ES2823053T3 - Composiciones que comprenden una cepa bacteriana del género Megasphaera y usos de las mismas - Google Patents

Composiciones que comprenden una cepa bacteriana del género Megasphaera y usos de las mismas Download PDF

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Abstract

Una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, para uso en un método de tratamiento o prevención de un trastorno neurodegenerativo, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO:2.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones que comprenden una cepa bacteriana del género Megasphaera y usos de las mismas
CAMPO TÉCNICO
Esta invención pertenece al campo de las composiciones que comprenden cepas bacterianas aisladas del tracto digestivo de mamíferos y el uso de tales composiciones en el tratamiento de enfermedades.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Se cree que el intestino humano es estéril en el útero, pero está expuesto a una gran variedad de microbios maternos y ambientales inmediatamente después del nacimiento. A partir de entonces, se produce un período dinámico de colonización y sucesión microbiana, que está influenciado por factores como el modo de parto, el medio ambiente, la dieta y el genotipo del huésped, todos los cuales tienen un impacto sobre la composición de la microbiota intestinal, particularmente durante los primeros años de vida. Posteriormente, la microbiota se estabiliza y se vuelve del tipo adulto [1]. La microbiota intestinal humana contiene más de 500-1000 filotipos diferentes que pertenecen esencialmente a dos divisiones bacterianas principales, los Bacteroidetes y los Firmicutes [2]. Las relaciones simbióticas con éxito que surgen de la colonización bacteriana del intestino humano han producido una amplia variedad de funciones metabólicas, estructurales, protectoras y otras beneficiosas. Las actividades metabólicas mejoradas del intestino colonizado aseguran que los componentes dietéticos que de otro modo no serían digeribles se degradan con la liberación de subproductos que proporcionan una fuente importante de nutrientes para el huésped. De manera similar, la importancia inmunológica de la microbiota intestinal es bien reconocida y se ejemplifica en animales libres de gérmenes que tienen un sistema inmunitario deteriorado que se reconstituye funcionalmente después de la introducción de bacterias comensales [3-5].
Se han documentado cambios dramáticos en la composición de la microbiota en trastornos gastrointestinales como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). Por ejemplo, los niveles de la bacteria Clostridium clústerXlVa se reducen en pacientes con EII, mientras que el número de E. coli aumenta, lo que sugiere un cambio en el equilibrio de simbiontes y patobiontes dentro del intestino [6-9].
En reconocimiento del potencial efecto positivo que ciertas cepas bacterianas pueden tener sobre el intestino del animal, se han propuesto varias cepas para su uso en el tratamiento de varias enfermedades (ver, por ejemplo, [10-13]). Además, ciertas cepas, que incluyen principalmente cepas de Lactobacillus y Bifidobacterium, se han propuesto para su uso en el tratamiento de varias enfermedades inflamatorias y autoinmunes que no están directamente relacionadas con los intestinos (ver [14] y [15] para revisiones). Sin embargo, la relación entre diferentes enfermedades y diferentes cepas bacterianas, y los efectos precisos de cepas bacterianas particulares sobre el intestino y a nivel sistémico y sobre cualquier tipo particular de enfermedades están pobremente caracterizados, particularmente para los trastornos neurodegenerativos.
Recientemente, ha habido un interés creciente en la técnica con respecto a las alteraciones en el microbioma intestinal que pueden desempeñar un papel fisiopatológico en enfermedades cerebrales humanas [16]. La evidencia clínica y preclínica sugiere fuertemente un vínculo entre el desarrollo del cerebro y la microbiota [17]. Un creciente cuerpo de la bibliografía preclínica ha demostrado la señalización bidireccional entre el cerebro y el microbioma intestinal, que involucra múltiples sistemas de señalización neurocrina y endocrina. De hecho, los niveles aumentados de especies de Clostridium en el microbioma se ha relacionado con trastornos cerebrales [18], y un desequilibrio de Bacteroidetes y Firmicutes phyla también se ha implicado en los trastornos del desarrollo cerebral [19]. Las sugerencias de que los niveles alterados de comensales intestinales, incluyendo los de los géneros Bifidobacterium, Lactobacillus, Sutterella, Prevotella y Ruminococcus y de la familia Alcaligenaceae están involucrados en trastornos del sistema nervioso central (SNC) inmunomediados, son cuestionados por estudios que sugieren una falta de alteración en la microbiota entre pacientes y sujetos sanos [19]. También se ha sugerido que la administración de probióticos puede ser beneficiosa en el tratamiento de trastornos neurológicos. Sin embargo, estos estudios no llegaron a la conclusión de que las composiciones probióticas per se pueden lograr beneficios terapéuticos con respecto al tratamiento de la neurodegeneración y no mostraron ningún efecto útil para ninguna bacteria en particular [20, 21]. Esto indica que, en la actualidad, el efecto práctico del vínculo entre el microbioma y las enfermedades del cerebro humano está pobremente caracterizado. En consecuencia, se requieren estudios analíticos más directos para identificar el impacto terapéutico de alterar el microbioma sobre los trastornos neurodegenerativos.
Hay un requisito en la técnica de nuevos métodos para tratar los trastornos neurodegenerativos. También hay un requisito para que los efectos potenciales de las bacterias intestinales se caractericen para que puedan desarrollarse nuevas terapias que usen bacterias intestinales.
La US 2004/005304 describe una composición para el tratamiento de un trastorno neurológico y una afección gastrointestinal asociada. La US 2004/170617 describe un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada con una flora gastrointestinal anormal. La US 2004/120963 describe una comida o alimento que comprende una composición que comprende como ingrediente activo una bacteria o producto procesado de la misma capaz de convertir el ácido láctico en ácido butírico. Padmanabhan R. et al., Standars in Genomic Sciences 8(3)(p.525-538), describen la cepa NP3 de Megasphaera massiliensis, Nallabelli N. et al., Scientific Reports 6(1), describen análisis de secuencias de genomas de la Cepa DISK18 de Megasphaera sp. La US 2016/271188 describe composiciones probióticas para el tratamiento de trastornos gastrointestinales.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Los inventores han desarrollado nuevas terapias para tratar y prevenir los trastornos neurodegenerativos. Los inventores han identificado que las cepas bacterianas del género Megasphaera pueden ser eficaces para tratar enfermedades neurodegenerativas. Como se describe en los ejemplos, la administración de composiciones que comprenden Megasphaera massiliensis puede proteger contra especies reactivas de oxígeno y prevenir la inflamación, actuando por tanto como un neuroprotector. Los inventores también han identificado que el tratamiento con Megasphaera massiliensis puede reducir la activación de moléculas proinflamatorias, como NFkB e IL-6, por LPS y a-sinucleína mutante. Los inventores han identificado que el tratamiento con Megasphaera massiliensis puede reducir la actividad de desacetilación de histonas y la peroxidación lipídica in vitro, lo que puede ayudar a reducir la muerte celular y la apoptosis. Los inventores también han identificado que Megasphaera massiliensis puede producir indol que puede atenuar la inflamación y el estrés oxidativo. Además, los inventores han demostrado que el tratamiento con Megasphaera massiliensis puede aumentar los niveles de quinurenina.
Los inventores también han identificado que Megasphaera massiliensis produce ciertos ácidos orgánicos incluyendo ácido hexanoico, ácido valérico y ácido 4-hidroxifenilacético. Los inventores también han descubierto que Megasphaera massiliensis puede aumentar la activación de la citoquina proinflamatoria IL-8, que puede ayudar a promover la mielinización neuronal. Los inventores también han identificado que el tratamiento con una combinación de Megasphaera massiliensis y ácido retinoico puede aumentar la secreción del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), lo que puede ayudar a promover la neurogénesis y neuritogénesis y/o prevenir la muerte celular. Los inventores también han identificado que el tratamiento con Megasphaera massiliensis, que puede producir ácido valérico, puede reducir la desacetilación de histonas, lo que puede ayudar a reducir la muerte celular y la apoptosis. Además, los inventores también han descubierto que Megasphaera massiliensis puede producir ácido hexanoico, que puede ser neuroprotector o neurorestaurador, por ejemplo, promoviendo el crecimiento de neuritas. Los inventores han descubierto que Megasphaera massiliensis que puede producir ácido hexanoico aumenta la expresión de MAP2 (proteína 2 asociada a microtúbulos), que se cree que es esencial para la formación de microtúbulos en la neuritogénesis. Por lo tanto, los inventores han descubierto que Megasphaera massiliensis, que puede producir ácido hexanoico, puede usarse para promover el crecimiento de neuritas. La Megasphaera massiliensis y otras bacterias que producen ácidos orgánicos como el ácido hexanoico, el ácido valérico y el ácido 4-hidroxifenilacético pueden ser, por lo tanto, útiles para tratar trastornos neurodegenerativos.
La invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, para su uso en un método para tratar o prevenir un trastorno neurodegenerativo, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16s que es por lo menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO:2.
En realizaciones particulares, la invención proporciona una composición que comprende l cepa bacteriana anterior del género Megasphaera, para su uso en un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste de: enfermedad de Parkinson, incluyendo parálisis supranuclear progresiva, parálisis supranuclear progresiva, síndrome de Steele-Richardson-Olszewski, hidrocefalia a presión normal, parkinsonismo vascular o arteriosclerótico y parkinsonismo inducido por fármacos; enfermedad de Alzheimer, incluyendo el síndrome de Benson; esclerosis múltiple; enfermedad de Huntington; esclerosis lateral amiotrófica; enfermedad de Lou Gehrig; enfermedad de la neuronas motoras; enfermedad por priones; ataxia espinocerebelosa; atrofia muscular en la columna; demencia, incluyendo demencia de cuerpos de Lewy, vascular y frontotemporal; afasia progresiva primaria; defecto cognitivo leve; deterioro cognitivo relacionado con el VIH y degeneración corticobasal.
En realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa bacteriana anterior del género Megasphaera, para su uso en un método de tratamiento o prevención de la enfermedad de Parkinson, como la enfermedad ambiental, familiar o de Parkinson asociada con el estado inflamatorio general. Los inventores han identificado que el tratamiento con cepas de Megasphaera puede reducir la activación de moléculas proinflamatorias, como NFkB e IL-6, por LPS y a-sinucleína mutante en modelos in vitro de Parkinson ambiental y familiar. En realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Las composiciones que usan Megasphaera massiliensis pueden ser particularmente eficaces para tratar la enfermedad de Parkinson.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en un método de tratamiento o prevención de enfermedad neurodegenerativa de inicio temprano. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en un método para prevenir o retrasar la aparición o la progresión de un trastorno neurodegenerativo.
En realizaciones preferidas de la invención, la cepa bacteriana en la composición es de Megasphaera massiliensis. También pueden usarse cepas estrechamente relacionadas, como las cepas bacterianas que tienen una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la secuencia de ARNr 16S de un cepa bacteriana de Megasphaera massiliensis. La cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la SEQ ID NO:2. Preferiblemente, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene la secuencia de ARNr 16S representada por la SEQ ID NO:2.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención es para administración oral. La administración oral de las cepas de la invención puede ser eficaz para trastornos neurodegenerativos. Además, la administración oral es conveniente para pacientes y profesionales y permite la administración y/o la colonización parcial o total del intestino.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención comprende uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención comprende una cepa bacteriana que se ha liofilizado. La liofilización es una técnica eficaz y conveniente para preparar composiciones estables que permiten la administración de bacterias.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona un producto alimenticio que comprende la composición como se ha descrito anteriormente.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición de vacuna que comprende la composición como se ha descrito anteriormente.
Al desarrollar la invención anterior, los inventores han identificado y caracterizado una cepa bacteriana que es particularmente útil para la terapia. Se ha demostrado que la cepa Megasphaera massiliensis de la invención es eficaz para tratar las enfermedades descritas en la presente, como enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención proporciona una célula de la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787. La invención también proporciona composiciones que comprenden tales células, o cultivos biológicamente puros de tales células. La invención también proporciona una célula de la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787 para su uso en terapia, en particular para las enfermedades descritas en la presente.
En ciertas realizaciones de la invención, la composición es para su uso en el tratamiento de lesiones cerebrales. La actividad neuroprotectora de las composiciones de la invención y su capacidad para reducir los niveles de actividad de histona desacetilasa (HDAC) pueden hacerlas útiles para tratar lesiones cerebrales. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento del derrame cerebral, como el tratamiento de la lesión cerebral resultante de un derrame cerebral.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1: Viabilidad celular de las células de neuroblastoma
Figura 2: Regulación descendente de la secreción de IL-6
Figura 3: Secreción de IL-8
Figura 4: Inhibición de la secreción de a-sinucleína IL-6 e IL-8
Figura 5: Inhibición de la activación del promotor de NFkB inducida por a-sinucleína
Figura 6: Inhibición de la activación del promotor NFkB inducida por LPS
Figura 7: Cambio en la capacidad antioxidante
Figura 8: Cambio en la capacidad antioxidante total (oxidación de lípidos)
Figura 9: Cambio en la actividad de histona desacetilasa (HDAC)
Figura 10: Nivel de producción de Indol
Figura 11: Nivel de producción de Quinurenina.
Figura 12: Niveles medios de dopamina (DA) (Figura 12A), niveles de DOPAC (Figura 12B) y niveles de HVA (Figura 12C) en el cuerpo estriado. Los datos se muestran como Media SEM.
Figura 13: Promoción del crecimiento de neuritas: microscopía óptica y expresión del gen MAP2 (Figura 13 A), microscopía de inmunofluorescencia de faloidina (Figura 13B)
Figura 14: Cambio en los niveles de ROS en (a) células U373 y (b) células SHSY-5Y
Figura 15: Neuroprotección - viabilidad celular. La Figura 15 muestra los mismos datos que la Figura 1. Figura 16: Cambios inducidos por la cepa en la actividad de la histona desacetilasa de la célula completa y el lisado celular (Figura 16A), cambios inducidos por el ácido en la actividad de la histona desacetilasa (Figura 16B), producción de metabolitos por cepas (Figura 16C)
Figura 17: Inhibición de HDAC1 (Figura 17A), inhibición de HDAC2 (Figura 17B), inhibición de HDAC3 (Figura 17C)
Figura 18: Inhibición de HDAC de Clase I (Figura 18A); inhibición de HDAC1 (Figura 18B); inhibición de HDAC2 (Figura 18C); inhibición de HDAC3 (Figura 18D)
Figura 19: Nivel de producción de BDNF
Figura 20: Niveles de producción de metabolitos - neurotransmisores en el cerebro
Figura 21: Niveles de producción de metabolitos - ácidos orgánicos en el sobrenadante
Figura 22: Efecto sobre la función de barrera intestinal
Figura 23: Producción de neurotransmisores en el cerebro.
Figura 24: Cambios en la expresión del receptor del hipocampo - A) Receptor de oxitocina, B) Receptor de vasopresina, C) Receptor de glucocorticoides y D) Receptor de mineralocorticoides
Figura 25: Cambios en la expresión del hipocampo de A) Hormona liberadora de corticotropina (CRH), B) Expresión de BDNF y C) TLR4
Figura 26: A) Cambios en la expresión del receptor 1 de la hormona liberadora de corticotropina del hipocampo (CRFR1) y B) expresión del receptor 2 de la hormona liberadora de corticotropina (CRFR2) Figura 27: Cambios en la expresión del hipocampo de A) Factor de necrosis tumoral, B) Interleucina 1b y C) IL-6
Figura 28: A) Cambios en la expresión de la Integrina Alfa M del hipocampo (CD1 lb) y B) Cambios en la expresión del receptor de serotonina 1A del hipocampo (receptor 5-HT1A)
Figura 29: A) Cambios en la expresión de la subunidad 2A del tipo NMDA del receptor de glutamato hipocampal del hipocampo (Grin2A) y B) expresión de la subunidad 2B del tipo NMDA del receptor del glutamato iónotrópico 2B (Grin2B)
Figura 30: Cambios en la expresión del hipocampo de A) Receptor 2 de ácido gamma-aminobutírico A (GABA A2), B) Receptor 1 de ácido gamma-aminobutírico B (GABA BR1) y C) Receptor 1 de dopamina (DRD1)
Figura 31: Cambios en la expresión del receptor de amígdala - A) Receptor de oxitocina, B) Receptor de vasopresina, C) Receptor de glucocorticoides y D) Receptor de mineralocorticoides
Figura 32: Cambios en la expresión de amígdala de A) Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), B) Receptor tipo Toll 4 (TLR-4), C) Receptor de hormona liberadora de corticotropina 1 (CRFR1) y D) Receptor de hormona liberadora de corticotropina 2 (CRFR2)
Figura 33: Cambios en la expresión de amígdala de A) Integrina Alfa M (CD11b), B) Interleucina-6 (IL-6), C) Subunidad 2Atipo NMDA del receptor ionotrópico de glutamato (Grin2A) y D) Subunidad 2B tipo n MdA del receptor iontrópico de glutamato (Grin2B)
Figura 34: Cambios en la expresión de amígdala de A) Subunidad alfa 2 del receptor GABA-A (GABRA2), B) Subunidad del receptor 1 tipo B de GABA-A (GABBR1) y C) Receptor 1 de dopamina (DRD1)
Figura 35: Cambios en la expresión de la corteza prefrontal de A) Receptor de oxitocina, B) Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), C) Receptor de mineralocorticoides y D) Receptor de glucocorticoides
Figura 36: Cambios en la expresión de la corteza prefrontal de A) Receptor 4 tipo Toll (TLR-4), B) Receptor 1 de hormona liberadora de corticotropina (CRFR1), C) Receptor 2 de hormona liberadora de corticotropina (CRFR2) y D) Alfa integrina M (CD11 b)
Figura 37: Cambios en la expresión de corteza prefrontal de A) Interleucina-6 (IL-6), B) Subunidad 2A tipo NMDA del receptor ionotrópico de glutamato (Grin2A), C) Subunidad 2B tipo NMDA del receptor ionotrópico de glutamato (Grin2B) y D) Subunidad Alfa 2 del receptor de GABA-A (GABRA2)
Figura 38: Cambios en la expresión de corteza prefrontal de A) Subunidad 1 del receptor tipo B de GABA-A (GABBR1) y B) Receptor 1 de dopamina (DRD1)
Figura 39: Cambios en la expresión de colon de A) triptófano hidroxilasa-1 (Tph1) y B) indoleamina2,3-dioxigenasa-1 (IDO1)
Figura 40: Cambios en la expresión de íleo de A) triptófano hidroxilasa-1 (Tph1) y B) indoleamina2,3-dioxigenasa-1 (IDO1)
Figura 41: Cambios en los niveles de metabolitos de triptófano circulantes A) Quinurenina, B) Triptófano y C) Índice de metabolismo de quinurenina/triptófano
Figura 42: Efecto sobre la producción de interferón-Y de esplenocitos de ratón de ratones alimentados con MRx0029
Figura 43: Efecto sobre la producción de interleucina-1p de esplenocitos
Figura 44: Efecto sobre la producción de interleucina-6 de esplenocitos
Figura 45: Efecto sobre la producción del factor de necrosis tumoral de esplenocitos
Figura 46: Efecto sobre la producción de interleucina-10 de esplenocitos
Figura 47: Efecto sobre la producción de CXCL1 quimioatrayente de esplenocitos
Figura 48: Cambios en los niveles de ácidos grasos de cadena corta cecales
Figura 49: Cambios inducidos por MRx0029 y MRX005 en los niveles de expresión génica de Actina, Vilina, Occludina TJP1, TJP2, MAP2, DRD2, GABRB3, SYP, PINK1, PARK7 y NSE.
Figura 50: diferenciación celular de SHSY5Y inducida por MRx0005 y MRx0029. (A-C) Imágenes representativas de células inmunomarcadas con faloidina y MAP2. (D-F) imágenes de A-C fusionadas con imágenes DAPI. (G- I) células inmunomarcadas con p3 tubulina. (J-L) fusionadas con imágenes DAPI.
Ampliación x630. Análisis de transferencia Western de los efectos del tratamiento con MRx0005 y MRx0029 sobre células SHSY5Y. Las membranas de transferencia Western se sondearon con anticuerpos para MAP2(M) y tubulina b3 (N). Se usó actina como control de carga. Paneles inferiores: transferencias representativas de uno de seis experimentos separados; paneles superiores: intensidad densitométrica relativa.
DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN
Cepas bacterianas
Las composiciones de la invención comprenden una cepa bacteriana del género Megasphaera. en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO:2. Los ejemplos demuestran que las bacterias de este género son útiles para tratar o prevenir trastornos neurodegenerativos. Las cepas bacterianas preferidas son las de la especie Megasphaera massiliensis.
Los ejemplos de especies de Megasphaera para su uso en la invención incluyen Megasphaera elsdenii, Megasphaera cerevisiae, Megasphaera massiliensis, Megasphaera indica, Megasphaera paucivorans, Megasphaera sueciensis y Megasphaera micronuciformis. Un ejemplo adicional de una especie Megasphaera para su uso en la invención es Megasphaera hexanoica. Las Megasphaera son microbios gastrointestinales, fermentados con lactato, obligadamente anaerobios de mamíferos rumiantes y no rumiantes, incluyendo los humanos.
La cepa tipo de M. massiliensis es NP3 (=CSUR P245=DSM 26228) [22]. El número de registro de GenBank para las secuencias génicas de ARNr 16S de la cepa NP3 de M. massiliensis es JX424772.1 (divulgado en la presente como SEQ ID NO: 1).
La bacteria Megasphaera massiliensis probada en los Ejemplos es referida en la presente como cepa MRx0029. En la SEQ ID NO: 2 se proporciona una secuencia de ARNr 16S para la cepa MRx0029 que se probó.
La cepa MRx0029 fue depositada en la autoridad depositaria internacional NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia) por 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Cornhill Road, Aberdeen, AB252ZS, Escocia) el 13 de julio de 2017 como "Megasphaera massiliensis MRx0029" y se le asignó el número de registro NCIMB 42787.
También se espera que las cepas bacterianas estrechamente relacionadas con la cepa probada en los ejemplos sean eficaces para tratar o prevenir trastornos neurodegenerativos. En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana divulgada en la presente tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la secuencia de ARNr 16S de una cepa bacteriana de Megasphaera massiliensis. La cepa bacteriana para su uso en la invención tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 95%, 96%, 91%, 98%), 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la SEQ ID NO:2. Preferiblemente, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene la secuencia de ARNr 16S representada por la SEQ ID NO: 2.
También se espera que las cepas bacterianas que son biotipos de las cepas MRx0029 o NP3 sean eficaces para tratar o prevenir trastornos neurodegenerativos. Un biotipo es una cepa estrechamente relacionada que tiene las mismas características fisiológicas y bioquímicas o unas muy similares.
