ES2583853T3

ES2583853T3 - 1-Pirazolil-3-(4-((2-anilinopirimidin-4-il)oxi)naftalen-1-il)ureas como inhibidores de p38 MAP cinasa

Info

Publication number: ES2583853T3
Application number: ES12772383.1T
Authority: ES
Inventors: Kazuhiro Ito; Catherine Elisabeth Charron; John King-Underwood; Stuart Thomas Onions; Alistair Ian Longshaw; Rudy Broeckx; Walter Filliers; Alex Copmans
Original assignee: Respivert Ltd
Current assignee: Respivert Ltd
Priority date: 2011-10-03
Filing date: 2012-10-03
Publication date: 2016-09-22
Anticipated expiration: 2032-10-03
Also published as: NI201400027A; EA023650B1; NZ621440A; CO6910202A2; EA201490730A1; CL2014000813A1; BR112014007694B1; US20160009695A1; IL231025A; SG11201400226UA; CN103917536B; CA2846222C; US9108950B2; JP2015155445A; GT201400054A; KR20140074908A; PE20142355A1; AU2012320300A1; AU2012320300C1; ECSP14013282A

Abstract

Un compuesto de fórmula (I)**Fórmula** o su sal farmacéuticamente aceptable, incluidos todos sus estereoisómeros y tautómeros.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

El compuesto de fórmula (I) puede también re-sensibilizar el cuadro del paciente al tratamiento con un corticoesteroide, cuando el cuadro del paciente se ha vuelto resistente al mismo.

Asimismo, la presente invención da a conocer una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la descripción opcionalmente combinado con uno o más diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.

La presente invención también da a conocer un procedimiento para preparar dicha composición farmacéutica, que comprende mezclar los ingredientes.

Los diluyentes y vehículos pueden incluir aquellos adecuados para administración parenteral, oral, tópica, mucosa y rectal.

Como se mencionó anteriormente, dichas composiciones se pueden preparar, p. ej., para administración parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intra-articular o peri-articular, particularmente en la forma de disoluciones o suspensiones líquidas, para administración oral, particularmente en la forma de comprimidos o cápsulas; para administración tópica, p. ej., pulmonar o intranasal, particularmente en la forma de polvos, gotas o aerosoles nasales y administración transdérmica; para administración mucosa, p. ej., bucal, sublingual o de la mucosa vaginal, y para administración rectal, p. ej., en la forma de un supositorio.

Las composiciones pueden administrarse convenientemente en una forma farmacéutica de dosis unitaria y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica farmacéutica, por ejemplo, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985). Las formulaciones para administración parenteral pueden contener como excipientes agua estéril o disolución salina, alquilenglicoles tales como propilenglicol, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. Las formulaciones para administración nasal pueden ser sólidas y pueden contener excipientes, por ejemplo, lactosa o dextrano, o pueden ser disoluciones acuosas u oleosas para uso en la forma de gotas nasales o pulverizaciones dosificadas. Para administración bucal, los excipientes típicos incluyen azúcares, estearato de calcio, estearato de magnesio, almidón pregelatinizado y similares.

Las composiciones adecuadas para administración oral pueden comprender uno o más vehículos y/o excipientes fisiológicamente compatibles, y pueden estar en forma sólida o líquida. Se pueden preparar comprimidos o cápsulas con agentes aglutinantes, por ejemplo jarabe, goma arábiga, gelatina, sorbitol, tragacanto o polivinilpirrolidona; cargas tales como lactosa, sacarosa, almidón de maíz, fosfato de calcio, sorbitol o glicina; lubricantes tales como estearato de magnesio, talco, polietilenglicol o sílice; y tensioactivos tales como laurilsulfato sódico. Las composiciones líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, por ejemplo jarabe de sorbitol, metilcelulosa, jarabe de azúcar, gelatina, carboximetilcelulosa o grasas comestibles; agentes emulsionantes tales como lecitina o goma arábiga; aceites vegetales tales como aceite de almendras, aceite de coco, aceite de hígado de bacalao o aceite de cacahuete; conservantes tales como hidroxianisol butilado (BHA) e hidroxitolueno butilado (BHT). Las composiciones líquidas pueden encapsularse, por ejemplo, en gelatina para proporcionar una forma farmacéutica de dosis unitaria.

Las formas farmacéuticas orales sólidas incluyen comprimidos, cápsulas de gelatina dura de dos piezas y cápsulas de gelatina blanda elásticas (SEG).

Una formulación de recubrimiento seco habitualmente comprende aproximadamente 40% a 60% p/p concentración de gelatina, aproximadamente 20% a 30% concentración de plastificante (tal como glicerina, sorbitol o propilenglicol) y aproximadamente 30% a 40% concentración de agua. Otros materiales tales como conservantes, tintes, opacificantes y saporíferos también pueden estar presentes. El material de relleno líquido comprende un fármaco sólido que se ha disuelto, solubilizado o dispersado (con agentes de suspensión tales como cera de abeja, aceite de ricino hidrogenado o polietilenglicol 4000) o un fármaco líquido en vehículos o combinaciones de vehículos tales como aceite mineral, aceites vegetales, triglicéridos, glicoles, polioles y agentes activos de superficie.

