CN105658226B - 使用益生菌治疗癌症的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及益生菌组合物和使用益生菌组合物治疗肝细胞癌(HCC)的方法。益生菌组合物可抑制HCC的生长。益生菌组合物可减少HCC的风险。益生菌组合物包含3种细菌组合物的特定的组合：(a)热灭活的嗜酸乳杆菌(Moro)Hansen和Mocqu(ATCC 53103)，(b)活的大肠杆菌Nissle 1917，和(c)热灭活的VSL#3®。与对照生长比较，细菌的这种组合有效减少肝细胞癌(HCC)生长。

Description

使用益生菌治疗癌症的方法和组合物
相关申请的交叉参照
本申请要求2013年8月16日提交的美国临时申请系列号61/866,784的权益，其通过引用以其全文结合到本文中。
发明背景
肝细胞癌(HCC)是世界上第五大最流行的癌症和所有癌症相关的死亡的第三大原因(Ferlay, J.,等人, 2008年全球癌症负担的估计(Estimates of worldwide burden of cancer in 2008)：GLOBOCAN 2008. International journal of cancer, 2010. 127(12): 第2893-2917页)。据报道，每年全球有超过600,000人死亡。HCC影响所有地区的世界人口(El–Serag, H.B.和K.L. Rudolph, 肝细胞癌：流行病学和分子致癌作用(Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis).Gastroenterology, 2007. 132(7): 第2557-2576页)。大约75% HCC患者集中在亚洲，但已有报道，在包括欧洲和美国的几个发达国家，HCC的发病率最近有上升的趋势(Venook,A.P.,等人，肝细胞癌的发病率和流行病学：全球和地区展望(incidence and epidemiology of Hepatocellular carcinoma: a global and regional perspective).Oncologist, 2010. 15 (增刊4): 第5-13页)。
护理的现行标准可以分为3大类，包括(1) 手术治疗；(2) 局部消融疗法；和(3)化学疗法。手术治疗包括肝切除术和肝移植。非手术治疗包括局部消融疗法，其中经皮乙醇注射(PEI)和射频消融(RFA)是最常实施的；和化学疗法，其或者是经动脉化疗栓塞(TACE)给药或者是***给药。标准治疗涉及高费用。例如，使用如由NCCN/AASLD/JSH/ESMO指南推荐的索拉非尼的分子靶向疗法是昂贵的，每月的平均费用约US$6,000。
口服活的益生菌是已在文献中报道的许多可供选择的实验性癌症治疗之一。益生菌被定义为活的微生物，当其以适合的量给予时，对宿主提供健康益处。益生菌对癌症发展的功效已由几条科学证据和假设提出，包括增加免疫细胞激活，增加抗肿瘤监视免疫活性，促进抗炎作用，和抑制细菌转化前致癌物(de LeBlanc, A.d.M., C. Matar，和G. Perdigón，益生菌在癌症中的应用(The application of probiotics in cancer). BritishJournal of Nutrition, 2007. 98(S1): 第S105-S110页)。大多数数据从结肠和乳腺癌病例获得。在前者中，预防首先在动物模型中实现并被归因于益生菌的显著抗炎作用(Perdigon, G.,等人, 酸奶在预防结肠癌中的作用(Role of yoghurt in the prevention of colon cancer). European journal of clinical nutrition, 2002.56: 第S65页)。而在乳腺癌的情况下，提示的益生菌的有益作用似乎是通过增加抗肿瘤监视免疫活性来介导(de Moreno de LeBlanc, A.,等人, 瑞士乳杆菌R389发酵的乳对正常乳腺和乳腺癌模型相关的免疫细胞的影响(Effects of milk fermented by Lactobacillus helveticus R389 on immune cells associated to mammary glands in normal and a breast cancer model). Immunobiology, 2005. 210(5): 第349-358页)。
在肝癌的背景下，有关于益生菌补剂(活的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) LC705和费氏丙酸杆菌谢尔曼亚种(Propionibacterium freudenreichii subsp. Shermani))作为食物途径以降低肝癌风险的用途的报道。提出的机制与通过结合于黄曲霉毒素(aflotoxin)阻断致癌物质黄曲霉毒素B1的肠吸收，并由此减少生物有效剂量的食物黄曲霉毒素暴露有关(El-Nezami, H.S.,等人, 益生菌补充减少在中国南方的年青人中增加的肝癌风险的生物标记(Probiotic supplementation reduces a biomarker for increased risk of liver cancer in young men from Southern China).American journal of clinical nutrition, 2006. 83(5): 第1199-1203页)。
有大量的证据表明，一些益生菌可通过调节免疫功能(包括调节T辅助细胞应答)提供益处。取决于疾病模型，这些益生菌可诱导T-细胞低反应性(Braat, H.,等人, 鼠李糖乳杆菌在刺激的CD4+ T细胞中通过调节树突状细胞功能诱导外周免疫低反应性(Lactobacillus rhamnosus induces peripheral hyporesponsiveness in stimulated CD4+ T cells via modulation of dendritic cell function). American journal ofclinical nutrition, 2004. 80(6): 第1618-1625页)，上调或下调与Th1/Th2应答有关的细胞因子的产生(Valio Ltd, R.D.a.S., LGG® Summatim, 载于Health effects of LGG2009；Mutaflor. 最近的Mutaflor证据和临床研究(Most Recent Mutaflor Evidence and Clinical Studies) (2006-2010). 2010；可在网页mutaflor.ca/health-care-professionals/mutaflor-clinical-studies/获得; Sigma-Tau Pharmaceuticals, I.VSL#3® references. 2012；可从网页vsl3.com/hcp/references.asp获得)。大肠杆菌(Escherichia coli)Nissle 1917 (EcN)已经临床研究用于溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、慢性便秘、长期腹泻、肠易激综合征和结肠袋炎(Mutaflor. 最近的Mutaflor证据和临床研究(Most Recent Mutaflor Evidence and Clinical Studies) (2006-2010). 2010；可在网页mutaflor.ca/health-care-professionals/mutaflor-clinical- studies/获得)。嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)(Moro) Hansen和Mocquot GG菌株(ATCC 53103)(LGG)已显示除了治疗上述胃肠道紊乱外，还增强在病毒感染和呼吸道感染期间的抗体形成(Valio Ltd, R.D.a.S., LGG® Summatim, 载于Health effects of LGG2009)。VSL#3® (Sigma-Tau)也广泛用于溃疡性结肠炎、肠易激综合征和回肠袋的临床管理(Sigma-TauPharmaceuticals, I. VSL#3® references. 2012；可在网页vsl3.com/hcp/references.asp上获得)。在动物模型中，VSL#3®已显示在结肠炎相关的结肠直肠中通过减弱各种炎症相关参数，在延缓向异型增生转变中的保护作用(Appleyard, C.B.,等人 用益生菌VSL# 3预处理在结肠炎相关癌症的大鼠模型中延缓从炎症向异型增生的转变(Pretreatment with the probiotic VSL# 3 delays transition from inflammation to dysplasia in a rat model of colitis-associated cancer). American Journalof Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology, 2011. 301(6): 第G1004-G1013页)。
