびHIループ中に挿入されたHAエピトープ配列を有する。
HAエピトープを含むポリペプチドをファイバーノブのHIループ（配列番号１のア
ミノ酸543と544との間）に導入した。得られたファイバーは、FGループ中にTAYT
欠失、およびHIループ中に挿入されたHAエピトープ配列を有する。
【００７０】 この変異ファイバーをコードする遺伝子を、E1領域に上記ファイバー変異およ
びCMV-駆動性のLacZレポータ遺伝子を有する、完全長のE1およびE3欠失アデノウ
イルスゲノムを含むプラスミド中に組み込んだ。次いでこのプラスミドを線状化
し、そして実施例３に記載の抗HA擬レセプターを発現するHEK-293細胞にトラン
スフェクトした。５日後、細胞を３回凍結融解し、ウイルス含有ライセートを新
鮮な抗HA-293細胞に継代接種した。
びCMV-駆動性のLacZレポータ遺伝子を有する、完全長のE1およびE3欠失アデノウ
イルスゲノムを含むプラスミド中に組み込んだ。次いでこのプラスミドを線状化
し、そして実施例３に記載の抗HA擬レセプターを発現するHEK-293細胞にトラン
スフェクトした。５日後、細胞を３回凍結融解し、ウイルス含有ライセートを新
鮮な抗HA-293細胞に継代接種した。
【００７１】 得られたアデノウイルスを、抗HA-293細胞中でさらに増幅し、次いで標準的方
法を用いて精製した。ベクター（AdZ.F*fg(HA)hi）は、TAYT欠失のせいで、標準
HEK-293細胞上のCARに対して低下した結合能力を示す：しかしながら、このベク
ターは、抗HA-293細胞株上に存在する抗HA擬レセプターに対して、そのHAエピト
ープを介して高い親和性で結合する。
法を用いて精製した。ベクター（AdZ.F*fg(HA)hi）は、TAYT欠失のせいで、標準
HEK-293細胞上のCARに対して低下した結合能力を示す：しかしながら、このベク
ターは、抗HA-293細胞株上に存在する抗HA擬レセプターに対して、そのHAエピト
ープを介して高い親和性で結合する。
【００７２】 （実施例５） 本実施例は、CAR蛋白質に対して低下した親和性を示す組換えファイバー蛋白
質を有し、かつ１つより多い非天然リガンドを有する選択的にターゲッティング
されたアデノウイルスを記載する。
質を有し、かつ１つより多い非天然リガンドを有する選択的にターゲッティング
されたアデノウイルスを記載する。
【００７３】 実施例１に記載のAd5-10変異体を、さらに部位特異的突然変異誘発に供して、
HAエピトープおよび高親和性RGDリガンドを含むポリペプチドをファイバーノブ
のHIループ（配列番号１のアミノ酸543と544との間）に導入した。得られたプラ
スミドは、FGループ中にTAYT欠失、およびHIループ中に挿入されたRGD配列を有
するファイバーをコードする。
HAエピトープおよび高親和性RGDリガンドを含むポリペプチドをファイバーノブ
のHIループ（配列番号１のアミノ酸543と544との間）に導入した。得られたプラ
スミドは、FGループ中にTAYT欠失、およびHIループ中に挿入されたRGD配列を有
するファイバーをコードする。
【００７４】 次いで、この変異ファイバー遺伝子をコードする遺伝子を、E1領域に上記ファ
イバー変異およびCMV-駆動性のLacZレポータ遺伝子を有する、完全長のE1および
E3欠失アデノウイルスゲノムを含むプラスミド中に組み込んだ。次いでこのプラ
スミドを線状にし、そして実施例２に記載の抗HA擬レセプターを発現するHEK-29
3細胞にトランスフェクトした。５日後、細胞を３回凍結融解し、ウイルス含有
ライセートを新鮮なHEK-293細胞に継代接種した。
イバー変異およびCMV-駆動性のLacZレポータ遺伝子を有する、完全長のE1および
E3欠失アデノウイルスゲノムを含むプラスミド中に組み込んだ。次いでこのプラ
スミドを線状にし、そして実施例２に記載の抗HA擬レセプターを発現するHEK-29
3細胞にトランスフェクトした。５日後、細胞を３回凍結融解し、ウイルス含有
ライセートを新鮮なHEK-293細胞に継代接種した。
【００７５】 得られたアデノウイルスを、抗HA-293細胞中でさらに増幅し、次いで標準的方
法を用いて精製した。ベクターは、TAYT欠失のせいで、標準HEK-293細胞上のCAR
に対して低下した結合能力を示す：しかしながら、このベクターは、HIループ中
に存在するRGDリガンドを介して、αvインテグリンを発現する細胞（例えば、腫
瘍細胞）を効率的に感染させる。
法を用いて精製した。ベクターは、TAYT欠失のせいで、標準HEK-293細胞上のCAR
に対して低下した結合能力を示す：しかしながら、このベクターは、HIループ中
に存在するRGDリガンドを介して、αvインテグリンを発現する細胞（例えば、腫
瘍細胞）を効率的に感染させる。
【００７６】 （実施例６） 本実施例は、CAR蛋白質に対して低下した親和性を示す組換えファイバー蛋白
質を有し、かつ非天然リガンドを有する選択的にターゲッティングされたアデノ
ウイルスを記載する。
質を有し、かつ非天然リガンドを有する選択的にターゲッティングされたアデノ
ウイルスを記載する。
【００７７】 実施例１に記載のAd5-3変異体を、さらに部位特異的突然変異誘発に供して、H
Aエピトープを含む18アミノ酸ポリペプチドをファイバーノブのHIループ（配列
番号１のアミノ酸543と544との間）に導入した。得られたファイバーは、ABルー
プのRLNAEK変異、およびHIループ中に挿入されたHAエピトープ配列を有する。
Aエピトープを含む18アミノ酸ポリペプチドをファイバーノブのHIループ（配列
