EA015438B1 - Новые оксидоредуктазы и их применение - Google Patents

Abstract

Данное изобретение относится к недавно идентифицированным полинуклеотидным последовательностям, содержащим ген, который кодирует новую оксидоредуктазу, выделенную из Aspergillus niger. Это изобретение описывает полноразмерную нуклеотидную последовательность этого нового гена, кДНК-последовательность, содержащую полноразмерную кодирующую последовательность этой новой оксидоредуктазы, а также аминокислотную последовательность полноразмерного функционального белка и его функциональных эквивалентов. Данное изобретение относится также к способам применения этих ферментов в приложениях в хлебопекарном производстве и молочных хозяйствах. В данное изобретение включены также клетки, трансформированные полинуклеотидом в соответствии с данным изобретением, и клетки, в которых оксидоредуктаза по этому изобретению генетически модифицирована для увеличения или уменьшения ее активности и/или уровня экспрессии.

Description

Данное изобретение относится к недавно идентифицированным полинуклеотидным последовательностям, содержащим гены, которые кодируют новые оксидоредуктазы, выделенные из АкретдШик шдет. Это изобретение описывает полноразмерную нуклеотидную последовательность этих новых генов, кДНК-последовательность, содержащую полноразмерные кодирующие последовательности этих новых оксидоредуктаз, а также аминокислотную последовательность полноразмерного функционального белка и его функциональных эквивалентов. Данное изобретение относится также к способам применения этих ферментов в приложениях в хлебопекарном производстве и производстве молочных продуктов. В данное изобретение включены также клетки, трансформированные полинуклеотидом в соответствии с данным изобретением, и клетки, в которых оксидоредуктаза по этому изобретению генетически модифицирована для увеличения или уменьшения ее активности и/или уровня экспрессии.

Уровень техники

Оксидоредуктазы определяются здесь как ферменты, которые катализируют окислительновосстановительные реакции. Этот класс ферментов, известных как оксидоредуктазы (ЕС 1.#.#.# где # является числом), определяется Номенклатурным комитетом Международного союза биохимии по номенклатуре и классификации ферментов (Епхуше №тепе1аШге. Аеабетю Ргекк, Ыете Уогк, 1992) как все ферменты, которые катализируют окислительно-восстановительные реакции. Окисляемым субстратом считается донор водорода или электрона. Второе число в этом коде указывает группу в доноре водорода, которая подвергается окислению. Третье число указывает тип участвующего акцептора, и 3 обозначает, что этим акцептором является кислород. Субстрат, который окисляется, считается донором водорода.

Примерами оксидоредуктаз являются лакказа (ЕС 1.10.3.2), которая катализирует окисление как о-, так и п-хинолов и часто действует также на аминофенолы и фенилендиамин;

глюкозооксидаза (ЕС 1.1.3.4 - СОХ), которая катализирует окисление глюкозы и нескольких других сахаров;

гексозооксидаза (ЕС 1.1.3.5), которая катализирует ту же самую реакцию, что и СОХ, а именно, окисление глюкозы и нескольких других сахаров, таких как галактоза, манноза, мальтоза, лактоза и целлобиоза;

холестеролоксидаза (ЕС 1.1.3.6), которая катализирует окисление-восстановление холестерина; холиндегидрогеназа (ЕС 1.1.99.1), которая катализирует окисление-восстановление холина; глюкозодегидрогеназа (ЕС 1.1.99.10), которая катализирует окисление-восстановление глюкозы; алкогольоксидаза (ЕС 1.1.3.13), которая катализирует окисление-восстановление первичных спиртов;

оксидаза вторичных спиртов (ЕС 1.1.3.18), которая катализирует окисление-восстановление вторичных спиртов;

Ό-аспартатоксидаза (ЕС 1.4.3.1), которая катализирует окисление-восстановление аспартазы и известна также как аспартатоксидаза;

путресциноксидаза (ЕС 1.4.3.10), которая катализирует окисление-восстановление путресцина в 4аминобутаналь, который конденсируется в 1-пирролин;

аминооксидаза (ЕС 1.4.3.4), которая катализирует окисление-восстановление аминов, в основном первичных аминов и обычно некоторых вторичных и третичных аминов;

саркозиноксидаза (ЕС 1.5.3.1), которая катализирует окисление-восстановление саркозина; полиаминоксидаза (ЕС 1.5.3.11), которая катализирует окисление-восстановление Ν¹ацетилспермина;

(Я)-б-гидроксиникотиноксидаза (ЕС 1.5.3.6), которая катализирует окисление-восстановление (Я)6-гидроксиникотина;

ретикулиноксидаза (ЕС 1.5.3.9), которая катализирует окисление-восстановление (8)-ретикулина, который известен также как образующий бербериновый мостик фермент;

катехолоксидаза (ЕС 1.10.3.1), которая катализирует окисление-восстановление катехина и ряда замещенных катехинов;

тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5), которая катализирует восстановление окисленного тиоредоксина;

сульфитредуктаза (ЕС 1.8.1.2), которая катализирует восстановление сероводорода;

хлоридпероксидаза (ЕС 1.11.1.10), которая осуществляет хлорирование органических молекул с образованием стабильных связей С-С1 и которая может также действовать на Вг^- и I^-;

Каталаза (ЕС 1.11.1.6), которая осуществляет окисление-восстановление нескольких органических веществ, таких как, например, этанол.

Другими примерами оксидоредуктаз являются люцифераза светляка (ЕС 1.13.12.7), циннамат-4гидроксилаза (ЕС 1.14.13.11), бензоат-4-монооксигеназа (ЕС 1.14.13.12), холестерол-7а-монооксигеназа (ЕС 1.14.13.17), пентахлорфенолмонооксигеназа (ЕС 1.14.13.50), монооксигеназа (ЕС 1.14.14.1), стероид11 β-монооксигеназа (ЕС 1.14.15.4), монофенолмонооксигеназа (ЕС 1.14.18.1), простагландинсинтаза (ЕС

- 1 015438

1.14.99.1) и салицилатгидроксилаза (ЕС 1.14.13.1).

Эти приведенные примеры ни в коем случае не означают, что они являются ограничивающими или лимитирующими в отношении данного изобретения.

Оксидоредуктазы могут быть подходящим образом продуцированы в микроорганизмах. Микробные оксидоредуктазы доступны из различных источников; виды ВасШик являются обычным источником бактериальных ферментов, тогда как грибные ферменты обычно получают из видов АкретдШик.

Микробные ферменты с оксидоредуктазной активностью сообщались из разных источников, в том числе РешсШшш, Та1агошусе§, СМокротиш (\УО 95/29996), Тташе1е8 Ыт8и1а (\УО 97/22257). Гены микробных оксидоредуктаз были клонированы из нескольких источников, включающих в себя Еикатшш (ЕР 1157117 А1), Сотю1и8 \егмсо1ог (ΌΕ 19545780 А1), Тташе1е8 (И8 6146865), Тпсйобетша (И8 6248575) и МктобосЫиш И1уа1е (\УО 9931990).

Оксидоредуктазы могут быть использованы во всех областях приложений, где используются также химические окислители. Такими химическими окислителями являются обычно неспецифические окислители, такие как иодаты, пероксиды, аскорбиновая кислота, бромат калия и азодикарбонамид. Однако, применение некоторых из доступных в настоящее время химических окислителей не пользовалось спросом у потребителей или не было одобрено регулирующими агенствами, особенно в области пищевых применений.

Применение оксидоредуктаз рассматривалось в качестве альтернативы химическим окислителям.

Оксидоредуктазы могут использоваться во множестве промышленных применений, в том числе в приготовлении пищевых продуктов и получении детергентов.

Вышеупомянутые промышленные применения оксидоредуктазного фермента являются только несколькими примерами, и этот список не является ограничивающим.

Один пример приготовления пищевых продуктов, в котором могут быть выгодно использованы оксидоредуктазы, находится в области применений в хлебопекарном производстве, например, для улучшения качества теста или хлебопекарных продуктов.

Например, И8 2783150 описывает применение СОХ в муке для улучшения силы теста и консистенции и вида выпеченного хлеба. ЕР 0338452 описывает применение глюкозооксидазы в комбинации с деградирующими гемицеллюлозу и/или целлюлозу ферментами. XVО 02/30207 описывает применение СОХ в хлебопекарном производстве в комбинации с протеиндисульфидизомеразой для улучшения эффективности СОХ. ^О 96/39851 описывает применение гексозооксидазы красной морской водоросли С1юпбги5 спкрик в применениях в хлебопекарном производстве. XVО 98/44804 описывает применение глицеролоксидазы для улучшения реологических свойств теста.

Другие пищевые продукты, в которых могут быть использованы оксидоредуктазы, включают в себя молочные пищевые продукты. Например, XVО 02/39828 описывает применение гексозооксидазы для уменьшения реакции Майяра в сыре пиццы во время приготовления пиццы, а XVО 99/31990 описывает применение оксидазы углеводов для получения лактобионовой кислоты из лактозы, наиболее обильного сахара в молоке.

