BR112013020312B1 - Composições simbióticas para restauração e reconstituição da microbiota intestinal - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES SIMBIÓTICAS PARA RESTAURAÇÃO E RECONSTITUIÇÃO DA MICROBIOTA INTESTINAL. A presente invenção se refere a composições simbióticas compreendendo cepas bacterianas probióticas e substâncias prebióticas que, quando combinadas exibem comportamento sinergístico. As composições sinergéticas a microflora indígena para restaurar e reconstituir condições com as intestinais in vivo após diarreia associada a antibióticos (AAD), e/ou outras infecções intestinais causadas por patógenos gastrointestinais, e recaídas das mesmas, bem como a prevenção de ditos transtornos.

Description

COMPOSIÇÕES SIMBIÓTICAS PARA RESTAURAÇÃO E RECONSTITUIÇÃO DA MICROBIOTA INTESTINAL CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a composições simbióticas compreendendo cepas bacterianas probióticas e substâncias prebióticas que, quando combinadas exibem comportamento sinergistico. As composições sinergéticas estimularão a microflora indígena para restaurar e reconstituir condições como as intestinais in vivo após diarreia associada a antibióticos (AAD), e/ou outras infecções intestinais causadas por patógenos gastrointestinais, e recaídas das mesmas, bem como a prevenção de ditos transtornos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A microbiota intestinal constitui um "órgão extracorpóreo" verdadeiro com um importante papel para o metabolismo intrínseco do corpo e várias funções imune. Este "órgão" realiza funções digestivas únicas que simplesmente não podem ser conseguidas pelo trato gastrointestinal (GI) de um animal livre de germes. No entanto, juntos o GI e a microbiota formam uma diafonia metabólica complexa entre espécies bacterianas e o hospedeiro.

Normalmente a camada de muco intestinal protege o epitélio contra invasão, e colonização por patógenos, e serve como uma matriz na qual residem fatores antimicrobianos produzidos pelo epitélio juntos com cepas da microbiota intestinal normal. Esta camada de muco constitui uma zona de tampão que alcança a compartimentalização luminal da microbiota e estabelece uma linha de comunicação para uma troca de moléculas através de diafonias entre cepas bacterianas e o epitélio intestinal (Sansonetti, Mucosal Immunol, 2011, 4:8-14).

Um uso crescente de antibióticos na medicina humana e animal autalmente leva a'uma severa amplificação de cepas resistentes a antibióticos no intestino tal como Staphylococci resistentes a meticilina (MRSA e MRSE), Enterobacteriaceae que produzem β-lactamase de espectro estendido (ESBL), Enterococcus spp resistentes a vancomicina (VRE), Helicobacter pilori resistente a claritromicina, Clostridium difficile resistente a vancomicina (CD), Campylobacter jejuni resistente a quinolona e várias cepas de espécies de Candida.

CD é em pequenas quantidades parte da flora intestinal normal indígena, mas antibióticos de amplo espectro tais como clindamicina, cefalosporinas, e fluoroquinolonas, que destroem a microflora intestinal humana indígena, causará o crescimento exagerado no intestino de CD que produz toxinas, destroem enterócitos na mucosa, e induzem diarreia, que em casos severos leva a colite pseudomembranosa com uma alta mortalidade. A cepa epidêmica de CD NAP1/027 produz substancialmente mais toxina A e toxina B que cepas de hospital até agora isoladas e é altamente virulenta.

A microbiota intestinal é um ecossistema complexo que age em simbiose com o hospedeiro. As espécies de bifidobactérias entéricas (Bif) possuem um número muito alto de genes para metabolizar carboidratos no cólon ao passo que lactobacilos são as bactérias do ácido láctico (LAB) dominantes no intestino delgado.

A fermentação prebiótica produz ácidos graxos de cadeia curta (SCFA), tal como ácido acético, ácido butirico e ácido láctico que reduzem o pH local do cólon. Além disso, prebióticos e fibras dietéticas ajudam na multiplicação de LAB e bifidobactérias para produzir densidades celulares altas e prevenir o crescimento de ditos patógenos de intestino mencionados acima por meio da produção de substâncias bactericidas, antioxidantes, redução de inflamação da mucosa, manutenção de integridade de colônias da mucosa, e promoção de fortes respostas anti-inflamatórias do hospedeiro. Exclusão competitiva é outro modo de defesa antimicrobiana contra os patógenos invasores.

O uso atual dos termos probiótico e prebiótico são normalmente relacionados com um conceito simbiótico complementar, em que o probiótico é selecionado com base em efeitos benéficos específicos desejáveis para o hospedeiro, e o prebiótico é selecionado para estimular o crescimento de microflora indígena. No entanto, a presente invenção usa a abordagem de um novo conceito sinergístico, em que o prebiótico é selecionado para estimular o crescimento de cepas probióticas que têm efeitos benéficos específicos sobre o hospedeiro. Pode também aumentar os níveis de microbiota benéfica do GI do hospedeiro, mas o alvo primário é estimular o crescimento das cepas probióticas ingeridas. o co-cultivo estimula outros parceiros na composição que são pobres para utilizar oligossacarídeos prebióticos e outros carboidratos não digeríveis no intestino humano.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um primeiro aspecto da invenção se refere a uma composição simbiótica compreendendo pelo menos duas cepas bacterianas selecionado do grupo consistindo nos gêneros Lactobacillus e Bifidobacteria, e uma ou mais substâncias prebióticas, caracterizada pelo fato de que

• - pelo menos uma das cepas bacterianas é capaz de degradar amido; e
• - pelo menos uma substância prebiótica é amido.

Vantajosamente a cepa bacteriana capaz de degradar amido é do gênero Bifidobacteria, ou da espécie Bifidobacterium breve tal como Bif LU 10.

Vantajosamente o amido é amido resistente (RS) e/ou amido solúvel (SS).

Vantajosamente uma de ditas cepas bacterianas é uma cepa que não degrada amido, ou da espécie de Lactobacillus paracasei, tal como LAB LU 33.

Vantajosamente a composição simbiótica compreende pelo menos Bif LU 10 e uma ou mais das cepas LAB LU 23, LAB LU 28, LAB LU 33, BIF LU 29, e/ou BIF LU 30, ou pelo menos Bif LU 10, e LAB LU 33, ou pelo menos BIF LU 10, LAB LU 33, e BIF LU 30, ou pelo menos BIF LU 10, LAB LU 33, BIF LU 30, e LAB LU 28.

Vantajosamente uma ou mais das cepas bacterianas foi exposta a ácido, bile e/ou mucina durante a sua produção, tal que a exposição a ácido envolve reduzir o pH de um caldo de cultura até pH 2-5, preferivelmente até pH 2,5-4,5, mais preferivelmente pH a 3-4, por 15-150 min, preferivelmente por 20-140 min, mais preferivelmente por 30-130 min, mais preferivelmente por 40-120 min durante o crescimento das cepas bacterianas, e a exposição a bile envolve crescer as cepas bacterianas na presença de 0,1-2,5 % (p/vol), preferivelmente 0,5-2 %, mais preferivelmente 1,0-1,5 % taurocolato de sódio, ou 1-10 % (vol/vol), preferivelmente 2-7 %, mais preferivelmente 3-5 % bile porcina por 2-8 h, preferivelmente por 2,5-7 h, mais preferivelmente por 3-6 h, e a exposição a mucina envolve crescer as cepas bacterianas na presença de 0,01-1 % (vol/vol), preferivelmente 0,03-0,7 %, mais preferivelmente 0,05-0,5 % mucina por 2-8 h, preferivelmente por 2,5-7 h, mais preferivelmente por 3-6 h.

Vantajosamente a composição simbiótica compreende ainda uma substância prebiótica do grupo consistindo em dissacarideos, oligossacarideos, e/ou polissacarideos, em que o dissacarideo é lactulose, os oligossacarideos são do grupo consistindo em fructo- oligossacarideos (FOS), galactooligossacarideos (GOS), Xilo-oligossacarideos (XOS), oligossacarideo de quitosana (quioses), oligossacarideos de isomaltose (IMOS), goma arábica, oligossacarideos de soja e pectina, e os polissacarideos são do grupo consistindo em pectina, xilana, inulina, quitosana, e/ou β-glucana.

Vantajosamente a composição simbiótica compreende ainda substâncias prebióticas do grupo consistindo em galactooligossacarideos (GOS), Xilo-oligossacarideos (XOS), oligossacarideos de isomaltose (IMOS), fructo-oligossacarídeos (FOS) e/ou lactulose.

Vantajosamente a composição simbiótica compreende ainda galactooligossacarideos (GOS), e/ou Isomaltooligossacarídeos (IMOS).

A composição simbiótica como foi descrito acima é vantajosamente usada na colonização da mucosa intestinal de um sujeito, e na prevenção, tratamento, melhora de sintomas, e/ou prevenção de recaída de diarreia associada a antibióticos (AAD) e/ou infecções causadas por patógenos gastrointestinais em um sujeito.

A diarreia associada a antibióticos (AAD) é induzida por Clostridium difficile.

A infecção por patógenos gastrointestinais é causada por Salmonella, Campylobacter jejuni, E. coli que produz Beta Lactamase de Espectro Estendido (ESBL).

Vantajosamente o sujeito é um mamífero, tal como um mamífero do grupo que consiste em seres humanos, primatas não humanos, gado, ovelha, porcos, cabras e cavalos, cachorros, gatos, roedores e cobaias. Preferivelmente o sujeito é um ser humano.

A composição simbiótica como foi descrito acima pode ser usada na fabricação de um medicamento para uso na colonização da mucosa intestinal de um sujeito para prevenir, tratar, melhorar sintomas de, e prevenir a recaída de diarreia associada a antibióticos (AAD), e/ou infecções causadas por patógenos gastrointestinais.

A composição simbiótica como foi descrito acima pode ser usada para a fabricação de um medicamento para uso no tratamento de um sujeito que sofre de diarreia associada a antibióticos (AAD) , e/ou infecções causadas por patógenos gastrointestinais.

A composição simbiótica como foi descrito acima pode ser usada em um método para a colonização da mucosa intestinal de um sujeito, dito método compreendendo a etapa de administrar a composição simbiótica em uma dose eficaz a um sujeito em necessidade do mesmo.

A composição simbiótica como foi descrito acima pode ser usada em um método para tratar um sujeito de diarreia associada a antibióticos (AAD) e/ou infecções causadas por patógenos gastrointestinais, dito método compreendendo a etapa de administrar a composição simbiótica em uma dose eficaz a um sujeito em necessidade do mesmo.