除了活的益生菌之外，热灭活的益生菌补充的健康益处也已被研究，虽然疾病模型不是癌症。益生菌菌株如嗜酸乳杆菌(L. acidophilus) L-92、短乳杆菌(L. brevis) SBC8803、干酪乳杆菌(L. casei) Shirota、格氏乳杆菌(L. gasseri) OLL2809、类干酪乳杆菌(L. paracasei) KW3110、戊糖乳杆菌(L. pentosus) S-PT84仍然在敏化和过敏表现的动物模型中显示免疫调节功能，包括影响IgE产生和影响Th1/Th2细胞因子产生，甚至在热处理之后(Sashihara, T., N. Sueki，和S. Ikegami, 热杀灭乳酸细菌在减轻过敏性疾病中的效力的分析(An analyis of the effectiveness of heat-killed lactic acid bacteria in alleviating allergic diseases). Journal of dairy science, 2006.89(8): 第2846-2855页)。同时，非益生菌细菌已经热减毒并用于癌症疫苗形式的癌症研究。这样的实例包含Coley氏毒素——一种热灭活酿脓链球菌(S. pyogenes)和粘质沙雷氏菌(S. marcescens)的混合物，其中减毒的细菌已经***给予以由细菌内毒素诱导针对肿瘤的严重炎性反应和诱导细胞凋亡。虽然它主要用于治疗肉瘤、淋巴瘤和黑素瘤(Cann,S.H., J. Van Netten，和C. Van Netten, Dr William Coley和肿瘤消退：历史上或将来的一个地方(Dr William Coley and tumour regression: a place in history or in the future) . Postgraduate medical journal, 2003. 79(938): 第672-680页)，它在HCC患者中的用途在一个作为辅助治疗的研究中已有报道。然而，这种治疗可在伴有严重发热和患者死亡的高风险(Richardson, M.A.,等人, Coley毒素免疫疗法：一种回顾性评述(Coley toxins immunotherapy:a retrospective review). Alternative therapies inhealth and medicine, 1999. 5(3): 第42页)。
发明简述
本发明的一个目的是提供可通过例如抑制癌症生长来治疗癌症的益生菌组合物。本发明的另一个目的是提供用益生菌组合物治疗癌症的方法。
制备用作有助于减少肝细胞癌(HCC)的生长的食物补剂和治疗剂的益生菌制剂是合乎需要的。为该目的，所公开的益生菌制剂可用作食物补剂和治疗剂，且另外地特别用于减少HCC生长。
本发明的方面提供包含有效量的细菌的组合的益生菌组合物，其中细菌的组合包含(a) 热灭活的嗜酸乳杆菌(Moro) Hansen和Mocqu (ATCC 53103)，(b) 活的大肠杆菌(Escherichia coli)Nissle 1917，和(c) 热灭活的VSL#3®。与对照生长比较，细菌的组合可有效减少肝细胞癌(HCC)生长。细菌(a)、(b)和(c)可各自独立地以约20-55%重量的浓度存在于益生菌组合物中。
VSL#3®包含短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)。
在至少一个实施方案中，本发明提供包含有效量的细菌组合的益生菌组合物，其中细菌的组合包含(a) 热灭活的嗜酸乳杆菌(Moro) Hansen和Mocqu (ATCC 53103)，(b)活的大肠杆菌Nissle 1917，和(c) 热灭活的选自以下的细菌：短双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、类干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌及其组合。
本发明的方面也提供治疗肝细胞癌(HCC)的方法。所述方法包含口服给予面临HCC的风险或经诊断患有HCC的受试者益生菌组合物。益生菌组合物可以任何有效的方案给予。例如，且不意味着限制，益生菌组合物可每日给予。益生菌组合物可每日给予，持续至少一个月。受试者可被诊断患有HCC。受试者可面临HCC的风险中。受试者可以是被诊断有乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或二者的受试者。受试者可以是暴露于黄曲霉毒素B1 (AFB1)的受试者。受试者可以是经诊断患有酒精中毒的受试者。
所述方法可进一步包括在给予益生菌组合物之前，诊断受试者患有HCC。所述方法可进一步包括在给予益生菌组合物之前，诊断受试者面临HCC的风险。诊断受试者面临HCC的风险可包括诊断受试者有乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或二者。诊断受试者面临HCC的风险可包括诊断受试者已暴露于黄曲霉毒素B1 (AFB1)。诊断受试者面临HCC的风险可包括诊断受试者患有酒精中毒。
还公开了包括诊断受试者患有HCC或面临HCC的风险中和口服给予诊断为患有HCC或面临HCC的风险中的受试者益生菌组合物的方法。
益生菌组合物可以是任何公开的益生菌组合物。例如，且不意味着限制，益生菌组合物可包含有效量的细菌的组合，其中细菌的组合包含(a) 热灭活的嗜酸乳杆菌(Moro)Hansen和Mocqu (ATCC 53103)，(b) 活的大肠杆菌Nissle 1917，和(c) 热灭活的选自以下的细菌：短双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、类干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌及其组合。与对照生长比较，细菌的组合可有效减少肝细胞癌(HCC)生长。细菌(a)、(b)和(c)可各自独立地以约20-55%重量的浓度存在于益生菌组合物中。
在至少一个实施方案中，本发明提供一种治疗受试者的方法，其包括口服给予面临肝细胞癌(HCC)的风险或经诊断患有肝细胞癌(HCC)的受试者益生菌组合物，益生菌组合物包含有效量的细菌的组合，其中细菌的组合包含(a) 热灭活的嗜酸乳杆菌(Moro)Hansen和Mocqu (ATCC 53103)，(b) 活的大肠杆菌Nissle 1917，和(c)热灭活的选自以下的细菌：短双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、类干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌及其组合。
在至少一个实施方案中，本发明提供依据本发明的益生菌组合物在制备用于治疗或预防受试者的肝细胞癌(HCC)的食物补剂或治疗剂中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供依据本发明的益生菌组合物在制备用于治疗面临肝细胞癌(HCC)的风险或经诊断患有肝细胞癌(HCC)的受试者的食物补剂或治疗剂中的用途。益生菌组合物包含有效量的细菌的组合，其中细菌的组合包含(a) 热灭活的嗜酸乳杆菌(Moro) Hansen和Mocqu (ATCC53103)，(b) 活的大肠杆菌Nissle 1917，和(c) 热灭活的选自以下的细菌：短双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、类干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌及其组合。