В настоящее время глюкозооксидаза из АкретдШик шдет является единственным ферментом, который используют в промышленности для описанных выше применений. Проблемой с другими оксидоредуктазами является то, что их получение не может проводиться экономичным образом, и/или то, что их свойства не являются оптимальными для их предполагаемого применения. Таким образом, все еще существует потребность в улучшении оксидоредуктаз для конкретных применений, например, ввиду эффективности, субстратной специфичности и/или аффинности, стабильности и активности при необходимых диапазонах температур и диапазонов рН и т.д.

Более конкретно, для применений в хлебопекарном производстве оксидоредуктазы, используемые в хлебопекарном производстве в настоящее время (преимущественно глюкозооксидаза из АкретдШик шдег), являются не эффективными, например с броматом калия. Бромат калия является химическим окислителем, который считается технически превосходным окислителем, особенно для продолжительных процессов выпечки. Запрещение бромата оставляет пекарей с отставанием по эффективности, которое еще не восполнено в настоящее время. Другим примером является ферментативное отбеливание мякиша для получения приятного мякиша белого хлеба. В течение многих лет для этой цели использовали ферментативно активную соевую муку, содержащую липоксигеназу. Введение на рынок сортов генетически модифицированной сои инициировало сопротивление потребителей против применения такой соевой муки в хлебопекарном производстве. В качестве альтернативы могут быть использованы другие виды муки фасоли и гороха, однако они не являются такими эффективными, как соевая мука. Таким образом, для применения в отбеливании мякиша также все еще существует большая потребность в ферментативном решении этой проблемы.

Более конкретно, для применений на молочных заводах слабое изменение или отклонение в параметрах процесса во время обработки нагреванием приводит к увеличенному развитию окраски, являющемуся следствием усиления реакций Майяра. Это развитие окраски является нежелательным, и существует потребность в контроле этого процесса побурения, другом, чем строгий контроль температуры и процесса, для придания процессу пастеризации большей силы.

- 2 015438

В обработке нагреванием сыра побурение сыра, например на пицце, также является нежелательным. \νϋ 02/39828 суммирует несколько попыток уменьшения побурения, которые обычно нацелены на получение либо очень строгого контроля процесса, либо технологических модификаций процесса производства сыра. Недостатком этих решений является то, что они трудны в манипулировании и/или могут увеличивать стоимость или уменьшать выход. Данное изобретение направлено на по меньшей мере одну, если не все, из вышеупомянутых проблем.

Раскрытие изобретения

Целью этого изобретения является обеспечение новых полинуклеотидов, кодирующих новые оксидоредуктазы с улучшенными свойствами. Следующей целью является обеспечение природно и рекомбинантно продуцируемых оксидоредуктаз, а также рекомбинантных штаммов, продуцирующих их. Целью этого изобретения являются также способы получения и применения полинуклеотидов и полипептидов в соответствии с этим изобретением.

Целью этого изобретения является также обеспечение новых оксидоредуктаз, которые решают по меньшей мере одну из вышеупомянутых проблем, или обеспечение новых оксидоредуктаз, которые имеют одно или несколько улучшенных свойств при применениях на молочном заводе и/или в хлебопекарном производстве.

Улучшенные свойства молочных продуктов могут быть выбраны из группы, состоящей из уменьшения побурения вследствие реакции Майяра, улучшенных антимикробных свойств и улучшенного сшивания белков.

Улучшенные свойства теста и/или выпеченных продуктов могут быть выбраны из группы, состоящей из увеличенной силы (хлебопекарной способности) теста, увеличенной эластичности теста, увеличенной стабильности теста, уменьшенной липкости теста, улучшенной устойчивости к расстойке, улучшенной растяжимости теста, улучшенной обрабатываемости на тесторазделочных машинах, увеличенного объема выпеченного продукта, улучшенной структуры мякиша выпеченного продукта, улучшенной мягкости выпеченного продукта, улучшенного вкуса выпеченного продукта, улучшенной устойчивости против черствения выпеченного продукта, улучшенного цвета выпеченного продукта, улучшенной корки выпеченного продукта; причем используемые оксидоредуктазы, обеспечиваемые для получения этих свойств, имеют широкую субстратную специфичность.

Осуществление изобретения Полинуклеотиды

Данное изобретение обеспечивает новые полинуклеотиды, кодирующие новые оксидоредуктазные ферменты, в частности ферменты, имеющие любую из вышеупомянутых активностей, предпочтительно ферменты с активностью оксидазы изоамилового спирта, углеводоксидазной активностью, лакказной, глюкозооксидазной или гексозооксидазной активностью.

Данное изобретение обеспечивает 6 новых полинуклеотидов, кодирующих оксидоредуктазы, экспериментально названные 0X1 01, 0X1 02, 0X1 03, 0X1 04, 0X1 05, 0X1 06 (далее называемые 0X1 01-0X1 06), имеющие аминокислотные последовательности, соответственно, 8ЕЦ ΙΌ N0: 013, 8ЕЦ ΙΌ N0: 014, 8ЕС ГО N0: 015, 8ЕС ГО N0: 016, 8ЕС ГО N0: 017, 8Ер ГО N0: 018 (далее называемые 8ЕС ГО N0: 013 018), или функциональные эквиваленты любой из них. Последовательность гена, кодирующего 8ЕЦ ГО N0: 013-018, определяли секвенированием клона, полученного из ЛкретдШик шдет.

Неожиданно было обнаружено, что полипептиды 0X1 01-0X1 06 согласно данному изобретению улучшают силу теста при применении в процессе приготовления теста.

Данное изобретение обеспечивает полинуклеотидные последовательности, содержащие ген, кодирующий оксидоредуктазы 0X1 01 - 0X1 06 (содержащие, соответственно, 8ЕЦ ГО N0: 001, 8ЕЦ ГО N0: 002, 8ЕС ГО N0: 003, 8ЕС ГО N0: 004, 8ЕС ГО N0: 005, 8ЕС ГО N0: 006, далее называемые 8ЕС ГО N0: 001 - 006), а также его полную последовательность кДНК (соответственно, 8ЕЦ ГО N0: 007, 8ЕЦ ГО N0: 008, 8ЕС ГО N0: 009, 8ЕС ГО N0: 010, 8ЕС ГО N0: 011, 8ЕС ГО N0: 012, далее называемые 8ЕС ГО N0: 007 - 012.

Таким образом, это изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 001 - 006 или 8ЕЦ ГО N0: 007 - 012, или функциональным эквивалентам любого из них.

Более конкретно, это изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, гибридизуемому при строгих условиях с полинуклеотидом по 8ЕЦ ГО N0: 001 - 006 или 8ЕЦ ГО N0: 007 - 012. Предпочтительно такие полинуклеотиды могут быть получены из мицелиальных грибов, в частности из ЛкретдШик шдет. Более конкретно, это изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 001 - 006 или 8ЕЦ ГО N0: 007 - 012.

Это изобретение относится также к выделенному полинуклеотиду, кодирующему по меньшей мере один из функциональных доменов полипептида в соответствии, соответственно, с 8ЕЦ ГО N0: 013 - 018, или функциональным эквивалентам любого из них.

Во избежание любых сомнений: 0X1 01 соответствует последовательностям нуклеиновых кислот 8ЕЦ ГО N0: 001 и 8ЕЦ ГО N0: 007 и аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 013 и их гомоло

- 3 015438 гичным функциональным эквивалентам; 0X1 02 соответствует 8ЕЦ ГО N0: 002, 8ЕЦ ГО N0: 008 и 8ЕЦ ГО N0: 014 и их гомологичным функциональным эквивалентам, и т.д. и 0X1 06 соответствует 8ЕЦ ГО N0: 006, 8ЕЦ ГО N0: 012 и 8ЕЦ ГО N0: 018 и их гомологичным функциональным эквивалентам.

В данном контексте термины ген и рекомбинантный ген относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые могут быть выделены из хромосомной ДНК, которые включают в себя открытую рамку считывания, кодирующую белок, например оксидоредуктазу А. шдег. Ген может включать в себя кодирующие последовательности, некодирующие последовательности, интроны и регуляторные последовательности. Кроме того, геном называют выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, определенную здесь.

Молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения, например молекула нуклеиновой кислоты, имеющая нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 001 - 006 или 8ЕЦ ГО N0: 007 - 012, или ее функциональный эквивалент может быть выделена с использованием стандартных способов молекулярной биологии и обеспеченной здесь информации о последовательности. Например, с использованием всей или части последовательности нуклеиновой кислоты 8ЕЦ ГО N0: 001 - 006 или 8ЕЦ ГО N0: 007 012 в качестве гибридизационного зонда молекулы нуклеиновых кислот согласно этому изобретению могут быть выделены с использованием стандартных способов гибридизации и клонирования (например, описанных в 8атЬгоок, 1., Ггйкй, Е.Г., аи4 ΜαηίαΙίδ. Т. Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога1огу Мапиа1. 2и4, е4., Со14 8рг1ид НагЬог ЬаЬога1огу, Со14 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, Со14 8рппд НагЬог, ПУ, 1989).

Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты, включающая в себя всю или часть 8ЕЦ ГО N0: 001 006 или 8Е0 ГО N0: 007 - 012, может быть выделена при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием синтетических олигонуклеотидных праймеров, сконструированных на основе информации об этой последовательности, содержащейся в 8ЕЦ ГО N0: 001 - 006 или 8ЕЦ ГО N0: 007 - 012.

Нуклеиновая кислота этого изобретения может быть амплифицирована с использованием кДНК в качестве матрицы и подходящих олигонуклеотидных праймеров в соответствии со стандартными способами ПЦР-амплификации. Амплифицированная таким образом нуклеиновая кислота может быть клонирована в подходящий вектор и охарактеризована при помощи анализа секвенирования ДНК.

Кроме того, олигонуклеотиды, соответствующие нуклеотидным последовательностям или гибридизуемые с нуклеотидными последовательностями этого изобретения, могут быть получены стандартными синтетическими способами, например, с использованием автоматизированного ДНК-синтезатора.

В предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты этого изобретения содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая является комплементом нуклеотидной последовательности, показанной в 8ЕЦ ГО N0: 007 - 012.

Последовательность 8ЕЦ ГО N0: 007 - 012 соответствует кодирующему району кДНК 0X1 01 - 0X1 06 А. шдег. Эта кДНК содержит последовательности, кодирующие полипептид 0X1 01 - 0X1 06 А. шдег в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 013 - 018.

В другом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты этого изобретения содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая является комплементом нуклеотидной последовательности, показанной в 8ЕЦ ГО N0: 001 - 006 или 8ЕЦ ГО N0: 007 - 012, или функциональным эквивалентом этих нуклеотидных последовательностей.

Молекула нуклеиновой кислоты, которая комплементарна другой нуклеотидной последовательности, является молекулой нуклеиновой кислоты, которая является достаточно комплементарной другой нуклеотидной последовательности таким образом, что она может гибридизоваться с другой нуклеотидной последовательностью с образованием стабильного дуплекса.

Один аспект этого изобретения относится к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептид этого изобретения или его функциональный эквивалент, такой как биологически активный фрагмент или домен, а также молекулам нуклеиновых кислот, достаточным для применения в качестве гибридизационных зондов для идентификации молекул нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид этого изобретения, и фрагментов таких молекул нуклеиновых кислот, подходящих для применения в качестве ПЦР-праймеров для амплификации или мутации молекул нуклеиновых кислот.

Выделенный полинуклеотид или выделенная нуклеиновая кислота является ДНК или РНК, которая не является непосредственно смежной с обеими кодирующими последовательностями, с которыми она является непосредственно смежной (одной на 5'-конце и одной на З'-конце) в природновстречающемся геноме организма, из которого она получена. Таким образом, в одном варианте осуществления выделенная нуклеиновая кислота включает в себя некоторые или все из 5'-некодирующих (например, промотор) последовательностей, которые являются непосредственно смежными с этой кодирующей последовательностью. Таким образом, этот термин включает в себя, например, рекомбинантную ДНК, которая включена в вектор, в автономно реплицирующиеся плазмиду или вирус, или в геномную ДНК прокариота или эукариота, или существует в виде отдельной молекулы (например, кДНК или фрагмента геномной ДНК, полученных при помощи ПЦР или обработкой рестрикционной эндонуклеазой) независимо от других последовательностей. Этот термин включает в себя рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительный полипептид, которая, по существу,

- 4 015438 не содержит клеточного материала, вирусного материала или культуральной среды (при получении способами рекомбинантных ДНК) или химических предшественников или других химикалиев (при химическом синтезе). Кроме того, фрагмент выделенной нуклеиновой кислоты является фрагментом нуклеиновой кислоты, который не встречается в природе в виде фрагмента и не мог бы быть обнаружен в этом природном состоянии.

В данном контексте термины полинуклеотид или молекула нуклеиновой кислоты включают в себя молекулы ДНК (например, кДНК или геномную ДНК) и молекулы РНК (например, мРНК) и аналоги ДНК или РНК, генерированные с использованием аналогов нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. Эта нуклеиновая кислота может быть синтезирована с использованием аналогов или производных олигонуклеотидов (например, инозина или фосфоротиоатных нуклеотидов). Такие олигонуклеотиды могут быть использованы, например, для получения нуклеиновых кислот, которые имеют измененные способности спаривания оснований или увеличенную устойчивость к нуклеазам.

Другой вариант этого изобретения обеспечивает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая является антисмысловой в отношении молекулы нуклеиновой кислоты 0X1 01 - 0X1 06, например кодирующую цепь молекулы нуклеиновой кислоты 0X1 01 - 0X1 06. В объем этого изобретения включены также комплементарные цепи описанных здесь молекул нуклеиновых кислот.

Ошибки секвенирования

Информация о последовательностях, обеспеченная здесь, не должна пониматься настолько узко, чтобы требовать включения ошибочно идентифицированных оснований. Описанные здесь конкретные последовательности могут быть легко использованы для выделения полного гена из мицелиальных грибов, в частности А. шдег, которые, в свою очередь, могут быть легко подвергнуты дополнительным анализам последовательности для идентификации посредством этого ошибок секвенирования.

Если нет других указаний, все нуклеотидные последовательности, определенные с использованием автоматизированного ДНК-секвенатора, и все аминокислотные последовательности полипептидов, кодируемые определенными здесь последовательностями ДНК, были предсказаны трансляцией последовательности ДНК, определенной, как описано выше. Таким образом, как известно в данной области, для любой последовательности ДНК, определенной этим автоматизированным подходом, любая нуклеотидная последовательность, определенная здесь, может содержать некоторые ошибки. Нуклеотидные последовательности, определенные при помощи автоматизации, являются обычно по меньшей мере на приблизительно 90% идентичными, более часто по меньшей мере на приблизительно 95% идентичными по меньшей мере на приблизительно 99,9% идентичными фактической нуклеотидной последовательности этой секвенированной молекулы ДНК. Фактическая последовательность может быть точно определена другими подходами, включающими в себя мануальные способы секвенирования, хорошо известные в данной области. Как также хорошо известно в данной области, единственная инсерция или делеция в определенной нуклеотидной последовательности в сравнении с фактической последовательностью будет вызывать смещение рамки считывания в трансляции этой нуклеотидной последовательности, так что предсказанная аминокислотная последовательность, кодируемая определенной нуклеотидной последовательностью, будет полностью отличающейся от аминокислотной последовательности, фактически кодируемой этой секвенируемой молекулой ДНК, начинаясь в точке такой инсерции или делеции.

Человек с квалификацией в этой области способен идентифицировать такие ошибочно идентифицированные основания и знает, как корректировать такие ошибки.

Фрагменты, зонды и праймеры нуклеиновых кислот

Молекула нуклеиновой кислоты этого изобретения может содержать только часть или фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в 8Еф ΙΌ N0: 001 - 006 или 8Еф ΙΌ N0: 007 012, например, фрагмент, который может быть использован в качестве зонда или праймера, или фрагмент, кодирующий часть белка 0XI 01 - 0XI 06. Нуклеотидная последовательность, определенная из клонирования гена 0X1 01 - 0X1 06 и кДНК, позволяет генерировать зонды и праймеры, сконструированные для применения в идентификации и/или клонировании других членов семейства 0X1 01 - 0X1 06, а также гомологов 0X1 01 - 0X1 06 из других видов. Этот зонд/праймер обычно содержит, по существу, очищенный олигонуклеотид, который обычно содержит район нуклеотидной последовательности, который гибридизуется предпочтительно при условиях высокой строгости по меньшей мере с приблизительно 12 или 15, предпочтительно приблизительно 18 или 20, предпочтительно приблизительно 22 или 25, более предпочтительно приблизительно 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 75 или более последовательными нуклеотидами нуклеотидной последовательности, показанной в 8Еф ΙΌ N0: 001 - 006 или 8Еф ΙΌ N0: 007 - 012, или его функциональный эквивалент.

Зонды на основе нуклеотидных последовательностей 0X1 01 - 0X1 06 могут быть использованы для детектирования транскриптов или геномных последовательностей 0X1 01 - 0X1 06, кодирующих те же самые или гомологичные белки, например, в других организмах. В предпочтительных вариантах осуществления этот зонд дополнительно содержит группу-метку, присоединенную к нему, например, этой группой-меткой может быть радиоактивный изотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор

- 5 015438 фермента. Такие зонды могут быть также использованы в виде части диагностического набора для идентификации клеток, которые экспрессируют белок 0X1 01 - 0X1 06.

