CN101702918B

CN101702918B - 具有e3-19k蛋白的内质网滞留结构域内突变的腺病毒及其在癌症治疗中的应用

Info

Publication number: CN101702918B
Application number: CN2008800082803A
Authority: CN
Inventors: 马内尔·马里亚·卡斯卡利略皮克拉斯; 阿莱纳·格罗; 拉蒙·阿莱马尼博纳斯特雷
Original assignee: Institut Catala dOncologia
Current assignee: Institut Catala dOncologia
Priority date: 2007-03-14
Filing date: 2008-03-12
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2028-03-12
Also published as: PT2137301E; EP2137301A2; US8974777B2; WO2008110579A2; US20100124546A1; JP5746823B2; ES2367227T3; HK1143992A1; CA2680659C; JP2010520762A; EP2137301B1; CA2680659A1; CN101702918A; DK2137301T3; JP2015043777A; WO2008110579A3; ATE510907T1

Abstract

本发明涉及腺病毒，其中所述腺病毒复制并且其包含E3-19K的内质网滞留结构域内的突变，并且涉及所述突变体在治疗癌症中的应用。所述突变病毒还可以包含用于赋予选择性和抗肿瘤功效的DNA序列的其他突变和***。本发明已应用于癌症治疗领域中。

Description

具有E3-19K蛋白的内质网滞留结构域内突变的腺病毒及其在癌症治疗中的应用

技术领域

本发明的领域总体上涉及癌症治疗，更具体地涉及包含在内质网滞留结构域(retention domain)内突变的E3-19K基因的腺病毒以及这些腺病毒在治疗癌症中的应用。

背景技术

当前癌症治疗主要基于化学疗法、放射疗法以及外科手术。尽管在早期阶段进行治疗时成功率较高，但大部分晚期疾病状况是不可治愈的，这是因为肿瘤不能通过外科手术被切除，或者能够给予的放射和化学治疗的剂量由于对正常细胞的毒性而受到限制。为了缓解这个问题，寻求更高选择性和效力的生物技术方案已经得到开发。其中，基因治疗和病毒治疗应用针对癌症具有治疗目的的病毒。在基因治疗中，对病毒进行改造来避免其复制以及来用作治疗性基因材料的媒介物(vehicle)或载体。相反，病毒治疗采用在肿瘤细胞中选择性复制和增殖的病毒。在病毒治疗中，肿瘤细胞由于细胞内的病毒复制所引发的细胞病变效应而非治疗性基因的作用导致细胞死亡。肿瘤细胞内的优先复制(preferential replication)称为肿瘤细胞溶解作用(溶瘤细胞作用，oncolysis)。肿瘤内选择性复制的病毒称为溶瘤细胞病毒。

癌症的病毒治疗早于基因治疗。关于采用病毒进行癌症治疗的首次报道追溯到上个世纪初。在1912年，De Pace发现在***中接种狂犬病毒后肿瘤细胞衰退(De Pace N.Sulla scomparsa di unenorme cranco vegetante del collo dell′utero senza cura chirurgica.Ginecologia 1912；9：82-89.)。此后，许多类型的病毒被注射到肿瘤内以对其进行治疗。存在着多种呈现天然的亲癌性(或癌趋向性，oncotropism)的病毒，例如自主性细小病毒、水泡性口膜炎病毒和呼肠病毒。其他病毒可以进行遗传操作(或基因操作)以实现在肿瘤中的选择性复制。例如，单纯疱疹病毒(HSV)通过缺失核糖核苷酸还原酶基因而被赋予亲瘤性，这种酶活性对于在细胞中，例如肿瘤细胞中进行活性增殖不是必需的。然而，腺病毒，由于其较低的致病性和感染肿瘤细胞的高功效，已成为癌症的病毒治疗和基因治疗中最普遍采用的病毒。

已鉴定51种腺病毒血清型并分成六个不同组，A至F。

5型人腺病毒(Ad5)，属于C组，由二十面体蛋白质衣壳组成，其包含36kb(36,000碱基)的线性DNA。在成年人中，Ad5感染通常是无症状的，但在儿童中却引发感冒和结膜炎。概括地说，Ad5感染上皮细胞，自然感染情况下为支气管上皮细胞。其通过纤维(一种病毒蛋白，像触角一样从衣壳的十二个顶点延伸)与细胞间粘附有关的细胞蛋白(称为柯萨奇-腺病毒受体(CAR))间的相互作用而进入细胞。当病毒DNA到达核时，早期基因(E1至E4)转录开始。待表达的第一基因是来自早期1A区域(E1A)的那些基因。E1A结合于细胞蛋白pRb(视网膜母细胞瘤蛋白)以释放转录因子E2F来激活其他病毒基因如E2、E3、和E4的转录，并且激活活化细胞周期的细胞基因的转录。另一方面，E1B结合于转录因子p53以激活细胞周期并抑制被感染细胞的凋亡。E2编码用于病毒复制的蛋白质。E3编码抑制抗病毒免疫反应的蛋白质。E4编码传输病毒ARN的蛋白质。早期基因的表达导致基因组的复制，并且一旦被复制，导致主要晚期启动子的激活。该启动子驱使mRNA的表达，mRNA通过差异剪接处理得到编码形成衣壳的结构蛋白质的全部RNA。

由于与本发明尤其相关，会更详细地描述E3蛋白质。在病毒生命周期的早期阶段，基因组复制之前，E3基因由E3启动子表达。这个启动子驱使pre-mRNA(mRNA前体)表达，通过剪接生成9种不同的mRNA。在大多数血清型腺病毒，即B、C、D和E组腺病毒中，七种蛋白质(多肽)从以下这些mRNA合成：E3-12.5K、E3-6.7K、E3-19K、E3-11.6K(也称为腺病毒死亡蛋白或ADP)、E3-10.4K(RIDα)、E3-14.5K(RIDβ)、和E3-14.7K(基因组中从左到右的位置)。在晚期阶段，E3启动子被抑制，而主要晚期启动子被激活。从该启动子，一个pre-mRNA(mRNA前体)被合成，通过剪接而得到不同的mRNA。仅由这些晚期mRNA合成的E3蛋白是E3-11.6K(ADP)。ADP或E3-11.6K是位于核、高尔基体和内质网膜的完整膜蛋白。它在被感染细胞的溶解中发挥作用。剩余E3蛋白具有抑制对被感染细胞的免疫反应相关的功能。例如，E3-6.7K、RIDα、RIDβ和E3-14.7K保护细胞免于TNF-介导的细胞凋亡。E3-19K是膜蛋白，其使主要组织相容性1类蛋白(MHC-I)保持在内质网。因此，E3-19K避免了在被感染细胞膜内的抗原呈递(antigen presentation)。具有两种关键肽区域或结构域以介导该E3-19K功能。一种是E3-19K MHC-I结合结构域。另一种是E3-19K羧基末端的肽序列，其将蛋白保持在内质网内，并避免其转移至细胞膜。采用在表达质粒内分离的E3-19K，对具有特异于这些结构域的突变的这些E3-19K功能性结构域进行描述(Gabathuler R，Kvist S.The endoplasmic reticulum retention signal of the E3/19Kprotein of adenovirus type 2consists of three separate amino acidsegments at the carboxy terminus.J Cell Biol 1990；111(5Pt1)：1803-10)。