Las cepas que son biotipos de las cepas MRx0029 o NP3 y que son adecuadas para su uso en la invención pueden identificarse secuenciando otras secuencias de nucleótidos para las cepas MRx0029 o NP3. Por ejemplo, sustancialmente todo el genoma puede secuenciarse y una cepa de biotipo para su uso en la invención puede tener por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia en por lo menos un 80% de su genoma completo (por ejemplo, en por lo menos un 85%, 90%, 95% o 99%, o en su genoma completo). Otras secuencias adecuadas para su uso en la identificación de cepas de biotipo pueden incluir hsp60 o secuencias repetitivas como BOX, ERIC, (GTG)5, o REP o [23]. Las cepas de biotipo pueden tener secuencias con por lo menos un 95%, 96%, 91%, 98% o, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia con la secuencia correspondiente de las cepas MRx0029 o NP3.
Alternativamente, las cepas que son biotipos de las cepas MRx0029 o NP3 y que son adecuadas para su uso en la invención pueden identificarse usando cepas MRx0029 o NP3 y análisis de fragmentos de restricción y/o análisis de PCR, por ejemplo usando polimorfismo de longitud de fragmento amplificado fluorescente (FAFLP) y obtención de huellas por (rep)-PCR del elemento de ADN repetitivo o realizando perfiles de proteínas, o secuenciación de ADNr de 16S o 23S parcial. En realizaciones preferidas, tales técnicas pueden usarse para identificar otras cepas de Megasphaera massiliensis.
En ciertas realizaciones, las cepas que son biotipos de las cepas MRx0029 o NP3 y que son adecuadas para su uso en la invención son cepas que proporcionan el mismo patrón que las cepas MRx0029 o NP3 cuando se analizan mediante análisis de restricción de ADN ribosómico amplificado (ARDRA), por ejemplo cuando se usa enzima de restricción Sau3AI (para métodos ejemplares y orientación, ver, por ejemplo, [24]). Alternativamente, las cepas biotipo se identifican como cepas que tienen los mismos patrones de fermentación de carbohidratos que las cepas MRx0029 o NP3.
Pueden identificarse otras cepas de Megasphaera que son útiles en las composiciones y métodos de la invención, como los biotipos de las cepas MRx0029 o NP3, usando cualquier método o estrategia apropiados, incluyendo los ensayos descritos en los ejemplos. Por ejemplo, las cepas para su uso en la invención pueden identificarse cultivando con células de neuroblastoma y luego evaluando los niveles de citoquinas y los niveles de neuroprotección o neuroproliferación. En particular, las cepas bacterianas que tienen patrones de crecimiento, tipo metabólico y/o antígenos de superficie similares a las cepas MRx0029 o NP3 pueden ser útiles en la invención. Una cepa útil tendrá una actividad inmunomoduladora comparable a las cepas MRx0029 o NP3. En particular, una cepa biotipo provocará efectos comparables en los modelos de enfermedad neurodegenerativos y efectos comparables sobre los niveles de citoquinas a los efectos mostrados en los Ejemplos, que pueden identificarse usando los protocolos de cultivo y administración descritos en los Ejemplos.
Una cepa particularmente preferida de la invención es la cepa MRx0029 de Megasphaera massiliensis. Esta es la cepa ejemplar probada en los ejemplos y mostrada como eficaz para tratar la enfermedad. Por lo tanto, la invención proporciona una célula, como una célula aislada, de la cepa MRx0029 de Megasphaera massiliensis. La invención también proporciona una composición que comprende una célula de la cepa MRx0029 de Megasphaera massiliensis. La invención también proporciona un cultivo biológicamente puro de la cepa MRX0029 de Megasphaera massiliensis. La invención también proporciona una célula de la cepa MRx0029 de Megasphaera massiliensis, para su uso en terapia, en particular para las enfermedades descritas en la presente.
Una cepa particularmente preferida de la invención es la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787. Esta es la cepa MRx0029 ejemplar probada en los ejemplos y que muestra ser eficaz para tratar la enfermedad. Por lo tanto, la invención proporciona una célula, como una célula aislada, de la cepa de Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787. La invención también proporciona una composición que comprende una célula de la cepa de Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787. La invención también proporciona un cultivo biológicamente puro de la cepa de Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787. La invención también proporciona una célula de la cepa de Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787, para su uso en terapia, en particular para las enfermedades descritas en la presente.
Un derivado de la cepa de la invención puede ser una cepa hija (progenie) o una cepa cultivada (subclonada) de la original. Un derivado de una cepa de la invención puede modificarse, por ejemplo a nivel genético, sin eliminar la actividad biológica. En particular, una cepa derivada de la invención es terapéuticamente activa. Una cepa derivada tendrá una actividad terapéutica comparable a la cepa MRx0029. En particular, una cepa derivada provocará efectos comparables en los modelos de enfermedades neurodegenerativas y efectos comparables sobre los niveles de citoquinas a los efectos mostrados en los Ejemplos, que pueden identificarse usando los protocolos de cultivo y administración descritos en los Ejemplos. Un derivado de la cepa MRx0029 generalmente será un biotipo de la cepa MRx0029.
Las referencias a células de la cepa MRx0029 de Megasphaera massiliensis abarcan cualquier célula que tenga las mismas características de seguridad y eficacia terapéutica que la cepa MRx0029, y tales células están abarcadas por la invención.
En realizaciones preferidas, las cepas bacterianas en las composiciones de la invención son viables y capaces de colonizar parcial o totalmente el intestino.
Los inventores han descubierto que las cepas de Megasphaera massiliensis reducen la activación de las citoquinas inflamatorias como la IL-6 y aumentan la activación de la citoquina inflamatoria IL-8. La IL-8 se ha implicado en la formación de vainas de mielina [25]. La inflamación crónica inducida por IL-6 en última instancia puede llevar a la muerte celular. Por lo tanto, las cepas bacterianas de la invención son particularmente útiles en el tratamiento o prevención de trastornos neurodegenerativos. En algunas realizaciones, las cepas bacterianas son útiles en el tratamiento de afecciones caracterizadas por la activación mejorada de IL-6. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades neurodegenerativas caracterizadas por desmielinización. Muchas enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por la desmielinización. La desmielinización impide la propagación de potenciales de acción dentro de las neuronas, deteriorando la comunicación eficaz dentro del sistema nervioso. Se ha demostrado que IL-8 contribuye positivamente a la formación y reparación de la vaina de mielina. Por lo tanto, las composiciones de la invención son particularmente beneficiosas en el tratamiento o prevención de trastornos neurodegenerativos caracterizados por desmielinización, como la esclerosis múltiple.
Los inventores han descubierto que las cepas de Megasphaera massiliensis de la invención alivian los síntomas de enfermedades neurodegenerativas en modelos de la enfermedad. Por ejemplo, los inventores han descubierto que las cepas de Megasphaera massiliensis promueven el crecimiento de neuritas in vitro y, por lo tanto, pueden usarse para promover la restauración de neuronas para el tratamiento o prevención de enfermedades neurodegenerativas. Por tanto, las cepas bacterianas de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades neurodegenerativas.
Los inventores también han descubierto que las cepas bacterianas de la invención aumentan la activación de BDNF. BDNF es un factor de crecimiento neurotrófico que se ha demostrado que mejora la diferenciación y supervivencia de las neuronas. Por tanto, las composiciones de la invención pueden usarse en un método para mejorar la supervivencia de las células nerviosas en el tratamiento o prevención de enfermedades neurodegenerativas.
Una bacteria adicional que puede usarse en las composiciones de la invención es la especie Parabacteroides distasonis. Los ejemplos demuestran que Parabacteroides distasonis y Megasphaera massiliensis tienen ambas actividades neuroprotectoras, pero producen diferentes metabolitos y pueden tener diferentes mecanismos de acción y actividades neuroprotectoras específicas. Por lo tanto, estas especies pueden ser particularmente eficaces cuando se usan en combinación. En realizaciones preferidas, la composición comprende una cepa de la especie Parabacteroides distasonis y una cepa de la especie Megasphaera massiliensis.
La bacteria Parabacteroides distasonis depositada con el número de registro NCIMB 42382 se probó en los Ejemplos y también es referida en la presente como cepa MRx0005. MRX0005, MRX005, MRx005 y Mrx0005 se usan indistintamente en la presente. En la SEQ ID NO:17 se proporciona una secuencia de ARNr 16S para la cepa MRx0005 que se probó. La cepa MRx0005 se depositó en la autoridad depositaria internacional NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia) por GT Biologies Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB252ZS, Escocia) el 12 de marzo de 2015 como "Parabacteroides sp 755' y se le asignó el número de registro NCIMB 42382. GT Biologies Ltd. posteriormente cambió su nombre a 4D Pharma Research Limited.
En realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa depositada en NCIMB con el número de registro NCIMB 42787, o un derivado o biotipo de la misma, y la cepa depositada en NCIMB con el número de registro NCIMB 42382, o un derivado o biotipo de la misma, preferiblemente para su uso en terapia, preferiblemente para su uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa como la enfermedad de Parkinson.
Usos terapéuticos
Como se demuestra en los ejemplos, las composiciones bacterianas de la invención son eficaces para tratar trastornos neurodegenerativos. En particular, el tratamiento con composiciones de la invención aumenta la neuro-proliferación y actúa como neuroprotector contra agentes que destruyen las neuronas dopaminérgicas.
Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir trastornos neurodegenerativos que son el resultado de la muerte neuronal.
Las composiciones de la invención pueden disminuir la activación del promotor NFkB, que activa la producción de citoquinas, por ejemplo IL-1p, iL-1 a, IL-18, TNFa e IL-6. El tratamiento de células con a-sinucleína mutante es un modelo para el Parkinson familiar. Una mutación puntual en la posición 53 de adenina a treonina lleva a un plegamiento erróneo de la a-sinucleína. La a-sinucleína plegada incorrectamente se agrega posteriormente en fibrillas insolubles que forman cuerpos de Lewy. Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir trastornos neurodegenerativos que son el resultado de neuroinflamación, plegamiento erróneo de proteínas y/o exposición ambiental. Las composiciones de la invención pueden usarse para el tratamiento del Parkinson familiar. La activación del promotor NFkB está mediada a través del ligando TLR4. Se sabe que TLR4 media la muerte celular en el modelo de ratón MPTP, que simula la enfermedad de Parkinson. Las composiciones de la invención pueden usarse para inhibir la capacidad de señalización de TLR4 para activar el promotor NFkB. De particular relevancia para la e P, se descubrió que tanto TLR2 como TLR4 estaban regulados por incremento en cerebros de pacientes con EP [26]. Además, a-syn ha sido descrito como un ligando para TLR2 [27] y hemos demostrado que a-syn también es un ligando para TLR4 usando células HEK-TLR4 [28].
Las composiciones de la invención disminuyen la secreción de citoquinas proinflamatorias como IL-6, que puede ser inducida por lipopolisacáridos (LPS). El tratamiento de las células con LPS simula el Parkinson provocado por factores ambientales. Las composiciones de la invención pueden usarse para disminuir la secreción de IL-6. Las composiciones de la invención pueden usarse para el tratamiento del Parkinson ambiental.
Los ejemplos de enfermedades neurodegenerativas que pueden tratarse por las composiciones de la invención incluyen: enfermedad de Parkinson, incluyendo parálisis supranuclear progresiva, parálisis supranuclear progresiva, síndrome de Steele-Richardson-Olszewski, hidrocefalia de presión normal, parkinsonismo vascular o arteriosclerótico y parkinsonismo inducido por fármacos; enfermedad de Alzheimer, incluyendo el síndrome de Benson; esclerosis múltiple; enfermedad de Huntington; esclerosis lateral amiotrófica; enfermedad de Lou Gehrig; enfermedad de las neuronas motoras; enfermedad por priones; ataxia espinocerebelosa; atrofia muscular espinal; demencia, incluyendo demencia de cuerpos de Lewy, vascular y frontotemporal; afasia progresiva primaria; defecto cognitivo leve; deterioro cognitivo relacionado con el VIH y degeneración corticobasal. Una enfermedad adicional que puede tratarse por la composiciones de la invención es neuropatía inflamatoria progresiva.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción de la muerte de neuronas, en particular, en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la protección de neuronas, en particular en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción o prevención de la pérdida de células dopaminérgicas en la sustancia negra. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción o prevención de la degeneración de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra pars compacta. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción o prevención de la degeneración de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra de la compacta y la consiguiente pérdida de sus fibras nerviosas proyectadas en el cuerpo estriado. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción o prevención de la pérdida de neuronas dopaminérgicas nigrostriatales.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en aumentar los niveles de dopamina. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en aumentar los niveles de DOPAC (ácido 3,4-dihidroxifenilacético). En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en aumentar los niveles de dopamina y DOPAC. En ciertas realizaciones, los niveles de dopamina y/o DOPAC se aumentan en el cuerpo estriado. Los niveles de dopamina y DOPAC pueden medirse usando cualquier método apropiado conocido en la técnica, como un método radioenzimático, por ejemplo en plasma o CSF (por ejemplo, como se describe en [29]), o un método de HPLC de fase inversa, tal vez con detección electroquímica, por ejemplo en plasma o CSF (por ejemplo, como se describe en [30]).
Las propiedades neuroprotectoras de las composiciones de la invención, como se muestra en los ejemplos, significan que las composiciones pueden ser particularmente eficaces para prevenir o retrasar la aparición o progresión de trastornos neurodegenerativos. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en retrasar la aparición o la progresión de trastornos neurodegenerativos.
Las composiciones de la invención pueden aumentar la secreción de IL-8. Se ha demostrado que IL-8 desempeña un papel en la mielinización neuronal. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención pueden usarse para aumentar la secreción de IL-8.
Las composiciones terapéuticas de la invención pueden aumentar la activación de BDNF. BDNF actúa sobre ciertas neuronas del sistema nervioso central para apoyar la supervivencia de las neuronas existentes y ayudar al crecimiento y desarrollo de nuevas neuronas y sinapsis. BDNF es activo en el hipocampo, la corteza y el cerebro anterior basal, y es importante para la memoria a largo plazo. Las composiciones de la invención pueden usarse por lo tanto para aumentar la secreción de BDNF. Las composiciones pueden usarse por lo tanto en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas asociadas con el deterioro de la memoria a largo plazo. Las composiciones de la invención pueden usarse para mejorar la memoria a largo plazo, en particular para mejorar la memoria a largo plazo que está deteriorada por una enfermedad neurodegenerativa.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención aumentan la actividad metabólica de las mitocondrias en las células neuronales.
Modulación del eje microbiota-intestino-cerebro
La comunicación entre el intestino y el cerebro (el eje microbiota-intestino-cerebro) se produce a través de un sistema de comunicación neurohumoral bidireccional. La evidencia reciente muestra que la microbiota que reside en el intestino puede modular el desarrollo del cerebro y producir fenotipos conductuales a través del eje microbiotaintestino-cerebro. De hecho, una serie de revisiones sugieren un papel del eje microbiota-intestino-cerebro en el mantenimiento de la funcionalidad del sistema nervioso central e implican la disfunción del eje microbiota-intestinocerebro en el desarrollo de trastornos y afecciones del sistema nervioso central [16], [19], [31].
La comunicación bidireccional entre el cerebro y el intestino (es decir, el eje intestino-cerebro) incluye el sistema nervioso central, los sistemas neuroendocrino y neuroinmune, incluyendo el eje hipotálamo-hipófisissuprarrenal (HPA), los brazos simpático y parasimpático del sistema nervioso autónomo (a Ns ), incluyendo el sistema nervioso entérico (ENS) y el nervio vago, y la microbiota intestinal.
Como se demuestra en los ejemplos, las composiciones de la presente invención pueden modular el eje microbiota-intestino-cerebro y reducir la muerte celular asociada con trastornos neurodegenerativos. Por consiguiente, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir trastornos neurodegenerativos, en particular aquellos trastornos y afecciones asociadas con la disfunción del eje microbiotaintestino-cerebro.
En realizaciones particulares, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste de: enfermedad de Parkinson, incluyendo parálisis supranuclear progresiva, parálisis supranuclear progresiva, síndrome de Steele-Richardson-Olszewski, hidrocefalia de presión normal, parkinsonismo vascular o arteriosclerótico y parkinsonismo inducido por fármacos; enfermedad de Alzheimer, incluyendo el síndrome de Benson; esclerosis múltiple; enfermedad de Huntington; esclerosis lateral amiotrófica; enfermedad de Lou Gehrig; enfermedad de las neuronas motoras; enfermedad por priones; ataxia espinocerebelosa; atrofia muscular espinal; demencia; incluyendo demencia de cuerpos de Lewy, vascular y frontotemporal; afasia progresiva primaria; defecto cognitivo leve; deterioro cognitivo relacionado con el VIH y degeneración corticobasal.
Las composiciones de la invención pueden ser particularmente útiles para tratar o prevenir enfermedades crónicas, tratar o prevenir enfermedades en pacientes que no han respondido a otras terapias (como tratamiento con Levodopa, agonistas de dopamina, inhibidores de MAO-B, inhibidores de COMT, antagonistas de glutamato, y/o anticolinérgicos), y/o tratar o prevenir el daño tisular y los síntomas asociados con la disfunción del eje microbiotaintestino-cerebro.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el SNC. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el sistema nervioso autónomo (SNA). En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el sistema nervioso entérico (SNE). En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el eje hipotalámico, pituitario, suprarrenal (HPA). En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la ruta neuroendocrina. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la ruta neuroinmune. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el SNC, el SNA, el SNE, el eje HPA y/o las rutas neuroendocrinas y neuroinmunes. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de metabolitos comensales y/o la permeabilidad gastrointestinal de un sujeto.
La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por sistemas neuronales. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la señalización en sistemas neurales. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la señalización del sistema nervioso central. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la señalización en neuronas sensoriales. En otras realizaciones, las composiciones de la invención modulan la señalización en neuronas motoras. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la señalización en el SNA. En algunas realizaciones, el SNA es el sistema nervioso parasimpático. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención modulan la señalización del nervio vago. En otras realizaciones, el SNA es el sistema nervioso simpático. En otras realizaciones, Las composiciones de la invención modulan la señalización en el sistema nervioso entérico. En ciertas realizaciones, la señalización de las neuronas del SNA y el SNE responde directamente al contenido luminal del tracto gastrointestinal. En otras realizaciones, la señalización de las neuronas del SNA y el SNE responde indirectamente a los neuroquímicos producidos por las bacterias luminales. En otras realizaciones, la señalización de las neuronas del SNA y el SNE responde a neuroquímicos producidos por bacterias luminales o células enteroendocrinas. En ciertas realizaciones preferidas, las neuronas del SNE activan aferentes vagales que influyen en las funciones del SNC. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención regulan la actividad de las células de enterocromafina.
Enfermedades neurodegenerativas
Enfermedad de Parkinson
La enfermedad de Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa común caracterizada neuropatológicamente por la degeneración de poblaciones heterogéneas de células neurales (células productoras de dopamina). El diagnóstico clínico de la enfermedad de Parkinson requiere bradicinesia y por lo menos uno de los siguientes síntomas centrales: temblor en reposo; rigidez muscular y deterioro del reflejo postural. Otros signos y síntomas que pueden estar presentes o desarrollarse durante la progresión de la enfermedad son trastornos autónomos (sialorrea, seborrea, estreñimiento, trastornos de micción, funcionamiento sexual, hipotensión ortostática, hiperhidrosis), trastornos del sueño y trastornos en el sentido del olfato o del sentido de la temperatura. La enfermedad de Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa que puede desarrollarse o persistir debido a la disfunción del eje microbiota-intestino-cerebro. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de la enfermedad de Parkinson en un sujeto.
En realizaciones preferidas adicionales, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, para su uso en un método de tratamiento o prevención de la enfermedad de Parkinson en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16s que es por lo menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO:2. Las composiciones que comprenden una cepa bacteriana del género Megasphaera pueden mejorar las funciones motoras y cognitivas en modelos de la enfermedad de Parkinson. El tratamiento con cepas de Megasphaera puede modular la señalización en los sistemas nervioso central, autónomo y entérico; puede modular la actividad de la ruta del eje HPA; puede modular rutas neuroendocrinas y/o neuroinmunes; y puede modular los niveles de metabolitos comensales, marcadores inflamatorios y/o la permeabilidad gastrointestinal de un sujeto, todo lo cual está implicado en la neuropatología de la enfermedad de Parkinson. En realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis para su uso en un método de tratamiento o prevención de la enfermedad de Parkinson. Las composiciones que usan Megasphaera massiliensis pueden ser particularmente eficaces para tratar la enfermedad de Parkinson.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian uno o más de los síntomas de la enfermedad de Parkinson en un sujeto. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian uno o más síntomas centrales de la enfermedad de Parkinson en un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la bradicinesia en un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian el temblor en reposo; rigidez muscular y/o deterioro del reflejo postural en un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian uno o más síntomas asociados con la progresión de la enfermedad de Parkinson seleccionados de trastornos autonómicos (sialorrea, seborrea, estreñimiento, trastornos de micción, funcionamiento sexual, hipotensión ortostática, hiperhidrosis), trastornos del sueño y trastornos en el sentido del olfato o del sentido de la temperatura.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian los síntomas depresivos comórbidos con la enfermedad de Parkinson. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la memoria verbal y/o las funciones ejecutivas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la atención, la memoria de trabajo, la fluidez verbal y/o la ansiedad.
En otras realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian disfunciones cognitivas comórbidas con la enfermedad de Parkinson.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la progresión de la enfermedad de Parkinson. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian complicaciones motoras posteriores. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian las fluctuaciones motoras tardías. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la pérdida neuronal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran los síntomas de la demencia de la enfermedad de Parkinson (PDD). En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian el deterioro de la función ejecutiva, la atención y/o la memoria de trabajo. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la neurotransmisión dopaminérgica. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la neurotransmisión dopaminérgica deteriorada.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran los síntomas de la enfermedad de Parkinson de acuerdo con una escala sintomática o diagnóstica. En ciertas realizaciones, las pruebas para evaluar la mejora sintomática de la función motora en la enfermedad de Parkinson es la Escala de calificación de la enfermedad de Parkinson unificada. En particular, UPDRS II considera la actividad de la vida diaria y UPDRS III considera el examen motor.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran los síntomas asociados con la PDD de acuerdo con una prueba y/o escala sintomática o diagnóstica. En ciertas realizaciones, la prueba o escala se selecciona de la Prueba de aprendizaje verbal de Hopkins - Revisada (HVLT-R); la prueba de interferencia de colorpalabra del sistema de función ejecutiva Delis-Kaplan (D-KEFS); la escala de calificación de depresión de Hamilton (HAM-D 17; depresión); la escala de calificación de ansiedad de Hamilton (HAM-A; ansiedad) y la escala de calificación de la enfermedad de Parkinson unificada (UPDRS; gravedad de los síntomas de EP).