DEFINIÇÕES

Os termos usados nesta invenção são em geral esperados que estejam aderidos a definições padrão aceitas por aqueles que têm habilidade ordinária na técnica de microbiologia e bioquímica. Umas poucas exceções, como listado a seguir, foram definidas adicionalmente dentro do escopo da presente invenção.

Como usado no presente documento o termo "dissacarídeo" é o carboidrato formado quando dois monossacarídeos passam por uma reação de condensação que envolve a eliminação de uma pequena molécula, tal como água, dos grupos funcionais somente.

Como é usado no presente documento o termo "oligossacarídeo" se refere a um polímero de sacarídeos contendo um pequeno número de açúcares (monossacarídeos), usualmente dois a dez.

Como é usado no presente documento o termo "polissacarídeos" são estruturas poliméricas de carboidrato formadas de unidades repetidas (mono ou dissacarídeos) unidas juntas por ligações glicosídicas. Estas estruturas são com frequência lineares, mas podem conter vários graus de ramificação.

Como é usado no presente documento o termo "amido" é um carboidrato consistindo em um grande número de unidades de glicose unidas juntas pelas ligações glicosídicas. Este polissacarídeo é produzido por todas as plantas verdes como um armazém de energia. Consiste em dois tipos de moléculas:
a amilose linear e helicoidal e a amilopectina ramificada. Dependendo da planta, amido geralmente contém de 20 a 25 % de amilose e de 75 a 80 % de amilopectina. O termo amido inclui, mas não é limitado a amido solúvel (SS), amido resistente (RS) dos cereais (arroz, trigo, e milho), os vegetais de raiz (batatas e cassava), bolotas, araruta, arracácia, bananas, cevada, fruta-pão, trigo-mourisco, balizeiro, colacásia, katakuri, kudzu, malanga, milheto, aveias, oca, araruta da Polinésia, sago, sorgo, batatas-doces, centeio, taro, castanhas, castanhas de água e inhames, feijões, tais como favas, lentilhas, feijões mung, ervilhas, e grão-de-bico.

Como é usado no presente documento o termo "probióticos" se refere a bactérias que, quando consumidas em quantidades suficientes conferem um beneficio à saúde.

Como é usado no presente documento o termo "prebióticos" se refere a substâncias que são ingredientes alimentícios não digeríveis que estimulam o crescimento e/ou atividade de bactérias no sistema digestivo nas maneiras reivindicadas como sendo benéficas à saúde.

Como é usado no presente documento o termo "simbióticos" se refere a suplementos nutricionais ou medicamento para combinar probióticos e prebióticos em uma forma de sinergismo. Uma composição simbiótica estimulará o crescimento de cepas probióticas presentes na composição e na microflora indígena e exibirá efeito sinergístico in vivo.

Como é usado no presente documento o termo "sujeito" se refere a qualquer organismo vivo tal como um animal ou ser humano em necessidade de tratamento para, ou suscetível a, uma condição envolvendo um micro-organismo não desejado ou indesejado, por exemplo, um tratamento particular para ter um patógeno gastrointestinal indesejado como definido a seguir. O termo sujeito inclui, mas não é limitado a, seres humanos, primatas não humanos e espécies de macaco, animais de fazenda tais como, porcos, cabras e cavalos, mamíferos domésticos tais como cachorros e . gatos, animais de laboratório incluindo roedores tais como camundongos, ratos e cobaias. O termo não denota uma idade ou sexo particular. Assim, sujeitos adultos e recém-nascidos, sejam masculinos ou femininos, são destinados a estarem cobertos). Em modalidades preferidas, o sujeito é um mamífero, incluindo seres humanos e mamíferos não humanos. Na modalidade mais preferida, o sujeito é um ser humano. Como usado no presente documento o termo "patogênico" se refere a uma substância ou condição que tem a capacidade de causar uma doença.

Como é usado no presente documento os termos "patógeno gastrointestinal" ou "enteropatógeno" incluem micróbios com patogenicidade para o trato gastrointestinal (desde o esôfago descendo até reto). Inclui enterobactérias, enterococos, corynebacteria, subespécies de Mycobacterium avium paratuberculosis, Brachyspira hyodysenteriae, Lawsonia intracellulars, Campilobacter, Clostridia. Bactérias patógenas gastrointestinais podem incluir bactérias do gênero Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Campylobacter jejuni, Clostridium, Escherichia coli, Yersinia, Vibrio cholerae, e outros.

Como é usado no presente documento os termos "bacteriocinas" ou "substâncias semelhantes a bacteriocinas" são toxinas proteináceas produzidas pelas bactérias para inibir o crescimento de cepas bacterianas similares ou proximamente relacionadas.

Como é usado no presente documento o termo "tratamento" inclui a tentativa de prevenção, remediação, melhora, e a prevenção de recaída de um problema de saúde em um sujeito, usualmente em seguida a um diagnóstico.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 Algoritmo para o estimulador de trânsito semelhante ao gastrointestinal (GITS).
Figura 2 Contagens bacterianas durante Estimulação de semelhante ao trânsito gastrointestinal (GITS) como determinado por qPCR.
Figura 3 Desenho experimental da prevenção de CDI em um modelo murino com uma mistura simbiótica, probiótica e prebiótica.
Figura 4. Contagem cecal dos conteúdos cecais agrupados de todos os animais dentro de um grupo.
Figura 5 Histopatologia de tecidos cecais de animais Figura 6 Resultados de qPCR para LAB cecal e bifidobactérias em grupo simbiótico e grupo de controle.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a composições simbióticas compreendendo pelo menos duas cepas probióticas do gênero Lactobacilli (LAB) e/ou Bifidobacteria (Bif) e uma ou mais substâncias prebióticas. Pelo menos uma das cepas bacterianas deveria ter a capacidade de degradar amido, e pelo menos uma das substâncias prebióticas presentes na composição deveria ser amido. As cepas bacterianas deveriam ter a capacidade de aderir ao intestino e inibir toxinas A e B produzidas por C. difficile, mas não o crescimento uma da outra. Além disso, a pelo menos uma ou mais substâncias prebióticas presentes na composição deveriam aumentar o crescimento das cepas probióticas, mas não esse de patógenos gastrointestinais. As composições simbióticas da presente invenção são vantajosamente usadas para a colonização da mucosa intestinal de um sujeito para prevenir, tratar, melhorar sintomas de, e prevenir a recaída de diarreia associada a antibióticos (AAD), e/ou infecções causadas por patógenos gastrointestinais.

No presente estudo mais que 75 cepas probióticas diferentes do gênero Lactobacillus e Bifidobacteria foram tríadas e caracterizadas em relação a propriedades benéficas tais como adesão à camada de muco do intestino, atividades antimicrobianas contra C. difficile (CD) e/ou outros patógenos intestinais, degradação de substâncias prebióticas e a produção de antioxidantes etc. De maneira surpreendente, descobriu-se que estas propriedades são muito específicas a cepa e não gerais para todas as cepas de um gênero.

Lactobacilli pertencem a um grupo de bactérias (microaerofílicas) compreendendo mais que 100 espécies de Lactobacillus diferentes que produzem ácido láctico durante o crescimento. Constituem a parte dominante da flora vaginal normal e do intestino de recém-nascidos, mas também formam parte da flora normal de adultos. Lactobacilli são capazes de crescer em pH baixo e toleram >20 % de bile no meio de crescimento. A produção de ácido láctico torna o seu ambiente ácido, que inibe o crescimento de algumas bactérias prejudiciais. L. acidophilus, L. plantarium, L. casei, L. paracasei, L. reuterí, L. rhamnosus, L. bifidus, e L bulgaricus são algumas espécies importantes do gênero Lactobacillus que podem ser usadas na composição da presente invenção.

Bifidobacteria pertencem a um grupo anaeróbico de bactérias que colonizam o intestino de recém-nascidos e gradualmente diminui com idade. Exercem efeitos benéficos durante o crescimento incluindo a regulação de homeostase microbiana intestinal, a inibição de patógenos e bactérias prejudiciais que colonizam e/ou infectam a mucosa do intestino, a modulação de respostas imunes sistêmicas e locais, a repressão de atividades enzimáticas pró-carcinogênicas dentro da microbiota, a produção de vitaminas, e a bioconversão de um número de compostos da dieta em moléculas bioativas. B. longum, B. breve, B. animalis, B. bifidum, B. infantis são exemplos de espécies do gênero Bifidobacterium que podem ser usadas na composição da presente invenção.

Em seguida à triagem inicial, seis cepas (isto é, LAB LU28, LAB LU 33, Bif LU 10, Bif LU 29 e Bif LU 30) foram eventualmente selecionadas do grupo de mais de 75 cepas probióticas com base nas suas propriedades benéficas como discutido acima. As cepas selecionadas foram depois disso testadas em relação à sua capacidade de sobreviver e multiplicar, bem como exhibir atividade antimicrobiana (AMA) durante o crescimento na presença uma da outra, isto é, durante co-cultura. Todas as cepas selecionadas de bifidobactérias e lactobacilos sobreviveram bem à co-cultura e não produziram substâncias semelhantes a bacteriocinas uma contra a outra.

As cepas selecionadas foram também investigadas em relação à sua utilização de prebióticos tais como galactooligossacarídeos (GOS), Xilo-oligossacarídeos (XOS), oligossacarídeos de isomaltose (IMOS), fructo-oligossacarídeos (FOS), lactulose, goma arábica, beta glucana, xilana, pectina, inulina e/ou solúvel e amido resistente, quando co-cultivadas uma com a outra. Co-cultura de cepas selecionadas probióticas estimularam o crescimento de cepas bacterianas especificas dependendo da sua capacidade de degradação prebiótica nas combinações diferentes de prebióticos. De maneira surpreendente, a co-cultura de uma cepa que não degrada amido e uma cepa que degrada amido, na presença de amido como a única substância prebiótica disponível, estimulou o crescimento da cepa que não degrada amido. A AMA de tais composições foi retida contra CD e outros patógenos intestinais. Isto indicou um novo conceito de alimentação cruzada e demonstra a sinergia exibida entre as cepas da composição da presente invenção. Este conceito é usado ao desenvolver composições ótimas a serem usadas na colonização da mucosa intestinal de um sujeito para prevenir, tratar, melhorar sintomas de e prevenir a recaída de diarreia associada a antibióticos (AAD), e/ou infecções causadas por patógenos gastrointestinais.

