ES2168236T3 - Utilizacion de lipasa para mejorar las pastas de pan y los productos de panaderia. - Google Patents
Utilizacion de lipasa para mejorar las pastas de pan y los productos de panaderia.Info
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Abstract
Polipéptido que presenta actividad lipásica, en el que dicho polipéptido es una enzima triacilglicerol hidrolizante y en el que dicho polipéptido es capaz de separar ácidos grasos que tienen una longitud de cadena corta, media o larga, y en el que dicho polipéptido es capaz de hidrolizar galactolípidos, normalmente presentes en una harina, en los galactosil monogliceridos correspondientes, en el que dicho polipéptido es capaz de hidrolizar por lo menos el 10% de los galactosil digliceridos, normalmente presentes en una masa preparada con harina, en monogliceridos.
Description
Utilización de lipasa para mejorar las pastas de
pan y los productos de panadería.
La presente invención se refiere al campo de la
fabricación alimenticia, en particular a la preparación de
productos mejorados de panadería. Específicamente, la invención
proporciona la utilización de un polipéptido que tiene actividad
lipásica, que es capaz de mejorar las características de los
productos alimenticios, incluyendo los productos de panadería.
Las lipasas (EC 3.1.1.3), que pueden definirse
como carboxiesterasas que catalizan la hidrólisis de los
acilgliceroles, son enzimas muy importantes fisiológicamente, uno
de los tres grupos más importantes de enzimas digestivos, junto con
las amilasas y las proteasas. Hidrolizan lípidos a glicerol y ácidos
grasos, pero pueden también funcionar en las reacciones de
esterificación o de transesterificación.
Varios estudios informan sobre la purificación y
caracterización de las lipasas a partir de Aspergillus
niger. Así, Tombs y Blake (Biochim. Biophys., 1982,
700:81-89) purificaron una lipasa a partir de
un concentrado comercial en bruto de un medio de
Aspergillus. La lipasa pura consistió en un dímero
glicosilado que contenía dos cadenas, cada una con un peso molecular
de 25 kDa.
Iwai y Tsujisaka (en Lipases, Borgström y
Brockman, (eds), Elsevier, Amsterdam, 1984, páginas
443-468), purificaron también una lipasa secretada
extracelularmente a partir de Aspergillus niger y obtuvieron
cristales de ella. Determinaron que el peso molecular de la lipasa
era de 38 kDa y encontraron que el enzima era monomérico. Se
determinó que el pI era 4,3. El pH óptimo sobre aceite de oliva era
de 5,6 y la temperatura óptima sobre el mismo substrato fue de 25ºC.
La lipasa era estable en un intervalo del pH de entre 2,2 y 6,8
(30ºC, 24 horas y hasta una temperatura de 50ºC (pH 5,6, 15 min).
La lipasa mostró una intensa actividad respecto a los triglicéridos
de ácidos grasos con una cadena de longitud media.
Höfelmann et al. (J. Food Sci., 1985,
50:1721-1731) utilizaron un producto
comercial de lipasa de Aspergillus niger (Lipasa 2212, Röhm)
como material de partida para la purificación de la lipasa. Se
obtuvieron dos lipasas con pesos moleculares de 19 kDa y 31 kDa y
un pI de 3,5 y 4,0, respectivamente. Ambos enzimas estaban
glicosi-
lados.
lados.
Torossian y Bell (Biotechnol. Appl Biochem.,
1991, 13:205-211) utilizaron una preparación
comercial en bruto de lipasa a partir de Aspergillus niger
de Amano (Japón). Determinaron que el peso molecular era de 37 kDa
y el pI de 4,0. Se determinó que el extremo N era XVSTSTLDELQFALQ.
Sugihara et al. (Agric. Biol. Chem., 1988,
52:1591-1592) encontraron que el extremo N
era SVT y que el peso molecular era de 35 kDa para una lipasa
purificada a partir de una preparación de lipasa de Aspergillus
niger de Amano (Japón).
A pesar de las discrepancias en el peso molecular
para las lipasas mencionadas, se informó que todas ellas eran
1,3-específicas respecto a la hidrólisis de los
triglicéridos.
En la industria panadera, es bien conocida la
utilización de enzimas tales como amilasas, xilinasas, oxidasas y
proteasas, para que las pastas y sus características mejoren, y/o
para que el producto de panadería consiga un aumento de volumen, un
retraso en su degradación (porque se eche a perder) y una mayor
blandura. También es conocida la utilización de las lipasas como
aditivo para la hornada.
Así, la patente US nº 3.368.903 da a conocer
preparaciones de lipasa purificada aislada de semillas vegetales
que, cuando se añaden a una mezcla de pasta de pan, poseen un
significativo efecto de retraso sobre el proceso de degradación del
pan.
La patente
JP-62-285749-A
describe un procedimiento para fabricar el pan en el que la lipasa
se añade a la pasta, mezclándola con gluten vital y lecitina. Se
determina que esta lipasa deteriora las propiedades de calidad tales
como el volumen del pan y la elasticidad de la miga.
Mohsen et al. (Egypt. J. Food Sci.,1986,
14:175-182) describe que una lipasa
producida por Rhizopus delemar mejora la blandura del
pan.
En la patente EP 468 731 A1 se da a conocer una
combinación que mejora el pan, que comprende glucosa oxidasa con
oxidasas distintas que ésta, o hidrolasas tales como por ejemplo,
lipasa. Se obtiene pan de un volumen suficiente que es
satisfactorio en la calidad de las características internas y
externas. Sin embargo, la utilización de lipasa sola posee un
efecto de proporcionar volumen al pan.
La patente WO-94/04035 da a
conocer un procedimiento para mejorar las propiedades de una pasta
(con grasa añadida o no) y/o de un producto de panadería fabricado
a partir de ésta, añadiéndole una lipasa de origen microbiano. La
utilización de la lipasa microbiana dió lugar a un aumento del
volumen y mejoró la blandura del producto de panadería. Además, se
encontró un efecto anti-degradación.
La patente EP 585 988 A1 da a conocer una
composición que mejora el pan, que incluye por lo menos una lipasa,
una hemicelulosa y una amilasa. Los experimentos de cocción
mostraron que la utilización de sólo la lipasa en una pasta a la
que no se le había añadido grasa, dió lugar a un volumen reducido
del producto de panadería, mientras que no se observó ningún efecto
sobre el volumen cuando la lipasa se utilizó en una pasta que
contenía grasa añadida.
A partir de la técnica anterior puede, por tanto,
deducirse que los efectos de lipasas conocidas cuando se utilizan
como aditivos de la pasta, son muy variables respecto a la acción
sobre su degradación, al retardo en la firmeza de la miga y en el
volumen del pan.
La presente invención proporciona la utilización
de un polipéptido que tiene actividad lipásica, en la preparación
de una pasta y/o de un producto de panadería, el cual polipéptido
es un enzima que hidroliza el triacilglicerol y en la que dicho
polipéptido es capaz de dividir los ácidos grasos que presentan
cadenas cortas, medias y largas, caracterizada porque dicho
polipéptido es capaz de hidrolizar galactolípidos que se encuentran
normalmente presentes en la harina a los correspondientes
galactosil monoglicéridos, y en la que dicho polipéptido es capaz
de hidrolizar por lo menos un 10% de los galactosil diglicéridos,
que se encuentran normalmente presentes en la pasta de harina, a
galactosil monoglicéridos, y en la que el enzima proporciona una o
más de las características siguientes del producto de panadería:
mejora en la homogeneidad de los poros y diámetro reducido de
éstos.
Según la presente invención, pueden utilizarse
nuevos polipéptidos con actividad lipásica que se encontró que
conferían características desconocidas en la técnica anterior a las
pastas y a los productos de panadería. Así, en experimentos de
cocción estos polipéptidos mostraron propiedades sorprendentes que
no habían sido enseñadas o sugeridas cuando se utilizaron en pastas
de harina, que incluyen el aumento de la homogeneidad del poro de
la miga y la reducción del diámetro de éste, sin efectos negativos
concomitantes sobre el volumen del pan y la porosidad de la miga.
De este modo, la utilización según la invención proporciona
productos de panadería que son menos propensos a la deformación
mecánica.
El diámetro medio de poro pequeño, el aumento de
la homogeneidad de los poros y la porosidad que no ha cambiado,
implican que la invención proporciona los medios para obtener
productos de panadería con una estructura reforzada de la miga. La
mejora en la homogeneidad de los poros del producto de panadería
implica además la ventaja de que se obtiene un producto que es más
capaz de partirse en rebanadas y resistente a la manipulación
física, debido a la estructura reforzada de la miga.
Es bien conocido que resulta difícil extender
capas delgadas de mantequilla o margarina sobre rebanadas de pan
que presentan una estructura de los poros muy poco homogénea. Por
tanto, constituye una ventaja que el pan, tal como puede obtenerse
según la presente invención, presente una estructura de poro fina y
homogénea.
Es bien sabido que una hoja cortada es menos
resistente a la manipulación física que una hoja que no se corte.
Por tanto, la estructura reforzada de la miga, que se obtiene
añadiendo el polipéptido de la presente invención a la pasta, es
particularmente ventajosa en los productos de panadería, tales como
el pan tostado, que se parten típicamente en rodajas inmediatamente
después de ser cocidos por el fabricante y que son distribuidos en
rodajas a establecimientos de comida rápida y supermercados.
Se ha encontrado además que la utilización según
la presente invención mejora la estabilidad de la red de gluten en
pastas de harina, lo cual implica la ventaja de que se potencia la
tolerancia a las variaciones en el tiempo de fermentación.
Constituye, por tanto, un objetivo importante de
la presente invención proporcionar dichos polipéptidos lipasa
activos útiles. Se ha encontrado que dichos polipéptidos puede
derivarse de hongos filamentosos tales como por ejemplo
Aspergillus tubigensis. Sin embargo, el polipéptido se
produce sólo en pequeñas cantidades en cepas fúngicas de tipo
salvaje. Otro objetivo importante es por tanto proporcionar un
procedimiento para producir los nuevos polipéptidos de una forma
rentable utilizando tecnología del ADN recombinante.
En consecuencia, la presente invención se refiere
a la utilización de un polipéptido con actividad lipásica en la
preparación de una pasta y/o del producto de panadería y el cual
polipéptido es un enzima que hidroliza el triacilglicerol y en la
que dicho polipéptido es capaz de dividir los ácidos grasos que
poseen cadenas cortas, medias y largas, caracterizada porque dicho
polipéptido es capaz de hidrolizar galactolípidos que se encuentran
normalmente en la harina, a los correspondientes galactosil
monoglicéridos, y en la que dicho polipéptido es capaz de
hidrolizar por lo menos el 10% de los galactosil diglicéridos, que
se encuentran normalmente en la pasta de harina, a los galactosil
monoglicéridos, en la que dicho polipéptido conserva por lo menos
una actividad del 80% después de 4 días a 20ºC y a un pH del orden
de 3,5-8; y en la que el enzima da lugar a una o
más de las características siguientes en el producto de panadería:
mejora en la homogeneidad del poro y reducción en el diámetro de
éste.
Un polipéptido que se utiliza según la presente
invención, que posee actividad lipásica y que puede provenir de
Aspergillus tubigensis, presenta las características
siguientes: (i) conserva por lo menos el 80% de la actividad
después de 4 días a 20ºC a un pH del orden de 3,5-8,
(ii) conserva por lo menos al 60% de su actividad después de 1 hora
a 60ºC en tampón de 100 mM acetato sódico a pH de 5,0, y (iii)
posee un punto isoeléctrico determinado por un enfoque isoeléctrico
del orden de 3,5-4,5. Específicamente, el
polipéptido es uno que comprende por lo menos una secuencia
aminoácida seleccionada a partir del grupo formado por SEC ID nº:
1, SEC ID nº: 2 y SEC ID nº: 3, donde Xaa en dichas secuencias es
un aminoácido seleccionado a partir del grupo formado por Ala, Arg,
Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro,
Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.
En la presente memoria, también se da a conocer
una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia
nucleótida que codifica el polipéptido con actividad lipásica.
En la presente memoria, se hace referencia
también a una célula que comprende la molécula de ADN recombinante
que es capaz de expresar el polipéptido que posee actividad
lipásica.
También se hace referencia en la presente memoria
a un procedimiento para la preparación del polipéptido para su
utilización según la invención, el cual procedimiento comprende la
transformación de una célula huésped con una molécula de ADN
recombinante que incluye una secuencia que codifica el polipéptido,
siendo capaz dicha célula huésped de expresar la secuencia
nucleótida que codifica el polipéptido cuando dicha célula huésped
se cultiva transformada, bajo condiciones en las que la secuencia
nucleótida se expresa, y se recupera el polipéptido.
Un procedimiento para la preparación de un
producto de panadería, el cual producto exhibe una mejora en la
homogeneidad del poro y un diámetro de éste reducido, comprende la
adición del polipéptido, según la utilización de la invención, a la
pasta.
De este modo, la presente invención se refiere a
la utilización del polipéptido que presenta actividad lipásica en
una pasta, para que un producto de panadería mejore la estabilidad
de la red de gluten en ella, o para producir una mejoría en la
homogeneidad del poro o reducir el diámetro de éste en el producto
de panadería, y una composición que mejore la pasta, que incluye el
polipéptido y por lo menos otro componente aditivo convencional de
la pasta.
Como se ha mencionado anteriormente, la invención
se refiere a la utilización de un polipéptido que posee actividad
lipásica. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término
"lipasa" se utiliza para designar cualquier enzima que
hidrolice el triacilglicerol, que incluye los enzimas que son
capaces de dividir los ácidos grasos que poseen cadenas cortas,
medias y largas. Según la invención, el polipéptido que posee
actividad lipásica es el que conserva el 80%, por lo menos, de la
actividad, después de 4 días a 20ºC y a un pH del orden de
3,5-8 que incluye un pH del orden de
5-7.
Para que sea útil de modo práctico, es también
ventajoso que el polipéptido que debe utilizarse según la
invención, posea una buena termotolerancia y una temperatura óptima
para su actividad, por lo menos en un grado en el que sea
completamente activo en una pasta, por lo menos hasta que la
(pasta) que se someta a prueba se caliente en un horno.