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la escala de Impresión clínica global -Mejora global (CGI-I) para evaluar trastornos psiquiátricos y neurológicos. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención muestran un efecto positivo sobre el deterioro social y ocupacional global del sujeto con enfermedad de Parkinson.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de trastornos neurológicos como la enfermedad de Parkinson en un sujeto en donde dicho uso implica reducir o prevenir la pérdida de células dopaminérgicas en la sustancia negra. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de trastornos neurológicos como la enfermedad de Parkinson en un sujeto en donde dicho uso implica reducir o prevenir la degeneración de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra de la pars compacta. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de trastornos neurológicos como enfermedad de Parkinson en un sujeto en donde dicho uso implica reducir o prevenir la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra pars compacta y la consiguiente pérdida de sus fibras nerviosas proyectadas en el cuerpo estriado. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de trastornos neurológicos como la enfermedad de Parkinson en un sujeto en donde dicho uso implica reducir o prevenir la pérdida de neuronas dopaminérgicas nigrostriatales.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de trastornos neurológicos como la enfermedad de Parkinson en un sujeto en donde dicho uso implica aumentar los niveles de dopamina. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de trastornos neurológicos como la enfermedad de Parkinson en un sujeto en donde dicho uso implica aumentar los niveles de DOPAC. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de trastornos neurológicos como la enfermedad de Parkinson en un sujeto en donde dicho uso implica aumentar los niveles de dopamina y DOPAC. En ciertas realizaciones, los niveles de dopamina y/o DOPAC aumentan en el cuerpo estriado.
Enfermedad de Alzheimer y demencia
En DSM-5, el término demencia fue reemplazado por los términos trastorno neurocognitivo mayor y trastorno neurocognitivo leve. El trastorno neurocognitivo es una clase heterogénea de enfermedades psiquiátricas. El trastorno neurocognitivo más común es la enfermedad de Alzheimer, seguida de demencias vasculares o formas mixtas de ambas. Otras formas de trastornos neurodegenerativos (por ejemplo, enfermedad de cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, demencia de Parkinson, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Huntington y síndrome de Wernicke-Korsakoff) están acompañados por demencia.
La enfermedad de Alzheimer y la demencia también se caracterizan por la pérdida neuronal, por lo que los efectos neuroprotectores y neuroproliferativos que se muestran en los ejemplos para las composiciones de la invención indican que pueden ser útiles para tratar o prevenir estas afecciones.
Los criterios sintomáticos para la demencia bajo el DSM-5 son evidencia de un deterioro cognitivo significativo de un nivel previo de rendimiento en uno o más dominios cognitivos seleccionados de: aprendizaje y memoria; idioma; función ejecutiva; atención compleja; cognición perceptual-motora y social. Los déficits cognitivos deben interferir con la independencia en las actividades cotidianas. Además, los déficits cognitivos no se producen exclusivamente en el contexto de un delirio y no se explican mejor por otro trastorno mental (por ejemplo, MDD o esquizofrenia).
Además del síntoma primario, los sujetos con trastornos neurodegenerativos muestran síntomas conductuales y psiquiátricos que incluyen agitación, agresión, depresión, ansiedad, apatía, psicosis y trastornos del ciclo sueño-vigilia.
Los trastornos neurodegenerativos pueden desarrollarse o persistir debido a la disfunción del eje microbiota-intestino-cerebro. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de trastornos neurodegenerativos en un sujeto. En realizaciones preferidas, el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Alzheimer. En otras realizaciones, el trastorno neurodegenerativo se selecciona de demencias vasculares; forma mixta de la enfermedad de Alzheimer y demencia vascular; enfermedad de cuerpos de Lewy; demencia frontotemporal; demencia de Parkinson; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; enfermedad de Huntington; y síndrome de Wernicke-Korsakoff.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian uno o más de los síntomas de trastornos neurodegenerativos en un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la aparición de deterioro cognitivo en un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran el nivel de rendimiento de un sujeto con trastornos neurodegenerativos en uno o más dominios cognitivos seleccionados de: aprendizaje y memoria; idioma; función ejecutiva; atención compleja cognición perceptual-motora y social. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la aparición de uno o más síntomas conductuales y psiquiátricos asociados con trastornos neurodegenerativos seleccionados de agitación, agresión, depresión, ansiedad, apatía, psicosis y trastornos del ciclo vigilia-sueño.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la enfermedad sintomática mediante la intervención en mecanismos patogénicos sospechosos en una etapa preclínica. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la modificación de la enfermedad, con la ralentización o detención de la progresión de los síntomas. En algunas realizaciones, la ralentización o la detención de la progresión de los síntomas se correlaciona con evidencia para retrasar el proceso neuropatológico subyacente. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención mejoran los síntomas de trastornos neurodegenerativos que comprenden una mejora cognitiva y funcional mejorada. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención mejoran los síntomas conductuales y psiquiátricos de la demencia (BPSD). En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención mejoran la capacidad de un sujeto con trastorno neurodegenerativo de realizar las actividades cotidianas.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención mejoran tanto la cognición como el funcionamiento en un sujeto con enfermedad de Alzheimer. En algunas realizaciones, la composición de la invención mejora el punto final cognitivo en un sujeto con enfermedad de Alzheimer. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran el punto final funcional en un sujeto con enfermedad de Alzheimer. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención mejoran el punto final cognitivo y funcional en un sujeto con enfermedad de Alzheimer. En realizaciones aún más preferidas, las composiciones de la invención mejoran la respuesta clínica global (el punto final global) en un sujeto con enfermedad de Alzheimer.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran los síntomas de trastornos neurodegenerativos de acuerdo con una prueba sintomática o diagnóstica. En ciertas realizaciones, las pruebas para evaluar la mejora sintomática de la enfermedad de Alzheimer (y otros trastornos neurodegenerativos) se seleccionan de objetivos cognitivos, actividades de la vida diaria, evaluación global del cambio, pruebas de calidad de vida relacionadas con la salud y pruebas que evalúan los síntomas conductuales y psiquiátricos de trastornos neurodegenerativos.
En ciertas realizaciones, las pruebas cognitivas objetivas para la evaluación de la mejora sintomática usan la subescala cognitiva de la escala de evaluación de la enfermedad de Alzheimer (ADAS-cog) y la escala ADAS clásica. En ciertas realizaciones, la mejora sintomática de la cognición se evalúa usando la batería de pruebas neurofisiológicas para el uso en la enfermedad de Alzheimer (NTB).
En algunas realizaciones, la prueba de evaluación global de cambio usa la escala Impresión clínica globalmejora global (CGI-I) para evaluar trastornos psiquiátricos y neurológicos. En algunas realizaciones, la escala global es la impresión de cambio basada en la entrevista del practicante clínico plus (CIBIC-plus). En algunas realizaciones, la escala global es la impresión de cambio global del clínico de la unidad de estudio cooperativo de la enfermedad de Alzheimer (ADCS-CGIC).
En ciertas realizaciones, las medidas de calidad de vida relacionadas con la salud son la QOL relacionada con la enfermedad de Alzheimer (ADRQL) y la QOL-Enfermedad de Alzheimer (QOL-AD).
En ciertas realizaciones, las pruebas que evalúan los síntomas conductuales y psiquiátricos de los trastornos neurodegenerativos se seleccionan de la Escala de clasificación de la patología del comportamiento en la enfermedad de Alzheimer (BEHAVE-AD); la Escala de calificación de comportamiento para la demencia (BRSD); el Inventario neuropsiquiátrico (NPI); y el Inventario de agitación de Cohen-Mansfield (CMAi).
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son particularmente eficaces para prevenir, reducir o aliviar trastornos neurodegenerativos cuando se usan en combinación con otra terapia para tratar trastornos neurodegenerativos. En ciertas realizaciones, tales terapias incluyen inhibidores de acetilcolinesterasa que incluyen donepezil (Aricept®), galantamina (Razadyne®) y rivastigmina (Exelon®) y memantina.
Esclerosis múltiple
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad desmielinizante en la que se daña la vaina de mielina que rodea las neuronas del cerebro y la médula espinal. Se desconocen las causas subyacentes exactas de la EM, pero se cree que varían de un individuo a otro. Ciertas formas de EM son hereditarias. También se piensa que los factores ambientales contribuyen a la EM. En algunos individuos, una combinación de factores genéticos y ambientales puede desencadenar la aparición de EM.
Hay una amplia variedad de síntomas asociados con la EM. Los sujetos pueden mostrar casi cualquier síntoma neurológico asociado con el deterioro del control autonómico, visual, motor o sensorial. Los síntomas exactos variarán dependiendo del sitio del daño neuronal/desmielinización.
IL-8 se ha implicado en la formación de vainas de mielina. Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden usarse para la remielinización de neuronas en sujetos con EM. Las composiciones de la invención también pueden usarse para proteger a las neuronas de la desmielinización. En otras palabras, las composiciones de la invención pueden usarse en un método para tratar o prevenir la esclerosis múltiple restaurando o evitando la pérdida de vainas de mielina neuronal.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian uno o más síntomas de la EM en un sujeto. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la fatiga en un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención evitan, reducen o alivian el temblor en reposo, debilidad muscular, espasmos musculares, rigidez muscular, parestesia y/o ataxia en un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian uno o más síntomas asociados con la progresión de la EM seleccionados de la lista que consiste de trastornos autónomos: estreñimiento, trastornos de micción, funcionamiento sexual, disfagia, disartria, síncope, vértigo y/o mareos; trastornos del sueño; y alteraciones en el sentido del olfato o el sentido de la temperatura. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian uno o más síntomas oculares asociados con la EM. En algunas realizaciones, el síntoma ocular se selecciona de la lista que consiste de pérdida de visión, dolor ocular, daltonismo, visión doble y/o movimientos oculares involuntarios en un sujeto.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian los mareos, vértigo, dolor neuropático, dolor musculoesquelético, disfunción cognitiva, incontinencia intestinal, disfagia, disartria o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian los síntomas depresivos o la ansiedad comórbida con la EM.
En algunas realizaciones, la mejora de los síntomas se determina usando los criterios McDonald 2017 para diagnosticar la EM.
En ciertas realizaciones, el tratamiento con las composiciones de la invención da como resultado una reducción en la incidencia o gravedad de la EM. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción de la incidencia de recaída o la gravedad de la recaída. En ciertas realizaciones, el tratamiento con las composiciones de la invención evita una disminución de la función motora o da como resultado una función motora mejorada asociada con la EM. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la prevención de una disminución de la función motora o para mejorar la función motora en el tratamiento de la EM. En ciertas realizaciones, el tratamiento con las composiciones de la invención previene el desarrollo de parálisis en la EM. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la prevención de la parálisis en el tratamiento de la EM.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la prevención de la esclerosis múltiple en un paciente que ha sido identificado que tiene riesgo de esclerosis múltiple, o al que se le ha diagnosticado esclerosis múltiple en etapa temprana o esclerosis múltiple "recurrente-remitente". Las composiciones de la invención pueden ser útiles para prevenir el desarrollo de la EM. Las composiciones de la invención pueden ser útiles para prevenir la progresión de la EM. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en un paciente al que se le ha identificado que tiene una predisposición genética a la EM, como el fenotipo de clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), antígeno leucocitario humano (HLA) -DR2 o HLA-DR4.
Las composiciones de la invención pueden ser útiles para gestionar o aliviar la esclerosis múltiple. Las composiciones de la invención pueden ser particularmente útiles para reducir los síntomas asociados con la esclerosis múltiple. El tratamiento o la prevención de la esclerosis múltiple puede referirse, por ejemplo, a un alivio de la gravedad de los síntomas o una reducción en la frecuencia de las exacerbaciones o el intervalo de factores desencadenantes que son un problema para el paciente. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención ralentizan o detienen la progresión de la enfermedad.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de la EM recurrente-remitente. En realizaciones alternativas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de EM progresiva, como EM progresiva secundaria (EMPS), que se desarrolla con el tiempo después del diagnóstico de EMRr , EM progresiva primaria (EMPP) que muestra un deterioro neurológico continuo gradual y EM con recaída progresiva (PRMS), que es similar a la EMPP pero con recaídas superpuestas.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de uno o más de los síntomas de la EM seleccionados del grupo que consiste de: fatiga, problemas de visión, entumecimiento, hormigueo, espasmos musculares, rigidez muscular, debilidad muscular, problemas de movilidad, dolor, problemas de pensamiento, aprendizaje y planificación, depresión y ansiedad, problemas sexuales, problemas de vejiga, problemas intestinales, dificultades para hablar y tragar.
Factores neuroquímicos, neuropéptidos y neurotransmisores y el eje microbiota-intestino-cerebro
Como se ha descrito anteriormente, el eje microbiota-intestino-cerebro está modulado por una serie de sistemas fisiológicos diferentes. El eje microbiota-intestino-cerebro está modulado por una serie de moléculas de señalización. Las alteraciones en los niveles de estas moléculas de señalización provocan enfermedades neurodegenerativas. Los experimentos realizados por los inventores indican que la administración de especies de Megasphaera, y en particular de Megasphaera massiliensis, puede modular los niveles de indol y quinurenina. La desregulación de estos metabolitos puede llevar a enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de monoaminas cerebrales y metabolitos de las mismas. En realizaciones preferidas, el metabolito es quinurenina. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la quinurenina, que es la ruta principal del metabolismo del triptófano, que sirve como ruta para la producción de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+). La quinurenina puede metabolizarse a compuestos neuroactivos como el ácido quinurénico (KYNA) y 3-hidroxi-1-quinurenina (3-OH-1-KYN), y en pasos adicionales al ácido quinolínico (QUIN). La desregulación de la ruta de la quinurenina puede llevar a la activación del sistema inmune y a la acumulación de compuestos potencialmente neurotóxicos. Las alteraciones en el metabolismo de la quinurenina pueden estar involucradas en el desarrollo de las enfermedades de Parkinson. Se ha demostrado que los niveles de quinurenina disminuyen en la corteza frontal, el putamen y la sustancia negra pars compacta de pacientes con EP [32]. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se usan para aumentar los niveles de quinurenina en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
En ciertas realizaciones de la invención, las composiciones de la invención pueden aumentar los niveles de quinurenina. Se ha demostrado que los niveles de quinurenina aumentados atenúan la muerte celular neuronal inducida por MPP+ in vitro en una línea celular de neuroblastoma dopaminérgico humano [33]. En ciertas realizaciones, la quinurenina y el ácido quinurénico pueden activar el receptor de hidrocarburo de arilo GI (Ahr) y los receptores de GPR35. La activación del receptor de Ahr induce la producción de IL-22, que puede inhibir la inflamación local. La activación de GPR35 induciendo la producción de inositol trifosfato y movilización de Ca2+.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de indol. En realizaciones preferidas, el metabolito es quinurenina. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la quinurenina, que es la ruta principal del metabolismo del triptófano.
La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por niveles de factores neuroquímicos, neuropéptidos y neurotransmisores. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan niveles de factores neuroquímicos, neuropéptidos y neurotransmisores. Por consiguiente, en ciertas realizaciones preferidas, las composiciones de la invención alteran directamente la bioquímica del SNC.
La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por los niveles de ácido Y-aminobutírico (GABA). Por consiguiente, en realizaciones preferidas, las composiciones de la invención modulan los niveles de GABA. GABA es un neurotransmisor inhibidor que reduce la excitabilidad neuronal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención aumentan los niveles de GABA. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención disminuyen los niveles de GABA. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención alteran la neurotransmisión GABAérgica. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el nivel de transcripción de GABA en diferentes regiones del sistema nervioso central. En ciertas realizaciones, el GABA derivado comensal cruza la barrera hematoencefálica y afecta directamente a la neurotransmisión. En ciertas realizaciones, Las composiciones de la invención llevan a una reducción de GABA en el hipocampo, la amígdala y/o el locus coeruleus. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención llevan a un aumento de GABA en regiones corticales.
Respuesta inmune
La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por alteraciones en la respuesta inmune y factores y marcadores inflamatorios. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden modular la respuesta inmune. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles sistémicos de moléculas de señalización neuroinmunes circulantes. En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones de la invención modulan la producción de citoquinas proinflamatorias y la inflamación. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el estado inflamatorio. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención disminuyen la producción y secreción de IL-6. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención disminuyen la activación del promotor NFkB. En ciertas realizaciones, Las composiciones de la invención son capaces de modular la activación de la producción de IL-6 por el lipopolisacárido de endotoxina proinflamatorio potente (LPS). En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden modular la activación del promotor NFkB por LPS y proteínas mutantes de a-sinucleína como A53T. Los niveles circulantes aumentados de citoquinas están estrechamente relacionados con varios trastornos neurodegenerativos, incluyendo el Parkinson, la demencia y el Alzheimer. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se usan para reducir los niveles de IL-6 y/o los niveles de NFkB en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención aumentan la secreción de IL-8. Se ha demostrado que IL-8 induce la formación de vainas de mielina y restaura o conserva la comunicación neuronal eficaz. Por tanto, en algunas realizaciones, las composiciones de la invención se usan para inducir la formación de vaina de mielina en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la restauración de la comunicación neuronal. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la preservación de la comunicación neuronal.
La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por los niveles de metabolitos comensales. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles sistémicos de metabolitos de la microbiota. En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones de la invención modulan el nivel de ácidos grasos de cadena corta (SCFA). En ciertas realizaciones, el nivel de los SCFA aumenta o disminuye. En algunas realizaciones, el SCFA es ácido butírico (BA) (o butirato). En algunas realizaciones, el SCFA es ácido propiónico (PPA). En algunas realizaciones, el SCFA es ácido acético. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la capacidad de los SCFA para cruzar la barrera hematoencefálica.
La acetilación y desacetilación de histonas son importantes reguladores epigenéticos de la expresión génica. Un desequilibrio en la acetilación y desacetilación de histonas puede provocar apoptosis. La desregulación de tales histonas acetiltransferasas se ha implicado en la patogénesis asociada con enfermedades neurodegenerativas asociadas con la edad, como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica y el deterioro cognitivo [34]. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden modular la actividad de histona desacetilasa. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden reducir la actividad de histona desacetilasa. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden reducir la actividad de histona acetilasa.
Los pacientes con enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis lateral amiotrófica, muestran altos niveles de peroxidación lipídica. Los lípidos son vulnerables a la oxidación por especies reactivas de oxígeno, y el cerebro es rico en ácidos grasos poliinsaturados. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden modular la peroxidación lipídica. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden reducir la peroxidación lipídica. La reducción del daño oxidativo provocado por las especies reactivas de oxígeno puede usarse para dirigirse a las enfermedades neurodegenerativas en etapas tempranas. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de la neurodegeneración en etapa temprana. También, por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la prevención del desarrollo de un trastorno neurodegenerativo. En tales realizaciones, las composiciones de la invención pueden usarse en un paciente que ha sido identificado en riesgo de desarrollar un trastorno neurodegenerativo.
La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por los niveles de permeabilidad gastrointestinal. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las composiciones de la invención alteran la integridad del epitelio del tracto gastrointestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la permeabilidad del tracto gastrointestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la función barrera y la integridad del tracto gastrointestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la motilidad del tracto gastrointestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la translocación de metabolitos comensales y moléculas de señalización inflamatoria en el torrente sanguíneo desde la luz del tracto gastrointestinal.
La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por la composición del microbioma en el tracto gastrointestinal. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la composición de microbioma del tracto gastrointestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen la disbiosis de microbioma y los aumentos asociados en los metabolitos tóxicos (por ejemplo, LPS). En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de Clostridium en el tracto gastrointestinal. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención reducen el nivel de Clostridium en el tracto gastrointestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen los niveles de Campylobacter jejuni. En ciertas realizaciones, Las composiciones de la invención modulan la proliferación de bacterias anaerobias nocivas y la producción de neurotoxinas producidas por estas bacterias. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de microbioma de Lactobacillus y/o Bifidobacterium. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de microbioma de los géneros Sutterella, Prevotella, Ruminococcus y/o la familia Alcaligenaceae. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención aumentan el nivel de Lactobacillus plantarum y/o Saccharomyces boulardii.
Lesiones cerebrales
Los ejemplos demuestran que las composiciones de la invención son neuroprotectoras y tienen actividad inhibidora de HDAC. HDAC2 es un objetivo crucial para la recuperación funcional del derrame cerebral [35] y la inhibición de HDAC puede prevenir la lesión de la materia blanca [36], por lo que las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de lesiones cerebrales.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de lesiones cerebrales. En algunas realizaciones, la lesión cerebral es una lesión cerebral traumática. En algunas realizaciones, la lesión cerebral es una lesión cerebral adquirida. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de lesiones cerebrales resultantes de traumatismos. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de lesiones cerebrales resultantes de un tumor. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de lesiones cerebrales resultantes de un derrame cerebral. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de lesiones cerebrales resultantes de una hemorragia cerebral. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de lesiones cerebrales resultantes de encefalitis. En algunas realizaciones, Las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de lesiones cerebrales resultantes de hipoxia cerebral. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de lesiones cerebrales resultantes de anoxia cerebral.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento del derrame cerebral. Los efectos mostrados en los ejemplos son particularmente relevantes para el tratamiento del derrame cerebral. El derrame cerebral se produce cuando se interrumpe el flujo sanguíneo a por lo menos una parte del cerebro. Sin un suministro adecuado de sangre para proporcionar oxígeno y nutrientes al tejido cerebral y eliminar los productos de desecho del tejido cerebral, las células cerebrales comienzan a morir rápidamente. Los síntomas del derrame cerebral dependen de la región del cerebro que se ve afectada por el flujo sanguíneo inadecuado. Los síntomas incluyen parálisis, entumecimiento o debilidad de los músculos, pérdida de equilibrio, mareos, dolores de cabeza graves y repentinos, problemas del habla, pérdida de memoria, pérdida de la capacidad de razonamiento, confusión repentina, deterioro de la visión, coma o incluso la muerte. Un derrame cerebral también se conoce como ataque cerebral o accidente cerebrovascular (ACV). Los síntomas del derrame cerebral pueden ser breves si se restablece el flujo sanguíneo adecuado en un corto período de tiempo. Sin embargo, si el flujo sanguíneo inadecuado continúa durante un período de tiempo significativo, los síntomas pueden ser permanentes.
En algunas realizaciones, el derrame cerebral es isquemia cerebral. La isquemia cerebral se produce cuando no hay flujo sanguíneo suficiente a los tejidos del cerebro para satisfacer la demanda metabólica. En algunas realizaciones, la isquemia cerebral es isquemia cerebral focal, es decir, confinada a una región específica del cerebro. En algunas realizaciones, la isquemia cerebral es isquemia cerebral global, es decir, que abarca un área amplia del tejido cerebral. La isquemia cerebral focal se produce comúnmente cuando un vaso cerebral se ha bloqueado, parcial o completamente, reduciendo el flujo de sangre a una región específica del cerebro. En algunas realizaciones, la isquemia cerebral focal es un derrame cerebral isquémico. En algunas realizaciones, el derrame cerebral isquémico es trombótico, es decir, provocado por un trombo o coágulo sanguíneo, que se desarrolla en un vaso cerebral y restringe o bloquea el flujo sanguíneo. En algunas realizaciones, el derrame cerebral isquémico es un derrame cerebral trombótico. En algunas realizaciones, el derrame cerebral isquémico es embólico, es decir, provocado por un émbolo o una masa no unida que se desplaza a través del torrente sanguíneo y restringe o bloquea el flujo sanguíneo en un sitio distante de su punto de origen. En algunas realizaciones, el derrame cerebral isquémico es un derrame cerebral embólico. La isquemia cerebral global se produce comúnmente cuando el flujo sanguíneo al cerebro en su conjunto se bloquea o se reduce. En algunas realizaciones, la isquemia cerebral global está provocada por hipoperfusión, es decir, debido a shock. En algunas realizaciones, la isquemia cerebral global es el resultado de un paro cardíaco.