Sobrenadante livre de células (CFS) de Co-culturas de duas ou mais das cepas selecionadas com diferentes combinações de prebióticos exibiram AMA contra patógenos ESBL E. coli, S. aureus, C. difficile 2167 e NAPl/027. De maneira surpreendente, AMA foi retida quando o extrato de CFS foi diluído até 1:500 contra alguns patógenos e 1:10 contra outros, uma atividade que foi significativamente mais alta que de cepas crescidas como mono-culturas. Isto claramente mostra que cepas selecionadas exibem sinergismo entre si levando a AΜA alta contra patógenos. Além disso, co-cultura de uma mistura de cepas selecionadas e CD, crescimento reduzido de CD, e produção de Toxina A e B por CD foram fortemente inibidos pela presença das cepas selecionadas probióticas.

Em dita composição é uma vantagem, mas não necessariamente um requisito que uma ou mais das cepas bacterianas sejam expostas a ácido, bile e/ou mucina durante a produção das cepas bacterianas. A exposição a ácido e/ou bile induz respostas a stress nas bactérias que aumentam a sua capacidade de sobreviver ao transporte através do trato gastrointestinal e colonizam a camada de muco intestinal onde produzem atividade antimicrobiana (AMA) possibilitando que as cepas exerçam efeitos benéficos.

A exposição a ácido pode envolver a diminuição do pH do caldo de cultura em que uma ou mais das cepas bacterianas são crescidas em meios MRS até pH 2-5, preferivelmente até pH 2,5-4,5, mais preferivelmente pH a 3-4, por 15-150 min, preferivelmente por 20-140 min, mais preferivelmente por 30-130 min, mais preferivelmente por 40-120 min. A exposição a bile pode envolver a adição de 0,1-2,5 % (p/vol), preferivelmente 0,5-2 %, mais preferivelmente 1,0-1,5 % taurocolato de sódio, ou 1-10 % (vol/vol), preferivelmente 2-7 %, mais preferivelmente 3-10 % de bile porcina, um caldo de cultura por 2-8 h, preferivelmente por 2,5-7 h, mais preferivelmente por 3-6 h durante a produção das cepas bacterianas. A exposição a mucina envolve crescer as cepas bacterianas na presença de 0,01- 1 % (vol/vol), preferivelmente 0,03-0,7 %, mais preferivelmente 0,05-0,5 % mucina por 2-8 h, preferivelmente por 2,5-7 h, mais preferivelmente por 3-6 h durante a produção das cepas bacterianas.

Usualmente bactérias são cultivadas em um meio que é "justo" ótimo para o crescimento. Exposição a ácido, bile ou mucina durante o crescimento é um stress para as bactérias. Como uma defesa, genes de stress são induzidos que por sua vez induzem a produção de Proteínas de Choque Térmico (HSP) e outras proteínas de stress que tornam as bactérias mais robustas. A exposição a stress de ácido e bile mimetizam a condição do trato gastrointestinal. A estabilidade, robustez e sinergia de composições de cepas selecionadas com prebióticos foram confirmadas em um modelo simulador do trato gastrointestinal (GITS) bem como em modelos de camundongo in vivo.

Com base nos estudos em relação a co-cultura, co-alimentação, ΑΜΑ contra CD e patógenos intestinais, atividade de inibição de toxina, capacidade de tolerar a exposição a ácidos, bile e/ou mucina, bem como as simulações in vitro (modelo GITS) e modelos de camundongo in vivo, componentes ótimos da composição da invenção foram selecionados. A composição da invenção compreende pelo menos duas cepas probióticas do gênero Lactobacilli (LAB) e/ou Bifidobacteria (Bif) e uma ou mais substâncias prebióticas. Além disso, pelo menos uma das cepas bacterianas tem a capacidade de degradar amido, e pelo menos uma das substâncias prebióticas presentes na composição é amido.

Vantajosamente, a cepa bacteriana capaz de degradar amido é do gênero Bifidobacteria, tal como, por exemplo, uma espécie de Bifidobacterium breve ou mais especificamente a cepa Bif LU 10. A cepa bacteriana que degrada amido da invenção é capaz de degradar amido tal como amido solúvel (isto é, amido que pode ser degradado no intestino), e/ou amido resistente (isto é, amido que não pode ser degradado no intestino). Vantajosamente, a composição simbiótica da invenção compreende ainda uma cepa que não degrada amido que é da espécie de Lactobacillus paracasei tal como LAB LU 33.

Assim, composições vantajosas da presente invenção compreendem pelo menos Bif LU 10 e uma ou mais das cepas LAB LU 23, LAB LU 28, LAB LU 33, BIF LU 29, e/ou BIF LU 30. Uma composição vantajosa adicional compreende pelo menos Bif LU 10, e LAB LU 33, ou pelo menos BIF LU 10, LAB LU 33, e BIF LU 30. Ainda uma composição vantajosa adicional compreende pelo menos BIF LU 10, LAB LU 33, BIF LU 30, e LAB LU 28. Vantagens das composições descritas são reveladas a seguir.

A composição simbiótica da invenção pode, além de amido, compreender substâncias prebióticas adicionais que são do grupo consistindo em dissacarideos, oligossacarideos, e/ou polissacarideos. O dissacarideo pode ser lactulose. Os oligossacarideos podem ser do grupo consistindo em fructo-oligossacarideos (FOS), galactooligossacarideos (GOS), Xilo- oligossacarideos (XOS), oligossacarideo de quitosana (quioses), oligossacarideos de isomaltose (IMOS), goma arábica, oligossacarideos de soja e pectina. Os polissacarideos podem ser do grupo consistindo em pectina, xilana, inulina, quitosana, arabinoxilana, e/ou β-glucana.

Preferivelmente pelo menos uma ou mais das substâncias prebióticas adicionais além de amido são do grupo consistindo em galactooligossacarideos (GOS), Xilo-oligossacarídeos (XOS), . oligossacarídeos de isomaltose (IMOS), fructo-oligossacarídeos (FOS) e/ou lactulose.

Assim, uma composição da invenção pode, por exemplo, compreender duas ou mais das cepas bacterianas como foi descrito acima, amido e uma ou mais substâncias prebióticas adicionais do grupo consistindo em galactooligossacarideos (GOS), Xilo-oligossacarideos (XOS), oligossacarídeos de isomaltose (IMOS), fructo-oligossacarídeos (FOS) e/ou lactulose.

A composição da presente invenção pode vantajosamente ser usada para colonizar a mucosa intestinal de um sujeito. Como usado no presente documento o termo "sujeito" se refere a qualquer animal ou ser humano vivo em necessidade de tratamento para, ou suscetível a, uma condição envolvendo um micro-organismo gastrointestinal não desejado ou indesejado, por exemplo, um tratamento particular para ter uma infecção por patogênico gastrointestinal não desejado como definido acima. Em modalidades preferidas, o sujeito é um mamífero, incluindo seres humanos e mamíferos não humanos. O seu uso é particularmente vantajoso quando o sujeito é um ser humano.

Em uma modalidade da invenção a composição da invenção é usada para prevenir, tratar, melhorar sintomas de, e/ou prevenir a recaída de diarreia associada a Clostridium difficile (CDAD) e/ou infecções causadas por patógenos gastrointestinais (GI). Como usado no presente documento, o termo "patógenos gastrointestinais" se refere a vírus, parasitas e bactérias que podem causar infecções em um sujeito, por exemplo, quando o sujeito é um mamífero tal como um ser humano. Bactérias patógenas gastrointestinais podem incluir bactérias do gênero Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Campylobacter jejuni, Clostridium, Escherichia coli, Yersinia, Vibrio cholerae, e outros.

Vantajosamente a composição pode ser usada para prevenir, tratar, melhorar sintomas de, e/ou prevenir a recaída de diarreia associada a antibióticos (AAD) induzida por cepas de Clostridium difficile de diferente virulência e ribotipos. Clostridium difficile é uma espécie anaeróbica do gênero Clostridium que.em baixas contagens formam parte da flora intestinal normal. C. difficile é a causa mais ’séria de diarreia associada a antibióticos (AAD) e pode levar a colite pseudomembranosa, uma infecção severa do cólon, com frequência resultando de erradicação da flora intestinal normal por antibióticos. Durante o crescimento C. difficile produz e secreta fatores de virulência, por exemplo, Toxina A e B. Toxina A é tóxica para todas as células, enquanto a Toxina B é tóxica para os enterócitos, uma vez que danifica as células e induz a secreção (diarreia). A composição da invenção pode ser usada para prevenir, tratar, melhorar sintomas de, e prevenir a recaída de diarreia associada a antibióticos (AAD) induzida por cepas de Clostridium difficile do grupo consistindo em ribotipos CD NAPl/027, CD 1939, CD2167, CD 1958, CD 2165, CD 2166, CD2168, CD 027 e CD 1551.

Um aspecto adicional da invenção proporciona um uso da composição descrita acima, para a fabricação de um medicamento para uso na colonização da mucosa intestinal de um sujeito e para prevenir, tratar, melhorar sintomas de, e prevenir a recaída de diarreia associada a antibióticos (AAD), e/ou infecções causadas por patógenos gastrointestinais em dito sujeito.

Um aspecto adicional da invenção proporciona um uso da composição descrita acima, para a fabricação de um medicamento para uso no tratamento de um sujeito que sofre de diarreia associada a antibióticos (AAD), e/ou infecções causadas por patógenos gastrointestinais.

Um aspecto adicional da invenção proporciona um uso da composição descrita acima, para a fabricação de um medicamento para uso na prevenção de uma recaída de diarreia associada a antibióticos (AAD), e/ou infecções causadas por patógenos gastrointestinais em um sujeito.

As substâncias prebióticas e cepas probióticas da composição na presente invenção podem ser isoladas em qualquer nível de pureza por métodos padrão e purificação pode ser conseguida por meios convencionais conhecidos aos técnicos no assunto, tal como destilação, recristalização e cromatografia.

As células bacterianas cultivadas a serem usadas na composição são separadas do caldo com qualquer método incluindo, sem limitações, centrifugação, filtração ou decantação. As células separadas do caldo de fermentação são opcionalmente lavadas pela água, salina (0,9 % de NaCl) ou com qualquer tampão adequado. A massa de células úmidas obtida pode ser seca por qualquer método adequado e preferivelmente por liofilização.

As substâncias prebióticas e cepas probióticas da composição na presente invenção podem ser administradas em separado ou em combinação com carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, e tal administração pode ser levada a cabo em doses únicas ou múltiplas.