关于设计溶瘤细胞腺病毒(oncolytic adenoviruse)，需要考虑两个重要点：选择性和功效。为了实现针对肿瘤细胞的选择性，可采用两种策略：缺失肿瘤细胞中不必要的病毒功能以及用肿瘤选择性启动子替换病毒启动子。采用这种基因改造，已经获得相当高水平的选择性，其中在肿瘤细胞内的复制效率，比在正常细胞内高10000倍。关于溶瘤细胞效力，也已经描述了多种用以提高溶瘤细胞效力的基因改造。这些改造影响病毒入侵细胞或病毒从细胞中释放。为了增进入侵步骤，病毒用于感染细胞的衣壳蛋白被改造。例如，在纤维内***RGD多肽(精氨酸-甘氨酸-天冬酰胺基序)导致腺病毒采用整联蛋白(integrin)停靠(dock，锚定)在细胞内，而不仅仅如野生型腺病毒时的内化(internalize)。使用整合素作为病毒的细胞受体提高了感染性和溶瘤细胞功效。关于增进病毒从被感染细胞中释放的改造，已经描述了两种：缺失E1B-19K以及E3-11.6K(ADP)的过表达。E1B-19K是相同于Bcl-2的细胞凋亡抑制剂。E1B-19K缺失通过感染细胞的未成熟细胞凋亡而使细胞死亡增加。这种未成熟细胞凋亡通常导致在许多被感染的细胞系内总的病毒产量降低，然而，它促进病毒的快速释放并进而促进病毒在细胞培养物内的扩散。因此，在空斑测定中，与野生型腺病毒相比，不表达E1B-19K的突变体呈现较大的空斑表型(phenotype)。用于提高腺病毒的溶瘤细胞功效的另一种策略是过表达E3-11.6K(ADP)蛋白。这种蛋白在被感染细胞的溶解中发挥作用并且ADP过表达增进了积累在核内的病毒的释放。ADP-过表达病毒的表型的特征还在于较大的空斑以及在被感染细胞上清液中存在更多病毒。ADP过表达已通过两种机制而实现：1)除了ADP，或除了ADP和E3-12.5K之外，去除其他的E3基因。这种缺失移除了由E3启动子驱使的pre-mRNA中的其他剪接位点。没有对这些剪接位点的竞争，处理编码ADP的mRNA是有利的。2)在强启动子后***ADP基因。

本发明披露了基于E3-19K蛋白的突变来提高腺病毒从被感染细胞中释放的新的并经改良的机制。

发明内容

具体地，本发明描述了基于E3-19K蛋白的内质网滞留结构域的突变使腺病毒的释放增强。本发明证实了与影响E3-19K细胞定位的突变相关的表型与ADP过表达不相关，因此它是一种不同的机制(既非先前描述的也非暗示的)，来提高腺病毒从感染细胞中释放。

对腺病毒5基因组进行随机突变后，选择获得更高溶瘤细胞功效的突变体。使用亚硝酸钠的突变生成过渡性突变，其中核苷酸碱基脱去氨基。在DNA复制后，这些脱去氨基的碱基产生新配对，突变被固定。对腺病毒5株(或毒种，stock)诱变之后，将获得的诱变集合在癌细胞系内扩增并采用标准方法提纯。病毒株对应腺病毒对照标准品(ARM)(GenBank序列文件AY339568)。溶瘤细胞突变体的生物选择过程在具有预先接种的人肿瘤的免疫缺陷小鼠(裸鼠)体内进行。在血液中存在较长时间并且在肿瘤中更有效复制的病毒被分离、扩增并在随后几轮生物选择中再次注射入具有肿瘤的小鼠。已存在实例采用这种随机方法来发现呈现较高溶瘤细胞功效的突变体，尽管在该先例中采用的生物选择过程是不同的(YanW，Kitzes G，Dormishian F，Hawkins L，Sampson-Johannes A，Watanabe J，et al.Developing novel oncolytic adenoviruses throughbioselection.J Virol 2003；77(4)：2640-50)。该先例发现了不同于本发明中主题的其他突变。

本发明涉及特征为在E3-19K内质网滞留结构域中包含突变的腺病毒。具体地，E3-19K的羧基末端结构域被除去或者被改造(或修饰)来阻止E3-19K在内质网内滞留并导致其转移至质膜。复制并包含这种E3-19K特定突变的腺病毒更有效地从被感染细胞内释放。这种更高的释放引发更高的溶瘤细胞作用。这种提高的溶瘤细胞作用对治疗癌症是有益的。

E3-19K羧基末端突变增进了腺病毒从被感染细胞内释放这一证实结果令人惊讶，因为所描述的E3-19K的功能是免疫调节功能。具体地，关于E3-19K所描述的功能涉及结合至MHC-I以及MHC-I在内质网内滞留来避免MHC-I转移至质膜以及MHC-I相关抗原的呈递。因此，不表达E3-19K的腺病毒突变体的表型特征为在质膜处存在MHC-I以及对病毒具有较高免疫反应。这种表型不影响腺病毒在细胞培养物内进行体外繁殖，因此，作为基因治疗载体的腺病毒领域中的专家通常会缺失完整E3区，这对病毒生成没有不良反应。除了对于不表达E3-19K的腺病毒表型的了解之外，表征部分缺失E3-19K的腺病毒的表型是未知的，因为E3-19K结构域的功能性研究是采用脱离了腺病毒环境的分离的E3-19K蛋白进行的(Gabathuler R，Kvist S.The endoplasmic reticulum retention signal ofthe E3/19K protein of adenovirus type 2consists of three separateamino acid segments at the carboxy terminus.J Cell Biol 1990；111(5Pt 1)：1803-10)。这些研究从未提出羧基末端尾部缺失或E3-19K内质网滞留结构域能增加病毒释放。因此，没有合理的现有知识提出E3-19K内质网滞留结构域的改造可能导致腺病毒从被感染细胞内更多释放。这个结果源自在本发明中进行的采用有利于更有效地从被感染细胞中释放的腺病毒筛选的步骤，对腺病毒的随机突变体文库的筛选。

因此，本发明包括一种腺病毒，其中该腺病毒是复制型(replicative)的并包含E3-19K内质网滞留结构域中的突变。

本发明中考虑的E3-19K突变可能为***、改变或缺失一个或多个编码E3-19K的基因序列碱基对。在所有情况下作用是相同的：它对E3-19K内质网滞留结构域产生改变，使E3-19K从内质网膜重定位于质膜。相同方式下，间接导致E3-19K相同重定位的其他突变是本发明的目的。例如，***蛋白酶靶位点(其去除E3-19K羧基末端)、或者***可替换的细胞内运输信号，可将E3-19K重定位于质膜。

在本发明的另一种实施方式中，包含E3-19K内质网滞留结构域内突变的复制型腺病毒也在E1a、E1b、E4、和VA-RNA组的一个或多个基因中突变从而在肿瘤中达到选择性复制。

本发明的另一种实施方式是复制型腺病毒，其包括E3-19K内质网滞留结构域中的突变，还包括组织特异性启动子或肿瘤特异性启动子以达到肿瘤内的选择性复制。

在本发明的另一种实施方式中，复制型腺病毒包括E3-19K内质网滞留结构域内的突变并且还包括控制来自由E1a、E1b、E2、和E4组成的组中的一个或多个基因的表达的启动子序列，以达到肿瘤内选择性复制。

本发明的另一种实施方式是复制型腺病毒，其包括E3-19K内质网滞留结构域内的突变以及提高其感染性或对肿瘤细胞内所存在受体的靶向的衣壳改造。

本发明的另一个目的是复制型腺病毒，其包括E3-19K内质网滞留结构域内的突变并且还包括普遍用在癌症基因治疗领域中的基因。优选地，普遍用在癌症基因治疗领域中的基因选自由前药-活化基因、肿瘤抑制基因和免疫刺激性基因组成的组。

