ES2350891T3 - Lipasa y utilización de la misma para mejorar las masas y los productos horneados. - Google Patents

Abstract

Utilización de un polipéptido que presenta actividad de lipasa y que modifica mediante hidrólisis los glucolípidos, monogalactosil-diglicéridos (MGDG) y digalactosil-diglicéridos (DGDG), a los componentes más polares monogalactosil-monoglicérido (MGMG) y digalactosil-monoglicérido (DGMG), que son componentes más activos en superficie que MGDG y DGDG, en combinación con un enzima adicional en la que dicho enzima adicional se selecciona de entre el grupo constituido por una amilasa, una hemicelulasa, una proteasa, una oxidorreductasa y una celulasa, en la preparación de una masa y/o un producto horneado, en la que una o más de las características siguientes se proporciona al producto horneado: homogeneidad de los poros mejorada y diámetro de los poros reducido, en la que el polipéptido que presenta actividad de lipasa comprende la secuencia de aminoácidos representada como SEC ID nº 9 o una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 95% respecto a la SEC ID nº 9, y en la que el polipéptido es un enzima hidrolizante de triacilglicerol.

Description

Lipasa y utilización de la misma para mejorar las masas y los productos horneados.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la elaboración de alimentos, en particular a la preparación de productos de panadería mejorados. Específicamente, la invención proporciona nuevos polipéptidos que presentan actividad de lipasa que puede proporcionar características mejoradas a productos alimentarios, incluyendo los productos de panadería.

Antecedentes de la invención y Técnica anterior

Las lipasas (EC 3.1.1.3), que pueden definirse como carboxiléster-asas que catalizan la hidrólisis de acilgliceroles, son enzimas fisiológicamente muy importantes; uno de los tres enzimas digestivos principales, con las amilasas y las proteasas. Hidrolizan lípidos en glicerol y ácidos grasos, aunque también pueden funcionar en las reacciones de esterificación o transesterificación.

Varios estudios informan de la purificación y caracterización de lipasas de Aspergillus niger. De esta manera, Tombs y Blake (Biochim. Biophys. 700: 81-89, 1982) purificaron una lipasa de un concentrado de medio crudo comercial de Aspergillus. La lipasa pura era un dímero glucosilado que contenía dos cadenas, presentando cada una un peso molecular de 25 kDa.

Iwai y Tsujisaka (en: Lipases, Borgström y Brockman (editores), Elsevier, Amsterdam, páginas 443 a 468, 1984) también han purificado una lipasa secretada extracelularmente de Aspergillus niger y obtuvieron cristales de la lipasa. Determinaron el peso molecular de la lipasa en 38 kDa y descubrieron que el enzima era monomérico. Determinaron que el pI era de 4,3. El pH óptimo en aceite de oliva era de 5,6 y la temperatura óptima en el mismo sustrato, de 25ºC. La lipasa era estable en un intervalo de pH de entre 2,2 y 6,8 (30ºC, 24 horas) y hasta una temperatura de 50ºC (pH 5,6, 15 minutos). La lipasa mostraba una actividad elevada hacia los triglicéridos de ácidos grasos de longitud de cadena intermedia.

Höfelmann et al. (J. Food Sci. 50: 1721-1731, 1985) utilizaron un producto comercial de lipasa de
Aspergillus niger (Lipasa 2212, Röhm) como material de partida para la purificación de lipasa. Se obtuvieron dos lipasas con pesos moleculares de 19 kDa y 31 kDa y un pI de 3,5 y 4,0, respectivamente. Ambos enzimas se encontraban
glucosilados.

Torossian y Bell (Biotechnol. Appl. Biochem. 13: 205-211, 1991) utilizaron una preparación cruda comercial de lipasa de Aspergillus niger de Amano (Japón). Determinaron que su peso molecular era de 37 kDa y el pI era de 4,0. Se determinó que el extremo N-terminal era XVSTSTLDELQFALQ. Sugihara et al. (Agri. Biol. Chem. 52: 1591-1592, 1988) encontraron que el extremo N-terminal era SVT y el peso molecular era de 35 kDa para una lipasa purificada a partir de una preparación de lipasa de Aspergillus niger Amino (Japón).

A pesar de las discrepancias de peso molecular para las lipasas mencionadas se informa de que todas son 1,3-específicas con respecto a la hidrólisis de los triglicéridos.

En la industria panadera, es bien conocida la utilización de enzimas, tales como amilasas, xilanasas, oxidasas y proteasas, para la mejora de la masa, de las propiedades de manipulación de la masa y/o del producto horneado con el fin de obtener un volumen incrementado, el retraso del envejecimiento y una mayor blandura. También es conocida la utilización de lipasas como aditivo en el horneado.

De esta manera, la patente US nº 3.368.903 da a conocer preparaciones de lipasa purificada aisladas de semillas de plantas que, al añadirse a una mezcla de masa de pan, presenta un efecto retardante del envejecimiento del pan significativo.

La patente JP nº 62-285749-A describe un método de fabricación de pan en el que se añade lipasa a la masa mezclada con gluten vital y lecitina. Se indica que dicha lipasa deteriora las propiedades cualitativas, tales como el volumen del pan y la elasticidad de la miga.

Mohsen et al. (Egypt. J. Food Sci. 14: 175-182, 1986) describen que una lipasa producida por Rhizopus delemar mejora la blandura del pan.

En el documento EP nº 468 731 A1 se da a conocer un producto mejorante del pan que comprende glucosa oxidasa en combinación con oxidasas diferentes de la glucosa oxidasa o hidrolasas tales como, por ejemplo, lipasa. Se obtiene pan de un volumen suficiente que resulta satisfactorio en la calidad de las características internas y externas. Sin embargo, la utilización de lipasa sola presenta un efecto de incremento de volumen del pan.

El documento WO 94/04035 da a conocer un procedimiento para mejorar las propiedades de una masa (con o sin adición de grasa) y/o un producto horneado preparado a partir de la masa mediante la adición de una lipasa de origen microbiano a la masa. La utilización de la lipasa microbiana resultó en un volumen incrementado y en una blandura mejorada del producto horneado. Además, se encontró un efecto antienvejecimiento mejorado.

El documento EP nº 585 988 A1 da a conocer una composición mejorante del pan que comprende por lo menos una lipasa, por lo menos una hemicelulasa y por lo menos una amilasa. Los experimentos de horneado han demostrado que la utilización de lipasa sola en una masa sin adición de grasa resultaban en un volumen reducido del producto horneado, mientras que no se observaba efecto de incremento del volumen al utilizar lipasa en una masa con grasa añadida.

A partir de la técnica anterior pueden inferirse de esta manera que los efectos de lipasas conocidas al utilizarlas como aditivos de la masa son altamente variables con respecto al antienvejecimiento o el retraso de la pérdida de la firmeza de la miga y del volumen del pan.

La presente invención proporciona nuevos polipéptidos que presentan actividad de lipasa que se ha descubierto que proporcionan características altamente deseables no dadas a conocer en la técnica anterior a masas y productos de panadería. De esta amanera, en experimentos de horneado, dichos polipéptidos mostraron propiedades inesperadas y no enseñadas ni sugeridas anteriormente al utilizarlas en masas de harina, entre ellas la homogeneidad incrementada del poro de la miga y un diámetro reducido del diámetro del poro sin efectos negativos concomitantes sobre el volumen del pan y la porosidad de la miga. De esta manera, la utilización de los polipéptidos según la invención proporciona productos horneados con menor tendencia a la deformación mecánica.

Un diámetro medio de poro pequeño, una homogeneidad de poro incrementada y una porosidad no modificada implican que la invención proporciona el medio para obtener productos horneados que presentan una estructura de miga reforzada. La homogeneidad de poro mejorada del producto horneado implica además la ventaja de que se obtiene un producto que es más fácil de cortar en rodajas y que es más resistente a la manipulación física debido a la estructura reforzada de la miga.

Es bien conocido que resulta difícil extender capas delgadas de mantequilla o margarina sobre rodajas de pan que presentan una estructura de poro muy poco homogénea.

Es bien conocido que un pan en rodajas es menos resistente a la manipulación física que un pan no cortado en rodajas. Por lo tanto, la estructura reforzada de la miga, que se obtiene mediante la adición del polipéptido de la presente invención a la masa, resulta particularmente ventajosa en los productos horneados, tales como el pan tostado, que típicamente el fabricante corta en rodajas inmediatamente después del horneado y que se distribuyen en la condición de pan en rodajas en tiendas de comida rápida y en supermercados.

Además se ha descubierto que el polipéptido de la presente invención mejora la estabilidad de la red de gluten en las masas de harina, lo que implica la ventaja de que se incrementa la tolerancia a variaciones del tiempo de fermentación.

Por lo tanto, un objetivo importante de la presente invención consiste en proporcionar dichos polipéptidos de lipasa activa. Se ha encontrado que dichos polipéptidos pueden derivarse de hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Aspergillus tubigensis. Sin embargo, el polipéptido únicamente se produce en cantidades reducidas en las cepas fúngicas de tipo salvaje. Por lo tanto, otro objetivo importante consiste en proporcionar un método para producir los nuevos polipéptidos de un modo rentable mediante la utilización de tecnología de ADN recombinante.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a la utilización de un polipéptido tal como se describe en las reivindicaciones que presenta actividad de lipasa y un enzima adicional o un emulsionante en la preparación de una masa para un producto horneado con el fin de proporcionar una homogeneidad de poro mejorada o un diámetro de poro reducido al producto horneado.

Exposición detallada de la invención

El término "lipasa" se utiliza para referirse a cualquier enzima hidrolizante de triacilglicerol, incluyendo los enzimas que pueden dividir los ácidos grasos que presentan longitud de cadena corta, intermedia o larga. El polipéptido de lipasa activa puede ser uno que conserve por lo menos 80% de la actividad tras 4 días a 20ºC y a un pH comprendido en el intervalo de entre 3,5 y 8, incluyendo un pH en el intervalo de entre 5 y 7.

Para que resulte útil en la práctica, también resulta ventajoso que el polipéptido presente una buena tolerancia a la temperatura y una temperatura óptima para la actividad, por lo menos en un grado en el que sea totalmente activo en una masa por lo menos hasta que la masa fermentada se caliente en un horno. Preferentemente, la lipasa presenta una termoestabilidad que activa el enzima durante por lo menos parte del procedimiento de horneado. Específicamente, la termoestabilidad del polipéptido se encuentra a un nivel en el que conserva por lo menos 60% de su actividad tras 1 hora a 60ºC en tampón de acetato sódico 100 mM a pH 5,0, incluyendo un polipéptido que conserva por lo menos 80% de su actividad tras 1 hora a 50ºC bajo las mismas condiciones.

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El polipéptido de la invención puede mostrar actividad enzimática a un pH comprendido en el intervalo de entre 3,5 y 8,0, incluyendo el intervalo de entre 5 y 7.

El polipéptido puede presentar un punto isoeléctrico determinado mediante enfoque isoeléctrico comprendido en el intervalo de entre 3,5 y 4,5, tal como el intervalo de entre 3,8 y 4,2, incluyendo un punto isoeléctrico de 4,0\pm0,1.

Una característica altamente ventajosa del polipéptido es su capacidad de hidrolizar galactolípidos, tales como los diglicéridos galactosilo, incluyendo el diglicérido digalactosilo y el diglicerido monogalactosilo, que se encuentran normalmente presentes en una harina, en los monoglicéridos galactosilo correspondientes. De esta manera, se ha descubierto que los presentes polipéptidos pueden hidrolizar por lo menos 10% de los diglicéridos galactosilo normalmente presentes en una masa de harina en monoglicéridos. Preferentemente, por lo menos 15% de dichos diglicéridos, tal como por lo menos 25%, resultan hidrolizados.

El polipéptido puede encontrarse en una forma glucosilada. Sin embargo, se ha descubierto que la actividad enzimática de dicha lipasa glucosilada puede incrementarse mediante desglucosilación. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, puede resultar preferido proporcionar el polipéptido en una forma no glucosilada. De esta manera, en el caso de que el polipéptido se obtenga de su fuente natural o de una célula huésped recombinante en una forma glucosilada, puede incrementarse su actividad mediante N-desglucosilación mediante la eliminación por lo menos parcial de los grupos carbohidrato mediante digestión con un enzima desglucosilante, tal como endo-\beta-N-acetil-glucosamidasa H.

Alternativamente, puede proporcionarse un polipéptido no glucosilado mediante la modificación de una secuencia de ADN codificante de dicho polipéptido, de manera que se proporcione una secuencia codificante que no codifique aminoácidos o una subsecuencia del polipéptido que proporcione sitios de glucosilación. Tal como se explicará a continuación, pueden proporcionarse dichas secuencias mutadas codificantes de polipéptidos mutantes que presentan actividad de lipasa que, respecto al polipéptido de tipo salvaje, presenten una actividad enzimática incrementada.

El grado de glucosilación del polipéptido tal como se obtiene se refleja en el peso molecular. A título de ejemplo, en el caso de que el polipéptido se derive de Aspergillus tubigensis en una forma glucosilada, típicamente presenta un peso molecular determinado mediante filtración en gel utilizando Superosa 12 de 32\pm1 kDa. Según la espectrometría de masas de ionización/desorción por láser asistida por matriz (MALDI-ms), el polipéptido según la invención típicamente presenta un peso molecular de 31\pm1,5 kDa. Se ha descubierto que, en este polipéptido inicialmente glucosilado, los oligosacáridos N-ligados forman aproximadamente 10% del polipéptido.

El polipéptido según la invención comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la presente memoria como SEC ID nº 9.

En particular, el término "homólogo" es utilizado en la presente memoria para comprender los polipéptidos que presentan actividad de lipasa que, con respecto a la secuencia representada como SEC ID nº: 9, es de una composición o secuencia de aminoácidos similar, permitiendo unas menores variaciones que no presentan un efecto adverso sobre las propiedades enzimáticas y/o la función biológica, o que pueden proporcionar unas nuevas propiedades o funciones biológicas útiles e interesantes. El polipéptido homólogo puede obtenerse a partir de cualquier organismo o puede obtenerse mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante siendo un polipéptido de origen natural modificado en su secuencia. Un polipéptido homólogo es uno en el que existe una homología de por lo menos 75%, más preferentemente por lo menos 85% y todavía más preferentemente por lo menos 95% con la secuencia representada como SEC ID nº: 9.