Adecuadamente, el compuesto de fórmula (I) se administra por la ruta tópica al pulmón. En consecuencia, se da a conocer de acuerdo con la presente invención una composición farmacéutica que comprende el Compuesto (I) de la descripción opcionalmente en combinación con uno o más diluyentes o vehículos tópicamente aceptables. La administración tópica al pulmón se puede lograr con el uso de una formulación en aerosol. Las formulaciones en aerosol típicamente comprenden el ingrediente activo suspendido o disuelto en un propulsor de aerosol adecuado, tal como un clorofluorocarbono (CFC) o un hidrofluorocarbono (HFC). Los propulsores de CFC adecuados incluyen tricloromonofluorometano (propulsor 11), diclorotetrafluorometano (propulsor 114) y diclorodifluorometano (propulsor 12). Los propulsores de HFC adecuados incluyen tetrafluoroetano (HFC-134a) y heptafluoropropano (HFC-227). El propulsor típicamente comprende 40% a 99,5%, p. ej., 40% a 90% en peso de la composición de inhalación total. La formulación puede comprender excipientes que incluyen codisolventes (p. ej., etanol) y tensioactivos (p. ej., lecitina, sorbitan trioleato y similares). Las formulaciones en aerosol se envasan en latas, y se suministra una dosis adecuada mediante una válvula de dosificación (p. ej., como la provista por Bespak, Valois o 3M).

La administración tópica al pulmón también se puede lograr con el uso de una formulación no presurizada tal como una disolución o suspensión acuosa. Esta se puede administrar mediante un nebulizador. Los nebulizadores pueden

10

imagen9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

En una realización, el compuesto de fórmula (I) y el otro ingrediente(s) activo se co-formulan en la misma formulación farmacéutica. En otra realización, el otro ingrediente(s) activo se administra en una o más formulaciones farmacéuticas separadas.

En consecuencia, otro aspecto de la invención da a conocer un producto combinado que comprende:

(A): un compuesto de la presente invención (es decir, un compuesto de fórmula (I) como se definió precedentemente,

: o su sal farmacéuticamente aceptable); y

(B): otro agente terapéutico,

en donde cada uno de los componentes (A) y (B) se formula en mezcla con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

En este aspecto de la invención, el producto combinado puede ser o bien una formulación farmacéutica individual (combinación) o un kit de partes.

Por lo tanto, este aspecto de la invención abarca una formulación farmacéutica que incluye un compuesto de la presente invención y otro agente terapéutico en mezcla con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable (cuya formulación se denomina en lo sucesivo “preparación combinada”).

También abarca un kit de partes que comprende los siguientes componentes:

(i): una formulación farmacéutica que incluye un compuesto de la presente invención en mezcla con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable; y

(ii): una formulación farmacéutica que incluye otro agente terapéutico, en mezcla con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable,

en donde los componentes (i) y (ii) se proveen cada uno en forma adecuada para administración en conjunta con el otro componente.

El componente (i) del kit de partes es por lo tanto el componente (A) anteriormente mencionado en mezcla con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. De modo similar, el componente (ii) es el componente (B) anteriormente mencionado en mezcla con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

El otro agente terapéutico (es decir, el componente (B) anteriormente mencionado) puede ser, por ejemplo, cualquiera de los ingredientes anteriormente mencionados en relación al tratamiento de trastornos respiratorios. Los datos indicados a continuación en relación con las propiedades antivíricas del compuesto de fórmula (I) ofrecen pruebas de que otras terapias antivíricas combinadas con un compuesto de fórmula (I) serían útiles en el tratamiento

o la prevención de exacerbaciones inducidas por virus (por ejemplo infecciones víricas respiratorias) que padecen los pacientes con enfermedad respiratoria tal como EPOC y/o asma, y/o una o más de las indicaciones precedentemente mencionadas. Por consiguiente, en un aspecto, se da a conocer el uso del Compuesto (I) combinado con una terapia antivírica tal como, aunque sin limitarse a ello, zanamavir u oseltamivir (por ejemplo fosfato de oseltamivir) en el tratamiento o la prevención de infecciones víricas respiratorias que sufren los pacientes con enfermedad respiratoria tal como EPOC y/o asma.