本发明的另一种实施方式是复制型腺病毒，其包括E3-19K内质网滞留结构域内的突变以及导致所述E3-19K蛋白表达增加的基因组改造。

本发明复制型腺病毒包括核苷酸序列SEQ ID NO：1。

在本发明的另一个方面，复制型腺病毒表达具有SEQ ID NO：2的羧基末端尾部的E3-19K内质网滞留结构域。

本发明的另一个目的是复制型腺病毒，其包括E3-19K内质网滞留结构域内的突变并且其中所述腺病毒包括核苷酸序列SEQ IDNO 4。

本发明的复制型腺病毒表达具有SEQ ID NO：5的羧基末端尾部的E3-19K内质网滞留结构域。

本发明的另一个目的是复制型腺病毒，其包括E3-19K内质网滞留结构域内的突变，其中所述腺病毒至少包括核苷酸序列SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。

本发明的复制型腺病毒表达具有SEQ ID NO：2的羧基末端尾部的E3-19K内质网滞留结构域；并且包含***RGD基序(限定于SEQ ID NO：8的位置1648至1656)；调控区，其赋予所述腺病毒在肿瘤细胞内的选择性复制，所述调控区存在于DM1隔离子(insulator)内(限定于SEQ ID NO：7的位置367至1095)，E2F1启动子的片段(限定于SEQ ID NO：7的位置1282至1545)，ccacckozak序列(限定于SEQ ID NO：7的位置1546至1550)和E1a-Δ24突变腺病毒基因(限定于SEQ ID NO：7的位置1551至2512)。

本发明的另一个目的是一种药物组合物，其包括药理有效量的复制型腺病毒，该复制型腺病毒包括在E3-19K内质网滞留结构域内的突变和一种或多种药用载体或赋形剂。

本发明的另一个目的是如上所限定的用作药物的复制型腺病毒。

本发明的复制型腺病毒是癌症预防和/或治疗剂。

本发明也提供了治疗癌症的新方法，该方法包括给予包含E3-19K内质网滞留结构域突变的复制型腺病毒。

本发明的另一个目的是如上所限定的复制型腺病毒在制备用于治疗或预防癌症或导致癌症的癌前病变(pre-malignant disease)的药物制剂中的应用。

在另一种实施方式中，本发明的E3-19K突变腺病毒可与其他癌症治疗如化学疗法或放射疗法联合使用。

本发明描述了复制型腺病毒以及所述腺病毒在治疗或预防癌症或导致癌症的癌前病变中的应用，其中这种复制型腺病毒包含E3-19K内质网滞留结构域内的突变。关于溶瘤细胞腺病毒中E3-11.6K(ADP)的过表达或E1B-19K的缺失，先前已有报道。与本发明相反，先前描述的这些改造既不意味着也不要求E3-19K定位在质膜处并且其作用机制是不同的。在本发明之前，不能停靠在内质网内的E3-19K蛋白的活性在病毒基因组内从没有被分析过。涉及与病毒释放相关的溶瘤细胞功效提高的所述蛋白的活性是令人惊讶的，因为只有对E3-19K所描述的功能是结合MHC-I，并通过这种结合E3-19K降低抗原呈递和免疫反应。

使包含本发明目的的E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒在基因治疗和病毒治疗领域中普遍采用的细胞系如HEK-293和A549内繁殖并扩增。纯化包含E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒以将其用于癌症治疗中的步骤，与关于在癌症的病毒治疗和基因治疗中使用的其他腺病毒和腺病毒载体所描述的步骤相同。

本发明提出了对于改进癌症(包括但不限于，胰腺癌、结肠癌和肺癌)治疗的需要。采用包含E3-19K内质网滞留结构域内突变的溶瘤细胞腺病毒进行癌症治疗可通过直接在肿瘤内注射病毒或者通过采用腺病毒进行基因治疗或病毒治疗领域中的标准方法对癌症患者进行***给予来完成。

附图说明

附图包括在本文中使得上述特征、优点和构建体变得清晰并能够被详细了解。这些附图构成说明书的一部分并举例说明了优选实施方式，但不应认为限制本发明的范围。

图1.人腺病毒血清型5基因组的示意性图示(GenBank序列文件AY339865)。35934个碱基对的线性基因组从左至右常规分成100个图距单位(mu)。编码早期(E1a E4)和晚期(L)RNA的区域被标出。E3区编码源自pre-mRNA转录产物通过差异剪接的7种蛋白质。本发明涉及E3-19K蛋白和影响其羧基末端尾部的突变。

图2.突变体AdT1的大空斑表型特征。这种突变体通过对5型人腺病毒基因组(GenBank序列文件AY339865)进行随机突变，随后基于从植入有肿瘤的小鼠血液和肿瘤中分离病毒进行筛选来获得。将腺病毒AdT1对肿瘤细胞的细胞毒性与野生型腺病毒(Adwt)的细胞毒性进行对比。人肿瘤A549细胞接种在6孔培养板内。在80％汇合时，用连续稀释的Adwt或AdT1进行感染。在感染后4小时，移除病毒，并在细胞单层上覆盖一层混有琼脂糖的培养基。被感染细胞孵育6天，然后用中性红(仅被活细胞吸附的染料)染色。结果显示AdT1产生的空斑比Adwt产生的空斑直径更大(上图)。下图显示在光学显微镜下观察的空斑的放大图(100×)，其中可以注意到病毒AdT1具有较高细胞毒性。

图3.鉴定赋予AdT1较大空斑表型的突变。通过重组Adwt和突变体AdT1构建一系列腺病毒并对呈现较大空斑表型的这些重组体进行研究。在图中，Adwt基因组以细线示出而AdT1基因组以粗线示出。对所有表现大空斑表型的重组体中存在的共同区域进行测序。通过与野生型的5型腺病毒序列对比，我们确定在5型腺病毒的29173位置中***1个碱基对(A，在病毒基因组从左至右的正义链中)。***改变了E3-19K内质网滞留信号。

图4.与野生型腺病毒血清型5(Adwt)序列比较，在AdT1(SEQID NO：1)内存在的突变的序列。示出的Adwt核苷酸序列对应AY339865中编码E3-19K羧基末端尾部的片段(SEQ ID NO：3)。通过针对静脉给予后血液和肿瘤中持续进行更长时间的体内筛选(在异种移植人肿瘤的免疫缺陷小鼠体内)，从腺病毒突变体的随机文库中分离AdT1病毒。AdT1病毒在编码蛋白E3-19K的DNA的位置445处包含腺嘌呤核苷酸(A)的***。该突变(以下称为445-A)改变氨基酸序列并除去了E3-19K内质网滞留结构域。对比野生型序列，突变序列生成较短的羧基末端尾部。

图5.E3-19K蛋白的图示和E3-19K内质网滞留结构域内445-A突变的影响。E3-19K是停靠在腺病毒感染细胞的内质网处的跨膜糖蛋白。在功能上，E3-19K包含腔内结构域(氨基-末端)和细胞质结构域(羧基-末端)，腔内结构域包含与主要组织相容性复合物1类蛋白(MHC-1)作用的氨基酸残基，细胞质结构域包含用于滞留在内质网的正信号(EKKMP或SEQ ID NO：6)。附图显示了抗体Tw1.3识别的表位(或抗原决定基，epitope)，用于检测E3-19K。突变445-A是C-末端尾部处的移码突变(frame shift mutation)，其除去响应EKKMP信号的氨基酸残基156至160。这种突变导致E3-19K重定位于质膜。

图6.***E3-19K内质网滞留结构域内445-A突变介导的大空斑表型转移至野生型腺病毒。采用酵母同源重组技术，将AdT1内存在的445-A突变转移至野生型病毒(Adwt)以获得腺病毒Ad19K-445A。我们还构建了另一种包含独立突变(除去E3-19K内质网滞留信号)的腺病毒突变体腺病毒Ad19K-KS，其中导致E3-19K滞留在内质网的两个赖氨酸信号(KK)替代了两个丝氨酸(SS)(SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)。AdT1、Ad19K-445A、和Ad19K-KS空斑尺寸在空斑测定中进行了对比。这三种病毒呈大空斑表型。