En otra forma de realización de la invención, el polipéptido es parte de una proteína de fusión que comprende secuencias enzimáticamente activas adicionales. Aunque resulta posible construir dichos polipéptidos quiméricos mediante modificaciones postraduccionales, generalmente resulta preferido proporcionar dichas proteínas de fusión por medios de ADN recombinante en los que se transforma una célula huésped con una secuencia de ADN codificante del producto de fusión y que presenta este producto expresado en forma de una proteína quimérica. Entre los ejemplos de dicha actividad enzimática adicional se incluyen las actividades proteolíticas, amilolíticas y hemicelulolíticas.

En el caso de que un polipéptido se obtenga de una célula que expresa el gen codificante del polipéptido, generalmente se encuentra en forma de una preparación más o menos cruda que contiene otras actividades enzimáticas (contaminantes). Según la invención, también resulta posible proporcionar el polipéptido en una forma sustancialmente pura. Dicho polipéptido purificado puede obtenerse sometiendo una preparación de enzima crudo a cualquier método convencional de purificación de polipéptidos y proteínas.

El polipéptido puede obtenerse de Aspergillus tubigensis tal como se describe en los ejemplos siguientes. Sin embargo, puede derivarse de cualquier organismo que produzca dicho polipéptido, incluyendo de hongos, especies de levadura, bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, células vegetales o animales, incluyendo células humanas.

Tal como se ha mencionado anteriormente, son propiedades interesantes del polipéptido su capacidad de reducir el diámetro de poro de la miga y de incrementar la homogeneidad de poro de la miga del pan. En una forma de realización específica, el polipéptido es uno que, al añadirlo a una masa de pan en una cantidad de 5.000 unidades de lipasa (LUS) por kg de harina, reduce el diámetro medio de poro de la miga del pan preparado a partir de la masa en por lo menos 10% respecto a un pan preparado a partir de una masa de pan sin adición de la lipasas. En otra forma de realización, el polipéptido es un polipéptido que, al ser añadido a una masa de pan en una cantidad de 5.000 LUS por kg de harina, incrementa la homogeneidad de los poros de la miga del pan preparado a partir de la masa en por lo menos 5% en comparación con un pan preparado a partir de una masa de pan sin adición de la lipasa.

Se da a conocer una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos codificante del polipéptido que presenta actividad de lipasa tal como se ha descrito anteriormente.

Dicha secuencia de nucleótidos puede aislarse a partir de una fuente natural o puede construirse tal como se describe en detalle en los ejemplos posteriormente, en los que dicha secuencia codificante aislada de Aspergillus tubigensis y denominada lipA se describe en detalle. La secuencia de nucleótidos también puede sintetizarse basándose en las secuencias de aminoácidos de un polipéptido natural que muestra actividad de lipasa.

La molécula de ADN recombinante comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido que muestra actividad de lipasa que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 9.

La molécula de ADN recombinante comprende por lo menos la secuencia codificante de secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 8 o una variante, o fragmento de la misma, o una secuencia complementaria a la misma.

En el presente contexto, los términos "variante" o "fragmento" en relación a la secuencia de nucleótidos codificante del polipéptido de la presente invención incluyen cualquier sustitución, variación, modificación, sustitución, deleción o adición de uno o más ácidos nucleicos de la secuencia, o en la secuencia, que proporciona la secuencia de nucleótidos resultante codificante de un polipéptido que presenta la secuencia mostrada como SEC ID nº 9.

También se da a conocer una célula que comprende una molécula de ADN recombinante tal como se ha indicado anteriormente y que puede expresar el polipéptido según la invención. Dicha célula puede seleccionarse de entre hongos, especies de levadura, bacterias, células vegetales y animales, incluyendo células humanas. Las células útiles se seleccionan de entre hongos filamentosos, tales como Aspergillus sp., Penicillium sp., Rhizomucor sp., Mucor sp., Trichoderma sp., incluyendo T. reesei, T. viridae y T. longibrachiatum, Neurospora sp. y Humicola sp. Entre las especies adecuadas de Aspergillus se incluyen A. niger, A. tubigensis, A. oryzae y A. awamori.

Entre las células huésped bacterianas útiles se incluyen las especies Gram-negativas, tales como, por ejemplo, E. coli, incluyendo la cepa de E. coli que aloja el plásmido pLIP4 tal como se ha depositado bajo el nº de acceso NCIMB 40863, y las especies Gram-negativas, tales como, por ejemplo, las especies de Bacillus y las especies bacterianas del ácido láctico, tales como Lactococcus lactis.

También se da a conocer un método de preparación del polipéptido según la invención mediante la expresión de una secuencia de nucleótidos capaz de expresar el polipéptido en una célula huésped transformada apropiada. El método comprende, en una primera etapa, que se transforme una célula transformable adecuada con la molécula de ADN recombinante anteriormente indicada, proporcionando una célula huésped transformada que expresa el polipéptido. Los procedimientos para la transformación de células huésped procarióticas se encuentran bien documentos en la técnica, por ejemplo ver Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

La expresión "célula huésped transformada" se utiliza en la presente memoria para incluir cualquier organismo transformable en el que se ha introducido la secuencia de nucleótidos codificante del enzima según la presente invención. La introducción de la secuencia codificante puede ser en forma de introducción de un replicón episómico, tal como un plásmido, un bacteriófago o un cósmido en la célula. Dichos replicones pueden introducirse ventajosamente en múltiples copias para obtener una expresión incrementada del polipéptido. En determinados casos puede resultar ventajoso que la secuencia de nucleótidos se incorpore al genoma del organismo, por ejemplo mediante un elemento transponible o un suceso de recombinación.

Un organismo huésped actualmente preferido para la expresión de la secuencia de nucleótidos y para la preparación del polipéptido de la presente invención es un organismo del género Aspergillus, tal como Aspergillus niger o Aspergillus tubigensis.

Una cepa de Aspergillus transformada según la presente invención puede prepararse, por ejemplo, según los métodos descritos por Rambosek y Leach (CRC Crit. Rev. Biotechnol. 6: 357-393, 1987), Davis (en: Progress in Industrial Microbiology, Martinelly y Kinghorn (editores), Elsevier Amsterdam, 29: 525-560, 1994), Ballance (en: Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi, Leong y Berga (editores), Marcel Dekker Inc., New York, páginas 1 a 29, 1991) y Turner (en: Progress in Industrial Microbiology, Martinelli y Kinghorn (editores), Elsevier Amsterdam, 29: 641-666, 1994).

En otro ejemplo, puede utilizarse una célula huésped de levadura, tal como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris. La expresión de genes heterólogos en Saccharomyces cerevisiae ha sido revisada por Goody et al. (en: Yeast Biotechnology, Berry et al. (editores), Allen y Unwin, London, páginas 401 a 429, 1987), y por King et al. (en: Molecular and Cell Biology of Yeasts, Walton y Yarronton (editores), Blackie, Glasgow, páginas 107 a 133, 1989).

La presente invención se refiere a la utilización del polipéptido en una masa de harina para proporcionar una homogeneidad de poros mejorada y un diámetro de poro reducido al producto horneado preparado a partir de dicha masa. Se ha encontrado que el polipéptido presenta estos efectos mejorados en una masa sin grasas.

En el presente contexto, la expresión "masa sin grasas" se utiliza para indicar que no se añade ningún lípido o grasa a la masa de harina. Una harina preferida es la harina de trigo o una harina compuesta en la que parte de la harina de trigo se sustituye por almidón, opcionalmente suplementado con proteína vegetal y aditivos, tales como emulsionantes. También se encuentran comprendidos otros tipos de harinas derivadas de arroz, maíz, cebada y centeno.

De esta manera, entre los ingredientes principales de la masa se incluyen harina, preferentemente harina de trigo, agua y una "sustancia generadora de gas", tal como levadura o un agente fermentador químico. Además de los ingredientes principales anteriormente indicados, la masa puede incluir ingredientes menores, tales como sal, azúcar, minerales, vitaminas, saborizante y por lo menos un aditivo adicional de la masa, tal como, por ejemplo, un agente emul-
sionante, un hidrocoloide, un enzima degradante del almidón o un enzima degradante de celulosa o de hemicelulosa.

Durante la mezcla y moldeo de los ingredientes de la masa para proporcionar una masa homogénea, la interacción entre el gluten del trigo, el almidón y el agua resulta esencial para obtener una masa con buenas propiedades de manipulación de la masa y un producto horneado satisfactorio preparado a partir de la masa.

Generalmente se supone que el almidón y el gluten forman una red estructural que incluye los glucolípidos en forma de fases líquido-cristal de estructura lamelar en forma de capas entre la proteína del gluten y el almidón.

La estructura de la miga de un producto horneado puede evaluarse mediante inspección visual de la sección transversal de pan. Sin embargo, un método más fiable que proporciona una medida cuantitativa de la estructura de la miga es el análisis de imágenes utilizando un analizador de imágenes que en la sección transversal completa del pan separa y analiza los poros individuales uno a uno y calcula el diámetro medio de poro. La sección transversal del pan en su totalidad se caracteriza por la distribución de los poros individuales, por ejemplo en forma de un histograma. Se entiende por homogeneidad, la uniformidad del tamaño de los poros y, en el presente contexto, el término "homogeneidad" se define como el porcentaje de poros que es mayor de 0,5 veces el diámetro medo de poro e inferior a 2 veces el diámetro medio de poro. El analizador de imágenes también calcula la porosidad, que es la proporción de la sección transversal del pan completo constituido por poros.

Mediante la utilización de análisis de imágenes se ha descubierto que los productos horneados preparados a partir de masa tal como se ha definido anteriormente, incluyendo una masa libre de grasas, que ha sido suplementada mediante la adición del polipéptido de la presente invención, alcanzan/obtienen una homogeneidad de poro incrementada y un tamaño de poro reducido, mientras que la porosidad no resulta modificada.

De esta manera, mediante la utilización del polipéptido según la invención en una masa libre de grasas se proporcionan productos horneados con una estructura de miga fortificada. También se ha encontrado que la homogeneidad de poro incrementada y la reducción del tamaño de poro no se ven acompañadas por una reducción de otras características del pan, tales como el volumen del pan y las propiedades de antienvejecimiento.

Tal como ya se ha mencionado, una característica muy interesante del polipéptido según la presente invención es su capacidad de modificar mediante hidrólisis los glucolípidos, diglicérido monogalactosilo (MGDG) y diglicérido digalactosilo (DGDG), en los componentes más polares monoglicérido monogalactosilo (MGMG) y monoglicérido digalactosilo (DGMG) que son componentes más activos en superficie que MGDG y DGDG.

Sin vincularse a ninguna teoría en particular, se supone que la homogeneidad de poro mejorada de la miga del pan que se obtiene mediante la utilización del polipéptido de la invención en una masa está causada por la formación de los glicéridos más activos en superficie MGMG y DGMG, que en combinación con los ácidos grasos liberados en forma ionizada contribuirán a la formación de fases mesomórficas de estructura lamelar.

Según la invención, la cantidad de polipéptido añadido a la masa corresponde a una actividad de lipasa comprendida en el intervalo de entre 100 y 30.000 unidades de lipasa (LUS) por kg de harina, tal como en el intervalo de entre 500 y 10.000 unidades de lipasa (LUS) por kg de harina, incluyendo en el intervalo de 1.000 a 8.000 unidades de lipasa (LUS) por kg de harina.

En una forma de realización interesante, el método de la invención implica la utilización combinada del polipéptido de la invención y un emulsionante, tal como monoglicéridos y diglicéridos, ésteres de sorbitán, polisorbatos, ésteres de sacarosa, ésteres de monoglicéridos y diglicéridos, poliglicerol ésteres de ácidos grasos, monoestearato de propilenglicol, ésteres de ácido láctico, lecitinas, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos comestibles y éster de ácido diacetil-tartárico de monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos comestibles.

Los ésteres de ácido diacetil-tartárico de monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos comestibles son bien conocidos en la tecnología de procesamiento de alimentos y se utilizan ampliamente en la industria de panadería como aditivos de masa para proporcionar estabilidad a la masa y un volumen incrementado de los productos horneados. Típicamente, se utilizan ésteres de ácido diacetil-tartárico de monoglicéridos y diglicéridos en una cantidad de hasta 1% en peso de la harina.

Se ha encontrado que, mediante la utilización del polipéptido de la invención en combinación con ésteres diacetil ácido tartárico de monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, todavía se obtiene una homogeneidad mejorada del poro y además, que resulta necesaria una concentración mucho menor de ésteres de ácido diacetil-tartárico de monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos para obtener el mismo volumen del pan.

Según la invención, una cantidad adecuada de ésteres de ácido diacetil-tartárico de monoglicéridos y diglicéridos de los ácidos grasos se encuentra comprendida en el intervalo de entre 0,1% y 1,0% en peso de la harina, preferentemente en el intervalo de entre 0,1% y 0,5% en peso de la harina, y más preferentemente en el intervalo de entre 0,1% y 0,4% en peso de la harina.

Los ésteres de ácido diacetil-tartárico de monoglicéridos y diglicéridos que pueden utilizarse según la invención se caracterizan porque presentan un valor de saponificación comprendido en el intervalo de entre 300 y 600, preferentemente un valor de saponificación comprendido en el intervalo de entre 300 y 400, y un valor ácido comprendido en el intervalo de entre 40 y 120, preferentemente un valor ácido comprendido en el intervalo de entre 50 y 100.

En un ejemplo, el polipéptido que presenta actividad de lipasa presenta la capacidad de incrementar el nivel etilésteres de ácidos grasos en una masa de harina en por lo menos 10%, tal como en por lo menos 50%, incluyendo en por lo menos 100%.

El polipéptido que presenta actividad de lipasa también puede presentar la capacidad de incrementar el índice de gluten en una masa de harina. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en un ejemplo útil, el método de preparación de un producto horneado comprende añadir a la masa el polipéptido en una cantidad que resulta en un incremento del índice de gluten, según determinación mediante un aparato Glutomatic 2200, en la masa de por lo menos 5% respecto a una masa sin adición del polipéptido.