在至少一个实施方案中，本发明提供用于治疗或预防受试者的肝细胞癌(HCC)的依据本发明的益生菌组合物。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗或预防面临肝细胞癌(HCC)的风险或经诊断患有肝细胞癌(HCC)的受试者的依据本发明的益生菌组合物。益生菌组合物包含有效量的细菌的组合，其中细菌的组合包含(a) 热灭活的嗜酸乳杆菌(Moro) Hansen和Mocqu (ATCC 53103)，(b) 活的大肠杆菌Nissle 1917，和(c) 热灭活的选自以下的细菌：短双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、类干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌及其组合。
所公开的方法和组合物的另外优点将部分地在以下说明书中提出，并将部分地从说明书中得到了解，或可通过实施所公开的方法和组合物而得知。所公开的方法和组合物的优点将通过所附权利要求书特别指出的要素和组合认知和获得。要理解，前述的一般描述和以下的详细说明二者都只是示例性的和说明性的且并不限制如所要求的发明。
附图简述
附图，其结合到本申请中并构成本说明书的一部分，图示说明所公开的方法和组合物的几个实施方案并与说明书一起，用于解释所公开的方法和组合物的原理。
图1是在不同的治疗后肿瘤重量与体重的比率的图。该图显示在预防模型中食用作为食物补剂的益生菌后的肿瘤负荷较小。雄性5-6周龄C57BL6/N小鼠在皮下注射小鼠肝癌细胞系Hepa1-6前1周开始每日喂给益生菌。在肿瘤注射后38天处死动物，以测定肿瘤:体重比率。如通过Tukey多重比较检验所测定的，益生菌群的肿瘤负荷显著小于对照，但在热灭活的和活的细菌之间无差异。*p<0.05. **p<0.01. ***p<0.001. C：阴性对照；cis：顺铂(每3天0.25mg/ml)；vd：热灭活的VSL#3®(1010cfu/d)；ld：热灭活的LGG (108cfu/d)；eh：活的高剂量的EcN (108cfu/d)。
图2显示在预防模型中食用作为食物补剂的益生菌后在肿瘤组织中的A) T辅助细胞亚群标记和B)血管生成标记的相对mRNA表达的图。益生菌组中的表达水平经Dunnett检验与对照比较。血管生成标记的表达减少通常可与Treg标记(TGFB-1)和Th17标记(RORγt)表达的减少一起被观察到，但不与Th1标记(IFNG、TBET)的表达一起被观察到。*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。c：对照；cis：顺铂；vd：热灭活的VSL#3®；ld：热灭活的LGG (108cfu/d)；eh：活的高剂量EcN (108cfu/d)。
图3显示用1x107 Hepa1-6肿瘤细胞皮下接种并从肿瘤接种前1-周(p: ProHep预防)或者在肿瘤接种的同一天(pt: ProHep治疗)开始用ProHep食物每日饲喂的小鼠的A)肿瘤大小和B)肿瘤重量的图。顺铂作为阳性对照每3天 i.p.给予。
图4显示A) 用TO-PRO-3对死亡细胞染色的整个肿瘤切片的共焦图像。比例尺，200µm。显示对代表B) Ki67、(C) 胱天蛋白酶3和(D) GLUT-1 (蓝)和CD31 (红)的肿瘤切片的免疫染色。比例尺，50 µm。
图5显示A) 代表性肿瘤切片的微血管密度。比例尺，50 µm。B) 显示在多个共焦平面(切片厚度，25µm)叠加后，由共焦Z堆栈(stack)获得的三维模型的图像。
图6显示A) 通过实时定量PCR (RT-qPCR)在全部肿瘤溶胞产物中的基因表达。Hprt被用作参考基因。B) 显示由分层基因聚类分析的差异基因表达的相关性。
图7显示A) IL-17在代表性肿瘤切片中的免疫染色。B) 显示在用肿瘤接种和用抗-IL-17抗体(200 µg/天)或对照大鼠IgG注射的C57BL/6N小鼠中随时间推移的肿瘤大小。监测肿瘤大小1个月。小鼠喂给对照或者从肿瘤接种前1周开始喂给ProHep食物。C) 显示在肿瘤中的% MDSC的流式细胞术分析。
图8显示A)用IL-17染色(蓝)的与CD3 (左小图)，CD11b (中小图)和MPO (右小图)共染色(红)的肿瘤切片的共焦图像。比例尺，50 µm。B) 显示% Th亚群在肿瘤中的流式细胞术分析。C) 显示% Th17、MVD和肿瘤大小的相关性分析。D) 显示Th17在肿瘤中的表型分析。E) 显示由流式细胞术进行的Th17在各种器官中出现的频率。
图9显示ProHep食物降低幼稚CD4+ T细胞分化为Th17的能力。幼稚CD4+CD62L+T细胞从对照或ProHep食物喂饲的小鼠肠分离并在抗-CD3和抗-CD28的存在下经72小时分化为Th1、Th2、Th17或Treg细胞。A) 显示Tbet、Gata3、Rorγt和Foxp3 mRNA表达的RT-qPCR分析。表达相对于Gapdh表达呈现。B) 显示在分化3天的CD4+ T细胞的上清液中经ELISA测定的细胞因子分泌。C) 显示在极化条件下，经5天培养评价的从幼稚CD4+ T细胞衍生的% Th1(CD4+IFN-γ+)、Th2 (CD4+IL-4+)和Th17 (CD4+IL-17+)的流式细胞术分析。来自3次独立的实验的代表性数据被示出。
本发明的详细公开
通过参照本文包括的特定实施方案和实施例的以下详细描述和附图及其先前的和以下的描述，可以更容易地理解所公开的方法和组合物。
已公开的材料、组合物和组分可用于所公开的方法和组合物，可与所公开的方法和组合物联合使用，可用于所公开的方法和组合物的产品的制备，或为所公开的方法和组合物的产品。这些和其它材料在此公开，并且要理解，当这些材料的组合、子集、相互作用、组等被公开时，虽然这些化合物的每个各种单独和集体组合和排列的具体提及可能未明确公开，但各自都是在此被特别地构思和描述的。例如，如果益生菌组合物被公开和讨论以及可对许多组分(包括益生菌细菌)进行的许多修饰被讨论时，则益生菌细菌的各个和每一个组合以及排列和可能的修饰被特别地构思，除非明确指出相反。因此，如果一类细菌A、B和C以及一类食物D、E和F被公开且组合组分的实例A-D被公开时，那么即使各自不被单独记载，各自也都是都是单独和集体考虑的。因此，在这种情况下，组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F的每一个被特别地构思并应考虑为从A、B和C；D、E和F；和实例组合A-D的公开内容公开的。同样地，这些的任何亚群或组合也被特别地构思和公开。因此，例如，A-E、B-F和C-E的亚组被特别地构思并应考虑为从A、B和C；D、E和F；和实例组合A-D的公开内容公开的。此外，如上构思和公开的各种材料、组合物、组分等也可特别地和独立地包含在此类材料的任何组、亚组、列表、集合等中或从此类材料的任何组、亚组、列表、集合等中排除。这些概念应用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果有各种可进行的另外的步骤，则要理解这些另外的步骤的每一个可用所公开方法的任何特定实施方案或实施方案的组合进行，且每个这样的组合被特别地构思并应考虑为公开的。
构思了可用作减少HCC肿瘤生长的食物补剂和治疗剂的益生菌制剂，称为ProHep。益生菌制剂包含有益益生菌微生物区系的混合物，其包含(a) 热灭活的嗜酸乳杆菌(Moro)Hansen和Mocqu (ATCC 53103)，(b) 活的大肠杆菌Nissle 1917，和(c) 热灭活的VSL#3®。VSL#3®是可市售获得的以商品名VSL#3®交易的产品并包含8个不同的细菌菌株：短双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、类干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。经测定这种益生菌制剂可减少HCC肿瘤生长。