Em uma composição da presente invenção, o componente prebiótico está presente em uma quantidade compreendida de 5 a 99 % em peso, com base no peso total da composição; preferivelmente de 30 % a 95 %, mais preferivelmente de 50 a 90 % em peso. Por sua vez, o componente probiótico está presente em uma quantidade compreendida de 1 a 15 % em peso, com base no peso total da composição; preferivelmente, de 5 a 10 %. A parte que falta até 100 % em peso da composição simbiótica, se houver, consiste nas substâncias adicionais tais como adjuvantes e/ou excipientes ou aditivos/carreadores apropriados.

Em uma composição farmacêutica (por exemplo, comprimidos) a composição da invenção está compreendida de 40 a 70 % em peso, com base no peso total da composição farmacêutica, e a parte restante é feita de adjuvantes e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em uma composição de alimentos (por exemplo, iogurte ou chocolate) a composição simbiótica está compreendida de 1 a 15 % em peso, com base no peso total da composição de alimentos.

Em uma modalidade preferida, a composição simbiótica contém cepas bacterianas em uma quantidade compreendida de 1x108 a 1x1013 UFC/g, com relação ao peso da composição simbiótica, preferivelmente de 1x109 a 1x1011 UFC/g.

As composições podem, por exemplo, estar na forma de comprimidos, pílulas, sachés, viais, cápsulas duras ou moles, suspensões aquosas ou oleosas, soluções aquosas ou oleosas, emulsões, pós, grânulos, xaropes, elixires, pastilhas, pós reconstituíveis, preparações líquidas, cremes, troches, balas duras, sprays, cremes, pomadas, geleias, géis, pastas, soluções injetáveis, aerossóis líquidos, formulações em pó seco, aerossóis de HFA ou sais de adição de ácido orgânico ou inorgânico.

As composições da invenção podem estar em uma forma adequada para administração através das vias orais, ou por inalação ou insuflação (por exemplo, nasal, traqueal, bronquial).

Para administração oral, bucal ou sublingual, as substâncias prebióticas e cepas probióticas da presente invenção podem ser combinadas com vários excipientes. Composições liquidas para administração oral podem estar na forma de, por exemplo, emulsões, xaropes, ou elixires, ou podem ser apresentadas como um produto seco para reconstituição com água ou outro veiculo adequado antes do uso. Outras cargas, ligantes, desintegrantes, lubrificantes e excipientes adicionais adequados são bem conhecidos a um técnico no assunto.

A invenção também pertence a uma composição como definida acima, em que a composição é pelo menos uma de ou parte de uma composição de alimentos, um suplemento alimentar, uma composição nutracêutica, uma composição farmacêutica e ração animal.

Um aspecto adicional da invenção proporciona um método para a colonização da mucosa intestinal, e a prevenção, tratamento, melhora de sintomas de, e prevenção de uma recaída de diarreia associada a antibióticos (AAD) e/ou infecções causadas por patógenos gastrointestinais em um sujeito, dito método compreendendo as etapas de administrar a composição como descrita acima em uma dose eficaz ao sujeito em necessidade do mesmo. Dependendo do transtorno e paciente a ser tratado e a via de administração, as composições podem ser administradas em doses variadas. Em uma modalidade preferida, a composição contém cepas bacterianas em uma quantidade compreendida de 1x107 a 1x1013 UFC/dose e cepa bacteriana, preferivelmente de 1x109 a 1x1011 UFC/dose e cepa bacteriana.

As vantagens da presente invenção serão agora ilustradas por meio de experimentos. No entanto, os experimentos descritos mencionados a seguir são somente dados como exemplos e não deveriam ser limitativos à presente invenção. Outras soluções, usos, objetivos, e funções dentro do escopo da invenção como nas reivindicações deveriam ser aparentes para o técnico no assunto.

Razão para a seleção de cepas para a composição da invenção

Os principais critérios de seleção para a maioria das cepas prometedoras de um banco de cepas usado foram atividade antimicrobiana (AMA) contra patógenos intestinais incluindo Clostridium difficile, e capacidade de aderir à parede intestinal, como medido por ligação a vermelho Congo (CRB) e teste de agregação de Sal (SAT). O seguinte critério foi a fermentação de pelo menos um ou mais que uma substância prebiótica. Os resultados de triagem das cepas testadas são apresentados na Tabela 1.

Hidrofobicidade de superfície celular (CSH) é uma importante propriedade de um micróbio para se ligar e interagir no intestino e competir com patógenos na camada de muco. CSH foi determinado com base em ensaios de CRB e SAT como a seguir. CRB foi realizada incubando células lavadas com vermelho Congo (100 microgramas/ml em PBS) por 10 min seguido por centrifugação (9.000 g * 30 min). Vermelho Congo residual no sobrenadante foi determinado medindo a absorbância a 480 nm. O vermelho Congo em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,2, 0,015 M) foi usado como controle. CRB é expresso como porcentagem de ligação de vermelho Congo. Portanto quanto mais próximo o resultado é de 100 mais alta é a hidrofobicidade da superfície celular. CSH foi determinado pelo Teste de agregação de sal (SAT) Dez microlitros de suspensão de células lavadas em PBS foram misturados com 10 microlitros de sulfato de amónio a pH 6,8 de várias molaridades vairando de 0,02 M a 4 M em uma lâmina de vidro. Após um minuto foi observada agregação. Os resultados de SAT são expressos como a menor concentração do sal (M) na qual a cepa agrega. Concentração de sal menor necessária para agregação significa hidrofobicidade de superfície celular mais alta.

A AMA das cepas probióticas potenciais foi determinada contra os patógenos intestinais ESBL E. coli, S. aureus, Salmonella typhimuríum e quatro cepas diferentes de C. difficile usando um ensaio de placa de microtitulação (MTP) como a seguir: Filtrados de cultura de sobrenadante livre de células (CFS) foram colhidos de culturas de 24 h de lactobacilos e bifidobactérias crescidos em MRS (De Man Rogosa Sharpe) e caldo de MRSC (MRS com cloridrato de L-cisteína a 0,05 % (p/v) ) por centrifugação (3.200 g, 20 min, 4°C) e o sobrenadante foi esterilizado em filtro usando filtro de 0,2 micrômetros. Para determinar AMA, o CFS foi adicionado a um MTP. Diferentes diluições (1:1, 1:10, 1:100 e 1:500) foram preparadas em caldo de infusão de coração e cérebro esterilizado (BHI). 100 microlitros do sobrenadante foram adicionados a poços de microtitulação e incubados a 37°C durante a noite anaerobicamente usando um sistema de cultura Anoxomat® (MART, Países Baixos) para equilibrar. Células de patógeno do intestino foram crescidas em placas de agar Fructose Fastidious por 24 h anaerobicamente. As células foram lavadas duas vezes em PBS, e ressuspensas em PBS estéril. Dez microlitros de células de patógeno do intestino com A620 = 0,02 foram preparados em caldo BHI e adicionados ao MTP pré-reduzido durante a noite. O crescimento foi medido após 48 h (patógenos CD) / 24 h (outros patógenos) a OD62o usando um leitor de placa e o resultado foi expresso como porcentagem de inibição de crescimento de patógeno do intestino calculado em relação a crescimento em poço de controle sem CFS.

ODt e ODc representam o crescimento de CD na presença e ausência de CFS de LAB ou bifidobactérias. De maneira similar, AMA de extrato co-cultivado de lactobacilos e bifidobactérias foi determinada contra CD. A mesma fórmula foi usada para todos os patógenos intestinais.

Uma triagem preliminar da capacidade de cepas probióticas potenciais para degradar prebióticos foi realizada como a seguir: cepas de Lactobacilli e Bifidobacteria foram inicialmente crescidas em agar MRS/MRSC sob condição micro-aerofílica e anaeróbica a 37ºC. Uma única colônia de cada cepa foi então espalhada como um pequeno emplastro em agar MRS basal sem glicose e com 1 % (p/vol) de prebiótico (Frutooligossacarideos (FOS), Xilooligossacarideos (XOS), galactooligossacarideos (GOS), Inulina, amido solúvel (SS), amido resistente (RS) , pectina, isomaltooligossacarideos (IMOS), Lactulose) para Lactobacilli ou agar de extrato de levedura de proteose peptona (PY) suplementado com 0,05 % (p/v) de agar de cloridrato de L-cisteina para bifidobactérias com 1 % (p/vol) de prebiótico (FOS, FOS (Orafti) , XOS, GOS, Inulina, SS, RS, pectina, IMOS, Lactulose) como a fonte principal de carbono, e 30 mg de púrpura de bromocresol por litro e foi incubado sob condição microaerofílica (para lactobacilos) ou anaeróbica (para bifidobactérias) a 37°C por 48 h. A capacidade de degradação de FOS, FOS (Orafti), XOS, GOS, inulina, SS, RS e pectina por vários LAB e bif idobactérias pode ser visto na Tabela 1 (ver nota de rodapé).

Tabela 1. Resultados de triagem para ligação a vermelho Congo, teste de agregação de sal, AMA e degradação de prebióticos.

Abreviações são como a seguir: - H- Alta atividade--≥70 % de inibição, Moderada-- 41-69 % de inibição, Baixa ≤40 % de inibição, nd- não determinado; Vw+ - muito fraca; 2+ fortemente positiva; 3+ muito fortemente positiva. Com base nos resultados dos experimentos apresentados na Tabela 1, cepas probióticas apresentadas na Tabela 2 foram selecionadas para experimentos adicionais.

Com base nos resultados dos experimentos apresentados na Tabela 1, cepas probióticas apresentadas na Tabela 2 foram selecionadas para experimentos adicionais.

Com base nos resultados dos experimentos apresentados na Tabela 1, cepas probióticas apresentadas na Tabela 2 foram selecionadas para experimentos adicionais.
Tabela 2. Lista selecionado de candidatos de probiótico.

As cepas selecionadas probióticas foram depositadas em 24 de novembro de 2010 com as Coleções Belgas Coordenadas de Micro-organismos (BCCM), Laboratorium voor Microbiologie Bacterienverzameling (LMG), Universiteit Gent, K.L. Ledenganckstraat 35, 9000 Gent, Bélgica (sitio Web: http://bccm.belspo.ser) com os seguintes números de depósito de Cepa: LAB LU 33: LMG P-26118, LAB LU 28: LMG P-26120, BIF LU 10: LMG P-26117, BIF LU 30: LMG P- 26116, BIF LU 29: LMG P-26115, LAB LU 23: LMG-P-26119

Co-cultura de cepas probióticas

Diferentes combinações das cepas de bifidobactérias e LAB selecionadas (Tabela 2) foram testadas para determinar uma possível sinergia e compatibilidade destas cepas uma com a outra. Para determinar se substâncias semelhantes a bacteriocinas são produzidas por uma cepa específica, AMA de extratos neutralizados de cada cepa foi determinada contra outras cepas usando o ensaio de MTP. Extratos de AMA foram obtidos como no procedimento experimental descrito como acima.