Preferentemente, la lipasa posee una termoestabilidad que hace que
el enzima sea activo durante por lo menos, parte del proceso de
cocido. Específicamente, la termoestabilidad del polipéptido se
encuentra a un nivel en el que conserva por lo menos el 60% de su
actividad, después de 1 hora a 60ºC en un tampón de 100 mM acetato
sódico a un pH de 5,0, incluyendo un polipéptido que conserva por lo
menos un 80% de su actividad después de 1 hora a 50ºC bajo las
mismas condiciones.
En una forma de realización específica, el
polipéptido para su utilización según la invención comprende por lo
menos una secuencia aminoácida que se muestra en la presente
memoria como SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2 y SEC ID nº: 3.
En unas formas de realización ventajosas, el
polipéptido para su utilización según la invención, muestra
actividad enzimática a un pH del orden de 3,5-8,0,
que incluye un pH del orden de 5-7.
El polipéptido para su utilización según la
presente invención, posee un punto isoeléctrico determinado
mediante enfoque isoeléctrico en el intervalo de
3,5-8,0, tal como el intervalo de 3,8 a 4,2
incluyendo un punto isoeléctrico de 4,0 \pm 0,1.
Una característica muy ventajosa del polipéptido
para su utilización según la invención, es su capacidad para
hidrolizar galactolípidos tales como galactosil diglicéridos,
incluyendo el digalactosil diglicérido y el monogalactosil
diglicérido, que se encuentran normalmente en la harina, a los
correspondientes galactosil monoglicéridos. Así, se ha encontrado
que estos polipéptidos son capaces de hidrolizar por lo menos el
10% de los galactosil diglicéridos que se encuentran en una pasta de
harina, a monoglicéridos. Preferentemente, el 15%, por lo menos, de
estos diglicéridos, tales como, por lo menos, el 25%, son
hidrolizados.
El polipéptido para su utilización según la
invención puede estar en forma glicosilada. Sin embargo, se ha
encontrado que la actividad enzimática de dicha lipasa glicosilada
puede potenciarse mediante desglicosilación. De acuerdo con esto,
puede preferirse suministrar el polipéptido de forma no glicosilada.
Así, cuando el polipéptido se obtiene a partir de su fuente natural
o a partir de una célula huésped recombinante en una forma
glicosilada, su actividad puede potenciarse mediante
N-desglicosilación mediante, por lo menos,
eliminación parcial de fracciones de hidratos de carbono por
digestión con un enzima desglicosilante tal como la
endo-\beta-N-acetil-glucosamidasa
H.
Alternativamente, un polipéptido no glicosilado
para su utilización con la invención, es suministrado mediante la
modificación de una secuencia de ADN que codifica dicho
polipéptido, de modo que se proporcione una secuencia codificante
que no codifique aminoácidos o una subsecuencia del polipéptido que
proporciona sitios de glicosilación. Como se explicará a
continuación, pueden proporcionarse dichas secuencias mutadas que
codifican polipéptidos mutantes con actividad lipásica, las cuales,
respecto al polipéptido de tipo salvaje, presentan una actividad
enzimática aumentada.
El grado de glicosilación del polipéptido
obtenido de este modo se refleja en el peso molecular. Como
ejemplo, cuando el polipéptido para su utilización según la
invención se deriva de Aspergillus tubigensis en una forma
glicosilada, posee típicamente un peso molecular determinado
mediante filtración en gel utilizando Superose 12 de 32 \pm 1
kDa. Por ionización de desabsorción de láser asistida por una
matriz (MALDI Ms), mediante un espectrómetro de masas, el
polipéptido para su utilización según la invención, posee
típicamente un peso molecular de 31 \pm 1,5 kDa. Se ha encontrado
que en este polipéptido glicosilado inicialmente, los
oligosacáridos unidos a N, dan cuenta del 10% aproximadamente del
polipéptido.
En una forma de realización específica, el
polipéptido para su utilización según la invención comprende la
secuencia aminoácida que se muestra en la presente memoria como SEC
ID nº: 9 o una variante, homólogo o fragmento suyo.
En el contexto presente, los términos
"variante" o "fragmento" respecto al polipéptido para su
utilización según la presente invención, incluyen cualquier
sustitución, variación, modificación, reemplazamiento, deleción o
adición de uno o más aminoácidos de o a la secuencia SEC ID nº: 9,
con tal que la secuencia aminoácida resultante posea actividad
lipásica, preferentemente, por lo menos, la misma actividad que el
polipéptido que se muestra como SEC ID nº: 9.
En particular, el término "homólogo" tal
como se utiliza en la presente memoria para incluir polipéptidos
con actividad lipásica que, respecto a la secuencia que se muestra
como SEC ID nº: 9, tiene una composición o secuencia similar en
aminoácidos, permite variaciones secundarias que no tienen un efecto
adverso sobre las propiedades enzimáticas y/o la función biológica,
o que puede dar lugar a interesantes propiedades y útiles nuevas
propiedades o funciones biológicas. El polipéptido homólogo puede
provenir de cualquier organismo o puede derivarse también
utilizando técnicas de ADN recombinante, por lo que un polipéptido
que se encuentra de forma natural se modifica en su secuencia.
Preferentemente, un polipéptido homólogo es el que posee una
homología, por lo menos, del 75%, más preferentemente, por lo
menos, del 85%, y muy preferentemente, por lo menos, del 95%,
respecto a la secuencia que se muestra como SEC ID nº: 9.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido forma parte de una proteína de fusión que comprende
otras secuencias enzimáticamente activas. Aunque es posible
construir dichos polipéptidos quiméricos mediante modificaciones
post-traduccionales, se prefiere generalmente
proporcionar dichas proteínas de fusión mediante técnicas del ADN
recombinante, en los que una célula huésped se transforma con una
secuencia de ADN que codifica el producto de fusión y que tiene
este producto expresado como una proteína quimérica. Ejemplos de
dicha actividad enzimática adicional incluye actividades
proteolíticas, amilolíticas y hemicelulolíticas.
Cuando un polipéptido se obtiene a partir de una
célula que expresa el gen que codifica el polipéptido, es
generalmente en forma de una preparación más o menos en bruto que
contiene otras actividades enzimáticas (contaminantes). Según la
invención, también es posible proporcionar el polipéptido en una
forma sustancialmente pura. Dicho polipéptido purificado puede
obtenerse sometiendo una preparación enzimática en bruto a
cualquier procedimiento convencional para la purificación de
polipéptidos y proteínas.
Según la invención, el polipéptido puede
obtenerse a partir de Aspergillus tubigensis, tal como se
describe en los ejemplos siguientes. Sin embargo, puede derivarse a
partir de cualquier organismo que produzca dicho polipéptido,
incluyendo hongos, especies de levaduras, bacterias Gram + y Gram
-, células vegetales o animales, incluyendo células humanas.
Tal como se menciona anteriormente, propiedades
importantes del polipéptido para su utilización según la invención
son su capacidad para reducir el diámetro del poro de la miga y
aumentar la homogeneidad de éste. En una forma de realización
específica, el polipéptido es el que, cuando se añade a una pasta
de pan en una cantidad de 5.000 unidades lipásicas (LUS) por kg de
harina, reduce en por lo menos un 10% el diámetro medio del poro de
la miga del pan fabricado con la pasta, respecto a un pan que se
fabrique a partir de una pasta de pan sin añadir la lipasa. En otra
forma de realización, el polipéptido es el que cuando se añade a una
pasta de pan en una cantidad de 5.000 LUS por kg de harina, aumenta
en por lo menos un 5% la homogeneidad del poro de la miga del pan
fabricado a partir de la pasta, respecto a un pan que se fabrique a
partir de una pasta de pan sin añadir la lipasa.
Se describe en la presente memoria como
referencia a una molécula de ADN recombinante que comprende una
secuencia nucleótida que codifica el polipéptido con actividad
lipásica tal como se ha dado a conocer anteriormente.
Dicha secuencia nucleótida puede aislarse a
partir de una fuente natural o puede construirse tal como se
describe con detalle en los ejemplos (que se dan) a continuación,
en los que dicha secuencia codificante aislada a partir de
Aspergillus tubigensis y a la que se hace referencia como
lipA, se describe detalladamente. La secuencia nucleótida puede
también ser sintetizada basándose en las secuencias aminoácidas de
un polipéptido que se encuentre naturalmente y que exhiba actividad
lipásica.
En formas de realización útiles, la molécula de
ADN recombinante comprende una secuencia nucleótida que codifica un
polipéptido que exhibe actividad lipásica, que incluye por lo menos
una de las secuencias aminoácidas que se muestran en la presente
memoria como SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2 y SEC ID nº: 3, o una
secuencia nucleótida que codifique un polipéptido que muestre
actividad lipásica que comprende la secuencia aminoácida que se
muestra como SEC ID nº: 9.
En otras formas de realización específicas, la
molécula de ADN recombinante comprende por lo menos una de las
secuencias SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 5, SEC ID nº: 6 y SEC ID nº: 7
o por lo menos la secuencia codificante de la secuencia nucleótida
que se muestra como SEC ID nº: 8 o una variante, homóloga o
fragmento de la misma, o una secuencia complementaria a ella.
En este contexto, los términos "variante" o
"fragmento" respecto a la secuencia nucleótida que codifica el
polipéptido de la presente invención, incluyen cualquier
sustitución, variación, modificación, reemplazamiento, deleción o
adición de uno o más ácidos nucleicos de, o a, la secuencia que
proporciona la secuencia nucleótida resultante que codifica un
polipéptido que tiene actividad lipásica, preferentemente que
presente por lo menos la misma actividad que el polipéptido que se
muestra como SEC ID nº: 9.
El término "homólogo" abarca la homología
con respecto a la secuencia y/o estructura y/o función, con tal que
la secuencia nucleótida resultante codifique un polipéptido que
posea actividad lipásica. Respecto a la homología secuencial (es
decir, similitud), existe preferentemente una homología por lo menos
del 75%, más preferentemente por lo menos, del 85%, y muy
preferentemente por lo menos, del 95%, con la secuencia que se
muestra como SEC ID nº: 8.
La molécula del ADN recombinante puede comprender
una secuencia que codifica un polipéptido según la invención, que
no comprende aminoácidos que proporcionen sitios de glicosilación.
Dichas útiles moléculas de ADN recombinante pueden seleccionarse a
partir de los plásmidos depositados con los números de registro
NCIMB 40931, NCIMB 40932, NCIMB 40933, NCIMB 40934, NCIMB
40935.
Una célula que comprende una molécula de ADN
recombinante, tal como se ha descrito anteriormente y la cual es
capaz de expresar el polipéptido para su utilización según la
invención, también se da a conocer en la presente memoria. Dicha
célula puede seleccionarse a partir de hongos, especies de levadura,
bacterias, células vegetales y animales, incluyendo células
humanas. Las células útiles son seleccionadas a partir de hongos
filamentosos tales como Aspergillus sp., un
Penicillium sp., un Rhizomucor sp., un Mucor
sp., un Trichoderma sp que incluye T. reesei, T.
viridae y T. longibrachiatum, un Neurospora sp.,
y un Humicola sp. Especies apropiadas de Aspergillus
incluyen A. niger, A. tubigensis, A. oryzae y A.
awamori.
Células bacterianas huéspedes útiles incluyen
especies Gram negativas tales como por ejemplo E. coli que
incluyen la cepa de E. coli que alberga el plásmido pLIP4
depositado con el número de registro No. NCIMB 40863, y especies
Gram negativas tales como por ejemplo, especies de Bacillus y
especies bacterianas del ácido láctico tales como Lactococcus
lactis.
En la presente memoria, se da a conocer un
procedimiento para la preparación del polipéptido para su
utilización según la invención, mediante la expresión de una
secuencia nucleótida capaz de expresar el polipéptido en una célula
huésped apropiada, capaz de transformarse. El procedimiento
comprende en una primera etapa que una célula apropiada se
transforme con la molécula de ADN recombinante anteriormente
mencionada, para proporcionar una célula huésped transformada que
exprese el polipéptido. Los procedimientos para la transformación
de las células huésped procarióticas está bien documentados en la
técnica, por ejemplo, véase Sambrook et al. (Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor
Laboratory Press).
El término "célula huésped transformada" se
utiliza en la presente memoria para incluir cualquier organismo
transformable en el que la secuencia nucleótida que codifica el
enzima según la presente invención, se ha introducido. La
introducción de la secuencia codificante puede llevarse a cabo
introduciendo un replicón episómico tal como un plásmido, un
bacteriófago o un cósmido en el interior celular. Dichos replicones
pueden introducirse ventajosamente en múltiples copias para obtener
una expresión aumentada del polipéptido. En ciertos casos, puede
ser ventajoso que la secuencia nucleótida se incorpore al genoma del
organismo de la célula huésped mediante, por ejemplo, un elemento
capaz de transposición o un evento recombinacional.
Un organismo huésped que se prefiere actualmente,
para la expresión de la secuencia nucleótida de la presente
invención y/o para la preparación del polipéptido de la presente
invención, es un organismo del género Aspergillus, tal como
Aspergillus niger o Aspergillus tubigensis.
Una cepa transformada de Aspergillus según
la presente invención puede, por ejemplo, prepararse según
procedimientos descritos por Rambosek y Leach (CRC Crit. Rev.
Biotechnol., 1987, 6:357-393), Davis (en:Progress in
Industrial Microbiology, Martinelli y Kinghorn (eds), Elsevier
Amsterdam, 1994, 29:525-560), Ballance (en:
Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for
Filamentous Fungi, Leong y Berka (eds), Marcel Dekker Inc, New York
1991, páginas 1-29) y Turner (en: Progress in
Industrial Microbiology, Martinelli y Kinghorn (eds), Elsevier
Amsterdam, 1994, 29:641-666).
En otra forma de realización, el procedimiento
utiliza una célula huésped de levadura tal como Saccharomyces
cerevisiae o Pichia pastoris. La expresión de genes
heterólogos en Saccharomyces cerevisiae ha sido
revisada por Goody et al. (en: Yeast Biotechnology, Berry
et al. (eds), Allen y Unwin, London, 1987, págs
401-429) y por King et al. (en: Molecular
and Cell Biology of Yeasts, Walton and Yarronton (eds), Blackie,
Glasgow, 1989, págs. 107-133).