番号１のアミノ酸543と544との間）に導入した。得られたファイバーは、ABルー
プのRLNAEK変異、およびHIループ中に挿入されたHAエピトープ配列を有する。
【００７８】 この変異ファイバーをコードする遺伝子を、E1領域に上記ファイバー変異およ
びCMV-駆動性のLacZレポータ遺伝子を有する、完全長のE1およびE3欠失アデノウ
イルスゲノムを含むプラスミド中に組み込んだ。次いでこのプラスミドを線状に
し、そして実施例３に記載の抗HA擬レセプターを発現するHEK-293細胞にトラン
スフェクトした。５日後、細胞を３回凍結融解し、ウイルス含有ライセートを新
鮮な抗HA-293細胞に継代接種した。
びCMV-駆動性のLacZレポータ遺伝子を有する、完全長のE1およびE3欠失アデノウ
イルスゲノムを含むプラスミド中に組み込んだ。次いでこのプラスミドを線状に
し、そして実施例３に記載の抗HA擬レセプターを発現するHEK-293細胞にトラン
スフェクトした。５日後、細胞を３回凍結融解し、ウイルス含有ライセートを新
鮮な抗HA-293細胞に継代接種した。
【００７９】 得られたアデノウイルスを、抗HA-293細胞中でさらに増幅し、次いで標準的方
法を用いて精製した。ベクター（AdZ.F*ab(HA)hi）は、RLNAEK変異のせいで、標
準HEK-293細胞上のCARに対して低下した結合能力を示す：しかしながら、このベ
クターは、抗HA-293細胞株上に存在する抗HA擬レセプターに対して、そのHAエピ
トープを介して高い親和性で結合する。
法を用いて精製した。ベクター（AdZ.F*ab(HA)hi）は、RLNAEK変異のせいで、標
準HEK-293細胞上のCARに対して低下した結合能力を示す：しかしながら、このベ
クターは、抗HA-293細胞株上に存在する抗HA擬レセプターに対して、そのHAエピ
トープを介して高い親和性で結合する。
【００８０】 （実施例７） 本実施例は、CAR蛋白質に対して低下した親和性を示す組換えファイバー蛋白
質を有し、かつ１つより多い非天然リガンドを有する選択的にターゲッティング
されたアデノウイルスを記載する。
質を有し、かつ１つより多い非天然リガンドを有する選択的にターゲッティング
されたアデノウイルスを記載する。
【００８１】 実施例１に記載のAd5-3変異体を、さらに部位特異的突然変異誘発に供して、H
Aエピトープおよび高親和性RGDリガンドを含むポリペプチドをファイバーノブの
HIループ（配列番号１のアミノ酸543と544との間）に導入した。得られたプラス
ミドは、ABループのRLNAEK変異ならびにHIループ中に挿入されたHAエピトープお
よびRGD配列を有するファイバーをコードする。
Aエピトープおよび高親和性RGDリガンドを含むポリペプチドをファイバーノブの
HIループ（配列番号１のアミノ酸543と544との間）に導入した。得られたプラス
ミドは、ABループのRLNAEK変異ならびにHIループ中に挿入されたHAエピトープお
よびRGD配列を有するファイバーをコードする。
【００８２】 次いで、この変異体ファイバー遺伝子をコードする遺伝子を、E1領域に上記フ
ァイバー変異およびCMV-駆動性のLacZレポータ遺伝子を有する、完全長のE1およ
びE3欠失アデノウイルスゲノムを含むプラスミド中に組み込んだ。次いでこのプ
ラスミドを線状にし、そして実施例３に記載の抗HA擬レセプターを発現するHEK-
293細胞にトランスフェクトした。５日後、細胞を３回凍結融解し、ウイルス含
有ライセートを新鮮な抗HA-293細胞に継代接種した。
ァイバー変異およびCMV-駆動性のLacZレポータ遺伝子を有する、完全長のE1およ
びE3欠失アデノウイルスゲノムを含むプラスミド中に組み込んだ。次いでこのプ
ラスミドを線状にし、そして実施例３に記載の抗HA擬レセプターを発現するHEK-
293細胞にトランスフェクトした。５日後、細胞を３回凍結融解し、ウイルス含
有ライセートを新鮮な抗HA-293細胞に継代接種した。
【００８３】 得られたアデノウイルスを、抗HA-293細胞中でさらに増幅し、次いで標準的方
法を用いて精製した。ベクターは、RLNAEK変異のせいで、標準HEK-293細胞上のC
ARに対して低下した結合能力を示す：しかしながら、このベクターは、抗HA-293
細胞株上に存在する抗HA擬レセプターに対して、そのHAエピトープを介して高い
親和性で結合する。さらに、ウイルスはまた、HIループ中に存在するRGDリガン
ドを介して、αvインテグリンを発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）を効率的に
感染させる。
法を用いて精製した。ベクターは、RLNAEK変異のせいで、標準HEK-293細胞上のC
ARに対して低下した結合能力を示す：しかしながら、このベクターは、抗HA-293
細胞株上に存在する抗HA擬レセプターに対して、そのHAエピトープを介して高い
親和性で結合する。さらに、ウイルスはまた、HIループ中に存在するRGDリガン
ドを介して、αvインテグリンを発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）を効率的に
感染させる。
【００８４】 （実施例８） 本実施例は、CAR蛋白質に対して低下した親和性を示す組換えファイバー蛋白
質を有し、かつ非天然リガンドを有する選択的にターゲッティングされたアデノ
ウイルスを記載する。
質を有し、かつ非天然リガンドを有する選択的にターゲッティングされたアデノ
ウイルスを記載する。
【００８５】 FGループ中のAsn-Pro残基（配列番号７の残基90および91）を欠失するAd2ファ