图7.E3-19K内质网滞留结构域内突变对E3-19K细胞定位的影响。为了证实***突变改变了腺病毒E3-19K蛋白的细胞定位，我们用相同剂量的Adwt和AdT1(每个细胞1500个病毒颗粒)感染人肿瘤细胞系(A549)。感染后36小时，收集细胞并将其培养在PBS中或用70％乙醇渗透(permeabilize)。然后，细胞用抗体Tw1.3(抗-E3-19K)孵育，采用绿色荧光蛋白标记的二抗检测该抗体。细胞悬浮液通过流式细胞仪并且显示出三次独立结果的平均值。没有质膜渗透情况下，E3-19K蛋白仅在受AdT1感染的细胞内检测到，表明其在细胞表面暴露。

图8.E3-19K内质网滞留结构域内突变对MHC-I细胞定位的影响。为了证实突变体形式E3-19K亚细胞定位的变化改变了1类主要组织相容性复合体(MHC-1)的暴露，采用相等剂量的Adwt或AdT1(每个细胞1500个病毒颗粒)感染人肿瘤细胞(A549)并且感染后24小时收集细胞。接下来，在没有渗透的情况下用抗体W6/32(针对MHC-1)孵育细胞从而专门标记位于质膜处的MHC-1片段。然后，采用绿色荧光蛋白标记的二抗检测结合的W6/32。悬浮细胞通过流式细胞仪。显示出三次独立结果的平均值。来自AdT1感染的细胞的MHC-I暴露于膜内，与未感染细胞的MHC-I的水平相似并高于Adwt感染细胞中MHC-I的水平。

图9.证明E3-19K内质网滞留结构域内突变相关的大空斑表型不依赖于MHC-I的功能。在(A)中，我们构建了命名为Ad19K-445A-CS40的腺病毒，其包含除去E3-19K内质网滞留结构域的445A突变并且还包含影响E3-19K中MHC-I结合结构域的突变(CS40)。一经A549感染，这种突变显示出与AdT1相同的大空斑表型，表明具有这种表型并不需要结合于MHC-I。下图(B)显示缺少MHC-1的细胞系(DLD-1细胞，来自人直肠腺癌)内AdT1的空斑测定并且也观察到大空斑表型。

图10.证明E3-19K内质网滞留结构域内突变不导致腺病毒死亡蛋白(ADP)过表达。我们采用Adwt或AdT1(每个细胞1500个病毒颗粒)感染来自细胞系A549的细胞并在指定的时间点提取全部细胞蛋白。作为对照，使用不进行感染的相同细胞(模拟，mock)。将每个样品中相同剂量的蛋白提取物(30微克)加样在15％丙烯酰胺凝胶上用于分离蛋白质(SDS-PAGE)。在跑完凝胶后，将蛋白转移至硝化纤维素滤纸(蛋白印迹(Western-blot)步骤)并使用针对ADP的抗体进行检测。结果显示AdT1和Adwt以相同的动力学表达相同量的ADP。

图11.证明病毒较多释放到腺病毒感染的细胞上清液中，该腺病毒包含E3-19K内质网滞留结构域内的突变。在(A)中，采用Adwt或AdT1(每个细胞1500个病毒颗粒)感染A549细胞并且在不同时间点测量释放到上清液中或者存在于细胞提取物内的病毒量(总病毒)。尽管产生的总病毒对于Adwt和AdT1是相同的，但AdT1突变体更有效地释放到上清液中。下图(B)显示几个细胞系应用的相同试验并且显示在指定时间点在被感染细胞上清液中检测到的病毒量。在所有细胞系内，AdT1更有效地释放到培养物上清液中。

图12.病毒释放到腺病毒感染的人成纤维细胞培养物上清液中，该腺病毒包含E3-19K内质网滞留结构域内的突变。采用Adwt或AdT1(每个细胞4500个病毒颗粒)感染人成纤维细胞并且在不同时间点测量释放到上清液中或存在于细胞提取物内的病毒量(总病毒)。结果显示病毒AdT1释放更多，病毒AdT1包含E3-19K内质网滞留结构域内的突变。

图13.与野生型腺病毒相比，包含E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒的抗肿瘤作用。将人胰腺癌细胞(NP-9)皮下接种于免疫缺陷小鼠(裸鼠)中。当肿瘤发生时，以单剂量采用2.10¹⁰个病毒颗粒/小鼠的野生型腺病毒(Adwt)或突变体AdT1腺病毒，对小鼠进行静脉治疗(每组10只小鼠)。肿瘤生长的百分比显示为相对于第0天的时间的函数关系(处理时间)。结果证明E3-19K内质网滞留结构域内的突变提高了腺病毒的溶瘤细胞功效。

图14.E3-19K内质网滞留结构域的445-A(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)突变的***介导大空斑表型转移至溶瘤细胞腺病毒。ICOVIR5(如在CASCALLO M，ALONSO MM，ROJAS JJ，PEREZ-GIMENEZ A，FUEYO J AND ALEMANY R.″SystemicToxicity-Efficacy Profile of ICOVIR-5，a Potent and SelectiveOncolytic Adenovirus Based on the pRB Pathway″.Molecular Therapy.2007 Sep；15(9)：1607-15中披露的)是溶瘤细胞腺病毒，包含E1a基因中的突变(Δ24突变、δ-24突变、去除了E1a的pRB结合位点的AD5中922至946的核苷酸缺失)、控制这种E1a-Δ24表达的E2F1启动子序列、DM1隔离子、和ccacc kozak序列(由SEQ IDNO：7限定的所有这些突变)、以及提高其对肿瘤细胞感染性的衣壳改造(RGD肽***)(SEQ ID NO：8突变)。SEQ ID NO：7的1至366位置包含ITR和5型(血清型)人腺病毒的包装信号(AY339865)。在SEQ ID NO：8中，1至1638位、和1666至1773位，是5型人类腺病毒纤维的编码区(codifying regions)，分别对应AY339865的核苷酸31037至32674位，以及核苷酸32675至32782位。采用酵母同源重组技术，将AdT1内存在的445-A突变转移至溶瘤细胞腺病毒ICOVIR5以获得腺病毒ICOVIR5-T1。AdΔ24RGD(如在SUZUKI，K.，FUEYO，J.KRASNYKH，V.，REYNOLDS，P.，CURIEL，D.T.，and ALEMANY，R.2001.″Aconditionally replicative adenovirus with enhanced infectivity showsimproved oncolytic potency″.Clinical Cancer Research-2001；7(1)：120-126中披露的)是另一种包含Δ24和RGD突变的腺病毒突变体。ICOVIR5-T1、ICOVIR5和AdΔ24RGD的空斑尺寸在空斑测定中进行比较，空斑测定使用每个细胞1个病毒颗粒(左图)或每个细胞0.1个病毒颗粒(右图)ICOVIR5-T1、ICOVIR5或AdΔ24RGD感染单层的A549肺腺癌细胞。10天后，对培养板进行拍照。与ICOVIR5和AdΔ24RGD相比，ICOVIR5-T1显示出大空斑表型。

具体实施方式

A.具有E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒的结构和功能以及其在癌症治疗中的应用。

本发明描述了具有E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒在癌症治疗中的使用。治疗基于这些病毒在肿瘤中的复制。

采用若干方法来操作病毒基因组。用于构建遗传改造腺病毒的方法在基因治疗和腺病毒病毒治疗领域中已得到良好确立。最普遍使用的方法是基于向含有待改造的腺病毒基因组区域的质粒中引入所期望的基因改造，然后在具有包含病毒基因组剩余部分的质粒的细菌中进行同源重组。