Además, la presente invención se refiere a un
aspecto particular para la utilización del polipéptido según la
invención, con objeto de mejorar la estabilidad de la red de gluten
en una pasta de harina y producir una mejoría en la homogeneidad
del poro y una reducción en el diámetro de éste para el producto de
panadería, fabricado a partir de dicha pasta. Se ha encontrado que
el polipéptido posee estos efectos de mejora en una pasta sin
grasa.
En este contexto, el término "pasta sin
grasa" se utiliza para indicar que no se añaden lípidos o grasas
a la pasta de harina. Una harina que se prefiere es la harina de
trigo o una harina compuesta, en la que parte de la harina de trigo
es reemplazada por almidón, suplementado opcionalmente con proteínas
vegetales y aditivos tales como emulsificantes. También se
consideran otros tipos de harinas derivadas del arroz, maíz, cebada
y centeno.
Así, los ingredientes más importantes de la pasta
incluyen harina, preferentemente harina de trigo, agua y una
"sustancia que genera gas" tal como la levadura o un agente
químico de fermentación. Además de los ingredientes más importantes
anteriormente mencionados, la pasta puede incluir ingredientes
secundarios tales como sal, azúcar, minerales, vitaminas,
condimentos y por lo menos, otro aditivo de la pasta, tal como, por
ejemplo, un agente emulsificante, un hidrocoloide, un enzima
degradante del almidón o un enzima degradante de la celulosa o de
la hemicelulosa.
Durante el mezclado y moldeado de los
ingredientes de la pasta para proporcionar una pasta homogénea, la
interacción entre el gluten de trigo, el almidón, y el agua, es
esencial para la obtención de una pasta con buenas propiedades de
manipulación y un producto de panadería satisfactorio fabricado a
partir de la pasta.
Se supone generalmente que el almidón y el gluten
forman una red estructural que incluye los glicolípidos en forma de
fases líquido-cristalinas de estructura lamelar
como capas entre proteínas del gluten y el almidón.
La estructura de la miga de un producto de
panadería puede evaluarse mediante inspección visual del corte
transversal del pan. Sin embargo, un procedimiento más seguro que
da lugar a una medición cuantitativa de la estructura de la miga,
es mediante análisis de la imagen, utilizando un analizador de
imagen, el cual, sobre el corte transversal entero del pan, separa
y analiza los poros individuales uno por uno y calcula el diámetro
medio del tamaño del poro. El corte transversal completo del pan
está caracterizado por la distribución de los poros individuales,
por ejemplo, en forma de un histograma. Por homogeneidad se
entiende la uniformidad del tamaño del poro, y en este contexto, el
término "homogeneidad" se define como el porcentaje de poros
que es superior a 0,5 veces e inferior a 2 veces el medio del
diámetro del poro. El analizador de imagen calcula asimismo la
porosidad, que es la proporción del corte transversal entero del
pan que está formada por poros.
Utilizando el análisis de imagen, se ha
encontrado que los productos de panadería fabricados a partir de
una pasta tal como se definió anteriormente, que incluye una pasta
sin grasa suplementada con el polipéptido según la presente
invención, alcanzan/obtienen un aumento en la homogeneidad del poro
y una reducción en su tamaño, mientras que la porosidad no
cambia.
Así, utilizando el polipéptido según la
invención, una pasta sin grasa provee productos de panadería con
una estructura fortificada de la miga. También se ha encontrado que
el aumento en la homogeneidad de poro y la disminución en el tamaño
de éste, no se acompaña por una reducción de otras características
del pan, tales como su volumen y las propiedades
antidegradantes.
Como ya se ha mencionado, la característica más
interesante del polipéptido para su utilización según la presente
invención, es su capacidad para modificar, mediante hidrólisis de
los glicolípidos monogalactosil diglicérido (MGDG) y digalactosil
diglicérido (DGDG), a los componentes más polares monogalactosil
monoglicérido (MGMG) y digalactosil monoglicérido (DGMG), que son
componentes superficiales más activos que MGDG y DGDG.
Sin querer teorizar, se asume que la mejoría en
la homogeneidad del poro de la miga del pan, que se obtiene
utilizando el polipéptido de la invención en una pasta, está
causada por la formación de los glicéridos superficiales más
activos MGMG y DGMG, que en combinación con los ácidos grasos
liberados en forma ionizada, contribuirán a la formación de fases
mesomórficas de estructura lamelar.
Según la invención, la cantidad añadida de
polipéptido en la pasta corresponde a una actividad lipásica del
orden de 100-30.000 unidades lipásicas (LUS) por kg
de harina, tal como del orden de 500-10000 unidades
lipásicas (LUS) por kg de harina, incluyendo del orden de
1000-8000 unidades lipásicas (LUS) por kg de
harina.
En una interesante forma de realización, la
utilización de la invención implica el empleo combinado del
polipéptido para su utilización según la invención, y un
emulsificante tal como mono- y diglicéridos, ésteres de sorbitano,
polisorbatos, ésteres de sacarosa, ésteres de ácido cítrico de mono
y diglicéridos, ésteres de poliglicerol de ácidos grasos,
propilenglicol monoestearato, ésteres de ácido láctico, lecitinas,
mono- y diglicéridos de ácidos grasos comestibles y éster diacetilo
del ácido tartárico de mono y diglicéridos de ácidos grasos
comestibles.
Los ésteres diacetilo del ácido tartárico de
mono- y diglicéridos de ácidos grasos comestibles, son bien
conocidos en la tecnología del procesamiento alimentario y son
ampliamente utilizados en la industria panadera como aditivos de la
pasta, para proporcionar la estabilidad de ésta y un aumento del
volumen de los productos de panadería. Típicamente, los ésteres
diacetilo del ácido tartárico de los mono y diglicéridos se
utilizan en una cantidad de hasta el 1% en peso de la harina.
Se ha encontrado que utilizando el polipéptido
según la invención en combinación con los ésteres diacetilo del
ácido tartárico de los mono y diglicéridos de los ácidos grasos se
obtiene todavía una mejoría en la homogeneidad del poro, y además,
que una concentración mucho más baja de los ésteres diacetilo del
ácido tartárico de los mono y diglicéridos de los ácidos grasos, es
necesaria para obtener el mismo volumen de pan.
Según la invención, una cantidad conveniente de
ésteres diacetilo del ácido tartárico de mono y diglicéridos de
ácidos grasos es del orden de 0,1 al 1,0% en peso de la harina,
preferentemente del orden de 0,1 al 0,5% en peso de la harina y muy
preferible del orden de 0,1 al 0,4% en peso de la harina.
Los ésteres diacetilo del ácido tartárico de mono
y diglicéridos que pueden utilizarse según la invención, están
caracterizados por tener un valor de saponificación del orden de
300 a 600, preferentemente un valor de saponificación del orden de
300 a 400, y un valor ácido del orden de 40 a 120, preferentemente
un valor ácido del orden de 50 a 100.
Según la descripción anterior de la utilización
del polipéptido en una pasta de harina que incluye una pasta sin
grasa, la presente invención se refiere en otro aspecto a un
procedimiento para la preparación de un producto de panadería que
posee una homogeneidad mejorada del poro y un diámetro reducido de
éste, a partir de una pasta sin grasa tal como se ha definido
anteriormente, que comprende la adición del polipéptido de la
invención a la pasta.
En una forma de realización, la utilización de la
invención se refiere a un polipéptido que tiene actividad lipásica,
la cual tiene la capacidad de aumentar el nivel de etilésteres de
ácidos grasos en una pasta de harina en por lo menos el 10%, tal
como, por lo menos, el 50%, incluyendo por lo menos el 100%.
Según la utilización de la invención, el
polipéptido que tiene actividad lipásica tiene la capacidad de
aumentar el índice de gluten en una pasta de harina. De acuerdo con
esto, en una forma de realización útil, la utilización de la
invención para la preparación de un producto de panadería, comprende
la adición a la pasta del polipéptido en una cantidad que
proporciona un aumento del índice del gluten de por lo menos un 5%,
determinado mediante un aparato Glutomatic 2200 en la pasta,
respecto a una en la que el polipéptido no se haya añadido.
Preferentemente, el índice de gluten aumenta por
lo menos un 10%, tal como, por lo menos, un 15%, o más
preferentemente, en un 20%, por lo menos.
En otra útil forma de realización, la utilización
según la invención es una en la que, por lo menos, otro enzima se
añade a la pasta. Ejemplos de dichos otros enzimas incluyen
hemicelulasas, proteasas, amilasas, oxidoreductasas tales como por
ejemplo, hexosa oxidasa y celulasas.
El polipéptido puede añadirse convenientemente a
la pasta o a cualquiera de los ingredientes de ésta o a cualquier
mezcla de los ingredientes de la pasta, en forma de una composición
seca o como una preparación líquida que comprende el polipéptido de
la presente invención.
Tal como se ha considerado anteriormente, la
cantidad de la actividad polipeptídica es del orden de
100-30000 unidades lipásicas (LUS) por kg de
harina, incluyendo del orden de 500-10000 unidades
lipásicas (LUS) por kg de harina, tal como del orden de
1000-8000 unidades lipásicas (LUS) por kg de
harina.
En una útil forma de realización de la
utilización según la invención, el polipéptido se añade a la pasta
mezclado con un éster diacetilo del ácido tartárico de mono y
diglicéridos de ácidos grasos comestibles.
En otra útil forma de realización de la
utilización según la invención, el producto de panadería es pan
tostado.
La presente invención se ilustra de forma más
completa haciendo referencia a las figuras adjuntas, en las que
la Fig 1 muestra el mapa de restricción del clon
genómico del gen lipA,
la Fig 2 muestra la estructura del gen lipA que
codifica la lipasa 3,
la Fig 3 muestra un cromatograma de un
sobrenadante de un cultivo fraccionado de HIC de un transformante
de Aspergillus tubigensis con un aumento de 62 veces de la
lipasa 3, y
la Fig 4 muestra un cromatograma de un
sobrenadante de un cultivo fraccionado de HIC de una cepa de
Aspergillus tubigensis no transformada.
El ensayo se ha modificado de Kouker y Jaeger
(Appl. Environ. Microbiol., 1987,
53:211-213).
Un protocolo típico para este ensayo es el
siguiente: 100 ml de agar al 2% en 50 mM de tampón fosfato sódico
(pH 6,3), se calienta hasta ebullición, y después de enfriar hasta
70ºC aproximadamente bajo agitación, se añaden entonces, igualmente
bajo agitación, 5 ml de Rodamina B al 0,2%, más 40 ml de
tributirina. La agitación se continúa durante 2 minutos. La mezcla
se trata entonces con ultrasonidos durante 1 minuto. Después de
otros 2 minutos de agitación, 20 ml de la mezcla de agar se vierten
en discos de Petri individuales. En ausencia de actividad lipásica,
las placas de agar que contienen tributirina y Rodamina B
aparecerán opacas y coloreadas de rosa.
Para cuantificar la actividad lipásica, se
perforan orificios con un diámetro de 3 mm en el agar mencionado y
se rellenan con 10 \mul de la preparación de lipasa. Las placas
se incuban durante tiempos variables a 37ºC. Cuando existe
actividad lipásica en la preparación que va a ensayarse, se forma
alrededor de los orificios una zona intensa de color rosa/rojizo.
Cuando las placas se irradian con luz UV a 350 nm, la actividad
lipásica se observa como halos de fluorescencia de color
anaranjado.
La actividad lipásica basada en la hidrólisis de
la tributirina, se mide según el Food Chemical Codex, Cuarta
Edición, National Academy Press, 1996, página 803, con la salvedad
de que el pH es 5,5 en vez de 7. Una LUT (unidad de lipásica de
tributirina) se define como la cantidad de enzima que puede liberar
2 \mumol de ácido butírico por min, bajo las condiciones del
ensayo que se han mencionado.
La actividad lipásica puede también determinarse
colorimétricamente utilizando el acetato de p-nitrofenilo
como substrato, utilizando, por ejemplo, el protocolo siguiente: a
una placa de microtitulación, se añaden 10 \mul de la muestra o
del blanco, seguido de la adición de 250 \mul de substrato (0,5
mg de acetato de p-nitrofenilo por ml de 50 mM de tampón
fosfato, pH 6,0). La placa de microtitulación se incuba durante 5
minutos a 30ºC y la absorbancia a 405 nm se lee utilizando un
lector de microplaca. 1 unidad se define como 1 \mumol de
p-nitrofenol que se ha liberado durante 5 minutos.
La actividad lipásica puede también determinarse
utilizando el hexanoato de p-nitrofenilo como substrato.
Este ensayo se lleva a cabo añadiendo 10 \mul de una preparación
de la muestra o del blanco a una placa de microtitulación, seguido
por la adición de 250 \mul de substrato (0,5 mg de hexanoato de
p-nitrofenilo por ml de 20 mM de tampón fosfato, pH 6). A
esta concentración de substrato, la mezcla reactiva aparecerá como
una solución lechosa. La placa de microtitulación se incuba
durante 5 minutos a 30ºC y la absorbancia a 405 nm se lee en un
lector de microplaca.
Alternativamente, la actividad lipásica se
determina según el Food Chemical Codex (3º Edición, 1981, pág
492-493), modificado para el aceite de girasol y un
pH de 5,5, en vez de aceite de oliva y un pH de 6,5. La actividad
lipásica se mide como LUS (unidades lipásicas de girasol) en la que
1 LUS se mide como la cantidad del enzima que puede liberar 1
\mumol de ácidos grasos por minuto a partir de aceite de girasol,
bajo las condiciones anteriormente citadas del ensayo.
Durante la purificación de la lipasa, tal como se
describe a continuación, la proteína eluída a partir de las
columnas se midió determinando la absorbancia a 280 nm. La proteína
en las muestras que se unieron, se determinó en placas de
microtitulación mediante un procedimiento sensible Bradfor según
Bio-Rad Bulletin 1177 EG, 1984). La albúmina sérica
bovina se utilizó como un estándar.
Se seleccionó una cepa mutante de Aspergillus
tubigensis y se utilizó para la producción de lipasa de tipo
salvaje. A esta lipasa se hace alusión en la presente memoria como
lipasa 3. La cepa se sometió a una fermentación en un fermentador
de 750 l que contenía 412,0 kg de agua del grifo, 10,8 kg de harina
de soja, 11,1 de monohidrogenofosfato amónico, 4,0 kg de ácido
fosfórico (75%), 2,7 kg de sulfato de magnesio, 10,8 kg de aceite
de girasol y 1,7 kg de antiespumante 1510. El substrato se calentó
y se trató a 121ºC durante 45 minutos. El medio de cultivo se
inoculó directamente con 7,5 x 10^{9} esporas de la cepa mutante.