イバーノブに変異を導入した。さらに、高親和性RGDモチーフをこの蛋白質のHI
ループに導入した。ノブドメインをコードする配列を、Ad5シャフトをコードす
る配列に融合し、キメラAd5-Ad2ファイバーをコードする核酸を得た。この構築
物を、lacZ遺伝子もまた含むAd5ゲノム（Adzウイルス）にクローニングし、天然
ファイバー配列を置換した。得られたウイルスをAdZ.F*(RGD)と呼ぶ。
イバーノブに変異を導入した。さらに、高親和性RGDモチーフをこの蛋白質のHI
ループに導入した。ノブドメインをコードする配列を、Ad5シャフトをコードす
る配列に融合し、キメラAd5-Ad2ファイバーをコードする核酸を得た。この構築
物を、lacZ遺伝子もまた含むAd5ゲノム（Adzウイルス）にクローニングし、天然
ファイバー配列を置換した。得られたウイルスをAdZ.F*(RGD)と呼ぶ。
【００８６】 AdZまたはAdZ.F*(RGD)のいずれかの粒子用量を増量させて、SKOV-3細胞（CAR
およびαvインテグリンの両方を発現する）またはRamos細胞（CARは発現するが
αvは発現しない）のいずれかと、懸濁液（106細胞／300μl培地）中、36℃で１
時間インキュベートし、この後、細胞を洗浄し一晩インキュベートした。インキ
ュベーション後、従来の方法を用いて、細胞をlacZ活性についてアッセイした。
およびαvインテグリンの両方を発現する）またはRamos細胞（CARは発現するが
αvは発現しない）のいずれかと、懸濁液（106細胞／300μl培地）中、36℃で１
時間インキュベートし、この後、細胞を洗浄し一晩インキュベートした。インキ
ュベーション後、従来の方法を用いて、細胞をlacZ活性についてアッセイした。
【００８７】 両方のウイルスによってSKOV-3細胞を形質導入し、一方、AdZによってRamos細
胞を形質導入した(transuded)が、AdZ.F*(RGD)によってはほとんど形質導入され
なかった。これらの結果は、ベクターの天然CAR結合能力が、非天然リガンドを
ウイルスコート蛋白質に加えることによって妨害されたファイバーノブおよびウ
イルスの選択的残基を変異させることによって遮断することができることを示す
。
胞を形質導入した(transuded)が、AdZ.F*(RGD)によってはほとんど形質導入され
なかった。これらの結果は、ベクターの天然CAR結合能力が、非天然リガンドを
ウイルスコート蛋白質に加えることによって妨害されたファイバーノブおよびウ
イルスの選択的残基を変異させることによって遮断することができることを示す
。
【００８８】 （実施例９） 本実施例は、CAR蛋白質に対する組換えファイバー蛋白質の低下した親和性を
示す。
示す。
【００８９】 種々の細胞型（A172、HuVEC、HCAEC、A549、HeLa、HEK-293およびHS68）（106 細胞／300μl培地）を、可溶性Ad5ファイバー蛋白質（３μg/ml）またはペント
ンベース蛋白質（100μg/ml）のいずれかと、37℃で30分間予備インキュベート
した。このインキュベーション後、AdZ、AdZ.F*ab(HA)hiまたはAdZ.F*fg(HA)hi
のいずれか（100ウイルス粒子／細胞）を細胞に加えた。37℃で１時間のインキ
ュベーション後、細胞を２回洗浄し、再度37℃で一晩インキュベートした。イン
キュベーション後、従来の方法を用いて、細胞をlacZ活性についてアッセイした
。HS68ファイバー芽細胞株を除いて、この結果は、Ad5ファイバーとの予備イン
キュベーションはAdZ形質導入を遮断したが、ペントンベースとの予備インキュ
ベーションは遮断しなかったことを示す。対照的に、変異ファイバーを含むウイ
ルスは、ファイバーとの予備インキュベーションによっては遮断されなかったが
、ペントンベースとの予備インキュベーションによっては遮断された。これらの
データは、示すようにファイバーの変異による天然ファイバーに基づく感染の除
去と一致する。
ンベース蛋白質（100μg/ml）のいずれかと、37℃で30分間予備インキュベート
した。このインキュベーション後、AdZ、AdZ.F*ab(HA)hiまたはAdZ.F*fg(HA)hi
のいずれか（100ウイルス粒子／細胞）を細胞に加えた。37℃で１時間のインキ
ュベーション後、細胞を２回洗浄し、再度37℃で一晩インキュベートした。イン
キュベーション後、従来の方法を用いて、細胞をlacZ活性についてアッセイした
。HS68ファイバー芽細胞株を除いて、この結果は、Ad5ファイバーとの予備イン
キュベーションはAdZ形質導入を遮断したが、ペントンベースとの予備インキュ
ベーションは遮断しなかったことを示す。対照的に、変異ファイバーを含むウイ
ルスは、ファイバーとの予備インキュベーションによっては遮断されなかったが
、ペントンベースとの予備インキュベーションによっては遮断された。これらの
データは、示すようにファイバーの変異による天然ファイバーに基づく感染の除
去と一致する。
【００９０】 （実施例１０） 本実施例は、選択的にターゲッティングされたアデノウイルスを用いる、イン
ビボでのウイルスターゲッティングの変化を示す。
ビボでのウイルスターゲッティングの変化を示す。
【００９１】 Balb/Cマウスの頸静脈に、AdZ、AdZ.F*ab(HA)hiまたはAdZ.F*fg(HA)hiのいず
れか（100ml中1010粒子／動物、それぞれ８種の動物）を注入した。実験を２回
１組で行い、２匹の動物をコントロール（100mlの生理食塩水）とした。接種１
日後、動物を実験に供し、それぞれの肝臓を液体窒素中にスナップ凍結(snap-fr