En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido isquemia cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido isquemia cerebral focal. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido un derrame cerebral isquémico. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido un derrame cerebral trombótico. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido un derrame cerebral embólico. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido isquemia cerebral global. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido hipoperfusión. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido un paro cardíaco.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de isquemia cerebral. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de isquemia cerebral focal. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de derrame cerebral isquémico. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de derrame cerebral trombótico. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de derrame cerebral embólico. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de isquemia cerebral global. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de la hipoperfusión.
En algunas realizaciones, el derrame cerebral es un derrame cerebral hemorrágico. El derrame cerebral hemorrágico está provocado por una hemorragia dentro o alrededor del cerebro que produce hinchazón, presión y daño a las células y tejidos del cerebro. El derrame cerebral hemorrágico es comúnmente el resultado de un vaso sanguíneo debilitado que se rompe y sangra en el cerebro circundante. En algunas realizaciones, el derrame cerebral hemorrágico es una hemorragia intracerebral, es decir, provocado por un sangrado dentro del propio tejido cerebral. En algunas realizaciones, la hemorragia intracerebral está provocada por una hemorragia intraparenquimatosa. En algunas realizaciones, la hemorragia intracerebral está provocada por una hemorragia intraventricular. En algunas realizaciones, el derrame cerebral hemorrágico es una hemorragia subaracnoidea, es decir, un sangrado que se produce fuera del tejido cerebral pero todavía dentro del cráneo. En algunas realizaciones, El derrame cerebral hemorrágico es el resultado de angiopatía amiloide cerebral. En algunas realizaciones, el derrame cerebral hemorrágico es el resultado de un aneurisma cerebral. En algunas realizaciones, el derrame cerebral hemorrágico es el resultado de una malformación arteriovenosa cerebral (AVM).
En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido un derrame cerebral hemorrágico. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido una hemorragia intracerebral. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido una hemorragia intraparenquimatosa. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido una hemorragia intraventricular. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido una hemorragia subaracnoidea. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido angiopatía amiloide cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido un aneurisma cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido AVM cerebral.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de derrame cerebral hemorrágico. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de una hemorragia intracerebral. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de una hemorragia intraparenquimatosa. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de una hemorragia intraventricular. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de una hemorragia subaracnoidea. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de una angiopatía amiloide cerebral. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de un aneurisma cerebral. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de AVM cerebral.
La restauración del flujo sanguíneo adecuado al cerebro después de un período de interrupción, aunque es eficaz para aliviar los síntomas asociados con el derrame cerebral, puede paradójicamente provocar un mayor daño al tejido cerebral. Durante el período de interrupción, el tejido afectado sufre una falta de oxígeno y nutrientes, y la restauración repentina del flujo sanguíneo puede provocar inflamación y daño oxidativo a través de la inducción del estrés oxidativo. Esto se conoce como lesión por reperfusión, y está bien documentado no solo después de un derrame cerebral, sino también después de un ataque cardíaco u otro daño tisular cuando el suministro de sangre regresa al tejido después de un período de isquemia o falta de oxígeno. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido una lesión por reperfusión como resultado de un derrame cerebral. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de lesiones por reperfusión como resultado de un derrame cerebral.
Un ataque isquémico transitorio (AIT), a menudo referido como mini-derrame cerebral, es una señal de advertencia reconocida para un derrame cerebral más grave. Por lo tanto, los sujetos que han sufrido uno o más AIT tienen un mayor riesgo de derrame cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto diagnosticado con lesión cerebral ha sufrido un AIT. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de un AIT. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de lesiones cerebrales en un sujeto que ha sufrido un AIT.
La presión arterial alta, colesterol alto en la sangre, antecedentes familiares de derrame cerebral, enfermedad cardíaca, diabetes, aneurismas cerebrales, malformaciones arteriovenosas, enfermedad de células falciformes, vasculitis, trastornos hemorrágicos, uso de medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), fumar tabaco, beber grandes cantidades de alcohol, el uso de drogas ilegales, la obesidad, la falta de actividad física y una dieta poco saludable se consideran factores de riesgo para el derrame cerebral. En particular, se ha demostrado de manera concluyente que la disminución de la presión arterial previene los accidentes cerebrovasculares isquémicos y hemorrágicos [37, 38]. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de lesiones cerebrales en un sujeto que tiene por lo menos un factor de riesgo de derrame cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto tiene dos factores de riesgo de derrame cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto tiene tres factores de riesgo de derrame cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cuatro factores de riesgo de derrame cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto tiene más de cuatro factores de riesgo de derrame cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto tiene presión arterial alta. En algunas realizaciones, el sujeto tiene colesterol alto en sangre. En algunas realizaciones, el sujeto tiene historial familiar de derrame cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto tiene enfermedad cardíaca. En algunas realizaciones, el sujeto tiene diabetes. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un aneurisma cerebral. En algunas realizaciones, el sujeto tiene malformaciones arteriovenosas. En algunas realizaciones, el sujeto tiene vasculitis. En algunas realizaciones, el sujeto tiene enfermedad de células falciformes. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un trastorno hemorrágico. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un historial de uso de fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE). En algunas realizaciones, el sujeto fuma tabaco. En algunas realizaciones, el sujeto bebe grandes cantidades de alcohol. En algunas realizaciones, el sujeto usa drogas ilegales. En algunas realizaciones, el sujeto es obeso. En algunas realizaciones, el sujeto tiene sobrepeso. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una falta de actividad física. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una dieta poco saludable.
Los ejemplos indican que las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar la lesión cerebral y ayudar a la recuperación cuando se administran antes de que se produzca el evento de lesión. Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden ser particularmente útiles para tratar lesiones cerebrales cuando se administran a sujetos con riesgo de lesión cerebral, como derrame cerebral.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del daño provocado por una posible lesión cerebral, preferiblemente un derrame cerebral. Las composiciones pueden reducir el daño provocado cuando se administran antes de que se produzca la posible lesión cerebral, en particular cuando se administra a un paciente al que se le ha identificado que tiene riesgo de sufrir una lesión cerebral.
Los ejemplos indican que las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar lesiones cerebrales y ayudar a la recuperación cuando se administran después de que se produce el evento de lesión. Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden ser particularmente útiles para tratar lesiones cerebrales cuando se administran a sujetos después de una lesión cerebral, como derrame cerebral.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención tratan la lesión cerebral reduciendo el daño motor. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención tratan la lesión cerebral mejorando la función motora. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención tratan la lesión cerebral mejorando la fuerza muscular. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención tratan la lesión cerebral mejorando la memoria. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención tratan la lesión cerebral mejorando el reconocimiento social. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención tratan la lesión cerebral mejorando la función neurológica.
El tratamiento de la lesión cerebral puede referirse, por ejemplo, a un alivio de la gravedad de los síntomas. El tratamiento de la lesión cerebral también puede referirse a la reducción de los deterioros neurológicos después del derrame cerebral. Las composiciones de la invención para su uso en el tratamiento del derrame cerebral pueden proporcionarse al sujeto antes del inicio del derrame cerebral, por ejemplo, en un paciente identificado en riesgo de derrame cerebral. Las composiciones de la invención para su uso en el tratamiento del derrame cerebral pueden proporcionarse después de que se haya producido un derrame cerebral, por ejemplo, durante la recuperación. Las composiciones de la invención para su uso en el tratamiento del derrame cerebral pueden proporcionarse durante la fase aguda de recuperación (es decir, hasta una semana después del derrame cerebral). Las composiciones de la invención para su uso en el tratamiento del derrame cerebral pueden proporcionarse durante la fase subaguda de la recuperación (es decir, desde una semana hasta tres meses después del derrame cerebral). Las composiciones de la invención para su uso en el tratamiento del derrame cerebral pueden proporcionarse durante la fase crónica de recuperación (a partir de los tres meses posteriores al derrame cerebral).
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en combinación con un agente activo secundario. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en combinación con aspirina o activador de plasminógeno tisular (tPA). Otros agentes secundarios incluyen otros antiplaquetarios (como clopidogrel), anticoagulantes (como heparinas, warfarina, apixaban, dabigatrán, edoxaban o rivaroxaban), antihipertensivos (como diuréticos, inhibidores de ACE, bloqueadores de los canales de calcio, beta-bloqueantes o alfa-bloqueantes) o estatinas Las composiciones de la invención pueden mejorar la respuesta del paciente al agente activo secundario.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen el efecto de la isquemia en los tejidos. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen la cantidad de daño a los tejidos provocado por la isquemia. En ciertas realizaciones, los tejidos dañados por la isquemia son los tejidos cerebrales. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen la necrosis o el número de células necróticas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen la apoptosis o el número de células apoptóticas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen el número de células necróticas y apoptóticas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen la muerte celular por necrosis y/o apoptosis. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen la muerte celular por necrosis y/o apoptosis provocada por isquemia. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la recuperación del tejido dañado por isquemia. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la velocidad de depuración de células necróticas y/o células apoptóticas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la eficacia de depuración de células necróticas y/o células apoptóticas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran el reemplazo y/o la regeneración de células dentro de los tejidos. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran el reemplazo y/o la regeneración de células dentro de tejidos dañados por isquemia. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la histología global del tejido (por ejemplo, tras una biopsia).
Modos de administración
Preferiblemente, las composiciones de la invención se administrarán al tracto gastrointestinal para permitir el suministro y/o la colonización parcial o total del intestino con la cepa bacteriana de la invención. Generalmente, las composiciones de la invención se administran por vía oral, pero pueden administrarse por vía rectal, intranasal o por vía bucal o sublingual.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden administrarse como una espuma, como un spray o un gel.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden administrarse como un supositorio, como un supositorio rectal, por ejemplo en forma de un aceite de teobroma (manteca de cacao), grasa dura sintética (por ejemplo, supocire, witepsol), glicerina-gelatina, polietilenglicol o composición de glicerina de jabón.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención se administra al tracto gastrointestinal a través de un tubo, como un tubo nasogástrico, tubo orogástrico, tubo gástrico, tubo de yeyunostomía (tubo J), gastrostomía endoscópica percutánea (PEG), o un puerto, como un puerto de pared torácica que proporciona acceso al estómago, el yeyuno y otros puertos de acceso adecuados.
Las composiciones de la invención pueden administrarse una vez, o pueden administrarse secuencialmente como parte de un régimen de tratamiento. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se administran diariamente.
En ciertas realizaciones de la invención, el tratamiento de acuerdo con la invención se acompaña de una evaluación de la microbiota intestinal del paciente. El tratamiento puede repetirse si no se logra la administración y/o la colonización parcial o total con la cepa de la invención de tal manera que no se observe eficacia, o el tratamiento puede cesar si la administración y/o la colonización parcial o total tiene éxito y se observa eficacia.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención puede administrarse a un animal preñado, por ejemplo, un mamífero como un humano para evitar que se desarrolle una enfermedad inflamatoria o autoinmune en su hijo en el útero y/o después de que nazca.
Las composiciones de la invención pueden administrarse a un paciente al que se le ha diagnosticado una enfermedad neurodegenerativa, o que se ha identificado que está en riesgo de una enfermedad neurodegenerativa. Las composiciones también pueden administrarse como una medida profiláctica para prevenir el desarrollo de enfermedad neurodegenerativa en un paciente sano.
Las composiciones de la invención pueden administrarse a un paciente al que se le ha identificado que tiene una microbiota intestinal anormal. Por ejemplo, el paciente puede tener una colonización reducida o ausente por Megasphaera, y en particular Megasphaera massiliensis.
Las composiciones de la invención pueden administrarse como un producto alimenticio, como un suplemento nutricional.
Generalmente, las composiciones de la invención son para el tratamiento de humanos, aunque pueden usarse para tratar animales que incluyen mamíferos monogástricos como aves de corral, cerdos, gatos, perros, caballos o conejos. Las composiciones de la invención pueden ser útiles para mejorar el crecimiento y el rendimiento de los animales. Si se administra a animales, puede usarse sonda oral.
Composiciones
Generalmente, la composición de la invención comprende bacterias. En realizaciones preferidas de la invención, la composición se formula en forma secada por congelación. Por ejemplo, la composición de la invención puede comprender gránulos o cápsulas de gelatina, por ejemplo cápsulas de gelatina dura, que comprenden una cepa bacteriana de la invención.
Preferiblemente, la composición de la invención comprende bacterias liofilizadas. La liofilización de bacterias es un procedimiento bien establecido y la orientación relevante está disponible, por ejemplo, en las referencias [39], [], [41]].
Alternativamente, la composición de la invención puede comprender un cultivo bacteriano vivo activo. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención no se ha inactivado, por ejemplo, no se ha inactivado por calor. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención no ha sido matada, por ejemplo, no ha sido matada por calor. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención no se ha atenuado, por ejemplo, no se ha atenuado por calor. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención no ha sido matada, inactivada y/o atenuada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención está viva. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención es viable. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención es capaz de colonizar parcial o totalmente el intestino. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención es viable y capaz de colonizar parcial o totalmente el intestino.
En algunas realizaciones, la composición comprende una mezcla de cepas bacterianas vivas y cepas bacterianas que han sido matadas.
En realizaciones preferidas, la composición de la invención se encapsula para permitir la administración de la cepa bacteriana al intestino. La encapsulación protege la composición de la degradación hasta la administración en la localización objetivo mediante, por ejemplo, la ruptura con estímulos químicos o físicos como presión, actividad enzimática o disgregación física, que pueden desencadenarse por cambios en el pH. Puede usarse cualquier método de encapsulación apropiado. Las técnicas de encapsulación ejemplares incluyen atrapamiento dentro de una matriz porosa, unión o adsorción sobre superficies portadoras sólidas, autoagregación por floculación o con agentes de reticulación y contención mecánica detrás de una membrana microporosa o una microcápsula. La orientación sobre la encapsulación que puede ser útil para preparar composiciones de la invención está disponible en, por ejemplo, las referencias [42] y [43].
La composición puede administrarse por vía oral y puede estar en forma de comprimido, cápsula o polvo. Se prefieren los productos encapsulados porque las Megasphaera son anaerobias. Pueden incluirse otros ingredientes (como la vitamina C, por ejemplo), como captadores de oxígeno y sustratos prebióticos para mejorar la administración y/o la colonización parcial o total y la supervivencia in vivo. Alternativamente, la composición probiótica de la invención puede administrarse por vía oral como un producto alimenticio o nutricional, como leche o producto lácteo fermentado a base de suero, o como un producto farmacéutico.
La composición puede formularse como un probiótico.
Una composición de la invención incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de una cepa bacteriana de la invención. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una cepa bacteriana es suficiente para ejercer un efecto beneficioso sobre un paciente. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una cepa bacteriana puede ser suficiente para dar como resultado la administración y/o colonización parcial o total del intestino del paciente.
Una dosis diaria adecuada de la bacteria, por ejemplo para un humano adulto, puede ser de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias (UFC); por ejemplo, de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1010 UFC; en otro ejemplo de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1010 UFC.
En ciertas realizaciones, la composición contiene la cepa bacteriana en una cantidad de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1011 UFC/g, con respecto al peso de la composición; por ejemplo, de aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1010 UFC/g. La dosis puede ser de, por ejemplo, 1 g, 3 g, 5 g y 10 g.
Típicamente, un probiótico, como la composición de la invención, se combina opcionalmente con por lo menos un compuesto prebiótico adecuado. Un compuesto prebiótico suele ser un carbohidrato no digerible, como un oligo- o polisacárido, o un alcohol de azúcar, que no se degrada ni se absorbe en el tracto digestivo superior. Los prebióticos conocidos incluyen productos comerciales como inulina y transgalacto-oligosacáridos.
En ciertas realizaciones, la composición probiótica de la presente invención incluye un compuesto prebiótico en una cantidad de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 30% en peso, con respecto a la composición en peso total (por ejemplo, del 5 al 20% en peso). Los carbohidratos pueden seleccionarse del grupo que consiste de: fructo-oligosacáridos (o FOS), fructo-oligosacáridos de cadena corta, inulina, isomaltoligosacáridos, pectinas, xilo-oligosacáridos (o XOS), quitosano-oligosacáridos (o COS), beta-glucanos, goma de almendra modificada y almidones resistentes, polidextrosa, D-tagatosa, fibras de acacia, algarroba, avena y fibras de cítricos. En un aspecto, los prebióticos son los fructo-oligosacáridos de cadena corta (por simplicidad mostrados a continuación como FOSs-c.c.); tales FOSs-c.c. son carbohidratos no digeribles, generalmente obtenidos por la conversión de azúcar de remolacha y que incluyen una molécula de sacarosa a la que se unen tres moléculas de glucosa.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se usan en combinación con otro compuesto terapéutico para tratar o prevenir el trastorno neurodegenerativo. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se administran con suplementos nutricionales que modulan la neuroprotección o neuroproliferación. En realizaciones preferidas, los suplementos nutricionales comprenden o consisten de vitaminas nutricionales. En ciertas realizaciones, las vitaminas son vitamina B6, magnesio, dimetilglicina (vitamina B16) y vitamina C. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se administran en combinación con otro probiótico.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se usan para potenciar el efecto de un segundo agente sobre una enfermedad neurodegenerativa. Los efectos inmunomoduladores de las composiciones de la invención pueden hacer que el cerebro sea más susceptible a las terapias convencionales como Levodopa, agonistas de dopamina, inhibidores de MAO-B, inhibidores de COMT, antagonistas de glutamato o anticolinérgicos, que son agentes secundarios ejemplares que se administrarán en combinación (secuencial o simultáneamente) con las composiciones de la invención.
Las composiciones de la invención pueden comprender excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de dichos excipientes adecuados pueden encontrarse en la referencia [44]. Los portadores o diluyentes aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en la referencia [45]. Los ejemplos de portadores adecuados incluyen lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol, sorbitol y similares. Ejemplos de diluyentes adecuados incluyen etanol, glicerol y agua. La elección del portador, excipiente o diluyente farmacéutico puede seleccionarse con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como, o además del portador, excipiente o diluyente, cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento, agente de solubilización adecuado. Ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, como acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietilenglicol. Los ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares. Pueden proporcionarse conservantes, estabilizadores, colorantes e incluso agentes aromatizantes en la composición farmacéutica. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido phidroxibenzoico. También pueden usarse antioxidantes y agentes de suspensión.
Las composiciones de la invención pueden formularse como un producto alimenticio. Por ejemplo, un producto alimenticio puede proporcionar un beneficio nutricional además del efecto terapéutico de la invención, como en un suplemento nutricional. De manera similar, un producto alimenticio puede formularse para mejorar el sabor de la composición de la invención o para hacer que la composición sea más atractiva para el consumo al ser más similar a un producto alimenticio común, que a una composición farmacéutica. En ciertas realizaciones, la composición de la invención se formula como un producto a base de leche. El término "producto a base de leche" significa cualquier producto a base de leche o suero líquido o semisólido que tenga un contenido variable de grasa. El producto a base de leche puede ser, por ejemplo, leche de vaca, leche de cabra, leche de oveja, leche desnatada, leche entera, leche recombinada a partir de leche en polvo y suero sin ningún procesamiento, o un producto procesado, como yogur, leche cuajada, cuajada, leche agria, leche entera agria, leche de mantequilla y otros productos de leche agria. Otro grupo importante incluye las bebidas lácteas, como las bebidas de suero, las leches fermentadas, las leches condensadas, las leches infantiles o para bebés; leches aromatizadas, helados; alimentos que contienen leche, como dulces.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden una o más cepas bacterianas del género Megasphaera y no contienen bacterias de ningún otro género, o comprenden solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otros géneros. Por tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una o más cepas bacterianas del género Megasphaera, que no contiene bacterias de ningún otro género o que comprende solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otros géneros, para su uso en terapia.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden una o más cepas bacterianas de la especie Megasphaera massiliensis y no contienen bacterias de ninguna otra especie, o comprenden solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra especie. Por tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una o más cepas bacterianas de la especie Megasphaera massiliensis, que no contiene bacterias de ninguna otra especie o que comprende solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra especie, para su uso en terapia.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden una o más cepas bacterianas de la especie Megasphaera massiliensis y no contienen bacterias de ninguna otra especie de Megasphaera, o comprenden solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra especie de Megasphaera. Por tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una o más cepas bacterianas de la especie Megasphaera massiliensis, que no contiene bacterias de ninguna otra especie de Megasphaera o que comprende solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra especie de Megasphaera, para su uso en terapia.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención contienen una única cepa o especie bacteriana y no contienen ninguna otra cepa o especie bacteriana. Tales composiciones pueden comprender solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de otras cepas o especies bacterianas. Tales composiciones pueden ser un cultivo que esté sustancialmente libre de otras especies de organismos.
En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una única cepa bacteriana del género Megasphaera, que no contiene bacterias de ninguna otra cepa o que comprende solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra cepa para su uso en terapia.
En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una única cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis, que no contiene bacterias de ninguna otra cepa o que comprende solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra cepa para su uso en terapia.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden más de una cepa bacteriana. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden más de una cepa de la misma especie (por ejemplo, más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 45 cepas) y, opcionalmente, no contienen bacterias de ninguna otra especie. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden menos de 50 cepas de la misma especie (por ejemplo, menos de 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 cepas) y, opcionalmente, no contienen bacterias de ninguna otra especie. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden 1-40, 1-30, 1-20, 1-19, 1-18, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1- 2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 6-30, 6-15, 16-25 o 31-50 cepas de la misma especie y, opcionalmente, no contienen bacterias de ninguna otra especie. La invención comprende cualquier combinación de lo anterior.
En algunas realizaciones, la composición comprende un consorcio microbiano. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición comprende la cepa bacteriana Megasphaera como parte de un consorcio microbiano. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana Megasphaera está presente en combinación con una o más (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4, 5, 10, 15 o 20) otras cepas bacterianas de otros géneros con las que puede vivir simbióticamente in vivo en el intestino. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición comprende una cepa bacteriana de Megasphaera en combinación con una cepa bacteriana de un género diferente. En algunas realizaciones, el consorcio microbiano comprende dos o más cepas bacterianas obtenidas de una muestra de heces de un único organismo, por ejemplo, un humano. En algunas realizaciones, el consorcio microbiano no se encuentra junto en la naturaleza. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el consorcio microbiano comprende cepas bacterianas obtenidas de muestras de heces de por lo menos dos organismos diferentes. En algunas realizaciones, los dos organismos diferentes son de la misma especie, por ejemplo, dos humanos diferentes. En algunas realizaciones, los dos organismos diferentes son un humano infantil y un humano adulto. En algunas realizaciones, los dos organismos diferentes son un mamífero humano y un mamífero no humano.