Los inventores también creen que otras terapias antivíricas combinadas con el Compuesto (I) serían útiles en el tratamiento o la prevención de exacerbaciones inducidas por virus (por ejemplo, infecciones víricas respiratorias) en pacientes con afecciones crónicas que no sean enfermedades respiratorias, por ejemplo afecciones tales como insuficiencia cardiaca congestiva, diabetes, cáncer o afecciones que padecen los pacientes inmunodeprimidos, por ejemplo post-trasplante de órganos. Por lo tanto, en otro aspecto, se da a conocer el uso de un compuesto de la invención combinado con una terapia anti-vírica, tal como, aunque sin limitarse a ello, zanamavir o oseltamivir (por ejemplo fosfato de oseltamivir), en el tratamiento o la prevención de infecciones víricas respiratorias en pacientes con afecciones crónicas tales como insuficiencia cardiaca congestiva, diabetes, cáncer, o en afecciones que padecen los pacientes inmunodeprimidos, por ejemplo, post-trasplante de órganos.

Sección experimental

Las abreviaturas empleadas en este documento se definen a continuación (Tabla 1). Cualquier abreviatura no definida deberá transmitir su significado generalmente aceptado.

Tabla 1: Abreviaturas

AcOH: ácido acético glaciar

Ac: acuoso

ATP: adenosina-5'-trifosfato

12

imagen10

imagen11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

usando detección UV a 215 y 254 nm. Información del gradiente: 0,0-0,5 min; 95% H2O-5% MeCN; 0,5-7,0 min; en rampa de 95% H2O-5% MeCN a 5% H2O-95% MeCN; 7,0-7,9 min; se mantiene a 5% H2O-95% MeCN; 7,9-8,0 min; se retorna a 95% H2O-5% MeCN; 8,0-10,0 min; se sostiene a 95% H2O-5% MeCN.

Métodos analíticos

Cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa: (Método 1): columna Agilent Scalar C18, 5 µm (4,6 x 50 mm) o Waters XBridge C18, 5 µm (4,6 x 50 mm) caudal 2,5 ml. min-1 eluyendo con un gradiente de H2O-MeCN que contiene o bien ácido fórmico al 0,1% v/v (ácido del Método 1) o NH3 (básico del Método 1) en 7 min empleando detección UV a 215 y 254 nm.

Información del gradiente: 0,0-0,1 min, 95% H2O-5% MeCN; 0,1-5,0 min, en rampa de 95% H2O-5% MeCN a 5% H2O-95% MeCN; 5,0-5,5 min, se mantiene a 5% H2O-95% MeCN; 5,5-5,6 min, se mantiene a 5% H2O-95% MeCN, se aumenta el caudal a 3,5 ml min-1; 5,6-6,6 min, se mantiene a 5% H2O-95% MeCN, caudal 3,5 ml min-1; 6,6-6,75 min, se retorna a 95% H2O-5% MeCN, caudal 3,5 ml min-1; 6,75-6,9 min, se mantiene a 95% H2O-5% MeCN, caudal 3,5 ml.min-1; 6,9-7,0 min, se mantiene a 95% H2O-5% MeCN, se reduce el caudal a 2,5 ml min-1 .

Cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa: (Método 2): columna Agilent Extend C18, 1,8 µm (4,6 x 30 mm) a 40°C; caudal 2,5-4,5 ml min-1 eluyendo con un gradiente de H2O-MeCN que contiene ácido fórmico al 0,1% v/v en 4 min empleando detección de UV a 254 nm. Información del gradiente: 0-3,00 min, en rampa de 95% H2O-5% MeCN a 5% H2O-95% MeCN; 3,00-3,01 min, se mantiene a 5% H2O-95% MeCN, se aumenta el caudal a 4,5 ml min-1; 3,01 3,50 min, se mantiene a 5% H2O-95% MeCN; 3,50-3,60 min, se retorna a 95% H2O-5% MeCN, se reduce el caudal a 3,50 ml min-1; 3,60-3,90 min, se mantiene a 95% H2O-5% MeCN; 3,90-4,00 min, se mantiene a 95% H2O-5% MeCN, se reduce el caudal a 2,5 ml min-1 .

Espectroscopia de RMN 1H: Los espectros se adquirieron en un espectrómetro Bruker Avance III a 400 MHz usando disolvente no deuterado residual como referencia.

Sorción de vapor dinámica: se obtuvieron gráficos usando un modelo para sorción de vapor dinámica de Surface Measurement Systems, DVS-1, que emplea aproximadamente 10 mg de la muestra. Se registró el cambio de peso con respecto a la humedad atmosférica a 25°C y se determinó usando los siguientes parámetros: secado: 60 min bajo nitrógeno seco; equilibrio: 60 min/paso; intervalo de datos: 0,05% o 2,0 min. Los puntos de la medición de humedad relativa [% HR] fueron los siguientes:

primer conjunto: 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5

segundo conjunto: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 0.