El índice de gluten puede incrementarse en por lo menos 10%, tal como en por lo menos 15% o en por lo menos 20%.

En otra forma de realización útil, por lo menos se añade un enzima adicional a la masa. Entre los ejemplos de dichos enzimas adicionales se incluyen hemicelulasas, proteasas, amilasas, oxidorreductasas, tales como, por ejemplo, hexosa oxidasa y celulasas.

El polipéptido puede añadirse convenientemente a la masa o a cualquiera de los ingredientes de la masa o a cualquier mezcla de los ingredientes de la masa en forma de una composición seca o en forma de una preparación líquida que comprende el polipéptido de la presente invención.

Tal como se ha indicado anteriormente, la magnitud de la actividad del polipéptido se encuentra comprendida en el intervalo de entre 100 y 30.000 unidades de lipasa (LUS) por kg de harina, incluyendo en el intervalo de entre 500 y 10.000 unidades de lipasa (LUS) por kg de harina, tal como en el intervalo de entre 1.000 y 8.000 unidades de lipasa (LUS) por kg de harina.

En una forma de realización útil, se añade el polipéptido de la invención a la masa en mezcla con un éster de ácido diacetil-tartárico de monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos comestibles.

En otra forma de realización útil, el producto horneado es pan tostado.

Breve descripción de las figuras

La presente invención se ilustra adicionalmente haciendo referencia a las figuras adjuntas en la que:

la figura 1 representa el mapa de restricción del clon genómico del gen lipA,

la figura 2 representa la estructura del gen lipA codificante de la lipasa 3,

la figura 3 representa un cromatograma de sobrenadante de cultivo fraccionado mediante HIC de un transformante de Aspergillus tubigensis con un incremento de 62 veces de lipasa 3, y

la figura 4 representa un cromatograma de sobrenadante de cultivo fraccionado mediante HIC de la cepa no transformada de Aspergillus tubigensis.

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Ejemplos Métodos analíticos para determinar la actividad de lipasa y proteína (i) Determinación de actividad de lipasa 1. Ensayo en placa de medio que contiene tributirina

Se modificó el ensayo de Kouker y Jaeger (Appl. Environ. Microbiol. 53: 211-213, 1987).

Un protocolo típico para dicho ensayo es el siguiente: se calientan hasta la ebullición 100 ml de agar al 2% en tampón de fosfato sódico 50 mM (pH 6,3), y tras enfriar hasta aproximadamente 70ºC bajo agitación, se añaden 5 ml de rodamina B al 0,2% bajo agitación más 40 ml de tributirina. Se continuó la agitación durante 2 minutos. A continuación, la mezcla se sonicó durante 1 minuto. Tras 2 minutos adicionales de agitación, se vertieron 20 ml de la mezcla de agar en placas de Petri individuales. En ausencia de actividad de lipasa, las placas de agar que contienen tributirina y rodamina B presentan una apariencia opaca y son de color rosa.

Para cuantificar la actividad de lipasa, se perforan orificios que presentan un diámetro de 3 mm en el agar anteriormente indicado y se rellena con 10 \mul de preparación de lipasa. Se incubaron las placas durante tiempos variables a 37ºC. En el caso de que se encuentre presente actividad de lipasa en la preparación aplicada que debe someterse a ensayo, se forma una zona rosa/rojiza claramente definida en torno a los orificios. Al irradiar las placas con luz UV de 350 nm, se observa actividad de lipasa en forma de halos de fluorescencia de color naranja.

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2. Ensayo Food Chemical Codex modificado de actividad de lipasa

Se midió la actividad de lipasa basada en la hidrólisis de la tributirina según el Food Chemical Codex, cuarta edición, National Academy Press, página 803, 1996, con la modificación de que el pH es 5,5 en lugar de 7. Se define un LUT (unidad de lipasa tributirina) como la cantidad de enzima que puede liberar 2 \mumoles de ácido butírico por minuto bajo las condiciones de ensayo mencionados anteriormente.

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3. Ensayo de acetato de p-nitrofenilo

La actividad de lipasa también puede determinarse colorimétricamente utilizando acetato de p-nitrofenilo como sustrato, por ejemplo utilizando el protocolo siguiente: en una placa de microtitulación, se añaden 10 \mul de muestra o de blanco seguido de la adición de 250 \mul de sustrato (0,5 mg de acetato de p-nitrofenilo por ml de tampón de fosfato 50 mM, pH 6,0). La placa de microtitulación se incuba durante 5 minutos a 30ºC y se lee la absorbancia a 405 nm utilizando un lector de microplaca. Se define 1 unidad como 1 \mumol de p-nitrofenol liberado en 5 minutos.

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4. Ensayo de hexanoato de p-nitrofenilo

Puede determinarse la actividad de lipasa mediante la utilización de hexanoato de p-nitrofenilo como sustrato. Este ensayo se lleva a cabo mediante la adición de 10 \mul de preparación de muestra o blanco en una placa de microtitulación seguido de la adición de 250 \mul de sustrato (0,5 mg de hexanoato de p-nitrofenilo por ml de tampón de fosfato 20 mM, pH 6). A esta concentración de sustrato, la mezcla de reacción presenta una apariencia de solución lechosa. La placa de microtitulación se incubó durante 5 minutos a 30ºC y se leyó la absorbancia a 405 nm en un lector de microplacas.

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5. Ensayo titrimétrico de la actividad de lipasa

Alternativamente, se determina la actividad de lipasa según el Food Chemical Codex (3a edición, páginas 492 a 493, 1981) modificado para aceite de girasol y pH 5,5 en lugar de aceite de oliva y pH 6,5. Se midió la actividad de lipasa como LUS (unidades de lipasa de girasol), en donde 1 LUS se define como la cantidad de enzima que puede liberar 1 \mumol de ácidos grasos por minuto de aceite de girasol bajo las condiciones de ensayo anteriormente indicadas.

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6. Medición de las proteínas

Durante el curso de la purificación de la lipasa tal como se describe posteriormente, se midieron las proteínas eluídas de las columnas mediante la determinación de la absorbancia a 280 nm. Se determinaron las proteínas en las muestras agrupadas en placas de microtitulación mediante un método de Bradford sensible según Bio-Rad (Bio-Rad Bulletin 1177 EG, 1984). Se utilizó como estándar albúmina de suero bovino.

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Ejemplo 1 Producción, purificación y caracterización de lipasa 3 1.1. Producción

Se seleccionó una cepa mutante de Aspergillus tubigensis y se utilizó para la producción de lipasa de tipo salvaje. Esta lipasa se denomina en la presente memoria lipasa 3. Se sometió la cepa a una fermentación en un fermentador de 750 litros que contenía 410,0 kg de agua corriente, 10,8 kg de harina de soja, 11,1 kg de monohidrogenofosfato amónico, 4,0 kg de ácido fosfórico (75%), 2,7 kg de sulfato de magnesio, 10,8 kg de aceite de girasol y 1,7 kg de antiespumante 1510. Se trató térmicamente el sustrato a 121ºC durante 45 minutos. Se inoculó directamente el medio de cultivo con 7,5x10^{9} esporas de la cepa mutante. Se cultivó la capa durante tres días a 38ºC, se controló el pH a 6,5, aireación a 290 l/min y agitación a 180 rpm los primeros dos días y a 360 rpm el último día. El fermentado se separó utilizando un filtro de tambor y se concentró el filtrado de cultivo 3,8 veces mediante ultrafiltración. Se conservó el filtrado concentrado con sorbato de potasio (0,1%) y benzoato sódico (0,2%) y se utilizó como material de partida para la purificación de la lipasa.

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1.2 Purificación de lipasa

Una muestra de 60 ml de fermento (ver 1.1) que contenía 557 LUS/ml se filtró en primer lugar a través de un filtro GF/B y después a través de un filtro de 0,45 \mum. La muestra filtrada se desaló utilizando una columna Superdex G25 SP (430 ml, 22 x 5 cm) equilibrada en trietanolamina 20 mM, pH 7,3. El caudal era de 5 ml/minuto. El volumen total tras la desalación era de 150 ml.

Se aplicó la muestra desalada a una columna intercambiadora de aniones Source Q30 (100 ml, 5x5 cm) equilibrada en trietanolamina 20 mM, pH 7,3. Se lavó la columna con tampón de equilibración hasta obtener una línea base estable. Se eluyó la actividad de lipasa con un gradiente lineal de 420 ml de 0 a 0,35 M de cloruro sódico en tampón de equilibración, caudal de 5 ml/minuto. Se recogieron fracciones de 10 ml. Se añadió acetato sódico (100 \mul de una solución 2 M) a cada fracción para ajustar el pH a 5,5. Se agruparon las fracciones 26 a 32 (70 ml).

Se añadió sulfato amónico hasta 1 M al grupo procedente de la etapa de intercambio aniónico y la muestra se aplicó a una columna de HIC Source Phenyl (20 ml, 10x2 cm) equilibrada en acetato sódico 20 mM (pH 5,5), sulfato amónico 1 M. Se lavó la columna con el tampón de equilibración. Se eluyó la lipasa con un gradiente lineal de 320 ml de 1 M a 0 M de sulfato amónico en acetato sódico 20 mM (pH 5,5), caudal: 1,5 ml/minuto. Se recogieron fracciones de 7,5 ml.

Se analizaron las fracciones 33 a 41 mediante SDS-PAGE utilizando un sistema NOVEX con geles premoldeados. Se realizó tanto electroforesis como tinción con plata de los geles según el fabricante (Novex, San Diego, USA) (se utilizó el mismo sistema para la electroforesis nativa y el enfoque isoeléctrico). Se descubrió que las fracciones 40 y 41 contenían lipasa como la única proteína.

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1.3. Caracterización de la lipasa purificada (i) Determinación del peso molecular

El peso molecular aparente de la lipasa nativa era de 37,7 kDa según medición del procedimiento de SDS-PAGE anterior. La lipasa purificada eluída a un peso molecular de 32,2 kDa de una columna de filtración en gel Superose 12 (fosfato sódico 50 mM, cloruro sódico 0,2 M, pH 6,85, caudal: 0,65 ml/minuto) y es por lo tanto un monómero.

También se determinó el peso molecular de la lipasa mediante ionización/desorción por láser asistida por matriz (MALDI) por medio de un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (TOF) (Voyager Bio-Spectrometry Workstation, Perspective Biosystems). Se prepararon muestras mediante la mezcla de 0,7 \mul de solución de lipasa desalada y 0,7 \mul de una solución de matriz que contenía ácido sinápico (ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico) en acetonitrilo al 70% (TFA al 0,1%, 10 mg/ml). Se colocaron 0,7 \mul de la mezcla de muestra en la parte superior de una punta de sonda de acero inoxidable y se dejó secar al aire antes de la introducción en el espectrómetro de masas. Se obtuvieron espectros a partir de por lo menos 100 disparos de láser y se calculó una media para obtener una buena proporción de señal a ruido. Se encontró que la masa molecular para la lipasa era de 30.384 Da y 30.310 Da mediante dos análisis independientes.

La digestión de la lipasa con endo-\beta-N-acetil-glucosamidasa H (10 \mul) de Streptomyces (Sigma) se llevó a cabo mediante la adición de 200 \mul de lipasa y la incubación a 37ºC durante 2 horas. Se desaló la mezcla de digestión utilizando un filtro VSWP y se analizó directamente mediante espectrometría de masas MALDI. Un componente principal de la lipasa desglucosilada proporcionó una masa de 29.339 Da y de 29.333 Da mediante dos análisis independientes. También se observó un componente menor con una masa de 29.508 Da. Estos valores corresponden bien al último valor teórico calculado de 28.939 Da basado en la secuencia completa de aminoácidos de la lipasa madura.

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(ii) Determinación del punto isoeléctrico

El punto isoeléctrico (pI) de la lipasa se determinó mediante enfoque isoeléctrico y se encontró que era 4,1.

Un cálculo del pI basado en la secuencia de aminoácidos realizado tal como se indica posteriormente y que se muestra en la secuencia SEC ID nº 9 proporcionó un pI estimado de 4,07.

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(iii) Determinación de la estabilidad térmica

Se incubaron tubos Eppendorf con 25 \mul de la lipasa 3 purificada más 50 \mul de tampón de acetato sódico 100 mM (pH 5,0) durante 1 hora en un baño de agua a, respectivamente, 30, 40, 50 y 60ºC. Se trató un control de la misma manera, aunque se dejó a temperatura ambiente. Tras 1 hora, se determinó la actividad de lipasa 3 mediante el ensayo de acetato de p-nitrofenilo tal como se ha indicado anteriormente.

La lipasa purificada presentaba una buena termoestabilidad. Se encontró que la lipasa mantuvo 60% de su actividad tras 1 hora a 60ºC. Se mantuvo una actividad de 80% y 85% tras 1 hora a 50ºC y 40ºC, respectivamente.

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(iv) Determinación de la estabilidad del pH

Se añadió lipasa 3 purificada (200 \mul) a 5 ml de soluciones de tampón 50 mM (fosfato sódico, pH 8,0, 7,0 y 6,0 y acetato sódico pH 5,0, 4,0 y 3,5). Se diluyó el control en 5 ml de acetato sódico 4 mM, pH 5,5. Tras cuatro días a 20ºC, se midió la actividad residual mediante el ensayo Food Chemical Codex modificado para actividad de lipasa tal como se ha indicado anteriormente. La lipasa era muy estable en el intervalo de pH de entre 4,0 y 7,0, en el que mantuvo aproximadamente 100% de actividad respecto al control (Tabla 1.1). A pH 3,5, la lipasa mantuvo 92% de la actividad, y a pH 8,0, se mantuvo 95% de actividad residual en comparación con el control.

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TABLA 1.1 Estabilidad frente al pH de la lipasa

1

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Ejemplo 2 Secuenciación de aminoácidos de la lipasa 3

Se secó mediante congelación el enzima lipasa purificado y se disolvieron 100 \mug del material secado por congelación en 50 \mul de una mezcla de urea 8 M e hidrogenocarbonato amónico 0,4 M, pH 8,4. Se desnaturalizó la proteína disuelta y se redujo durante 15 minutos a 50ºC, seguido del recubrimiento con nitrógeno y la adición de 5 \mul de ditiotreitol 45 mM. Tras enfriar hasta la temperatura ambiente, se añadieron 5 \mul de yodoacetamida 100 mM para derivar los residuos de cisteína durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad bajo nitrógeno.