Идентичность и гомология

Термины гомология или процент идентичности используются здесь взаимозаменяемо. Для цели этого изобретения здесь определяется, что для определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот эти последовательности сопоставляют для целей оптимального сравнения (например, в последовательность первой аминокислотной последовательности или последовательность нуклеиновой кислоты могут быть введены бреши (пробелы) для оптимального сопоставления со второй аминокислотной последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или нуклеотидов. Когда положение в первой последовательности занято тем же самым аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, тогда эти молекулы являются идентичными в этом положении. Процент идентичности между этими двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, общих для этих последовательностей (т.е. процент идентичности = количество идентичных положений/общее количество положений (т.е. частично совпадающих положений) х 100). Предпочтительно эти две последовательности имеют одну и ту же длину.

Квалифицированному специалисту известен тот факт, что для определения гомологии между двумя последовательностями доступны несколько различных компьютерных программ. Например, сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может выполняться с использованием математического алгоритма. В предпочтительном варианте осуществления процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с использованием алгоритма №еб1етаи апб Аипзсй (1. Μοί. ΒίοΙ. (48): 444-453 (1970)), который был включен в программу ОЛР в пакете программ ОСО (доступном в 1Шр://\\л\л\'.дс8.сот). использующую либо матрицу В1оззот 62, либо матрицу РАМ250 и вес бреши 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и вес длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Квалифицированному специалисту будет понятно, что все эти различные параметры будут давать слегка различные результаты, но что общий процент идентичности двух последовательностей не отличается значимо при использовании разных алгоритмов.

Еще в одном варианте осуществления процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием программы ОЛР в пакете программ ОСО (доступном в Ы1р://^тете.дсд.сот), использующей матрицу ША8дарбпа. СМР и вес бреши 40, 50, 60, 70 или 80 и вес длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В другом варианте осуществления процент идентичности двух аминокислотных последовательностей или нуклеотидных последовательностей определяют с использованием алгоритма Е. Меуетз апб А. МШет (СЛВЮ8, 4:11-17 (1989), который был включен в программу ΑΓΙΟΝ (уетзюи 2.0) (доступную в Ы1р://уедалдй.сиг8.1г/Ьш/а11ди-дие88.сд1), использующую таблицу весов остатков РАМ 120, штраф за длину бреши 12 и штраф за брешь 4.

Последовательности нуклеиновых кислот и последовательности белков данного изобретения могут быть дополнительно использованы в качестве запрашиваемой последовательности для выполнения поиска против публичных баз данных, например для идентификации других членов семейства или родственных последовательностей.

Такие поиски могут выполняться с использованием программ ΝΒΕΑ8Τ и ХВЬА8Т (уетзюи 2.0) Α118сйи1, е! а1. (1990) 1. Мо1. ΒίοΙ. 215:403-10. Поиски нуклеотидов ВЬА8Т могут выполняться с программой ΝΒΕΑ8Τ, оценка = 100, длина слова =12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот 0X1 01 - 0X1 06 этого изобретения. Поиски белков ВЬА8Т могут выполняться с программой XΒ^Α8Τ, оценка = 50, длин слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белков 0X1 01 - 0X1 06 этого изобретения. Для получения сопоставлений с брешами для целей сравнения может быть использована программа Оарреб ВЬА8Т, описанная в А11зс1ш1 е! а1., (1997) ШсШс Ас1бз Кез. 25(17): 3389-3402. При использовании программ ВЬА8Т и Оарреб ВЬА8Т, могут быть использованы параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XΒ^Α8Τ и №ЬА8Т). См. 1Шр://\\л\лу.псЬ1.п1т.ш11.доу.

Гибридизация

В данном контексте, термин гибридизация описывает условия гибридизации и промывания, при которых нуклеотидные последовательности, гомологичные друг другу по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 40%, по меньшей мере на приблизительно 70%, более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 80%, даже более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 85-90%, более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 95%, обычно остаются гибридизованными друг с другом.

Предпочтительным, неограничивающим примером таких условий гибридизации являются гибридизация в смеси 6х хлорид натрия/цитрат натрия (88С) при приблизительно 45°С, с последующими одной или несколькими промывками в 1 х 88С, 0,1% 8Ό8 при 50°С, предпочтительно при 55°С, предпочтительно при 60°С и даже более предпочтительно при 65°С.

- 6 015438

Условия высокой строгости включают в себя, например, гибридизацию при 68°С в смеси 5х 88С/5х раствор Денхардта/1,0% ДСН и промывание в 0,2х 88С/0,1% ДСН при комнатной температуре. Альтернативно, промывание можно выполнять при 42°С.

Квалифицированному специалисту будет известно, какие условия следует применять для условий строгой гибридизации и гибридизации высокой строгости. Дополнительное руководство в отношении таких условий является легко доступным в данной области, например, в 8ашЬтоок е! а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошид, А БаЬогаЮг^· Мапиа1, Со1б 8рпп§ НагЬог Ртезз, Ν.Υ. и Аи8иЬе1 е! а1. (ебз.), 1995, Ситгеи! Рго!осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, (1ойи АПеу & 8оиз, Ν. Υ.).

Конечно, полинуклеотид, который гибридизуется только с поли А-последовательностью (например, с З'-концевым участком мРНК) или с комплементарным участком остатков Т (или и), не мог бы быть включен в полинуклеотид этого изобретения, используемый для специфической гибридизации с частью нуклеиновой кислоты этого изобретения, так как такой полинуклеотид гибридизовался бы с любой молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей участок поли (А) или его комплемент (например, практически с любым двухцепочечным клоном кДНК).

Получение полноразмерной ДНК из других организмов

В одном типичном подходе могут быть подвергнуты скринингу библиотеки кДНК, сконструированные из других организмов, например мицелиальных грибов, в частности, из видов АзретдШиз.

Например, штаммы АзретдШиз могут быть подвергнуты скринингу на гомологичные 0X1 01 - 0X1 06 полинуклеотиды при помощи Нозерн-блот-анализа. После детектирования транскриптов, гомологичных полинуклеотидам в соответствии с данным изобретением, могут быть сконструированы библиотеки кДНК из РНК, выделенной из подходящего штамма, с использованием стандартных способов, хорошо известных квалифицированным в данной области специалистам. Альтернативно, библиотека общей геномной ДНК может быть подвергнута скринингу с использованием зонда, гибридизуемого с полинуклеотидами 0X1 01 - 0X1 06 в соответствии с данным изобретением.

Последовательности гомологичных генов могут быть выделены, например, выполнением ПЦР с использованием двух пулов вырожденных олигонуклеотидных праймеров, сконструированных на основе описанных здесь нуклеотидных последовательностей.

Матрицей для этой реакции может быть кДНК, полученная обратной транскрипцией мРНК, полученной из штаммов, о которых известно или в отношении которых предполагается, что они экспрессируют полинуклеотид в соответствии с этим изобретением. Продукт ПЦР может быть субклонирован и секвенирован для подтверждения того, что эти амплифицированные последовательности представляют последовательности новой нуклеиновой кислоты 0X1 01 - 0X1 06 или ее функционального эквивалента.

Затем этот фрагмент ПЦР может быть использован для выделения клона полноразмерной ДНК различными известными способами. Например, этот амплифицированный фрагмент может быть помечен и использован для скрининга библиотеки кДНК бактериофага или космиды. Альтернативно, этот меченый фрагмент может быть использован для скрининга геномной библиотеки.

Технология ПЦР может быть также использована для выделения полноразмерных последовательностей кДНК из других организмов. Например, может быть выделена РНК с использованием стандартных процедур из подходящего клеточного или тканевого источника. На этой РНК может быть выполнена реакция обратной транскрипции с использованием олигонуклеотидного праймера, специфического в отношении самого 5'-(левого)-конца этого амплифицированного фрагмента для праймирования синтеза первой цепи.

Затем к полученному гибриду РНК/ДНК может быть присоединен хвост (например, гуанины) с использованием стандартной реакции терминальной трансферазы, этот гибрид может быть расщеплен РНКазой Н и затем может быть праймирован синтез второй цепи (например, с использованием поли-Спраймера). Таким образом, могут быть легко выделены кДНК-последовательности слева от амплифицированного фрагмента. В отношении обзора применимых стратегий клонирования см., например, 8атЬгоок е! а1., зирга и АизиЬе1 е! а1., зирга.

Кодирует или не кодирует гомологичный ДНК-фрагмент функциональный белок 0X1 01 - 0X1 06, может быть легко испытано способами, известными в данной области.

Векторы

Другой аспект этого изобретения относится к векторам, предпочтительно экспрессирующим векторам, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую белок 0X1 01 - 0X1 06 или его функциональный эквивалент. В данном контексте термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой он был связан. Одним типом вектора является плазмида, которая является петлей кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, причем в этот вирусный геном могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их вводят (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации, и эписомные векторы). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина после введения в

- 7 015438 эту клетку-хозяина и посредством этого реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называют здесь экспрессирующими векторами. Обычно экспрессирующие векторы, применимые в способах рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме плазмид. Термины плазмида и вектор могут использоваться здесь взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Однако предполагается, что это изобретение включает в себя такие другие формы экспрессирующих векторов, как вирусные векторы (например, дефектные в отношении репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.