已进行多种类型的突变和基因操作以获得肿瘤选择性复制。其中之一是***启动子，这些启动子在肿瘤细胞中具有活性并用于控制病毒基因的表达。这些启动子包括E2F启动子、端粒末端转移酶(hTERT)启动子、酪氨酸酶启动子、***特异性抗原(PSA)启动子、α胎蛋白启动子、环加氧酶2(cox-2)启动子和人工启动子(基于引入转录因子结合位点如HIF-1(低氧诱导因子)、Ets(E26家族转录因子)和tcf(T-细胞因子))。本发明的一种实施方式是具有E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒联合这些启动子的应用。

为获得肿瘤选择性复制的另一种改造是缺失阻断pRB路径的早期E1A功能。这些突变体的选择性复制在几篇现有技术文献中已被证实。为了获得肿瘤细胞内选择性复制，直接与pRB相互作用的其他病毒基因如E4和E4orf6/7是待缺失的候选基因。本发明的一种实施方式是具有E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒联合导致选择性复制的这些E1缺失突变体的应用。

为获得肿瘤选择性复制的另一种改造是缺失编码病毒相关RNA(VA-RNA)的腺病毒基因。这些RNA阻断干扰素的抗病毒活性并且其缺失生成了对干扰素抑制敏感的腺病毒。由于肿瘤细胞内干扰素路径的特征性切断，这样的腺病毒在肿瘤内正常复制。本发明的一种实施方式是具有E3-19K内质网滞留结构域突变的腺病毒联合赋予选择性复制的病毒相关RNA中的这些缺失的应用。

在本发明的另一种实施方式中，具有E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒可包含其衣壳改造以提高其感染性或将其自身引导至肿瘤细胞内的受体。腺病毒衣壳蛋白经遗传改造以包括提高感染性或将病毒引导至肿瘤细胞内受体的配体。将病毒引导至肿瘤也可采用双功能配体(bifunctional ligand)而获得，这种双功能配体一端结合病毒而另一端结合肿瘤受体。为了提高腺病毒的血液持久性从而提高达到侵染肿瘤结节的可能性，衣壳也可用聚合物如聚乙二醇包覆。本发明的一种实施方式是用具有E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒联合这些衣壳改造的应用。

本发明的另一种实施方式是复制(复制型腺病毒)并包含E3-19K内质网滞留结构域内突变和导致所述突变E3-19K蛋白表达提高的其他基因组改造的腺病毒。几种途径可提高突变E3-19K的表达。例如，改造E3启动子以提高基因转录或进行突变来提高处理病毒RNA和蛋白合成中涉及的病毒蛋白的活性。由于突变E3-19K提供了新功能，这种过表达将导致增强的功能。

本发明的另一种实施方式涉及包含E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒，该腺病毒还包含其他基因以提高其在肿瘤细胞内的细胞毒性，例如胸苷激酶基因、胞嘧啶脱氨酶基因、促凋亡基因、免疫刺激基因或肿瘤抑制基因。

B.具有E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒的产生、纯化和制备。

本发明中描述的腺病毒可按照腺病毒学和腺病毒载体领域中的标准方法进行增殖，如Graham FL，Prevec L.Manipulation ofadenoviral vectors.Clifton，N.J.：Humana Press；1991；and Alemany R，Zhang W.Oncolytic adenoviral vectors.Totowa，NJ.：Humana Press；1999中所披露的。增殖的优选方法在于感染允许具有E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒复制的细胞系。肺腺癌A549细胞系是这种细胞系的一个实例。例如，如下进行增殖：将A549细胞培养在塑料细胞培养板内，用每个细胞50个病毒颗粒进行感染。两天后，当细胞分离形成葡萄状簇时，细胞病变效应证明病毒生成。收集细胞病将其储存在试管内。以1000g离心细胞5分钟，使细胞沉淀物冻融三次以释放细胞内病毒。将获得的细胞提取物以1000g离心5分钟，含有病毒的上清液分层在氯化铯梯度上，在35.000g下离心1小时。得到的病毒带被收集起来并在另一个氯化铯梯度上再次分层，以35.000g离心16小时。收集病毒带并经PBS-10％丙三醇渗析。渗析的病毒被等分并在-80℃下保存。病毒颗粒和空斑形成单元的数目的定量按照标准方案进行。

具有10％丙三醇的磷酸盐缓冲液(PBS)是用于腺病毒存储的标准制剂。然而，提高病毒稳定性的其他制剂也已经描述。

C.具有E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒在癌症治疗中的应用

本发明描述了具有E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒在癌症治疗中的应用。治疗是基于肿瘤细胞内这些病毒的复制。

本发明描述的病毒在癌症治疗中的应用方案所遵循的步骤，与采用腺病毒的病毒治疗和基因治疗领域所应用的那些方案相同。在基因治疗领域中应用复制缺陷性和复制竞争性腺病毒，存在着广泛的经验。很多出版物描述了在动物模型中或对患者的临床试验中对肿瘤细胞的体外治疗。为了体外治疗细胞，将纯化的腺病毒，在上述描述的任何制剂中，加入到培养基中以感染肿瘤细胞。为了治疗动物模型或患者体内的肿瘤，腺病毒可经过肿瘤内或腔内注射进行局部或区域给药，或者经过静脉注射进行***给药。采用本发明中描述的腺病毒***可联合其他治疗形式如化学治疗或放射治疗来使用，如先前在溶瘤细胞腺病毒领域中描述的。

实施例

实施例1

具有E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒更有效地扩散。

突变腺病毒文库构建如下：用0.7M亚硝酸处理8分钟诱变2×10¹⁰个5型人腺病毒病毒颗粒(Adwt)。然后，稀释病毒溶液并渗析除去诱变剂。为了固定突变，用诱变病毒感染人肿瘤A549细胞并扩增，按照先前描述的方法，使用氯化铯梯度纯化。诱变株(stock)被注射给接受皮下胰腺NP-9肿瘤异种移植的免疫抑制小鼠。注射4小时后小鼠血液含有的病毒在A549细胞内体外扩增，纯化，并在下一轮生物选择中再次进行静脉注射。几轮后，呈现最佳肿瘤衰退(最佳溶瘤细胞活性)的肿瘤内含有的病毒被提取(T1提取物)。最后，采用空斑测定(plaque assay)将命名为AdT1的病毒从T1提取物中分离出来。这个测定在于使用稀释病毒溶液感染单层肿瘤细胞并在注射后添加琼脂糖覆层。琼脂形成凝胶状聚合物，阻止病毒扩散穿过培养物并导致病毒从最初的被感染细胞进行病灶性(focally)扩散，导致形成或多或少的称为空斑的无细胞圆形区域。空斑测定证实T1空斑比亲本Ad5空斑大(参见本发明图2)。这个表型表明AdT1的细胞到细胞(cell-to-cell)扩散比Adwt更快。这种提高的扩散在癌症病毒治疗中的应用令人感兴趣，因为它能够提高抗肿瘤活性，如本发明中证实的。