ozen)した。次いで、肝臓を粉砕し、従来の方法によってlacZ活性をアッセイし
、酵素活性／組織重量を決定した。
れか（100ml中1010粒子／動物、それぞれ８種の動物）を注入した。実験を２回
１組で行い、２匹の動物をコントロール（100mlの生理食塩水）とした。接種１
日後、動物を実験に供し、それぞれの肝臓を液体窒素中にスナップ凍結(snap-fr
ozen)した。次いで、肝臓を粉砕し、従来の方法によってlacZ活性をアッセイし
、酵素活性／組織重量を決定した。
【００９２】 AdZ.F*ab(HA)hiまたはAdZ.F*fg(HA)hi接種動物からの肝臓は、AdZを接種した
動物の肝臓と同様の約10％のlacZ活性を示したが、コントロール動物はバックグ
ラウンドレベルの活性を示した。これらの結果は、天然細胞レセプター結合を除
去するファイバー変異が、インビボでの天然親和性を大いに低下させるのに有効
であることを示す。
動物の肝臓と同様の約10％のlacZ活性を示したが、コントロール動物はバックグ
ラウンドレベルの活性を示した。これらの結果は、天然細胞レセプター結合を除
去するファイバー変異が、インビボでの天然親和性を大いに低下させるのに有効
であることを示す。
【００９３】 本明細書中で引用したすべての文献は、ここで参照することにより、各文献が
個々にかつ特別に参考として援用されるように示され、その全体が本明細書中に
示されるのと同程度に、本明細書中に参考として援用される。
個々にかつ特別に参考として援用されるように示され、その全体が本明細書中に
示されるのと同程度に、本明細書中に参考として援用される。
【００９４】 本発明は好ましい実施態様を強調して記載されているが、好ましい実施態様の
変形を使用することができ、本発明が特に本明細書中の記載と別の方法で実施す
ることができると意図されることは、当業者には明らかである。従って、本発明
は、上記特許請求の範囲に規定される本発明の精神および範囲内に含まれるすべ
ての改変を含む。
変形を使用することができ、本発明が特に本明細書中の記載と別の方法で実施す
ることができると意図されることは、当業者には明らかである。従って、本発明
は、上記特許請求の範囲に規定される本発明の精神および範囲内に含まれるすべ
ての改変を含む。
【００９５】
【配列表】
【図１】 図１Ａおよび１Ｂは、ＰＡＭ１００残基重量表を用いるClustal法を使用した
、非Ｂ群血清型ファイバーノブのアミノ酸配列（配列番号５〜１８）の比較を示
す。配列比較の各列の上面の棒の高さは、相同性の程度に関連する。コンセンサ
ス配列およびマジョリティー配列は、それぞれ配列番号２９および３０として示
される。
、非Ｂ群血清型ファイバーノブのアミノ酸配列（配列番号５〜１８）の比較を示
す。配列比較の各列の上面の棒の高さは、相同性の程度に関連する。コンセンサ
ス配列およびマジョリティー配列は、それぞれ配列番号２９および３０として示
される。
【図２】 図２Ａおよび２Ｂは、ＰＡＭ２５０残基重量表を用いるJ. Hein法を使用した
、Ｂ群血清型ファイバーノブのアミノ酸配列（配列番号１９〜２５）の比較を示
す。配列比較の各列の上面の棒の高さは、相同性の程度に関連する。コンセンサ
ス配列およびマジョリティー配列は、それぞれ配列番号３１および３２として示
される。
、Ｂ群血清型ファイバーノブのアミノ酸配列（配列番号１９〜２５）の比較を示
す。配列比較の各列の上面の棒の高さは、相同性の程度に関連する。コンセンサ
ス配列およびマジョリティー配列は、それぞれ配列番号３１および３２として示
される。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１０月３０日（２０００．１０．３０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項３５】 該アデノウイルスゲノムが蛋白質をコードする非天然の核
酸を含み、該核酸が該細胞内で発現して該蛋白質を産生する、請求項３４に記載
の方法。
酸を含み、該核酸が該細胞内で発現して該蛋白質を産生する、請求項３４に記載
の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年９月３日（２００１．９．３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【特許請求の範囲】
【請求項１０】 該変異が該残基の電荷を変化させる、請求項１〜９のいず
れかに記載の組換えファイバー蛋白質。
れかに記載の組換えファイバー蛋白質。
【請求項１１】 該変異が欠失または置換である、請求項１〜１０のいずれ
かに記載の組換えファイバー蛋白質。
かに記載の組換えファイバー蛋白質。
【請求項１２】 請求項１〜１１のいずれかに記載の組換えファイバー蛋白
質を含む三量体であって、天然のアデノウイルス細胞レセプターに対する親和性
が、野生型アデノウイルスファイバー三量体よりも少なくとも約１桁小さい三量
体。
質を含む三量体であって、天然のアデノウイルス細胞レセプターに対する親和性
が、野生型アデノウイルスファイバー三量体よりも少なくとも約１桁小さい三量
体。
【請求項１３】 請求項１２に記載の三量体を含むアデノウイルスビリオン
。
。
【請求項１４】 少なくとも１つの天然ＲＧＤ配列に影響を与える変異を有
するペントンベースを含む、請求項１３に記載のアデノウイルスビリオン。
するペントンベースを含む、請求項１３に記載のアデノウイルスビリオン。
【請求項１５】 少なくとも１つの天然ＨＶＲ配列に影響を与える変異を有