Рекомбинантные экспрессирующие векторы этого изобретения содержат нуклеиновую кислоту этого изобретения в форме, подходящей для экспрессии этой нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает, что рекомбинантый экспрессирующий вектор включает в себя одну или несколько регуляторных последовательностей, выбранных на основе клеток-хозяев, которые должны быть использованы для экспрессии, которые функционально связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая должна быть экспрессирована. В рекомбинантном экспрессирующем векторе функционально связанные означает, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность связана с регуляторной последовательностью (регуляторными последовательностями) таким образом, что возможна экспрессия этой нуклеотидной последовательности (например, в системе ίη νίίτο транскрипции/трансляции или в клетке-хозяине, когда этот вектор вводят в клетку-хозяина). Термин регуляторная последовательность включает в себя промоторы, энхансеры и другие элементы регуляции экспрессии (например, сигнал полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Соеббек Оепе Ехргеккюп Тес1то1оду: МеЛобк ίη Епхуто1оду 185, Асабетк Ргекк, 8ап О|едо. СА (1990). Регуляторные последовательности включают в себя последовательности, которые управляют конститутивной экспрессией нуклеотидной последовательности во многих типах клеток, и последовательности, которые управляют экспрессией этой нуклеотидной последовательности только в определенной клетке-хозяине (например, тканеспецифические регуляторные последовательности). Квалифицированным в данной области специалистам будет понятно, что конструирование экспрессирующего вектора может зависеть от таких факторов, как выбор трансформируемой клетки-хозяина, уровень экспрессии желаемого белка и т. д. Экспрессирующие векторы этого изобретения могут быть введены в клетки-хозяева для получения посредством этого белков или пептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами, описанными здесь (например, белков 0X1 01 -0X1 06, мутантных форм белков 0X1 01 - 0X1 06, фрагментов, вариантов или функциональных эквивалентов любых из них, и т.д.).

Рекомбинантные экспрессирующие векторы этого изобретения могут быть сконструированы для экспрессии белков 0X1 01 - 0X1 06 в прокариотических или эукариотических клетках. Например, белки 0X1 01 - 0X1 06 могут быть экспрессированы в бактериальных клетках, таких как Е. сой, клетках насекомых (с использованием бакуловирусных экспрессирующих векторов), дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева обсуждаются дополнительно в Ооеббе1, Оепе Ехртеккюп Тес11по1оду: МеЛобк ίη Епхуто1оду 185, Асабетк Ргекк, 8ап Окдо, СА (1990). Альтернативно, рекомбинантный экспрессирующий вектор может быть транскрибирован и транслирован ш νίίΐΌ, например, с использованием регуляторных последовательностей промотора Т7 и полимеразы Т7.

Экспрессирующие векторы, применимые в данном изобретении, включают в себя полученные из хромосом, эписом и полученные из вируса векторы, например векторы, полученные из бактериальных плазмид, бактериофага, дрожжевой эписомы, дрожжевых хромосомных элементов, вирусов, таких как бакуловирусы, паповавирусы, вирусы осповакцины, аденовирусы, вирусы птичьего дифтерита, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, и векторы, полученные из их комбинаций, например векторы, полученные из генетических элементов плазмиды и бактериофага, такие как космиды и фагмиды.

ДНК-вставка должна быть функционально связана с подходящим промотором, таким как промотор фага лямбда РЬ, промоторы Е. сой 1ас, ίτρ и 1ас, ранний и поздний промоторы 8У40 и промоторы ретровирусных ЬТЯ, в качестве примера. Другие подходящие промоторы будут известны квалифицированному в данной области специалисту. В конкретном варианте осуществления предпочтительными являются промоторы, которые способны управлять высоким уровнем экспрессии оксидоредуктаз в мицелиальных грибах. Такие промоторы известны в данной области. Эти экспрессионные конструкции могут содержать сайты инициации транскрипции, терминации и, в транскрибируемом районе, сайт связывания рибосом для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессированных такими конструкциями, будет включать в себя инициирующий трансляцию АИО в начале и кодон терминации, подходящим образом расположенный в конце транслируемого пола.

Векторная ДНК может быть введена в прокариотические или эукариотические клетки общепринятыми способами трансформации или трансфекции. В данном контексте термины трансформация и трансфекция относятся к различным признанным в данной области способам введения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяина, включающим в себя соосаждение фосфатом кальция или хлоридом кальция, опосредованную ДЭАЭ-декстраном трансфекцию, трансдукцию, инфи

- 8 015438 цирование, опосредованную липидами трансфекцию или электропорацию. Подходящие способы трансформации или трансфекции клеток-хозяев могут быть найдены в 8атЬгоок, с1 а1. (Мо1еси1аг С1ои1ид: А БаЬогаЮгу Мапиа1, 2'¹. еб. Со1б 8рттд НагЬог ЬаЬотаЮту, Со1б 8ртшд НагЬог БаЬогаЮгу Ргекк, Со1б 8ргтд НагЬог, ΝΥ, 1989), Όηνίκ е1 а1., Баас Ме1йобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1986) и других лабораторных пособиях.

В отношении стабильной трансфекции клеток млекопитающих известно, что, в зависимости от используемых экспрессирующего вектора и способа трансфекции, только малая фракция клеток может интегрировать чужеродную ДНК в их геном. Для идентификации и отбора этих интегрантов ген, который кодирует селектируемый маркер (например, ген устойчивости к антибиотикам), вводят в эти клеткихозяева вместе с представляющим интерес геном. Предпочтительные селектируемые маркеры включают в себя маркеры, которые придают устойчивость к лекарственным средствам, таким как С418, гигромицин и метатрексат. Нуклеиновая кислота, кодирующая селектируемый маркер, может быть введена в клетку-хозяина на том же самом векторе, что и вектор, кодирующий белок 0X1 01 - 0X1 06, или может быть введена на отдельном векторе. Клетки, стабильно трансфицированные введенной нуклеиновой кислотой, могут быть идентифицированы отбором с использованием лекарственного средства (например, клетки, которые имеют включенный ген селектируемого маркера, будут выживать, в то время как другие клетки умирают).

Экспрессию белков в прокариотах часто проводят в Е. сой с векторами, содержащими конститутивные или индуцибельные промоторы, управляющие экспрессией белков.

Как показано, экспрессирующие векторы будут предпочтительно содержать селектируемые маркеры. Такие маркеры включают в себя дигидрофолатредуктазу или устойчивость к неомицину для культуры эукариотических клеток и устойчивость к тетрациклину или ампициллину для культивирования в клетках Е. сой и других бактериях. Репрезентативные примеры подходящего хозяина включают в себя бактериальные клетки, такие как Е. сой, 81гер1отусек и 8а1тоие11а 1урЫтигшт; грибные клетки, такие как дрожжи; клетки насекомых, такие как Эгокорййа 82 и 8робор1ега 8£9; клетки животных, такие как СНО, С08 и меланома Вотек; и клетки растений. Подходящие культуральные среды и условия для вышеописанных клеток-хозяев известны в данной области.

Среди векторов, предпочтительных для применения в бактериях, находятся рОЕ70, рОЕ60 и РОЕ-9, доступные из 01адеи; векторы рВ8, векторы Рйадексйр!, векторы В1иексг1р1, рNН8А, рNН16А, рNН18А, рNН46А, доступные из 81га1адепе; и р!гс99а, рКК223-3, рКК233-3, рЭВ540, рВ1Т5, доступные из Рйагтас1а. Среди предпочтительных эукариотических векторов находятся Ρ^ΕΝΕΟ, р8У2САТ, р0С44, р2Т1 и р8С, доступные из 81га1адеие; и р8УК3, рВРУ, рМ8С и р8УЪ, доступные из Рйагтааа. Другие подходящие векторы будут вполне очевидными для квалифицированного в данной области специалиста.

Известные бактериальные промоторы для применения в данном изобретении включают в себя промоторы 1ас1 и 1ас2 Е. сой, промоторы Т3 и Т7, промотор др!, промоторы РВ, РЬ лямбда и промотор 1тр, промотор тимидинкиназы Н8У, ранний и поздний промоторы 8У40, промоторы ретровирусных ЬТВ, такие как промоторы вируса саркомы Рауса (В8У), и промоторы металлотионеина, такие как промотор мышиного металлотионеина-1.

Транскрипция ДНК, кодирующей полипептиды данного изобретения, высшими эукариотами может быть увеличена инсерцией последовательности энхансера в этот вектор. Энхансеры являются цисдействующими элементами ДНК, обычно приблизительно 10-300 п.н., которые действуют, увеличивая транскрипционную активность промотора в конкретном типе клетки-хозяина. Примеры энхансеров включают в себя энхансер 8У40, который расположен на поздней стороне сайта инициации репликации при п.н. 100-270, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне сайта инициации репликации и энхансеры аденовируса.