目前HCC治疗的主要缺点是高的医疗护理成本。例如，使用如由NCCN/AASLD/JSH/ESMO指南推荐的索拉非尼的分子靶向疗法是昂贵的，每月的平均费用约US$6,000(Cabrera, R.和D. Nelson, 评论文章：肝细胞癌的管理(Review article: the management of hepatocellular carcinoma). Alimentary pharmacology &therapeutics, 2010. 31(4): 第461-476)页，因此它可只能在拥有广泛的医疗保健服务的财政资源的国家实施(Benson 3rd, A.,等人, 肿瘤学的NCCN临床实践指南：肝细胞癌(NCCN clinical practice guidelines in oncology: hepatobiliary cancers).Journal of the National Comprehensive Cancer Network: JNCCN, 2009. 7(4): 第350页；Jelic, S., 肝细胞癌：诊断、治疗和随访的ESMO临床建议(Hepatocellular carcinoma:: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up). Annals of Oncology, 2009. 20(增刊4): 第iv41-iv45页；Izumi, N., 肝病的日本社会的诊断和治疗法则：一种基于共识的实践指南(Diagnostic and treatment algorithm of the Japanese society of hepatology: a consensus-based practice guideline). Oncology, 2010. 78 (增刊1): 第78-86页；Bruix, J.和M. Sherman, 肝细胞癌的管理：一个更新(Management of hepatocellular carcinoma: an update).Hepatology, 2011. 53(3): 第1020-1022页)。美国HCC的公布成本分析指示，对于HCC患者平均5年净成本是平均每月US$45,000 (Yabroff, K.R.,等人, 对于美国的老年癌症患者的医护成本(Cost of care for elderly cancer patients in the United States).Journal of the National Cancer Institute, 2008. 100(9): 第630-641页)。同时，益生菌通常在乳制品食品中发现，而对于购买专利的商业产品如VSL#3®，成本仅为大约US$86.00每月。因此，所公开的有效的益生菌提供一种HCC干预的更廉价途径。
益生菌口服补剂，无论是活的或是热灭活的形式，先前并未用来治疗HCC且先前并不知道可减少HCC生长。此外，虽然益生菌已显示某些一般的免疫调节作用，但在HCC肿瘤微环境中的T辅助细胞相关免疫调节作用及其与HCC预防和干预的关系在本工作之前并未研究过。特别地，先前并不知道LGG、EcN和VSL#3®可具有对HCC的作用。
所公开的组合物和方法也可用来治疗处于发生HCC的风险中的那些。HCC的致病因素包括乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)的慢性感染，暴露于食物黄曲霉毒素B1(AFB1)，和酒精消费。其中，HBV占全世界HCC病例的50%–80%，而10%–25%的病例被认为是HCV感染的后果(Venook, A.P.,等人，肝细胞癌的发病率和流行病学: 全球和地区展望(The incidence and epidemiology of hepatocellular carcinoma: a global and regional perspective). Oncologist, 2010. 15 (增刊4): 第5-13页；Block, T.M.,等人, 肝细胞癌的分子病毒肿瘤学(Molecular viral oncology of hepatocellular carcinoma).Oncogene, 2003. 22 (33): 第5093-5107页；Anthony, P., 肝细胞癌：综述(Hepatocellular carcinoma: an overview). Histopathology, 2001. 39(2): 第109-118页)。所公开的益生菌组合物可通过在发生HCC前，口服消费益生菌调节免疫***来减少发展HCC的风险。因此，肝炎携带者可用所公开的益生菌组合物治疗，以帮助减少他们发展HCC的风险。世界卫生组织(WHO)估计世界上超过520,000,000人为面临发展肝硬化和/或肝癌风险的慢性肝炎病毒携带者(WHO. 乙型肝炎全球警报和响应(Hepatitis B Global Alert and Response). 2013 [2013引用的；可在网页who.int/csr/disease/hepatitis /whocdscsrlyo20022/en/index3.html上获得；WHO. 丙型肝炎全球警报和响应(Hepatitis C. Global Alert and Response). 2013；可在网页who.int/csr /disease/hepatitis/whocdscsrlyo2003/en/index4.html上获得)。假定每月益生菌消费的平均成本是大约US$68.30 (Ferring. VSL#3® ordering. 2013；可在网页vsl3.co.uk/order_vsl3上获得；Mutaflor. Buy Mutaflor. 2013；可在网页mutaflor.ca/products-page/上获得；verkkoapteekki, Gefilus. 2013)，估计的用所公开的益生菌治疗45天的市场大小为约US$440亿每年。
所公开的组合物和方法允许对要靶向的宿主的慢性微生物攻击源，这将有助于在肿瘤微环境中调节T辅助细胞相关免疫应答和减缓肝癌进展。使用益生菌减缓HCC肿瘤生长的方法和使用一种新的益生菌混合物(ProHep)减少肿瘤生长的方法被公开。通过预防或治疗与患者的肿瘤生长有关的问题，随后的健康问题可以得到预防或减轻，这可导致降低患者未来的健康护理成本。
某些所公开的益生菌组合物是细菌的混合物。例如，某些益生菌组合物可以是几种可市售获得的细菌或公共领域细菌(public domain bacteria)，即嗜酸乳杆菌(Moro)Hansen和Mocquot菌株GG (ATCC 53103)、大肠杆菌Nissle 1917 (以商品名Mutaflor交易的可市售获得的产品)、VSL#3® (以商品名VSL#3®交易的可市售获得的产品)的混合物。细菌混合物是活的和热灭活的细菌的混合物，该混合物可称为ProHep。益生菌组分也可以两种或更多种分开的组合物配制。这样的分开的组合物可在相同的时间或在不同的时间一起或分开给予。所公开的组合物可进一步包含组合物的其它组分，或可与组合物的其它组分一起给予。例如，所公开的益生菌组合物可与食物合并或可与食物一起给予。
虽然不希望被限制于一个特定的操作方式，但所公开的组合物和方法可通过影响肿瘤微环境中的T辅助细胞相关免疫应答和血管生成，减少HCC肿瘤生长(Sung CY, L.N.,El-Nezami H., 通过细菌调节T辅助细胞17：治疗肝细胞癌的途径(Regulation of T helper 17 by bacteria: an approach for the treatment of hepatocellular carcinoma). International journal of Hepatology, 2012. 2012(论文ID 439024):第8页)。
要理解，除非另外指明，所公开的方法和组合物并不限于特定的合成方法、特定的分析技术或特定的试剂，因此可改变。还要理解，本文所用的术语仅仅为了描述特定实施方案的目的并非意欲进行限制。
益生菌组合物
可用来治疗肝细胞癌(HCC)的益生菌组合物被公开。所公开的益生菌组合物是可用作食物补剂和治疗剂以降低HCC风险和/或生长的益生菌制剂并通常包含有益益生菌微生物区系的混合物。已观察到益生菌细菌的某些组合可减少HCC的风险和/或作用。某些益生菌组合物包含热灭活的嗜酸乳杆菌(Moro) Hansen和Mocqu (ATCC 53103)、活的大肠杆菌Nissle 1917和热灭活的VSL#3®。例如，益生菌组合物可包含嗜酸乳杆菌(Moro) Hansen和Mocquot菌株GG (ATCC 53103) (热灭活的，2x 1010 cfu/d)；市面上称为VSL#3®的短双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、类干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌 (热灭活的，总剂量1.8x 1012 cfu/d)；和大肠杆菌Nissle 1917 (活的, 5x 1012 cfu/d)。与对照生长比较，细菌的组合可有效减少肝细胞癌(HCC)生长。与对照风险比较，细菌的组合可有效减少肝细胞癌(HCC)风险。细菌(a)、(b)和(c)可各自独立地以约20-55%重量的浓度存在于益生菌组合物中。