Se añadieron 135 \mul de agua y 5 \mug de endoproteinasa Lys-C en 5 \mul de agua a la mezcla de reacción anteriormente indicada y se llevó a cabo la digestión a 37ºC bajo nitrógeno durante 24 horas. Los péptidos resultantes se separaron mediante HPLC de fase inversa en una columna VYDAC C18 (0,46x15 cm; 10 \mum; The Separation Group, California, USA) utilizando solvente A: TFA al 0,1% en agua, y solvente B: TFA al 0,1% en acetonitrilo. Se cromatografiaron nuevamente algunos péptidos seleccionados en una columna Develosil C18 (0,46x10 cm, Novo Nordisk, Bagsværd, Dinamarca) utilizando el mismo sistema de solventes, previamente a la secuenciación N-terminal. La secuenciación se realizó utilizando un secuenciador 476A de Applied Biosystems utilizando ciclos rápidos de pulsos de líquido siguiendo las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, California, USA).

\newpage

Para la secuenciación N-terminal directa, la proteína purificada se pasó a través de una columna Brownlee C2 Aquapore (0,46x3 cm, 7 \mum, Applied Biosystems, California, USA) utilizando el mismo sistema de solventes indicado anteriormente. A continuación, se llevó a cabo la secuenciación N-terminal tal como se ha indicado anteriormente. Debido a que la proteína no se derivó antes de la secuenciación, no pudieron determinarse los residuos de cisteína.

Se encontraron las secuencias peptídicas siguientes:

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2

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No pudieron purificarse péptidos adicionales a partir del fraccionamiento de HPLC supuestamente debido a que eran muy hidrofóbicos y por lo tanto se unían fuertemente a la columna de fase reversa.

Se llevó a cabo una búsqueda en la base de datos SWISS-PROT versión 31 para las secuencias de aminoácidos con homología para los péptidos anteriormente indicados y únicamente se encontraron tres secuencias.

La totalidad de los péptidos anteriormente indicados mostraba una homología reducida con las secuencias conocidas anteriormente indicadas. Especialmente el péptido interno 2 presentaba una homología muy reducida con las tres lipasas: LIP-RHIDL, LIP-RHIMI y MDLA-PENCA de Rhizopus delamar (Haas y Berka, Gene 109: 107-113, 1991), Rhizomucor miehei (Boel et al., Lipids 23: 701-706, 1988) y Penicillium camembertii (Yamaguchi et al., Gene 103: 61-67, 1991; Isobe y Nokihara, Febs. Lett. 320: 101-106, 1993), respectivamente. Aunque la homología no era muy alta, resultó posible situar los péptidos de lipasa 3 en estas secuencias, tal como se muestra en la Tabla 2.1, a continuación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2.1 Alineación de los péptidos de lipasa 3 con secuencias conocidas de lipasa

4

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Ejemplo 3 Aislamiento y purificación del ADN genómico de Aspergillus tubigensis

Se cultivó la cepa mutante de Aspergillus tubigensis en PDB (Difco) durante 72 horas y se recolectó el micelio. Se congelaron 0,5 a 1 gramo de micelio en nitrógeno líquido y se molió en un mortero. Tras la evaporación del nitrógeno, el micelio molido se mezcló con 15 ml de un tampón de extracción (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, EDTA 50 mM, NaCl 500 mM, \beta-mercaptoetanol 10 m) y 1 ml de dodecilsulfato sódico al 20%. La mezcla se agitó vigorosamente y se incubó a 65ºC durante 10 minutos. Se añadieron 5 ml de acetato de potasio 3 M (pH 5,1 ajustado con ácido acético glacial) y la mezcla se incubó adicionalmente en hielo durante 20 minutos. Se eliminaron los residuos celulares mediante centrifugación durante 20 minutos a 20.000xg y se añadieron 10 ml de isopropanol al sobrenadante para precipitar (30 minutos a -20ºC) el ADN extraído. Tras una centrifugación adicional durante 15 minutos a 20.000xg, se disolvió el pellet de ADN en 1 ml de TE (Tris\cdotHCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) y se precipitó nuevamente mediante la adición de 0,1 ml de NaAc 3 M, pH 4,8 y 2,5 ml de etanol. Tras centrifugar durante 15 minutos a 20.000xg, se lavó el pellet de ADN con
1 ml de etanol al 70% y se secó bajo vacío. Finalmente, se disolvió el ADN en 200 \mul de TE y se almacenó a -20ºC.

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Ejemplo 4 Generación de un fragmento del gen putativo codificante de lipasa 3 utilizando PCR

Para obtener un fragmento del gen putativo (en adelante denominado gen lipA) como etiqueta para aislar el gen completo, se llevó a cabo un procedimiento de amplificación por PCR basado en la información en las secuencias del péptido aislado.

Se diseñaron cebadores degenerados para la amplificación de PCR de un fragmento del gen de lipasa basándose en las secuencias de aminoácidos de los péptidos aislados. Se sintetizaron los tres cebadores de PCR siguientes:

C035: TTC CAR AAN CCN GTR TGN AC (SEC ID nº 4)

mezcla 256 de 20-mero basada en la secuencia de péptido 1 VHTGFWK (reversa).

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C036: CAR YTN TTY GCN CAR TGG (SEC ID nº 5)

mezcla 256 de 18-mero basada en la secuencia N-terminal QLFAQW.

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C037: GCV GCH SWY TCC CAV GC (SEC ID nº 6)

mezcla 216 de 17-mero, basada en la secuencia interna del péptido 2 AWESAA (reversa).

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Se sintetizaron los oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN modelo 392 de Applied Biosystems. Para reducir el grado de degeneración se excluyeron del diseño del cebador C037 el codón GCA raro de Ala y el codón TCA de Ser.

Con dichos cebadores, se amplificaron los fragmentos deseados mediante PCR. Utilizando dichos cebadores, se esperaba que debía amplificarse un fragmento de aproximadamente 300 pb con la condición de que no existiesen intrones en el fragmento.

Se prepararon las reacciones de PCR siguientes en tubos de PCR de 0,5 ml para amplificar un fragmento de lipA putativo:

1.

0,5 \mug de ADN genómico total,

\quad

100 pmoles de cebador C036,

\quad

100 pmoles de cebador C037,

\quad

10 \mul de tampón II de PCR (Perkin Elmer),

\quad

6 \mul de MgCl_{2} 25 mM,

\quad

2 \mul de mezcla de dNTPs (dATP 10 mM, dCTP 10 mM, dGTP 10 mM, dTTP 10 mM),

\quad

2 unidades de polimerasa Amplitaq (Perkin Elmer), y

\quad

agua hasta un volumen total de 100 \mul.

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2.

0,5 \mug de ADN genómico,

\quad

100 pmoles de cebador C035,

\quad

100 pmoles de cebador C036,

\quad

10 \mul de tampón II de PCR (Perkin Elmer),

\quad

6 \mul de MgCl_{2} 25 mM,

\quad

2 \mul de mezcla de dNTPs (dATP 10 mM, dCTP 10 mM, dGTP 10 mM, dTTP 10 mM),

\quad

2 unidades de polimerasa Amplitaq (Perkin Elmer), y

\quad

agua hasta un volumen total de 100 \mul.

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Las reacciones se llevaron a cabo utilizando el programa siguiente:

94ºC

2 minutos

94ºC

1 minuto)

40ºC

1 minuto)

72ºC

1 minuto) Estas tres etapas se repitieron durante 30 ciclos

72ºC

5 minutos

5ºC

SOAK

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Las amplificaciones por PCR se llevaron a cabo en un termociclador PTC-100 de MJ Research Inc.

En la reacción 1, pudieron detectarse tres bandas claras de aproximadamente 300, 360 y 400 pb, respectivamente. Estas bandas se aislaron y se clonaron utilizando el kit pT7-Blue-T (Novagene). Los tamaños de dichos fragmentos concuerdan con los tamaños esperados con la condición de que el fragmento contenga 0, 1 ó 2 intrones, respectivamente.

Los tres fragmentos se secuenciaron utilizando un "kit de secuenciación en ciclos con cebadores marcados fluorescentemente Thermo Sekvenase" (Amersham) y se analizaron en un secuenciador ALF (Pharmacia) siguiendo las instrucciones del fabricante. El fragmento de aproximadamente 360 pb contenía una secuencia que se identificó como una lipasa y, debido a que contenía la parte del extremo N-terminal distal respecto a la secuencia utilizada para el diseño del cebador, se concluyó que se había obtenido el fragmento del gen lipA deseado.

Se muestra en la Tabla 4.1, a continuación, la secuencia del fragmento de PCR de aproximadamente 360 pb (SEC ID nº 7). La secuencia peptídica utilizada para el diseño de los cebadores se encuentra subrayada. La parte restante de la secuencia N-terminal se encuentra doblemente subrayada.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4.1 Secuencia lipA putativa generada por PCR

6

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El hecho de encontrar dicha secuencia permitió la identificación completa del fragmento de PCR como parte del gen lipA. El codón de parada encontrado en el marco de lectura puede estar causado por una PCR o por un error de lectura o puede existir un intrón codificado en el fragmento a modo de inicio de intrón de consenso y señal de finalización (mostrados en negrita). En el caso de que se eliminase el intrón putativo, se producía un desplazamiento del marco de lectura. Sin embargo, una alineación de la secuencia de aminoácidos deducida y las lipasas fúngicas representadas en la Tabla 2.1 sugirió que el fragmento era parte del gen deseado.

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Ejemplo 5 Clonación y caracterización del gen lipA (i) Construcción de una biblioteca genómica de Aspergillus tubigensis

Se digirió parcialmente el ADN genómico de Aspergillus tubigensis con Tsp5091 (New England Biolabs Inc.). Se digirieron 10 \mug de ADN en 100 \mul de mezcla de reacción que contenía 2 unidades de Tsp5091. Tras 5, 10, 15 y 20 minutos, se extrajeron 25 \mul de la mezcla de reacción y se detuvo la digestión mediante la adición de 1 \mul de EDTA 0,5 M, pH 8,0. Tras detener las cuatro reacciones, se corrieron las muestras en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE (solución madre de 10xTAE que contenía, por litro: 48,4 g de base Trizma, 11,5 ml de ácido acético glacial, 20 ml de EDTA 0,5 M, pH 8,0). Se utilizó ADN de fago lambda digerido con HindIII como marcador de peso molecular (marcador II de peso molecular de ADN, Boehringer, Mannheim). Los fragmentos de un tamaño comprendido entre aproximadamente 5 y 10 kb se recortaron del gel y los fragmentos de ADN se purificaron utilizando el kit de lavado Clean II (Bio-101 Inc.). Los fragmentos purificados se agruparon y se ligaron 100 ng de los fragmentos agrupados en 1 \mug de vector ZAP II digerido con EcoRI y desfosforilado (Stratagene) en un volumen total de 5 \mul. Se empaquetaron 2 \mul de este volumen con extracto de empaquetamiento Gigapack II (Stratagene), proporcionando una biblioteca primaria de 650.000 pfu.

Se infectó la cepa XL1-Blue-MRF de E. coli (Stratagene) con 5x50.000 pfu de la biblioteca primaria. Las bacterias infectadas se mezclaron con Top-agarosa (en placas NZY, aunque con 6 gramos de agarosa por litro en lugar del agar) y se sembraron en 5 placas de NZY (13 cm). Tras la incubación a 37ºC durante 7 horas, se añadieron 10 ml de tampón SM (por litro: 5,8 g de NaCl, 2,0 g de MgCl_{2}\cdot7H_{2}O, 50 ml de Tris-HCl 1 M, pH 7,5, 5,0 ml de gelatina al 2% (p/v)) y se incubó durante la noche a temperatura ambiente bajo agitación suave. Se recogió el tampón que contenía los fagos eluídos y se agrupó. Se añadió cloroformo al 5% y, tras una agitación vigorosa, la mezcla se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras la centrifugación durante 2 minutos a 10.000xg, se recogió la fase superior que contenía la biblioteca amplificada y se añadió dimetilsulfóxido hasta una proporción del 7%. Se extrajeron alícuotas de la biblioteca en tubos pequeños y se congelaron a -80ºC. La biblioteca congelada contenía 2,7x10^{9} pfu/ml, en la que aproximadamente 6% no presentaba inserciones.

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(ii) Cribado de la biblioteca de Aspergillus tubigensis

Se sembraron en placa 2x50.000 pfu en placas NZY grandes (22x22 cm) que contenían un medio que contenía, por litro: 5 gramos de NaCl, 2 gramos de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 5 gramos de extracto de levadura, 10 gramos de hidrolizado de caseína, 15 gramos de agar, con el pH ajustado a 7,5 con NaOH. Se autoclavó el medio y se enfrió a aproximadamente 60ºC y se vertió en las placas. Por cada placa se utilizaron 240 ml de medio.

Las placas NZY inoculadas se incubaron durante la noche a 37ºC y se realizaron transferencias de las placas. Se realizaron dos transferencias de cada placa a filtros Hybond N (Amersham). Se fijó el ADN utilizando radiación UV durante 3 minutos y los filtros se hibridaron tal como se describe posteriormente utilizando, como sonda, el fragmento de PCR anteriormente indicado de aproximadamente 360 pb que se marcó con ^{32}P-dCTP utilizando el kit de marcaje Ready-to-Go (Pharmacia).

Los filtros se prehibridaron durante una hora a 65ºC en 25 ml de tampón de prehibridación que contenía 6,25 ml de 20xSSC (Na_{3}citrato 0,3 M, NaCl 3 M), 1,25 ml de 100 x solución de Denhardt, 1,25 ml de SDS al 10% y 16,25 ml de agua. Se añadieron 150 \mul de ADN de esperma de salmón desnaturalizado 10 mg/ml al tampón de prehibridación inmediatamente antes de la utilización. Tras la prehibridación, se descartó el tampón de prehibridación y los filtros se hibridaron durante la noche a 65ºC en 25 ml de tampón de prehibridación con el fragmento de PCR marcado radioactivamente.

