CN106687130B - 真杆菌属在预防和治疗结直肠癌相关疾病中的用途 - Google Patents

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Abstract

公开了微生物特别是真杆菌菌株在治疗和预防结直肠癌相关的疾病中的应用。涉及了包含真杆菌菌株的组合物。

Description

真杆菌属在预防和治疗结直肠癌相关疾病中的用途
相关申请的交叉引用
无
领域
本发明涉及微生物学，具体地，本发明涉及在本申请中治疗和预防结直肠癌相关疾病的真杆菌属细菌菌株，并且还涉及包含真杆菌属细菌的组合物及其应用。
背景
结直肠癌(CRC)是第三最常见的癌症形式，并且是西方世界中癌症相关死亡的第二主要原因(Schetter AJ，Harris CRC(2011)Alterations of microRNAs contribute tocolon carcinogenesis.Semin Oncol 38：734-742，通过引用并入本文)。许多人被诊断患有CRC，并且每年许多患者在全世界死于该疾病。虽然目前的策略，包括手术，放射治疗和化疗，对于CRC具有显著的临床价值，但是手术后癌症的复发和转移阻碍了这些治疗方式的成功。
发生在炎症性肠病(IBD)中的慢性肠炎症诱导沿胃肠道的持续损伤和增强的粘膜通透性，在结直肠癌(CRC)的发展中起重要作用。与家族性腺瘤性息肉病和遗传性非息肉病的遗传性综合征一起，IBD是CRC的前三种高风险条件(Xie J，Itzkowitz SH(2008)Cancerin inf lammatory bowel disease.World J Gastroenterol 14：378-389，通过引用并入本文)。在溃疡性结肠炎(UC)患者中，IBD的两种主要临床表现之一，发展CRC的相对风险与疾病的程度和持续时间相关(Eaden JA，Abrams KR，Mayberry JF(2001)The risk ofcolorectal cancer in ulcerative colitis：a meta-analysis.Gut 48：526-535，通过引用并入本文)。在IBD患者中，这种风险在8-10年后每年增加0.5-1.0％(Munkholm P(2003)Reviewarticle：the incidence and prevalence of colorectal cancer in inflammatory bowel disease.Aliment Pharmacol Ther 18Suppl 2：1-5，通过引用并入本文)。
包含约100万亿微生物的人肠微生物区系在通过吸收代谢物(例如维生素和短链脂肪酸)维持宿主健康(在胃肠道和全身)中起关键作用(Moore WE，Holdeman LV(1974)Human fecal flora：the normal flora of 20 Japanese-Hawaiians.Appl Microbiol27：961-979，通过引用并入本文)。最近的研究已经证明，细菌的特定菌株涉及肠内稳态的调节，向上皮，粘膜免疫***和肠的神经肌肉活性递送调节信号(Shanahan F(2004)Probiotics in inf lammatory bowel disease-therapeutic rationale and role.AdvDrug Deliv Rev 56：809-818，通过引用并入本文)。此外，人肠微生物组的一些共生和致病生物在IBD和CRC的发病机理中是必需的。因此，通过使用益生菌操纵肠细菌组成和局部代谢物已被探索为用于CRC治疗干预的有希望的途径。益生菌是活的微生物饲养添加剂，有利地影响宿主的健康。它们依赖于将特定的外源菌株引入肠微生物区系中。为了CRC的研究，发明人在宏基因组学领域进行分析，呈现来自CRC肠微生物组的深度宏基因组分析的数据。
发明概述
本公开的实施方案试图至少在某种程度上解决现有技术中存在的问题中的至少一个。
本发明基于本发明人的以下发现：
肠微生物群的评估和表征已经成为人类疾病的主要研究领域，所述疾病包括结直肠癌(CRC)，这是所有类型的癌症中最常见的死亡原因之一。为了对CRC患者中的肠微生物含量进行分析，本发明人进行了宏基因组-全联合研究(Megagenome-Wide AssociationStudy,MGWAS)的方案(Qin，J.等人A metagenome-wide association study of gutmicrobiota in type 2diabetes.Nature 490,55-60(2012)，通过引用并入本文)，其基于来自128个中国个体的肠微生物DNA的深度鸟枪法测序。本发明人鉴定了2种益生菌。然后本发明人分别验证了益生菌与结肠炎和CRC相关的动物实验。动物实验的结果证明了凸腹真杆菌(Eubacterium ventriosum)和挑剔真杆菌(Eubacteriumeligens)有效预防和治疗结肠炎和结直肠癌的能力。
附图简述
通过结合附图的以下描述，本公开的这些和其他方面和优点将变得清楚和更容易理解，其中：