するヘキソンを含む、請求項１３に記載のアデノウイルスビリオン。
するヘキソンを含む、請求項１３に記載のアデノウイルスビリオン。
【請求項１６】 天然のグリコシル化部位またはリン酸化部位を欠く、請求
項１３に記載のアデノウイルスビリオン。
項１３に記載のアデノウイルスビリオン。
【請求項１７】 １級アミン基、エポキシ基、またはジアシルグリセロール
基を含むポリエチレングリコールの脂質誘導体に結合している、請求項１３に記
載のアデノウイルスビリオン。
基を含むポリエチレングリコールの脂質誘導体に結合している、請求項１３に記
載のアデノウイルスビリオン。
【請求項１８】 宿主動物において、野生型アデノウイルスよりも免疫原性
の誘発が小さい、請求項１３に記載のアデノウイルスビリオン。
の誘発が小さい、請求項１３に記載のアデノウイルスビリオン。
【請求項１９】 非アデノウイルス性リガンドを含む、請求項１３に記載の
アデノウイルスビリオン。
アデノウイルスビリオン。
【請求項２０】 該非アデノウイルス性リガンドがファイバーに結合してい
る、請求項１９に記載のアデノウイルスビリオン。
る、請求項１９に記載のアデノウイルスビリオン。
【請求項２１】 該非アデノウイルス性リガンドがペントンに結合している
、請求項１９に記載のアデノウイルスビリオン。
、請求項１９に記載のアデノウイルスビリオン。
【請求項２２】 該非アデノウイルス性リガンドがヘキソンに結合している
、請求項１９に記載のアデノウイルスビリオン。
、請求項１９に記載のアデノウイルスビリオン。
【請求項２３】 該非アデノウイルス性リガンドが蛋白質IX、VIまたはIIIa
に結合している、請求項１９に記載のアデノウイルスビリオン。
に結合している、請求項１９に記載のアデノウイルスビリオン。
【請求項２４】 該非アデノウイルス性リガンドが天然の哺乳動物アデノウ
イルスレセプター以外の基質と結合する、請求項１９に記載のアデノウイルスビ
リオン。
イルスレセプター以外の基質と結合する、請求項１９に記載のアデノウイルスビ
リオン。
【請求項２５】 該非アデノウイルス性リガンドが天然の細胞表面蛋白質以
外の基質と結合する、請求項１９に記載のアデノウイルスビリオン。
外の基質と結合する、請求項１９に記載のアデノウイルスビリオン。
【請求項２６】 該基質が細胞の表面上に存在している、請求項２４または ２５ に記載のアデノウイルスビリオン。
【請求項２７】 請求項１３に記載のアデノウイルスビリオンおよびアデノ
ウイルスゲノムを含む、アデノウイルスベクター。
ウイルスゲノムを含む、アデノウイルスベクター。
【請求項２８】 複製能力がない、請求項２７に記載のアデノウイルスベク
ター。
ター。
【請求項２９】 ＨＥＫ−２９３細胞に増殖的に感染しない、請求項２７に
記載のアデノウイルスベクター。
記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３０】 該ビリオンが非アデノウイルス性リガンドを含み、該アデ
ノウイルスゲノムが転写のための非天然の核酸を含む、請求項２７に記載のアデ
ノウイルスベクター。
ノウイルスゲノムが転写のための非天然の核酸を含む、請求項２７に記載のアデ
ノウイルスベクター。
【請求項３１】 該転写のための非天然の核酸が非アデノウイルス性プロモ
ーターに機能的に連結している、請求項３０に記載のアデノウイルスベクター。
ーターに機能的に連結している、請求項３０に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３２】 該リガンドが細胞の表面上に存在する基質に結合し、該非
アデノウイルス性プロモーターが該細胞内で活性がある、請求項３１に記載のア
デノウイルスベクター。
アデノウイルス性プロモーターが該細胞内で活性がある、請求項３１に記載のア
デノウイルスベクター。
【請求項３３】 該非アデノウイルス性プロモーターが組織特異的プロモー
ターである、請求項３１または３２に記載のアデノウイルスベクター。
ターである、請求項３１または３２に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３４】 該非アデノウイルスプロモーターが調節可能なプロモータ
ーである、請求項３１または３２に記載のアデノウイルスベクター。
ーである、請求項３１または３２に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３５】 細胞を請求項２７に記載のアデノウイルスベクターと接触
させることを含む、細胞の感染方法。
させることを含む、細胞の感染方法。
【請求項３６】 該アデノウイルスゲノムが蛋白質をコードする非天然の核
酸を含み、該核酸が該細胞内で発現して該蛋白質を産生する、請求項３５に記載
の方法。
酸を含み、該核酸が該細胞内で発現して該蛋白質を産生する、請求項３５に記載
の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】 特定の細胞表面結合部位は、狭いクラスの細胞種（例えば、心筋、骨格筋、平
滑筋など）上に存在しても、幾つかの細胞種を含むより広い群上に存在してもよ
い。適切な細胞特異的リガンドを組み込むことによって、ビリオンを任意の所望
の細胞種（例えば、以下のもの）にターゲッティングさせるために使用すること
ができる；神経細胞、グリア細胞、内皮細胞（例えば、組織因子レセプター、Ｆ
ＬＴ−１、ＣＤ３１；ＣＤ３６；ＣＤ３４；ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＩＣＡＭ−