Al día siguiente, los filtros se lavaron siguiendo el procedimiento siguiente: 2x15 minutos con 2xSSC + SDS al 0,1%, 15 minutos con 1xSSC + SDS al 0,1% y 10 minutos con 0,1XSSC + SDS al 0,1%.

Todos los lavados se realizaron a 65ºC. Las hojas se autorradiografiaron durante 16 horas y se aislaron los clones positivos. Se consideró que un clon era positivo únicamente si se observaba una señal de hibridación en ambas transferencias de la placa en cuestión.

Se aislaron siete clones putativos y cuatro se purificaron mediante siembra en placas Petri pequeñas y llevan a cabo transferencias de placa esencialmente tal como se ha indicado anteriormente.

Los clones purificados se convirtieron en plásmidos utilizando un kit ExAssist (Stratagene).

Se diseñaron dos cebadores de secuenciación basados en el fragmento de PCR de aproximadamente 360 pb. Se utilizaron los cebadores de secuenciación para secuenciar los clones y se encontró un clon positivo con el gen lipA codificante de lipasa 3. El clon positivo aislado se denominó pLIP4.

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(iii) Caracterización del clon pLIP4

Se dibujó un mapa de restricción del clon. El fragmento de PCR de 360 pb anteriormente indicado contenía un sitio SaclI y, debido a que dicho sitio también pudo encontrarse en el clon genómico, este sitio facilitó la construcción del mapa. El mapa de restricción que muestra la estructura de pLIP4 se proporciona en la figura 1. El mapa de restricción muestra que el gen completo se encuentra presente en el clon. Además, debido a que se encuentran presentes las secuencias de promotor y terminador, se supuso que se encontraban presentes todas las regiones importantes en el clon.

Se depositó una muestra de la cepa DH5\alpha de Escherichia coli que contenía pLIP4 según el Tratado de Budapest en The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) en 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Escocia, Reino Unido, AB2 1RY, el 24 de febrero de 1997, bajo el número de acceso NCIMB 40863.

Se secuenció el gen utilizando tecnología de secuenciación en ciclos y de secuenciación convencional. La secuencia completa (SEC ID nº 8) se muestra a continuación, en la Tabla 5. La secuencia ha sido determinada para ambas cadenas para la región codificante completa y aproximadamente 100 pb cadena arriba y cadena abajo de la región codificante. Las secuencias cadena abajo de la región codificante únicamente han sido determinadas en una cadena y contienen unas cuantas incertidumbres. En la Tabla 5.1 mostrada a continuación, se indican las secuencias de intrón como letras minúsculas y los péptidos N-terminales y los dos péptidos internos (péptido 1 y péptido 2) se encuentran subrayados:

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TABLA 5.1 Secuencia de ADN para el gen lipA y secuencia flanqueantes

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(iv) Análisis de la secuencia del gen completo

La totalidad de las secuencias del péptido obtenidas pudo encontrarse en la secuencia de aminoácidos deducida (ver la Tabla 5.1), lo que confirma nuevamente que la secuencia observada es la secuencia del gen de la lipasa 3. El gen se denominó lipA.

La secuencia de aminoácidos se alineó con las tres lipasas fúngicas utilizadas para alinear las secuencias del péptido. Se muestra la alineación en la Tabla 5.2.

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TABLA 5.2 Alineación de la secuencia de la lipasa 3 con lipasas fúngicas conocidas

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La alineación anterior muestra que la lipasa 3 es homóloga de las secuencias de lipasa conocidas, pero que la homología no es muy alta. No se observaron deleciones ni inserciones en la secuencia de la lipasa 3 al comparar la secuencia con dichas tres lipasas. Lo expuesto anteriormente incrementa la probabilidad de que se hayan identificado correctamente los intrones putativos.

Se llevó a cabo una búsqueda en la base de datos SWISS-PROT versión 31 y no condujo a secuencias adicionales con una homología más alta que la homología respecto a las lipasas conocidas anteriormente indicadas (Tabla 5.3).

La secuencia con la homología más alta es la monodiacil-lipasa de Penicillium camembertii, en la que se encontró que la identidad era de 42%. Sin embargo, el extremo C-terminal de la lipasa 3 es similar a las 2 lipasas de zigomicetos (Rhizopus y Rhizomucor) y no al enzima de P. camembertii.

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TABLA 5.3 Alineación de las secuencias codificantes del gen lipA y el gen codificante de la monodiacil-lipasa de Penicillium camemberti

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Se ha determinado mediante secuenciación N-terminal que el extremo N-terminal de la lipasa madura es el residuo serina nº 28 del precursor de la lipasa 3 (SEC ID nº 9), tal como se muestra en la Tabla 5.4, posteriormente. Por lo tanto, los aminoácidos nº 1 a nº 27 representan la secuencia de señal.

TABLA 5.4 Secuencia de aminoácidos del precursor de la lipasa 3

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Los residuos 167 a 176 son reconocidos como un motivo común para las serina lipasas (PROSITE). Se ha examinado la estructura cristalina para la serina lipasa de Rhizomucor miehei y se han identificado los residuos en el sitio activo (Brady et al., Nature 343: 767-770, 1990; Derewanda et al., J. Mol. Biol. 227: 818-839, 1992). Todos los residuos del sitio activo de la lipasa de R. miehei se han conservado en todas las lipasas y corresponden a los residuos siguientes en la lipasa 3: serina 173, ácido aspártico 228 e histidina 28-5.

La lipasa 3 contiene 7 residuos de cisteína. Cuatro de ellos se encuentran conservados en la lipasa de P. camembertii, en la que forman enlaces disulfuro (Isobe y Nokuhara 103: 61-67, 1991). Esto corresponde a enlaces disulfuro entre los residuos 62 y 67 y entre 131 y 134. Además, dos residuos de cisteína son homólogos a dos residuos de C que forman un enlace disulfuro adicional en las lipasas de Rhizopus y de Rhizomucor correspondiente a los residuos 49 a 295.

Se han encontrado dos sitios putativos de N-glucosilación en la lipasa 3, en las posiciones 59 y 269. Ninguno de ellos se encuentra conservado en las demás lipasas fúngicas.

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Ejemplo 6 Transformación de Aspergillus tubigensis y sobreexpresión de la lipasa 3 en A. tubigensis

El protocolo para la transformación se basa en las enseñanzas de Buxton et al. (Gene 37: 207-214, 1985), Daboussi et al. (Curr. Genet. 15: 453-456, 1989) y Punt y van den Hondel (Meth. Enzym. 216: 447-457, 1992).

Se produjo una cepa multicopia de lipA mediante la transformación del plásmido pLIP4 en la cepa 6M 179 de Aspergillus tubigensis utilizando la cotransformación con un plásmido marcador resistente a la higromicina.

Se utilizó un procedimiento de cribado para visualizar la lipasa fúngica tras adaptar el enfoque isoeléctrico en capa ultrafina al cribado de transformantes de Aspergillus tubigensis cultivados sobre placas de agar. El cribado de los productores de lipasa sobre placas de agar se realizó utilizando aceite de oliva al 2% como el sustrato para el enzima (lipasa), así como el inductor del promotor de la lipasa. Además, las placas contenían un pigmento fluorescente, la rodamina B. En presencia de aceite de oliva, los transformantes se inducen y secretan lipasa. La lipasa secretada en la placa de agar hidroliza el aceite de oliva, causando la formación de colonias de color naranja fluorescente que son visibles tras la radiación UV (350 nm). Se realizó un seguimiento de la apariencia de las colonias fluorescentes generalmente tras 24 horas de crecimiento. Tras varios días de crecimiento, las cepas productoras de lipasa pudieron identificarse como cepas naranja fluorescentes que eran visibles al ojo desnudo. Bajo esta condición de cribado de la placa, la cepa no transformada no proporcionó fluorescencia de fondo y presentaba una apariencia de colonias opacas de color rosa.

Se cultivaron dieciséis transformantes que mostraban halos de fluorescencia naranja durante 8 días en matraces de agitación que contenían 100 ml de medio mínimo suplementado con aceite de oliva al 1%, extracto de levadura al 0,5% y ácidos casamino al 0,2%. Se cuantificó la cantidad de lipasa secretada mediante la aplicación de 10 \mul de sobrenadante de cultivo sin células en orificios perforados en placas de agar con aceite de oliva-rodamina B y la incubación de las placas durante la noche a 37ºC. Se encontraron cinco transformantes con una producción de lipasa más alta.

Se desalaron los sobrenadantes de cultivo sin células de los cinco transformantes utilizando columnas NAP5 (Pharmacia) y se equilibraron en sulfato amónico 1 M (acetato sódico 50 mM, pH 5,5). Los sobrenadantes de cultivo desalados se fraccionaron mediante cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC9 en una columna Biogel Phenyl-5 PW (Biorad). Se realizó la elución mediante un gradiente salino decreciente de 1 M a 0 M de sulfato amónico (acetato sódico 20 mM, pH 5,5). Se observó un único pico discreto de proteínas tras el fraccionamiento. Se calculó el área de los picos de proteínas de los diferentes transformantes y se compararon con el de la cepa no transformada. El mejor transformante mostró un incremento de 62 veces respecto a la cantidad de lipasa tras el fraccionamiento de HIC.

En la figura 3 se muestra un cromatograma del sobrenadante de cultivo fraccionado mediante HIC y en la figura 4 se muestra un cromatograma similar para la cepa no transformada.

La fracción que contenía la lipasa transformada se secó mediante congelación. La lipasa transformada se carboximetiló y se sometió a secuenciación N-terminal de aminoácidos de los primeros 15 aminoácidos y se encontró que la secuencia de la lipasa recombinante era exactamente igual a la de la lipasa nativa, indicando el corte correcto de la secuencia de señal.

Las diferentes fracciones de lipasa recogidas tras la HIC se separaron en un gel SDS de Tris-glicina al 12% y la tinción de plata reveló una banda de proteínas, confirmando la homogeneidad de las fracciones. Además, el extracto crudo mostró una banda de lipasa sustancial como la única banda que se acumulaba en el sobrenadante de cultivo en cantidades muy elevadas al cultivar el hongo en el medio que contenía aceite de oliva.

Se analizó la lipasa recombinante mediante desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI) por medio de un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (TOF), tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria. El peso molecular de la lipasa recombinante era de 32.237 Da.

La detección de los oligosacáridos N-ligados se consiguió mediante digestión de la lipasa con endo-\beta-acetil-glucosamidasa H de Streptomyces (Sigma). La digestión de la lipasa recombinante secretada en el medio de cultivo alteró la movilidad de la banda observada en el SDS-PAGE, en el que se desplazaba como una banda única con un peso molecular de aproximadamente 30 kDa.

La lipasa recombinante desglucosilada generada mediante digestión con endoglucosidasa y analizada directamente mediante espectrometría de masas MALDI proporcionó un peso molecular del esqueleto polipeptídico de 29.325 Da.

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Ejemplo 7 Construcción de mutantes por glucosilación de la lipasa 3

La sobreexpresión de la lipasa 3 en la cepa 6M 179 de A. tubigensis (Ejemplo 6) resultó en la sobreglucosilación de la proteína y la posterior reducción de la actividad enzimática.

Con el fin de evitar el problema de la sobreglucosilación y la pérdida de actividad, se construyeron varios geles mutados de lipA. Un modelo molecular de la estructura tridimensional de la lipasa 3 basado en la comparación en la base de datos de lipasas conocidas y sus estructuras cristalinas resueltas reveló la topología superficial de los dos sitios putativos de N-glucosilación en la lipasa. Los dos posibles sitios responsables de la glucosilación son los residuos asparagina en N59 y en N269. Los dos residuos de asparagina se modificaron mediante mutación a un residuo treonina (T) o a un residuo glutamina (Q). La mutación a treonina (N>T) elimina el grupo amida a través del que se glucosila la asparagina sin alterar el tamaño de la cadena lateral, así como reteniendo el oxígeno polar. La mutación a glutamina (N>Q) resulta en un carbono adicional en la cadena lateral y la retención del grupo amida. Se construyeron tres mutantes únicos, N59T, N269T y N269Q y dos mutantes dobles, N59TN269T y N59TN269Q, tal como se describe a continuación.

Los cebadores mutagénicos diseñados para incorporar mutaciones específicas de la secuencia se fosforilaron utilizando la polinucleótido quinasa de T4, tal como se describe en el manual del kit de mutagénesis in vitro Bio-Rad M13. La hibridación a un molde de ADN monocatenario tuvo lugar en Tris 20 mM, NaCl 50 mM, MgCl_{2} 2 mM a una proporción molar de cebador a molde de 30:1, incubación a 30ºC durante aproximadamente 1,5 horas. La síntesis de la segunda cadena se llevó a cabo con ADN polimerasa de T7 (0,5 unidades) en una mezcla de reacción que contenía 0,4 mM de cada uno de los dNTPs, ATP 0,75 mM, Tris-Cl 17,5 mM (pH 7,4), MgCl_{2} 3,75 mM, DDT 21,5 mM y ADN ligasa 4T (5 unidades) para la ligación de la cadena recién sintetizada al extremo 5' de los cebadores. La reacción se incubó en hielo durante 5 minutos, después a 25ºC durante 5 minutos y finalmente a 37ºC durante 30 minutos, y se detuvo mediante la adición de tampón de parada (Tris 10 mM, pH 8, EDTA 10 mM) y congelación. Las reacciones se analizaron en un gel de agarosa al 1% en tampón TAB antes de la transformación en células E. coli SURE. Los transformantes se analizaron mediante secuenciación de ADN.

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Los transformantes E. coli SURE que contenían los genes mutados de lipA se depositaron de acuerdo con el Tratado de Budapest en The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), en 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Escocia, Reino Unido, AB2 1R7, el 24 de marzo de 1998 bajo los números de acceso siguientes. Los tres mutantes únicos N59t: ncimb 40931; N269T: NCIMB 40932; N269Q: NCIMB 40933 y los dos mutantes dobles: N59TN269T: NCIMB 40934; N59TN269Q: NCIMB 40935.