图1显示了本研究中所有微生物基因的P值关联统计分布。CRC p值分布的关联分析鉴定了在较低P值下强相关标记物的不成比例的过度表现，其中大多数基因在零假设下遵循预期的P值分布。这表明显著的标记物可能代表真实而不是假的关联。
图2胃内给予的凸腹真杆菌ATCC 27560，凸腹真杆菌L2-12，凸腹真杆菌STAFF1042，挑剔真杆菌ATCC 27750，挑剔真杆菌STAFF1020，挑剔真杆菌TSDC10.2-1.1分别对DSS诱导的结肠炎C57BL/6J在(A)体重减轻、(B)疾病活动指数和(C)结肠长度方面的保护作用。数据表示为平均值±标准误差。不同的星号(*)表示显著差异(*P<0.05，**P<0.01，***p<0.001)。
图3在诱导结肠炎后第15天获得的结肠中使用ELISA(A)TNF-α和(B)IL-10进行的定量。数据表示为平均值±标准误差。不同的星号(*)表示显著差异(*P<0.05，**P<0.01，***p<0.001)
图4凸腹真杆菌ATCC 27560，凸腹真杆菌L2-12，凸腹真杆菌STAFF1042，挑剔真杆菌ATCC 27750，挑剔真杆菌STAFF 1020，挑剔真杆菌TSDC10.2-1.1分别对(A)疾病活动指数和(B)结肠组织病理的治疗作用。不同的星号(*)表示显著差异(*P<0.05，**P<0.01，***p<0.001)
图5凸腹真杆菌ATCC 27560，凸腹真杆菌L2-12，凸腹真杆菌STAFF1042，挑剔真杆菌ATCC 27750，挑剔真杆菌STAFF 1020，挑剔真杆菌TSDC10.2-1.1分别调控BABL/C小鼠中结肠基因表达(相对于β-肌动蛋白)。数据表示为平均值±标准误差。不同的星号(*)表示显著差异(*P<0.05，**P<0.01，***p<0.001)。
详细描述
本文使用的术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。诸如“一种”，“一个”和“该”的术语不旨在仅指单数实体，而是包括特定实施例可以用于说明的一般类别。本文中的术语用于描述本发明的具体实施方案，但是它们的用法不限制本发明，除非在权利要求中概述。
一方面，本申请提供了用于预防或治疗结肠炎和/或结直肠癌的挑剔真杆菌或凸腹真杆菌。另一方面，本申请提供了挑剔真杆菌或凸腹真杆菌用于制备用于预防或治疗结肠炎和/或结直肠癌的药物的用途。另一方面，本申请提供了用于预防或治疗结肠炎和/或结直肠癌的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的挑剔真杆菌或凸腹真杆菌。在另一方面，本申请提供了包含挑剔真杆菌或凸腹真杆菌以及其用作药物的说明书的试剂盒。本申请还提供了包含挑剔真杆菌或凸腹真杆菌和药学上可接受的载体的药物组合物。
优选地，挑剔真杆菌是选自由以下组成的组的菌株：挑剔真杆菌ATCC 27750，挑剔真杆菌STAFF 1020和挑剔真杆菌TSDC10.2-1.1。优选地，所述凸腹真杆菌是选自由以下组成的组的菌株：凸腹真杆菌ATCC27560，凸腹真杆菌L2-12和凸腹真杆菌STAFF1042。在一个实施方案中，以活的挑剔真杆菌或凸腹真杆菌或其代谢产物的形式施用挑剔真杆菌或凸腹真杆菌。
本发明在以下非限制性实施例中进一步举例说明。除非另有说明，份和百分比以重量计，度数为摄氏度。对于本领域普通技术人员显而易见的是，虽然指示本发明的优选实施方案，但这些实施例仅以说明的方式给出，并且试剂都是商购可获得的。
实施例
实施例1.鉴定来自128个中国个体的益生菌
1.1样品收集和DNA提取
在知情同意的情况下，在威尔斯亲王医院(Prince of Wales Hospital)收集来自128名受试者的粪便样品，包括74个结直肠癌患者和54个健康对照(表1)。为了有资格纳入本研究，个人必须符合以下粪便样品收集标准：1)没有服用抗生素或其他药物，没有特定饮食(糖尿病患者，素食者等)和正常生活方式(没有额外的压力)至少3个月；2)任何医疗干预后至少3个月；3)没有结肠直肠手术，或任何种类的癌症，或肠的炎症或感染性疾病的病史。要求受试者在家中在标准化容器中在结肠镜检查之前收集粪便样品，并立即将样品储存在家用冷冻箱中。然后将冷冻样品在绝缘聚苯乙烯泡沫容器中运送到威尔士亲王医院，并立即储存在-80℃直到使用。
将粪便样品在冰上解冻，并使用QiagenQIAamp DNA Stool Mini Kit根据制造商的说明书进行DNA提取。提取物用无DNA酶的RNA酶处理以消除RNA污染。使用NanoDrop分光光度计，Qubit荧光计(具有Quant-iTTMdsDNA BR测定试剂盒)和凝胶电泳测定DNA量。
表1组I中结直肠癌病例和对照的基线特征。BMI：身体质量指数；eGFR：表皮生长因子受体；DM：2型糖尿病。
参数 对照组(n＝54) 病例(n＝74)
年龄 61.76 66.04
性别(M：F) 33:21 48:26
BMI 23.47 23.9
eGFR 72.24 74.15
DM(％) 16(29.6％) 29(39.2％)