嗜酸乳杆菌(Moro) Hansen和Mocqu (ATCC 53103)是已知在全身和肠疾病模型中调节与Th1/Th2应答有关的细胞因子的产生、诱导T-细胞低反应性和减少炎症的细菌。
大肠杆菌Nissle 1917是已知可诱导T-细胞低反应性和促进抗炎作用的细菌。
VSL#3® (Sigma-Tau)是取得专利权的、商业可获得的益生菌混合物，其由8种细菌组成：短双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、类干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。VSL#3®可通过增加抗炎细胞因子的产生、扩大Treg池和降低促炎细胞因子的水平而促进抗炎作用。
这3种益生菌菌株和益生菌混合物可各、独立地以约20-约55%重量的浓度存在于益生菌组合物中。嗜酸乳杆菌(Moro) Hansen和Mocqu (LGG)、大肠杆菌Nissle 1917 (EcN)和VSL#3®在益生菌组合物中的浓度的组合的实例列出于表1中。
表1. 益生菌细菌的浓度(以组合物的%重量计)
实例号 LGG EcN VSL#3®
1 20 20 20
2 20 20 25
3 20 20 30
4 20 20 35
5 20 20 40
6 20 20 45
7 20 20 50
8 20 20 55
9 20 25 20
10 20 30 20
11 20 35 20
12 20 40 20
13 20 45 20
14 20 50 20
15 20 55 20
16 25 20 20
17 30 20 20
18 35 20 20
19 40 20 20
20 45 20 20
21 50 20 20
22 55 20 20
23 30 20 25
24 30 20 30
25 30 20 35
26 30 20 40
27 30 20 45
28 30 20 50
29 30 25 20
30 30 30 20
31 30 35 20
32 30 40 20
33 30 45 20
34 30 50 20
35 40 20 25
36 40 20 30
37 40 20 35
38 40 20 40
39 40 25 20
40 40 30 20
41 40 35 20
42 40 40 20
43 50 20 25
44 50 20 30
45 50 25 20
46 50 30 20
47 55 20 25
48 55 25 20
益生菌组合物的成分可通过常规方法混合在一起并形成例如片剂用于口服给予。或者，成分可被混合在一起并放入明胶胶囊中。所公开的益生菌制剂也可含有常规食物补充填充剂和增量剂例如米粉。便利地，益生菌制剂可以范围从约5毫克每天至约50毫克每天的剂量比率口服。
所公开的益生菌组合物可配制为可食用的、化妆品用的或药用产品。除了益生菌细菌外，益生菌组合物还可包含一种或多种其它活性剂和/或化妆品可接受的赋形剂(在化妆品组合物的情况下)、药学上可接受的赋形剂(在药用组合物的情况下)或充分可食用的成分(在可食用的组合物的情况下)。一些益生菌组合物可进一步包含一种或多种活性剂。例如，一种或多种另外的活性剂可以是不拮抗形成所公开的益生菌组合物的细菌的其它益生菌细菌。取决于制剂，细菌可作为纯化的细菌、作为细菌培养物、作为细菌培养物的一部分、作为已被后处理的细菌培养物单独或与合适的载体或成分一起被加入。也可加入益生元。
所公开的益生菌组合物也可被包含在各种可食用的产品，如乳制品、酸奶、凝乳、奶酪(如，quark、奶油、加工的、软的和硬的)、发酵乳、奶粉、乳基发酵产品、冰激凌、发酵谷类基产品、乳基粉末、饮料、调味品和宠物食物中。术语"可食用的产品"在此以其最广泛的含义使用，包括以任何呈现形式的可被动物摄取的任何类型的产品，但排除化妆品、药品和兽医产品。其它可食用的产品的实例是肉制品(如，肝酱、法兰克福香肠和意大利香肠或肉涂味品(meat spreads))、巧克力涂味品、馅料(如块菌(truffle)、奶油)和糖霜、巧克力、糖果(如，焦糖、糖果、软糖或太妃糖)、烘焙食品(蛋糕、糕点)、酱汁和汤、果汁和咖啡增白剂。本发明的组合物也可用作其它食品的成分。特别有用的可食用产品是功能性食品。
因此，也公开了含有所公开的益生菌组合物以及其它可食用的成分的可食用的组合物。术语"可食用的成分"指的是适合被动物优选地但不限于人、家畜或宠物动物食入即用作食物的成分。
通常，益生菌组合物如本文所公开的那些被考虑为膳食补剂。膳食补剂，也称为食物补剂或营养补剂，提供通常在正常食物中不能摄取的有益成分。主要地，膳食补剂被认为是食品，但有时将它们定义为药物、天然健康产品或营养制品(nutraceutical product)。如本文所用的，膳食补剂也包含营养制品。膳食补剂通常在"柜台上"出售，即无需处方。所公开的益生菌组合物的一些形式是膳食补剂。
如果益生菌组合物是膳食补剂，它可原样给予，可与合适的可饮用的液体如水、酸奶、奶或果汁混合，或可与固体或液体食物混合。在本文中，膳食补剂可以呈现片剂、丸剂、胶囊、糖锭剂、颗粒剂、粉末剂、混悬剂、香囊剂(sachet)、锭剂、糖果、条块(bar)、糖浆的形式和相应的给予形式，通常呈单位剂量的形式。例如，包含益生菌组合物的膳食补剂可以片剂、糖锭剂、胶囊或粉末剂的形式给予，在制备膳食补剂的常规方法中制备。
形成所公开的益生菌组合物的细菌可呈活细胞或非活细胞的形式。在一些实施方案中，嗜酸乳杆菌(Moro) Hansen和Mocqu和VSL#3®是非活的，而大肠杆菌Nissle 1917是活的细胞。非活细胞可通过例如热杀死的微生物或经由暴露于改变的pH、超声处理、辐射或经受压力而杀死的微生物来制备。对于非活的细胞，产品制备更简单，细胞可以容易地加入到市售产品中且贮存的要求的限制比活细胞要小得多。
用于益生菌组合物的细菌的量或浓度一般可以表示为组合物中每一菌株或菌株的组合的菌落形成单位(cfu)的数量。一般来说，细菌的有效量可为高至足以以积极方式显著地改变待治疗的病况，但低至足以避免严重副作用(以合理的益处/风险比)的、在合理的医学判断范围内的量。益生菌细菌的有效量可由技术人员确定并将随要实现的特定目标、待治疗的患者的年龄和身体状况、潜在病症的严重程度、和最终制剂而变化。例如，细菌可以约105 cfu/g-约1012 cfu/g的量，优选地以约107 cfu/g-约1011 cfu/g的量存在。术语"菌落形成单位" ("cfu")指在琼脂平板上经微生物计数所显示的细菌细胞数。在一些益生菌组合物中，益生菌组合物包含107-1010 cfu/g。
用于所公开的益生菌组合物的细菌可通过例如在合适的培养基中和在合适的条件下培养细菌而产生。细菌可单独培养以形成纯的培养物，或作为与其它微生物一起的混合培养物培养，或通过分开培养不同类型的细菌，然后将它们以所需的比例合并而培养。培养后，可回收细胞悬浮液并原样使用或以所需的方式(例如通过浓缩或冷冻干燥)处理，以进一步用于制备产品。有时益生菌制剂可经受固定化或封装过程，以提高保存期。用于细菌的固定化或封装的几种技术是本领域已知的。
嗜酸乳杆菌(Moro) Hansen和Mocqu (ATCC 53103)、大肠杆菌Nissle 1917和VSL#3®可不仅在以单一组合物合并时有效，而且还当以它们自身使用或以两种或更多种不同的组合物同时、顺序或在某些时间段后分开给予时有效。
“益生菌”是当以适量给予时赋予宿主有益健康作用的活的微生物。天然肠微生物区系包含许多益生菌微生物。热灭活的益生菌指已被加热杀死的益生菌。
术语组合物或物品中特定要素或组分的“重量份”，指用重量份表示的组合物或物品中的所述要素或组分和任何其它要素或组分之间的重量关系。因此，在含有2重量份的组分X和5重量份的组分Y的化合物中，X和Y以2:5的重量比存在，并以这样的比例存在，而不管化合物中是否包含另外的组分。
如本文所用的，组分的“%重量”，除非另外指出相反，均基于其中包含所述组分的制剂或组合物的总重量。因此，例如，20-55%重量浓度的组分意指该组分构成其中包含所述组分的组合物的总重量的20-55%。
试剂盒