La cepa se cultivó durante tres días a 38ºC, controlándose el pH a
6,5, la aireación a 290 l/min y la agitación a 180 rpm los primeros
dos días y a 360 rpm el último día. El fermentado se separó
utilizando un filtro de tambor y el filtrado del cultivo se
concentró 3,8 veces mediante ultrafiltración. El filtrado
concentrado se conservó con sorbato potásico (0,1%) y benzoato
sódico (0,2%) y se utilizó como un material de partida para la
purificación de la lipasa.
Una muestra de 60 ml de fermento (cf 1.1) que
contenía 557 LUS/ml, pH 5,5 se filtró en primer lugar a través de
un filtro GF/B y a continuación, a través de un filtro de 0,45
\mum. La muestra filtrada se desaló utilizando una columna
Superdex G25 SP (430 ml, 22 x 5 cm), y se equilibró en 20 mM
trietanolamina, pH 7,3. La velocidad del flujo fue de 5 ml/min. El
volumen total después de desalación fue de 150 ml.
La muestra desalada se aplicó sobre una columna
de intercambio aniónico Source Q30 (100 ml, 5 x 5 cm) y se
equilibró en 20 mM de trietanolamina, pH 7,3. La columna se lavó
con tampón de equilibración hasta que se obtuvo un valor basal
estable.
La actividad lipásica se eluyó con un gradiente
lineal de 420 ml entre 0 y 0,35 M de cloruro sódico en tampón de
equilibrio, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Se recuperaron
fracciones de 10 ml. Se añadió acetato sódico (100 \mul de una
solución 2 M) a cada fracción para ajustar el pH a 5,5. Se reunieron
las fracciones 26-32 (70
ml).
ml).
Al conjunto de la etapa de intercambio aniónico
se añadió sulfato amónico hasta 1 M y la muestra se aplicó a una
columna Source Phenyl HIC (20 ml, 10 x 2 cm) equilibrada en 20 mM
de acetato sódico (pH 5,5), 1 M de sulfato amónico. La columna se
lavó con el tampón de equilibración. La lipasa se eluyó con un
gradiente lineal de 320 ml entre 1 M y 0 M de sulfato amónico en 20
mM de acetato sódico (pH 5,5), a una velocidad de flujo de 1,5
ml/min. Se recuperaron fracciones de 7,5 ml.
Las fracciones 33-41 se
analizaron mediante SDS-PAGE utilizando un sistema
NOVEX con geles prefabricados. Tanto la electroforesis como la
tinción argéntica de los geles se llevaron a cabo según el
fabricante (Novex, San Diego, USA).(El mismo sistema se utilizó
para la electroforesis y el enfoque isoeléctrico nativos). Se
encontró que la fracción 40 y la 41 contenían lipasa como única
proteína.
El peso molecular aparente de la lipasa nativa
fue de 37,7 kDa, medido mediante el procedimiento
SDS-PAGE anteriormente citado. La lipasa purificada
eluyó a un peso molecular de 32,2 kDa a partir de una columna de
filtración de gel Superose 12 (50 mM fosfato sódico, 0,2 M cloruro
sódico, pH 6,85, flujo de 0,65 ml/min) y es, por tanto, un
monómero.
El peso molecular de la lipasa se determinó
también por ionización de desabsorción de láser asistida por una
matriz (MALDI), mediante un espectrómetro de masas (Voyager
BioSpectrometry Workstation, Perspective Biosystems) con un tiempo
de trayectoria (TOF). Las muestras se prepararon mezclando 0,7
\mul de una solución desalada de lipasa y 0,7 \mul de una
solución matriz que contiene ácido sinápico (ácido
3,5-dimetoxi-4-hidroxi
cinnámico) en acetonitrilo al 70% (0,1% TFA, 10 mg/ml). 0,7 \mul
de la mezcla de la muestra se situó en la parte superior del
extremo de una sonda de acero inoxidable y se dejó secar al aire
antes de introducirse en el espectrómetro de masas. Los espectros se
obtuvieron a partir de, por lo menos, 100 disparos de láser y se
promediaron para obtener una buena señal respecto a la proporción
de ruido. Se encontró que el peso molecular para la lipasa era de
30,384 Da y de 30,310 Da mediante dos análisis independientes.
La digestión de la lipasa con
endo-\beta-N-acetil-glucosamidasa
H (10 \mul) de Streptomyces (Sigma) se llevó a cabo
añadiendo 200 \mul de lipasa e incubando a 37ºC durante 2 horas.
La mezcla digestiva se desaló utilizando un filtro VSWP y se
analizó directamente mediante espectrometría de masas MALDI. Un
componente importante de la lipasa desglicosilada dió lugar a un
peso molecular de 29,339 Da y de 29,333 Da, mediante dos análisis
independientes. También se observó un componente secundario con un
peso molecular de 29,508 Da. Estos valores corresponden bien al
valor teórico calculado posteriormente de 28,939 Da, basado en la
secuencia aminoácida completa de la lipasa madura.
El punto isoeléctrico (pI) para la lipasa se
determinó mediante enfoque isoeléctrico y se encontró que era de
4.1.
Un cálculo del pI basado en la secuencia
aminoácida, tal como se determina a continuación y se muestra en la
SEC ID nº: 9, dió lugar a un pI estimado de 4,07.
Tubos de Eppendorf con 25 \mul de lipasa 3
purificada, más 50 \mul de tampón de 100 mM acetato sódico (pH
5,0), se incubaron durante 1 hora en un baño acuoso a
respectivamente 30, 40, 50 y 60ºC. Un control se trató de la misma
forma, pero se dejó a temperatura ambiente. Después de una hora, la
actividad de la lipasa 3 se midió mediante el ensayo del acetato de
p-nitrofenilo, tal como se describió
anteriormente.
La lipasa purificada presentaba una buena
termoestabilidad. Se encontró que la lipasa conservaba el 60% de su
actividad después de 1 hora a 60ºC. Un actividad del 80% y del 85%
se mantuvo después de 1 hora, a 50ºC y 40ºC, respectivamente.
Se añadió lipasa 3 purificada (200 \mul) a 5 ml
de soluciones de 50 mM de tampón: (fosfato sódico, pH 8,0, 7,0 y
6,0 y acetato sódico, pH 5,0, 4,0 y 3,5). El control se diluyó en 5
ml de 4 mM acetato sódico pH 5,5. Después de cuatro días a 20ºC, la
actividad residual se midió mediante el Food Chemical Codex
modificado respecto a la actividad lipásica, tal como se ha descrito
anteriormente. La lipasa fue muy estable en un pH del orden de 4,0
a 7,0, donde mantenía una actividad del 100% aproximadamente
respecto al control (Tabla 1.1). Al pH de 3,5, la lipasa conservaba
una actividad del 92%, y a un pH de 8,0., se conservó una actividad
residual del 95 % cuando se comparó con el control.
La enzima lipasa purificada se liofilizó y 100
\mug del material liofilizado se disolvieron en 50 \mul de una
mezcla de 8 M urea y 0,4 M de hidrogencarbonato amónico, pH 8,4. La
proteína disuelta se desnaturalizó y se redujo durante 15 minutos a
50ºC, seguido por un revestimiento con nitrógeno y la adición de 5
\mul de 45 mM ditiotreitol. Después de enfriamiento a temperatura
ambiente, se añadieron 5 \mul de 100 mM yodoacetamida para que los
residuos de cisteína se derivatizaran durante 15 minutos a
temperatura ambiente en la oscuridad, bajo nitrógeno.
135 \mul de agua y 5 \mug de endoproteinasa
Lys-C en 5 \mul de agua, se añadieron a la mezcla
reactiva anterior y la digestión se llevó a cabo a 37ºC bajo
nitrógeno durante 24 horas. Los péptidos resultantes se separaron
mediante HPLC de fase inversa en una columna VYDAC C18 (0,46 x 15
cm; 10 \mum; The Separation Group, California, USA) utilizando
disolvente A: TFA al 0,1% en agua, y disolvente B:TFA al 0,1% en
acetonitrilo. Péptidos seleccionados se volvieron a cromatografiar
en una columna Develosil C18 (0,46 x 10 cm, Novo Nordisk,
Bagsvaerd, Dinamarca) utilizando el mismo sistema disolvente, antes
de la secuenciación del extremo N. La secuenciación se realizó
utilizando un secuenciador 476A de Applied Biosystems utilizando
ciclos rápidos del líquido impulsado, según las instrucciones del
fabricante (Applied Biosystems, California, USA).
Para la secuenciación directa del extremo N, la
proteína purificada se hizo pasar a través de una columna Brownlee
C2 Aquapore (0,46 x 3 cm, 7 \mum, Applied Biosystems, California,
USA) utilizando el mismo sistema de disolvente que antes. La
secuenciación del extremo N se llevó a cabo entonces tal como se ha
descrito anteriormente. Como la proteína no se derivatizó antes de
la secuenciación, los residuos de cisteína no pudieron
determinarse.
Se encontraron las siguientes secuencias
peptídicas:
N-terminal: | Ser-Val-Ser-Thr-Ser-Thr-Leu-Asp-Glu-Leu-Gln-Leu-Phe-Ala-Gln-Trp-Ser-Ala-Ala-Ala- |
Tyr-X-Ser-Asn-Asn (SEC ID nº: 1) | |
Péptido interno 1: | Val-His-Thr-Gly-Phe-Trp-Lys (SEC ID nº: 2) |
Péptido interno 2: | Ala-Trp-Glu-Ser-Ala-Ala-Asp-Glu-Leu-Thr-Ser-Lys-Ile-Lys (SEC ID nº: 3) |
No se pudieron purificar más péptidos a partir
del fraccionamiento de HPLC, considerando que eran muy hidrofóbicos
y por tanto, estaban unidos fuertemente a la columna de fase
inversa.
Una investigación que se llevó a cabo en la base
de datos SWISS-PROT 31, respecto a las secuencias
aminoácidas que presentaban homología con los péptidos anteriores,
encontró sólo tres secuencias.
Todos los péptidos anteriores mostraron una
escasa homología respecto a las secuencias anteriores conocidas.
Especialmente, el péptido interno 2 posee una homología muy escasa
respecto a las tres lipasas, LIP-RHIDL,
LIP-RHIMI y MDLA-PENCA de
Rhizopus delamar(Haas y Berka, Gene, 1991,
109:107-113), Rhizomucor miehei (Boel
et al., Lipids, 1988, 23:701-706) y
Penicillium camenbertii (Yamaguchi et al., Gene, 1991,
103:61-67; Isobe y Nokihara, Febs, Lett., 1993,
320:101-106) respectivamente. Aunque la
homología no fue muy alta, se pudieron posicionar los péptidos
lipasa 3 sobre estas secuencias, tal como se muestra a continuación
en la Tabla 2.1.
La cepa mutante de Aspergillus tubigensis
se hizo crecer en PDB (Difco) durante 72 horas, recuperándose el
micelio, congelándose 0,5-1 gramos de éste en
nitrógeno líquido y haciéndolos crecer en un mortero. Después de la
evaporación del nitrógeno, el micelio que se había desarrollado se
mezcló con 15 ml de un tampón de extracción (100 mM
Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM EDTA, 500 mM NaCl, 10 mM
\beta-mercaptoetanol) y 1 ml de dodecilsulfato
sódico al 20%. La mezcla se mezcló vigorosamente y se incubó a 65ºC
durante 10 minutos. Se añadieron 5 ml de 3 M acetato de potasio,
(pH 5,1 ajustado con ácido acético glacial) y la mezcla se incubó
posteriormente durante 20 minutos en hielo. Los desechos celulares
se eliminaron mediante centrifugación durante 20 minutos, a 20000 x
g, añadiéndose 10 ml de isopropanol al sobrenadante para precipitar
(30 min a -20ºC) el ADN. Después de ulterior centrifugación durante
15 minutos a 20000 x g, el sedimento del ADN se disolvió en 1 ml de
TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) y se
precipitó otra vez añadiendo 0,1 ml de 3 M NaAc, pH 4,8 y 2,5 ml
etanol. Después de centrifugar durante 15 minutos a 20000 x g, el
sedimento de ADN se lavó con 1 ml de etanol al 70%, secándose al
vacío. Finalmente, el ADN se disolvió en 200 \mul de TE y se
conservó a -20ºC.
Para obtener un fragmento del gen putativo (al
que se hará referencia en el futuro como el gen lipA) como
una marca identificativa para aislar el gen completo, se llevó a
cabo un procedimiento PCR que se basó sobre la información en las
secuencias peptídicas aisladas.
Para la amplificación PCR de un fragmento del gen
de la lipasa, se diseñaron iniciadores degenerados, basándose en
las secuencias aminoácidas de los péptidos aislados. Se
sintetizaron los siguientes tres iniciadores PCR:
C035: TTC CAR AAN CCN GTR TGN AC
\hskip2cm(SEC ID nº: 4)
mezcla 256 de 20 unidades metaméricas, basada en
la secuencia VHTGFWK del péptido 1 (Invertida).
C036: CAR YTN TTY GCN CAR TGG
\hskip2.6cm(SEC ID nº: 5)
mezcla 256 de 18 unidades metaméricas, basada en
la secuencia QLFAQW del extremo N.
C037: GCV GCH SWY TCC CAV GC
\hskip2.9cm(SEC ID nº: 6)
mezcla 216 de 17 unidades metaméricas, basada en
la secuencia AWESAA (Invertida).
Los oligonucleótidos se sintetizaron en un
Sintetizador de ADN/ARN de Applied Biosystems, modelo 392. Para
reducir el grado de degeneración, en el diseño del iniciador CO37
se excluyeron el raro codon GCA de Ala y el codon TCA de Ser.
Con estos iniciadores, los fragmentos deseados se
amplificaron mediante PCR. Utilizando estos iniciadores, se
esperaba que se amplificaría un fragmento de 300 pares de bases
aproximadamente, teniendo en cuenta que no existen intrones en el
fragmento.