肠型(Enterotype)(1：2：3) 26:22:6 37:31:6
疾病阶段(1：2：3：4) n.a. 16:21:30:7
位置(近端：远端) n.a. 13:61
1.2DNA文库构建和测序
按照制造商的说明书(Illumina HiSeq 2000平台)进行DNA文库构建。本发明人使用与先前所述相同的工作流程来进行簇生成，模板杂交，等温扩增，线性化，封闭和变性，以及测序引物的杂交(Qin，J.等人A metagenome-wide association study of gutmicrobiota in type 2 diabetes.Nature 490,55-60(2012)，通过引用并入本文)。
发明人对于每个样品构建了一个具有***片段大小为350bp的双末端(PE)文库，随后进行高通量测序以获得长度为2x100bp的约30,000,000 PE读数。通过从原始数据过滤具有'N'碱基的低质量读数、衔接头污染和人源DNA污染，以及通过同时修剪读取的低质量末端碱基，来提取高质量读数。产生了751,000,000个宏基因组读数(高质量读数)(平均每个个体有5,860,000个读数，表2)。
1.3读数映射
本发明人将高质量读数映射到基因目录(表2)至由欧洲和中国成年人建立的公开的参考肠基因目录(Qin，J.等人A metagenome-wide association study of gutmicrobiota in type 2 diabetes.Nature 490,55-60(2012)，通过引用并入本文)(同一性≥90％)，基于此，本发明人使用Qin等人(2012，同上)中公开的T2D文章(paper)的相同方法衍生基因谱(gene profile)。从参考基因目录(gene catalogue)如Qin等人(2012，同上)，本发明人衍生了出现在所有128个香港样品中的至少6个样品中的2,110,489(2.1M)个基因的子集。
表2.宏基因组数据和映射到参考基因目录的总结。第四列报告来自Wilcoxon秩和检验的结果。
参数 对照 病例 P-值
平均原始读数 60162577 60496561 0.8082
删除低质量读数后 59423292(98.77％) 59715967(98.71％) 0.831
删除人读数后 59380535±7378751 58112890±10324458 0.419
映射率 66.82％ 66.27％ 0.252
1.4影响肠微生物群基因谱的因素分析
为了确保128个宏基因组的基因含量的鲁棒比较(robust comparison)，本发明人创建了一组2,110,489(2.1M)个基因，其存在于至少6个受试者中，并且使用这210万个基因产生128个基因丰度谱(abundance profile)。发明人使用置换多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance)(PERMANOVA)检验来评估不同特征(包括年龄，BMI，eGFR，TCHO，LDL，HDL，TG，性别，DM，CRC状态，吸烟状况和位置)对2.1M基因的基因谱的影响。本发明人使用在R中的“vegan”包中实施的方法进行分析，并且通过10,000次排列获得经排列的p值。本发明人还用Benjamini-Hochberg方法使用R中的“p.adjust”来校正多重检验，以获得每个基因的q值。
当发明人对13种不同的协变量进行置换多元方差分析(PERMANOVA)时，仅CRC状态与这些基因谱显著相关(q＝0.0028，表3)，显示出比第二最佳决定因素BMI(身体质量指数)更强的关联(q＝0.15)。因此，数据表明CRC患者微生物组中基因组成的改变。
表3.使用微生物基因谱的PERMANOVA分析。进行分析以测试临床参数和结直肠癌(CRC)状态是否对肠微生物群具有显著影响(q<0.05)。BMI：身体质量指数；DM：2型糖尿病；HDL：高密度脂蛋白；TG：甘油三酯；eGFR：表皮生长因子受体；TCHO：总胆固醇；LDL；低密度脂蛋白。
Figure BDA0001218902460000071
Figure BDA0001218902460000081
1.5由MGWAS鉴定的CRC相关基因
1.5.1结直肠癌相关基因的鉴定。本发明人进行了宏基因组关联分析(MGWAS)以鉴定对CRC中改变的基因组成有贡献的基因。为了鉴定宏基因组谱和结直肠癌之间的关联，在2.1M(2,110,489)个基因谱中使用双侧Wilcoxon秩和检验。发明人获得了140,455个基因标记物，其在病例或对照中富集，P<0.01(图1)。
1.5.2估计假阳性率(FDR)。代替顺序P值排除方法，本发明人应用了在先前研究中提出的“qvalue”方法(J.D.Storey，R.Tibshirani，Statistical significance forgenomewide studies.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 100，9440(2003年8月5日)，通过引用并入本文)来估计FDR。在MGWAS中，对140,455个基因的大量特征进行了统计假设检验。假阳性率(FDR)为11.03％。