En algunas realizaciones, la composición de la invención comprende adicionalmente una cepa bacteriana que tiene las mismas características de seguridad y eficacia terapéutica que la cepa MRx0029, pero que no es la MRx0029, o que no es una Megasphaera massiliensis.
En algunas realizaciones en las que la composición de la invención comprende más de una cepa, especie o género bacteriano, las cepas, especies o géneros bacterianos individuales pueden ser para administración separada, simultánea o secuencial. Por ejemplo, la composición puede comprender todas de más de una cepa, especie o género bacteriano, o las cepas, especies o géneros bacterianos pueden almacenarse por separado y administrarse por separado, simultánea o secuencialmente. En algunas realizaciones, la más de una cepa, especie o género bacteriano se almacenan por separado pero se mezclan antes de su uso.
En algunas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención se obtiene de heces de humanos adultos. En algunas realizaciones en las que la composición de la invención comprende más de una cepa bacteriana, todas las cepas bacterianas se obtienen de heces de humanos adultos o si hay otras cepas bacterianas presentes, están presentes solo en cantidades mínimas. La bacteria puede haber sido cultivada después de ser obtenida de las heces de humanos adultos y ser usada en una composición de la invención.
Como se ha mencionado anteriormente, en algunas realizaciones, la una o más cepas bacterianas de Megasphaera son los únicos agentes terapéuticamente activos en una composición de la invención. En algunas realizaciones, las cepas bacterianas en la composición son los únicos agentes terapéuticamente activos en una composición de la invención.
Las composiciones para su uso de acuerdo con la invención pueden requerir o no aprobación de comercialización.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde dicha cepa bacteriana se liofiliza. En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde dicha cepa bacteriana se seca por pulverización. En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la cepa bacteriana se liofiliza o se seca por pulverización y en donde está viva. En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la cepa bacteriana se liofiliza o se seca por pulverización y en donde es viable. En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la cepa bacteriana se liofiliza o se seca por pulverización y en donde es capaz de colonizar parcial o totalmente el intestino. En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la cepa bacteriana se liofiliza o se seca por pulverización y en donde es viable y capaz de colonizar parcial o totalmente el intestino.
En algunos casos, la cepa bacteriana liofilizada se reconstituye antes de la administración. En algunos casos, la reconstitución es mediante el uso de un diluyente descrito en la presente.
Las composiciones de la invención pueden comprender excipientes, diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: una cepa bacteriana de la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde la cepa bacteriana está en una cantidad suficiente para tratar un trastorno neurodegenerativo cuando se administra a un sujeto con necesidad de ello.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: una cepa bacteriana de la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde la cepa bacteriana está en una cantidad suficiente para tratar o prevenir un trastorno neurodegenerativo.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la cantidad de la cepa bacteriana es de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias por gramo con respecto al peso de la composición.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la composición se administra a una dosis de 1 g, 3 g, 5 g o 10 g.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la composición se administra mediante un método seleccionado del grupo que consiste de oral, rectal, subcutáneo, nasal, bucal y sublingual.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un portador seleccionado del grupo que consiste de lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol y sorbitol.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un diluyente seleccionado del grupo que consiste de etanol, glicerol y agua.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un excipiente seleccionado del grupo que consiste de almidón, gelatina, glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorante de maíz, acacia, tragacanto, alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio y cloruro de sodio.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende además por lo menos uno de un conservante, un antioxidante y un estabilizador.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un conservante seleccionado del grupo que consiste de benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido phidroxibenzoico.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde dicha cepa bacteriana está liofilizada.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde cuando la composición se almacena en un recipiente sellado a de aproximadamente 4° C o aproximadamente 25° C y el recipiente se coloca en una atmósfera con un 50% de humedad relativa, por lo menos un 80% de la cepa bacteriana medida en unidades formadoras de colonias, permanece después de un período de por lo menos aproximadamente: 1 mes, 3 meses, 6 meses, 1 año, 1,5 años, 2 años, 2,5 años o 3 años.
En algunas realizaciones, la composición de la invención se proporciona en un recipiente sellado que comprende una composición como se describe en la presente. En algunas realizaciones, el recipiente sellado es una bolsita o botella. En algunas realizaciones, la composición de la invención se proporciona en una jeringuilla que comprende una composición como se describe en la presente.
La composición de la presente invención puede, en algunas realizaciones, proporcionarse como una formulación farmacéutica. Por ejemplo, la composición puede proporcionarse como un comprimido o cápsula. En algunas realizaciones, la cápsula es una cápsula de gelatina ("gel-cap").
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se administran por vía oral. La administración oral puede implicar la deglución, de modo que el compuesto se introduzca en el tracto gastrointestinal, y/o la administración bucal, lingual o sublingual por la cual el compuesto se introduce en el torrente sanguíneo directamente desde la boca.
Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para administración oral incluyen tapones sólidos, micropartículas sólidas, semisólidas y líquidas (incluyendo sistemas de múltiples fases o dispersos) como comprimidos; cápsulas blandas o duras que contienen multi- o nanopartículas, líquidos (por ejemplo, soluciones acuosas), emulsiones o polvos; grageas (incluyendo las rellenas de líquido); gomas de mascar; geles; formas de dosificación de dispersión rápida; películas; óvulos; espráis; y parches bucales/mucoadhesivos.
En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica es una formulación entérica, es decir, una formulación gastrorresistente (por ejemplo, resistente al pH gástrico) que es adecuada para la administración de la composición de la invención al intestino mediante administración oral. Las formulaciones entéricas pueden ser particularmente útiles cuando la bacteria u otro componente de la composición es sensible al ácido, por ejemplo, propenso a la degradación en condiciones gástricas.
En algunas realizaciones, la formulación entérica comprende un recubrimiento entérico. En algunas realizaciones, la formulación es una forma de dosificación con recubrimiento entérico. Por ejemplo, la formulación puede ser un comprimido con recubrimiento entérico o una cápsula con recubrimiento entérico, o similares. El recubrimiento entérico puede ser un recubrimiento entérico convencional, por ejemplo, un recubrimiento convencional para un comprimido, cápsula o similar para administración oral. La formulación puede comprender un recubrimiento de película, por ejemplo, una capa de película delgada de un polímero entérico, por ejemplo, un polímero insoluble en ácido.
En algunas realizaciones, la formulación entérica es intrínsecamente entérica, por ejemplo, gastrorresistente sin la necesidad de un recubrimiento entérico. Por tanto, en algunas realizaciones, la formulación es una formulación entérica que no comprende un recubrimiento entérico. En algunas realizaciones, la formulación es una cápsula elaborada a partir de un material termogelificante. En algunas realizaciones, el material termogelificante es un material celulósico, como metilcelulosa, hidroximetilcelulosa o hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). En algunas realizaciones, la cápsula comprende una cubierta que no contiene ningún polímero formador de película. En algunas realizaciones, la cápsula comprende una cubierta y la cubierta comprende hidroxipropilmetilcelulosa y no comprende ningún polímero formador de película (por ejemplo, ver [46]). En algunas realizaciones, la formulación es una cápsula intrínsecamente entérica (por ejemplo, Vcaps® de Capsugel).
En algunas realizaciones, la formulación es una cápsula blanda. Las cápsulas blandas son cápsulas que pueden, debido a las adiciones de ablandadores como, por ejemplo, glicerol, sorbitol, maltitol y polietilenglicoles, presentes en la cubierta de la cápsula, tener cierta elasticidad y blandura. Las cápsulas blandas pueden producirse, por ejemplo, a base de gelatina o almidón. Las cápsulas blandas a base de gelatina están disponibles comercialmente de varios proveedores. Dependiendo del método de administración como, por ejemplo, por vía oral o rectal, las cápsulas blandas pueden tener varias formas, pueden ser, por ejemplo, redondas, ovales, oblongas o con forma de torpedo. Las cápsulas blandas pueden producirse mediante procesos convencionales como, por ejemplo, mediante el proceso de Scherer, el proceso de Accogel o el proceso de goteo o soplado.
Métodos de cultivo
Las cepas bacterianas para su uso en la presente invención pueden cultivarse usando técnicas de microbiología estándar como se detalla, por ejemplo, en las referencias [47], [] y [49].
El medio sólido o líquido usado para el cultivo puede ser agar YCFA o medio YCFA. El medio YCFA puede incluir (por 100 ml, valores aproximados): casitona (1,0 g), extracto de levadura (0,25 g), NaHCO3 (0,4 g), cisteína (0,1 g), K2HPO4 (0,045 g), KH2PO4 (0,045 g), NaCl (0,09 g), (NH4)2SO4 (0,09 g), MgSO4'7H2O (0,009 g), CaCh (0,009 g), resazurina (0,1 mg), hemina (1 mg), biotina (1 |jg), cobalamina (1 |jg), ácido p-aminobenzoico (3 jg), ácido fólico (5 jg ) y piridoxamina (15 jg).
Cepas bacterianas para su uso en composiciones de vacunas.
Los inventores han identificado que las cepas bacterianas de la invención son útiles para tratar o prevenir trastornos neurodegenerativos. Es probable que esto sea el resultado del efecto que las cepas bacterianas de la invención tienen sobre el sistema inmunitario del huésped. Por lo tanto, las composiciones de la invención también pueden ser útiles para prevenir trastornos neurodegenerativos, cuando se administran como composiciones de vacuna. En ciertas realizaciones de este tipo, las cepas bacterianas de la invención pueden matarse, inactivarse o atenuarse. En ciertas de tales realizaciones, las composiciones pueden comprender un adyuvante de vacuna. En ciertas realizaciones, las composiciones son para administración por inyección, como por inyección subcutánea. General
La puesta en práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Ver, por ejemplo, las referencias [50] y [51,57], etc.
El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.
El término "aproximadamente" en relación a un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x ± 10%.
La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.
Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos significa que, cuando están alineadas, ese porcentaje de nucleótidos es el mismo al comparar las dos secuencias. Esta alineación y el porcentaje de homología o identidad de secuencia pueden determinarse usando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la sección 7.7.18 de la ref. [58] El algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman determina una alineación preferida usando una búsqueda de espacio afín con una penalización de espacio abierto de 12 y una penalización de extensión de espacio de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman se describe en la ref. [59]
A menos que se indique específicamente, un proceso o método que comprende numerosos pasos puede comprender pasos adicionales al principio o al final del método, o puede comprender pasos intermedios adicionales. Además, los pasos pueden combinarse, omitirse o realizarse en un orden alternativo, si es apropiado.
En la presente se describen varias realizaciones de la invención. Se apreciará que las características especificadas en cada realización pueden combinarse con otras características especificadas, para proporcionar realizaciones adicionales. En particular, las realizaciones resaltadas en la presente como adecuadas, típicas o preferidas pueden combinarse entre sí (excepto cuando son mutuamente excluyentes).
MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN
Ejemplo 1 - Eficacia de los inóculos bacterianos para actuar como neuroprotectores
Resumen
Las células de neuroblastoma se trataron con composiciones que comprenden cepas bacterianas de acuerdo con la invención. Las células de neuroblastoma SH-SY5Y usadas son productoras de dopamina y están bien establecidas como modelo in vitro para estudiar enfermedades neurodegenerativas. Se observó la capacidad de las cepas bacterianas para aumentar la neuroproliferación. Las células de neuroblastoma también se trataron con neurotoxina dopaminérgica 1 -metil-4-fenilpiridinio (MPP), que induce síntomas permanentes de la enfermedad de Parkinson en las células de neuroblastoma. Se investigó la capacidad de las cepas bacterianas para actuar como neuroprotector contra MPP.
Material y métodos
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRx0029; Parabacteroides distasonis MRX0005
Línea celular
Las células de neuroblastoma SH-SY5Y se adquirieron de ECCACC (N° de Cat.: 94030304) y se cultivaron en MEM (Sigma Aldrich, N° de cat. M2279) suplementado con Nutrient Mixture F-12 Ham (Sigma Aldrich, N° de cat. N4888).
Método
Una vez cultivadas, las células de neuroblastoma SH-SY5Y se colocaron en placas en una placa de 96 pocillos a 11.000 células/pocillo y se incubaron durante 2 días. Las células se transfirieron luego al medio de diferenciación (que contenía FBS al 1%) y ácido retinoico 10 pM (Sigma Aldrich, N° de cat. R2625-100MG). El medio de diferenciación se reemplazó cada dos días y las células se recogieron a los 7 días de diferenciación. Las células se pretrataron con o sin MPP (Sigma Aldrich, N° de cat. D048-1G) durante 8 horas. Posteriormente, las células se trataron con sobrenadante bacteriano al 10% y se incubaron durante la noche. La viabilidad celular se midió usando el reactivo CCK-8 (Sigma Aldrich, Cell Counting Kit-8, N° de cat. 96992-3000TESTS-F) y se leyó a una longitud de onda de 450 nm.
Resultados
Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 1. El tratamiento de las células de neuroblastoma con MRx0029 o MRX0005 condujo a un aumento en la proliferación de neuronas. Las células de neuroblastoma que fueron tratadas con MPP junto con la cepa bacteriana habían aumentado la viabilidad celular en comparación con las células tratadas con MPP solamente (que tenían viabilidad disminuida). Estos datos muestran que la cepa bacteriana puede actuar como neuroprotector. El efecto protector fue mayor para las células tratadas con MRX0029, que rescataron la viabilidad más que las células de control positivo tratadas con quercetina. Estos datos muestran que las cepas bacterianas pueden actuar como un neuroprotector.
Ejemplo 2 - Eficacia de los inóculos bacterianos para reducir la secreción de IL-6.
Resumen
La activación de citoquinas proinflamatorias se ha asociado con daño neuronal en la enfermedad neurodegenerativa. El lipopolisacárido (LPS) es un estimulador conocido de la citoquina proinflamatoria IL-6. Las células de astrocitoma de glioblastoma humano se trataron con composiciones que comprenden cepas bacterianas de acuerdo con la invención en combinación con LPS para observar su capacidad de modular los niveles de IL-6. Material y métodos
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRx0029
Línea celular
MG U373 es un astrocitoma de glioblastoma humano derivado de un tumor maligno y se adquirieron de Sigma-Aldrich (N° de cat. 08061901-1 VL). Se cultivaron células de astrocitoma de glioblastoma humano MG U373 en MEM (Sigma Aldrich, N° de cat. M-2279) suplementado con 10% de FBS, 1% de Pen Strep, L-Glut 4 mM, solución de aminoácidos no esenciales IX MEM y piruvato de sodio IX.
Método
Una vez cultivadas, las células MG U373 se colocaron en placas en una placa de 24 pocillos a 100.000 células/pocillo. Las células fueron tratadas con LPS (lug/ml) solo o con un 10% de sobrenadante de bacterias de MRx0029 durante 24 h. También se realizó un control donde las células se incubaron en medios no tratados. Posteriormente, se recogieron los sobrenadantes libres de células, se centrifugaron a 10.000 g durante 3 minutos a 4° C. La IL-6 se midió usando el kit ELISA de IL-6 humana de Peprotech (N° de cat. 900-K16) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Resultados
Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 2. El tratamiento de las células de neuroblastoma con LPS y la cepa de bacterias condujo a una disminución en el nivel de IL-6 secretada.
Ejemplo 2b - Eficacia de los inóculos bacterianos para modularla secreción de IL-8.
Resumen
Como la neuroinflamación desempeña un papel fundamental en las enfermedades neurodegenerativas y se ha demostrado que IL-8 tiene efectos neuro-positivos, se evaluó el efecto de las composiciones que comprenden cepas bacterianas de la invención y LPS sobre la activación de IL-8. Las células de astrocitoma de glioblastoma humano se trataron con composiciones que comprenden cepas bacterianas de acuerdo con la invención en combinación con LPS para observar su capacidad de modular los niveles de IL-8.
Material y métodos
Cepas bacterianas
Megasphaera massiliensis MRX0029; Parabacteroides distasonis MRX0005
Línea celular
MG U373 es un astrocitoma de glioblastoma humano derivado de un tumor maligno y se adquirieron de Sigma-Aldrich (N° de cat. 08061901-1VL). Se cultivaron células de astrocitoma de glioblastoma humano MG U373 en MEM (Sigma Aldrich, N° de cat. M-2279) suplementado con 10% de FBS, 1% de Pen Strep, L-Glut 4 mM, solución de aminoácidos no esenciales IX MEM y piruvato de sodio IX.
Método
Una vez cultivadas, las células MG U373 se sembraron en placas en una placa de 24 pocillos a 100.000 células/pocillo. Las células fueron tratadas con LPS (lug/ml) solo o con un 10% de sobrenadante de bacterias de MRX0029 durante 24 h. Posteriormente, se recogieron los sobrenadantes libres de células, se centrifugaron a 10.000 g durante 3 minutos a 4° C. La IL-8 se midió usando el kit ELISA de IL-8 humana de Peprotech (N° de cat.
900-K18) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Resultados
Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 3. El tratamiento de las células de neuroblastoma con las cepas de bacterias lleva a un aumento en la secreción de IL-8 independientemente de la presencia de LPS.
Ejemplo 2C - Eficacia de los inóculos bacterianos para reducir la inflamación inducida por a-sinucleína. Resumen
La neuroinflamación desempeña un papel fundamental en la enfermedad de Parkinson y se ha demostrado que la a-sinucleína induce la neuroinflamación in vivo. Por lo tanto, se evaluó la capacidad de las cepas de bacterias de la invención para inhibir la neuroinflamación inducida por a-sinucleína. Se expuso un cocultivo de células de astrocitoma de glioblastoma humano y células de neuroblastoma a a-sinucleína de tipo salvaje y las isoformas mutantes E46K y A53T y se trataron con composiciones que comprenden cepas bacterianas de acuerdo con la invención. Luego se probó la capacidad de las cepas de bacterias para inhibir la secreción de IL-6 inducida por asinucleína.
Material y métodos
Cepas bacterianas
Megasphaera massiliensis MRX0029; Parabacteroides distasonis MRX0005
Línea celular
MG U373 es un astrocitoma de glioblastoma humano derivado de un tumor maligno y se adquirieron de Sigma-Aldrich (N° de cat. 08061901-1 VL). Se cultivaron células de astrocitoma de glioblastoma humano MG U373 en MEM (Sigma Aldrich, N° de cat. M-2279) suplementado con 10% de FBS, 1% de Pen Strep, L-Glut 4 mM, solución de aminoácidos no esenciales IX MEM y piruvato de sodio IX.
SH-SY5Y es una línea celular de neurobastoma humano derivada de un neuroblastoma maligno y puede adquirirse de Sigma-Aldrich (N° de cat. 94030304-1VL). Las células se cultivaron en 50% de MEM y 50% de medio F-12 Ham de mezcla nutritiva suplementado con L-Glutamina 2 mM, 10% de FBS inactivado por calor, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina. Las células en el medio de crecimiento se colocaron en placas en una placa de 96 pocillos a 11.000 células/pocillo y se colocaron en la incubadora. Después de 2 días, los medios fueron reemplazados por medio de diferenciación (medio de crecimiento que contenía 1% de FBS) y 10 pM de ácido retinoico. El medio de diferenciación se reemplazó cada dos días y las células se usaron después de 7 días de diferenciación.
Método
Se colocaron en placas células SHSY5Y en placas de 12 pocillos a una densidad de 50.000 células/pocillo. Las células se cultivaron en 50% de MEM y 50% de medio F-12 Ham de mezcla nutritiva suplementado con L-Glutamina 2 mM, 10% de FBS inactivado por calor, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina. Las células en el medio de crecimiento se colocaron en placas en una placa de 96 pocillos a 11.000 células/pocillo y se colocaron en la incubadora. Después de 2 días, los medios fueron reemplazados por medio de diferenciación (medio de crecimiento que contenía 1% de FBS) y 10 pM de ácido retinoico. El medio de diferenciación se reemplazó cada dos días y las células se usaron después de 7 días de diferenciación. U373 se colocaron en placas en 12 placas transwell (membrana de poliéster de 0,4pm, Costar) a una densidad de 50.000 células/pozo durante 72 horas. Las células se cocultivaron durante 24 horas antes del tratamiento en medio de diferenciación (medio de crecimiento que contenía 1% de FBS sin ácido retinoico).
Posteriormente, las células se trataron con 25 |jg/ml de a-sinucleína (Wt, A53T, E46K) en presencia o ausencia de un 10% de sobrenadante de bacterias durante 48 horas. Se recogieron los sobrenadantes libres de células, se centrifugaron a 10000 g durante 3 minutos a 4° C, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80° C. Las IL-6 e IL-8 humanas se midieron como se ha descrito anteriormente.
Resultados
Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 4. El tratamiento de las células con asinucleína de tipo salvaje y las isoformas mutantes E46K y A53T indujeron una secreción moderada de IL-6 (Figura 4A). La secreción inducida por a-sin de IL-6 se inhibió en células tratadas con las cepas de bacterias (Figura 4A). La reducción en la secreción de IL-6 fue mayor en la administración de MRX0029.
Ejemplo 3 - Eficacia de los inóculos bacterianos para reducir la activación de NFkB
Resumen
La activación del promotor de NFkB lleva a la producción de citoquinas proinflamatorias incluyendo IL-1p, IL-1a, IL-18, TNFa e IL-6. El promotor de NFkB puede activarse mediante a-sinucleína y LPS estimulando el ligando TLR4. Las mutaciones en la a-sinucleína, como la a-sinucleína A53T, están implicadas en el Parkinson familiar. El tratamiento de las células neuronales con LPS simula el Parkinson provocado por factores ambientales. Se investigó la capacidad de las composiciones que comprenden cepas bacterianas de acuerdo con la invención para inhibir la activación del promotor de NFkB.
Material y métodos
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRx0029
Línea celular
Se adquirieron TLR4 azules Hek humanas de InvivoGen (N° de cat. Hkb-htlr4). Se cultivaron TLR4 azules Hek humanas en DMEM con alto contenido de glucosa (Sigma Aldrich, N° de cat. D-6171) suplementado con 10% de FBS, 1% de Pen Strep, L-Glut 4 mM, Normocina y solución de selección azul IX HEK.
Método
Una vez cultivadas, las células azules Hek humanas se colocaron en placas en placas de 96 pocillos a 25.000 células/pocillo en 4 réplicas. Un conjunto de células se trató con a-sinucleína A53T (lug/ml) solo o con 10% de sobrenadante de bacterias de MRx0029 durante 22 h. El segundo conjunto de células se trató con LPS (10 ng/ml, de Salmonella entérica serotipo Typhimurium, Sigma Aldrich, N° de cat. L6143) solo o con 10% de sobrenadante de bacterias de MR029 durante 22 h. Posteriormente, las células se centrifugaron y se mezclaron 20 ul del sobrenadante con 200 ul de reactivo Quanti azul (InvivoGen, N° de cat. Rep-qb2), se incubaron durante 2 h y se leyó la absorbancia a 655 nm.