一旦AdT1病毒被分离出，下一步是确定导致大空斑表型的基因改造。通过将AdT1基因组片段***到Ad5野生型基因组中来构建几种病毒(参见图3)。这种表型图(phenotypic map)表明导致大型空斑表型的突变存在于腺病毒序列的75.8(Ad5的位置27300)至100图距单位的区域。该AdT1区域被测序并与Adwt的序列进行比较。发现的唯一突变定位在内质网滞留结构域内E3-19K蛋白的C末端区(参见本发明的图4和5)。名为445-A的该突变***一个碱基对(翻译链中的腺嘌呤和互补链中的对应胸腺嘧啶，如可在序列SEQ ID NO：1中看到的)，其改变mRNA的阅读框并导致天然蛋白C末端的残基5′-SRRSFIDEKKMP-3′(SEQ ID NO：3)改变。为了证实这种突变导致病毒AdT1的表型，包含这种突变的5型腺病毒通过定点突变构建。这种名为Ad-19K-445A的病毒给出和病毒AdT1相同的大空斑表型，证实AdT1表型由突变E3-19K 445-A导致(参见本发明图6)。

在本发明之前，表明细胞培养物中更好的细胞至细胞间扩散的大空斑表型从来没有与E3-19K内质网滞留结构域内的突变关联起来。实际上，据发明人所知，没有公开含有该E3-19K结构域内突变的病毒，因为E3-19K结构域的研究是采用分离蛋白的cDNA而进行并不是在病毒背景中进行的，如上所指明的。先前的研究描述了E3-19K C末端尾部突变导致在质膜内存在这种蛋白质。为了证明是否AdT1的突变E3-19K蛋白定位于质膜，使用针对该蛋白的特异性抗体(Tw1.3抗体)在未渗透的细胞内进行E3-19K蛋白检测。在这些情况下，感染AdT1的细胞呈现E3-19K细胞表面表达，而感染Adwt的细胞则不呈现(参见本发明图7)。当渗透膜时，内质网内E3-19K片段对于抗体变得易接近并在经AdT1和Adwt感染的两种细胞内被检测到。

腺病毒AdT1中存在的突变445-A影响E3-19K内质网滞留结构域并生成大空斑表型，这表明并提高了细胞至细胞间病毒扩散。为了证实这种表型与E3-19K蛋白从内质网到细胞膜的定位相关并与定位变化无关的特定445-A突变不相关，构建另一种具有不同于445-A突变的病毒，但该病毒也影响E3-19K蛋白内质网滞留结构域。称为Ad19K-KS的腺病毒的特征是E3-19K内质网滞留结构域的两个赖氨酸替代两个丝氨酸(SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)。在研究分离的蛋白质时，描述了E3-19K的这种改造，其用于去除内质网内E3-19K的滞留(Pahl HL，Sester M，Burgert HG，BaeuerlePA.Activation of transcription factor NF-kappaB by the adenovirusE3/19K protein requires its ER retention.J Cell Biol 1996；132(4)：511-22)。如本发明图6中显示的，构建的腺病毒(Ad19K-KS)也存在大空斑表型。这个结果证实影响E3-19K内质网定位的不同突变导致病毒扩散的增加。

由于E3-19K的主要功能是结合MHC I并将MHC I滞留在内质网阻止针对感染细胞的免疫反应，因而对AdT1表型和其功能之间的关系进行研究。用包含E3-19K内质网滞留结构域中突变的AdT1感染会导致E3-19K的细胞表面表达增加(图7)。相应地，与用野生型腺病毒感染的细胞相比，MHC I的细胞表面表达增加(图8)。E3-19K/MHC-I复合物定位的这种变化可能导致大空斑表型。为了证实这个假设，构建包含AdT1中突变445-A和E3-19K中MHC I结合结构域中名为CS-40(天然蛋白质中从半胱氨酸至丝氨酸的氨基酸40的改变)的突变的病毒。病毒Ad19K-445A-CS40仍呈现大空斑表型(参见图9)，表明细胞膜上E3-19K/MHC I复合物的存在对大空斑表型的诱导不是必要的。证实MHC-I不导致大空斑表型的另一个证据是采用AdT1感染DLD-1细胞。尽管这些细胞缺乏细胞表面MHC I表达，与Adwt相比，AdT1仍呈现更大空斑(参见图9)。

以前，ADP(E3-11.6K)过表达已被描述成导致形成与本发明中出现的表型类似的表型。ADP过表达的腺病毒的特征在于，由于从被感染细胞中进行更有效以及早期的病毒释放而形成大空斑表型。ADP过表达可通过除去E3-19K和其他E3蛋白从而提高E3-11.6K mRNA的剪接而获得。本发明的目的是为了测定具有E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒，是否导致ADP的过表达(其可解释该表型)，测定AdT1-感染细胞中的ADP表达。如本发明图10中观察到的，通过采用抗-ADP抗体的蛋白质印迹(western-blot)进行的ADP检测说明AdT1-感染细胞的蛋白质提取物包含与Adwt感染细胞提取物相同量的ADP并且表明其以具有相似的表达动力学。这证实E3-19K内质网滞留结构域内的突变所导致的增强的扩散不取决于ADP过表达并揭示了不同于本发明领域中先前描述的新机制。

总体来说，这个实施例说明E3-19K内质网滞留结构域内的突变导致腺病毒扩散提高。两种不同突变，都影响该结构域，具有相同功效，这说明表型与E3-19K定位相关，与特定突变序列无关。具有E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒的增强扩散不取决于与MHC I的相互作用也不取决于ADP过表达。

实施例2

具有E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒更有效地从被感染细胞释放到上清液中。

实施例1中发现的大空斑表型表明具有E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒的增强扩散。空斑测定从少量被感染细胞开始，反映了由于几个病毒周期导致的病毒的细胞至细胞间扩散。为了确定E3-19K内质网滞留结构域内的突变是否产生明显的表型改变，在一个病毒周期过程中，用大量AdT1感染单层细胞，并与Adwt比较病毒后代的产生和释放。为了获得病毒复制一个周期内的全部病毒生成和释放的信息，分别测量细胞内病毒和细胞培养物的上清液中存在的病毒。用每个细胞1500个病毒颗粒感染6孔培养板内A549细胞单层。在注射后不同时间测量上清液和细胞提取物中存在的病毒。结果表明腺病毒AdT1(其包含E3-19K内质网滞留结构域内的突变)比Adwt的释放效率高100倍，而全部病毒产量不受影响(本发明的图11，上方)。这个测定在不同起源的一组肿瘤细胞系内进行。AdT1在所有测定的细胞系内比Adwt更有效地进行释放(图11，下方)，病毒释放差异为5-125倍。为了证实这种增强释放至上清液的表型是否在非肿瘤细胞内也明显，从人肿瘤活检组织中分离人癌相关成纤维细胞。结果表明具有E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒AdT1在这些成纤维细胞内也更有效地释放。总体来说，这个实施例说明具有E3-19K内质网滞留结构域内突变的复制-竞争腺病毒更有效地从被感染细胞内释放出。病毒从感染细胞内的增强释放是用于癌症治疗的复制型腺病毒的适宜特征。

实施例3

E3-19K内质网滞留结构域内的突变增强了腺病毒的溶瘤细胞功效并且具有这种突变的腺病毒可有效地用于***。

体内试验在具有皮下胰腺人肿瘤的Balb/c裸鼠中进行。将全部8×10⁶个NP-9细胞皮下注射进小鼠侧腹。15天后，当肿瘤体积达到80-100mm³时，将小鼠随机分为不同的试验组(每组n＝10)。对照组肿瘤经尾部血管静脉注射磷酸盐缓冲液(150微升)。用AdT1治疗的组接受单次静脉内注射2×10¹⁰病毒颗粒/小鼠。每两天测量肿瘤，体积采用公式：V(mm³)＝A(mm)B²(mm²)×3.14/6进行计算，其中B是肿瘤长度。图13示出从注射当天(0天)开始的肿瘤生长。结果表示为平均值±S.E.M。差异显著性采用针对非配对样本的非参数Mann-Whitney检验进行计算。生长曲线采用方差分析进行比较。当p＜0.05时，结果被认为是显著性的。采用SPSS统计分析软件(SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺斯州)进行计算。从注射后第10天直到试验结束，在用AdT1处理的肿瘤生长中观察到显著性差异。