1.6数据谱构建
基于上述获得的128个微生物群的测序读数，发明人检查了对照和CRC相关微生物群之间的分类学差异，以鉴定引起生态失调的微生物群。为此，本发明人使用源自三种不同方法的分类学谱(taxonomic profile)，因为来自多种方法的支持证据将加强关联。首先，本发明人将宏基因组学读数映射到IMG数据库(版本400)中的4650个微生物基因组，并估计包括在该数据库中的微生物物种(表示为IMG物种(denoted IMG species))的丰度。其次，本发明人使用通用***发育标记物基因(universal phylogenetic marker gene)估计物种水平的分子操作分类单位(mOTU)的丰度。第三，发明人将由MGWAS鉴定的140,455个基因组织成代表来源于相同基因组的基因簇的宏基因组连锁群(MLG)，尽可能地使用IMG数据库在物种水平注释MLG，基于这些物种注释分组MLG，然后估计这些物种的丰度(表示为MLG物种)。
1.6.1 IMG基因组的物种注释(Species annotation)
对于每个IMG基因组，使用由IMG提供的NCBI分类鉴别器，发明人使用NCBI分类转储文件(taxonomy dump file)在物种和属水平上鉴定了相应的NCBI分类学分类。没有相应NCBI物种名称的基因组被保持其原始IMG名称，其中大多数未分类。
1.6.2基因谱
本发明人将高质量读数映射到基因目录至由欧洲和中国成年人建立的公开的参考肠基因目录(Qin，J.等人A metagenome-wide association study of gut microbiotain type 2 diabetes.Nature 490，55-60(2012)，通过引用并入本文)(同一性≥90％)，基于此，本发明人使用与Qin等人(2012，同上)中公开的T2D文章的相同方法衍生基因谱。
1.6.3 mOTU谱
使用默认参数(S.Sanagawa等人，Metagenomic species profiling usinguniversal phylogenetic marker genes. Nature methods 10,1196(Dec，2013)，通过引用并入本文)将洁净读数(实施例1中的高质量读数)与mOTU参考(总共79268个序列)比对。鉴定了549个物种水平的mOTU，包括307个经注释的物种和242个没有代表性基因组的mOTU连锁群，其被推定为厚壁菌门(Firmicutes)或拟杆菌门(Bacteroidetes)。
1.6.4 IMG物种和IMG属谱
从下载自http：//ftp.jgi-psf.org的IMG v400参考数据库(V.M.Markowitz等人，IMG：the Integrated Microbial Genomes database and comparative analysissystem. Nucleic acids research 40，D115(Jan，2012)，通过引用并入本文)提取细菌，古细菌和真菌序列。总共获得522,093个序列，并且基于原始文件的7个相等大小的块(chunk)构建SOAP参考索引(reference index)。使用SOAP比对器(R.Li等人，SOAP2：an improvedultrafast tool for short read alignment，Bioinformatics 25,1966(Aug 1，2009)，通过引用并入本文)2.22版，使用参数“-m 4 -s 32 -r 2 -n 100 -x 600 -v 8-c 0.9 -p 3”将洁净读数与参考比对。然后，使用SOAP覆盖软件(coverage software)来计算每个基因组的阅读覆盖，用基因组长度标准化，并进一步针对每个个体样品的相对丰度进行标准化。谱仅基于唯一映射的读取而生成。
1.7结直肠癌相关物种的鉴定
基于鉴定的140,455个结直肠癌相关标记物基因谱，本发明人使用在先前的2型糖尿病研究中描述的方法(如Qin等人2012，同上)构建结直肠癌相关MLG。所有基因与IMG数据库v400的参考基因组比对以获得基因组水平注释。如果>50％组成型基因注释到基因组，则将MLG指定给该基因组，否则其被称为未分类的。选择基因数超过100的总共87个MLG作为结直肠癌相关MLG。这些MLG基于这些基因组的物种注释来分组，以构建MLG物种。
为了估计MLG物种的相对丰度，发明人在去除5％最低和5％最高丰度基因后，估计MLG物种的基因的平均丰度。通过合计属于该物种的IMG基因组的丰度来估计IMG物种的相对丰度。
这些分析鉴定了与CRC状态显著相关的30个IMG物种，21个mOTU和86个MLG物种(Wilcoxon秩和检验，q<0.05；参见表4，5)。在所有三种方法(Wilcoxon秩和检验-IMG：q＝0.0414；mOTU：q＝0.012757；MLG：q＝5.446×10-4)中，凸腹真杆菌一致地富集在对照微生物群中，并且根据两个方法富集了挑剔真杆菌(Wilcoxon秩和检验-IMG：q＝0.069；MLG：q＝0.00031)。这些结果表明，这两种物种均在预防和治疗CRC相关疾病中作为益生菌具有很大的能力。