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Ejemplo 8 Transformación de la cepa 3 M pyrA de Aspergillus tubigensis con mutantes de lipA codificantes de mutantes de glucosilación de la lipasa 3 y la expresión de los genes mutados (i) Procedimiento de transformación

Se cultivaron esporas de la cepa 3M pyrA de A. tubigensis durante la noche a 34ºC en un matraz de agitación que contenía medio mínimo suplementado con 2% de glucosa y uridina 10 mM. Se recolectaron los micelios y se resuspendieron en tampón de lisis más enzima de lisado. Los protoplastos producidos se mezclaron con plásmidos codificantes de tres mutantes por glucosilación de la lipasa mediante el método de cotransformación.

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(ii) Expresión de genes lipA codificantes de lipasas mutantes

Se cribaron los transformantes para la producción de lipasas mutantes. Se propagaron cultivos puros de transformantes en medio líquido de la manera siguiente: se añadieron esporas a una densidad de 10^{6}/ml y se cultivaron a 34ºC durante 5 días bajo agitación a 200 rpm. El medio de cultivo para los transformantes contenía 100 ml de medio mínimo suplementado con 2% de aceite de girasol (inductor), 1,5% de peptona, 0,2% de ácidos casamino y 50 \mug/ml de ampicilina. Se recogió el filtrado de cultivo cada día y se sometió a ensayo en placas de aceite de oliva-rodamina para la actividad de lipasa. Se inspeccionaron las placas de aceite-rodamina para halos fluorescentes (actividad de lipasa) tras una incubación durante la noche a 37ºC. Además, se utilizó un ensayo cromogénico utilizando éster resorufina de ácido 1,2-O-dilauril-rac-gliceorl-3-glutárico (sustrato cromogénico de la lipasa, Boehringer Mannheim Biochemica, nº de cat. 1179934) para comprobar doblemente que los filtrados recogidos los días 2, 3, 4 y 5. La Tabla 8.1 a continuación muestra la actividad de lipasa de transformantes seleccionados que expresan diferentes genes lipA modificados codificantes de lipasa 3 mutante. Se midió la actividad de lipasa el día 5 utilizando el ensayo cromogénico anteriormente indicado.

TABLA 8.1 Actividad de lipasa de enzimas de lipasa 3 codificados por los mutantes por glucosilación del gen lipA

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Además, la actividad de lipasa en los filtrados de cultivos de los transformantes S3-4, S4-3 y cepa 6M 179 (que expresa lipasa 3 sobreglucosilada) mostró actividades lipolíticas incrementadas (Tabla 8.2) durante la fermentación entre los días 2 y 5.

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TABLA 8.2 Actividad de lipasa en filtrados de cultivo durante la fermentación (ensayo cromogénico medido a 572 nm)

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Ejemplo 9 Fermentación y purificación de lipasas 3 de tipo salvaje y modificada (i) Fermentación

Se utilizaron esporas (10^{6}/ml) de cepas de Aspergillus tubigensis que expresaban diferentes mutantes por glucosilación de lipasa 3 para inocular matraces de agitación que contenían 200 ml de medio mínimo suplementado con 2% de aceite de girasol (inductor), 1,5% de peptona, 0,2% de aminoácidos casamino y ampicilina 50 \mug/ml. Los cultivos se cultivaron bajo agitación a 200 rpm durante 4 días a 34ºC. Se separó el filtrado de cultivo a partir de los micelios mediante filtración a través de un filtro de nilón.

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(ii) Purificación de la lipasa

Todas las muestras de sobrenadante de cultivo de las fermentaciones de S2-6, S3-4, S4-1 y S4-3 se trataron de la misma manera. En primer lugar se desaló una muestra de 15 ml en una columna PD-10 equilibrada en trietanolamina 20 mM, pH 7,3. La muestra desalada se aplicó a un intercambiador aniónico Source Q15 (HR5/5) equilibrado en trietanolamina 20 mM, pH 7,3. Caudal: 1,5 ml/minuto. La columna se lavó con tampón de equilibración hasta obtener una línea base estable. A continuación, se eluyó la actividad de lipasa con 30 ml de un gradiente lineal de NaCl entre 0 y 0,53 M en tampón de equilibración. Se recogieron fracciones de 1,5 ml. Se cribaron las fracciones para actividad utilizando el ensayo de placa en tributirina tal como se ha indicado anteriormente.

Al grupo de actividades de lipasa de Source Q15 se le añadió sulfato amónico hasta 1 M y la muestra se aplicó a una columna Source Phenyl HIC (HR5/5) equilibrada en acetato sódico 20 mM (pH 5,5), sulfato amónico 1 M. Se lavó la columna con tampón de equilibración. La lipasa se eluyó con un gradiente lineal de sulfato amónico de 1 a 0 M en acetato sódico 20 mM (pH 5,5), caudal: 1,5 ml/minuto. Se recogieron fracciones de 0,75 ml. Las fracciones de picos de lipasa eran totalmente homogéneas (una banda) según el examen de SDS-PAGE seguido de tinción de plata, tal como se ha indicado anteriormente.

Los cuatro mutantes por glucosilación de lipasa diferentes se comportaban de la misma manera durante la purificación.

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(iii) Determinación de la actividad específica

Se determinó la actividad específica para los cuatro mutantes de lipasa purificados. Tanto con respecto a la actividad en tributirina (LUT) tal como se ha indicado anteriormente, y con respecto al aceite de girasol (LUS), tal como también se ha indicado anteriormente, se determinaron las proteínas tal como se ha indicado anteriormente. Se resumen los resultados en la Tabla 9.1.

TABLA 9.1 Actividad específica de lipasas mutantes en comparación con lipasa 3 de tipo salvaje y lipasa 3 sobreglucosilada

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Puede observarse que la actividad específica de las lipasas mutantes expresadas en S2-6, S4-1 y S4-3 es dos veces la actividad específica de la lipasa 3 sobreglucosilada al medirla (LUS) en aceite de girasol, que contiene ácidos grasos de cadena larga como lípidos presentes normalmente en harina y masa. Al medirlas en tributirina (LUT), las diferencias de actividad específica son menos pronunciadas. Esto podría explicarse por el hecho de que un posible "enmascaramiento" del sitio activo mediante sobreglucosilación resultará menos perjudicial en el caso de que el sustrato sea pequeño, tal como la tributirina, en comparación con los ácidos grasos de cadena larga en el aceite de girasol. La actividad específica de la lipasa 3 S3-4 es inferior a la de la lipasa 3 sobreglucosilada (medida en aceite de girasol).

En el ensayo en LUS, ninguno de los mutantes presentaba tan buena actividad específica como la lipasa 3 de tipo salvaje, aunque, tal como se muestra en un ejemplo a continuación, la actividad enzimática es más alta para los mutantes por glucosilación que para la lipasa 3 de tipo salvaje en un sistema de masa.

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(iv) Determinación del peso molecular

El peso molecular aparente de las lipasas mutantes purificadas se determinó corriendo las lipasas en un gel SDS-PAGE. Se muestran los resultados en la Tabla 9.2.

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TABLA 9.2 Peso molecular de las lipasas de tipo salvaje, sobreglucosiladas y mutantes

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Se observa que la lipasa sobreglucosilada da lugar a una molécula de lipasa 3 que presenta un peso molecular mayor que la lipasa 3 nativa de tipo salvaje. Mediante la eliminación de uno de los dos sitios potenciales de N-glucosilación, tal como se realiza en S2-6 (N269Q) y en 3S-4 (N269T), se obtuvo un peso molecular inferior, aunque todavía ligeramente superior que el de la lipasa 3 de tipo salvaje, indicando la sobreglucosilación en el segundo sitio de glucosilación. Mediante la eliminación de ambos sitios potenciales de N-glucosilación, tal como en S4-1 y en S4-3 (ambos N59T N269Q), se obtiene un peso molecular claramente inferior al de la lipasa 3 de tipo salvaje que concuerda con una falta total de N-glucosilación en este mutante.

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(v) Determinación del punto isoeléctrico de las lipasas mutantes

Se determinaron los puntos isoeléctricos de los 4 mutantes diferentes por glucosilación de lipasa mediante cromatoenfoque en un Mono P (HR5/5) hasta pH 4,1 para todos los enzimas mutantes. Se equilibró la columna en bib-tris 25 mM, pH 6,10. Se generó un gradiente de pH corriendo 100% de un politampón 74 al 10% en agua (pH 3,8 con HCl) más betaína al 2,5%, que eluyó la lipasa o lipasas. Caudal: 0,70 ml/minuto. Se recogieron fracciones de 0,4 ml.

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(vi) Determinación de la estabilidad frente a la temperatura de la lipasa mutante S4-1

Se diluyó una muestra de lipasa S4-1 purificada (296 LUT/ml) 1:1 con NaAc 200 mM, pH 5,0. Se incubaron durante 1 hora en un baño de agua tubos Eppendorf con 1 ml de dicha muestra diluida a 30ºC, 40ºC, 50ºC y 60ºC, respectivamente. Se trató un control de la misma manera, aunque a temperatura ambiente. La actividad de lipasa restante se determinó mediante el ensayo de acetato de p-nitrofenilo tal como se ha indicado anteriormente. Se muestran los resultados a continuación, en la Tabla 9.3.

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TABLA 9.3 Estabilidad térmica de la lipasa mutante (S4-1) en comparación con la lipasa 3 de tipo salvaje

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(vii) Determinación de la estabilidad frente al pH de la lipasa mutante S3-4

Se añadieron muestras de 200 \mul de lipasa mutante S3-4 purificada a 5 ml de tampón 50 mM (pH 3,5, 4,0, 5,0, NaAc, y pH 6,0, 7,0, 8,0, tampón fosfato). Se diluyó el control en 5,0 ml de NaAcl 4 mM, pH 5,5. Tras 4 días a 20ºC, se midió la actividad residual de las muestras mediante el ensayo Food Chemical Codex modificado para actividad de lipasa tal como se ha indicado anteriormente. La lipasa mutante S3-4 era muy estable en el intervalo de pH de 4,0 a 8,0, en el que mantuvo aproximadamente 100% de la actividad respecto al control. A pH 3,5, la lipasa mantuvo 88% de la actividad en comparación con el control. Se muestran los resultados en la Tabla 9.4.

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TABLA 9.4 Estabilidad frente al pH de la lipasa mutante S3-4

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Ejemplo 10 Experimentos de horneado utilizando lipasa 3 10.1. Procedimientos de horneado y métodos analíticos (i) Procedimiento de horneado para pan tostado danés

Se amasaron 2.000 g de harina (harina Reforma danesa), 30 gramos de levadura seca, 30 gramos de sal y agua correspondiente a 400 unidades Brabender + 3%, en un mezclador Hobart con gancho durante 2 minutos a velocidad baja y 10 minutos a velocidad alta. La temperatura de la masa tras el amasado era de 25ºC. El tiempo de reposo fue de 10 minutos a 30ºC. Se pesaron trozos de 750 gramos de masa y se dejaron reposar nuevamente durante 5 minutos a 33ºC y 85% de HR. Tras moldear en un moldeador Glimik, se añadió levadura a la masa en bandejas durante 50 minutos a 33ºC y se horneó en un horno Wachtel durante 40 minutos a 220ºC inyectando vapor durante 16 segundos. Tras enfriar, se pesó el pan y se midió el volumen del mismo mediante el método de desplazamiento de semillas de colza. Se calculó el volumen específico dividiendo el volumen del pan (ml) por el peso (g) del pan.

Se evaluó subjetivamente la miga utilizando una escala de 1 a 5, en la que 1=gruesamente no homogénea, y 5=perfectamente homogénea.

Se almacenaron a 20ºC tres panes horneados en bandejas con tapa y se utilizaron para mediciones de la firmeza y de los poros por medio de un analizador de imágenes.

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(ii) Procedimiento de horneado de bollos daneses

Se amasaron 1.500 gramos de harina (Reforma danesa), 90 gramos de levadura comprimida, 24 gramos de azúcar, 24 gramos de sal y agua correspondiente a 400 unidades Brabender-2%, en un mezclador Hobart con gancho durante 2 minutos, a velocidad baja y 9 minutos a velocidad alta. Tras amasar, la temperatura de la masa era de 26ºC. Se pesó un trozo de masa de 1.350 g. Tras dejar reposar durante 10 minutos a 30ºC, la masa se moldeó en un moldeador Fortuna, después de lo cual se dejó fermentar la masa con levadura durante 45 minutos a 34ºC y se horneó en un horno Bago durante 18 minutos a 220ºC inyectando vapor durante 12 segundos. Tras enfriar, se pesaron los bollos y se midió el volumen de los mismos mediante el método de desplazamiento de semillas de colza. Se calculó el volumen específico tal como se ha indicado anteriormente.

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(iii) Determinación de la homogeneidad de los poros

Se midió la homogeneidad de los poros del pan mediante un analizador de imágenes compuesto de una videocámara CCD estándar, un digitalizador de vídeo y un ordenador personal con software WinGrain. Para cada pan, se calcularon los resultados de diámetro de poro en mm y homogeneidad de poro como medias de mediciones de 10 rodajas de pan. Se expresó la homogeneidad de los poros en % de poros mayor de 0,5 veces el diámetro medio de poro y menores de 2 veces el diámetro medio.

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(iv) Determinación de la firmeza

La firmeza del pan, expresada como N/dm^{2}, se midió con un Instron UTM modelo 4301 conectado a un ordenador personal. Las condiciones para la medición de la firmeza del pan fueron:

Celda de carga

max. 100 N

Diámetro del pistón

50 mm

Velocidad de desplazamiento del cabezal

200 mm/minuto

Compresión

25%

Grosor de la rodaja de pan

11 mm

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El resultado era una media de las mediciones de 10 rodajas de pan para cada pan.