实施例4

具有E3-19K内质网滞留结构域内突变的溶瘤细胞条件性-复制腺病毒(oncolytic conditionally-replicative adenovirus，ICOVIR5)扩散更有效。

ICOVIR5(Cascallo等，Molecular Therapy 15：1607.2007)是肿瘤选择性腺病毒，其在E1a基因中突变(Δ24突变)，包含控制这种突变E1a(SEQ ID NO：7中反映的突变)表达的E2F 1启动子序列，并且包含提高对肿瘤细胞感染性的衣壳改造(RGD多肽***)，如SEQ ID NO：8限定的。为了证实E3-19K内质网滞留结构域内突变可有效联合溶瘤细胞腺病毒的这些基因改造特征，包含E3-19K内的445-A突变(依据SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)的ICOVIR5衍生物被构建并命名为ICOVIR5-T1。该病毒在空斑测定中与亲本病毒ICOVIR5比较，并与具有Δ24和RGD突变的第二对照病毒(命名为AdΔ24RGD)比较。空斑测定在于使用稀释病毒溶液感染单层肿瘤细胞并在注射后添加琼脂覆层。琼脂形成凝胶状聚合物，其阻止病毒扩散穿过培养物并导致病毒从最初被感染细胞病灶性(focally)扩散，导致形成细胞单层内空洞(hole)形成，称为“空斑”。空斑测定通过使用每个细胞1或0.1个ICOVIR5-T1、ICOVIR5或AdΔ24RGD病毒颗粒感染A549肺腺癌细胞单层。10天后，培养板被拍照(本发明图14)。ICOVIR5-T1空斑比ICOVIR5和AdΔ24RGD空斑更大。

尽管上述实施例举例说明了获自血清型5中的具有E3-19K内质网滞留结构域内突变的腺病毒，然而本领域技术人员应理解所有具有E3基因并能够翻译E3-19K蛋白的血清型也是本发明的目的。

P28123VERE-序列表

序列表

<110>卡塔拉肿瘤研究所

<120>具有E3-19K蛋白内质网滞留结构域内突变的腺病毒及其在癌症治疗中的应用

<130>P28123VERE

<140>PCT/EP2008/052960

<141>2008-03-12

<150>ES 200700665

<151>2007-03-14

<160>8

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>484

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人腺病毒血清型5的蛋白E3-19K编码区的突变

<400>1

atgattaggt acataatcct aggtttactc acccttgcgt cagcccacgg taccacccaa 60

aaggtggatt ttaaggagcc agcctgtaat gttacattcg cagctgaagc taatgagtgc 120

accactctta taaaatgcac cacagaacat gaaaagctgc ttattcgcca caaaaacaaa 180

attggcaagt atgctgttta tgctatttgg cagccaggtg acactacaga gtataatgtt 240

acagttttcc agggtaaaag tcataaaact tttatgtata cttttccatt ttatgaaatg 300

tgcgacatta ccatgtacat gagcaaacag tataagttgt ggcccccaca aaattgtgtg 360

gaaaacactg gcactttctg ctgcactgct atgctaatta cagtgctcgc tttggtctgt 420

accctactct atattaaata caaaaagcag acgcagcttt attgaggaaa agaaaatgcc 480

ttaa 484

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>5型人腺病毒的蛋白E3-19K中突变羧基末端片段的片段

<400>2

Lys Lys Gln Thr Gln Leu Tyr

1 5

<210>3

<211>13

<212>PRT

<213>5型人腺病毒

<400>3

Lys Ser Arg Arg Ser Phe Ile Glu Glu Lys Lys Met Pro

1 5 10

<210>4

<211>483

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5型人腺病毒的蛋白E3-19K编码区的突变

<400>4

atgattaggt acataatcct aggtttactc acccttgcgt cagcccacgg taccacccaa 60

aaggtggatt ttaaggagcc agcctgtaat gttacattcg cagctgaagc taatgagtgc 120

accactctta taaaatgcac cacagaacat gaaaagctgc ttattcgcca caaaaacaaa 180

attggcaagt atgctgttta tgctatttgg cagccaggtg acactacaga gtataatgtt 240

acagttttcc agggtaaaag tcataaaact tttatgtata cttttccatt ttatgaaatg 300

tgcgacatta ccatgtacat gagcaaacag tataagttgt ggcccccaca aaattgtgtg 360

gaaaacactg gcactttctg ctgcactgct atgctaatta cagtgctcgc tttggtctgt 420

accctactct atattaaata caaaagcaga cgcagcttta ttgaggaaag cagcatgcct 480

taa 483

<210>5

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>5型人腺病毒的蛋白E3-19K中突变羧基末端片段的片段

<400>5

Lys Ser Arg Arg Ser Pro Ile Glu Glu Ser Ser Met Pro

1 5 10

<210>6

<211>5

<212>PRT

<213>5型人腺病毒

<400>6

Glu Lys Lys Met Pro

1 5

<210>7

<211>2512

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>具有调控区DM1隔离子(从位置367至1095)的序列；

E2F1启动子片段(从位置1282至1545)的序列；

ccacc kozak序列(从位置1546至1550)的序列；

以及E1a-24基因(从位置1551至2512)的序列

<400>7

catcatcaat tataccttcc attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60

ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120

gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180

gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240

taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300

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gatccctcga gaccctgaaa ctgtcttcga ctccggggcc ccgttggaag actgagtgcc 420

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ctgctgctgg ggggatcaca gaccatttct ttctttcggc caggctgagg ccctgacgtg 660

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tctggggagc gtctggcgcg atctctgcct gcttactcgg gaaatttgct tttgccaaac 840