Patrones de difracción de rayos X de polvos: los patrones se obtuvieron en un difractómetro PANalytical (Philips) X’PertPRO MPD equipado con un tubo de rayos X Cu LFF (45 kV; 40 mA; Bragg-Brentano; etapa de agitación) y se adquirieron usando radiación Cu Kα bajo las siguientes condiciones de medición: modo de barrido: continuo; intervalo de barrido: 3 a 50° 2θ; tamaño del paso: 0,02°/paso; tiempo de recuento: 30 seg/paso; tiempo de revolución del agitador: 1 seg; trayecto del haz incidente: programa, rendija de divergencia: 15 mm; rendija Soller: 0,04 rad; máscara del haz: 15 mm; rendija antidispersión: 1°; cuchilla del haz: +; trayecto de haz difractado: escudo largo antidispersión: +; rendija Soller: 0,04 rad; filtro de Ni: +; detector: X’Celerator. Las muestras se prepararon propagando en un soporte de muestras sin ruido de fondo.

Espectroscopia infrarroja: se usó reflectancia total micro atenuada (microATR) y la muestra se analizó usando un accesorio adecuado microATR y las siguientes condiciones de medición: aparato: espectrómetro Thermo Nexus 670 FTIR; número de barridos: 32; resolución: 1 cm-1; intervalo de longitud de onda: 4000 a 400 cm-1; detector: DTGS con ventanas KBr; divisor de haz: Ge en KBr; accesorio de micro ATR: Harrick Split Pea con cristal Si.

Calorimetría de barrido diferencial: los datos se obtuvieron en un aparato TA-lnstruments Q1000 MTDSC equipado con una unidad de refrigeración RCS. Típicamente, 3 mg de cada compuesto, en una cubeta de muestra de aluminio estándar TA-lnstrument, se calentó a 10 °C/min de 25 C a 300°C. Se mantuvo una purga de nitrógeno a 50 ml/min sobre la muestra.

Análisis termogravimétrico: los datos se obtuvieron en un medidor termogravimétrico TA-lnstruments Q500. Típicamente, 10 mg de cada muestra se transfirieron a una cubeta de aluminio pre-pesada y se calentó a 20 °C/min de temperatura ambiente a 300 °C o < 80[(p/p)%] a menos que se indique otra cosa.

Estabilidad química por HPLC: se llevaron a cabo análisis en una columna Waters Xbridge C18 (3,0 x 150 mm; 3,5 µm) usando las siguientes condiciones operativas: temperatura de la columna: 40°C; temperatura de la muestra: 5°C; caudal: 0,45 ml/min; volumen de inyección: 7 µl; detección UV a 260 nm; composición de la fase móvil comprendida por la Fase A: acetato de amonio 10 mM + ácido trifluoroacético al 0,1%, v/v en agua, y la Fase B: acetonitrilo, usando el gradiente definido por los parámetros que siguen (Tabla 2).

15 5

10

15

20

25

30

35

40

45

Tabla 2: Condiciones del gradiente para estudios de estabilidad química por HPLC.

% Composición en tiempo de ejecución (min)

Eluyente: 0 20 25 26 32

Fase A: 70 0 0 70 70

Fase B: 30 100 100 30 30

Métodos experimentales para pruebas biológicas

Ensayos de inhibición enzimática

Las actividades de unión de la enzima cinasa de los compuestos descritos en este documento se determinaron usando un ensayo exclusivo que mide la unión competitiva de sitio dirigido activo a un ligando inmovilizado (Fabian,

M.A. et al., Nature Biotechnol., 2005, 23:329-336). Estos ensayos se realizaron mediante DiscoverX (antes Ambit; San Diego, CA). El valor Kd (valor de la constante de disociación) se calculó como el índice de afinidad de los compuestos hacia cada cinasa.

Ensayos de inhibición enzimática

Las actividades inhibidoras de enzimas de los compuestos descritos en este documento se determinaron por FRET usando péptidos sintéticos con fluoróforos donantes y aceptores (Z-LYTE, Invitrogen Ltd., Paisley, Reino Unido).

Inhibición de la enzima p38 MAPKα

Las actividades inhibidoras de los compuestos de ensayo contra la isoforma p38 MAPKα (MAPK14: Invitrogen) se evaluaron indirectamente determinando el nivel de activación / fosforilación de la molécula posterior, MAPKAP-K2. La proteína p38 MAPKa (80 ng/ml, 2,5 µl) se mezcló con el compuesto de ensayo (2,5 µl de 4 µg/ml, 0,4 µg/ml, 0,04 µg/ml o 0,004 µg/ml) durante 2 h a TA. La disolución mezclada (2,5 µl) de la diana inactiva de p38α, MAPKAP-K2 (Invitrogen, 600 ng/ml) y el péptido de FRET (8 µM; una diana de fosforilación para MAPKAP-K2) se añadieron luego y se inició la reacción de la cinasa por adición de ATP (40 µM, 2,5 µl). La mezcla se incubó durante 1 h a TA. Se añadió reactivo de desarrollo (proteasa, 5 µl) durante 1 hora antes de la detección en un lector de microplacas para fluorescencia (Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific).