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(v) Determinación del índice de gluten

Se midió el índice de gluten por medio de un Glutomatic 2200 de Perten Instruments (Suecia). Inmediatamente después de la fermentación, se pesaron 15 gramos de masa y se introdujeron en el Glutomatic y se lavaron con 500 ml de solución de NaCl al 2% durante 10 minutos. La masa lavada se transfirió a una centrífuga 2015 de índice de gluten y las dos fracciones de gluten se pesaron y se calculó el índice de gluten según la ecuación siguiente:

Índice de gluten = (peso del gluten restante en el tamiz x 100)/peso total de gluten

(vi) Extracción de lípidos de la masa

Se congelaron inmediatamente y se secaron por congelación 30 gramos de masa totalmente fermentada. La masa seca por congelación se molió en un molinillo de café y se pasó a través de un tamiz de 235 \mum. Se pesaron 4 gramos de masa seca por congelación en un tubo de centrífuga de 50 ml con tapa enroscable y se añadieron 20 ml de n-butanol saturado de agua (WSB). Se introdujo el tubo de centrífuga en un baño de agua a una temperatura de 100ºC durante 10 minutos, después de los cual se introdujeron los tubos en un Rotamix y se centrifugaron a 45 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se introdujeron nuevamente los tubos en el baño de agua durante 10 minutos y se centrifugaron en el Rotamix durante 30 minutos adicionales a temperatura ambiente.

Se centrifugaron los tubos a 10.000xg durante 5 minutos. Se pipetearon 10 ml del sobrenadante a un vial y se evaporaron a sequedad bajo atmósfera de nitrógeno. Se utilizó esta muestra para el análisis de HPLC.

Se fraccionó una muestra similar en un Bond Elut Si (Varian 1211-3036). La fracción no polar se eluyó con 10 ml de ciclohexano:isopropanol:ácido acético (55:45:1) y se evaporó a sequedad. Se utilizó esta muestra para el análisis de GLC.

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(vii) Análisis de HPLC

Columna: LiChrospher 100 DIOL 5 \mum (Merck art. nº 16152), 250x4 mm con una camisa de agua a una temperatura de 50ºC.

Fases móviles:

A: heptano:isopropanol:n-butanol:tetrahidrofurano:isooctano:agua(64,5:17,5:7:5:5:1).

B: isopropanol:n-butanol:tetrahidrofurano:isooctano:agua (73:7:5:5:10).

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Las fases móviles contenían 1 mmol de ácido trifluoroacético por 1 fase móvil y se ajustaron a pH 6,6 con amonio.

Bomba: Waters 510 dotada de un controlador de gradiente. Gradiente:

22

Detector: CUNOW DDL21 (dispersión de la luz evaporativa); temperatura: 100ºC; voltage: 600 voltios; flujo de aire: 6,0 l/minuto.

Inyector: Hewlett Packard 1050; volumen de inyección: 50 \mul.

Las muestras para el análisis se disolvieron en 5 ml de cloroformo:metanol (75:25), se sonicaron durante 10 minutos y se filtraron a través de un filtro de 0,45 \mum.

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(viii) Análisis de GLC

Cromatógrafo de gases capilar Perkin Elmer 8420 dotado de una columna WCOT de sílice fundido de 12,5 m x 0,25 mm recubierta con una fase estacionaria de 0,1 \mum de fenilmetil-silicona al 5% (CP Sil 8 CB de Crompack).

23

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Preparación de las muestras: se disolvieron 50 mg de fracción no polar de lípidos del trigo en 12 ml de heptano:piridina (2:1) que contenían heptadecano 2 mg/ml como estándar interno. Se transfirieron 500 \mul de la solución a un vial de tapa ondulada y se añadieron 100 \mul de N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetamida. Se dejó reaccionar la mezcla durante 15 minutos a 90ºC.

Cálculo: se determinaron los factores de respuesta para monoglicéridos, diglicéridos y triglicéridos y ácidos grasos libres a partir de mezclas de referencia de estos componentes. Basándose en estos factores de respuesta, se calcularon los glicéridos y los ácidos grasos libres en lípidos del trigo.

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10.2. Experimentos de horneado con lipasa 3 en pan tostado danés

Se evaluó el efecto de añadir lipasa 3 a una masa para preparar pan tostado danés. Se añadió el enzima en forma de una preparación seca por congelación en maltodextrina conjuntamente con los demás ingredientes. Se muestran los resultados de los ensayos de horneado en las Tablas 10.1 a 10.4.

TABLA 10.1

25

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TABLA 10.2

26

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TABLA 10.3

27

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TABLA 10.4

28

Tras la adición de hasta aproximadamente 5.000 LUS/kg de harina de la lipasa, no se observó ningún cambio de volumen del pan, aunque a una dosis más alta de lipasa 3 se produjo una tendencia a una reducción pequeña, aunque no estadísticamente significativa, del volumen (Tabla 10.1).

De los resultados en la Tabla 10.2, aparentemente la lipasa 3 mejoró la homogeneidad de la miga del pan y el diámetro medio de los poros de la miga se redujo significativamente.

El índice de gluten también se correlacionaba claramente con la adición de lipasa 3, indicativo de un gluten más firme causado por la modificación de los componentes lipídicos del trigo, que causa una mejor estabilidad de la masa y una estructura más homogénea de los poros del pan. Sin embargo, estas modificaciones aparentemente eran óptimas a una adición de 5.000 LUS/kg de harina de lipasa 3, mientras que una dosis más alta resultó en una modificación muy fuerte del gluten del trigo.

Los resultados de los análisis de GLC y de HPLC (Tabla 10.3) demuestran claramente que los triglicéridos en la masa se habían hidrolizado. Sin embargo, resulta más interesante la observación de una modificación de los glucolípidos monogalactosil-diglicérido y digalactosil-diglicérido. Estos componentes se convirtieron en los componentes más polar monogalactosil-monoglicérido y digalactosil-monoglicérido. Debido a que el digalactosil-monoglicérido es un componente más activo en superficie que el digalactosil-diglicérido, se supone que este componente contribuyó a la estructura de celda de la miga y homogeneidad de la misma mejoradas. Aparentemente fosfolípidos como la fosfatidilcolina únicamente resultaron modificados en un grado muy reducido.

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10.3. Experimentos de horneado con lipasa 3 en bollos daneses

Se evaluó el efecto de la adición de lipasa 3 a una masa para preparar bollos daneses. Se añadió el enzima en forma de una preparación secada por congelación en maltodextrina conjuntamente con los demás ingredientes. Se muestran los resultados de los ensayos de horneado en las Tablas 10.5 a 10.7.

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TABLA 10.5

30

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TABLA 10.6

31

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TABLA 10.7

32

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Resulta evidente a partir de los resultados mostrados en la Tabla 10.5 que la adición de lipasa 3 no incrementa significativamente el volumen de los bollos. Además, se encontró que la lipasa 3 mejoraba la homogeneidad de la miga.

Los análisis de GLC y de HPLC de los lípidos del trigo, tal como se muestra en las Tablas 10.6 y 10.7, demuestran la modificación de dichos lípidos.

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Ejemplo 11 Experimentos comparativos de horneado utilizando lipasa 3 y productos comerciales de lipasa

Se sometió a ensayo la lipasa 3 en bollos daneses en un ensayo comparativo con dos productos de lipasa comercialmente disponibles: NOVOZYM 677 BG (nº 1885) de Novo Nordisk (Dinamarca) y lipasa A "Amano 6" (nº 1757) de Amano (Japón). Se resumen los resultados en la Tabla 11.1.

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TABLA 11.1

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Resulta evidente a partir de los resultados en la Tabla 11.1 que la lipasa 3 no presenta ningún efecto sobre el volumen de los bollos, mientras que se observa un efecto significativo sobre el volumen con los productos enzimáticos comerciales nº 1885 y nº 1757.

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Ejemplo 12 Experimentos comparativos que muestran la hidrólisis relativa de los triglicéridos en comparación con la hidrólisis de DGDG

La lipasa 3, la lipasa nº 1885 y la lipasa nº 1757 se sometieron a ensayo en bollos daneses con el fin de estudiar la hidrólisis relativa de los triglicéridos en comparación con la hidrólisis del digalactosil-diglicérido (DGDG). Se secó por congelación masa totalmente fermentada y se extrajo con n-butanol saturado de agua. Los lípidos extraídos se analizaron mediante GLC y HPLC tal como se ha indicado anteriormente. A partir de los resultados analíticos, se calculó el grado de hidrólisis de los triglicéridos en comparación con el grado de hidrólisis del digalactosil-diglicérido (DGDG) a diferentes niveles de lipasas. Los niveles de lipasa utilizados fueron, para nº 1885: 0, 400 y 800 LUS/kg de harina, para nº 1757: 0, 1.770 y 2.360 LUS/kg de harina, y para la lipasa 3: 0, 10.000 y 20.000 LUS/kg de harina. Se resumen los resultados en la Tabla 12.1.

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TABLA 12.1

34

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A partir de los resultados en la Tabla 12.1, resulta evidente que la lipasa 3 presenta un efecto significativo sobre la hidrólisis del digalactosil-diglicérido, mientras que el efecto de las dos lipasas comercialmente disponibles, nº 1757 y nº 1885, son despreciables.

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Ejemplo 13 Experimentos de horneado utilizando lipasa 3 en combinación con un éster de ácido diacetil-tartárico de monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos

Se sometió a ensayo la lipasa 3 en combinación con éster diacetil-ácido tartárico de monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos comestibles que presentaban un valor de saponificación de 355 y un valor ácido de 60 (PANODAN A2020 DATEM). Los bollos se hornearon tras cuatro tiempos de fermentación diferentes: 45, 65, 85 y 105 minutos. Se añadió lipasa 3 a los ingredientes de la masa en forma de polvos secados mediante congelación. Se evaluó subjetivamente la homogeneidad de los poros en una escala de 1 a 5, en la que 1=grueso no homogéneo y 5=perfectamente homogéneo. Se muestran los resultados de los experimentos en la Tabla 13.1.

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TABLA 13.1

35

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Aparentemente de la Tabla 13.1 la lipasa 3 en combinación con DATEM mejoró la homogeneidad de los poros y se encontró que se producía un efecto combinado, lo que implica que resulta posible utilizar DATEM a una concentración muy inferior en combinación con lipasa 3 y todavía obtener el mismo volumen y una miga mejor.

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Ejemplo 14 Experimento de horneado con lipasa 3 en la preparación de bollos daneses con y sin adición de aceite de soja

Se sometió a ensayo el efecto de la lipasa 3 de tipo salvaje purificada en la preparación de bollos daneses con y sin la adición de aceite de soja a la masa. Se evaluaron los bollos horneados para volumen específico, homogeneidad de los poros de la miga y calidad de la corteza del pan. Se midió el volumen específico tal como se ha indicado anteriormente. Se evaluó subjetivamente la homogeneidad de los poros en una escala de 1 a 10, en la que 1=gruesos no homogéneos y 10=perfectamente homogéneos. Se evaluó la calidad de la corteza del pan en una escala de 1 a 10, en la que 1=baja calidad y 10=alta calidad.

Las masas totalmente fermentadas de dichos ensayos de horneado se congelaron y se secaron mediante congelación. Las masas secadas por congelación se extrajeron con butanol saturado de agua y se determinó el contenido de ácidos grasos libres mediante análisis de GLC tal como también se indica en el Ejemplo 10. Se resumen los resultados de los ensayos de horneado y el análisis de los ácidos grasos libres en la Tabla 14.1.

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TABLA 14.1 Evaluación de la calidad del pan de bollos y el contenido de ácidos grasos libres en masa fermentada

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A partir de los experimentos de horneado aparentemente la lipasa 3 mejora tanto la homogeneidad de los poros como la calidad de la corteza tanto en el pan con aceite añadido como en el pan sin adición de aceite. Mediante la adición de un nivel elevado de lipasa 3 (13.500 LUT/kg de harina) se observó una reducción del volumen del pan.

Los resultados del análisis para ácidos grasos libres en la masa de estos experimentos de horneado también se muestran en la Tabla 14.1. A partir de estos resultados aparentemente la lipasa 3 se encuentra activa en la masa con independencia de que se añada aceite o no. Además, el nivel de ácidos grasos libres en la masa es igual al nivel en masas con y sin aceite.

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Ejemplo 15 Formación de éster de etilo en la masa mediante la adición de lipasa 3

Tal como se muestra en el Ejemplo 14, se producen ácidos grasos libres al añadir lipasa 3 a la masa. Durante la fermentación de la masa del pan, la levadura produce dióxido de carbono y etanol, y el nivel de etanol en la masa normalmente es superior a 1% al final de la fermentación. En el caso de que se encuentre presente lipasa 3 en la masa, dicho enzima no sólo cataliza la hidrólisis de los triglicéridos, sino que inesperadamente se ha encontrado que también se forma estiléster de los ácidos grasos.

Los etilésteres de los ácidos grasos son un componente del sabor bien conocido que se utiliza, inter alia, para enmascarar sabores desagradables en alimentos de tipo graso. Algunos experimentos de horneado no informados en la presente memoria han demostrado que la lipasa añadida a una masa es capaz de enmascarar el sabor "viejo" del pan que se produce al preparar pan a partir de harina almacenada a 35ºC durante 3 meses. Esto podría explicarse por la formación de etilésteres en la masa.

Se determinó la cantidad de etiléster de ácidos grasos mediante la extracción de masa seca por congelación con butanol saturado de agua. La fase lipídica aislada se analizó mediante GLC-MS para determinar tanto la identidad como la cantidad de etilésteres de ácidos grasos. Se muestran los resultados de estos análisis en la Tabla 15.1.

TABLA 15.1 Contenido de etilésteres de ácidos grasos en masa con lipasa añadida

37

Los resultados muestran claramente un nivel creciente de etiléster de ácidos grasos con dosis crecientes de lipasa en la masa.

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Ejemplo 16 Efecto de la lipasa 3 sobre los bizcochos

Se sometió a ensayo el efecto de la lipasa 3 en un bizcocho preparado mediante la receta y procedimiento siguientes.

Azúcar

208 g

Harina

188 g

Almidón de maíz

60 g

Levadura en polvo

14 g

Huevo

200 g

GATODAN 504, gel para bizcocho*

18 g

Agua

150 g

Lipasa 3

ver posteriormente

\quad

\text{*}Emulsionante constituido por glicerol y propilenglicol esterificado con ácidos grasos comestibles (28%), etanol (8%), Grindsted PS 409 (estearato sódico al 25% en glicerol)(6%) y agua (58%).