CFS obtido como no procedimento experimental descrito acima foram neutralizados até pH 7 usando 5N NaOH. AMA de CFS neutralizado de bifidobactérias e lactobacilos selecionados foi determinada uma contra a outra usando um ensaio de MTP. Extratos neutralizados de cepas selecionadas de lactobacilos ou bifidobactérias usados no estudo não exibiram AMA uma contra a outra (lactobacilos ou bifidobactérias). Além disso, não inibiram outros lactobacilos e bifidobactérias que foram usados como cepas de referência, indicando que as cepas selecionadas de bifidobactérias e lactobacilos não produzem substâncias semelhantes a bacteriocinas uma contra a . outra. Esta propriedade das cepas foi útil no desenvolvimento de misturas de cepas adequadas em uma "formulação simbiótica" para prevenir e tratar a infecção causada por patógenos intestinais e C. difficile.

Muitas infecções gastrointestinais são causadas por Salmonella, Campylobacter jejuni, e ESBL E. colí, enquanto AAD é principalmente causada por CD e MRSA. Portanto, após confirmar que as cepas selecionadas de LAB e bifidobactérias da Tabela 2 não inibem uma a outra, foram co- cultivadas em caldo MRSC e a sua AMA potencial contra CD incluindo CD 027 /NAP1 hipervirulenta, ESBL E. coli, S. aureus, e Salmonella typhimurium foi determinada usando um ensaio de MTP.

Cultura ativada das cepas selecionadas de LAB e bifidobactérias da Tabela 2 foram co- cultivadas inoculando 10 % de inóculo de cepa (total de todas as cepas) de LAB e/ou bifidobactérias diferentes em 5 ml de caldo MRSC pré-reduzido e deixada para crescer sob condições anaeróbicas usando uma jarra Anoxomat a 37°C por 24 h. Após 24 h, as culturas foram colhidas por centrifugação e o sobrenadante foi esterilizado em filtro usando filtro de 0,22 micrômetros. O CFS foi usado para determinar AMA contra CD e outros patógenos usando ensaio de MPT como foi descrito acima ou anteriormente. O crescimento foi medido após 48 h (patógenos CD) / 24 h (outros patógenos) a OD62o usando um leitor de placa e o resultado foi expresso como porcentagem de inibição de crescimento de patógenos calculado em relação ao crescimento em poço de controle sem CFS.

Co-culturas de diferentes combinações de LAB LU 28, LAB LU 33, Bif LU 10 e Bif LU 30 mostraram AMA alta contra Salmonella typhimurium, E. coli, C. difficile CD NAPl/027 e S. aureus. De maneira surpreendente, AMA foi retida quando o extrato de CFS foi diluído até 1:500 contra patógenos (CD 027 e S. aureus) e 1:10 contra S. typhimurium e ESBL E. coli, que não foi encontrado quando cepas foram testadas como mono-culturas (Tabela 3 & Tabela 4). A composição contendo LAB LU 28, LAB LU 33, Bif LU 10 e Bif LU 30 mostraram AMA mais alta a diluição de 1:10 contra S. typhimurium e ESBL E. coli que foi encontrado com- outros combinações (Tabela 4). Isto claramente mostra que cepas selecionadas exibem sinergismo entre as cepas levando a AMA alta contra patógenos.
Tabela 3. AMA de diferentes combinações de co-culturas contendo cepa probiótica contra C. difficile NAPl/027, C. difficile 2167 e MRSA S. aureus

- Nenhuma inibição, nd Não determinado, CFS é obtido de MRSC contendo 2 % de glicose e crescido anaerobicamente
Tabela 4. AMA de diferentes combinações de co-culturas contendo cepas probióticas contra Salmonella typhimurium e E. coli

- Nenhuma inibição, nd Não determinado, CFS é obtido de MRSC contendo 2 % de glicose e crescido anaerobicamente

Além disso, AMA produzida pelas cepas selecionadas contra C. difficile se correlacionaram bem com a quantidade reduzida de toxina produzida pela cepa hipervirulenta CD NAP1/027. Nenhuma toxina foi detectada da cepa CD NAP1/027 quando crescida na presença de extrato de CFS de cepas co-cultivadas selecionadas diluídas até 1:10. Quando o extrato de NAP1/027 contendo altas quantidades de toxina A e toxina B foi incubado com LAB e bifidobactérias vivas, a toxicidade foi inibida, indicando que as cepas selecionadas de LAB e bifidobactérias exibem atividade antitoxina. AMA de CFS produzido por diferentes combinações de LAB LU 28, LAB LU 33, Bif LU 10 e Bif LU 30 é atribuída não somente a ácidos, mas também a proteínas/peptídeos antimicrobianos extracelulares estáveis ao calor. Uma composição compreendendo as cepas LAB LU 28, LAB LU 33, Bif LU 10 e Bif LU 30 mostraram AMA contra cepa hipervirulenta de CD NAP1/027, S. aureus, S. typhimurium e ESBL E. coli (Tabela 3 & Tabela 4) .

Além disso, a combinação de cepas probióticas selecionada acima foi co-cultivada com CD NAPl/027 em extrato de glicose de protease peptona de levedura com meios de 0,05 % (p/v) de cloridrato de L-cisteína (pH 7,2). CD NAPl/027 mostrou uma redução de 2 log de ufc em crescimento e as produções de toxina A e toxina B de CD foram fortemente inibidas após 24 h de crescimento em comparação com CD crescido em separado em PYG. Pode, portanto ser concluído que uma composição incluindo duas ou mais das cepas LAB LU 28, LAB LU 33, Bif 10 e Bif 30 exibe sinergia levando a AMA aumentada contra patógenos intestinais.

Co-alimentação: Probióticos+ Prebióticos

Para desenvolver um probiótico multi-cepa ou um simbiótico, é importante selecionar cepas eficazes com alta pontuação prebiótíca e/ou índice prebiótico para restaurar a microbiota intestinal com micróbios benéficos no intestino do sujeito.

A triagem inicial incluiu FOS, GOS, XOS; IMOS e Lactulose (Tabela 5) . Também, outros polissacarídeos naturais como amido resistente (RS) de trigo, goma arábica, beta glucana, xilana, pectina e inulina foram avaliados para o seu potencial prebiótico.

FOS é bem conhecido pelo seu efeito bifidogênico e lactogênico, mas pode causar irritação na mucosa em seres humanos e aumentar a translocação de Salmonella enterica em camundongos tratados com antibióticos, uma desvantagem que encoraja os inventores a triar GOS, IMOS, XOS e lactulose como prebiótico em vez de FOS.

A maioria das cepas probióticas selecionadas (Tabela 2) degradaram mais que um componente prebiótico (Tabela 5). Uma pontuação prebiótica (PS) foi desenvolvida para cada cepa selecionada pela determinação do crescimento relativo de cada cepa em um prebiótico individual em comparação com glicose.
Tabela 5. Pontuação prebiótica para LAB e bifidobactérias

Definição de pontuação: -, Nenhuma degradação (0 mm); +, degradação Fraca (1 mm); 2 + , Moderada (2 mm); 3 + , Forte (3 mm) & ND, Não determinado.

Co-cultura de probióticos misturados com diferentes combinações de prebióticos

No experimento de co-cultura acima, foi mostrado que as cepas selecionadas eram compatíveis uma com a outra uma vez que não exibiram AMA uma contra a outra. As mesmas cepas selecionadas foram co-cultivadas na presença de um único prebiótico, uma combinação de prebióticos e uma combinação de prebióticos com SS sob condições de pH incontrolado, para investigar mais a possibilidade de sinergismo entre as cepas probióticas.

As cepas LAB LU 28, LAB LU 33, BIF LU 10 e BIF LU 30 foram misturadas e sub-cultivadas em agar MRSC a 37 °C por 48 h. Colônias únicas foram inoculadas em 5 ml de um caldo MRSC pré-reduzido e sub-cultivadas três vezes. Cada cultura foi colhida, lavada como acima e ressuspensa em PBS. As quatro cepas selecionadas probióticas foram inoculadas como uma mistura para conseguir uma absorbância final de 0,5 unidades (isto é, 0,125 por cepa) em 5 ml de caldo MRSC pré-reduzido com 1 % (p/v) (um) GOS, IMOS e amido solúvel (SS) em uma mistura (1:1:1), (b) IMOS e GOS (1:1), (c) GOS e SS (1:1), (d)GOS e (e) tubos SS foram incubados sob condição anaeróbica por 24 h. Amostras colhidas após 0, e 24 h e 100 microlitros de caldo de cultura foi serialmente diluídos e 50 microlitros foram espalhados em agar MRS (para LAB) e agar Bereens (para bifidobactérias), para determinar as contagens viáveis em termos de UFC/ml.

O número total de Lactobacillus e bifidobactérias em diferentes combinações de prebióticos individuais e misturados é mostrado na Tabela 6. Com glicose (GLU), GOS e IMOS/GOS, as contagens totais de bifidobactérias foram mais altas que LAB total. Com SS, os aumentos em número de LAB e bifidobactérias foram iguais. Com SS/GOS e SS/IMOS/GOS, contagens totais de LAB foram mais altas que contagens de bifidobactérias. A ordem de aumento em log de ufc/ml para LAB é SS/IMOS/GOS > SS/GOS >GOS > SS > IMOS/GOS > GLU e para bifidobactérias IMOS/GOS > GOS >GLU > SS/IMOS/GOS > SS > SS/GOS (Tabela 6).
Tabela 6. Lactobacilos totais e bifidobactérias totais durante o experimento de co-cultura após 0 e 24 h de crescimento.