Las siguientes reacciones PCR se fijaron en tubos
PCR de 0,5 ml para amplificar un fragmento putativo
lipA:
0,5 \mug de ADN genómico total, |
100 pmol del iniciador CO36, |
100 pmol del iniciador CO37, |
10 \mul del tampón II de PCR (Perkin Elmer), |
6 \mul de 25 mM MgCl_{2}, |
2 \mul de mezcla de dNTP (10 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dGTP, 10 mM de dTTP), |
2 unidades de polimerasa Amplitaq (Perkin Elmer), y |
agua hasta un volumen total de 100 \mul. |
0,5 \mug de ADN genómico total, |
100 pmol del iniciador CO35, |
100 pmol del iniciador CO36, |
10 \mul del tampón II de PCR (Perkin Elmer), |
6 \mul de 25 mM MgCl_{2}, |
2 \mul de mezcla de dNTP (10 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dGTP, 10 mM de dTTP), |
2 unidades de polimerasa Amplitaq (Perkin Elmer), y |
agua hasta un volumen total de 100 \mul. |
Las reacciones se llevaron a cabo utilizando el
siguiente programa:
94ºC | 2 min |
94ºC | 1 min ) |
40ºC | 1 min ) |
72ºC | 1 min ) Estos tres pasos se repitieron durante 30 ciclos. |
72ºC | 5 min |
5ºC | PONER EN REMOJO |
Las amplificaciones PCR se realizaron en un
Termociclador PTC-100 de MJ Research Inc.
En la reacción 1, pudieron detectarse tres bandas
distintas de 300, 360 y 400 pares de bases respectivamente. Estas
bandas se aislaron y clonaron utilizando el equipo del
vector-T-Azul-pT7
(Novagene). Los tamaños de este fragmento están de acuerdo con el
tamaño esperado, teniendo en cuenta que el fragmento contiene 0, 1
ó 2 intrones, respectivamente.
Los tres fragmentos se secuenciaron utilizando un
"equipo Thermo Sekvenase" de secuenciación de ciclos de
iniciadores marcados fluorescentemente (Amersham) y se analizaron
en un secuenciador ALF (Pharmacia) según las instrucciones del
fabricante. El fragmento de alrededor de 360 pares de bases
contenía una secuencia que se identificó como una lipasa, y, como
contenía la parte del extremo N distal a la secuencia utilizada
para el diseño del iniciador, se concluyó que se había obtenido el
fragmento génico lipA deseado.
La secuencia del fragmento PCR de 360 pares de
bases aproximadamente (SEC ID nº 7) se muestra en la Tabla 4.1
siguiente. La secuencia peptídica utilizada para el diseño del
iniciador, está subrayada. La parte restante de la secuencia
N-terminal está doblemente subrayada.
El hallazgo de esta secuencia permitió la
identificación plena del fragmento PCR como parte del gen
lip. El codon de finalización que se encontró en el marco de
lectura, puede estar causado por un PCR o un error de lectura o
puede existir un intrón codificado en el fragmento como una señal
consenso de finalización y partida del intrón (que se muestra en
negritas). Si el intrón putativo se elimina tendrá lugar un cambio
en el marco de lectura. Sin embargo, un alineamiento de la
secuencia aminoácida deducida y las lipasas fúngicas que se
muestran en la Tabla 2.1, sugirieron que el fragmento formaba parte
del gen deseado.
El ADN genómico del Aspergillus tubigensis
se digirió parcialmente con Tsp5091 (New England Biolabs Inc.). 10
\mug del ADN se digirieron en 100 \mul de la mezcla reactiva
que contenía 2 unidades Tsp5091. Después de 5, 10, 15 y 20 minutos,
se eliminaron 25 \mul de la mezcla reactiva y la digestión se
detuvo añadiendo 1 \mul de 0,5 M EDTA, pH 8,0. Después de que las
cuatro reacciones se hubieron detenido, las muestras se procesaron
sobre un gel de agarosa al 1% en tampón TAE (10 x almacenamiento de
TAE, conteniendo por litro: 48,4 g de Trizma base, 11,5 ml de ácido
acético glacial, 20 ml de 0,5 M EDTA pH 8,0). Se utilizó ADN del
fago lambda digerido con HindIII como marcador del peso
molecular (ADN molecular weight marker II, Boehringer, Mannheim).
Fragmentos de un tamaño de entre 5 y 10 kb aproximadamente se
extrajeron del gel y los fragmentos de ADN se purificaron
utilizando el equipo Gene Clean II (Bio- 101 Inc). Los fragmentos
purificados se reunieron y 100 ng de los fragmentos que se habían
juntado se unieron con 1 \mug de un vector ZAP II defosforilado y
digerido con EcoRI (Stratagene) en un volumen total de 5
\mul. 2 \mul de este volumen se empaquetaron con extracto de
empaquetamiento Gigapack II (Stratagene) que dió lugar a una
genoteca primaria de 650.000 pfu.
Una cepa
XL1-Blue-MRF de E. coli
(Stratagene) se infectó con 5 x 50000 pfu de la genoteca primaria.
Las bacterias infectadas se mezclaron con agarosa "superior"
(como en las placas NZY pero con 6 g de agarosa por litro, en vez
del agar) y se sembraron sobre placas 5 NZY (13 cm). Después de la
incubación a 37ºC durante 7 horas, se añadieron 10 ml de tampón SM
(por litro: 5,8 g NaCl, 2,0 g MgCl_{2}.7 H_{2}O, 50 ml de 1 M
Tris.HCl pH 7,5., 5,0 ml de gelatina al 2% (peso/vol)) y se
incubaron por la noche a temperatura ambiente con una suave
agitación. El tampón que contenía los fagos lavados, se recuperó y
reunió. Se añadió cloroformo al 5% y después de una mezcla
vigorosa, la mezcla se incubó durante 1 hora a temperatura
ambiente. Después de centrifugación durante 2 minutos a 10000 x g,
la fase superior que contenía la genoteca amplificada se recuperó y
se añadió dimetilsulfóxido al 7%. Se recogieron alícuotas de la
genoteca en tubos pequeños y se congelaron a -80ºC. La genoteca
congelada contenía 2,7 x 10^{9} pfu/ml con alrededor del 6% sin
inserciones.
2 x 50.000 pfu se sembraron en grandes (22 x 22
cm) placas NZY que contienen un medio que comprende por litro: 5 g
de NaCl, 2 g de MgSO_{4}.7H_{2}O, 5 g de extracto de levadura,
10 g de hidrolisado de caseína, 15 g de agar, pH ajustado a 7,5 con
NaOH. El medio se sometió al autoclave y se enfrió hasta alrededor
de 60ºC y se vertió en las placas. Se utilizaron 240 ml de medio por
placa.
Las placas NZY inoculadas se incubaron por la
noche a 37ºC y se produjeron calvas en las placas. Se produjeron dos
calvas para cada placa sobre filtros Hybond N (Amersham). El ADN se
fijó utilizando radiación UV durante 3 minutos, y los filtros se
hibridizaron, tal como se describe a continuación, utilizando, como
sonda, el fragmento PCR anteriormente citado de alrededor de 360
pares de bases, que se marcó con ^{32}p-dCTP
utilizando el equipo de marcaje Ready-to- Go
(Pharmacia).
Los filtros se prehibridizaron durante una hora a
65ºC en 25 ml de tampón de prehibridización que contenía 6,25 ml de
20 x SSC (0,3 M Na_{3} citrato, 3 M NaCl), 1,25 ml de 100 x
solución Denhard, 1,25 ml de SDS al 10% y 16,25 ml de agua. Se
añadieron 150 \mul de 10 mg/ml de ADN espermático de salmón al
tampón de prehibridización inmediatamente antes de utilizarlo.
Después de la prehibridización, el tampón de prehibridización se
eliminó y los filtros se hibridizaron durante la noche a 65ºC en 25
ml del tampón de prehibridización con el fragmento PCR marcado
radioactivamente.
Al día siguiente los filtros se lavaron según el
siguiente procedimiento: 2 x 15 min. con 2 x SSC + SDS al 0,1%, 15
min. con 1 x SSC + SDS al 0,1% y 10 min. con 0,1 x SSC + SDS al
0,1%.
Todos los lavados se realizaron a 65ºC. Las
láminas se autoradiografiaron durante 16 horas y se aislaron los
clones positivos. Los clones se consideraron positivos sólo si se
daba una señal de hibridización en las dos calvas de la placa en
cuestión.
Se aislaron siete clones putativos y cuatro se
purificaron mediante siembra sobre pequeños discos de Petri,
produciéndose calvas, esencialmente tal como se ha descrito
anteriormente.
Los clones purificados se convirtieron a
plásmidos, utilizando un equipo ExAssist (Stratagene).
Se diseñaron dos iniciadores de secuenciación,
basándose en el fragmento PCR de alrededor de 360 pares de bases.
Los iniciadores de secuenciación se utilizaron para secuenciar los
clones, encontrándose un clon positivo, con el gen lipA que
codificaba la lipasa 3. El clon positivo aislado se denominó
pLIP4.
Se llevó a cabo un mapa de restricción del clon.
El fragmento anterior PCR de 360 pares de bases contenía un sitio
SacII y como éste se podía encontrar en el clon genómico,
también este sitio facilitaba la construcción del mapa. El mapa de
restricción que muestra la estructura de pLIP4 se muestra en la Fig
1. El mapa de restricción muestra que el gen completo se encuentra
en el clon. Además, ya que las secuencias del promotor y del
finalizador están presentes, se asumió que todas las regiones
importantes estaban presentes en el clon.
Una muestra de la cepa DH5\alpha de
Escherichia coli que contenía pLIP4 se depositó según el
Tratado de Budapest en el National Collection of Industrial and
Marine Bacteria Limited (NCIMB), en el número 23 de St. Machar
Drive, Aberdeen, Escocia, Reino Unido, AB2 1RY, el 24 de febrero de
1997, con el número de registro NCIMB 40863.
El gen se secuenció utilizando la secuenciación
en ciclos y la tecnología convencional de secuenciación. La
secuencia completa (SED ID NO: 8) se muestra a continuación en la
Tabla 5.1. La secuencia se ha determinado, para ambas cadenas, para
la región codificante completa y (para) alrededor de 100 pares de
bases por encima y por debajo de la región codificante. Las
secuencias por debajo de la región codificante se han determinado
sólo en una cadena y contienen algunas incertidumbres. En la Tabla
5.1 que se muestra a continuación, las secuencias intrónicas se
indican como letras minúsculas y el extremo N y los dos péptidos
internos (péptido 1 y péptido 2) están subrayados:
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias peptídicas obtenidas podían
encontrarse todas en la secuencia aminoácida que se deduce (véase
Tabla 5.1), que confirma otra vez que la secuencia encontrada, es
la secuencia del gen de la lipasa 3. El gen se denominó
lipA.
La secuencia aminoácida se alineó con las tres
lipasas fúngicas utilizadas para alinear las secuencias peptídicas.
La alineación se muestra en la Tabla 5.2.
LIPASA 3
\vskip1.000000\baselineskip
La alineación anterior muestra que la lipasa 3 es
homóloga para las secuencias lipásicas conocidas, pero que la
homología no es muy alta. Deleciones o inserciones en la secuencia
de la lipasa 3 no se observaron cuando se comparó la secuencia con
estas tres lipasas. Esto refuerza la probabilidad de que los
intrones putativos se han identificado correctamente.
Una investigación que se llevó a cabo en la base
de datos SWISS-PROT 31, no condujo a ulteriores
secuencias con una homología más alta que aquella para las lipasas
conocidas, que anteriormente se mencionaron. (Tabla 5.3)
La secuencia con la homología más alta es una
mono-diacil lipasa de Penicillium
camembertii, en la que la identidad que se encuentra es del
42%. Sin embargo, el C terminal de la lipasa 3 se parece a 2 lipasas
de Zygomycetes (Rhizopus y Rhizomucor) y no al enzima
de P. camembertii.
Identidad: 126 aminoácidos (42,42%)
Se ha determinado, mediante secuenciación
N-terminal, que el extremo N de la lipasa madura es
el residuo de serina nº 28 del precursor de la lipasa 3 (SEC ID nº:
9), tal como se muestra en la Tabla 5.4 a continuación. Por lo
tanto, los aminoácidos nº 1 a nº 27 constituyen la secuencia
señal.
Número de residuos: 297.
Los residuos 167-176 se reconocen
como un motivo común para las serín lipasas (PROSITE). Se ha
examinado la estructura cristalina para la serín lipasa de
Rhizomucor miehei y los residuos en el sitio activo
identificado (Brady et al., Nature, 1990,
343:767-770; Derewanda et al., J. Mol.
Biol., 1992, 227:818-839). Los residuos del
sitio activo de la R. miehei lipasa se han conservado en su
totalidad en todas las lipasas y corresponden a los residuos
siguientes en la lipasa 3: serina 173, ácido aspártico 228 e
histidina 285.
La lipasa 3 contiene 7 residuos de cisteína.
Cuatro de estos se conservan en la lipasa de P. camembertii
donde forman enlaces disulfuro (Isobe y Nokuhara, Gene, 1991,
103:61-67). Esto corresponde a enlaces
disulfuro entre el residuo 62 y 67 y el 131 y el 134. Además, dos
residuos de cisteína homólogos a dos residuos C que forman otro
enlace disulfuro en las lipasas de Rhizopus y
Rhizomucor que corresponden a los residuos
49-295.
Dos sitios putativos de
N-glicosilación se encontraron en la lipasa 3 en
posición 59 y 269. Ninguno de estos se conservan en las otras
lipasas fúngicas.
El protocolo para la transformación se basó en
las enseñanzas de Buxton et al. (Gene, 1985,
37:207-214), Daboussi et al. (Curr.
Genet., 1989, 15:453-456) y Punt y Van den Hondel,
(Meth. Enzym., 1992, 216:447-457).
Una cepa multicopia lipA se produjo
transformando el plásmido pLIP4 en la cepa 6 M 179 de
Aspergillus tubigensis utilizando la cotransformación con un
plásmido marcador resistente a la higromicina.