Resultados
Los resultados de estos experimentos se muestran en las Figuras 5 y 6. La Figura 5 muestra que la activación del promotor de NFkB por la a-sinucleína es inhibida por MRx0029. La Figura 6 muestra que MRx0029 inhibe la activación del promotor de NFkB por LPS.
Ejemplo 4 - Eficacia de los inóculos bacterianos para alterarla capacidad antioxidante
Resumen
La capacidad de las composiciones que comprenden cepas bacterianas de acuerdo con la invención para alterar la capacidad antioxidante. La capacidad antioxidante de la cepa bacteriana se estableció usando el ensayo ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)) bien conocido.
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRx0029
Método
Se recogieron y centrifugaron células bacterianas (106 o más). Se resuspendieron en tampón de ensayo (usando tres veces el volumen del sedimento). La suspensión se sonicó en hielo durante 5 minutos y luego se centrifugó a 12.000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se eliminó y se midió usando el kit de ensayo ABTS producido por Sigma Aldrich (código CS0790), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Resultados
Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 7. La Figura 7 muestra que MRx0029 tiene una capacidad antioxidante de aproximadamente 2 mM en comparación con Trolox.
Ejemplo 5 - Eficacia de los inóculos bacterianos para alterar los niveles de peroxidación lipídica Resumen
Se investigó la capacidad de las composiciones que comprenden cepas bacterianas de acuerdo con la invención para alterar los niveles de peroxidación lipídica. Se usó el ensayo de sustancias reactivas tiobarbitúricas (TBAR) para medir los subproductos de la peroxidación lipídica.
Material y métodos
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRx0029
Método
Se recogieron y centrifugaron células bacterianas (106 o más), se realizó un paso de lavado con solución salina isotónica antes de volver a suspender el sedimento en tampón de ensayo de cloruro de potasio. La suspensión se sonicó en hielo durante 10 minutos y luego se centrifugó a 10.000 x g durante 10 minutos. Se retiró el sobrenadante y se evaluó el nivel de peroxidación lipídica usando el ensayo de sustancias reactivas tiobarbitúricas. Resultados
Los resultados de los experimentos se muestran en la Figura 8. La Figura 8 muestra que MRx029 es capaz de inhibir la peroxidación lipídica en aproximadamente un 20%, que es una capacidad antioxidante más lata que el control positivo, hidroxitolueno butilado (1% p/v).
Ejemplo 6 - Eficacia de los inóculos bacterianos sobre la actividad de histona desacetilasa
Resumen
Se investigó la capacidad de las composiciones que comprenden cepas bacterianas de acuerdo con la invención para alterar la actividad de la histona desacetilasa. La desregulación de la histona desacetilasa se ha implicado en la patogénesis asociada con enfermedades neurodegenerativas asociadas con la edad.
Material y métodos
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRx0029
Línea celular
Se usó la línea celular HT-29 porque la histona desacetilasa está presente.
Método
Se aislaron sobrenadantes libres de células de cultivos bacterianos en fase estacionaria por centrifugación y filtración en un filtro de 0,22 pM. Se usaron células HT-29 3 días después de la confluencia y se redujeron escalonadamente en 1 ml de DTS 24 horas antes del comienzo del experimento. Las células HT-29 se desafiaron con un sobrenadante libre de células al 10% diluido en DTS y se dejó incubar durante 48 horas. Luego se extrajeron las proteínas de nucleasas usando el kit de extracción de nucleasas de Sigma Aldrich y las muestras se congelaron al instante antes de la medición de la actividad de HDAC. La actividad de HDAC se evaluó fluorométricamente usando el kit Sigma Aldrich (Reino Unido).
Resultados
Los resultados de los experimentos se muestran en la Figura 9. La Figura 9 muestra que MRx0029 puede reducir los niveles de la actividad de histona desacetilasa.
Ejemplo 7 - Nivel de producción de indol en bacterias
Resumen
Se investigó la capacidad de las bacterias de la invención para producir indol. El indol se ha implicado en la atenuación de la inflamación y el estrés oxidativo.
Material y métodos
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRx0029
ATCC 11775 es una cepa de referencia bacteriana que se sabe que produce indol.
Método
Se incubaron células bacterianas intactas en fase estacionaria con triptófano 6 mM durante 48 horas. Las especies bacterianas que poseen la enzima triptofanasa utilizarán el triptófano como sustrato para producir indol. Después del período de incubación de 48 horas, se retiró el sobrenadante y se añadió al reactivo de Kovac para cuantificar el indol. Se prepararon estándares, soluciones madre y reactivos usando métodos estandarizados validados internamente.
Resultados
Los resultados de los experimentos se muestran en la Figura 10. La Figura 10 muestra que MRx0029 tiene la capacidad de producir indol a partir de triptófano, a concentraciones de aproximadamente 0,2 mM.
Ejemplo 8 - Nivel de producción de quinurenina en bacterias
Resumen
Se investigó la capacidad de las bacterias de la invención para producir quinurenina. La desregulación de la ruta de la quinurenina puede llevar a la activación del sistema inmune y la acumulación de compuestos potencialmente neurotóxicos. Las alteraciones en el metabolismo de la quinurenina pueden estar involucradas en el desarrollo de las enfermedades de Parkinson.
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRx0029
DSM 17136 es una cepa de Bacteroides copricola que se sabe que produce quinurenina.
Método
Los sobrenadantes libres de células de cultivos bacterianos de fase estacionaria se aislaron por centrifugación y filtración en un filtro de 0,22 pM y se congelaron hasta su uso. Los estándares de quinurenina, soluciones madre y reactivos se prepararon usando métodos estandarizados validados internamente. Las muestras se trataron con ácido tricloroacético y se centrifugaron a 10.000xg durante 10 minutos a 4° C. El sobrenadante se recogió y se dispensó en una placa de 96 pocillos. El reactivo de Ehrlich se usó para la detección de quinurenina y se añadió en una proporción de 1:1.
Resultados
Los resultados de los experimentos se muestran en la Figura 11. La Figura 11 muestra que MRx0029 tiene la capacidad de producir quinurenina a una concentración de aproximadamente 40 pM.
Ejemplo 9 - Niveles de dopamina, DOPAC y HVA en el cuerpo estriado en ratones MPTP tratados con bacterias
La enfermedad de Parkinson es un trastorno neurodegenerativo común cuyas características clínicas cardinales incluyen temblor, lentitud de movimiento, rigidez e inestabilidad postural. Estos síntomas son principalmente atribuibles a la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra pars compacta y la consiguiente pérdida de sus fibras nerviosas proyectadas en el cuerpo estriado [60]. Los ratones tratados con MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina) pierden selectivamente un número significativo de neuronas dopaminérgicas nigrostriatales [61]. La pérdida inducida por MPTP de células dopaminérgicas en sustancia negra imita la condición clínica de la enfermedad de Parkinson y es, por lo tanto, un modelo útil para probar fármacos contra el Parkinson.
El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos de la bacteria anaeróbica MRX0029 usando ratones lesionados con MPTP.
Se asignaron 48 ratones macho a 4 grupos de tratamiento diferentes (grupos A, B, E e I, con n=12 animales en cada grupo). Los grupos de tratamiento se muestran en la Tabla 1 a continuación y el curso del tiempo del proyecto se describe a continuación.
Figure imgf000033_0001
Los grupos A, B, E e I fueron tratados diariamente durante 18 días mediante sonda oral con bacterias (MRx0029-grupo E) o vehículo (PBS). El tratamiento oral comenzó 14 días antes de la lesión MPTP. Los animales del grupo I recibieron un tratamiento diario con vehículo (PBS) p.o. (por vía oral) y se les inyectó i.p. (intraperitoneal) con el fármaco de referencia 30 minutos antes y 90 minutos después del primer MPTP en el día 0. El volumen de aplicación para el tratamiento con vehículo y p.o. fue de 200 pl por ratón. La cepa de bacterias del grupo E era de reservas de glicerol (gly). Para el tratamiento oral, se almacenaron sondas de alimentación para aplicaciones en un vial que contenía etanol al 70% y se enjuagaron antes y después de cada uso con agua destilada. Cada grupo de tratamiento tenía su propio vial de sonda de alimentación y etanol y vial de agua destilada. Los tubos y las sondas de alimentación no se cambiaron entre los grupos. Directamente antes del tratamiento cada jeringuilla se enjuago con N2.
En el día 0 de MPTP (20 mg/kg de peso corporal (p.c.) se inyectó i.p. 4 veces, intervalo de 2 h entre tratamientos) en animales de los grupos B, E e I. Un grupo de animales (A) se lesionó simulando por administración i.p. de vehículo MPTP (solución salina al 0,9%). El volumen de aplicación fue de 10 pl por g de peso corporal. El pesaje de los animales se realizó antes del tratamiento con MPTP para dosificar a los animales de acuerdo con su peso corporal real. Posteriormente los animales recibieron el tratamiento de p.o. diario.
Formulación de preparaciones para dosificación y preparación de reservas de glicerol para
dosificación
Figure imgf000034_0002
Para el grupo de tratamiento E (MRx0029)
1. ) Se tomó 1 reserva de glicerol del congelador a -80° C y se colocó en condiciones anaeróbicas (frasco anaeróbico con bolsita) a 37° C para descongelar (esto llevó 30-40 minutos).
2. ) El stock de glicerol completamente descongelado se centrifugó a 6000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
3. ) El sobrenadante se desechó sin alterar el sedimento (por ejemplo, usando una pipeta).
4. ) Se añadieron 4,22 ml de 1 x PBS estéril precalentada (37° C) y se mezcló suavemente usando una pipeta.
5. ) A los ratones se les dosificó con 200 l de la solución bacteriana. A los animales se les dosificó en el plazo de 15 minutos después de la resuspensión del sedimento con PBS.
Formulación del grupo de fármacos de referencia
Figure imgf000034_0001
La cantidad apropiada de 7-nitroindazol se disolvió en aceite de cacahuete para alcanzar la concentración final de 50 mg/kg.
Materiales y métodos
Animales
Figure imgf000035_0001
Manejo específico de animales y aleatorización
Los guantes se cambiaron entre cada grupo de tratamiento y se rociaron con una solución de etanol al 70% entre cada jaula del mismo grupo para minimizar el riesgo de contaminación cada vez que se manipulaban animales (por ejemplo: tratamiento, pruebas de comportamiento, limpieza y muestreo de tejidos).
El tratamiento fue aleatorio y alternado diariamente para evitar que los mismos grupos se tratasen a la misma hora todos los días. Los animales fueron aleatorizados por jaula en el muestreo de tejido.
Muestreo y procesamiento de tejidos.
El día 4 se sacrificaron animales de todos los grupos y se recogieron los cerebros. Por lo tanto, los ratones se anestesiaron profundamente mediante inyección de pentobarbital (600 mg/kg).
Se recogió sangre (aproximadamente 500 jl) mediante punción cardíaca. Los ratones fueron luego perfundidos transcardiacamente con solución salina al 0,9% y se retiraron los cerebros y se hemiseccionaron. El hemisferio izquierdo se subdividió en tejido estriatal (para HPLC), el tejido de sustancia negra y el cerebro residual, se pesaron e inmediatamente se congelaron y almacenaron a -80° C. Los instrumentos y las superficies que estaban en contacto con los animales tuvieron que limpiarse con etanol al 70% antes de diseccionar el siguiente animal. Análisis bioquímico de los niveles de dopamina, DOPAC y HVA con HPLC en el cuerpo estriado
Las muestras estriatales (n=6 de cada grupo de tratamiento; un total de 24 muestras) se mezclaron a una proporción de 1:10 (p/v) con ácido perclórico 0,2M incluyendo 100 jM de EDTA-2Na y se homogeneizaron a 0° C en un homogeneizador Pestlemicro de vidrio. Después de reposar durante 30 minutos en hielo, los homogeneizados se centrifugaron a 10.000 RPM durante 10 minutos en una centrífuga refrigerada Biofuge Fresco (Heraeus Instruments, Alemania). Los sobrenadantes se aspiraron cuidadosamente y se mezclaron con tampón de acetato de sodio 0,4 M, pH 3 a una proporción 1:2 (v/v) y se filtraron a través de un filtro centrífugo de 0,22 jm (Merck Millipore, Alemania) durante 4 minutos a 14000 g a 4° C. Los filtrados se almacenaron a -80° C antes del análisis por HPLc .
Análisis por HPLC
Las concentraciones de DA, DOPAC y HVA en las muestras estriatales se determinaron por cromatografía líquida en columna con detección electroquímica [62; 63]. Se usó el sistema HPLC (HTEC-500, Eicom Corp., Kyoto, Japón) que incluye una bomba de microflujo de pulso libre, un desgasificador y un detector amperométrico equipado con un electrodo de carbono vidrioso que funciona a 0,45 V frente a un electrodo de referencia de Ag/AgCl. Las muestras se inyectaron mediante el uso de un micromuestreador refrigerado CMA/200 (CMA/Microdialisys, Estocolmo, Suecia). Los cromatogramas se registraron e integraron mediante el uso de un sistema de adquisición de datos computarizado (DataApex, Praga, República Checa). DA, DOPAC y HVA se separaron en una columna de 150 x 2,1 mm de diámetro (CA5-ODS, Eicom Corp., Kyoto, Japón). La fase móvil consistió en tampón fosfato 0,1 M a pH 6,0, EDTA 0,13 mM, 1-octanosulfonato de sodio 2,3 mM y metanol al 20% (v/v). El límite de detección (proporción de señal a ruido = 3) para DA se estimó en 0,5 fmol en 15 j l (0,03 nM) inyectado en la columna.
Resultados
La administración de cepas de bacterias fue bien tolerada por los animales. El día de la lesión MPTP y, si es necesario, el día posterior, se usó una luz roja para calentar a los animales. Si los animales estaban en malas condiciones (se sentían fríos, deshidratados, comportamiento anormal), se les suministró comida húmeda y tratamiento salino subcutáneo si fue necesario.
Para el análisis de los niveles de dopamina, DOPAC y HVA, se usó tejido estriado de 6 animales por grupo de tratamiento. Los datos se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba post hoc de comparación múltiple de Dunn o el análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba post hoc de Bonferroni (A frente a todos (*), B frente a todos, I frente a todos (#)). */# = p <0,05; ** = p <0,01; *** = p0,001.
Los animales sanos en el grupo A tenían altos niveles de dopamina, DOPAC y HVA, mientras que el tratamiento con MPTP en el grupo B redujo esto y el control positivo (grupo I) recuperó la producción en algún grado (Figura 12). Los animales del grupo I tendieron a tener niveles de dopamina más altos que el grupo tratado con bacterias y el grupo B. Los niveles de DOPAC (un metabolito de dopamina) en general fueron significativamente más bajos en animales del grupo B en comparación con los niveles de DOPAC de animales no lesionados del grupo A (Figura 12B).
Significativamente, se descubrió que el tratamiento con MRx0029 (grupo E) recuperaba la producción de dopamina y DOPAC (Figuras 12A y 12B, respectivamente). Por lo tanto, el tratamiento con MRx0029 puede ser útil para tratar o prevenir trastornos neurodegenerativos.
Ejemplo 10 - Eficacia de las bacterias para alterar el crecimiento de neuritas
Resumen
El crecimiento de neuritas es un proceso importante para el desarrollo de conexiones entre neuronas. Por lo tanto, la capacidad de las cepas bacterianas y los ácidos orgánicos para inducir el crecimiento de neuritas se probó midiendo los niveles transcripcionales de la proteína asociada a microtúbulos MAP2, un marcador de diferenciación neuronal específico.
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRX0029.
Método
SHSY5Y se sembraron en placas de Petri de 10 cm a una densidad de 2 x 106 células. Después de 24 h, las células se trataron en medio de diferenciación (medio de crecimiento que contenía FBS al 1% sin RA) con sobrenadantes de bacterias al 10% o YCFA+, RA 10uM, ácido hexanoico 200 uM o ácido valproico 200 uM, durante 17 h. Posteriormente se tomaron imágenes representativas usando un microscopio de núcleo EVOS XL de contraste de fase con un aumento de 40X/0,65. Se recogieron las células y se aisló el a Rn total de acuerdo con el protocolo del RNeasy mini kit (Qiagen). Los ADNc se elaboraron usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). La expresión génica se midió usando qPCR. Se usó GAPDH como control interno. Las veces cambio se calcularon de acuerdo con el método 2(-ññct).
Inmunofluorescencia y microscopía confocal
Las células se sembraron en portaobjetos de cámara de 8 pocillos (Marienfeld Laboratory Glassware) a 5x104 células/pocillo durante la noche y se trataron con sobrenadante bacteriano al 10% durante 24 h. Para la diferenciación, las células se trataron con ácido retinoico 10nM durante 5 días antes de tratarlas con sobrenadante bacteriano. Luego se fijaron las células con paraformaldehído al 4% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT). Las células fijadas se lavaron con PBS y se permeabilizaron con Triton X-100 al 1% en PBS durante 10 minutos. Después de lavar con PBS, los portaobjetos se incubaron con tampón de bloqueo (BSA/PBS al 4%) durante 1 hora a temperatura ambiente antes de añadir el anticuerpo anti-MAP2 (sc-74421, Santa Cruz Biotechnology Inc) diluido en BSA/PBS al 1% durante 12 horas a 4° C. Luego se lavaron dos veces con PBS, seguido de incubación con el anti-ratón conjugado Alexa Flour 488 (Molecular Probes Inc) y faloidina conjugada con Alexa Flour 594 (ab176757, Abeam) durante 1 hora a RT. Después de lavar 3 veces con PBS, los portaobjetos se montaron con VectorshieldD que contiene DAPI (Sigma, Aldrich). Los portaobjetos se vieron usando un microscopio Zeiss Axioscope equipado con un objetivo Korr de 63x/1.2 W y conjuntos de filtros adecuados para la detección de los fluorocromos usados. Los tiempos de exposición manual para la adquisición digital de imágenes inmunomarcadas con MAP-2 se mantuvieron constantes permitiendo la comparación entre diferentes pocillos y tratamientos. Los tiempos de exposición a faloidina (F-actina) y DAPI variaron para adaptarse al campo de visión. Los campos de visión aleatorizados se adquirieron usando una cámara Qlmaging controlada por el software Image Pro Plus. Las imágenes se guardaron como TIF y se abrieron en Adobe Photoshop CC 2015.1.2 y las superposiciones de las imágenes MAP-2, DAPI y Phalloidion se superpusieron y fusionaron. Se seleccionaron imágenes representativas para ilustrar las diferencias en abundancia y localización de las proteínas examinadas. Resultados
Los resultados se muestran en la Figura 13. La Figura 13A muestra imágenes de microscopía representativas de células SHSY-5Y no diferenciadas incubadas con cada uno de los sobrenadantes de ácidos y bacterias. El tratamiento de las células con MRX0029 indujo un fenotipo similar a una neurona, mostrando características similares a las células tratadas con ácido retinoico (que se usa para la diferenciación terminal de las células de neuroblastoma), donde los cuerpos celulares son más grandes y de forma piramidal, con neuritas y ramificaciones procesadas fuera de la red con celdas colindantes. La Figura 13B muestra que MRx0029 regula por incremento significativamente MAP2 en células de neuroblastoma no diferenciadas. La tinción con faloidina (un agente de unión al citoesqueleto de actina) demostró además una disposición diferente de la estructura citoesquelética en las células tratadas con MRx0029, lo que respalda aún más la hipótesis de diferenciación neuronal para MRx0029 (Fig. 13B).
Ejemplo 11 - Eficacia de los inóculos bacterianos para reducirlos niveles oxidativos en las células.
Antecedentes
La generación de especies reactivas de oxígeno contribuye a la patología de las enfermedades neurodegenerativas. Se investigó la capacidad de las cepas bacterianas para proteger las células SHSY-5Y y U373 diferenciadas de las especies reactivas de oxígeno (ROS) generadas por el tratamiento con peróxido de hidrógeno de terc-butilo (TBHP).
Material y métodos
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRX0029
Método
Se colocaron en placas células SHSY-5Y en placas de 96 pocillos de fondo plano negro a una densidad de 5000 células/pocillo y se colocaron en la incubadora de CO2. Después de 24 h, los medios se reemplazaron por medio de diferenciación (medio de crecimiento que contenía FBS al 1%) y 10 pM de ácido retinoico. El medio de diferenciación se reemplazó cada dos días. El día 10 se retiró el medio de diferenciación y las células se lavaron con PBS precalentado y se tiñeron con sonda molecular DCFDA 10 mM durante 20 minutos en medio de crecimiento que contenía FBS al 1%. Luego, las células se lavaron con PBS precalentado de nuevo y se trataron con TBHP 100uM en presencia o ausencia de sobrenadante de bacterias al 10% durante 2 h. La intensidad de fluorescencia se midió usando el lector de placas TECAN a Ex/Em 485/530 nm.
Resultados
Los resultados de los experimentos se muestran en la Figura 14. La Figura 14b muestra que MRX0029 puede inhibir la producción de rOs en células de neuroblastoma SHSY-5Y diferenciadas. MRX0029 no tuvo un efecto sobre la generación de ROS en células de astroglioblastoma U373 (Figura 14a). Esto muestra que este aspecto del efecto antioxidante es específico de neuronas.
Ejemplo 12 - neuroprotección
Las células SHSY-5Y diferenciadas con RA se trataron con MPP+, el metabolito activo de MPTP, un producto químico ampliamente usado para imitar in vitro e in vivo algunas de las características de la patología de la EP. La viabilidad celular se midió como la tasa de respiración de las mitocondrias (Figura 15). Tanto MRx0005 como MRx0029 mostraron efectos significativos y promueven per se un aumento de la actividad metabólica de las mitocondrias en las células SHSY-5Y. MRX0029 mostró una protección completa contra MPP+, restaurando la viabilidad celular casi al mismo nivel de células no tratadas y más alto que el control positivo de quercetina. La protección de MRx0005 fue de aproximadamente el 20% en comparación con la muestra tratada con YCFA-MPP+, aproximadamente la misma observada para el control positivo de quercetina (Fig. 15).
Ejemplo 13 - Análisis adicional del mecanismo de inhibición de la desacetilación de histonas Introducción
La microbiota intestinal, con su inmensa diversidad y capacidad metabólica, representa un enorme depósito metabólico para la producción de una amplia variedad de moléculas con potencial para influir en la actividad de HDAC. Pocos estudios han evaluado la actividad inhibidora de HDAC de metabolitos derivados de microbios distintos del butirato, que se ha demostrado que inhibe HDAC y se asocia con una mejora de la función motora en la enfermedad de Huntington [64]. Por lo tanto, los inventores buscaron determinar qué metabolitos son responsables de la inhibición de HDAC y dilucidar aún más los mecanismos por los cuales se logra la inhibición.