Co-cultura de LAB LU 33 e Bif LU 10 em amido solúvel para co-alímentação

Para elucidar uma possível co-alimentação e aumento de crescimento da cepa que não degrada amido LAB LU 33 com a cepa que degrada amido Bif LU 10, estas cepas foram co-cultivadas em caldo MRSC com 1 % (p/v) de SS como única fonte de carbono. A co-cultura de Bif LU 10 e LAB LU 33 melhorou o crescimento de LAB LU 33.. Os metabólitos intermediários produzidos durante a degradação de amido suportou o crescimento de LAB LU 33 (Tabela 7). A degradação de amido é importante para manter um ambiente de cólon normal, e melhorar o crescimento de outros micróbios benéficos para restaurar a microflora do intestino. A diminuição em pH durante o metabolismo de amido não inibiu LAB LU 33, e ambas estas cepas são compatíveis uma com a outra e mostram atividade sinergistica. A sinergia exibida por LAB 33 e Bif LU 10 de maneira surpreendente se tornou especifico de cepa. Quando LAB LU 28, também uma cepa que não degrada amido, e Bif LU 10, foram crescidas na presença de RS, o crescimento de LAB LU 28 não foi estimulado. A mesma observação foi feita quando a bem conhecida cepa probiótica L. rhamnosus GG, uma cepa que não degrada amido, foi co-cultivada com a cepa que degrada amido Bif LU 10 na presença de SS; o crescimento de L. rhamnosus GG não foi estimulado. Estes dois exemplos indicam que a alimentação cruzada é especifica para cepas selecionadas usada em combinação uma com a outra. A alimentação cruzada aparentemente não é uma propriedade óbvia mesmo entre cepas do mesmo gênero.
Tabela 7. Co-alimentação de LAB que não degrada amido com Bif LU 10 que degrada amido em SS

Aumento liquido em log de ufc de LAB em um co-cultura é calculado usando a fórmula =(Log de ufc a T 48h - Log de ufc a T0h de F8 com B 46+ amido solúvel) - (Log de ufc a T 48h -Log de ufc a T0h de F8 na presença de amido solúvel) .

AΜΑ de extrato co-cultivado contra patógenos humanos AMA de extratos de duas ou mais das cepas selecionadas (Tabela 2) co-cultivadas com diferentes combinações de prebióticos foi determinado contra patógenos intestinais. Foi encontrado- que todos CFS crescido com diferentes combinações de prebióticos exibiram AMA contra patógenos ESBL E. coli, S. aureus, C. difficile 2167 e NAP1/027 (Tabela 8). Quando o CFS de extrato co-cultivado foi incubado com extrato de CD contendo toxina, >70 % do efeito tóxico foi inibido, indicando que os ácidos produzidos no CFS exibem atividade antitoxina.
Tabela 8. AMA exibida pelas cepas selecionadas LAB LU 28, LAB LU 33, Bif LU 10 e Bif LU 30 durante co-cultura em diferentes combinações de prebióticos.

- sem inibição, nd- não determinado, CFS foi obtido de MRS-BB contendo 1 % de prebióticos total ou glicose.

# nível de toxina não foi detectado nestas amostras isto é, as toxinas foram inibidas; toxina A e toxina B, fator de virulência responsável pela infecção de CD determinado por ensaio de ELISA.

Pode ser concluído que as cepas selecionadas na presente composição possuem alta capacidade de degradar prebióticos. O co-cultivo das cepas selecionadas com diferentes combinações de prebióticos deram diferentes razões de LAB/bif dependendo da capacidade das cepas para degradar prebióticos. Também foi encontrado que o metabolismo pela cepa que degrada amido Bif LU 10 estimulou o crescimento da cepa que não degrada amido LAB LU 33. Deveria também ser ressaltado que as cepas selecionadas exibiram AMA alta contra patógenos intestinais, dependendo da combinação de diferentes prebióticos utilizados durante a cultura (ver Tabela 8).

Co-alimentação: Patógeno + prebióticos

Como foi descrito acima, C. difficile, ESBL E. coli, S. aureus, S. typhimurium, são patógenos humanos. Portanto é essencial examinar se tais patógenos são capazes de degradar e utilizar os prebióticos presentes na mistura simbiótica. Os testes mostraram que nenhum dos patógenos humanos; cinco isolados clínicos de C. difficile incluindo a cepa hipervirulenta NAP1/027, S. aureus, ESBL E. coli, e S. typhimurium do Hospital LU foram capazes de utilizar FOS, GOS, IMOS, XOS, inulina, RS, SS, pectina ou xilana. Portanto, patógenos humanos não exibiram capacidade de degradação prebiótica que é muito encorajador para o desenvolvimento de um coquetel de probióticos e prebióticos para combater infecção intestinal.

Pulso de Stress e simulação in vitro do trato gastrointestinal (GIT) para a avaliação de cepas selecionadas

Um método in vitro simples e confiável foi desenvolvido para simular in vivo as condições do trânsito gástrico. Isto foi feito pela exposição das cepas selecionadas probióticas a um ácido combinado (durante 30 min) , e pulso de stress de bile por 4 h para imitar o trânsito gastrointestinal (GITS) in vivo a 37°C, aerobicamente (LAB) e anaerobicamente (bifidobactérias). Em primeiro lugar as células foram submetidas a stress de ácido no meio MRSC/MRS a pH 2,5. Após 30 min, as células foram lavadas com PBS e estressadas com MRSC/MRS compreendendo bile porcina a 5 % (v/v) por 4 h. A viabilidade das cepas foi determinada após 30 min e 4 h. caldo MRSC sem ácido ou stress de bile foi usado como um controle. Para estudar a capacidade de degradação prebiótica das células pulsadas estressadas, foram também lavadase inoculadas em caldo MRSC com diferente prebióticos ou glicose. Células não estressadas foram usadas como controle.

Três cepas, LAB LU 28, LAB LU 33 e LGG, mostraram 100 % de viabilidade após pulso de stress. BIF LU 30 e Bif LU 10 mostraram 100 e 40 % de viabilidade respectivamente ao final da fase de bile no modelo de trânsito GI. A cepa de referência, B. lactis JCM 10602 (Bbl2), mostrou 85 % de viabilidade após trânsito GI. A ordem de robustez, isto é, tolerância em uma simulação de trânsito similar ao GI é como a seguir: Bif LU 30 > B. lactis JCM 10602 > Bif LU 10.

Idealmente in vivo, as cepas selecionadas alcançam várias partes do intestino em uma forma viável e se multiplicam bem usando prebióticos como alimento com a finalidade de exercer suas funções probióticas. A capacidade das cepas na mistura de probióticos de metabolizar suplementos prebiótico foi analisada em um Trânsito similar ao GI, isto é, após pulso de stress. Células com pulso de stress e não estressadas de LAB LU 28 mostraram um crescimento similar com GOS e glicose. Células com pulso de stress de Bif LU 10 mostraram fase lag mais longa, mas após 24 h seu padrão de crescimento foi similar a aquele de células não estressadas na presença de IMOS, GOS e FOS. Além disso, o crescimento de Bif LU 10 com pulso de stress foi mais alto em GOS, IMOS, FOS em comparação com glicose. A cepa' Bif LU 30 mostrou a mesma cinética de crescimento como as células não estressadas quando crescido com GOS, XOS e glicose.

Para uma composição, as cepas probióticas serão selecionadas com base na robustez (isto é, pulso de stress), AMA contra C. difficile e outros patógenos entéricos, a capacidade de uso prebióticos, a capacidade de alcançar o intestino sem perder sua atividade metabólica, a capacidade de se multiplicar na presença de prebióticos de uma mistura simbiótico e exercer seus efeitos probióticos.

CFS de LAB LU 28 e LAB LU 33 crescidas na presença de 5 % de bile porcina reteve mais que 60 % de AMA contra S. aureus, S. typhímuríum, C. difficile 2167 e C. difficile NAP1/027. Bif LU 10 e Bif LU 30 crescidas na presença de 5 % de bile porcina reteve mais que 60 % AMA contra C. difficile 2167 e C. difficile 027. As cepas selecionadas cresceram na presença de 5 % de bile porcina reteve AMA contra C. difficile e outros patógenos gastrointestinais (incluindo S. typhimurium, ESBL E. coli, S. aureus).

Células robustas produzidas após pulso de stress serão úteis para produzir rendimento celular mais alto durante liofilização e o empacotamento final de . formulação simbiótica com prebióticos e RS.

Uso de um Simulador do trato gastrointestinal (GITS) para avaliar a sobrevivência de cepas selecionadas probióticas em culturas misturadas.

O GITS consiste em um fermentador "Biobundle" de 1 L, um biocontrolador ADI 1030 e balanças, conectado ao PC e é controlado por um programa de cultivo "BioXpert". A temperatura, o pH, o volume de cultura, a agitação, o conteúdo de oxigênio e as taxas de velocidade de líquidos (isto é, HC1, NaHC03, sais de bile, meio de alimentação) são controladod pelo programa. 0 GITS é um fermentador com diversos vasos (P1-P5) que simulam o trato gastrointestinal (Figura 1).

Uma suspensão bacteriana é injetada e permanece no primeiro vaso que simula o estômago (pH 3,0), durante 3 h. A suspensão bacteriana é depois disso bombeada em um segundo vaso que simula o intestino delgado com bile, pH 6,5, e o intestino grosso (diluição, pH 6,0).

No início de simulação, 100 ml de 0,01 M de HC1 foram adicionados em fermentados para simular o estômago vazio. As cepas selecionadas de probióticos multicepas (i) Bif LU 10, Bif LU 29, LAB LU 28 (ii) Bif LU 10, Bif LU 29, Bif LU 30, LAB LU 28 (iii) Bif LU 10, Bif LU 30, LAB LU 28, LAB LU 33 em 200 ml "alimento modelo " com meio contendo extrato de levedura triptona contendo cisteína HC1 com mistura de prebióticos: FOS, GOS, XOS foram bombeadas no fermentador.

Como é mostrado na Figura 1, Pl, P2, P3, P4, e P5 mostram os pontos de amostragem chave que correspondem ao início do experimento (Pl), fase gástrica (P2), fase de bile (P3) ; fase de diluição para remover bile (P4) e no final do experimento (P5). O pH no vaso foi titulado a 3,0 pela adição de 1 M de HC1 a uma taxa de 20 mmol h”1 para simular as condições do estômago. Após pH 3 ter sido alcançado, o conteúdo do biorreator foi ajustado até pH 6,0 pela adição de 1 M de NaHC03. Bile porcina (30 ml de solução a 30 %) até 3 % foi adicionado ao fermentador e incubado por 30 min. O conteúdo foi diluído até experimento total por 24 h com um meio de diluição contendo extrato de levedura com triptona contendo cisteína HC1 com uma mistura de prebióticos de FOS, GOS, XOS (3g/L por pprebiótico). Bctérias formadoras de colônia foram enumeradas como foi descrito acima no experimento de co-cultura durante diferentes fases da simulação. A análise de fingerprinting REP-PCR com primer (GTG)5 foi realizada por 20-40 colônias selecionadas do início e do final dos experimentos. As células bacterianas foram quantificadas em termos de número de cópioas de DNA total usando qPCR. As concentrações de ácidos orgânicos (lactato, acetato, formato) e etanol nos meios dee cultura foram analisados por cromatografia líquidas (sistema Alliance 2795), usando uma coluna BioRad HPX-87H (Hercules, CA) com eluição isocrática de 0,005 M H2S04 a uma taxa de fluxo de 0,6 mL min-1 e a 35 °C. Detector de índice refrativo (RI) (modelo 2414; Waters Corp) foi usado para a detecção e quantificação das substâncias.