上述材料，以及其它材料，可以任何合适的组合包装在一起，作为可用来实施或帮助实施所公开方法的试剂盒。如果在给定的试剂盒中的试剂盒组分被设计且适合在所公开的方法中一起使用时，则它是有用的。例如，公开了用于治疗面临HCC的风险或经诊断患有HCC的受试者的试剂盒，所述试剂盒包含热灭活的嗜酸乳杆菌(Moro) Hansen和Mocqu(ATCC 53103)、活的大肠杆菌Nissle 1917和热灭活的VSL#3®。
方法
公开了治疗肝细胞癌(HCC)的方法。所述方法包括口服给予面临HCC的风险或经诊断患有HCC的受试者益生菌组合物。益生菌组合物可以任何有效的方案给予。例如，益生菌组合物可每日给予。益生菌组合物可每日给予，持续至少一个月。受试者可被诊断患有HCC。受试者可面临HCC的风险。受试者可以是被诊断有乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或二者的受试者。受试者可以是暴露于黄曲霉毒素B1 (AFB1)的受试者。受试者可以是经诊断患有酒精中毒的受试者。
所述方法可进一步包括在给予益生菌组合物之前诊断受试者患有HCC。所述方法可进一步包括在给予益生菌组合物之前，诊断受试者面临HCC的风险。诊断受试者面临HCC的风险可包括诊断受试者有乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或二者。诊断受试者面临HCC的风险可包括诊断受试者已暴露于黄曲霉毒素B1 (AFB1)。诊断受试者面临HCC的风险可包括诊断受试者患有酒精中毒。
还公开了包括诊断受试者患有HCC或处于HCC的风险中和口服给予诊断为患有HCC或处于HCC的风险中的受试者益生菌组合物的方法。
还公开了通过实施或准备实施所公开的方法形成的混合物。例如，公开了包含热灭活的嗜酸乳杆菌(Moro) Hansen和Mocqu (ATCC 53103)、活的大肠杆菌Nissle 1917、热灭活的VSL#3®的混合物。所公开的益生菌制剂也可以是与例如食物、食物组分和常规食物补充填充剂和增量剂例如米粉的混合物。
每当所述方法包括混合组合物或组分或试剂或使组合物或组分或试剂接触时，实施所述方法形成许多不同的混合物。例如，如果所述方法包括3个混合步骤，在这些步骤的每一步骤之后形成独特的混合物，如果所述步骤独立进行的话。此外，在所有的步骤完成时(而不管所述步骤是如何进行的)形成混合物。本公开考虑通过实施所公开的方法获得的这些混合物以及含有任何所公开的试剂、组合物或组分的混合物(例如本文公开的)。
术语"一天的治疗"、"每日治疗"、"每日给予"和"每日摄取"可互换使用并意指在治疗期的每一天由患者摄取或给予患者的益生菌组合物的总剂量。如果治疗由患者自身给予，正确的剂量优选在含有正确剂量的医药产品的适当容器中提供。每日总剂量可便利地分成两个或更多个含有在当天中待摄取或给予的正确剂量的容器，例如作为当天的早餐和最后一餐。或者，患者或医务人员可从包含益生菌组合物的较大容器中测量每次给予的正确剂量。
术语病况或事件的“减少风险”指以下二者之一或二者：(a) 与病况或事件发生或存在的标准或参照可能性或概率比较，减少病况或事件发生或存在的可能性或概率和(b)与病况或事件的标准或参照量、大小、浓度、严重性、比率、阶段、进展和/或其它量度比较，减少或改善病况或事件(如果其发生的话)的量、大小、浓度、严重性、比率、阶段、进展和/或其它量度。例如，减少HCC的风险指以下二者之一或二者：(a) 如果HCC发生的话，减少HCC发生的可能性或概率和(b) 减少或改善HCC的严重性或阶段的量、大小、严重性、生长速率、阶段、进展和/或其它量度。与风险相关的任何一种作用或作用的组合可被认为是降低病况或事件的风险。例如，如果HCC一旦发生，其生长速率低于生长的标准或参照速率(如未治疗的HCC受试者的生长速率)，则HCC的风险可被认为已经减少。作为另一个实例，如果治疗的无HCC的受试者以比标准或参照比率更低的比率发生HCC，则HCC的风险可被认为已经减少。
术语“口服完全营养补剂”指可口服提供营养完全的营养给受试者的产品和制剂；即是说，可用作营养的唯一来源的产品和制剂。
术语“高”、“更高”、“增加”、提高”或“升高”指例如与对照比较，增加至基础或参照水平以上。术语“低”、“更低”、“减少”或“降低”指例如与对照比较，降低至基础或参照水平以下。
术语“减少”意指活性、量、大小、重量、比率、阶段、严重性、表达等的降低或减少。这可以是活性、量、大小、重量、比率、阶段、严重性、表达等的完全减少，或活性、量、大小、重量、比率、阶段、严重性、表达等的部分减少。减少可与对照或与标准水平比较。减少可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64,65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。
本文所用的术语“提供”指的是将化合物、分子、组分或组合物加至其他的事物中的任何手段，以及这样的加入行动。提供的实例可包含使用移液管、pipettemen、注射器、针、管道、枪等。这可以是手动的或自动的。它可包括通过任何方式的转染或提供核酸至器皿、细胞、组织、无细胞***的任何其它方式并可以是体外或体内的。
本文所用的术语“预防”指的是疾病或病况的临床症状发作前给予组合物，以防止与疾病或病况有关的异常的身体表现。
本文所用的术语“需要治疗”指的是由护理者(如在人的情况下的医师、护士、从业护士或个体；在动物(包括非人哺乳动物)情况下的兽医)作出的受试者需要治疗或将从治疗中受益的判断。这种判断根据各种因素作出，所述因素在护理给予者的专业知识领域内的，但包括因由本发明的化合物可治疗的病况所致，受试者生病或将生病的知识。
如本文所用的，“受试者”包括，但不限于动物、植物、细菌、病毒、寄生虫和任何其它生物体或实体。受试者可以是脊椎动物，更特别是哺乳动物(如，人、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、非人灵长类动物、牛、猫、豚鼠或啮齿动物)、鱼、鸟或爬行动物或两栖动物。受试者可以是无脊椎动物，更特别是节肢动物(如，昆虫和甲壳类动物)。该术语并不指明特定的年龄或性别。因此，成年和新生受试者，以及胎儿，无论是雄性或雌性，均意欲涵盖在内。患者指罹患疾病或病症的受试者。术语“患者”包括人和兽医受试者。
所谓“治疗”和"处理"意思是意欲治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或病症的受试者的医疗管理。该术语包括积极的治疗，即是说，特别针对疾病、病理状态或病症的改善的治疗，并且还包括病因治疗，即针对移除相关疾病、病理状态或病症的原因的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，即设计用于缓解症状而不是治愈疾病、病理状态或病症的治疗；预防性治疗，即针对最小化或部分地或完全地抑制与相关疾病、病理状态或病症的发展的治疗；和支持治疗，即用来补充针对相关疾病、病理状态或病症的改善的另一种特异性疗法的治疗。要理解，治疗，虽然意欲治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或病症，但不必在实际上导致治愈、改善、稳定或预防。治疗效果可如本文所述和如本领域已知的适合于所涉及的疾病、病理状态或病症的方法测量或评价。这样的测量和评价可在定性和/或定量方面作出。因此，例如，疾病、病理状态或病症的特征或特点和/或疾病、病理状态或病症的症状可以任何效果或任何量减少。
细胞可以在体外。或者，细胞可以在体内并可发现于受试者中。“细胞”可以是来自任何生物体(包括但不限于细菌)的细胞。
术语组合物的“有效量”指提供所需结果的组合物的无毒性但足够的量。如本文别处所讨论的，所需的精确量将在不同的受试者之间变化，取决于受试者的物种、年龄和一般状况、给予模式等。因此，不可能规定精确的“有效量”。然而，适当的有效量可由本领域普通技术人员仅使用常规实验确定。
所公开的益生菌组合物的剂量或量大到足以在发生递药的方法中产生所需效果。剂量不应大到引起不利的副作用，如不需要的交叉反应、过敏反应等。一般来说，剂量将随受试者的年龄、状况、性别和疾病的程度而变化并可由本领域技术人员确定。剂量可由个体医师根据所涉及的受试者的临床病况进行调整。剂量、剂量方案和给药途径可以变化。
所谓“药学上可接受的”意指不是生物学上或其它不希望的材料，即，材料可与经选择的化合物一起给予受试者，而不引起任何不希望的生物作用或以有害的方式与包含它的药用组合物的任何其它组分相互作用。
用途