Для секреции транслированного белка в просвет эндоплазматического ретикулума в пространство периплазмы или во внеклеточную среду в этот экспрессируемый полипептид может быть включен подходящий сигнал секреции. Эти сигналы могут быть эндогенными относительно этого полипептида или они могут быть гетерологичными сигналами.

Этот полипептид может экспрессироваться в модифицированной форме и может включать в себя не только сигналы секреции, но также дополнительные гетерологичные функциональные сигналы. Так, например, на Ν-конце этого полипептида может быть добавлен район дополнительных аминокислот, в частности заряженных аминокислот, для улучшения стабильности и устойчивости в клетке-хозяине во время очистки или во время последующего манипулирования и хранения. К этому полипептиду могут быть также добавлены пептидные части для облегчения очистки.

Полипептиды в соответствии с данным изобретением

Это изобретение обеспечивает выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность в соответствии с 8Е0 ГО N0: 013 - 018, аминокислотную последовательность, получаемую экспрессией полинуклеотида 8Е0 ГО N0: 001 - 007 в подходящем хозяине, а также аминокислотную последовательность, получаемую экспрессией полинуклеотидных последовательностей 8Е0 ГО N0: 007 012 в подходящем хозяине. Пептид или полипептид, содержащий функциональный эквивалент приведенных выше полипептидов, также находится в пределах этого изобретения. Приведенные выше поли

- 9 015438 пептиды включены вместе в термин полипептиды в соответствии с данным изобретением.

Термины пептид и олигопептид считаются синонимами (как обычно признается), и каждый термин может быть использован взаимозаменяемо, как требует контекст, для обозначения цепи из по меньшей мере двух аминокислот, связанных пептидильными связями. Слово полипептид используется здесь обычно для цепей, содержащих более семи аминокислотных остатков. Все формулы или последовательности олигопептидов и полипептидов написаны здесь слева направо в направлении от аминоконца к карбоксиконцу. Однобуквенный код аминокислот, используемый здесь, обычно известен в данной области и может быть найден в 8ашЬтоок, с1 а1. (Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2¹¹'¹. ей. Со1й 8ртшд НагЬог ЬаЬогаФту, Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬота1огу Ргекк, Со1й 8ргшд НагЬог, ΝΥ, 1989).

Под выделенным полипептидом или белком имеется в виду полипептид или белок, удаленный из его природного окружения. Например, рекомбинантно полученные полипептиды и белки, экспрессированные в клетках-хозяевах, считаются выделенными для цели этого изобретения, как и природные или рекомбинантные полипептиды, которые были, по существу, очищены подходящим способом, таким как, например, одностадийный способ очистки, описанный в 8ιηί11ι апй 1оЬпкоп, Оепе 67:31-40 (1988).

Оксидоредуктаза 0X1 01 - 0X1 06 в соответствии с данным изобретением может быть выделена и очищена из культур рекомбинантных клеток хорошо известными способами, включающими в себя осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионо- или катионообменную хроматографию, фосфоцеллюлозную хроматографию, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, гидроксиапатитную хроматографию и хроматографию с использованием лектина. Наиболее предпочтительно для очистки используется высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Полипептиды данного изобретения включают в себя природно очищенные продукты, продукты процедур химического синтеза и продукты, полученные рекомбинантными способами из прокариотического или эукариотического хозяина, включающего в себя, например, бактериальные, дрожжевые клетки, клетки высших растений, клетки насекомых и клетки млекопитающих. В зависимости от хозяина, используемого в процедуре рекомбинантного получения, полипептиды данного изобретения могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными. Кроме того, полипептиды этого изобретения могут также включать в себя начальный модифицированный остаток метионина, в некоторых случаях как результат опосредованных хозяином процессов.

Фрагменты белков

Это изобретение описывает также биологически активные фрагменты полипептидов по данному изобретению.

Биологически активные фрагменты полипептида этого изобретения включают в себя полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, достаточно идентичные аминокислотной последовательности или полученные из аминокислотной последовательности белка 0X1 01 - 0X1 06 (например, аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 013 - 018), которые включают в себя меньше аминокислот, чем полноразмерный белок, и проявляют по меньшей мере одну биологическую активность соответствующего полноразмерного белка. Обычно биологически активные фрагменты содержат домен или мотив по меньшей мере с одной активностью белка 0X1 01 - 0X1 06. Предпочтительным является фрагмент с глюкозооксидазной активностью (ЕС 1.1.3.4).

Биологически активный фрагмент белка этого изобретения может быть полипептидом, который имеет длину, например, 10, 25, 50, 100 или более аминокислот. Кроме того, другие биологически активные части, в которых делетированы другие районы этого белка, могут быть получены рекомбинантными способами и оценены на одну или несколько биологических активностей природной формы полипептида этого изобретения.

Это изобретение описывает также фрагменты нуклеиновых кислот, которые кодируют вышеуказанные биологически активные фрагменты белка 0X1 01 - 0X1 06.

Функциональные эквиваленты

Термины функциональные эквиваленты и функциональные варианты используются здесь взаимозаменяемо. Функциональные эквиваленты ДНК 0X1 01 - 0X1 06 являются фрагментами выделенной ДНК, которые кодируют полипептид, который проявляет частичную функцию оксидоредуктазы 0X1 01 0X1 06 А. шдет, как определено здесь. Функциональным эквивалентом полипептида 0X1 01 - 0X1 06 по данному изобретению является полипептид, который проявляет по меньшей мере одну функцию оксидоредуктазы А. шдет, как определено здесь. Таким образом, функциональные эквиваленты также включают в себя биологически активные фрагменты.

Функциональные эквиваленты белка или полипептида могут содержать только консервативные замены одной или нескольких аминокислот 8Еф ГО N0: 013 - 018 или замены, инсерции или делеции несущественных аминокислот. Таким образом, несущественная аминокислота является остатком, который может быть изменен в 8Еф ГО N0: 013-018 по существу без изменения биологической функции. Например, предсказывается, что аминокислотные остатки, которые являются консервативными среди белков 0X1 01-0X1 06 данного изобретения, являются особенно не подлежащими изменению. Кроме того, аминокислоты, консервативные среди белков 0X1 01 - 0X1 06 в соответствии с данным изобретением и дру

- 10 015438 гих оксидоредуктаз, вероятно, не являются подлежащими изменению.

Термин консервативная замена обозначает замену, в которой аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Эти семейства известны в данной области и включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин и гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

Функциональные эквиваленты нуклеиновых кислот могут обычно содержать молчащие мутации или мутации, которые не изменяют биологическую функцию кодируемого полипептида. Таким образом, это изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие белки 0X1 01 - 0X1 06, которые содержат изменения в аминокислотных остатках, которые не являются эссенциальными для конкретной биологической активности. Такие белки 0X1 01 - 0X1 06 отличаются по аминокислотной последовательности от 8Е0 ГО N0: 013 - 018, но все еще сохраняют по меньшей мере одну биологическую активность. Таким образом, это изобретение включает в себя также выделенные молекулы нуклеиновых кислот, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, где этот белок содержит, по существу, гомологичную аминокислотную последовательность, по меньшей мере на приблизительно 63, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 013. В другом варианте осуществления, эта выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, где этот белок содержит, по существу, гомологичную аминокислотную последовательность, по меньшей мере на приблизительно 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 014-018.

Например, руководство в отношении того, как получить фенотипически молчащие аминокислотные замены, приведено в Во\\1с. 1. и. с1 а1., 8с1еисе 247:1306-1310 (1990), где эти авторы указывают на то, что имеются два основных подхода к исследованию устойчивости аминокислотной последовательности к изменению. Первый способ основывается на процессе эволюции, в котором мутации либо принимаются, либо отторгаются естественным отбором. Второй подход использует генную инженерию для введения аминокислотных изменений в конкретных положениях клонированного гена и отбирает или подвергает скринингу для идентификации последовательностей, которые сохраняют функциональность. Как утверждают авторы, эти исследования выявили, что белки являются удивительно толерантными к аминокислотным заменам. Кроме того, эти авторы указывают, какие изменения, по-видимому, являются пермиссивными в определенном положении белка. Например, большинство скрытых аминокислотных остатков требуют неполярных боковых цепей, тогда как лишь немногие признаки поверхностных боковых цепей обычно являются консервативными. Другие подобные фенотипически молчащие замены описаны в Во\\1е е1 а1., 8ирга и цитированных в этой статье ссылках.

Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок 0X1 01 - 0X1 06, гомологичный белку в соответствии с 8Е0 ГО N0: 013 - 018, может быть создана введением одной или нескольких нуклеотидных замен, добавлений или делеций, в кодирующие нуклеотидные последовательности в соответствии с 8Е0 ГО N0: 001 - 006 или 8Е0 ГО N0: 007 - 012, таким образом, что одна или несколько аминокислотных замен, делеций или инсерций вводятся в кодируемый белок. Такие мутации могут вводиться стандартными способами, такими как сайт-направленный мутагенез или ПЦР-опосредованный мутагенез.