Em uma composição contendo Bif LU 10, Bif LU 29, e LAB LU 28 e a mistura de prebióticos FOS, XOS ou GOS, as cepas Bif LU 10 e LAB LU 28 sobreviveram bem durante as condições de GIT simuladas (Tabela 9) . Uma diminuição de Bif LU 10 foi mais pronunciada durante a incubação de ácido e bile e aumentada durante a fase de diluição. (Os números de BIF LU 29 foram significativamente menores no final do experimento e essa cepa não foi detectada na cultura).
Tabela 9. Números bacterianos (log10 ufc ml-1) como contado em agar MRS. O número total foi enumerado em MRS-C agar anaerobicamente, LAB LU 28 em agar MRS aerobicamente.

Produção de lactato, acetato e etanol em uma razão de 2:5:1 sugere melhor crescimento de bifidobactérias durante a fase de "intestino grosso". No entanto, lactobacilos pode teoricamente produzir acetato também sob condições de glicose limitada.

Com uma composição contendo Bif LU 10, Bif LU 29, Bif LU 30, LAB LU 28 em quantidades iguais no inicio do experimento, a distribuição de cepa foi de cerca de 73 % de LAB LU 28, 21 % de Bif LU 30 e 6 % de Bif LU 10 no final do experimento de GITS. Estes resultados indicam boa sobrevivência e crescimento de Bif LU 10, Bif LU 30 e LAB LU 28 nesta combinação. Com uma composição contendo as cepas LAB LU 28, LAB LU 33, Bif LU 10 e Bif LU 30 com uma mistura de prebióticos contendo FOS, XO S, GOS, nenhuma diminuição significativa nos números de LAB ou bifidobactérias foi detectada no final do experimento de GITS.

Cada biomassa foi analisado por qPCR para números de cópias de DNA total das cepas de LAB e bifidobactérias bem como a proporção de LAB LU 28, LAB LU 33, Bif LU 10 e Bif LU 30 (Figura 2). Os resultados mostraram que os números de cópias log de LAB LU 28, LAB LU 33, e Bif LU 30 permaneceram os mesmos após 20 h e no final do experimento.

As cepas LAB LU 28 e LAB LU 33 sobreviveram ao stress de ácido e bile bem e foram capazes de crescer com oligossacarideos como fonte de carbono. A proporção de LAB LU 28 e LAB LU 33 em comparação com as outras cepas presentes na mistura aumentou significativamente durante a simulação, de acordo com os resultados do rep-PCR.

Bif LU 10 e Bif. LU 30 foram detectadas no final de experimento, embora a sua proporção na mistura de probióticos tivesse diminuído durante a simulação. A Bif LU 29 é menos tolerante a bile e as contagens foram sempre inferiores em comparação com as outras cepas no início do experimento e não foram detectadas no final do experimento.

No início da simulação, as contagens de colônias de LAB foram sempre mais altas em comparação com a Bif LU 10 e Bif LU 30, e LAB foram capazes de multiplicar de maneira bem-sucedida durante a fase de diluição. As bifidobactérias se recuperaram melhor do stress de ácido/ bile que as cepas de LAB, apesar de um declínio inicial mais severo durante tratamentos de ácido/bile. Isto devido a um consumo preferido de oligossacarídeos em comparação com as cepas de LAB durante a fase de diluição. Existe uma boa correlação entre estudos de cepa única como descrito na seção de pulsação de stress a seguir e co- culturas destas cepas probióticas, confirmando a sua robustez no modelo de trânsito similar ao GI.

É digno de nota que em um experimento de GITS realizado com LAB LU 28, LAB LU 33, Bif LU 10, Bif LU 30 e B. pseudocatenulatum 1200 cepas, em que SS (5 g/L) e GOS (5 g/L) foram usados como fontes de carbono principais, a cepa LAB LU 33 foi a mais forte nesta combinação com SS/GOS apesar do fato de que esta cepa não utiliza SS ou GOS.

O experimento de GITS confirmou o novo conceito de alimentação cruzada exibida por Bif LU 10 e LAB LU 33 quando crescidas na presença de SS e GOS. LAB LU 33 não é capaz de usar SS ou GOS. No entanto, quando crescida na presença de outras cepas selecionadas, especialmente a única cepa que degrada amido na composição, isto é, Bif LU 10 e SS/GOS, as contagens de LAB LU 33 aumentaram. Além disso, a robustez de cepas durante o trânsito de GIT foi também vista. Pode ser concluído que uma composição contendo mistura de probióticos de LAB LU 28, LAB LU 33, Bif LU 10 e Bif LU 30 é estável no modelo de trânsito similar ao GI em um modelo de GITS de vaso único.

Nestes experimentos, as cepas foram selecionadas com base em uma alta pontuação prebiótica. Todas as quatro cepas selecionadas foram crescidas na presença de prebióticos e amido para desenhar uma mistura simbiótica sinergistica. Foi encontrado que estas cepas na mistura simbiótica eram compatíveis uma com a outra e a razão de LAB/ bif aumentou ou diminuiu dependendo da capacidade de degradação prebiótica das cepas (pontuação prebiótica Tabela 5) bem como a sua AMA exibida contra patógenos humanos. Além disso, a sinergia entre probióticos com prebióticos aumentou o crescimento das cepas probióticas que não degradam amido na presença de cepas probióticas que degradam amido. As cepas selecionadas são robustas, podem aguentar trânsito similar a GI, podem manter atividade metabólica, e são capazes de metabolizar prebióticos. Prevenção de infecção usando modelo de camundongo

As composições da presente invenção podem vantajosamente ser usadas para colonizar a mucosa intestinal de um sujeito, (e em particular) para prevenir e tratar infecções, melhorar sintomas, e prevenir a recaída de diarreia associada a antibióticos (AAD) e/ou infecções causadas por patógenos gastrointestinais em um sujeito.

Como foi descrito acima, as cepas selecionadas (isto é, LAB LU 28, LAB LU 33, Bif LU 10 e Bif LU 30) todas têm AMA alta contra CD NAP1/027, são robustas em termos de sobrevivência em simulação de GITS, possuem capacidade de degradar pelo menos um ou mais prebióticos usados na mistura. Para investigar o efeito das cepas selecionadas probióticas crescidas na presença dos prebióticos selecionados, diferentes combinações foram testadas in vivo usando um modelo de camundongo. A programação experimental detalhada é mostrada na Figura 3. Camundongos C57BL/6 de seis a sete semanas de idade foram divididos em quatro grupos experimentais. Grupo 1 (n=5) o grupo simbiótico foi tratado com "mistura simbiótica" consistindo em RS, IMOS, GOS e LAB LU 28, LAB LU 33, BIF LU 10 & BIF LU 30; Grupo 2 (n=6) o grupo probiótico, foi tratado com uma "mistura de probióticos" consistindo em LAB LU 28, LAB LU 33, BIF LU 10 & BIF LU 30; Grupo 3 (n=6) foi tratado com uma "mistura de prebióticos" consistindo em RS, IMOS, GOS; e Grupo 4 (n=7) compreendida de "controle positivo" em que os animais foram infectados somente com CD 027. Grupos 1 e 2 foram dados uma dose diária de 1 x 1010 ufc/camundongo de cada cepa probiótica.

A concentração prebiótica total foi 5 % (p/p) da dieta normal, calculada com base em um consumo de alimentação diária de 5 g por camundongo. RS foi misturado com uma dieta de roedor baixa em proteínas (R70, Lantmannen, Malmo, Sweden) e precipitados foram preparados e dados como alimentação diariamente. Grupo 4 (n=7) foi um grupo de controle, infectado com a cepa NAP1/027 e que não recebeu quaisquer misturas de simbióticos, prebióticos ou probióticos. A microflora intestinal indígena de camundongo foi rompida dando uma mistura de antibióticos durante cinco dias (dias -15 to -11) diluída na água de beber. Um coquetel de antibióticos de kanamicina, gentamicina, colistina, metronidazol, e vancomicina foi preparado em água de beber e esterilizado em filtro. No dia nove (-9) todos os animais, incluindo o grupo de controle, receberam uma dose única de clindamicina (10 mg/kg) intraperitonealmente. Grupos 1-3 foram alimentados com uma mistura simbiótica, probiótica e prebiótica por sete dias (Figura 3A). No dia zero, todos os animais foram desafiados com 106 ufc de NAP1/027 (10s uf c/camundongo) por tubo gástrico. A alimentação de simbióticos, probióticos ou prebióticos de respectivos grupos foi continuada ainda por outros cinco dias e no dia seis todos os animais foram sacrificados por asfixia com CO2 (Figura 3A) . Conteúdos cecais frescos foram colhidos assepticamente para testes de cultura, PCR quantitativa em tempo real (qPCR), histopatologia e toxina. Tratamento com antibióticos do grupo de controle (Grupo 4) foi iniciado de tal maneira que a infecção por C. difficile (CDI) cairia no mesmo dia que para os Grupos 1-3. Isto foi feito para manter a uniformidade de dose de CD usada para infectar os animais e para reduzir erros de experimentos (Figura 3B).

Contagens totais de colônias de lactobacilos, bifidobactérias e NAP1/027 viáveis de conteúdos cecais agrupados de todos os animais dentro de um grupo foram analisadas (Figura 4A) . Contagens dè colônias de NAPl/027 foram determinadas em placas de Fructose Fastidious com cefoxitina sob condições anaeróbicas por 72 h a 37° C. Contagens viáveis foram expressas como log de ufc/100 mg de conteúdo cecal. Além disso, números de cópias de DNA total como determinados por qPCR de Bif LU 10, Bif LU 30, LAB LU 33 e LAB LU 28 nos conteúdos cecais dos diferentes grupos de animais. *P-valor <0,05, foi também determinado (Figura 4B) .