公开了依据本发明的益生菌组合物在制备用于治疗或预防受试者的肝细胞癌(HCC)的食物补剂或治疗剂中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供依据本发明的益生菌组合物在制备用于治疗面临肝细胞癌(HCC)的风险或经诊断患有肝细胞癌(HCC)的受试者的食物补剂或治疗剂中的用途。食物补剂或治疗剂经口服给予面临HCC的风险或经诊断患有HCC的受试者。食物补剂或治疗剂可以任何有效的方案给予。例如，食物补剂或治疗剂可以每日给予。食物补剂或治疗剂可以每日给予，持续至少一个月。受试者可被诊断患有HCC。受试者可以面临HCC的风险。受试者可以是被诊断有乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或二者的受试者。受试者可以是暴露于黄曲霉毒素B1 (AFB1)的受试者。受试者可以是经诊断患有酒精中毒的受试者。
还公开了通过实施或准备实施所公开的方法形成的混合物。例如，公开了包含热灭活的嗜酸乳杆菌(Moro) Hansen和Mocqu (ATCC 53103)、活的大肠杆菌Nissle 1917、热灭活的VSL#3®的混合物。所公开的益生菌制剂也可以是与例如食物、食物组分和常规食物补充填充剂和增量剂例如米粉的混合物。
每当食物补剂或治疗剂的制备包括混合组合物或组分或试剂或使组合物或组分或试剂接触时，实施所述方法产生许多不同的混合物。例如，如果食物补剂或治疗剂的制备包括3个混合步骤，在这些步骤的每一步骤之后形成独特的混合物，如果步骤独立进行的话。此外，在所有的步骤完成时(而不管所述步骤是如何进行的)形成混合物。本公开考虑通过实施所公开的方法获得的这些混合物以及含有任何所公开的试剂、组合物或组分的混合物(例如本文公开的)
在益生菌组合物和方法的章节中描述的术语和定义也适用于用途实施方案。
本文提及或引用的所有的专利、专利申请、临时申请和出版物通过参考以其全文(包括所有的附图和表格)结合至它们与本说明书的明确的教导不会不一致的程度。
以下是说明实施本发明的程序的实施例。这些实施例不应被理解为限制。所有的百分比均以重量计并且所有的溶剂混合比例以体积计，除非另外指明。
实施例1—ProHep治疗减少肿瘤大小。
测试了细菌的益生菌混合物对HCC动物模型的作用。在用1x107 Hepa106细胞皮下肿瘤接种之前1周开始，雄性C57BL/6N小鼠(5-6周龄)每日喂给治疗有效量的益生菌，持续共45天。发现在用热灭活的细菌和活细菌二者饲喂的动物中肿瘤大小显著较小(图1)。对VSL#3®组的分析揭示，较小的肿瘤大小似乎与Treg标记TGFB (R=0.5, p<0.05)、Th17标记RORC (R=0.5, p<0.05)和血管生成标记 ANGPT2 (R=0.6, p<0.05)、TIE1 (R=0.6, p<0.01)、VE-钙粘蛋白(R=0.7, p<0.005)的较低的表达水平相关，提示益生菌消费可调节肿瘤中的T细胞亚群并且这可能对肿瘤血管生成有影响(图2)。
在另一项研究中，C57BL6/N小鼠用1x107 Hepa1-6肿瘤细胞皮下接种，而肿瘤大小用测径器监测38天。从肿瘤接种之前1-周(p: ProHep预防)或者在肿瘤接种的同一天(pt:ProHep治疗)开始，小鼠每日喂给ProHep食物。给予顺铂(一种常用的化疗药物)作为阳性对照，剂量为0.25mg/mL，每3天i.p.给予，1个月后肿瘤体积在益生菌组中显著较小(图3A)。与对照比较，在实验结束时切除的肿瘤在预防组中具有较轻的重量(*p<0.05) (图3B)。统计学分析采用单向ANOVA，事后Tukey多重比较检验。
实施例2—肿瘤生长受限于缺氧增加。
死亡细胞的TO-PRO-3染色的全部肿瘤切片的共焦图像示于图4A中。比例尺，200 µm。图4B、C和D显示对于(B) Ki67、(C) 胱天蛋白酶3和(D) GLUT-1 (蓝)和CD31 (红)的代表性肿瘤切片的免疫染色。比例尺，50 µm。在ProHep组中观察到细胞死亡面积的显著增加，然而，在增殖细胞(Ki67+)和凋亡细胞(胱天蛋白酶-3+)的数目方面没有显著的差异，提示减小的肿瘤大小与减少的生长和增加的细胞凋亡无关，但与坏死增加有关。同时，缺氧面积(GLUT-1)的显著增加发现于ProHep预防(p)组中，提示减小的肿瘤大小很可能与缺氧诱导的细胞死亡有关。
实施例3—ProHep抑制皮下HCC模型中的血管生成。
代表性肿瘤切片的微血管密度示于图5A中。图5B显示在多个共焦平面叠加后，由共焦Z堆栈获得的三维模型的图像。与对照比较，显著较小的微血管密度、相对的血管面积和血管芽在ProHep组中被观察到(*p < 0.05；**, p < 0.01；∗∗∗, p < 0.001)。
实施例4—ProHep治疗下调肿瘤中促血管生成基因的表达。
图6A显示在全部肿瘤溶胞产物中通过实时定量PCR (RT-qPCR)的基因表达。Hprt被用作参考基因。*p < 0.05；**, p < 0.01；∗∗∗, p < 0.001。图6B显示通过分层基因聚类分析的差异基因表达的相关性。在ProHep组中的较小肿瘤负荷可与Th17 (RORC, IL-17)和血管生成标记(VE-钙粘蛋白、ANG2、KDR、FLT、TEK和TGFB)的较低表达水平相关。
实施例5— ProHep以IL-17-依赖性方式预防肿瘤生长。
图7A显示在代表性肿瘤切片中IL-17的免疫染色。IL-17+细胞的密度在ProHep组中显著较小。C57BL/6N小鼠用肿瘤接种并用抗-IL-17抗体(200 µg/天)或对照大鼠IgG注射。监测肿瘤大小1个月。小鼠从肿瘤接种前1周开始喂给对照或者ProHep食物。如图7B中所示，ProHep在IL-17中和后未能显示对肿瘤发展的任何作用。C) 在肿瘤中的% MDSC的流式细胞术分析显示减少的MDSC在ProHep和IL-17中和中的浸润(图7C)。
实施例6— ProHep预防与Th17有关的肿瘤生长。
图8A显示用IL-17染色(蓝)的与CD3 (左小图)、CD11b (中小图)和MPO (右小图)共染色(红色)的肿瘤切片的共焦图像。比例尺，50 µm。图8B显示% Th亚群在肿瘤中的流式细胞术分析。图8C显示% Th17、MVD和肿瘤大小的相关性分析。图8D显示Th17在肿瘤中的表型分析，和图8E显示经流式细胞术进行的Th17在各种器官中的频率。
免疫染色显示，在肿瘤中的大多数IL-17+细胞被发现是CD3+细胞。由于Th细胞被报道是IL-17的主要生产者，Th亚群表型分析通过流式细胞术进行并发现Th17亚群在肿瘤微环境中显著减少，以及发现它们的群体与减少的MVD和肿瘤大小相关。在肿瘤中的Th17已表达迁移性表型CCR6，提示这些细胞可从外周部位募集。流式细胞术分析显示Th17经由循环从肠向肿瘤的募集减少的趋势。
实施例7— ProHep食物减小幼稚CD4+ T细胞分化成Th17的能力。
幼稚CD4+CD62L+ T细胞从喂饲对照或ProHep食物的小鼠肠分离并在抗-CD3和抗-CD28的存在下，经72小时分化为Th1、Th2、Th17或Treg细胞。图9A显示Tbet、Gata3、Rorγt和Foxp3 mRNA表达的RT-qPCR分析。表达相对于Gapdh表达呈现。Th17转录因子Rorγt的明显下调被观察到。图9B显示出在分化3天的CD4+ T细胞的上清液中经ELISA测定的细胞因子分泌。IL-17 (右小图)的产生下降，而IFN-γ (left小图)和IL-4 (中小图)从Th1和Th2的产生未受影响。图9C显示在极化条件下，对5天培养物评估的自幼稚CD4+ T细胞衍生的% Th1(CD4+IFN-γ+)、Th2 (CD4+IL-4+)和Th17 (CD4+IL-17+)的流式细胞术分析。显示出来自3个独立的实验的代表性数据。Th17极化的显著减少被观察到。
讨论
在该研究中，描述了益生菌经由肿瘤微环境中的免疫调节在HCC治疗中的用途。益生菌被定义为活的微生物，当其以适量给予时，对宿主提供健康益处。发现包含(a) 热灭活的嗜酸乳杆菌(Moro) Hansen和Mocqu (ATCC 53103)，(b) 活的大肠杆菌Nissle 1917，和(c) 热灭活的VSL#3®的有益的益生菌制剂(ProHep)当每日口服给予38天时，有效减少小鼠皮下HCC生长。在益生菌组中的肿瘤大小从31天开始显著小于对照组，而当在肿瘤接种前1周给予ProHep时,有益作用可甚至在更早的时侯(第28天)观察到。但是，益生菌组的抗癌作用比药物(顺铂)治疗组的效力低。