另一方面，Parvimonas micra(q<1.80x10-5)，Peptostreptococcus stomatis(q<1.80x10-5)，Solobacterium moorei(q<0.004331)和具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)(q<0.004565)在所有三种方法中一致地富集在CRC患者微生物群中。P.stomatis与口腔癌有关(S.Pullalkar等人，Comparison of oral microbiota in tumorand non-tumor tissues of patients with oral squamous cell carcinoma.BMCmicrobiology 12,144(2012)，通过引用并入本文)，S.moorei与菌血症有关(R.M.Pedersen，H.M.Holt，U.S.Justesen，Solobacterium moorei bacteremia：identification，antimicrobial susceptibility，and clinicalcharacteristics.Journal of clinical microbiology 49,2766(2011年7月)，通过引用并入本文)。使用16S rRNA测序的最近研究已经观察到具核梭杆菌在CRC肿瘤样品中显著富集(M.Castellarin等人，Fusobacterium nucleatum infection is prevalent in humancolorectal carcinoma.Genome research 22,299(Feb，2012)，通过引用并入本文)，并且这种细菌已显示具有粘性(G.Bachrach,C.Ianculovici,R.Naor,E.I.Weiss,Fluorescencebased measurements of Fusobacterium nucleatum coaggregation and offusobacterial attachment to mammalian cells.FEMS microbiology letters 248,235(Jul 15,2005)通过引用并入本文)，侵入性(Y.W.Han等人，Interactions betweenperiodontal bacteria and human oral epithelial cells：Fusobacterium nucleatumadheres to and invades epithelial cells.Infection and immunity 68,3140(Jun，2000)，通过引用并入本文)，和促炎症(A.D.Kostic等人，Fusobacterium nucleatumPotentiates Intestinal Tumorigenesis and Modulates the Tumor-ImmuneMicroenvironment.Cell Host Microbe 14,207(2013)，通过引用并入本文)特性。这些结果证实了在具有不同遗传和培养起源的新群体中的这种关联。然而，P.micra(专性厌氧细菌(obligate anaerobic bacterium)，其可以引起口腔感染如具核梭杆菌(G.sundqvist，Taxonomy，ecology，and pathogenicity of the root canal flora.Oral surgery，oralmedicine，and oral pathology 78,822(Oct，1994)，通过引用并入本文)在CRC相关的微生物中的高度显著的富集是一种新的发现。P.micra参与牙周病(periodontis)的病因学(B.H.Kremer等人，Peptostreptococcus micros smooth and rough genotypes inperiodontitis and gingivitis.Journal of periodontology 71,209(2000年2月)，通过引用并入本文)，并且其产生宽范围的蛋白水解酶并且使用胨和氨基酸作为能源(D.A.Murdoch，H.N.Shah，Reclassification of Peptostreptococcus magnus(Prevot1933)Holdeman and Moore 1972 as Finegoldia magna comb.Nov.andPeptostreptococcus micros(Prevot 1933)Smith 1957 as Micromonasmicroscomb.nov.Anaerobe 5,555(10//，1999)，通过引用并入本文)。