Foi encontrado que alimentação com uma composição simbiótica compreendendo as quatro cepas selecionadas probióticas, com prebióticos IMOS, GOS e RS, preveniram CDI em comparação com o grupo de controle onde os animais estavam severamente doentes por causa de colite.

Todos os animais em Grupos 1-3 estavam saudáveis e nenhum sintoma de diarreia foi observado. Três camundongos no Grupo 4 ficaram severamente doentes após dois dias de CDI devido a colite e foram, portanto sacrificados.

Contagens de colônias de conteúdos cecais nos Grupos 1-3 mostraram uma significativa redução de NAPl/027 (P<0,05) em comparação com animais do Grupo 4. Contagens de colônias de lactobacilos foram mais altas no Grupo 4 (P<0,05) em comparação com os outros grupos. Contagens de colônias de bifidobactérias foram significativamente mais altas nos Grupos 1 e 2 èm comparação com Grupos 3 e 4 (Figura 4A). Números de cópias log de DNA de bifidobactérias totais, de números de cópias Bif LU 10, LAB LU 28 e LAB LU 33 foram mais altos nos Grupos 1 e 2 em comparação com Grupos 3 e 4 (P<0,05). Os números de cópias lactobacilos totais log DNA foram similares em todos os quatro grupos (Figura 4B). No Grupo 1, o conteúdo cecal de 3/5 camundongos mostraram um decline moderado e dois mostraram números de cópias de DNA de NAPl/027 negativos. No Grupo 2, 1/6 camundongos mostraram um muito baixo número de cópias de CD e cinco foram negativos. No Grupo 3, 2/6 animais foram negativos, um mostrou DNA de CD muito baixo, dois mostraram moderada e um mostrou números de cópias de DNA de NAPl/027 muito altos. No Grupo 4, o conteúdo cecal de quatro camundongos mostraram entre 2-4 números de cópias de DNA de log de NAPl/027.

A Figura 5 mostra resultados de uma investigação de histopatologia de tecidos do ceco obtido dos animais no experimento. A Figura 5A mostra a histopatologia de tecidos do ceco de animais no Grupo 1 (grupo simbiótico), Figura 5B; cecos do Grupo 2 (grupo probiótico) (vista de 40 x) revela glândulas tubulares normais e epitélio colunar superficial bem conservado. A Figura 5C; cecos do Grupo 3 (grupo prebiótico) apresentam pequenas áreas com superfície irregular. Números baixos de polimorfos são visíveis entre criptas na lâmina própria. A Figura 5D; cecos do Grupo 4 (grupo de controle) mostrando ulceração com supressão de revestimento de células epiteliais da mucosa e criptas no ceco. A mucosa e sub-mucosa são hemorrágicas e mostram severo edema inflamatório.

Amostras cecais dos Grupos 1-3 não mostram quaisquer sinais de inflamação, mas no Grupo 4, três animais foram sacrificados devido a uma colite severa (Figura 5). 0 ceco de um animal no Grupo 1 e um no Grupo 3 mostraram pontuações 3+ e 2+ de inflamação. Nenhum dos animais do Grupo 2 mostrou inflamação. Todos os camundongos que mostraram inflamação do ceco nos Grupos 1 e 4 deram também positivos para toxina A ou B, no Grupo 2 todos os camundongos deram negativos para toxina (Tabela 10).
Tabela 10. análises de qPCR da cepa de CD NAP1/027, pontuações histopatológicas e valores de toxina dos conteúdos do ceco dos quatro grupos de camundongos.

aPontuações de histopatologia: muito severa: +++++, severa:
++++, moderada: +++, suave: ++, muito suave: + lesões significativas não observadas.

"Valores de fluorescência relativa. Níveis de corte para o teste de toxina: negativo <0,13, equívoco >0,13 a 0,37, positivo > 0,37
*nd, não determinado, animais estavam severamente doentes e morreram devido a infecção. Conteúdo cecal poderia não ser colhido.

Em conclusão, a administração de uma mistura simbiótica contendo quatro cepas probióticas e GOS, IMOS e RS ou um probiótico contendo uma mistura multi-cepa conferiu um efeito protetor nos camundongos tratados com antibióticos contra CDI com a cepa NAP1/027. Juntos, a alimentação com um simbiótico ou uma mistura de probióticos protegeu os camundongos contra infecção por CD, e uma proteção parcial foi proporcionada por uma alimentação prebiótica equivalente. Este é o primeiro estudo sobre prevenção de CDI em um modelo de camundongo usando um novo conceito de tratamento com simbiótico e probiótico.

Restauração de microbiota.

O efeito de alimentação de um suplemento simbiótico contendo as cepas probióticas LAB LU 28, LAB LU 30, Bif LU 10 e Bif LU 30 com os prebióticos GOS, IMOS e RS foi investigado em um modelo de camundongo C57/BL/6. A multiplicação de misturas de probióticos em fezes em diferentes pontos após a alimentação e no ceco no final do experimento foi seguida.

Antes de alimentação da mistura de probióticos no modelo de camundongo C57BL/6, os camundongos foram tratados com uma mistura de antibióticos para desfazer a LAB nativa e microflora de bifidobactérias como foi descrito acima no experimento de prevenção. Os números de cópias de DNA de bifidobactérias probióticas totais, lactobacilos totais, LAB LU 28, LAB LU 33, Bif LU 10 e Bif LU 30 em ceco dos grupos simbiótico e de controle foram determinados por qPCR. A significância é expressa como * P<0,05 (Figura 6).

No grupo simbiótico, o LAB Total e bifidobactérias aumentaram após a alimentação da mistura simbiótica a camundongos tratados com antibióticos em comparação com o grupo de controle. As contagens totais de bifidobactérias de cecos foram mais altas no grupo simbiótico que no grupo de controle e não foram detectadas bifidobactérias cultiváveis. As contagens de bifidobactérias fecais totais e Bif LU 10 aumentaram durante a metade do tratamento de simbiótico, e no final dos experimentos. As cópias de DNA de LAB LU 33, Bif LU 10 e Bif LU 30 fecais foram mais altas no final do experimento.

Cecos do grupo simbiótico mostraram as contagens mais altas de bifidobactérias e LAB. LAB LU 28, LAB LU 33 e Bif LU 10 em comparação com grupo de controle como determinado por qPCR (Figura 6). Não houve diferença significativa nas cópias DNA de LAB entre os grupos simbiótico e de controle. Os números de cópias de DNA de BIF LU 30 foram mais altos no grupo simbiótico em comparação com o grupo de controle, mas sem diferença significativa. Portanto, as cepas probióticas multiplicadas bem na presença de prebióticos e RS no ceco de camundongos tratados com antibióticos, como LAB Total e bifidobactérias contagens aumentaram significativamente nas fezes e ceco como determinado por contagens de colônias e qPCR. O fato de que LAB LU 28, LAB LU 33, Bif LU 10 e Bif LU 30 tenham sido recobertos de amostras fecais e cecais, pode ser concluído que a utilização de prebióticos em uma mistura simbiótica, promoveu a multiplicação e colonização das cepas selecionadas probióticas no intestino murino. Na presente composição das quatro cepas com GOS, IMOS e RS foi visto que a multiplicação de cada cepa foi em proporção igual no ceco.

Experimento de segurança

A segurança da composição compreendendo LAB LU 28, LAB LU 33, Bif LU 10 e Bif LU 30 com GOS e RS foi estabelecida em um modelo de camundongo imunocompromometido C57/BL/6. Os camundongos foram imunocompromometidos usando metotrexato, um inibidor de dihidrofolato redutase e síntese de DNA é amplamente usado em quimioterapia contra o câncer. Metotrexato (3,5 mg/Kg) foi dado oralmente a camundongos por três dias. Após dois dias ao grupo simbiótico foi dado 4xl010 ufc/ml com 5 % de GOS em água. RS foi misturado com ração e dado diariamente a camundongos por seis dias. No 7o dia os camundongos foram mortos e o fígado, baço, sangue e rim foram colhidos por investigação de viabilidade usando método de contagem de placa e fígado para histopatologia.

Os resultados confirmaram nenhuma translocação de bactérias a fígado, sangue, rim, baço e que a histopatologia do fígado foi normal. Além disso, foi encontrado que as contagens de células brancas sanguíneas foram reduzidas no grupo de controle após tratamento com metotrexato, e que a alimentação do suplemento simbiótico por 7 dias elevou o nível de contagem de WBC.

Claims (11)

1. Composição simbiótica compreendendo pelo menos duas cepas bacterianas selecionadas do grupo consistindo nos gêneros Lactobacillus e Bifidobacteria, e uma ou mais substâncias prebióticas, caracterizada pelo fato de que

   • - pelo menos uma das cepas bacterianas é Bifidobacterium breve Bif LU 10 (depósito N° LMG P-26117) e capaz de degradar amido; e
   • - pelo menos uma substância prebiótica é amido.
2. Composição simbiótica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o amido é amido resistente (RS) e/ou amido solúvel (SS).
3. Composição simbiótica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2, caracterizada pelo fato de que uma de ditas cepas bacterianas é uma cepa que não degrada amido.
4. Composição simbiótica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a cepa bacteriana que não degrada amido é da espécie de Lactobacillus paracasei.
5. Composição simbiótica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a cepa bacteriana que não degrada amido é LAB LU 33 (depósito N° LMG P-26118).
6. Composição simbiótica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma ou mais das cepas LAB LU 23 (depósito N° LMG P-2 6119) , LAB LU 28 (depósito N° LMG P-26120), BIF LU 29 (depósito N° LMG P-26115), e/ou BIF LU 30 (depósito N° LMG P-26116).
7. Composição simbiótica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos LAB LU 33 (depósito N° LMG P-26118), e BIF LU 30 (depósito N° LMG P-26116).
8. Composição simbiótica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos LAB LU 33 (depósito N° LMG P-26118), BIF LU 30 (depósito N° LMG P-26116), e LAB LU 28 (depósito N° LMG P26120).
9. Composição simbiótica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizada pelo fato de que uma ou mais das cepas bacterianas foi exposta a ácido, bile e/ou mucina durante a sua produção.
10. Composição simbiótica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma substância prebiótica do grupo consistindo em dissacarídeos, oligossacarídeos, e/ou polissacarídeos.
11. Composição simbiótica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizada pelo fato de que é para uso na colonização da mucosa intestinal de um sujeito.

Images