ccgctttttc ggggatcccg cgcccccctc ctcacttgcg ctgctctcgg agccccagcc 900

ggctccgccc gcttcggcgg tttggatatt tattgacctc gtcctccgac tcgctgacag 960

gctacaggac ccccaacaac cccaatccac gttttggatg cactgagacc ccgacattcc 1020

tcggtattta ttgtctgtcc ccacctagga cccccacccc cgaccctcgc gaataaaagg 1080

ccctccatct gcccctcgag tctagagatg gccgcaataa aatatcttta ttttcattac 1140

atctgtgtgt tggttttttg tgtgaatcga tagtactaac atacgctctc catcaaaaca 1200

aaacgaaaca aaacaaacta gcaaaatagg ctgtccccag tgcaagtgca ggtgccagaa 1260

catttctcta tcgataggta ccatccggac aaagcctgcg cgcgccccgc cccgccattg 1320

gccgtaccgc cccgcgccgc cgccccatct cgcccctcgc cgccgggtcc ggcgcgttaa 1380

agccaatagg aaccgccgcc gttgttcccg tcacggccgg ggcagccaat tgtggcggcg 1440

ctcggcggct cgtggctctt tcgcggcaaa aaggatttgg cgcgtaaaag tggccgggac 1500

tttgcaggca gcggcggccg ggggcggagc gggatcgagc cctcgccacc atgagacata 1560

ttatctgcca cggaggtgtt attaccgaag aaatggccgc cagtcttttg gaccagctga 1620

tcgaagaggt actggctgat aatcttccac ctcctagcca ttttgaacca cctacccttc 1680

acgaactgta tgatttagac gtgacggccc ccgaagatcc caacgaggag gcggtttcgc 1740

agatttttcc cgactctgta atgttggcgg tgcaggaagg gattgactta ctcacttttc 1800

cgccggcgcc cggttctccg gagccgcctc acctttcccg gcagcccgag cagccggagc 1860

agagagcctt gggtccggtt tctatgccaa accttgtacc ggaggtgatc gatccaccca 1920

gtgacgacga ggatgaagag ggtgaggagt ttgtgttaga ttatgtggag caccccgggc 1980

acggttgcag gtcttgtcat tatcaccgga ggaatacggg ggacccagat attatgtgtt 2040

cgctttgcta tatgaggacc tgtggcatgt ttgtctacag taagtgaaaa ttatgggcag 2100

tgggtgatag agtggtgggt ttggtgtggt aatttttttt ttaattttta cagttttgtg 2160

gtttaaagaa ttttgtattg tgattttttt aaaaggtcct gtgtctgaac ctgagcctga 2220

gcccgagcca gaaccggagc ctgcaagacc tacccgccgt cctaaaatgg cgcctgctat 2280

cctgagacgc ccgacatcac ctgtgtctag agaatgcaat agtagtacgg atagctgtga 2340

ctccggtcct tctaacacac ctcctgagat acacccggtg gtcccgctgt gccccattaa 2400

accagttgcc gtgagagttg gtgggcgtcg ccaggctgtg gaatgtatcg aggacttgct 2460

taacgagcct gggcaacctt tggacttgag ctgtaaacgc cccaggccat aa 2512

<210>8

<211>1773

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码5型人腺病毒纤维(从位置1至1638；以及位置1666至1773)的序列；

包含肽RGD的***(从位置1639至1665)的序列；

包含RGD基序(从1648至1656)的序列

<400>8

atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg tgtatccata tgacacggaa 60

accggtcctc caactgtgcc ttttcttact cctccctttg tatcccccaa tgggtttcaa 120

gagagtcccc ctggggtact ctctttgcgc ctatccgaac ctctagttac ctccaatggc 180

atgcttgcgc tcaaaatggg caacggcctc tctctggacg aggccggcaa ccttacctcc 240

caaaatgtaa ccactgtgag cccacctctc aaaaaaacca agtcaaacat aaacctggaa 300

atatctgcac ccctcacagt tacctcagaa gccctaactg tggctgccgc cgcacctcta 360

atggtcgcgg gcaacacact caccatgcaa tcacaggccc cgctaaccgt gcacgactcc 420

aaacttagca ttgccaccca aggacccctc acagtgtcag aaggaaagct agccctgcaa 480

acatcaggcc ccctcaccac caccgatagc agtaccctta ctatcactgc ctcaccccct 540

ctaactactg ccactggtag cttgggcatt gacttgaaag agcccattta tacacaaaat 600

ggaaaactag gactaaagta cggggctcct ttgcatgtaa cagacgacct aaacactttg 660

accgtagcaa ctggtccagg tgtgactatt aataatactt ccttgcaaac taaagttact 720

ggagccttgg gttttgattc acaaggcaat atgcaactta atgtagcagg aggactaagg 780

attgattctc aaaacagacg ccttatactt gatgttagtt atccgtttga tgctcaaaac 840

caactaaatc taagactagg acagggccct ctttttataa actcagccca caacttggat 900

attaactaca acaaaggcct ttacttgttt acagcttcaa acaattccaa aaagcttgag 960

gttaacctaa gcactgccaa ggggttgatg tttgacgcta cagccatagc cattaatgca 1020

ggagatgggc ttgaatttgg ttcacctaat gcaccaaaca caaatcccct caaaacaaaa 1080

attggccatg gcctagaatt tgattcaaac aaggctatgg ttcctaaact aggaactggc 1140

cttagttttg acagcacagg tgccattaca gtaggaaaca aaaataatga taagctaact 1200

ttgtggacca caccagctcc atctcctaac tgtagactaa atgcagagaa agatgctaaa 1260

ctcactttgg tcttaacaaa atgtggcagt caaatacttg ctacagtttc agttttggct 1320

gttaaaggca gtttggctcc aatatctgga acagttcaaa gtgctcatct tattataaga 1380

tttgacgaaa atggagtgct actaaacaat tccttcctgg acccagaata ttggaacttt 1440

agaaatggag atcttactga aggcacagcc tatacaaacg ctgttggatt tatgcctaac 1500

ctatcagctt atccaaaatc tcacggtaaa actgccaaaa gtaacattgt cagtcaagtt 1560

tacttaaacg gagacaaaac taaacctgta acactaacga tcacactaaa cggtacacag 1620

gaaacaggag acacaacttg tgactgccgc ggagactgtt tctgcccatc tgcatactct 1680

atgtcatttt catgggactg gtctggccac aactacatta atgaaatatt tgccacatcc 1740

tcttacactt tttcatacat tgcccaagaa taa 1773

Claims

1.一种复制型腺病毒，包括抑制E3-19K在内质网内滞留的E3-19K内质网滞留结构域内的突变并进一步包括遗传修饰以达到在肿瘤中的选择性复制。

2.根据权利要求1所述的复制型腺病毒，其中所述腺病毒包括来自E1a、E1b、E4和VA-RNA构成的组中的一个或多个基因中的突变，以获得在肿瘤中的选择性复制。

3.根据权利要求1所述的复制型腺病毒，其中所述腺病毒包括组织特异性启动子或肿瘤特异性启动子，以获得在肿瘤中的选择性复制。

4.根据权利要求3所述的复制型腺病毒，其中所述组织特异性启动子或肿瘤特异性启动子是用于控制来自E1a、E1b、E2和E4构成的组中的一个或多个基因表达的启动子序列，以获得在肿瘤中的选择性复制。

5.根据权利要求1所述的复制型腺病毒，其中所述腺病毒还包括用于提高它的感染性或将它靶向在肿瘤细胞中存在的受体的衣壳改造。

6.根据权利要求1所述的复制型腺病毒，其中所述腺病毒还包括在癌症基因治疗领域中常用的基因。

7.根据权利要求6所述的复制型腺病毒，其中所述在癌症治疗领域中常用的基因是至少一种选自由前药-活化基因、肿瘤抑制基因或免疫刺激性基因构成的组中的基因。

8.根据权利要求1所述的复制型腺病毒，其中所述腺病毒还包括导致所述E3-19K蛋白表达增强的基因组改造。

9.一种复制型腺病毒，包括抑制E3-19K在内质网内滞留的E3-19K内质网滞留结构域内的突变，所述复制型腺病毒表达具有SEQ ID NO：2的羧基末端尾部的E3-19K内质网滞留结构域。

10.根据权利要求9所述的复制型腺病毒，其中所述腺病毒包括核苷酸序列SEQ ID NO：1。

11.根据权利要求1-8中任一项所述的复制型腺病毒，其中所述腺病毒具有核苷酸序列SEQ ID NO：4。

12.根据权利要求1-8任一项所述的复制型腺病毒，所述复制型腺病毒表达包含具有SEQ ID NO：5的羧基末端尾部的E3-19K内质网滞留结构域。

13.根据权利要求1-8中任一项所述的复制型腺病毒，其中所述腺病毒至少包括核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7和SEQID NO：8。

14.根据权利要求13所述的复制型腺病毒，所述复制型腺病毒表达包含具有SEQ ID NO：2的羧基末端尾部的E3-19K内质网滞留结构域。

15.一种药物组合物，包括药理有效量的权利要求1至14任一项所述的复制型腺病毒和一种或多种药用载体或赋形剂。

16.根据权利要求1至14中任一项所述的复制型腺病毒在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的应用。

17.根据权利要求1-14中任一项所述的复制型腺病毒在制备用于治疗或预防癌症或导致癌症的癌前病变的药物制剂中的应用。

18.包括抑制E3-19K在内质网内滞留的E3-19K内质网滞留结构域内的突变的复制型腺病毒在制备用于治疗或预防癌症或导致癌症的癌前病变的药物中的应用。