Inhibición de la enzima p38 MAPKγ

Las actividades inhibidoras de los compuestos de la invención contra p38MAPKγ (MAPK12: Invitrogen) se evaluaron en un modo similar a aquel descrito anteriormente en el presente documento. La enzima (800 ng/ml, 2,5 µl) se incubó con el compuesto de ensayo (2,5 µl a 4 µg/ml, 0,4 µg/ml, 0,04 µg/ml o 0,004 µg/ml) durante 2 h a TA. Los péptidos de FRET (8 µM, 2,5 µl) y la disolución de ATP adecuada (2,5 µl, 400 µM) se añadieron luego a la mezcla de enzimas/compuesto y se incubó durante 1 hora. Se añadió reactivo de desarrollo (proteasa, 5 µl) durante 1 h antes de la detección en un lector de microplacas para fluorescencia (Varioskan® Flash, Thermo Scientific).

Inhibición de las enzimas c-Src y Syk

Las actividades inhibidoras de los compuestos de la invención contra las enzimas c-Src y Syk (Invitrogen) se evaluaron en un modo similar a aquel descrito anteriormente en este documento. La enzima relevante (3000 ng/ml o 2000 ng/ml respectivamente, 2,5 µl) se incubó con el compuesto de ensayo (o bien 4 µg/ml, 0,4 µg/ml, 0,04 µg/ml o 0,004 µg/ml, 2,5 µl cada una) durante 2 h a TA. Los péptidos de FRET (8 µM, 2,5 µl) y las disoluciones de ATP adecuadas (2,5 µl, 800 µM para c-Src, y 60 µM ATP para Syk) se añadieron luego a las mezclas de enzima/compuesto y se incubaron durante 1 h. Se añadió reactivo de desarrollo (proteasa, 5 µl) durante 1 h antes de la detección en un lector de microplacas para fluorescencia (Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific).

Inhibición de la enzima GSK 3α

Las actividades inhibidoras de los compuestos de ensayo contra la isoforma de la enzima GSK 3α (Invitrogen) se evaluaron determinando el nivel de activación/fosforilación del péptido diana. La proteína GSK3-α (500 ng/ml, 2.5 µl) se mezcló con el compuesto de ensayo (2,5 µl o bien a 4 µg/ml, 0,4 µg/ml, 0,04 µg/ml o a 0,004 µg/ml) durante 2 h a TA. El péptido de FRET (8 µM, 2,5 µl), que es una diana de fosforilación para GSK3α, y ATP (40 µM, 2,5 µl) se añadieron a la mezcla de enzima/compuesto y la mezcla resultante se incubó por 1 h. Se añadió reactivo de desarrollo (proteasa, 5 µl) durante 1 h antes de la detección en un lector de microplacas para fluorescencia (Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific).

En todos los casos, la proteasa específica del sitio escinde el péptido no fosforilado solamente y elimina la señal de FRET. Los niveles de fosforilación de cada reacción se calcularon usando la relación de emisión de cumarina (donante) frente a la emisión de fluoresceína (aceptor), en donde las bajas relaciones indican una alta fosforilación y

16 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

las altas relaciones indican bajos niveles de fosforilación. El porcentaje de cada reacción se calculó en relación al control no inhibido y la concentración del 50% de inhibición (valor CI50) se calculó luego a partir de la curva de concentración y respuesta.

Ensayos celulares

Liberación de TNFα / IL-8 inducida por LPS en células d-U937

Las células U937, una línea celular monocítica humana, se diferenciaron en células de tipo macrófagos por incubación con PMA (100 ng/ml) durante 48 a 72 horas. Las células se preincubaron con concentraciones finales del compuesto de ensayo durante 2 h y luego se estimularon con LPS (0,1 µg/ml; de E. Coli: 0111: B4, Sigma) durante 4 horas. El sobrenadante se recogió para determinación de concentraciones de TNFα e IL-8 por ELISA sándwich (Duo-set, R&D systems). La inhibición de la producción de TNFα se calculó como un porcentaje de aquella lograda por 10 µg/ml de BIRB796 en cada concentración del compuesto de ensayo por comparación frente al vehículo control. La concentración 50% efectiva relativa (REC50) se determinó a partir de la curva de concentración y respuesta resultante. La inhibición de la producción de IL-8 se calculó en cada concentración del compuesto de ensayo por comparación con el vehículo control. La concentración de 50% de inhibición (CI50) se determinó a partir de la curva de concentración y respuesta resultante.

Liberación de TNFα inducida por LPS en células THP-1

Células THP-1, una línea celular monocítica humana, se estimularon con 3 µg/ml de LPS (de E. Coli; 0111: B4, Sigma) durante 4 h y se recogió el sobrenadante para determinación de la concentración de TNFα por ELISA sándwich (Duo-set, R&D systems). La inhibición de la producción de TNFα se calculó en cada concentración por comparación con vehículo control. La concentración de 50% de inhibición (CI50) se determinó a partir de la curva de concentración y respuesta resultante.