Термин функциональные эквиваленты включает в себя также ортологи белка А. шдег 0X1 01 0X1 06. Ортологи белка А. шдег 0X1 01 - 0X1 06 являются белками, которые могут быть выделены из других штаммов или видов и имеют сходную или идентичную биологическую активность. Такие ортологи могут быть легко идентифицированы как содержащие аминокислотную последовательность, которая, по существу, гомологична 8Е0 ГО N0: 013 - 018.

Как определено здесь, термин по существу гомологичные относится к первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая содержит достаточное или минимальное количество идентичных или эквивалентных (например, со сходной боковой цепью) аминокислот или нуклеотидов относительно второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, так что эти первые и эти вторые аминокислотные или нуклеотидные последовательности имеют общий домен. Например, аминокислотная или нуклеотидная последовательности, которые содержат общий домен, имеющий приблизительно 40%, предпочтительно 65%, более предпочтительно 70%, даже более предпочтительно 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% или большую идентичность, определяются здесь как достаточно идентичные.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие другие члены семейства 0X1 01 - 0X1 06, которые, следовательно, имеют нуклеотидную последовательность, которая отличается от 8Е0 ГО N0: 001 - 006 или 8Е0 ГО N0: 007 - 012, также находятся в объеме этого изобретения. Кроме того, нуклеиновые кислоты, коди

- 11 015438 рующие белки 0X1 01 - 0X1 06 из других видов, которые, следовательно, имеют нуклеотидную последовательность, которая отличается от 8Е0 ΙΌ N0: 001 - 006 или 8Е0 ГО N0: 007 - 012, также находятся в объеме этого изобретения.

Молекулы нуклеиновых кислот, соответствующие вариантам (например, природным аллельным вариантам) и гомологам ДНК 0X1 01 - 0X1 06 этого изобретения, могут быть выделены на основе их гомологии с описанными здесь нуклеиновыми кислотами 0X1 01 - 0X1 06 с использованием кДНК, описанных здесь, или их подходящего фрагмента, в качестве гибридизационного зонда в соответствии со стандартными способами гибридизации, предпочтительно при условиях гибридизации высокой строгости.

Квалифицированному специалисту будет понятно, что, кроме природно-встречающихся аллельных вариантов последовательности 0X1 01 - 0X1 06, в нуклеотидные последовательности 8Е0 ГО N0: 001 006 или 8Е0 ГО N0: 007 - 012 изменения могут быть введены мутацией, что приведет к изменениям в аминокислотной последовательности белка 0X1 01 - 0X1 06, по существу, без изменения функции белка 0X1 01 - 0X1 06.

В другом аспекте этого изобретения обеспечены улучшенные белки 0X1 01 - 0X1 06. Улучшенные белки 0X1 01 - 0X1 06 являются белками, в которых по меньшей мере одна биологическая активность является улучшенной. Такие белки могут быть получены случайным введением мутаций вместе со всей или частью кодирующей последовательности 0X1 01 - 0X1 06, например, при помощи насыщающего мутагенеза, и полученные мутанты могут быть экспрессированы рекомбинантно и подвергнуты скринингу на биологическую активность. Например, в этой области имеются стандартные анализы для измерения ферментативной активности оксидоредуктаз, и, следовательно, могут быть легко отобраны улучшенные белки.

В предпочтительном варианте осуществления белок 0X1 01 - 0X1 06 имеет аминокислотную последовательность в соответствии с 8Е0 ГО N0: 013 - 018. В другом варианте осуществления этот полипептид 0X1 01 - 0X1 06 является, по существу, гомологичным аминокислотной последовательности в соответствии с 8Е0 ГО N0: 013 -018 и сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность полипептида в соответствии с 8Е0 ГО N0: 013 - 018, но отличается по аминокислотной последовательности вследствие природной вариации или мутагенеза, как описано выше.

В следующем предпочтительном варианте осуществления белок 0X1 01 - 0X1 06 имеет аминокислотную последовательность, кодируемую выделенным фрагментом нуклеиновой кислоты, способным гибридизоваться с нуклеиновой кислотой в соответствии с 8Е0 ГО N0: 001 - 006 или 8Е0 ГО N0: 007 012, предпочтительно при условиях гибридизации высокой строгости.

Для белка, содержащего аминокислотную последовательность в соответствии с 8Е0 ГО N0: 013, ближайшим гомологом функционального фермента является оксидаза изоамилового спирта из ЛзрсгдП1из ГишщаШз. которая обнаруживает 62%-ную идентичность с 8Е0 ГО N0: 013. В одном варианте осуществления эта выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, причем этот белок содержит, по существу, гомологичную аминокислотную последовательность, по меньшей мере на приблизительно 63, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 013, и является функциональным эквивалентом белка, содержащего аминокислотную последовательность, соответствующую 8Е0 ГО N0: 013.

Для белка, содержащего аминокислотную последовательность в соответствии с 8Е0 ГО N0: 014, ближайшим гомологом функционального фермента является 6-гидрокси-Э-никотиноксидаза из ЛшЬгоЬас1ег охИаиз, которая обнаруживает хх% идентичности с 8Е0 ГО N0: 014. В одном варианте осуществления, эта выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, причем этот белок содержит, по существу, гомологичную аминокислотную последовательность, по меньшей мере на приблизительно 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 014, и является функциональным эквивалентом белка, содержащего аминокислотную последовательность, соответствующую 8ЕО ГО N0: 014.

Для белка, содержащего аминокислотную последовательность в соответствии с 8Е0 ГО N0: 015, ближайшим гомологом функционального фермента является версиколорин В-синтаза из ЛзрегдШиз рагаДйсиз, которая обнаруживает 31% идентичности с 8Е0 ГО N0: 015. В одном варианте осуществления, эта выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, причем этот белок содержи, по существу, гомологичную аминокислотную последовательность, по меньшей мере на приблизительно 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 015, и является функциональным эквивалентом белка, содержащего аминокислотную последовательность, соответствующую 8Е0 ГО N0: 015.

Белок, содержащий аминокислотную последовательность в соответствии с 8Е0 ГО N0: 016, не обнаруживает гомологию с каким-либо функциональным ферментом. В одном варианте осуществления эта выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, причем этот белок содержит, по существу, гомологичную аминокислотную последовательность,

- 12 015438 по меньшей мере на приблизительно 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО N0: 016, и является функциональным эквивалентом белка, содержащего аминокислотную последовательность, соответствующую 8ЕО ГО N0: 016.

Для белка, содержащего аминокислотную последовательность в соответствии с 8Е0 ГО N0: 017, ближайшим гомологом функционального фермента является 6-гидрокси-Э-никотиноксидаза из Ап!йгоЬае1сг охйапк, которая обнаруживает <25% идентичности с 8Е0 ГО N0: 017. В одном варианте осуществления, эта выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, причем этот белок содержит, по существу, гомологичную аминокислотную последовательность, по меньшей мере на приблизительно 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8 ЕС ГО N0: 017, и является функциональным эквивалентом белка, содержащего аминокислотную последовательность, соответствующую 8Е0 ГО N0: 017.

Белок, содержащий аминокислотную последовательность в соответствии с 8Е0 ГО N0: 018, не обнаруживает гомологию с каким-либо функциональным ферментом. В одном варианте осуществления, эта выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, причем этот белок содержит, по существу, гомологичную аминокислотную последовательность, по меньшей мере на приблизительно 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 018, и является функциональным эквивалентом белка, содержащего аминокислотную последовательность, соответствующую 8Е0 ГО N0: 018.

Таким образом, белок 0X1 01 является белком, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на приблизительно 63, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 013, и сохраняет по меньшей мере одну функциональную активность полипептида, соответствующего 8Е0 ГО N0: 013.

Аналогично, белки 0X1 2 - 0X1 06 являются белками, которые содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере на приблизительно 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 014 - 018, соответственно, и сохраняют по меньшей мере одну функциональную активность полипептида, соответствующего 8ЕС ГО N0: 014 - 018.

Функциональные эквиваленты белка по данному изобретению могут быть также идентифицированы, например, скринингом комбинаторных библиотек мутантов, например укороченных мутантов, белка этого изобретения на оксидоредуктазную активность. В одном варианте осуществления смешанную библиотеку вариантов генерируют комбинаторным мутагенезом на уровне нуклеиновых кислот. Смешанная библиотека вариантов может быть получена, например, ферментативным лигированием смеси синтетических олигонуклеотидов в последовательности генов, так что вырожденный набор потенциальных белковых последовательностей может экспрессироваться в виде отдельных полипептидов. Имеются различные способы, которые могут быть использованы для получения библиотек потенциальных вариантов полипептидов этого изобретения из вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Способы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны в данной области (см., например, №гапд (1983) Тс1гайейгоп 39:3; Йакита е! а1. (1984) Аппи. Ксу. Вюсйеш. 53:323; Йакита е! а1. (1984) 8с1епсе 198:1056; 1ке е! а1. (1983) №с1ею Ас1й Век. 11:477).