Material y métodos
Cultivo bacteriano y recogida de sobrenadante libre de células
Se cultivaron anaeróbicamente cultivos puros de bacterias en caldo YCFA hasta que alcanzaron su fase de crecimiento estacionaria. Los cultivos se centrifugaron a 5.000 x g durante 5 minutos y el sobrenadante libre de células (CFS) se filtró usando un filtro de 0,2 pM (Millipore, Reino Unido). Se almacenaron alícuotas de 1 ml de CFS a -80° C hasta su uso. Se obtuvieron butirato de sodio, ácido hexanoico y valérico de Sigma Aldrich (Reino Unido) y se prepararon suspensiones en caldo YCFA.
Cuantificación de SCFA y MCFA de sobrenadantes bacterianos
Se analizaron y cuantificaron los ácidos grasos de cadena corta (SCFA) y los ácidos grasos de cadena media (MCFA) de los sobrenadantes bacterianos por MS Omics APS de la siguiente manera. Las muestras se acidificaron usando ácido clorhídrico y se añadieron patrones internos marcados con deuterio. Todas las muestras fueron analizadas en un orden aleatorio. El análisis se realizó utilizando una columna de alta polaridad (Columna Zebron™ ZB-FFAP, GC Cap. 30 m x 0,25 mm x 0,25 pm) instalada en un GC (7890B, Agilent) acoplada con un detector de cuadropolos (59977B, Agilent). El sistema fue controlado por ChemStation (Agilent). Los datos brutos se convirtieron al formato netCDF usando Chemstation (Agilent), antes de que los datos se importaran y procesaran en Matlab R2014b (Mathworks, Inc.) usando el software PARADISe descrito en [65].
Análisis de actividad de HDAC específico
La actividad de inhibición específica de HDAC se analizó para HDAC1, 2, 3, 4, 5, 6, 9 usando kits de ensayo fluorogénico para cada tipo de HDAC (BPS Bioscience, CA). Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cada muestra se realizó en réplicas. Los sobrenadantes libres de células se diluyeron 1 en 10 y se expusieron a proteínas HDAC específicas proporcionadas en el kit para mantener la consistencia entre los métodos.
Resultados
Los metabolitos microbianos comensales del intestino inhibidores de la histona desacetilasa son butirato y ácido valérico
MRx0029, cuyo sobrenadante mostró una fuerte inhibición de HDAC tanto en células completas HT29 como en lisados celulares de HT29, produjeron ácido valérico y ácido hexanoico a concentraciones medias de 5,08 mM y 1,60 mM, respectivamente (Figura l6Ay C).
Para investigar qué metabolitos fueron responsables de la inhibición de HDAC inducida por la cepa, se midieron diferentes concentraciones de ácido hexanoico, ácido valérico y butirato de sodio para determinar su inhibición de HDAC en células HT-29 completas y en lisado de células HT-29. Los resultados en la Fig. 16B muestran una inhibición significativa (P<0,05) de la actividad HDAC por el butirato de sodio en células completas así como en el lisado celular, mientras que el ácido hexanoico no mostró actividad inhibidora significativa. El ácido valérico inhibió la actividad total de HDAC (* (p<0,05), ** (p<0,005), *** (P<0,001), **** (p<0,0001)).
HDAC de clase I objetivo investigadas como inhibidores de HDAC totales potentes.
Se investigó el perfil de inhibición específico de HDAC de la cepa de bacterias de prueba. Se llevaron a cabo ensayos específicos de inhibición de HDAC (BPS Bioscience, CA) para HDAC de Clase I y Clase II. La capacidad de la cepa bacteriana para inhibir las enzimas de HDAC se comparó con el butirato, el ácido hexanoico y el ácido valérico. Nuestros resultados demuestran que MRX0029 es un inhibidor muy potente de las enzimas HDAC de Clase 1 (HDAC1, 2 y 3). La inhibición de los HDAc de clase II no fue tan significativa (datos no mostrados). P
Análisis
La cepa con actividad inhibidora de HDAC produjo cantidades significativas de ácido valérico y ácido hexanoico, así como cantidades significativas de butirato de sodio (Figura 16C). Cuando se probó como sustancias puras, el ácido valérico y el butirato de sodio produjeron una inhibición significativa de HDAC (p<0,0001).
Curiosamente, los resultados de la actividad específica de HDAC muestran que la cepa probada es un potente inhibidor de HDAC de Clase I, y particularmente HDAC2 (Figura 17 y 18). Los h Da C de clase I (HDAC 1, 2, 3 y 8) residen en el núcleo y se expresan de manera ubicua en varios tipos de células humanas. Las HDAC 1-3 comparten más del 50% de homología, pero tienen distintas estructuras y funciones celulares [66]. Están implicadas principalmente en la supervivencia, la proliferación y la diferenciación celular, y por lo tanto su inhibición puede ser útil en una amplia gama de enfermedades [67]; [68]; [69]; [70] [71]
Ejemplo 14 - Nivel de secreción de BDNF en células SHSY-5Y
Antecedentes
El factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) es una molécula ubicua en el cerebro asociada con el desarrollo neural, la neuroprotección y la neuroregeneración. BDNF no solo protege contra la neurodegeneración sino también contra trastornos mentales como la depresión y la ansiedad, que son bastante comunes entre los pacientes diagnosticados con EP o EA.
Métodos
Se colocaron en placas SH-SY5-SY en placas de 24 pocillos a una densidad de 60.000 células/pocillo y se colocaron en la incubadora. Después de 24 h, los medios se reemplazaron por medio de diferenciación (medio de crecimiento que contenía FBS al 1%) y 10 pM de ácido retinoico. El medio de diferenciación se reemplazó cada dos días y las células se usaron el día 10 de diferenciación. Para el tratamiento, se eliminó el medio de diferenciación y se reemplazó con 450 ul de medio de crecimiento completo y se añadieron 50 pl de bacteria SN a los pocillos tratados o se añadió YCFA+ como control negativo.
Resultados
Los resultados se muestran en la Figura 19, que muestra que la administración de MRX0029 en combinación con ácido retinoico aumenta la secreción de BDNF de las células de neuroblasoma diferenciadas. Por lo tanto, las composiciones que comprenden bacterias comensales y ácidos orgánicos pueden ser útiles en terapia.
Ejemplo 15 - Producción de metabolitos - metabolitos en el cerebro
Antecedentes
Los metabolitos presentes en los sobrenadantes de bacterias pueden influir directamente en la respuesta del huésped al estrés oxidativo, la comunicación de célula a célula y la neuroprotección. Los metabolitos que desempeñan un papel clave en los procesos neurológicos se midieron durante el examen ex vivo en el tejido cerebral de ratones alimentados con MRx0005 y MRx0029.
Métodos
Animales
Se alojaron en grupo ratones macho adultos BALBc (Envigo, Reino Unido) bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h; comida para roedores estándar y agua estaban disponibles ad libitum. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices europeas tras la aprobación del University College Cork Animal Ethics Experimentation Committee. Los animales tenían 8 semanas de edad al comienzo del experimento.
Diseño del estudio
Se permitió a los animales habituarse a su sala de espera durante una semana después de llegar a la unidad animal. Reciben alimentación por sonda oral (dosis de 200 pl) de bioterapéuticos vivos a una dosis de 1 X 109 UFC durante 6 días consecutivos entre las 15:00 y las 17:00. El día 7, los animales se decapitan y los tejidos se recogen para experimentación.
Recogida de tejidos
Los animales se sacrificaron de manera aleatoria con respecto al tratamiento y la condición de prueba; el muestreo se realizó entre las 9.00 a.m. y la 1 p.m. Se recogió sangre troncal en tubos de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) de potasio y se centrifugó durante 15 minutos a 4000 g. El plasma se aisló y se almacenó a -80° C para su posterior análisis. El cerebro fue extirpado rápidamente, disecado y cada región del cerebro fue congelada al instante en hielo seco y almacenada a -80° C para su posterior análisis. El bazo se retiró y se procesó inmediatamente después de los sacrificios para la estimulación inmune ex vivo. El tejido intestinal (se extirparon segmentos de 2 cm de íleon y colon más cercanos al ciego, y se usó el 1 cm de tejido más alejado del ciego) se montaron en las cámaras Ussing para el ensayo de permeabilidad intestinal. Se retiró el ciego, se pesó y se almacenó a -80° C para el análisis de SCFA.
Análisis de monoaminas
La concentración de neurotransmisores se analizó por HPLC en muestras del tronco encefálico. Brevemente, el tejido del tronco encefálico se sonicó en 500 pl de fase móvil enfriada adicionada con 4 ng/40 pl de N-metil 5-HT (Sigma Chemical Co., Reino Unido) como estándar interno. La fase móvil contenía ácido cítrico 0,1 M, ácido octano-1-sulfónico 5,6 mM (Sigma), dihidrógeno fosfato de sodio 0,1 M, EDTA 0,01 mM (Alkem/Reagecon, Cork) y metanol al 9% (v/v) (Alkem/Reagecon) y se ajustó a pH 2,8 usando hidróxido de sodio 4N (Alkem/Reagecon). Luego se centrifugaron los homogeneizados durante 15 minutos a 22.000 x g a 4° C y se inyectaron 40 |jl del sobrenadante en el sistema HPLC que consistía en un controlador del sistema SCL 10-Avp, un detector electroquímico LECD 6A (Shimadzu), una bomba LC-10AS, un horno CTO-10A, un autoinyector SIL-10A (con enfriador de muestras mantenido a 40 C) y un desgasificador Gastorr en línea (ISS, Reino Unido). Se empleó una columna de fase inversa (Kinetex 2,6 u C18 100 x 4,6 mm, Phenomenex) mantenida a 30° C en la separación (Caudal 0,9 ml/min). El electrodo de trabajo de carbono vidrioso combinado con un electrodo de referencia Ag/AgCl (Shimdazu) operaba a 0.8 V y los cromatogramas generados se analizaron usando el software Class-VP5 (Shimadzu). Los neurotransmisores se identificaron por sus tiempos de retención característicos de acuerdo con lo determinado por las inyecciones estándar, que se ejecutan a intervalos regulares durante el análisis de la muestra. Las proporciones de los picos máximos de analito frente al estándar interno se midieron y compararon con la inyección estándar. Los resultados se expresaron como ng de neurotransmisor por g de peso fresco de tejido.
Análisis de metabolitos
Para el análisis del metabolito GC, se derivatizaron muestras de sobrenadantes bacterianos con cloroformato de metilo usando una versión ligeramente modificada del protocolo descrito en [72]. Todas las muestras fueron analizadas en un orden aleatorio. El análisis se realizó usando GC (7890B, Agilent) acoplado con un detector de cuadropolos (59977B, Agilent). El sistema fue controlado por ChemStation (Agilent). Los datos brutos se convirtieron al formato netCDF usando Chemstation (Agilent), antes de que los datos se importaran y procesaran en Matlab R2014b (Mathworks, Inc.) usando el software PARADISe descrito en [65].
Para el análisis de ácidos grasos, las muestras se acidificaron usando ácido clorhídrico y se añadieron patrones internos marcados con deuterio. Todas las muestras fueron analizadas en un orden aleatorio. El análisis se realizó usando una columna de alta polaridad (Columna Zebron™ ZB-FFAP, GC Cap. 30 m x 0,25 mm x 0,25 jm) instalada en un GC (7890B, Agilent) acoplada con un detector de cuadropolos (59977B, Agilent). El sistema fue controlado por ChemStation (Agilent). Los datos brutos se convirtieron al formato netCDF usando Chemstation (Agilent), antes de que los datos se importaran y procesaran en Matlab R2014b (Mathworks, Inc.) usando el software PARADISe descrito en [65].
Resultados - producción de neurotransmisores
Los resultados se muestran en la Figura 20, que muestra que en los cerebros de ratones alimentados con MRx0029, los niveles de noradrenalina aumentan (p = 0,0507), acompañados de un ligero aumento de serotonina y 5-HIAA. Estos datos respaldan el análisis de metabolitos que se expone a continuación, lo que sugiere que MRx00029 es un importante productor de ácido 4-hidroxifenilacético, un antioxidante conocido [73]. Más importante aún, el ácido 4-hidroxifenilacético es un producto intermedio sintético de dopamina y noradrenalina y una importante molécula bioactiva [74]. De hecho, en la EP, los cambios degenerativos se extienden más allá del sistema dopaminérgico, afectando por igual a los sistemas serotoninérgicos y noradrenérgicos, lo que a su vez lleva a niveles disminuidos de serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) y noradrenalina (norepinefrina) tanto en el cuerpo estriado como en el extra estructuras estriatales [75]. L-DOPA se dirige principalmente a las características relacionadas con la dopamina de la EP, sin embargo, no aborda las disminuciones tanto en 5-HT como en noradrenalina. Además de esto, cuanto más larga sea la duración del tratamiento con L-DOPA, más visibles son un rango de complicaciones motoras y no motoras (por ejemplo, discinesia, síntomas psiquiátricos) [76]. Por lo tanto, estos datos demuestran que las bacterias que producen ácidos orgánicos, como el ácido 4-hidroxifenilacético, pueden ser útiles en la terapia, en particular en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
Resultados - producción de metabolitos
Los metabolitos presentes en los sobrenadantes de bacterias pueden influir directamente en la respuesta del huésped al estrés oxidativo, la comunicación de célula a célula y la neuroprotección en el específico. Se analizaron los metabolitos en el sobrenadante de cultivos de MRX0029 y MRX0005 y los resultados se muestran en la Figura 21.
Algunos metabolitos mostraron una notable diferencia entre las dos cepas analizadas. La concentración de ácido succínico fue particularmente elevada en MRx0005. Curiosamente, la proporción muestra/medio para el ácido 4-hidroxifenilacético fue significativamente mayor en MRx0029 (Fig. 21A).
El análisis de ácidos grasos en los sobrenadantes reveló una dicotomía interesante en las dos cepas: MRx0005 produjo principalmente ácido acético y propanoico, mientras que MRx0029 produjo ácido butanoico, pentanoico y hexanoico, tanto en forma lineal como ramificada (Fig.21B). Las dos cepas parecían muy diferentes y, en particular, la producción de ácido succínico y ácido 4-hidroxifenilacético por MRx0005 y MRx0029 respectivamente fue notable (Figura 21A). Además, MRx0005 parece producir más ácidos grasos de cadena corta C2 y C3, mientras que MRx00029 produce más C4 (butirato) y ácidos grasos de cadena media tanto lineal como ramificada, incluyendo el ácido hexanoico.
El ácido succínico es un metabolito del ciclo de Krebs implicado en la fosforilación oxidativa. El complejo de fosforilación oxidativa es un paso clave para el tráfico sináptico de proteínas y vesículas a las regiones proximales y distales [77]. Se ha informado de su disfunción en trastornos neurodegenerativos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la ataxia espinocerebelosa tipo 1 [78]. Estos descubrimientos son particularmente interesantes ya que el ácido succínico puede aumentar la actividad mitocondrial y apoyar a las neuronas vulnerables en enfermedades neurodegenerativas relacionadas con proteínas mal plegadas, incluida la EP [79]. El BDNF y el ácido succínico tienen ambos una actividad protectora similar no solo en la neurodegeneración sino también en trastornos mentales como la depresión y la ansiedad, que son bastante comunes entre los pacientes diagnosticados con EP o EA.
La Figura 21B también demuestra que MRX0029 es un productor de butirato (ácido butanoico). Esto puede ser significativo porque el butirato tiene una función conocida que es reducir la impermeabilidad de la barrera hematoencefálica, lo que tiene un efecto neuroprotector [80]. Esta propiedad de MRx0029 (y otras bacterias neuroprotectoras) puede contribuir a su eficacia.
Ejemplo 16 - Modulación de la expresión de ARNm de proteínas de unión estrecha por MRx0029
Como la evidencia reciente sugiere que la disfunción intestinal y la inflamación es un síntoma no motor asociado con la EP, se investigó la capacidad de las cepas bacterianas de la invención de provocar cualquier disfunción de la barrera intestinal. Las monocapas celulares epiteliales HT29-mtx productoras de mucina [81] se utilizaron como modelo in vitro para evaluar la alteración de la barrera intestinal y la estimulación inmune después del tratamiento con MRx0005 y MRx0029. Las células HT29-mtx diferenciadas expuestas a forbol 12-miristato-13-acetato (PMA) secretaron una cantidad significativa de IL-8; por el contrario, el tratamiento durante 24 h con sobrenadantes bacterianos MRx005 y MRx0029, indujo una secreción aún más baja de IL-8 en comparación con las células no tratadas y tratadas con YCFA (Fig. 22A).
Luego se investigó la capacidad de MRx0005 y MRx0029 para regular la permeabilidad epitelial modificando la transducción de señales intracelulares implicada en la expresión y localización de proteínas implicadas en la formación de barrera intestinal.
Se aisló el ARN y se realizó un análisis cuantitativo de RT-PCR (qRT-PCR) para caracterizar los cambios en la expresión génica de proteínas de unión estrecha durante la incubación con MRx0005 y MRx0029. La administración de MRx0029 mejoró la expresión de ARNm de Occludina, Villina, Tight Proteína de unión Estrecha 1 y 2 (respectivamente TJP1 y TJP2) después de 2 h de incubación (Fig. 22B). Por el contrario, la exposición a MRx0005 no alteró la expresión génica de las proteínas de unión estrecha, lo que indica que las dos cepas actúan de manera diferencial en la barrera intestinal.
Los resultados in vitro se compararon con los datos del análisis paralelo ex vivo en el intestino de ratones alimentados con MRx0005 y MRx0029. La expresión génica de TJP2 y occludina se cuantificó en el colon y el íleon. Los datos ex vivo reflejan perfectamente los datos in vitro ya que MRx0029 pudo regular significativamente TJP1 y Occludina (p = 0,073) en la región del colon del intestino murino (Fig. 22C+22D). MRx0029 también fue capaz de disminuir la función de permeabilidad en el colon de los mismos ratones (Fig. 22E+22F).
Materiales y métodos - extracción de ARN y análisis de qPCR
El ARN total se extrajo usando el RNeasy mini kit (Qiagen, Manchester, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y la concentración de ARN se determinó por absorbancia a 260/280 nm usando un espectrofotómetro (nano-Drop ND-1000; Thermo Scientific, Wilmington, DE). Para el análisis de expresión de ARNm, se preparó ADNc a partir de ARN total usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de transcripción inversa se realizaron en un termociclador (Biometra, Alemania) a 25° C durante 10 min, 37° C durante 120 min y 85° C durante 5 min, mantenido a 4° C. El ADNc resultante se amplificó por duplicado mediante el ensayo SYBR-Green PCR, y los productos se detectaron en la máquina de PCR en tiempo real QuantStudio 6 flex (Applied Biosystems, Reino Unido) usando un perfil estandarizado (desnaturalización inicial de 95° C durante 10 minutos, seguida de 40 ciclos de 15 segundos de desnaturalización a 95° C y 60 segundos de apareamiento/extensión a 60/65° C, dependiendo de los cebadores. Se añadió una etapa de disociación después de 40 ciclos para generar una curva de fusión. El análisis se realizó usando el software de PCR en tiempo real de Applied Biosystems QuantStudio v1.2. Las secuencias de cebadores para Actina, Villina, Occludina TJP1 y TJP2 se proporcionan en el listado de secuencias.
Ejemplo 16 - Prueba de estabilidad
Una composición descrita en la presente que contiene por lo menos una cepa bacteriana descrita en la presente se almacena en un recipiente sellado a 25° C o 4° C y el recipiente se coloca en una atmósfera que tiene un 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% o 95% de humedad relativa. Después de 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 año, 1,5 años, 2 años, 2,5 años o 3 años, por lo menos un 50%, 60%, 70% o, 80% o 90% de la cepa bacteriana permanecerá medida en unidades formadoras de colonias determinadas por protocolos estándar.
Ejemplo 17
Métodos
Animales
Los animales y el diseño del estudio usados fueron los mismos que para el Ejemplo 15.
Cepas bacterianas
• 755: Parabacteroides distasonis (MRX005)
• Megasphaera massiliensis (MRX0029)
Recogida de tejidos
Los animales fueron sacrificados de manera aleatoria con respecto al tratamiento y la condición de prueba; el muestreo se realizó entre las 9.00 a.m. y las 2.30 p.m. Se recogió sangre troncal en tubos de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) de potasio y se centrifugó durante 15 minutos a 4000 g. El plasma se aisló y se almacenó a -80° C para su posterior análisis. El cerebro se extirpó rápidamente, se diseccionó y cada región del cerebro se congeló al instante en hielo seco y se almacenó a -80° C para su posterior análisis. El bazo se retiró, se recogió en medio RPMI de 5 ml (con L-glutamina y bicarbonato de sodio, R8758 Sigma 10% de FBS (F7524, Sigma) 1% de Pen/Strep (P4333, Sigma)) y se procesó inmediatamente después de los sacrificios para estimulación inmune in vivo. Se extirparon tejido intestinal (2 segmentos de 3 cm de íleon y colon más cercanos al ciego y se utilizaron los 1 cm 2 cm más lejanos del ciego) se montaron en las cámaras Ussing para el ensayo de permeabilidad intestinal. El ciego se retiró, se pesó y se almacenó a -80° C para el análisis de SCFA.
Análisis de monoaminas
La concentración de neurotransmisores se analizó como se describe en el Ejemplo 10
Ensayo de citoquinas de bazo
Los bazos se recogieron inmediatamente en 5 ml de medio RPMI después del sacrificio y se cultivaron inmediatamente. Las células de bazo se homogeneizaron primero en este medio RPMI, seguido de 5 minutos de incubación con 1 ml de tampón de lisis RBC (11814389001 ROCHE, Sigma). Se añadieron otros 10 ml de medio RPMI, seguido de una centrifugación de 200G durante 5 minutos. El sobrenadante se filtró luego a través de un colador de 40um. Las células se contaron y sembraron (4.000.000/ml de medio). Después de 2,5 h de adaptación, las células se estimularon con lipopolisacárido (LPS-2 pg/ml) o concanavalina A (ConA-,.5 pg/ml) durante 24 h. Después de la estimulación, se recogieron los sobrenadantes para evaluar la liberación de citoquinas usando el kit V-p LeX Proinflammatory Panel 1 (ratón) (Meso Scale Discovery, Maryland, USA). Para TNFa, IL-10, IL-lp, interferón Y, CXCL2 e IL6. Los análisis se realizaron usando MESO QuickPlex SQ 120, SECTOR Imager 2400, SECTOR Imager 6000, SECTOR S 600.