Expresión de ICAM-1 inducida por Poly l:C en células BEAS2B

Se usó Poly l:C en estos estudios como un imitador vírico de ARN simple. Se transfectó una mezcla de Poly l:C-Oligofectamine (1 µg/ml Poly l:C, ± 2% Oligofectamine, 25 µl; Invivogen Ltd., San Diego, CA, e Invitrogen, Carlsbad, CA, respectivamente) en células BEAS2B (células epiteliales bronquiales humanas, ATCC). Las células se preincubaron con concentraciones finales de los compuestos de ensayo durante 2 horas y se determinó el nivel de expresión de ICAM-1 sobre la superficie celular mediante ELISA celular. En un punto de tiempo 18 horas después de la transfección de poly l:C, las células se fijaron con formaldehído al 4% en PBS (100 µl) y luego se inactivó la peroxidasa endógena por adición de tampón de lavado (100 µl, 0,05% Tween en PBS: PBS-Tween) que contenía 0,1% de azida de sodio y 1% de peróxido de hidrógeno. Las células se lavaron con tampón de lavado (3 x 200 µl) y, después de bloquear los pocillos con leche 5% en PBS-Tween (100 µl) durante 1 h, las células se incubaron con anticuerpo ICAM-1 anti-humano (50 µl; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) en BSA PBS al 1% durante toda la noche a 4°C.

Las células se lavaron con PBS-Tween (3 x 200 µl) y se incubaron con el anticuerpo secundario (100 µl; IgG anticonejo conjugado a HRP, Dako Ltd., Glostrup, Dinamarca). Las células se incubaron luego con sustrato (50 µl) durante 2-20 min, seguidas de adición de disolución de cese (50 µl, 1N H2SO4). La señal de ICAM-1 se detectó leyendo la absorbancia a 450 nm contra una longitud de onda de referencia de 655 nm usando un espectrofotómetro. Las células después se lavaron con PBS-Tween (3 x 200 µl) y se determinaron los números de células totales en cada pocillo, leyendo la absorbancia a 595 nm después de la tinción con cristal violeta (50 µl de una disolución al 2% en PBS) y elución por disolución de SDS al 1% (100 µl) en agua destilada. Las lecturas de OD 450-655 medidas se corrigieron para el número de células dividiendo con la lectura de OD595 en cada pocillo. La inhibición de la expresión de ICAM-1 se calculó en cada concentración del compuesto de ensayo por comparación con el vehículo control. La concentración del 50% de inhibición (CI50) se determinó a partir de la curva de concentración y respuesta resultante.

Ensayo de mitosis celular

Mononucleocitos de sangre periférica (PBMC) de sujetos humanos se separaron de sangre completa (Quintiles, Londres, Reino Unido) usando un gradiente de densidad (Histopaque®-1077, Sigma-Aldrich, Poole, Reino Unido). Las PBMC (3 millones de células por muestra) se trataron posteriormente con 2% PHA (Sigma-Aldrich, Poole, Reino Unido) durante 48 h, seguidas de una exposición de 20 horas a concentraciones variables de los compuestos de ensayo. 2 horas antes de la recolección, las PBMC se trataron con demecolcina (0,1 µg/ml; Invitrogen, Paisley, Reino Unido) para detener las células en metafase. Para observar las células mitóticas, las PBMC se permeabilizaron y fijaron añadiendo Intraprep (50 µl; Beckman Coulter, Francia), y se tiñeron con anti-fosfo-histona 3 (0,26 ng/l; #9701; Cell Signalling, Danvers, MA) y yoduro de propidio (1 mg/ml; Sigma-Aldrich, Poole, Reino Unido,) como se describió previamente (Muehlbauer P.A. y Schuler M.J., Mutation Research, 2003, 537:117-130). Se observó la fluorescencia usando un citómetro de flujo ATTUNE (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), seleccionando los linfocitos. Se calculó el porcentaje de inhibición de mitosis para cada tratamiento en relación al tratamiento con vehículo (0,5% DMSO).

17

imagen12

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

RPMI1640 y el segundo en 10% medio FCS RPMI1640 durante 24 h. El sobrenadante se reemplazó con medio nuevo (200 µl) y se añadió disolución madre de MTT (10 µl, 5 mg/ml a cada pocillo. Después de la incubación durante 1 h, se eliminó el medio, se añadió DMSO (200 µl) a cada pocillo y las placas se agitaron ligeramente durante 1 h antes de leer la absorbancia a 550 nm. Se calculó el porcentaje de pérdida de viabilidad celular de cada pocillo en relación al tratamiento con vehículo (DMSO al 0,5%). En consecuencia, un incremento aparente de la viabilidad celular para el tratamiento con el fármaco en relación con el vehículo se tabula como porcentaje negativo.

Producción de citocinas en macrófagos de esputo de EPOC.