Un procedimiento de rastreo utilizado para
visualizar la lipasa fúngica después de un enfoque isoeléctrico de
capa ultrafina, se adaptó a rastrear transformantes de
Aspergillus tubigensis que habían crecido sobre placas de
agar. El rastreo de los productores de lipasa sobre placas de agar
se llevó a cabo utilizando aceite de oliva al 2% como substrato
para el enzima (lipasa), así como el inductor para el promotor
lipásico. Además, las placas contenían un tinte fluorescente,
Rodamina B. En presencia del aceite de oliva, los transformantes
serán inducidos a secretar lipasa. La lipasa secretada en la placa
de agar hidrolizará el aceite de oliva, causando la formación de
colonias fluorescentes anaranjadas que serán visibles con radiación
UV (350 nm). La aparición de colonias fluorescentes se controló
generalmente después de 24 horas de crecimiento. Después de varios
días de crecimiento, las cepas productoras de lipasa podían
identificarse como cepas fluorescentes anaranjadas que eran
visibles a simple vista. Bajo estas condiciones de rastreo de las
placas, la cepa no transformada no volvió a mostrar fluorescencia y
aparecía como colonias opacas de color rosado.
Dieciséis transformantes que mostraban halos de
fluorescencia anaranjada se cultivaron durante 8 días en matraces
para agitación que contenían 100 ml de medio mínimo suplementado
con aceite de oliva al 1%, extracto de levadura al 0,5%, y
casaminoácidos al 0,2%. La cantidad de lipasa secretada se
cuantificó aplicando 10 \mul de sobrenadante del cultivo acelular
en pocillos taladrados en placas de agar con Rodamina
B-aceite de oliva, e incubando las placas por la
noche a 37ºC. Se encontraron cinco transformantes con una abundante
producción de lipasa.
Los sobrenadantes del cultivo acelular
procedentes de los cinco transformantes, se desalaron utilizando
columnas NAP 5 (Pharmacia) y se equilibraron en 1 M sulfato amónico
(50 mM acetato de sodio, pH 5,5). Los sobrenadantes del cultivo
desalados se fraccionaron mediante cromatografía de interacción
hidrofóbica (HIC) en una columna Biogel Phenyl-5 PW
(Biorad). Se llevó a cabo la elución mediante un gradiente salino
descendente de 1 M a 0 M sulfato amónico (20 mM acetato sódico, pH
5,5). Se observó, después de fraccionamiento, un único y discreto
pico proteico. El área de los picos de la proteína se calcularon
entre los distintos transformantes y se compararon con la cepa no
transformada. El mejor transformante mostró un aumento de 62 veces
en la cantidad de lipasa después del fraccionamiento mediante
HIC.
En la Fig 3, se muestra un cromatograma del
sobrenadante del cultivo fraccionado mediante HIC de este
transformante, y un cromatograma similar para la cepa no
transformada se muestra en la Fig 4.
La fracción que contiene la lipasa transformada
se liofilizó. La lipasa transformada se carboximetiló y se sometió
a secuenciación aminoácida del N-terminal de los
primeros 15 aminoácidos y se encontró que la secuencia de la lipasa
recombinante era exactamente la misma que la de la lipasa nativa,
indicando una fragmentación correcta de la secuencia señal.
Las distintas fracciones lipásicas recuperadas
después de HIC, se separaron sobre un gel SDS
Tris-Glicina al 12% y la tinción argéntica reveló
una banda proteica, confirmando la homogeneidad de las fracciones.
Además, el extracto en bruto mostró una banca lipásica principal
como la única banda que se acumulaba en el sobrenadante del cultivo
en cantidades considerables cuando el hongo se cultivó en el medio
que contenía aceite de oliva.
La lipasa recombinante se analizó mediante
ionización de desabsorción de láser asistida por una matriz
(MALDI), mediante un espectrómetro de masas con un tiempo de
trayectoria (TOF), tal como se ha descrito anteriormente en la
presente memoria. El peso molecular de la lipasa recombinante fue de
32,237 Da.
La detección de oligosacáridos unidos a N se
alcanzó mediante digestión de la lipasa con
endo-\beta-N-acetil-glucosamidasa
H de Streptomyces (Sigma). La digestión de la lipasa
recombinante secretada en el medio de cultivo alteró la movilidad
de la banda que se había apreciado en SDS-PAGE, que
se trasladó como una banda única con un peso molecular de alrededor
de 30 kDa.
La lipasa recombinante desglicosilada que se
generó mediante digestión con endoglicosidasa y se analizó
directamente mediante espectrometría de masas MALDI, dió lugar a
un peso molecular de la estructura polipeptídica de 29,325 Da.
La sobre expresión de la lipasa 3 en la cepa 6 M
179 de A. tubigensis (Ejemplo 6), dió lugar a la
sobreglicosilación de la proteína y a la subsiguiente reducción en
la actividad enzimática. Con objeto de burlar el problema de la
sobreglicosilación y de la pérdida de actividad, se construyeron
varios genes lipA mutados. Un modelo molecular para la
estructura tridimensional de la lipasa 3 basada en la comparación de
las bases de datos con lipasas conocidas y sus estructuras
cristalinas resueltas, reveló la topología superficial de los dos
sitios putativos de N-glicosilación en la lipasa.
Los dos sitios posibles responsables de la glicosilación, son los
residuos de asparagina en los lugares N59 y N269. Los 2 residuos de
asparagina se cambiaron mediante mutación, bien a un residuo de
treonina (T), o a un residuo de glutamina (Q). La mutación a la
treonina (N>T) elimina el grupo amida mediante el cual la
asparagina es glicosilada, sin alterar el tamaño de la cadena
lateral, así como conservando el oxígeno polar. La mutación a la
glutamina (N>Q) da lugar a un carbono extra en la cadena lateral
y a la retención del grupo amido. Tres mutantes únicos, N59T;
N269T; N269Q y dos mutantes dobles, N59TN269T y N59TN269Q, se
construyeron, tal como se describe a continuación.
Los iniciadores mutagénicos diseñados para
incorporar mutaciones secuenciales específicas se fosforilaron
utilizando T4 polinucleótido quinasa, tal como se describe en el
Manual del Equipo de Mutagénesis in Vitro M13 de
Bio-Rad. La hibridación a la matriz del ADN
monocatenario tuvo lugar en 20 mM Tris, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl_{2}
en una proporción molar del iniciador a la matriz de 30:1,
incubación a 30ºC durante alrededor de 1,5 horas. La síntesis de la
segunda cadena se llevó a cabo mediante la T7 ADN polimerasa (0,5
unidades) en una mezcla reactiva que contenía 0,4 mM de cada dNTP,
0,75 mM ATP, 17,5 mM Tris-Cl (pH 7,4), 3,75 mM
MgCl_{2}, 21,5 mM DDT y 4 T ADN ligasa (5 unidades) para la unión
de la cadena nuevamente sintetizada al extremo 5' de los
iniciadores. La reacción se incubó en hielo durante 5 minutos,
seguidamente a 25ºC durante 5 minutos y finalmente a 37ºC durante 30
minutos, deteniéndose por la adición de tampón de detención (10 mM
Tris pH 8, 10 mM EDTA) y congelando. Las reacciones se analizaron
en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE antes de la transformación
a células E. coli SURE. Los transformantes se analizaron
mediante secuenciación del ADN.
Los transformantes de E. coli SURE que
contenían los genes lipA mutados, se depositaron, según el
Tratado de Budapest, en el National Collection of Industrial and
Marine Bacteria Limited (NCIMB), en el número 23 de St. Machar
Drive, Aberdeen, Escocia, Reino Unido, AB2 1RY, el 24 de marzo de
1998, con los siguientes números de registro: los tres mutantes
únicos N59T: NCIMB 40931; N269T: NCIMB 40932; N269Q:NCIMB 40933 y
los dos mutantes dobles, N59TN269T: NCIMB 40934; y N59TN269Q: NCIMB
40935.
Esporas de la cepa 3 M pyrA de
Aspergillus tubigensis se cultivaron durante la noche a 34ºC
en un matraz de agitación que contenía medio mínimo suplementado
con glucosa al 2% y 10 mM de uridina. Los micelios se recuperaron y
se volvieron a suspender en tampón de lisis más enzima de lisis. Los
protoplastos producidos se mezclaron con plásmidos que codificaban
los distintos mutantes de glicosilación de la lipasa mediante el
procedimiento de co-transformación.
Los transformantes se rastrearon respecto a la
producción de lipasas mutantes. Cultivos puros de los
transformantes se propagaron en medio líquido de la siguiente
forma: se añadieron esporas con una densidad de 10^{6}/ml y se
hicieron crecer a 34ºC durante 5 días bajo agitación a 200 rpm. El
medio para el cultivo de los transformantes contenía 100 ml de
medio mínimo suplementado con aceite de girasol al 2% (inductor),
peptona al 1,5%, 0,2 casamino ácidos y 50 \mug/ml de ampicilina.
El filtrado de los cultivos se recuperó cada día y se ensayó en
placas de aceite de oliva-rodamina respecto a la
actividad lipásica. Las placas de aceite de
oliva-rodamina se inspeccionaron respecto a la
producción de halos fluorescentes (actividad lipásica), después de
una incubación nocturna a 37ºC. Además, se utilizó un ensayo
cromogénico utilizando un éster de
1,2-O-dilauril-rac-glicero-3-ácido
glutárico-resorufina (Lipase chromogenic substrate,
Boehringer Mannheim Biochemica, cat. No. 1179934) para chequear
doblemente los filtrados recuperados en los días 2, 3, 4 y 5. La
Tabla 8.1 que sigue muestra la actividad lipásica de transformantes
seleccionados que expresan distintos genes lipA modificados
que codifican la lipasa 3 mutante. La actividad lipásica se midió
en el día 5 utilizando el ensayo cromogénico que se acaba de
mencionar.
Además, la actividad lipásica en los filtrados
del cultivo de los transformantes S3-4,
S4-3 y la cepa 6 M 179 (que expresa la lipasa 3
sobreglicosilada), mostraron un aumento de las actividades
lipolíticas (Tabla 8.2) durante la fermentación desde el día 2 al
día 5.
Esporas (10^{6}/ml) de cepas de Aspergillus
tubigensis que expresaban distintos mutantes de glicosilación
de la lipasa 3, se utilizaron para inocular matraces de agitación
que contenían 200 ml de medio mínimo suplementado con aceite de
girasol al 2% (inductor), peptona al 1,5%, casamino ácidos al 0,2%
y 50 \mug/ml de ampicilina. Los cultivos se hicieron crecer
mediante agitación a 200 rpm durante 4 días a 34ºC. El filtrado del
cultivo se separó de los micelios mediante filtración a través de
un calibrador de nylon.
Muestras del sobrenadante del cultivo de las
fermentaciones S2-6, S3-4,
S4-1 y S4-3, respectivamente, se
trataron todas de la misma forma. Una muestra de 15 ml se desaló en
primer lugar en una columna PD-10 equilibrada en 20
mM trietanolamina, pH 7,3. La muestra desalada se aplicó a un
intercambiador aniónico Source Q15 (HR5/5) equilibrado 3n 20 mM de
trietanolamina, pH 7,3. Flujo de 1,5 ml/min. La columna se lavó con
un tampón de equilibración hasta que se obtuvo un nivel de base
estable. La actividad lipásica se eluyó entonces con un gradiente
lineal de 30 ml entre 0 y 0,53 M NaCl en tampón de equilibración.
Se recuperaron fracciones de 1,5 ml. Las fracciones se rastrearon
respecto a la actividad, utilizando el ensayo de placa sobre
tributirina tal como se describió anteriormente.
Al conjunto de la actividad lipásica del
intercambiador aniónico Source Q15 se le añadió sulfato amónico
hasta 1 M y la muestra se aplicó a una columna Source Phenyl HIC
(HR5/5) equilibrada en 20 mM de acetato sódico (pH 5,5) y 1 M de
sulfato amónico. La columna se lavó con tampón de equilibración. La
lipasa se eluyó con un gradiente lineal desde 1 a 0 M de sulfato
amónico en 20 mM de acetato sódico (pH 5,5), flujo 1,5 ml/min. Se
recuperaron fracciones de 0,75 ml. Las fracciones pico lipásicas
eran totalmente homogéneas (una banda) cuando se examinaron
mediante SDS-PAGE seguido por una tinción argéntica,
tal como se ha descrito anteriormente.
Los cuatro distintos mutantes lipásicos de
glicosilación se comportaron de la misma forma durante la
purificación.
La actividad específica se determinó para los
cuatro mutantes lipásicos purificados, tanto con respecto a la
actividad sobre la tributirina (LUT) tal como se ha descrito
anteriormente, como con respecto al aceite de girasol (LUS),
también descrito antes. La proteína se determinó tal como se
determinó anteriormente. Los resultados se resumen en la Tabla
9.1.
Puede apreciarse que la actividad específica de
las lipasas mutantes expresadas en S2-6,
S4-1 y S4-3 es el doble de la
actividad específica de la lipasa 3 sobreglicosilada cuando se mide
(LUS) en el aceite de girasol que contiene ácidos grasos de cadena
larga como los lípidos que se encuentran normalmente en la harina y
en la pasta. Cuando se miden sobre la tributirina (LUT), las
diferencias en la actividad específica son menos pronunciadas. Esto
podría explicarse por el hecho de que un posible
"oscurecimiento" del sitio activo por la sobreglicosilación,
será menos perjudicial si el substrato es pequeño como la
tributirina, opuesto a las largas cadenas de los ácidos grasos en
el girasol. La actividad específica de la lipasa 3
S3-4 es inferior que la de la lipasa 3
sobreglicosilada (medida sobre el aceite de girasol).
Cuando se ensayan con la prueba LUS, ninguno de
los mutantes tiene una actividad específica tan buena como la lipasa
3 del tipo salvaje, pero tal como se muestra en el ejemplo
siguiente, la actividad enzimática es superior para los mutantes
glicosilados que para la lipasa 3 de tipo salvaje en un sistema de
pasta.
El peso molecular aparente de las lipasas
mutantes purificadas se determinó procesando las lipasas sobre un
gel SDS-PAGE. Los resultados se muestran en la
tabla 9.2.
Se aprecia que la lipasa sobreglicosilada da
lugar a una molécula de lipasa 3 que posee un peso molecular más
grande que la lipasa 3 nativa de tipo salvaje. Eliminando uno de
los dos sitios potenciales de N-glicosilación, tal
como se lleva a cabo en S2-6 (N269Q) y en
3S-4 (N269T), se obtuvo un peso molecular más bajo,
pero que es todavía ligeramente más alto que el de la
lipasa-3 de tipo salvaje, indicando una
sobreglicosilación en el segundo sitio de glicosilación. Eliminando
ambos sitios potenciales de N-glicosilación tal
como se realiza en S4-1 y S4-3
(ambos N59T N269Q), se obtiene un peso molecular claramente más
bajo que el de la lipasa 3 de tipo salvaje, que está de acuerdo con
una falta total de N-glicosilación en este
mutante.