１（McCormickら、J. Biol. Chem., 273, 26323-29 (1998)）；トロンボモジュ
リンレセプター（Lupusら、Suppl., 2, S120 (1998)）；ＶＥＧＦＲ−３（Lymbo
ussakiら、Am. J. Pathol., 153(2), 395-403 (1998)；マンノースレセプター；
ＶＣＡＭ−１（Schwarzacherら、Atherocsclerosis, 122, 59-67 (1996)）また
は他のレセプターを介して）；血餅（例えば、フィブリノーゲンまたはａＩＩｂ
ｂ３ペプチドを介して）、上皮細胞（例えば、セレクチン類、ＶＣＡＭ−１、Ｉ
ＣＡＭ−１などを介する炎症性組織）、ケラチノサイト、濾胞細胞、脂肪細胞、 線維 芽細胞、造血または他の幹細胞、筋芽細胞、筋原線維、心筋細胞、平滑筋、
体細胞、破骨細胞、骨芽細胞、歯芽細胞(tooth blast)、軟骨細胞、メラノサイ
ト、造血細胞など、ならびに上記細胞型のいずれか由来の癌細胞（例えば、前立
腺（例えば、PSMAレセプターを介して（例えば、Schuurら、J. Biol. Chem., 27
1(12), 7043-7051 (1996);Cancer Res., 58, 4055 (1998)））、***、肺、脳（
例えば、グリア芽細胞腫）、白血病／リンパ腫、肝臓、肉腫、骨、結腸、精巣、
卵巣、膀胱、咽喉、胃、膵臓、直腸、皮膚（例えば、メラノーマ）、腎臓など）
。従って、本発明のビリオンは、任意の器官または系（例えば、呼吸器系（例え
ば、気管、上気道、下気道、肺胞）、神経系および知覚器官（例えば、皮膚、耳
、鼻、舌、目）、消化器系（例えば、口腔上皮および知覚器官、唾液腺、胃、小
腸／十二指腸、結腸、胆嚢、膵臓、直腸）、筋系（例えば、骨格筋、結合組織、
腱）、骨格系（例えば、関節（滑膜細胞）、破骨細胞、骨芽細胞など）、免疫系
（例えば、骨髄、幹細胞、脾臓、胸腺、リンパ系など）、循環器系（例えば、筋
結合組織、および／または動脈、静脈、毛細血管の内皮など）、生殖器系（例え
ば、精巣、前立腺、子宮、卵巣）、泌尿器系（例えば、膀胱、腎臓、尿道）、内
分泌腺または外分泌腺（例えば、***、副腎、下垂体）などを含む）内の細胞に
対してターゲッティングすることができる。
滑筋など）上に存在しても、幾つかの細胞種を含むより広い群上に存在してもよ
い。適切な細胞特異的リガンドを組み込むことによって、ビリオンを任意の所望
の細胞種（例えば、以下のもの）にターゲッティングさせるために使用すること
ができる；神経細胞、グリア細胞、内皮細胞（例えば、組織因子レセプター、Ｆ
ＬＴ−１、ＣＤ３１；ＣＤ３６；ＣＤ３４；ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＩＣＡＭ−
１（McCormickら、J. Biol. Chem., 273, 26323-29 (1998)）；トロンボモジュ
リンレセプター（Lupusら、Suppl., 2, S120 (1998)）；ＶＥＧＦＲ−３（Lymbo
ussakiら、Am. J. Pathol., 153(2), 395-403 (1998)；マンノースレセプター；
ＶＣＡＭ−１（Schwarzacherら、Atherocsclerosis, 122, 59-67 (1996)）また
は他のレセプターを介して）；血餅（例えば、フィブリノーゲンまたはａＩＩｂ
ｂ３ペプチドを介して）、上皮細胞（例えば、セレクチン類、ＶＣＡＭ−１、Ｉ
ＣＡＭ−１などを介する炎症性組織）、ケラチノサイト、濾胞細胞、脂肪細胞、 線維 芽細胞、造血または他の幹細胞、筋芽細胞、筋原線維、心筋細胞、平滑筋、
体細胞、破骨細胞、骨芽細胞、歯芽細胞(tooth blast)、軟骨細胞、メラノサイ
ト、造血細胞など、ならびに上記細胞型のいずれか由来の癌細胞（例えば、前立
腺（例えば、PSMAレセプターを介して（例えば、Schuurら、J. Biol. Chem., 27
1(12), 7043-7051 (1996);Cancer Res., 58, 4055 (1998)））、***、肺、脳（
例えば、グリア芽細胞腫）、白血病／リンパ腫、肝臓、肉腫、骨、結腸、精巣、
卵巣、膀胱、咽喉、胃、膵臓、直腸、皮膚（例えば、メラノーマ）、腎臓など）
。従って、本発明のビリオンは、任意の器官または系（例えば、呼吸器系（例え
ば、気管、上気道、下気道、肺胞）、神経系および知覚器官（例えば、皮膚、耳
、鼻、舌、目）、消化器系（例えば、口腔上皮および知覚器官、唾液腺、胃、小
腸／十二指腸、結腸、胆嚢、膵臓、直腸）、筋系（例えば、骨格筋、結合組織、
腱）、骨格系（例えば、関節（滑膜細胞）、破骨細胞、骨芽細胞など）、免疫系
（例えば、骨髄、幹細胞、脾臓、胸腺、リンパ系など）、循環器系（例えば、筋
結合組織、および／または動脈、静脈、毛細血管の内皮など）、生殖器系（例え
ば、精巣、前立腺、子宮、卵巣）、泌尿器系（例えば、膀胱、腎臓、尿道）、内
分泌腺または外分泌腺（例えば、***、副腎、下垂体）などを含む）内の細胞に
対してターゲッティングすることができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３８】 本発明のアデノウイルスベクターがそのビリオン中に非天然アミノ酸および非
アデノウイルスリガンドを含む場合、非天然アミノ酸は、任意の適切なプロモー
ター、例えば、アデノウイルスゲノムまたは非アデノウイルスプロモーターに対
してネイティブであるプロモーターに機能的に連結させることができる。リガン
ドが所望の細胞種にベクターを送達するために使用される場合、好ましくは、非