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Se mezclaron todos los ingredientes durante 6 minutos utilizando un mezclador Hobart N50. La mezcla para pastel se dividió en 3x175 gramos en bandejas para bizcochos y se horneó durante 35 minutos a 180ºC.

Se midió el volumen específico del pastel mediante el método de desplazamiento de semillas de colza y se midió la blandura del pastel tras el almacenamiento a 20ºC durante 7 días utilizando un analizador de alimentos Instron.

Se resumen los resultados del ensayo de horneado en la Tabla 16.1.

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TABLA 16.1 Volumen específico y blandura del pastel tras 7 días de almacenamiento (hPa)

39

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A partir de estos resultados aparentemente la lipasa 3 mejora la blandura del pastel sin modificar el volumen del mismo.

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Ejemplo 17 Experimentos de horneado utilizando lipasa 3 y opcionalmente hemicelulasa para la preparación de pan de centeno/trigo

Se preparó pan de centeno/trigo a partir de una masa que contenía los ingredientes siguientes: harina de trigo, 667 gramos; harina de centeno tamizada, 1.333 gramos; "Back aroma sauer", 40 gramos; levadura comprimida, 60 gramos; sal, 44 gramos; agua, 1.160 gramos; lipasa 3, ver posteriormente; GRINDAMYL^{TM} H121 (producto comercial de hemicelulasa de Grindsted Products, Brabrand, Dinamarca).

Se mezcló la masa utilizando un mezclador Kemper durante 2 minutos a velocidad reducida y durante 11 minutos a velocidad alta. Temperatura de la masa: 27ºC, tiempo de reposo: 30 minutos a 32ºC, pesada: 800 gramos, fermentación: 20 minutos a 32ºC y 85% de HR, horneado durante 30 minutos a 230ºC y 10 segundos de inyección de vapor.

Se evaluó la pegajosidad de la masa utilizando una escala de 1 a 5, en la que 1=muy pegajoso y 5=normal no pegajoso. También se evaluó el volumen específico del pan. Los resultados se muestran en la Tabla 16.1.

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TABLA 17.1 Efecto de la lipasa 3 sobre la pegajosidad y el volumen del pan con o sin adición de GRINDAMYL^{TM} H121

40

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La adición de lipasa 3 en combinación con hemicelulasa a pan de centeno/trigo mejoró claramente las propiedades de manipulación de la masa en el aspecto de que ésta era menos pegajosa.

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Ejemplo 18 Evaluación del efecto en un sistema modelo de masa de la lipasa 3 producida por transformantes de A. tubigensis

Se sometieron a ensayo las lipasas de cinco transformantes de A. tubigensis: 161, S2-6, S3-4, S4-1 y 720-4 3M (ver la Tabla 8.1) en un sistema modelo de masa a diferentes concentración y se analizó la formación de ácidos grasos libres según el procedimiento siguiente:

Se preparó una masa utilizando los ingredientes siguientes: harina, 50 gramos; levadura seca, 0,375 gramos; NaCl, 0,75 gramos; agua, 28 gramos; lipasa, ver posteriormente. Se mezclaron harina, levadura seca y sal durante 1 minuto en una taza de mezcla Brabender (50 gramos). Se añadieron la lipasa y el agua a la masa seguido de la mezcla durante 6 minutos a 62 rpm. Se transfirió la masa a un vaso dotado de una tapa y se fermentó la masa durante 60 minutos a 32ºC. Se secó por congelación la masa. La masa seca por congelación se molió y se tamizó y se extrajo con butanol saturado de agua (WSB). Se evaporó el WSB bajo un flujo de N_{2} y se determinó el contenido de ácidos grasos libres mediante espectrofotometría según Kwon D.Y. y J.S. Rhee, JAOCS 63: 89, 1986.

En un primer experimento, la lipasa 3 de tipo salvaje purificado se comparó con el enzima mutante producido por el transformante S3-4 a diferentes concentraciones, tal como se muestra en la Tabla 18.1. Los resultados muestran claramente un nivel incrementado de ácidos grasos a medida que se incrementa el nivel de dosificación de enzima. Sin embargo, también resulta evidente que los niveles de lipasa 3 de tipo salvaje se estabilizan a aproximadamente 3\textperthousand de ácidos grasos a una dosis elevada de lipasa, mientras que la lipasa producida por el transformante S3-4 continuó produciendo más ácidos grasos a una dosis incrementada de enzima hasta alcanzar aproximadamente 5\textperthousand de ácidos grasos.

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TABLA 18.1 Liberación de ácidos grasos libres en un sistema modelo de masa

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Las lipasas producidas por los transformantes 161, S2-6, S4-1 y 720-4 3M también se sometieron a ensayo mediante el mismo procedimiento, con los resultados representados en la Tabla 18.2.

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TABLA 18.2 Liberación de ácidos grasos libres en un sistema modelo de masa

42

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Los resultados demuestran claramente que las cinco lipasas transformantes eran más activas en una masa en comparación con la lipasa 3 de tipo salvaje en la comparación a la misma dosis de enzima (LUT/kg).

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Ejemplo 19 Experimento de horneado utilizando lipasas producidas por S3-4 y S4-1 en la preparación de bollos daneses

Se llevaron a cabo experimentos de horneado en los que se prepararon bollos daneses con diferentes dosis de lipasa producida por transformante S3-4 y S4-1, respectivamente. Tras el horneado, se determinó el volumen específico del pan y la homogeneidad de la miga se evaluó subjetivamente tal como se ha indicado anteriormente. Se muestran los resultados de los ensayos de horneado en la Tabla 19.1.

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TABLA 19.1 Efecto sobre la calidad del pan de lipasas producidas por los transformantes S3-4 y S4-1, respectivamente

100

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Una dosis incrementada de las dos lipasas anteriormente indicadas mejoró la estructura de la miga y produjo pan de mejor apariencia y estructura de la corteza. A dosis elevadas del enzima producido por S3-4, se produjo una reducción del volumen del pan y se observó la misma tendencia para la lipasa producida por S4-1 a una dosis más baja.

Se concluye que también dichas lipasas mutantes sometidas a ensayo mejoraron la estabilidad de la masa y del pan y mejoraron la estructura de la miga al igual que la lipasa 3 de tipo salvaje.

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(Formulario pasa a página siguiente)

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44

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<110> DANISCO A/S

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<120> Lipasa y utilización de la misma para mejorar las masas y los productos horneados

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<130> P012875EPF

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<150> 06002232.4

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<151> 2006-02-03

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<150> 04075819.5

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<151> 1998-04-03

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<150> DK 0400/97

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<151> 1997-04-09

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<150> Solicitud divisionaria de 06002232.4

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<151> 2006-02-03

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<160> 9

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<170> PatentIn version 3.3

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<210> 1

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<211> 25

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<212> PRT

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<213> Aspergillus tubingensis

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (22)..(22)

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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de manera natural

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<400> 1

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45

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<210> 2

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Aspergillus tubingensis

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<400> 2

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<210> 3

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Aspergillus tubingensis

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<400> 3

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<210> 4

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador oligonucleótido

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (9)..(9)

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<223> n es a, c, g, o t

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (12)..(12)

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<223> n es a, c, g, o t

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (18)..(18)

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<223> n es a, c, g, o t

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<400> 4

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<210> 5

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador oligonucleótido

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (6)..(6)

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<223> n es a, c, g, r t

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (12)..(12)

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<223> n es a, c, g, r t

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<400> 5

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<210> 6

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Cebador oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm

50

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<210> 7

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<211> 317

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<212> ADN

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<213> Aspergillus tubingensis

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 1833

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<212> ADN

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<213> Aspergillus tubingensis

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (3)..(3)

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<223> n es a, c, g, o t

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (372)..(453)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_peptide

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<222> (372)..(452)

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_peptide

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<222> (453)..()

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (506)..(672)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (719)..(1054)

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1108)..(1413)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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52

53

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<210> 9

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<211> 297

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<212> PRT

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<213> Aspergillus tubingensis

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<400> 9

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54

Claims (13)

1. Utilización de un polipéptido que presenta actividad de lipasa y que modifica mediante hidrólisis los glucolípidos, monogalactosil-diglicéridos (MGDG) y digalactosil-diglicéridos (DGDG), a los componentes más polares monogalactosil-monoglicérido (MGMG) y digalactosil-monoglicérido (DGMG), que son componentes más activos en superficie que MGDG y DGDG, en combinación con un enzima adicional en la que dicho enzima adicional se selecciona de entre el grupo constituido por una amilasa, una hemicelulasa, una proteasa, una oxidorreductasa y una celulasa, en la preparación de una masa y/o un producto horneado, en la que una o más de las características siguientes se proporciona al producto horneado: homogeneidad de los poros mejorada y diámetro de los poros reducido, en la que el polipéptido que presenta actividad de lipasa comprende la secuencia de aminoácidos representada como SEC ID nº 9 o una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 95% respecto a la SEC ID nº 9, y en la que el polipéptido es un enzima hidrolizante de triacilglicerol.

2. Utilización de un polipéptido que presenta actividad de lipasa y que modifica los fosfolípidos en una masa, en combinación con un enzima adicional en el que dicho enzima adicional se selecciona de entre el grupo constituido por una amilasa, una hemicelulasa, una proteasa, una oxidorreductasa y una celulasa, en la preparación de una masa y/o producto horneado, en la que una o más de las características siguientes se proporciona al producto horneado: homogeneidad de los poros mejorada y diámetro de los poros reducido, en la que el polipéptido que presenta actividad de lipasa comprende la secuencia de aminoácidos representada como SEC ID nº 9 o una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 95% respecto a la SEC ID nº 9 y en la que el polipéptido es un enzima hidrolizante de triacilglicerol.

3. Utilización de un polipéptido que presenta actividad de lipasa y que modifica mediante hidrólisis los glucolípidos, monogalactosil-diglicéridos (MGDG) y digalactosil-diglicéridos (DGDG), a los componentes más polares monogalactosil-monoglicérido (MGMG) y digalactosil-monoglicérido (DGMG), que son componentes más activos en superficie que MGDG y DGDG, en combinación con un emulsionante, en la preparación de una masa y/o producto horneado, en la que se proporcionan una o más de las características siguientes al producto horneado: homogeneidad de los poros mejorada y diámetro de los poros reducido, en la que el polipéptido que presenta actividad de lipasa comprende la secuencia de aminoácidos representada como SEC ID nº 9 o una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 75% respecto a la SEC ID nº 9 y en la que el polipéptido es un enzima hidrolizante de triacilglicerol.

4. Utilización de un polipéptido que presenta actividad de lipasa y que modifica los fosfolípidos en una masa, en combinación con un emulsionante, en la preparación de una masa y/o producto horneado, en la que se proporcionan una o más de las características siguientes al producto horneado: homogeneidad de los poros mejorada y diámetro de los poros reducido, en la que el polipéptido que presenta actividad de lipasa comprende la secuencia de aminoácidos representada como SEC ID nº 9 o una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 75% respecto a la SEC ID nº 9 y en la que el polipéptido es un enzima hidrolizante de triacilglicerol.

5. Utilización de un polipéptido que presenta actividad de lipasa y que modifica mediante hidrólisis los glucolípidos, monogalactosil-diglicéridos (MGDG) y digalactosil-diglicéridos (DGDG), a los componentes más polares monogalactosil-monoglicérido (MGMG) y digalactosil-monoglicérido (DGMG), que son componentes más activos en superficie que MGDG y DGDG, en combinación con un enzima adicional, en la que dicho enzima adicional se selecciona de entre el grupo constituido por una amilasa, una hemicelulasa, una proteasa, una oxidorreductasa y una celulasa, y en combinación con un emulsionante, en la preparación de una masa y/o producto horneado, en la que se proporcionan una o más de las características siguientes al producto horneado: homogeneidad de los poros mejorada y diámetro de los poros reducido, en la que el polipéptido que presenta actividad de lipasa comprende la secuencia de aminoácidos representada como SEC ID nº 9 o una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 75% respecto a la SEC ID nº 9 y en la que el polipéptido es un enzima hidrolizante de triacilglicerol.

6. Utilización de un polipéptido que presenta actividad de lipasa y que modifica los fosfolípidos en una masa, en combinación con un enzima adicional en la que dicho enzima adicional se selecciona de entre el grupo constituido por una amilasa, una hemicelulasa, una proteasa, una oxidorreductasa y una celulasa, y en combinación con un emulsionante en la preparación de una masa y/o producto horneado, en la que se proporciona una o más de las características siguientes al producto horneado: homogeneidad de los poros mejorada y diámetro de los poros reducido, en la que el polipéptido que presenta actividad de lipasa comprende la secuencia de aminoácidos representada como SEC ID nº 9, o una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 75% respecto a la SEC ID nº 9 y en la que el polipéptido es un enzima hidrolizante de triacilglicerol.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en la que dicho emulsionante es cualquiera de los mono- y diglicéridos, ésteres de sorbitán, polisorbatos, ésteres de sacarosa, ésteres de ácido cítrico de mono- y diglicéridos, poliglicerol ésteres de ácidos grasos, monoestearato de propilenglicol, ésteres de ácido láctico, lecitinas, mono- y diglicéridos de ácidos grasos comestibles y éster de ácido diacetil-tartárico de mono- y diglicéridos de ácidos grasos comestibles.

8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en la que el emulsionante son ésteres de ácido diacetil-tartárico de mono- y diglicéridos de ácidos grasos.

9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que al añadir el polipéptido a una masa de pan en una cantidad de 5.000 unidades de lipasa (LUS) por kg de harina, reduce el diámetro de poro medio de la miga del pan preparado a partir de la masa en por lo menos 10% respecto a un pan preparado a partir de una masa de pan sin adición de la lipasa.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que, al añadirlo a una masa de pan en una cantidad de 5.000 LUS por kg de harina, incrementa la homogeneidad de los poros de la miga del pan preparado a partir de la masa en por lo menos 5% respecto a un pan preparado a partir de una masa de pan sin adición de la lipasa.

11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la masa es una masa libre de grasas.

12. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido puede hidrolizar por lo menos 10% de los galactosil-diglicéridos presentes en la masa de harina a galactosil-monoglicéridos.

13. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido puede hidrolizar por lo menos 25% de los galactosil-diglicéridos presentes en la masa de harina a galactosil-monoglicéridos.