在益生菌组中的较小肿瘤大小不大可能是由于减少细胞增殖，但可能与坏死性细胞死亡的增加有关，因为免疫组织化学染色揭示，肿瘤组织中的Ki67+细胞的数目没有显著的差异，而有较大面积的细胞死亡(TO-PRO3)，并且胱天蛋白酶3+凋亡细胞的数目没有显著的变化。同时，缺氧(GLTU-1+)面积的增加在益生菌组中观察到，提示细胞死亡的增加可能与由于血管生成的减少所致的缺氧增加有关。确实，平均微血管密度、血管的面积百分比/肿瘤切片和血管芽的数目(如PECAM-1+细胞所定量的)在益生菌治疗的小鼠中建立的肿瘤与对照组比较均显著较低。在益生菌组中的肿瘤的RT-qPCR分析已显示几种血管生成基因(包括ANG2、FLT-1、KDR、TIE、TGFB)的表达减少，其中它们的表达经分层基因聚类已经与IL-17和RORC表达的减少相关，提示产生Th17或IL-17的细胞可涉及益生菌介导的对HCC生长的作用。这一观点得到以下观察的进一步的支持：益生菌组的肿瘤切片中的IL-17+细胞减少，和肿瘤生长的类似的减少可在IL-17抗体中和后在益生菌组和对照组中观察到。虽然几种免疫细胞已经用这些发现进行了报道，但大多数IL-17+细胞与CD3共染色，和肿瘤浸润Th17群体在益生菌组中已经下降。流式细胞术分析显示，在IL-17中和和益生菌治疗后血管生成细胞(如骨髓衍生的抑制细胞)向肿瘤微环境的浸润减少。这些数据一起提示了益生菌通过调节经由Th17的免疫细胞浸润在损害肿瘤血管生成中的作用。
由于肿瘤微环境中的大多数Th17细胞具有表达的迁移表型(CCR6+)，有可能Th17被***募集到肿瘤微环境中。肠似乎是Th17的潜在来源，因为在益生菌组的肠中通过流式细胞术发现Th17群体减少，但在其它器官如脾、肠系膜***、血液、肝中没有发现这样的减少。益生菌可减少幼稚T细胞在肠中分化为Th17细胞的能力。在激活从饲喂益生菌的小鼠肠分离的幼稚T细胞后，Th17的转录因子Rorc的基因表达减少，但TH1、TH2和Treg的转录因子的基因表达未减少。此外，经ELISA测定，从Th17细胞产生的IL-17A减少，而从饲喂益生菌食物的小鼠衍生的TH1和TH2细胞的IFN-γ或IL-4分泌未受影响。通过流式细胞术进行的细胞内染色分析也证实从TH17细胞的IL-17A分泌受到抑制。总之，这些结果提示，益生菌选择性影响肠中的Th17细胞分化和其向肿瘤微环境的募集。
总之，我们的发现提供了一种用益生菌组合物通过免疫调节减少HCC生长的方法和为开发更有效的癌症疗法开辟了新的途径。
应该理解本文描述的实施例和实施方案仅仅是为了举例说明的目的，且依据其的各种修饰或变化将对本领域技术人员提出并被包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求书的范围内。此外，本文公开的任何发明或其实施方案的任何要素或限制可与本文公开的任何其它发明或其实施方案的任何和/或所有其它要素或限制(各别地或以任何组合)组合，且所有这样的组合均预期在本发明范围内，而不对其限制。
必须注意到，如本文以及所附权利要求书所用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非文中另外清楚地指明。因此，例如，提及"一个组合物"时包括多个这样的组合物，提及"该组合物"是指一或多个组合物及其本领域技术人员已知的等价物等。
在本申请的说明书和权利要求书全文中，措辞“包含”及该措辞的变化如“含有”和“包括”意指“包括但不限于”，并且不打算排除例如其它添加剂、组分、整数或步骤。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件、环境或材料可以或可以不出现或存在，和说明书包括其中事件、环境或材料出现或存在的情况和其中事件、环境或材料不出现或不存在的情况。
范围在本文可表示为从"约"一个特定值和/或至"约"另一个特定值。当表示这样一个范围时，也特别地预期和考虑公开了从一个具体值和/或至另一个具体值的范围，除非文中另外具体地指明。类似地，当值通过在前面使用“约”而表示为近似值时，应该理解，特定值形成另一个特别构思的、应考虑为公开的实施方案，除非文中另外具体地指明。还应理解，各个范围的端点相对于另一端点和独立于另一端点都是有意义的，除非文中另外具体地指明。最后，应该理解，明确公开的范围内包含的所有的单个值和值的子范围也特别地预期并应认为是公开的，除非文中另外具体地指明。不论在具体的情况下某些或所有这些实施方案是否已明确地公开，前述均适用。
除非另外限定，本文所用的全部技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属领域技术人员通常理解相同的意义。虽然与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明的方法和组合物，描述了特别有用的方法、装置和材料。本文引用的出版物和因其而引用它们的材料通过引用而特别地结合到本文中。本文所有内容均不应视为承认本发明无权通过在先发明而先于这样的公开。不做出任何参考文献构成现有技术的承认。对参考文献的讨论陈述它们的作者声称的内容，申请人保留挑战所引用文件的准确性和切合性的权利。应该清楚地理解，虽然许多出版物在本文被提及，但这样的参考文献并不构成承认任何这些文件形成本领域的普通常识的一部分。
虽然材料、组合物、组分、步骤、技术等的描述可包括许多选项和替代，但这不应视为和不承认这样的选项和替代彼此是等同的或者尤其是明显的替代。因此，例如，不同细菌的列表并不表明所列的细菌彼此是明显的，也不是承认等同或显而易见的。
本领域的技术人员将认识到，或能够使用仅仅常规的实验确定，本文所述的方法和组合物的特定实施方案的许多等同物。这样的等同物意欲由所附的权利要求书涵盖。

Claims (17)

1.一种包含有效量的细菌组合的用于治疗/预防癌症的益生菌组合物，其中所述细菌的组合包含(a) 热灭活的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) (Moro) Hansen和Mocqu (ATCC 53103)，(b) 活的大肠杆菌(Escherichia coli)Nissle1917，和(c) 热灭活的选自以下的细菌：短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)及其任何组合。
2.权利要求1的益生菌组合物，所述细菌的组合有效减少肝细胞癌(HCC)生长。
3.权利要求1的益生菌组合物，其中细菌(a)、(b)和(c)各自独立地以20-55%重量的浓度存在于益生菌组合物中。
4.权利要求1的益生菌组合物在制备用于治疗面临肝细胞癌(HCC)的风险或经诊断患有肝细胞癌(HCC)的受试者的药物中的用途。
5.权利要求4的用途，其中益生菌组合物每日给予。
6.权利要求4的用途，其中益生菌组合物每日给予，持续至少一个月。
7.权利要求4的用途，其中受试者被诊断患有HCC。
8.权利要求4的用途，其中受试者面临HCC的风险。
9.权利要求8的用途，其中受试者被诊断有乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或二者。
10.权利要求8的用途，其中受试者已经暴露于黄曲霉毒素B1 (AFB1)。
11.权利要求8的用途，其中受试者被诊断患有酒精中毒。
12.权利要求4的用途，其中所述治疗还包括在给予药物之前，诊断受试者患有HCC。
13.权利要求4的用途，其中所述治疗还包括在给予药物之前，诊断受试者面临HCC的风险。
14.权利要求13的用途，其中诊断受试者面临HCC的风险包括诊断受试者有乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或二者。
15.权利要求13的用途，其中诊断受试者面临HCC的风险包括诊断受试者已暴露于黄曲霉毒素B1 (AFB1)。
16.权利要求13的用途，其中诊断受试者面临HCC的风险包括诊断受试者患有酒精中毒。
17.益生菌组合物在制备用于治疗面临肝细胞癌(HCC)的风险或经诊断患有肝细胞癌(HCC)的受试者的口服药物中的用途，所述益生菌组合物包含有效量的细菌的组合，其中所述细菌的组合包含(a) 热灭活的嗜酸乳杆菌(Moro) Hansen和Mocqu (ATCC 53103)，(b)活的大肠杆菌Nissle1917，和(c) 热灭活的选自以下的细菌：短双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、类干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌及其任何组合。
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