アデノウイルスプロモーターは、その細胞種内で活性であり、より好ましくは、
その非アデノウイルスプロモーターは、組織特異的プロモーター（例えば、リガ
ンドが結合する細胞種に対して特異的）であり、例えば、そのような細胞種は上
述のものである。例えば、ターゲッティングされる内皮細胞における発現は、Ｅ
−セレクチンプロモーターを用いて仲介することができる（例えば、Whelanら、
TIBS, 21, 65-69 (1996)を参照）：ターゲッティングされる前立腺癌細胞におけ
るパッセンジャー遺伝子の発現は、ＰＳＡプロモーター（例えば、Schuurら、J. B iol. Chem., 271(12), 7043-7051 (1996)、Pangら、Cancer Res., 57, 495 (1
997)を参照）またはＥ２Ｆプロモーターを用いて仲介することができる。さらに
、プロモーターは、組織特異的レセプター、例えば、本明細書中で述べるレセプ
ターに対するプロモーターであり得、さらに他の組織特異的プロモーター系が当
該分野で公知である。あるいは、非天然アミノ酸は、調節可能なプロモーター（
例えば、メタロチオネインプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター
、ＲＵ４８６応答性プロモーターなど）の制御下に置くことができる。
アデノウイルスリガンドを含む場合、非天然アミノ酸は、任意の適切なプロモー
ター、例えば、アデノウイルスゲノムまたは非アデノウイルスプロモーターに対
してネイティブであるプロモーターに機能的に連結させることができる。リガン
ドが所望の細胞種にベクターを送達するために使用される場合、好ましくは、非
アデノウイルスプロモーターは、その細胞種内で活性であり、より好ましくは、
その非アデノウイルスプロモーターは、組織特異的プロモーター（例えば、リガ
ンドが結合する細胞種に対して特異的）であり、例えば、そのような細胞種は上
述のものである。例えば、ターゲッティングされる内皮細胞における発現は、Ｅ
−セレクチンプロモーターを用いて仲介することができる（例えば、Whelanら、
TIBS, 21, 65-69 (1996)を参照）：ターゲッティングされる前立腺癌細胞におけ
るパッセンジャー遺伝子の発現は、ＰＳＡプロモーター（例えば、Schuurら、J. B iol. Chem., 271(12), 7043-7051 (1996)、Pangら、Cancer Res., 57, 495 (1
997)を参照）またはＥ２Ｆプロモーターを用いて仲介することができる。さらに
、プロモーターは、組織特異的レセプター、例えば、本明細書中で述べるレセプ
ターに対するプロモーターであり得、さらに他の組織特異的プロモーター系が当
該分野で公知である。あるいは、非天然アミノ酸は、調節可能なプロモーター（
例えば、メタロチオネインプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター
、ＲＵ４８６応答性プロモーターなど）の制御下に置くことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:92） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ロウエルヴィンク、ペトラス ダヴリュ ー． アメリカ合衆国、メリーランド州 20832、 オルニー、ギャラガー ウェイ 17502 (72)発明者 ブルーダー、ジョゼフ ティー． アメリカ合衆国、メリーランド州 21754、 イジャムズヴィル、ロイアル セイント アンドリュース プレイス 10243 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA32 CA04 DA02 EA02 FA02 GA11 HA01 HA17 4B064 AG32 CA10 CA19 CC24 DA01 DA16 4B065 AA90X AA95X AA95Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4H045 AA10 BA20 CA01 DA86 EA31 EA53 FA74 【要約の続き】
Claims (34)
- 【請求項１】 アデノウイルスファイバー蛋白質のアミノ末端、および三量
化ドメインを含む組換えファイバー蛋白質であって、該三量化ドメインが、野生
型Ａｄ５ファイバー蛋白質のＡＢループ、Ｂシート、ＤＥループ、またはＦＧル
ープに対応する領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基に影響を与える変異を有
するアデノウイルスファイバーノブドメインを含み、且つ該組換えファイバー蛋
白質が真核細胞中で産生されると三量化する、組換えファイバー蛋白質。 - 【請求項２】 該領域がＡＢループである、請求項１に記載の組換えファイ
バー蛋白質。 - 【請求項３】 該領域がＢシートである、請求項１に記載の組換えファイバ
ー蛋白質。 - 【請求項４】 該アミノ酸残基が、野生型Ａｄ５ファイバー蛋白質の４０８
、４０９、４１２〜４１７、４２０、４７４〜４７７および４８７〜４９２から
なる残基の群より選択される残基に対応する、請求項１に記載の組換えファイバ
ー蛋白質。 - 【請求項５】 アデノウイルスファイバー蛋白質のアミノ末端、および三量
化ドメインを含む組換えファイバー蛋白質であって、該三量化ドメインが、野生
型Ａｄ５ファイバー蛋白質の残基４０４〜４０６、４０８、４０９、４１２〜４
１７、４２０、４３９、４４１、４４２、４４９〜４５４、４５６、４５８、４