Análisis de expresión génica
El ARN total se extrajo usando el kit de aislamiento de ARNmi mirVana™ (Ambion/Llife technologies, Paisley, Reino Unido) y se trató con ADNasa (Turbo DNA-free, Ambion/life technologies) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El ARN se cuantificó usando el espectrofotómetro NanoDrop™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, Delaware, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad del ARN se evaluó utilizando el Bioanalizador Agilent (Agilent, Stockport, Reino Unido) de acuerdo con el procedimiento del fabricante y se calculó un número de integridad del ARN (RIN). Se usó ARN con un valor de RIN> 7 para experimentos posteriores. El ARN se transcribió inversamente a ADNc usando el kit de ADNc de alta capacidad de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadió transcriptasa inversa Multiscribe (50 U/pl) (1)(2)(1)(10) como parte de la mezcla maestra RT, se incubó a 25° C durante 10 min, 37° C durante 2 h, 85° C durante 5 min y se almacenó a 4° C. La PCR cuantitativa se llevó a cabo usando sondas (6 carboxi fluoresceína-FAM) diseñadas por Applied Biosystems para genes dirigidos específicos de ratón, mientras que se usó p-actina como control endógeno. Las reacciones de amplificación contenían 1 pl de ADNc, 5 pl de la mezcla maestra de PCR 2X (Roche), 900 nM de cada cebador y se llevaron a un total de 10 pl mediante la adición de agua libre de ARNasa. Todas las reacciones se realizaron por triplicado usando placas de 96 pocillos en el sistema LightCycler®480. Las condiciones de ciclado térmico fueron las recomendadas por el fabricante (Roche) durante 55 ciclos. Para verificar la contaminación del amplicón, cada serie no contenía controles de plantilla por triplicado para cada sonda usada. Se registraron los valores de umbral de ciclo (Ct). Los datos se normalizaron usando p-actina y se transformaron usando el método 2-AACT y se presentaron como veces de cambio frente al grupo de control.
Análisis de ácidos grasos de cadena corta en el contenido cecal
El contenido del ciego se mezcló y agitó en vórtex con agua MilliQ y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los sobrenadantes se obtuvieron por centrifugación (10000 g, 5 min, 4° C) para sedimentar bacterias y otros sólidos y filtración por 0,2|jm. Se transfirió a un vial de GC transparente y se usó ácido 2-etilbutírico (Sigma) como estándar interno. La concentración de SCFA se analizó usando un sistema de ionización por llama Varian 3500 GC, equipado con una columna ZB-FFAP (30 m x 0,32 mm x 0,25 mm; Phenomenex). Se construyó una curva estándar con diferentes concentraciones de una mezcla estándar que contiene acetato, propionato, isobutirato, n-butirato, isovalerato y valerato (Sigma). Los picos se integraron usando el software Varian Star Chromatography Workstation versión 6.0. Todos los datos SCFa se expresan como jmol/g.
Análisis estadístico
Los datos normalmente distribuidos se presentan como media ±SEM; Los conjuntos de datos no paramétricos se presentan como mediana con rango intercuartil. Se aplicó la prueba t de dos colas sin emparejar para analizar los datos paramétricos y se usó la prueba de Mann-Whitney para los no paramétricos. El coeficiente de correlación de rango de Spearman se empleó para el análisis de correlación en los conjuntos de datos agrupados. Un valor de p<0,05 se consideró significativo en todos los casos.
Resultados - Producción de neurotransmisores
Los resultados en la Figura 23 muestran el efecto del tratamiento MRx005 sobre la concentración de neurotransmisores en el cerebro de los ratones. En particular, el tratamiento con MRx005 lleva a una disminución de la dopamina.
Resultados - Expresión génica
Se analizó la expresión de genes para receptores de neurotransmisores [receptor de serotonina la (5-HTR1a), receptor de dopamina D1, subunidad B1 del receptor de GABA, receptor de GABAA, receptor de NMDa 2a (Grin2A) y receptor de NMDA2B (Grin2b)], marcadores inflamatorios [IL-lp, IL6, CD11b, TNFa y TLR4], y marcadores endocrinos [factor de liberación de corticosterona (CRF), receptores de factor de liberación de corticosterona 1 y 2 (CRFR1, CRFR2), factor de neurotrofina derivado del cerebro (BDNF), receptor de vasopresina, receptor de oxitocina, receptor de glucocorticoides y receptor de mineralocorticoides] en tejido cerebral del hipocampo, la amígdala y la corteza prefrontal.
Las Figuras 24-38 muestran los cambios en la expresión génica después del tratamiento con MRX005 o MRX0029 en el hipocampo, la amígdala y la corteza prefrontal. El tratamiento con MRx0029 llevó a un aumento en la expresión del receptor de glucocorticoides en la amígdala (Figura 31C). La Figura 32A muestra que MRx005 aumentó significativamente la expresión de BDNF en la amígdala, mientras que el tratamiento con MRx0029 aumentó significativamente la expresión de TLR4 en la amígdala (Figura 32).
Tanto MRx005 como MRx0029 pueden aumentar la expresión de CDIlb en la amígdala (Figura 33A), mientras que la expresión de IL-6, Grin2a y Grin2b se reduce después del tratamiento con MRx005 (Figuras 33B-D). Además, MRx005 y MRx0029 aumentaron significativamente la expresión de GABRA2 y aumentaron la expresión de GABBR1 en la amígdala.
El tratamiento con MRx005 llevó a un aumento significativo en la expresión de BDNF en la corteza prefrontal (Figura 35B).
Análisis
La administración de MRx005 y MRx0029 provocó cambios en la expresión génica, especialmente en la amígdala.
Resultados - Efecto sobre la expresión de Tph1 e IDO-1
La Figura 39 muestra que MRx0029 puede aumentar significativamente la expresión de triptófano hidroxilasa-1 (Tph1) en el colon y que el tratamiento con MRX005 puede aumentar la expresión de IDO-1 en el colon. El tratamiento con MRX005 aumentó la expresión de Tph1 e IDOl en el íleon (Figura 40).
Indoleamina-pirrolo 2,3-dioxigenasa-l (IDO-1) la primera enzima limitante de la velocidad en la vía triptófano/quinurenina mientras triptófano hidroxilasa 1 (Tph1), una isoforma de la enzima triptófano hidroxilasa, responsable de la síntesis de serotonina. Estos datos sugieren que MRx0029 y MRx005 pueden afectar los niveles de serotonina y la vía de triptófano/quinurenina.
Resultados - Efecto sobre los niveles de metabolitos de triptófano
La Figura 41 muestra el efecto del tratamiento con MRx005 sobre los niveles de quinurenina y triptófano circulantes.
Resultados - Efecto sobre la expresión de citoquinas de esplenocitos
El ensayo ex vivo de esplenocitos implica desafiar a los esplenocitos (células aisladas del bazo, un órgano principal involucrado en la defensa inmune), con un desafío mimético bacteriano o viral.
MRX005 redujo significativamente los niveles de interferón-Y en esplenocitos después de un desafío con LPS (Figura 42). Además, MRX005 redujo los niveles de interleucina-6 y el factor de necrosis tumoral después de un desafío con LPS (Figuras 44 y 45, respectivamente). El tratamiento con MRx0029 llevó a una reducción en interferón-Y, interleucina-1p e interleucina-6 después de un desafío con LPS (Figuras 42, 43 y 44, respectivamente).
El tratamiento con MRx005 y MRx0029 llevó a un aumento en los niveles de CXCL1 quimioatrayente (Figura 47).
Resultados - Efecto sobre los niveles de ácidos grasos de cadena corta cecales
Los ácidos grasos de cadena corta (SCFA) se producen cuando las fibras no digeribles de la dieta son fermentadas por bacterias en el intestino. Los efectos de la administración de MRX005 se muestran en la Figura 48.
Ejemplo 18 - Análisis adicional de los cambios inducidos por MRX029 y MRX005 en los niveles de expresión génica
Métodos
Línea celular
Células SH-SY5Y
Cepas bacterianas
• 755: Parabacteroides distasonis (MRX005)
• Megasphaera massiliensis (MRX0029) qPCR
Se colocaron en placas SHSY5Y en placas de Petri de 10 cm con una densidad de 2 x 106 células. Después de 24 h, las células se trataron en medio de diferenciación (medio de crecimiento que contenía FBS al 1% sin RA) con sobrenadantes de bacterias al 10% o YCFA+, RA 10uM, ácido hexanoico 200 uM o ácido valproico 200 uM, durante 17 h. Posteriormente, se tomaron imágenes representativas usando un microscopio de núcleo EVOS XL de contraste de fase con un aumento de 40X/0,65. Se recogieron las células y se aisló el a Rn total de acuerdo con el protocolo RNeasy mini kit (Qiagen). Los ADNc se elaboraron usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). La expresión génica se midió usando qPCR. Se usó GAPDH como control interno. Las veces de cambio se calcularon de acuerdo con el método 2('ññct). Las secuencias de cebadores para MAP2, DRD2, GABRB3, SYP, PrNK1, PARK7 y NSE se proporcionan en el listado de secuencias.
Inmunomarcado e imagenología celular
Las células se sembraron en portaobjetos de cámara de 8 pocillos (Marienfeld Laboratory Glassware) a 5x104 células/pocillo durante la noche y se trataron con sobrenadante bacteriano al 10% durante 24 h. Para la diferenciación, las células se trataron con AR 10 nM durante 5 días antes de tratarlas con sobrenadante bacteriano libre de células durante 24 h. Posteriormente, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT). Las células fijadas se lavaron con PBS y se permeabilizaron con Triton X-100 al 1% en PBS durante 10 minutos. Después de lavar con PBS, los portaobjetos se incubaron con tampón de bloqueo (BSA/PBS al 4%) durante 1 hora a temperatura ambiente antes de añadir el anticuerpo anti-MAP2 o p3-tubulina (sc-74421 y sc-80005 respectivamente, Santa Cruz Biotechnology Inc) diluido en BSA/PBS al 1% durante 12 h a 4° C. Luego se lavaron dos veces con PBS, seguido de incubación con el anti-ratón conjugado Alexa Flour488 (Molecular Probes Inc) y la faloidina conjugada Alexa Flour 594 (ab 176757, Abeam) durante 1 hora a RT. Después de lavar 3 veces con PBS, los portaobjetos se tiñeron con DAPI y se montaron con Vectashield® (Vector Laboratories). Los portaobjetos se observaron usando un microscopio Axioskop 50 (Zeiss) equipado con un objetivo Korr W de 63x/1,2 y conjuntos de filtros adecuados para la detección de los fluorocromos usados. Los tiempos de exposición manual para la adquisición digital de imágenes inmunomarcadas con MAP-2 se mantuvieron constantes permitiendo la comparación entre diferentes pocilios y tratamientos. Los tiempos de exposición a faloidina (F-actina) y DAPI variaron para adaptarse al campo de visión. Los campos de visión aleatorizados se adquirieron usando una cámara Qlmaging controlada por el software Image Pro Plus. Las imágenes se guardaron como archivos TIFF y se abrieron en Adobe Photoshop CC 2015.1.2. Las imágenes de las imágenes MAP-2, DAPI y faloidina se superpusieron y fusionaron. Se seleccionaron imágenes representativas para ilustrar las diferencias en la abundancia y localización de las proteínas examinadas.
Inmunotransferencia
Células SH-SY5Y cultivadas en las condiciones indicadas anteriormente, tratadas con MRx0005 y MRx0029 durante 24 horas y luego lisadas en tampón RIPA que contenía cóctel de inhibidores de proteasa (Roche Diagnostics, Reino Unido). La concentración de proteínas se estimó usando el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), separado por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF. Luego se bloquearon las membranas con leche en polvo desnatada al 5% o BSA al 5% y se incubaron durante la noche a 4° C con los anticuerpos primarios (respectivamente MAP2 ytubulina p3). Luego se incubaron las transferencias con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) apropiado, y las proteínas se detectaron mediante un kit de detección de quimioluminiscencia (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Tanto para MAP2 como para p3-tubulina, la p-actina sirvió como control para monitorizar la variabilidad de la carga de proteínas entre las muestras.
Resultados y análisis
Expresión génica
Las Figuras 13a (inserción del gráfico) y 49 muestran los cambios inducidos por MRx0029 y MRX005 en los niveles de expresión de Actina, Villina, Occludina TJP1, TJP2, MAP2, DRD2, GABRB3, SYP, PTNK1, PARK7 y NSE.
Microscopía e inmunotransferencia
La Figura 50 muestra el cambio en el nivel de expresión de MAP2 en células SHSY5Y de acuerdo con lo determinado por microscopía confocal. Los niveles de expresión de MAP2 y B3-tubulina también se cuantificaron mediante análisis de inmunotransferencia. Los resultados mostrados en las Figuras 50M y N indican que MRX029 induce un aumento en el nivel de expresión de MAP2.
Secuencias
SEQ ID NO: 1 (gen de Megasphaera massiliensis para ARN ribosómico 16S, secuencia parcial, cepa: NP3 - JX424772.1)
1 agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac 61 gagaagagat gagaagcttg cttcttatca attcgagtgg caaacgggtg agtaacgcgt 121 aagcaacctg cccttcagat ggggacaaca gctggaaacg gctgctaata ccgaatacgt 181 tctttccgcc gcatgacggg aagaagaaag ggaggccttc gggctttcgc tggaggaggg 241 gcttgcgtct gattagctag ttggaggggt aacggcccac caaggcgacg atcagtagcc 301 ggtctgagag gatgaacggc cacattggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 361 cagcagtggg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgaacga 421 tgacggcctt cgggttgtaa agttctgtta tatgggacga acagggcatc ggttaatacc 481 cggtgtcttt gacggtaccg taagagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 541 taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggcgc gcaggcggca 601 tcgcaagtcg gtcttaaaag tgcggggctt aaccccgtga ggggaccgaa actgtgaagc 661 tcgagtgtcg gcLQ ’ci.Q’Q’cLcLcLQ’ cggaattcct agtgtagcgg tgaaatgcgt agatattagg 721 aggaacacca gtggcgaaag cggctttctg gacgacaact gacgctgagg cgcgaaagcc 781 aggggagcaa acgggattag ataccccggt agtcctggcc gtaaacgatg gatactaggt 841 gtaggaggta tcgactcctt ctgtgccgga gttaacgcaa taagtatccc gcctggggag 901 tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagtat 961 gtggtttaat tcgacgcaac gcgaagaacc ttaccaagcc ttgacattga ttgctacgga 1021 aagagatttc cggttcttct tcggaagaca agaaaacagg tggtgcacgg ctgtcgtcag 1081 ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccctat cttctgttgc 1141 cagcacctcg ggtggggact cagaagagac tgccgcagac aatgcggagg aaggcgggga 1201 tgacgtcaag tcatcatgcc ccttatggct tgggctacac acgtactaca atggctctta 1261 atagagggac gcgaaggagc gatccggagc aaaccccaaa aacagagtcc cagttcggat 1321 tgcaggctgc aactcgcctg catgaagcag gaatcgctag taatcgcagg tcagcatact 1381 gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgaa agtcattcac 1441 acccgaagcc ggtgaggcaa ccgcaaggaa ccagccgtcg aaggtggggg cgatgattgg 1501 ggtgaagtcg taacaaggt
SEQ ID NO: 2 (secuencia de ARNr 16S de consenso para cepa de Megasphaera massiliensis MRx0029)
TGAGAAGCTTGCTTCTTATCGATTCTAGTGGCAAACGGGTGAGTAACGCGTAAGCAACCTGCCCTTCAGATGGGGAC AACAGCTGGAAACGGCTGCTAATACCGAATACGTTCTTTCCGCCGCATGACGGGAAGAAGAAAGGGAGGCCTTCGGG CTTTCGCTGGAGGAGGGGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGAGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCC GGTCTGAGAGGATGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTT CCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAAGTTCTGTTATATG GGACGAACAGGACATCGGTTAATACCCGGTGTCTTTGACGGTACCGTAAGAGAAAGCCACGGCTAACTACGIGCCAG CAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCGCGCAGGCGGCATCGCAAGT CGGTCTTAAAAGTGCGGGGCTTAACCCCGTGAGGGGACCGAAACTGTGAAGCTCGAGTGTCGGAGAGGAAAGCGGAA TTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTTTCTGGACGACAACTGA CGCTGAGGCGCGAAAGCCAGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCTGGCCGTAAACGATGGATACTAGG TGTAGGAGGTATCGACTCCTTCTGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTG AAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTA CCAAGCCTTGACATTGATTGCTACGGAAAGAGATTTCCGGTTCTTCTTCGGAAGACAAGAAAACAGGTGGTGCACGG CTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCTTCTGTTGCCAGCACC TCGGGTGGGGACTCAGAAGAGACTGCCGCAGACAATGCGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCGCCTT ATGGCTTGGGCTACACACGTACTACAATGGCTCTTAATAGAGGGAAGCGAAGGAGCGAICCGGAGCAAACCCCAAAA ACAGAGTCCCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCAGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATA CTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAAAGTCATTCACACCCGAAGCCGGTGA GGCAACCGCAAG
Cebadores usados para qPCR (con SEQ ID NO entre paréntesis)
Figure imgf000047_0002
SEQ ID NO: 17 (secuencia de ARNr 16S de consenso para cepa de Parabacteroides distasonis MRX0005)
AMCCGGGTGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACGCGTATGCAACTTGCCTATCAGAGGGGGATAACCCGGCGAAAGT CGGACTAATACCGCATGAAGCAGGGATCCCGCATGGGAATATTTGCTAAAGATTCATCGCTGATAGATAGGCATGCG TTCCATTAGGCAGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAACCGACGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACA TTGGTACTGAGACACGGACCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGTGAGCCTGAACC AGCCAAGTCGCGTGAGGGATGAAGGTTCTATGGATCGTAAACCTCTTTTATAAGGGAATAAAGTGCGGGACGTGTCC CGTTTTGTATGTACCTTATGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCGAGCGT TATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTGCGTAGGCGGCCTTTTAAGTCAGCGGTGAAAGTCTGTGGCTCAACCATAG AATTGCCGTTGAAACTGGGAGGCTTGAGTATGTTTGAGGCAGGCGGAATGCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCATAGAT ATCACGCAGAACCCCGATTGCGAAGGCAGCCTGCCAAGCCATTACTGACGCTGATGCACGAAAGCGTGGGGATCAAA CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCAGTAAACGATGATCACTAGCTGTTTGCGATACACTGTAAGCGGCACAGC GAAAGCGTTAAGTGATCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAG CGGAGGAACATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGTTTGAACGCATTCGGACMGAKGTGGAA ACACATTTTCTAGCAATAGCCATTTGCGAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCGGCTTAAG TGCCATAACGAGCGCAACCCTTGCCACTAGTTACTAACAGGTAAAGCTGAGGACTCTGGTGGGACTGCCAGCGTAAG CTGCGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACATCCGGGGCGACACACGTGTTACAATGGCGTGG ACAAAGGGAAGCCACCTGGCGACAGGGAGCGAATCCCCAAACCACGTCTCAGTTCGGAICGGAGTCTGCAACCCGAC TCCGTGAAGCTGGATTCGCTAGTAATCGCGCATCAGCCATGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCG CCCGTCAAGCCATGGGAGCCGGGGGTACCTGAAGTCCGTAACCGCGAGGATCGGCCTAGGGTAAAACTGGTGACTGG GGCTAAGTCGTACGGGG
Cebadores y sondas usadas para qPCR ex vivo (con SEQ ID NO entre paréntesis)
Ex vivo:
Figure imgf000047_0001
Cebadores adicionales usados en qPCR (con SEQ ID NO entre paréntesis)
ID del gen Secuencia directa Secuencia inversa
NSE CCCT GT AT CGTAAGAACGGT (30) GCCACCATT GAT CACGTT GA (31)
PINK1 CCC AAGC AACT AGCCCCT C (32) GGC AGC ACAT CAGGGTAGT C (33)
PARK7 GTAGCCGTGATGTGGTCATTT (34) CT GT GCGCCCAGATT ACCT (35)
SYP CT CGGCTTTGTG AAGGT GCT (36) GGCTT CATGGC A T CAACTT CA (37)
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-1 Formulario PCT/RO/134 Indicaciones Referentes a Microorganismos Depositados u Otro Material
Figure imgf000049_0001
Biológico (PCT Rule 13bis)
-1-1 Preparado Usando PCT Online Filing Version 3.5.000.256e MT/FOP 20141031/0.20.5.20
-2 N de Solicitud Internacional
-3 Referencia del archivo del soli
Figure imgf000049_0002
P070772WO
Las indicaciones hechas continuación se refieren a microorganismos depositados u material biológico referido en la descripción
Figure imgf000049_0003

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, para uso en un método de tratamiento o prevención de un trastorno neurodegenerativo, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO:2.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde el método para tratar o prevenir una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste de la enfermedad de Parkinson, incluyendo parálisis supranuclear progresiva, parálisis supranuclear progresiva, síndrome de Steele-Richardson-Olszewski, hidrocefalia de presión normal, parkinsonismo vascular o arteriosclerótico y parkinsonismo inducido por fármacos; enfermedad de Alzheimer, incluyendo el síndrome de Benson; esclerosis múltiple; enfermedad de Huntington; esclerosis lateral amiotrófica; enfermedad de Lou Gehrig; enfermedad de las neuronas motoras; enfermedad por priones; ataxia espinocerebelosa; atrofia muscular espinal; demencia, incluyendo demencia de cuerpos de Lewy, vascular y frontotemporal; afasia progresiva primaria; defecto cognitivo leve; deterioro cognitivo relacionado con el VIH y degeneración corticobasal.
3. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la composición es para su uso en un método de tratamiento o prevención de la enfermedad de Parkinson.
4. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la composición es para su uso en un método de tratamiento o prevención de enfermedad neurodegenerativa de inicio temprano; y/o en donde la composición es para su uso en un método para prevenir o retrasar la aparición o la progresión de un trastorno neurodegenerativo.
5. Una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, para su uso en un método de tratamiento de lesiones cerebrales, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16s que es por lo menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO:2.
6. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la lesión cerebral es derrame cerebral, como isquemia cerebral, isquemia cerebral focal, derrame cerebral isquémico o derrame cerebral hemorrágico.
7. La composición para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde la cepa bacteriana es de Megasphaera massiliensis.
8. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16s que es por lo menos un 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la SEQ ID NO:2; o en donde la cepa bacteriana tiene la secuencia de ARNr 16s representada por la SEQ ID NO: 2.
9. La composición para el uso de la reivindicación 1, en donde la composición comprende una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis, en un método de tratamiento o prevención de la enfermedad de Parkinson.
10. La composición para el uso de la reivindicación 5, en donde la composición comprende una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis, en un método para tratar lesiones cerebrales resultantes de un derrame cerebral.
11. La composición para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde la composición es para administración oral y/o en donde la composición comprende uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables, y/o en donde la cepa bacteriana está liofilizada; o un producto alimenticio que comprende dicha composición, para el uso de cualquier reivindicación anterior.
12. Una célula de la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787.
13. Una composición que comprende la célula de la reivindicación 12, preferiblemente que comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
14. Un cultivo biológicamente puro de la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787.
15. Una célula de la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787 para su uso en terapia, preferiblemente en donde la célula es para su uso en un método definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
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