Los puntos isoeléctricos para los 4 mutantes de
glicosilación de la lipasa se determinaron mediante cromatoenfoque
en un intercambiador aniónico Mono P (HR5/5), pH 4,1, para todos
los enzimas mutantes. La columna se equilibró en 25 mM
bib-tris, pH 6,10. Se generó un gradiente de pH
procesando 100% de un politampón 74 al 10% en agua (pH 3,6 con HCl)
más betaína al 2,5%, eluyendo esto las lipasas. Flujo de 0,70
ml/min. Se recuperaron fracciones de 0,4 ml.
Una muestra de lipasa S4-1
purificada (296 LUT/ml) se diluyó 1:1 con 200 mM NaAc, pH 5,0.
Tubos de Eppendorf con 1 ml de esta muestra diluída se incubaron
durante 1 hora en un baño acuoso a 30, 40, 50 y 60ºC
respectivamente. Se trató un control de la misma forma, pero a la
izquierda a la temperatura ambiente. La actividad lipásica restante
se determinó mediante el ensayo del acetato de
p-nitrofenilo, tal como se describió anteriormente. Los
resultados se muestran a continuación en la tabla 9.3.
Muestras de 200 \mul de lipasa
S3-4 mutante purificada se añadieron a 5 ml de 50
mM de tampón (pH 3,5, 4,0, 5,0 NaAc y tampón fosfato de pH 6,0, 7,0,
8,0). El control se diluyó en 5,0 ml de 4 mM NaAc, pH 5,5. Después
de 4 días a 200ºC las muestras se midieron respecto a la actividad
residual mediante el ensayo modificado del Food Chemical Codex para
la actividad lipásica, tal como se describió anteriormente. La
lipasa mutante S3-4 fue muy estable en el intervalo
de pH entre 4,0 y 8,0, donde mantuvo una actividad del 88%, cuando
se comparó a un control. Los resultados se muestran en las Tabla
9.4.
Harina (harina Danesa de reforma) 2000 g,
levadura seca 30 g, sal 30 g y agua, que corresponden a 400
unidades Brabender + 3%, se amasaron en un Mezclador Hobart con un
garfio durante 2 minutos, a una velocidad baja y 10 minutos a
velocidad alta. La temperatura de la pasta después del amasamiento
fue de 25ºC. Hubo un tiempo de descanso de 10 minutos, a 30ºC. La
pasta se distribuyó, pesando piezas de 750 g y se dejó otra vez
reposar durante 5 minutos a 33ºC y 85% RH. Después de moldear en un
moldeador Glimik, las pastas se probaron enlatadas durante 50
minutos a 33ºC y se cocieron en un horno Wachtel durante 40 minutos
a 220ºC con una inyección de vapor durante 16 segundos. Después de
enfriar, el pan se pesó y su volumen se midió mediante el
procedimiento del desplazamiento de la semilla de colza. El volumen
específico se calcula dividiendo el volumen del pan (ml) por el
peso (g) del
mismo.
mismo.
La miga se evaluó objetivamente utilizando una
escala de 1 a 5, en la que 1= toscamente no homogénea y 5=
bellamente homogénea.
Tres panes cocidos y enlatados se guardaron a
20ºC y se utilizaron para mediciones de la firmeza y de los poros
mediante un Analizador de Imagen.
Harina (harina Danesa de reforma) 1500 g,
levadura comprimida 90 g, azúcar 24 g, sal 24 g y agua, que
corresponden a 400 unidades Brabender - 2%, se amasaron en un
Mezclador Hobart con un garfio durante 2 minutos, a una velocidad
baja y 9 minutos a velocidad alta. La temperatura de la pasta
después del amasamiento fue de 26ºC. La pasta pesó 1350 g. Después
de reposar durante 10 minutos, a 30ºC, la pasta se moldeó en un
moldeador Fortuna, después de lo cual la pasta se probó enlatadas
durante 45 minutos a 34ºC y se coció en un horno Bago durante 18
minutos a 220ºC con una inyección de vapor durante 12 segundos.
Después de enfriar, los bollos se pesaron y su volumen se midió
mediante el procedimiento del desplazamiento de la semilla de
colza. El volumen específico se calcula como anteriormente.
La homogeneidad de los poros del pan se midió
mediante un analizador de imagen compuesto de una cámara de vídeo
CCD estándar, un digitalizador de vídeo y un ordenador personal con
software WinGrain. Para cada pieza de pan, los resultados del
diámetro de los poros en mm y de la homogeneidad del poro se
calcularon como un medio de las mediciones a partir de 10 rebanadas
de pan. La homogeneidad del poro se expresó como el porcentaje de
los poros que son mayores que 0,5 veces el medio del diámetro del
poro y más pequeños que 2 veces el diámetro
medio.
medio.
La firmeza del pan, expresada como N/dm^{2}, se
midió mediante un modelo Instron UTM 4301 conectado a un ordenador
personal. Las condiciones para la medida de la firmeza del pan
fueron:
\newpage
Carga celular | Máx 100 N |
Diámetro del émbolo | 50 mm |
Velocidad de la barra terminal del vástago del émbolo | 200 mm/min |
Compresión | 25% |
Grosor de la rebanada de pan | 11 mm |
El resultado fue un medio de las mediciones sobre
10 rebanadas del pan para cada pieza de pan.
El índice de gluten se midió mediante Glutomatic
2.200, de Perten Instruments (Suecia). Inmediatamente después del
ensayo, 15 g de la pasta se pesaron y situaron en el Glutomatic,
lavándose con 500 ml de una solución de NaCl al 2% durante 10
minutos. La pasta lavada se transfirió a una Centrífuga del Indice
de Gluten 2015, pesándose las dos fracciones de gluten, calculándose
el índice de gluten según la ecuación siguiente:
Índice de gluten = (peso del gluten
que queda en el tamiz x 100) / peso total del
gluten.
30 g de una pasta que se había ensayado
completamente, se congelaron inmediatamente y se liofilizaron. La
pasta liofilizada se molió en un molinillo de café y se hizo pasar
a través de un filtro de 235 \mum. En un tubo de centrífuga de 50
ml con tapa roscada se introdujeron 4 g de la pasta liofilizada
(que se habían pesado), añadiéndose 20 ml de butanol saturado con
agua (WSB). El tubo de centrífuga se emplazó en un baño acuoso a
una temperatura de 100ºC durante 10 minutos, después de lo cual los
tubos se situaron en un Rotamix para proveerles de una rotación a
45 pm durante 20 minutos, a temperatura ambiente. Los tubos se
dispusieron otra vez en el baño acuoso durante 10 minutos, y se
sometieron a la rotación en el Rotamix durante otros 30 minutos, a
temperatura ambiente.
Los tubos se centrifugaron a 10000 x g durante 5
minutos. 10 ml del sobrenadante se pipetearon en un vial y se
evaporaron hasta sequedad bajo una cubierta de nitrógeno. Esta
muestra se utilizó para análisis HPLC.
Una muestra similar se fraccionó en un Bond Elut
Si (Varian 1211-3036). La fracción no polar se eluyó
con 10 ml de ciclohexano:isopropanol:ácido acético (55:45:1) y se
evaporó hasta sequedad. Esta muestra se utilizó para análisis
GLC.
Columna: LiChrospher 100 DIOL 5 \mum
(Merck art. 16152) 250 x 4 mm con una camisa (envoltura) acuosa de
una temperatura de 50ºC.
Fases móviles:
A:heptano:isopropanol:n-butanol:tetrahidrofurano:isooctano:agua
(64.5:17,5:7:5:5:1)
B:isopropanol:n-butanol:tetrahidrofurano:isooctano:agua
(73:7:5:5:10)
Las fases móviles contenían un 1 mmol de ácido
trifluoroacético por 1 fase móvil y se ajustaron a pH 6,6 con
amoníaco.
Bomba: Waters 510 equipada con un
controlador de gradiente.
Gradiente:
Flujo (ml/min) | Tiempo (min) | A (%) | B (%) | |
1,0 | 0 | 100 | 0 | |
1,0 | 25 | 0 | 100 | |
1,0 | 30 | 0 | 100 | |
1,0 | 35 | 100 | 0 | |
1,0 | 40 | 100 | 0 |
Detector: CUNOW DDL21 (dispersión
evaporatoria de la luz); temperatura 100ºC; voltaje:600 voltios;
flujo de aire:6,0 l/min.
Inyector: Hewlett Packard 1050; volumen de
inyección: 50 \mul.
\newpage
Las muestras para el análisis se disolvieron en 5
ml de cloroformo: metanol (75:25), se trataron con ultrasonidos
durante 10 minutos y se filtraron a través de un filtro de 0,45
\mum.
Cromatógrafo Gaseoso Capilar 8420 Perkin Elmer
equipado con una columna de sílice fusionada WCOT de 12,5 x 0,25 mm
revestida con 0,1 \mum de una fase estacionaria de
fenil-metil-silicona al 5% (CP Sil 8
CB de Crompack).
Transportador: Helio
Inyección: 1,5 \mul con división
Detector: FID 385ºC
Programa del horno: | 1 | 2 | 3 | 4 |
Temperatura del horno, ºC | 80 | 200 | 240 | 360 |
Tiempo isotérmico, min | 2 | 0 | 0 | 10 |
Tasa térmica, ºC/min | 20 | 10 | 12 | - - |
Preparación de la muestra: 50 mg de la
fracción no polar de los lípidos del trigo se disolvieron en 12 ml
de heptano:piridina (2:1) que contenía 2 mg/ml de heptadecano como
estándar interno. 500 \mul de la solución se transfirieron a un
vial acanalado, añadiéndose 100 \mul de
N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetamida.
Se dejó que la mezcla reaccionara durante 15 minutos a 90ºC.
Cálculo: Los factores de respuesta para
los mono-, di- y triglicéridos y los ácidos grasos libres se
determinaron a partir de las mezclas de referencia de estos
componentes. Basándose en estos factores de respuesta, en los
lípidos del trigo se calcularon los glicéridos y los ácidos grasos
libres.
Se evaluó el efecto de adición de la lipasa 3 a
una pasta para obtener pan tostado Danés. El enzima se añadió como
una preparación liofilizada sobre maltodextrina, conjuntamente con
los otros ingredientes. Los resultados de las pruebas de cocción se
muestran en las Tablas 10.1 a 10.4.
Mediante la adición de hasta alrededor de 5.000
LUS/kg de harina, de lipasa, no se observaron cambios en el volumen
del pan, pero con una dosis más alta de la lipasa 3 existió una
tendencia a una pequeña pero no estadísticamente significativa
disminución en el volumen (Tabla 10.1).
De los resultados en la Tabla 10.2 se deduce que
la lipasa 3 mejoró la homogeneidad de la miga del pan y que el
diámetro medio de los poros de la miga se redujo
significativamente.
El índice de gluten se correlacionó también
claramente con la adición de la lipasa 3, como indicación de un
gluten más firme causado por la modificación de los componentes
lipídicos del trigo que provocan una mayor estabilidad de la pasta
y una estructura más homogénea de los poros del pan. Sin embargo,
estas modificaciones parecieron ser óptimas con la adición de 5.000
LUS /kg de harina, de lipasa 3, mientras que una dosis más alta dió
lugar a una modificación demasiado intensa del gluten del
trigo.
Los resultados de los análisis de GLC y HPLC
(Tabla 10.3), demostraron claramente que los triglicéridos en la
pasta fueron hidrolizados. Pero, de forma más interesante, se
observó también una modificación de los glicolípidos,
monogalactosil diglicérido y digalactosil diglicérido. Estos
componentes se convirtieron en los componentes más polares
monogalactosil monoglicérido y digalactosil monoglicérido. Como el
digalactosil monoglicérido es un componente superficial más activo
que el digalactosil diglicérido, se asume que este componente
contribuye a la mejora observada en la estructura celular y en la
homogeneidad de la miga. También se deduce que los fosfolípidos como
la fosfatidil colina sólo se modificaron en un grado muy
pequeño.
Se evaluó el efecto de adición de la lipasa 3 a
una pasta para obtener bollos daneses. El enzima se añadió como una
preparación liofilizada sobre maltodextrina, conjuntamente con los
otros ingredientes. Los resultados de las pruebas de cocción se
muestran en las Tablas 10.5 a 10.7.
De los resultados que se muestran en la Tabla 10,
es obvio que la adición de lipasa 3, no aumentó significativamente
el volumen de los bollos. Además, se encontró que la lipasa 3
mejoró la homogeneidad de la miga.
Los análisis GLC y HPLC de los lípidos del trigo,
tal como se muestra en las Tablas 10.6 y 10.7, demostraron la
modificación de estos lípidos.
La lipasa se ensayó en los bollos daneses en una
prueba comparativa con dos productos de lipasa comercialmente
disponibles: NOVOZYM 677 BG (no. 1885) de Novo Nordisk (Dinamarca)
y Lipasa A "Amano 6" (no. 1757) de Amano (Japón). Los
resultados se resumen en la Tabla 11.1.
Es obvio, que a partir de los resultados en la
Tabla 11.1 que la lipasa 3 no afecta al volumen de los bollos,
mientras un significativo efecto sobre el volumen se observó para
los productos enzimáticos comerciales no. 1885 y no. 1757.
La lipasa 3, la lipasa no. 1885 y la lipasa
no.1757 se ensayaron en bollos daneses con el propósito de estudiar
la hidrólisis relativa de los triglicéridos, comparada con la
hidrólisis del digalactosil diglicérido (DGDG). La pasta que se
había ensayado completamente, se liofilizó y se extrajo con
n-butanol saturado con agua. Los lípidos extraídos
se analizaron mediante GLC y HPLC tal como se ha descrito
anteriormente. A partir de los resultados analíticos, se calculó el
grado de hidrólisis de los triglicéridos comparado con el del
digalactosil diglicérido (DGDG), con distintos niveles de lipasas.
Los niveles de lipasa utilizados fueron para el No. 1885: 0, 400 y
800 LUS/kg de harina; para el nº 1757: 0, 1770 y 2360 LUS/kg de
harina, y para la lipasa 3: 0, 10.000 y 20.000 LUS/kg de harina.