６０、４６２、４６６、４６７、４６９〜４７２、４７４〜４７７、４８２、４
８５、４８７〜４９２、５０５〜５１２、５１５、５１７、５１９、５２１〜５
２８、５３３、５３５、５３７〜５４９、５５１、５５３、５５５、５５９〜５
６８、５８０または５８１に対応する少なくとも１つのアミノ酸に影響を与える
変異を有するアデノウイルスファイバーノブを含み、且つ該組換えファイバー蛋
白質が真核細胞中で産生されると三量化する、組換えファイバー蛋白質。 - 【請求項６】 該アミノ酸残基が、天然Ａｄ９ファイバー蛋白質の残基１８
９、１９０、１９８、２０１または２６２に対応する、請求項５に記載の組換え
ファイバー蛋白質。 - 【請求項７】 該アミノ酸残基が、天然Ａｄ４１長ファイバー蛋白質の残基
３９５、３９６、４０４、４０７または４７０に対応する、請求項５に記載の組
換えファイバー蛋白質。 - 【請求項８】 該アミノ酸残基が、天然Ａｄ３ファイバー蛋白質の残基１３
６、１５５、１７７、１８１、１９８、２１０、２１１、２１５、２３３、２３
４、２３６、２３８、２４８、２５７、２６０、２６１、２７６、２８４、３０
２、３０３、３１７または３１８に対応する、請求項５に記載の組換えファイバ
ー蛋白質。 - 【請求項９】 該変異が該残基の電荷を変化させる、請求項１〜８のいずれ
かに記載の組換えファイバー蛋白質。 - 【請求項１０】 請求項１〜８のいずれかに記載の組換えファイバー蛋白質
を含む三量体であって、天然のアデノウイルス細胞レセプターに対する親和性が
、野生型アデノウイルスファイバー三量体よりも少なくとも約１桁小さい三量体
。 - 【請求項１１】 請求項１０に記載の三量体を含むアデノウイルスビリオン
。 - 【請求項１２】 少なくとも１つの天然ＲＧＤ配列に影響を与える変異を有
するペントンベースを含む、請求項１１に記載のアデノウイルスビリオン。 - 【請求項１３】 少なくとも１つの天然ＨＶＲ配列に影響を与える変異を有
するヘキソンを含む、請求項１１に記載のアデノウイルスビリオン。 - 【請求項１４】 天然のグリコシル化部位またはリン酸化部位を欠く、請求
項１１に記載のアデノウイルスビリオン。 - 【請求項１５】 １級アミン基、エポキシ基、またはジアシルグリセロール
基を含むポリエチレングリコールの脂質誘導体に結合している、請求項１１に記
載のアデノウイルスビリオン。 - 【請求項１６】 宿主動物において、野生型アデノウイルスよりも免疫原性
の誘発が小さい、請求項１１に記載のアデノウイルスビリオン。 - 【請求項１７】 非アデノウイルス性リガンドを含む、請求項１１に記載の
アデノウイルスビリオン。 - 【請求項１８】 該非アデノウイルス性リガンドがファイバーに結合してい
る、請求項１７に記載のアデノウイルスビリオン。 - 【請求項１９】 該非アデノウイルス性リガンドがペントンに結合している
、請求項１７に記載のアデノウイルスビリオン。 - 【請求項２０】 該非アデノウイルス性リガンドがヘキソンに結合している
、請求項１７に記載のアデノウイルスビリオン。 - 【請求項２１】 該非アデノウイルス性リガンドが蛋白質IX、VIまたはIIIa
に結合している、請求項１７に記載のアデノウイルスビリオン。 - 【請求項２２】 該非アデノウイルス性リガンドが天然の哺乳動物アデノウ
イルスレセプター以外の基質と結合する、請求項１７に記載のアデノウイルスビ
リオン。 - 【請求項２３】 該非アデノウイルス性リガンドが天然の細胞表面蛋白質以
外の基質と結合する、請求項１７に記載のアデノウイルスビリオン。 - 【請求項２４】 該基質が細胞の表面上に存在している、請求項１７に記載
のアデノウイルスビリオン。 - 【請求項２５】 請求項１１に記載のアデノウイルスビリオンおよびアデノ
ウイルスゲノムを含む、アデノウイルスベクター。 - 【請求項２６】 複製能力がない、請求項２５に記載のアデノウイルスベク
ター。 - 【請求項２７】 ＨＥＫ−２９３細胞に増殖的に感染しない、請求項２５に
記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項２８】 該ビリオンが非アデノウイルス性リガンドを含み、該アデ
ノウイルスゲノムが転写のための非天然の核酸を含む、請求項２５に記載のアデ
ノウイルスベクター。 - 【請求項２９】 該転写のための非天然の核酸が非アデノウイルス性プロモ
ーターに機能的に連結している、請求項２５に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項３０】 該リガンドが細胞の表面上に存在する基質に結合し、該非
アデノウイルス性プロモーターが該細胞内で活性がある、請求項２５に記載のア
デノウイルスベクター。 - 【請求項３１】 該非アデノウイルス性プロモーターが組織特異的プロモー
ターである、請求項２９に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項３２】 該非アデノウイルスプロモーターが調節可能なプロモータ
ーである、請求項２９に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項３３】 細胞を請求項２５に記載のアデノウイルスベクターと接触
させることを含む、細胞の感染方法。 - 【請求項３４】 該アデノウイルスゲノムが蛋白質をコードする非天然の核
酸を含み、該核酸が該細胞内で発現して該蛋白質を産生する、請求項３３に記載
の方法。
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