已知它生产硫化氢(J.Carlsson，J.T.Larsen，M.B.Edlund，Peptostreptococcus micros has a uniquely high capacityto form hydrogen sulfide from glutathione.Oral microbiology and immunology 8,42(Feb，1993)，通过引用并入本文)，其促进肿瘤生长和结肠癌细胞的增殖(C.Szabo等人，Tumor-derived hydrogen sulfide，produced by cystathionine-beta-synthase，stimulates bioenergetics，cell proliferation，and angiogenesis in coloncancer.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 110,12474(2013年7月23日)，通过引用并入本文)。需要进一步的研究来验证P.micra是否参与CRC的发病机制，或其富集是否是结肠和/或直肠中CRC相关变化的结果。然而，它可能代表CRC的非侵入性诊断生物标记物的机会。
实施例2.动物实验中的验证
为了验证益生菌，凸腹真杆菌和挑剔真杆菌在预防和治疗CRC相关疾病中的能力，本发明人进行了动物实验。
2.1在与结肠炎相关的动物实验中的验证
2.1.1方法
在SPF条件下制备用于DSS诱导的结肠炎研究的十至十二周龄的C57BL/6J小鼠。在驯化后，部分小鼠随意获得含有3.5-5％DSS(葡聚糖硫酸钠)的饮用水，持续5天，用于结肠炎诱导。凸腹真杆菌ATCC27560，凸腹真杆菌L2-12，凸腹真杆菌STAFF 1042，挑剔真杆菌ATCC27750，挑剔真杆菌STAFF 1020，挑剔真杆菌TSDC10.2-1.1(109-1010cfu/ml，每天新鲜制备)的细菌悬浮液或介质在诱导结肠炎后第1天至第14天通过胃内管饲法每天分别向小鼠施用。无结肠炎和结肠炎对照组在胃内接受介质(每天500μl/50g.BW，每组n＝10)。
C57BL/6J小鼠购自中国南方医科大学实验动物中心。凸腹真杆菌ATCC 27560和挑剔真杆菌ATCC 27750购自美国模式培养物保藏所(ATCC)。
凸腹真杆菌L2-12：Estelle Devillard，Freda M.McIntosh，Sylvia H.Duncan和R.John Wallace(2007年3月)。Metabolism of Linoleic Acid by Human Gut Bacteria:Different Routes for Biosynthesis of Conjugated Linoleic Acid.Journal ofBacteriology 189(6)：2566-2570。
凸腹真杆菌STAFF 1042，挑剔真杆菌STAFF 1020：Kageyama，A等人Rapiddetection of human fecal Eubacterium species and related genera bynested PCR method，Microbiology and Immunology(2001)45(4)：315-318。
挑剔真杆菌TSDC10.2-1.1购自在圣路易斯的华盛顿大学(美国)http://www.genomesonline.org/projects？id＝47012。
每天观察小鼠并记录临床测量值。在DSS给药前和胃内管饲法后每周，对经历DSS刺激的小鼠的体重和疾病活动指数(表6)(Alex P，Zachos NC，Nguyen T，Gonzales L，ChenTE，Conklin，LS等人2009Distinct cytokine patterns identified frommultiplexprofiles of murine DSS and TNBS-induced colitis。Inflamm Bowel Dis；15(3)：341-52，通过引用并入本文)，(一种反映疾病的临床体征(例如***周围污染，直肠出血和腹泻等)的综合得分)进行评估，在诱导结肠炎后第15天监测炎症，此时通过颈脱位法处死小鼠。
表6临床评分标准
Figure BDA0001218902460000131
Figure BDA0001218902460000141
取出结肠，切除无脂肪和肠系膜，小心打开，并用PBS(磷酸盐缓冲盐水)清洗。测量结肠长度。根据Wallace标准在不知情的情况下评估结肠损伤和炎症。将结肠也收集在液氮中并储存在-80℃用于ELISA(酶联免疫吸附测定)检查。
2.1.2结果
2.1.2.1小鼠中DSS诱导的结肠炎的严重程度分别被凸腹真杆菌ATCC 27560，凸腹真杆菌L2-12，凸腹真杆菌STAFF 1042，挑剔真杆菌ATCC 27750，挑剔真杆菌STAFF 1020，挑剔真杆菌TSDC10.2-1.1减少。