Pacientes con EPOC inhalaron una disolución nebulizada de disolución salina hipertónica al 3% (p/v) usando un nebulizador ultrasónico (Devilbiss, Carthage, MO) con respiración tidal durante 5 min. Este procedimiento se repitió un máximo de tres veces hasta que se obtuvo suficiente esputo. Las muestras de esputo se homogeneizaron y mezclaron vigorosamente usando un mezclador en vórtex en disolución al 0,02% v/v de ditiotreitol (DTT). Las muestras se resuspendieron en PBS (40 ml) y luego se centrifugaron a 1500 rpm a 4°C durante 10 min para obtener los sedimentos de células de esputo. Los sedimentos se lavaron dos veces con PBS (40 ml). Las células de esputo luego se resuspendieron en medio libre de suero con macrófagos (macrophage-SFM, Life technologies, Paisley, Reino Unido; para lograr 2x106/célula en una placa de 24 pocillos) que contenía 20 U/ml de penicilina, 0,02 mg/ml de estreptomicina y 5 µg/ml de anfotericina B y se sembró en una placa de 96 pocillos de gran unión y luego se incubó durante 2 h a 37°C y a 5% CO2 para posibilitar que los macrófagos se adhirieran al fondo de la placa. Las células en la placa se lavaron con macrófagos-SFM frescos (200 µl/pocillo) para eliminar los neutrófilos y otras células contaminadas. Las células adherentes (principalmente macrófagos de esputo) en la placa se usaron para análisis posterior. La inducción y el aislamiento de los esputos se realizaron en una Unidad de Investigación de Fármacos Quintiles en Guys Hospital y se obtuvieron la aprobación ética y el consentimiento informado escrito de Quintiles.

De proceder, se añadió 1 µl de una disolución que contenía o bien el compuesto de ensayo o el artículo de referencia en las concentraciones establecidas o alternativamente 1 µl de DMSO como el vehículo control a cada pocillo (200 µl en medio) y las células se incubaron durante 2 h. Las células se estimularon con disolución LPS (50 µl, concentración final: 1 µg/ml) y se incubaron durante 4 h a 37°C y 5% CO2. El sobrenadante se recogió luego y se mantuvo a -80°C. Se usaron kits luminex de Millipore para medir los cuatro analitos. Después de descongelar el sobrenadante, se multiplexaron las esferas magnéticas de anticuerpo y se incubaron en una placa de 96 pocillos con disolución de fondo estándar o con el volumen adecuado de muestra durante la noche, agitando a 4°C. Después de lavar dos veces con 200 µl de tampón de lavado provisto por el kit por pocillo, usando una lavadora de placas magnéticas, las esferas se incubaron durante 1 h a TA con 25 µl de la disolución de anticuerpo conjugada a biotina provista por el kit con agitación. Se añadió disolución de estreptavidina durante 30 min agitando a TA. Después de lavar con 200 µl de tampón de lavado por pocillo, las esferas se resuspendieron en fluido envolvente (150 µl) y se analizaron de inmediato. El nivel de cada analito en el sobrenadante se calculó usando el software Xcel Fit con una ecuación de 4 o 5 parámetros usando cada curva estándar. Las inhibiciones de cada producción de citocinas se calcularon en cada concentración por comparación con el vehículo control. Los valores CI50 se determinaron a partir de las curvas de concentración e inhibición usando XL-Fit (idbs, Guildford, Reino Unido)

Producción de citocinas en células epiteliales bronquiales primarias de EPOC.

Se obtuvieron células epiteliales primarias de las vías respiratorias de pacientes con EPOC adquiridas de Asterand (Royston, Reino Unido) y se mantuvieron en medio de desarrollo de células epiteliales bronquiales que se preparó mezclando juntos LHC8 (Invitrogen) (500 ml) con LHC9 (Invitrogen) (500 ml) y 3 µl de disolución de ácido retinoico (5 mg/ml) en DMSO puro. El medio se eliminó por aspiración y se añadió BEGM nuevo (200 µl) a cada pocillo. De proceder, se añadió 1 µl de una disolución del compuesto de ensayo en las concentraciones indicadas o 1 µl de DMSO como el vehículo control, y las células se incubaron durante 2 h. Las células se estimularon con TNFα (50 µl; concentración final de 50 ng/ml) y después se incubaron durante 4 h a 37°C y 5% CO2. Se recogió luego el sobrenadante y se mantuvo a -20°C.

Se determinaron los niveles de IL-6 e IL-8 por ELISA usando los kits Elisa Duoset® de IL-6 e IL-8 humanas de R&D Systems. Se calculó la inhibición de la producción de IL-6 e IL-8 en cada concentración por comparación con el vehículo control. El 50% de las concentraciones inhibidoras (CI50) se determinó a partir de las curvas de concentración y respuesta resultantes usando XL-Fit (idbs, Guildford, Reino Unido).