Los resultados se muestran en la Tabla 12.1.
A partir de los resultados en la Tabla 12.1, es
obvio que la lipasa 3 posee un efecto significativo sobre la
hidrólisis del digalactosil diglicérido, mientras que los efectos
de las dos lipasas disponibles comercialmente, nº 1757 y nº 1885,
son despreciables.
La lipasa 3 se ensayó en combinación con un éster
diacetilo del ácido tartárico de mono- y diglicéridos de ácidos
grasos comestibles que tienen un valor de saponificación de 355 y
un valor ácido de 60 (PANODAN A2020 DATEM). Los bollos se cocieron
después de cuatro distintos tiempos de fermentación, de 45, 65, 85
y 105 minutos. La lipasa 3 se añadió a los ingredientes de la pasta
como un polvo liofilizado. La homogeneidad de los poros se evaluó
subjetivamente en una escala de 1 a 5, donde 1 = curso no homogéneo
y 5 = homogéneo exigente.
Los resultados de los experimentos se muestran en
la Tabla 13.1.
De la Tabla 13.1 se deduce que la lipasa 3 en
combinación con DATEM mejoró la homogeneidad de los poros y se
encontró que existía un efecto combinado, lo que significa que es
posible utilizar DATEM a una concentración mucho más baja en
combinación con la lipasa 3 y obtener todavía el mismo volumen y una
miga mejor.
El efecto de la lipasa 3 de tipo salvaje
purificada se ensayó en la preparación de bollos daneses con y sin
la adición de aceite de soja a la pasta. Los bollos cocidos se
evaluaron respecto al volumen específico, homogeneidad de los
poros de la miga y calidad de la corteza del pan. El volumen
específico se midió tal como se ha descrito previamente. La
homogeneidad de los poros se evaluó subjetivamente en una escala de
1 a 10, donde 1 = curso no homogéneo y 5 = homogéneo exigente. La
calidad de la corteza del pan se evaluó en una escala de 1 a 10,
donde 1 = baja calidad y 10 = alta calidad.
Las pastas que se habían ensayado completamente a
partir de estas pruebas de cocción, se congelaron y liofilizaron.
Las pastas liofilizadas se extrajeron con n-butanol
saturado con agua y el contenido de ácidos grasos libres se
determinó mediante análisis GLC, tal como también se describió en el
Ejemplo 10. Los resultados de los ensayos de cocción y del análisis
de los ácidos grasos libres, se resumen en la Tabla 14.1.
A partir del experimento de cocción se deduce que
la lipasa 3 mejora la homogeneidad de los poros y la calidad de la
corteza, tanto en el pan al que se había añadido aceite como en el
que no se había añadido. Añadiendo una gran cantidad de lipasa 3
(13.500 LUT/kg harina), se observó una reducción en el volumen del
pan.
Los resultados del análisis de los ácidos grasos
libres en la pasta, a partir de estos experimentos de cocción, se
muestran también en la Tabla 14.1. De estos resultados se deduce
que la lipasa 3 es activa en la pasta, tanto si se añade el aceite
como si no se añade. Además, el nivel de los ácidos grasos libres
en la pasta fue el mismo en las pastas con y sin aceite.
Tal como se muestra en el Ejemplo 14, los ácidos
grasos libres se producen cuando la lipasa 3 se añade a la pasta.
Durante la fermentación de una pasta de pan, la levadura produce
dióxido de carbono y etanol, y el nivel de éste en una pasta se
encuentra normalmente en un exceso de 1% al final del ensayo. Cuando
la lipasa 3 se encuentra en la pasta, este enzima no sólo cataliza
la hidrólisis de los triglicéridos, sino que se encontró
sorprendentemente que también se forma el éster etílico de los
ácidos grasos.
Los etilésteres del ácido graso constituyen
componentes olorosos bien conocidos que se utilizan, por ejemplo,
para enmascarar los olores en los alimentos que se basan en las
grasas. Experimentos de cocción a los que no se alude en la
presente memoria han mostrado que la lipasa que se añade a una pasta
es capaz de enmascarar "antiguos" sabores del pan que se
producen cuando este pan se fabrica a partir de la harina y se
guarda a 35ºC durante 3 meses. Esto podría explicarse por la
formación de ésteres etílicos en la pasta.
La cantidad de éster etílico de los ácidos grasos
se determinó extrayendo pasta liofilizada con butanol saturado con
agua. La fase aislada de grasa se analizó mediante
GLC-MS para determinar la identidad y la cantidad de
los ésteres etílicos de los ácidos grasos. Los resultados de estos
análisis se muestran en la Tabla 15.1.
Los resultados muestran claramente un aumento en
el nivel del éster etílico de los ácidos grasos, cuando se aumentó
la dosis de lipasa en la pasta.
El efecto de la lipasa 3 se ensayó en un
pastelillo esponjado, fabricado con la siguiente receta y
procedimiento:
Azúcar | 208 g |
Harina | 188 g |
Almidón de maíz | 60 g |
Polvo de panadería | 14 g |
Huevos | 200 g |
GATODAN 504, | |
gel de pastelillo | |
"esponjoso"* | 18 g |
agua | 150 g |
Lipasa 3 | véase a continuación |
* Es un emulsificante formado por glicerol y
propilen glicol esterificados con ácidos grasos comestibles (28%),
etanol (8%), Grinsted PS 409 (estearato sódico al 25% en glicerol)
(6%) y agua (58%).
Todos los ingredientes se mezclaron durante 6
minutos utilizando un mezclador Hobart N 50. La mezcla del
pastelillo se pesó 3 x 175 g en recipientes de pastelillos
"esponjados", cociéndose durante 35 minutos a 180ºC.
El volumen específico del pastelillo se midió
mediante el procedimiento del desplazamiento de la semilla de
colza, y la blandura del pastelillo se midió después de guardarlo a
20ºC durante 7 días utilizando un Instron Food Tester.
Los resultados del ensayo de cocción se resumen
en la Tabla 16.1.
De los resultados, se infiere que la lipasa 3
mejora la blandura del pastelillo sin cambiar el volumen del
mismo.
El pan de centeno/trigo se fabricó a partir de
una pasta que contenía los siguientes ingredientes: Harina de
trigo, 667 g; harina de centeno tamizado, 1333 g; "Back aroma
sauer" 40 g; levadura comprimida, 60 g; sal 44 g; agua, 1160 g;
lipasa 3, véase a continuación; GRINDAMYL™ H 121 (producto comercial
de hemicelulasa de Grindsted Products, Brabrand, Dinamarca).
La pasta se mezcló utilizando un mezclador Kemper
durante 2 minutos, a baja velocidad y durante 11 minutos, a alta
velocidad. Temperatura de la pasta, 27ºC, tiempo de reposo 30
minutos a 32ºC peso de 800 g, duración del ensayo, 20 minutos, a
32ºC y 85% RH., cocción durante 30 minutos a 230ºC y 10 segundos de
(corriente) de vapor.
La viscosidad de la pasta se evaluó utilizando
una escala entre 1 y 5, en la que 1 = muy viscoso y 5= normal, sin
viscosidad. También se evaluó el volumen específico del pan. Los
resultados se muestran en la tabla 17.1.
La adición de Lipasa 3 en combinación con la
hemicelulasa al pan de centeno/trigo, mejoró claramente las
propiedades de manipulación de la pasta porque ésta se volvió menos
viscosa.
La lipasa producida por cinco transformantes de
A. tubigensis: 161, S2-6,
S3-4, S4-1 y 720-4 3
M (véase Tabla 8.1) se ensayó en un sistema de pasta modelo a
distintas concentraciones, analizándose la formación de ácidos
grasos libres según el siguiente procedimiento:
Se preparó una pasta utilizando los siguientes
ingredientes: harina 50 g; levadura seca 0,375 g; NaCl 0,75 g;
agua, 28 g, lipasa, véase a continuación. Harina, levadura seca y
sal, se mezclaron durante 1 minuto, en un recipiente de mezcla
Brabender (50 gramos) La lipasa y el agua se añadieron a la pasta,
seguido por la mezcla durante 6 minutos, a 62 rpm. La pasta se
transfirió a una cubeta provista de una tapa, fermentándose la
pasta durante 60 minutos a 32ºC. La pasta se liofilizó. Esta pasta
liofilizada se pulverizó, filtró, y se extrajo con butanol saturado
con agua (WSB). WSB se evaporó bajo una corriente de N_{2} y el
contenido de los ácidos grasos libres se determinó mediante
espectrofotometría según Kwon, D.Y. y J.S. Rhee, 1986, JAOCS
63: 89.
En un primer experimento, la lipasa 3 purificada
de tipo salvaje se comparó con el enzima mutante producido por el
transformante S3-4 a distintas concentraciones, tal
como se muestra en la Tabla 18.1. Los resultados mostraron
claramente un aumento en el nivel de ácidos grasos al aumentar el
nivel de la dosificación del enzima. Sin embargo, también fue
evidente que la lipasa 3 de tipo salvaje, a altas dosis, se
estabilizó con unos ácidos grasos al 3 \textperthousand
aproximadamente, mientras que la lipasa producida por el
transformante S3-4 continuaba produciendo más ácidos
grasos al aumentar la dosis de aquélla, hasta que estos ácidos
grasos alcanzaron un valor del 5 \textperthousand.
Las lipasas producidas por los transformantes
161, S2-6, S4-1 y
720-4 3M también se ensayaron mediante el mismo
procedimiento con resultados tal como se muestra en la tabla
18.2.
Los resultados demuestran claramente que las
cinco distintas lipasas transformantes fueron más activas en la
pasta, comparadas con la lipasa 3 de tipo salvaje, a la misma dosis
(LUT/kg).
Se llevaron a cabo experimentos de cocción en los
que se fabricaron bollos daneses con distintas dosis de lipasa
producida por los transformantes S3-4 y
S4-1, respectivamente. Después de cocción, se
determinó el volumen específico del pan, evaluándose subjetivamente
la homogeneidad de la miga, tal como se describió anteriormente.
Los resultados de los ensayos de cocción, se muestran en la tabla
19.1.
El aumento de la dosis de ambas lipasas
anteriores mejoró la estructura de la miga y produjo un pan con una
mejor apariencia y estructura de la corteza. A altas dosis del
enzima producido por S3-4, apareció una disminución
del volumen del pan y la misma tendencia se observó para la lipasa
producida por S4-1 a una dosis más baja.
Se concluye que también estas lipasas mutantes
que se han ensayado, mejoraron la estabilidad de la pasta, del pan
y de la estructura de la miga, tal como lo hace la lipasa 3 del
tipo salvaje.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Formulario pasa a página
siguiente)
\newpage
OBSERVACIONES REFERENTES A UN
MICROORGANISMO
DEPOSITADO
(Regla PCT
13bis)
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: DANISCO A/S
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Langebrogade 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Copenhagen
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- ESTADO: Denmark
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL (ZIP): 1001 K
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELEFÓNO: +45 32 66 22 00
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: +45 32 66 21 67
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Clonación y uso del gen de lipasa 3 a partir Aspergillus tubigensis
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 24
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1,0, versión # 1,30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Aspergillus tubigensis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Val Ser Thr Ser Thr Leu Asp Glu Leu Gln
Leu Phe Ala Gln Trp}
\sac{Ser Ala Ala Ala Tyr Xaa Ser Asn Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Aspergillus tubigensis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val His Thr Gly Phe Trp Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Aspergillus tubigensis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Trp Glu Ser Ala Ala Asp Glu Leu Thr Ser
Lys Ile Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "Oligonucleotido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCCARAANC CNGTRTGNAC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "Oligonucleotido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCARYTNTTYG CNCARTGG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "Oligonucleotido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCVGCHSWYT CCCAVGC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 317 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "fragmento PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1045 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Aspergillus tubigensis
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: join (1..82, 135...300, 347...683, 737...1045)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: sig_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:1 ..81
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: join (1..82, 135...300, 347...683, 737...1045)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 8:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 297 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 9:
Claims (8)
1. Utilización de un polipéptido que tiene
actividad lipásica, para la preparación de una pasta y/o de un
producto de panadería y siendo dicho polipéptido un enzima que
hidroliza el triacilglicerol y en la que dicho polipéptido es capaz
de dividir los ácidos grasos que presentan cadenas cortas, medias y
largas, caracterizada porque dicho polipéptido es capaz de
hidrolizar galactolípidos que se encuentran normalmente presentes en
la harina a los correspondientes galactosil monoglicéridos; en la
que dicho polipéptido es capaz de conservar por lo menos una
actividad del 80% después de 4 días a 20ºC y a un pH del orden de
3,5-8; en la que dicho polipéptido es capaz de
hidrolizar por lo menos un 10% de los galactosil diglicéridos que se
encuentran normalmente presentes en la pasta de harina, a
galactosil monoglicéridos, y en la que el enzima proporciona una o
más de las características siguientes del producto de panadería:
mejora en la homogeneidad de los poros y diámetro reducido de
éstos.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho pH es del orden de 5-7.
3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en
la que dicho polipéptido conserva por lo menos un 60% de su
actividad después de 1 hora a 60ºC en un tampón de 100 mM de
acetato sódico a pH 5,0, que incluye un polipéptido que conserva
por lo menos un 80% de su actividad después de 1 hora a 50ºC bajo
las mismas condiciones.
4. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que cuando dicho polipéptido se añade
a una pasta de pan en una cantidad de 5.000 unidades lipásicas por
kg de harina, el diámetro medio del poro de la miga del pan
fabricado a partir de la pasta se reduce en por lo menos un 10%,
respecto a un pan que haya sido fabricado a partir de una pasta de
pan a la que no se haya añadido la lipasa.
5. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que cuando dicho polipéptido se
añade a una pasta de pan en una cantidad de 5.000 unidades
lipásicas por kg de harina, la homogeneidad del poro de la miga del
pan fabricado a partir de la pasta aumenta en por lo menos un 5%,
respecto a un pan que se fabricó a partir de una pasta de pan a la
que no se añadió la lipasa.
6. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la pasta es una pasta sin
grasa.
7. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la pasta y/o el producto de
panadería comprenden además un emulsificante.
8. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido es capaz de
hidrolizar por lo menos un 25% de los galactosil diglicéridos que
se encuentran normalmente en la pasta de harina, a galactosil
monoglicéridos.
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DK40097 | 1997-04-09 |
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