本发明人通过分别测试挑剔真杆菌ATCC 27750、STAFF 1020、TSDC10.2-1.1和凸腹真杆菌L2-12、STAFF 1042、ATCC 27560恢复由DSS诱导的急性结肠炎的能力，来探究体内抗炎效应。在DSS处理后，在结肠炎对照组中观察到严重的急性炎症，并且在接受无菌培养介质的小鼠中没有观察到显著的保护作用。相比之下，6种活的真杆菌属菌株分别每日胃内施用都导致结肠炎的显著减轻，伴有减少的体重减轻(表7，图2A)，并且在胃内管饲法后第7天和第14天减少与结肠炎相关的疾病活动指数(第7天的数据谱与第14天的数据谱类似，此处未示出)。并且与介质处理组相比，部分结肠长度被标准化(表8，图2B，2C)。在胃内管饲法开始时体重和疾病活动指数没有差异。数据表示为平均值±标准误差。
表7体重的数据(W0：DSS处理前体重；W1：胃内管饲法后第7天的体重)
Figure BDA0001218902460000151
*ATCC 27560代表凸腹真杆菌ATCC 27560；L2-12代表凸腹真杆菌L2-12，STAFF1042代表凸腹真杆菌STAFF 1042，ATCC 27750代表挑剔真杆菌ATCC 27750，STAFF 1020代表挑剔真杆菌STAFF 1020，TSDC10.2-1.1代表挑剔真杆菌TSDC10.2-1.1。
表8与结肠炎相关的临床测量的数据
Figure BDA0001218902460000152
2.1.2.2凸腹真杆菌ATCC 27560，凸腹真杆菌L2-12，凸腹真杆菌STAFF 1042，挑剔真杆菌ATCC 27750，挑剔真杆菌STAFF 1020，挑剔真杆菌TSDC10.2-1.1分别调节结肠炎症的表达
通过ELISA定量结肠促炎TNF-α(肿瘤坏死因子α)细胞因子和抗炎性IL-10(白细胞介素-10)。与无结肠炎对照组相比，TNF-α水平增加，而IL-10水平在结肠炎小鼠中几乎没有改变。用挑剔真杆菌ATCC 27750的悬浮液处理后，TNF-α的分泌(图3A，表8)显著低于结肠炎对照组和介质组。同时，在用ATCC 27750处理的小鼠的结肠中诱导IL-10分泌(图3B，表8)。在用凸腹真杆菌ATCC 27560，凸腹真杆菌L2-12，凸腹真杆菌STAFF 1042，挑剔真杆菌STAFF1020和挑剔真杆菌TSDC10.2-1.1(图3，表8)进行给药的C57Bl/6J小鼠中观察到类似现象。
2.2与结直肠癌相关的动物实验中的验证
2.2.1方法
BABL/c小鼠在10周龄时被氧化偶氮甲烷(AOM，10mg/kg)刺激，接着在第2周、第5周和第8周开始用含有2.0％葡聚糖硫酸钠(DSS)的饮用水处理7天，以诱导结肠炎相关的结直肠癌(CRC)。然后自研究的第9周分别用凸腹真杆菌ATCC 27560，L2-12，STAFF 1042，和挑剔真杆菌ATCC 27750，STAFF 1020，TSDC10.2-1.1(109-1010cfu/ml，每日新鲜制备)或对照介质处理小鼠，直到在第11周通过颈脱位法处死(每天0.1ml/50g.BW，每组n＝15)。BABL/c小鼠购自中国南方医科大学实验动物中心。
如前所述计算疾病活动指数，其是在胃内管饲法前和胃内管饲法后每周，对经历AOM+DSS刺激的小鼠进行评估。
对于组织病理学检查，尸检后，结肠切片在10％缓冲的中性***中固定，随后包埋在石蜡中，然后切片(6μm)并用H&E(苏木精和伊红)染色。在Olympus显微镜(lympusAmerica Inc.，Dulles，VA)中检查组织载玻片。标本经过不知情组织学检查，并在腺瘤和腺癌方面评分1-4。
对于RNA分离和细胞因子的实时聚合酶链反应，根据制造商的说明书使用QiagenRNA分离试剂盒(Qiagen)分离来自结肠的tTotalRNA，然后使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad,Hercules,CA)将其用于产生cDNA模板，并且如前所述进行实时RT-PCR(Bassaganya-Riera J，Reynolds K，Martino-Catt S，Cui Y，Hennighausen L，等人(2004)，Activation of PPAR gamma and delta by conjugated linoleic acidmediates protection from experimental inflammatory bowel disease.Gastroen-terology 127:777–791，通过引用并入本文)。通过实时定量PCR评估CD36和PPARγ(过氧化物酶体增生物激活受体γ)的mRNA表达。
2.2.2结果
2.2.2.1在持续2周每日给予凸腹真杆菌L2-12或凸腹真杆菌STAFF 1042或凸腹真杆菌ATCC 27560或挑剔真杆菌STAFF 1020或挑剔真杆菌TSDC10.2-1.1或挑剔真杆菌ATCC27750后，疾病活动指数显著低于CRC对照组(表9)，而在胃内管饲法之前在炎症驱动的结直肠癌模型中没有显示出差异(数据未在此显示)。并且检测了6种真杆菌属菌株处理分别对实验的氧化偶氮甲烷诱导的结直肠癌的结肠组织病理学的影响，并且所有这些处理与对照相比减少了腺瘤和腺癌形成(图4，表9)。