Ensayo in vivo: Farmacodinámica y actividad antiinflamatoria

Acumulación de neutrófilos inducida por LPS en ratones

A ratones Balb/c no en ayunas se les administró, por vía intra traqueal, o bien vehículo o la sustancia de ensayo en los momentos indicados (dentro del intervalo de 2-8 h) antes de la estimulación de la respuesta inflamatoria por aplicación de una exposición a LPS. A T = 0, los ratones se dispusieron en una cámara de exposición y se expusieron a LPS (7,0 ml, 0,5 mg/ml disolución en PBS) por 30 min). Después de otras 8 h, los animales fueron anestesiados, se les canularon las tráqueas y se extrajo BALF infundiendo y luego extrayendo de los pulmones 1,0 ml de PBS con la sonda traqueal. Se midieron los recuentos de glóbulos blancos totales y diferenciales en las muestras de BALF usando un hemocitómetro Neubaur. Se prepararon frotis de Cytospin de las muestras de BALF

19 5

10

15

20

25

30

por centrifugación a 200 rpm durante 5 min a TA y se tiñeron usando un sistema de tinción DiffQuik (Dade Behring). Las células se contaron empleando microscopia de inmersión en aceite. Los datos de los números de neutrófilos en BAL se muestran como ± SEM (error estándar de la media). Se calculó el porcentaje de inhibición de acumulación de neutrófilos para cada tratamiento en relación al tratamiento con vehículo.

Modelo de humo de cigarrillo

Se expusieron ratones A/J (machos, 5 semanas de vida) a humo de cigarrillo (4% humo de cigarrillo, diluido con aire) durante 30 min/día durante 11 días usando un sistema de experimento de inhalación de humo de tabaco para animales pequeños (Modelo SIS-CS; Sibata Scientific Technology, Tokio, Japón). Las sustancias de ensayo se administraron por vía intranasal (35 µl de disolución en 50% DMSO/PBS) una vez por día durante 3 días después de la exposición a humo de cigarrillo final. 12 horas después de la última dosis, se anestesió a cada uno de los animales, se les canuló la tráquea y se recogió fluido de lavaje broncoalveolar (BALF). Los números de macrófagos y neutrófilos alveolares se determinaron por análisis FACS (EPICS® ALTRA II, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, EE. UU.) usando anticuerpo MOMA2 antirratón (macrófagos) o anticuerpo 7/4 antirratón (neutrófilos). Se centrifugó BALF y se recogió el sobrenadante. El nivel de quimioatrayente de queratinocitos (KC; CXCL1) en BALF se cuantificó usando un kit ELISA KC de ratón Quentikine® (R&D systems, Inc., Minneapolis, MN, EE. UU.).

Ejemplo 1-Preparación del compuesto (I)

Los siguientes intermedios utilizados para preparar el Compuesto (I) de la invención se han descrito previamente y se prepararon usando los procedimientos que figuran en las referencias citadas a continuación (Tabla 3).

Tabla 3: Intermedios previamente descritos

Intermedio: Estructura Nombre, datos de LCMS y referencias

A: imagen13 3-terc-butil-1-p-tolil-1H-pirazol-5-amina. Rt 2,46 min (Método 1 básico); m/z 230 (M+H)+, (ES+). Cirillo, P. F. et al, WO 2000/43384, 27 Jul 2000.

B: imagen14 4-((2-cloropirimidin-4-il)oxi)naftalen-1-amina. Rt 1,80 min (Método 2); m/z 272/274 (M+H)+ , (ES+). Cirillo, P. F. et al., WO 2002/92576, 21 Nov 2000.

Intermedio C: 4-((4-Aminonaftalen-1-il)oxi)-N-fenilpirimidin-2-amina.

imagen15

A una disolución purgada de nitrógeno de la mezcla del Intermedio B (50,0 g, 184 mmol) y anilina (42,0 ml, 460 mmol) en THF (200 ml) se le añadió pTSA (17,5 g, 92,0 mmol) en una sola porción. La mezcla de reacción se calentó a 70 °C durante 1,5 h, tiempo durante el cual se formó un precipitado. La mezcla se enfrió hasta TA y se diluyó con THF (200 ml). El precipitado se recogió por filtración, se lavó con THF (2 x 100 ml) y luego se suspendió en una mezcla heterogénea de DCM (600 ml) y NaOH ac. (2M, 200 ml) y se agitó vigorosamente durante 1 h, tiempo durante el cual los sólidos suspendidos se disolvieron. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con DCM (200 ml). Los extractos de DCM se combinaron, se secaron y se evaporaron al vacío. El residuo se trituró con éter (150 ml) y el sólido resultante se lavó con éter (2 x 50 ml) para proporcionar el Intermedio C en forma de un sólido blanquecino (26 g, 43%); Rt 1,95 min (Método 2); m/z 329 (M+H)+ (ES+).

Compuesto (I): 1-(3-(terc-Butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-(fenilamino) pirimidin-4-il)oxi)naftalen-1-il)urea.

20

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

imagen23

imagen24

Claims

imagen1

imagen2