2.2.2.2凸腹真杆菌L2-12或凸腹真杆菌STAFF1042或凸腹真杆菌ATCC 27560或挑剔真杆菌STAFF1020或挑剔真杆菌TSDC10.2-1.1或挑剔真杆菌ATCC27750分别调节结肠炎症和致癌标记物的表达。
用氧化偶氮甲烷和DSS刺激的小鼠在疾病的荷瘤阶段被安乐死。用挑剔真杆菌ATCC 27750或挑剔真杆菌STAFF 1020或挑剔真杆菌TSDC10.2-1.1或凸腹真杆菌L2-12或凸腹真杆菌STAFF 1042或凸腹真杆菌ATCC 27560处理的那些小鼠与介质处理的对照组相比显示出结肠中的CD36和PPARγ的mRNA表达增加(图5，表9)。
表9与CRC相关的临床测量的数据
组 疾病活动指数 CD36 PPAR-γ 腺瘤和腺癌
健康 0 0.92±0.25 38.22±7.06 0
CRC对照 10.7±3.0 0.40±0.34 29.43±8.14 2.3±0.8
ATCC 27750 8.2±2.5 0.67±0.30 32.17±8.03 1.2±0.3
STAFF 1020 8.9±2.2 0.72±0.37 34.82±5.79 1.7±0.5
TSDC10.2-1.1 7.9±3.0 0.65±0.29 35.67±3.96 1.5±0.7
ATCC 27560 7.4±2.1 0.75±0.26 34.25±5.23 1.6±0.5
L2-12 9.1±1.8 0.71±0.39 36.11±7.40 1.4±1.1
STAFF 1042 8.8±2.4 0.69±0.40 35.93±6.67 1.7±0.6
总之，本研究的结果证明了凸腹真杆菌L2-12或凸腹真杆菌STAFF1042或凸腹真杆菌ATCC 27560或挑剔真杆菌STAFF 1020或挑剔真杆菌TSDC10.2-1.1或挑剔真杆菌ATCC27750改善结肠炎和结直肠癌两者的能力。
Figure BDA0001218902460000181
Figure BDA0001218902460000191
Figure BDA0001218902460000211
Figure BDA0001218902460000221
Figure BDA0001218902460000231
Figure BDA0001218902460000241
尽管已经示出和描述了说明性实施方案，但是本领域技术人员应当理解，上述实施方案不能被解释为限制本公开，并且在不脱离本公开的精神、原理和范围的情况下，可以对实施方案进行改变，替换和修改。

Claims (5)

1.凸腹真杆菌在制备用于预防或治疗结肠炎和/或结直肠癌的药物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中所述凸腹真杆菌是选自由以下组成的组的菌株：凸腹真杆菌ATCC 27560，凸腹真杆菌STAFF 1042和凸腹真杆菌L2-12。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其中所述凸腹真杆菌以活的凸腹真杆菌的形式施用。
4.一种用于预防或治疗结肠炎和/或结直肠癌的试剂盒，其包含凸腹真杆菌及其用作药物的说明书，其中所述凸腹真杆菌是选自由以下组成的组的菌株：凸腹真杆菌ATCC27560，凸腹真杆菌STAFF1042和凸腹真杆菌L2-12。
5.一种用于预防或治疗结肠炎和/或结直肠癌的药物组合物，其包含凸腹真杆菌和药学上可接受的载体，其中所述凸腹真杆菌是选自由以下组成的组的菌株：凸腹真杆菌ATCC27560，凸腹真杆菌STAFF1042和凸腹真杆菌L2-12。
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CB02 Change of applicant information
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Address after: 518083, Beishan Industrial Zone, 146 North Mountain Road, Yantian District, Guangdong, Shenzhen 11F-3

Applicant after: BGI-Shenzhen Co., Ltd.

Applicant after: Shenzhen Huada Academy of life science

Address before: 518083, Beishan Industrial Zone, 146 North Mountain Road, Yantian District, Guangdong, Shenzhen 11F-3

Applicant before: BGI-Shenzhen Co., Ltd.

Applicant before: BGI-Shenzhen

GR01 Patent grant
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