Кроме того, библиотеки фрагментов кодирующей последовательности полипептида этого изобретения могут быть использованы для генерирования смешанной популяции полипептидов для скрининга и последующего отбора вариантов. Например, библиотека фрагментов кодирующей последовательности может быть генерирована обработкой двухцепочечного фрагмента ПЦР представляющей интерес кодирующей последовательности нуклеазой при условиях, в которых образование одноцепочечных разрывов (ников ) встречается только один раз на молекулу, денатурацией двухцепочечной ДНК, ренатурацией этой ДНК для образования двухцепочечной ДНК, которая может включать в себя смысловые/антисмысловые пары из различных имеющих ники продуктов, удалением одноцепочечных частей из повторно образованных дуплексов обработкой нуклеазой 81 и лигированием полученной библиотеки фрагментов в экспрессирующий вектор. При помощи этого способа может быть получена экспрессионная библиотека, которая кодирует ^концевые и внутренние фрагменты разного размера представляющего интерес белка.

Несколько способов известны в данной области для скрининга генных продуктов комбинаторных библиотек, полученных с использованием точковых мутаций усечения, и для скрининга кДНКбиблиотек на генные продукты, имеющие выбранное свойство. Наиболее широко используемые способы, которые пригодны для высокопроизводительного анализа, для скрининга больших библиотек генов, обычно включают в себя клонирование библиотеки генов в реплицируемые экспрессирующие векторы, трансформацию подходящих клеток полученной библиотекой векторов и экспрессию этих комбинаторных генов при условиях, в которых детектирование желаемой активности облегчает выделение вектора, кодирующего ген, продукт которого был детектирован. Пошаговый согласованный мутагенез (тесшщуе

- 13 015438 сп5стЫс ти1адспс515). способ, который увеличивает частоту функциональных мутантов в этих библиотеках, может быть использован в комбинации со скрининг-анализом для идентификации вариантов белка этого изобретения (Агкш апб Уоигуап (1992) Ргос. Ыа11. Асаб. 8с1. И8А 89:7811- 7815; Ое1дгахе е! а1. (1993) Рго!ет Епдтееппд 6(3):327-331).

Для квалифицированного в данной области специалиста будет очевидным, что, кроме последовательности гена 0X1 01 - 0X1 06, показанной в 8Е0 ГО N0: 1, полиморфизмы последовательности ДНК, которые могут приводить к изменениям в аминокислотной последовательности белка 0X1 01 - 0X1 06, могут существовать в конкретной популяции. Такие генетические полиморфизмы могут существовать в клетках из различных популяций или в пределах одной популяции вследствие природной аллельной изменчивости. Аллельные варианты могут также включать в себя функциональные эквиваленты.

Фрагменты полинуклеотида в соответствии с данным изобретением могут также содержать полинуклеотиды, не кодирующие функциональные полипептиды. Такие полинуклеотиды могут функционировать в качестве зондов и праймеров для реакции ПЦР.

Нуклеиновые кислоты в соответствии с этим изобретением, независимо от того, кодируют ли они функциональные или нефункциональные полипептиды, могут быть использованы в качестве гибридизационных зондов или праймеров полимеразной цепной реакции (ПЦР). Применения молекул нуклеиновых кислот данного изобретения, которые не кодируют полипептид, имеющий активность 0X1 01 - 0X1 06, включают в себя ш!ег аба, (1) выделение гена, кодирующего белок 0X1 01 - 0X1 06, или его аллельных вариантов из кДНК-библиотеки, например из других организмов, чем А. шдег; (2) гибридизацию ίη 811и (например, ΕΙ8Η) с распластанными метафазными хромосомами для обеспечения точного хромосомного местоположения гена 0X1 01 - 0X1 06, как описано в Уегта е! а1., Нитап Сбготозотез: а Мапиа1 о£ Ва81с Тесбтдиез, Регдатоп Ргезз, Νονν Уогк (1988); (3) Нозерн-блот-анализ для детектирования экспрессии мРНК 0X1 01 - 0X1 06 в конкретных тканях и/или клетках и 4) зонды и праймеры, которые могут быть использованы в качестве диагностического инструмента для анализа присутствия нуклеиновой кислоты, гибридизуемой с зондом 0X1 01 - 0X1 06, в конкретной биологической пробе (например, ткани).

В это изобретение включен также способ получения функционального эквивалента гена или кДНК 0X1 01 - 0X1 06. Такой способ предусматривает получение меченого зонда, который включает в себя выделенную нуклеиновую кислоту, которая кодирует всю последовательность или часть последовательности в соответствии с 8Е0 ГО N0: 013 - 018 или ее вариант; скрининг библиотеки фрагментов нуклеиновой кислоты с использованием этого меченого зонда при условиях, которые делают возможной гибридизацию этого зонда с фрагментами нуклеиновых кислот в этой библиотеке, с образованием посредством этого дуплексов нуклеиновых кислот, и получение полноразмерной последовательности гена из этих фрагментов нуклеиновых кислот в любом меченом дуплексе с получением гена, родственного гену 0X1 01 - 0X1 06.

Клетки-хозяева

В другом варианте осуществления это изобретение описывает клетки, например трансформированные клетки-хозяева или рекомбинантные клетки-хозяева, которые содержат нуклеиновую кислоту, включенную в это изобретение. Трансформированной клеткой или рекомбинантной клеткой является клетка, в которую (или в прародителя которой) была введена способами рекомбинантных ДНК нуклеиновая кислота в соответствии с данным изобретением. В изобретение включены как прокариотические, так и эукариотические клетки, например бактерии, грибы, дрожжи и т.п., особенно предпочтительными являются клетки из мицелиальных грибов, в частности АзрегдШиз шдег.

Может быть выбрана клетка-хозяин, которая модулирует экспрессию встроенных последовательностей или модифицирует и процессирует продукт гена специфическим, желаемым образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут облегчать оптимальное функционирование этого белка.

Различные клетки-хозяева имеют характерные и специфические механизмы для посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Подходящие клеточные линии или системы хозяев, известные квалифицированным в области молекулярной биологии и микробиологии специалистам, могут быть выбраны для обеспечения желаемых и точных модификации и процессинга экспрессируемого чужеродного белка. Для этой цели могут быть использованы эукариотические клетки-хозяева, которые имеют клеточный аппарат для правильного процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такие клетки-хозяева хорошо известны в данной области.

Клетки-хозяева включают в себя также, но не ограничиваются ими, линии клеток млекопитающих, такие как СНО, УЕК.0, ВНК, НеЬа, С08, МОСК, 293, 3Т3, ΑΙ38, и линии клеток сосудистого сплетения.

Если желательно, полипептиды по данному изобретению могут продуцироваться стабильно трансфицированной клеточной линией. Ряд векторов, подходящих для стабильной трансфекции клеток млекопитающих, являются публично доступными, способы конструирования таких линий клеток являются также публично известными, например, из Аи8иЬе1 е! а1. (зирга).

Применение оксидоредуктаз в промышленных процессах

Данное изобретение относится также к применению оксидоредуктазы согласно данному изобретению в выбранном числе промышленных процессов. Несмотря на долгосрочный опыт, накопленный с

- 14 015438 этими процессами, оксидоредуктаза данного изобретения представляет ряд существенных преимуществ в сравнении с используемыми в настоящее время ферментами. В зависимости от конкретного применения эти преимущества могут включать в себя такие аспекты, как лучшая производительность, более низкие производственные расходы, большая субстратная специфичность, меньшая антигенность, меньшее число нежелательных побочных активностей, более высокие выходы при получении в подходящем микроорганизме, более подходящие диапазоны рН и температуры, лучший вкус конечного продукта, а также аспекты качества пищевых продуктов и аспекты кошерных пищевых продуктов.

Оксидоредуктаза данного изобретения может быть также использована в любом применении, где желательным является окисление субстрата или получение конкретных продуктов реакции окисления. Например, применение оксидоредуктазы этого изобретения может давать пероксид водорода вместе с альдегидами, спиртами, карбоновой кислотой и т.д.

Одним из промышленных процессов, для которых может быть использована новая оксидоредуктаза по данному изобретению, может быть применение для хлебопекарного производства. Это изобретение относится также к способу обеспечения мучного теста, имеющего улучшенные реологические свойства и готовым выпеченным или высушенным продуктам, изготовленным из такого теста, которые имеют улучшенные, структурные, пищевые качества и пространственные характеристики. Это изобретение относится также к премиксу для выпечки, который содержит муку, препарат фермента и подходящий носитель. Это изобретение обеспечивает более сильное тесто, с улучшенными свойствами, а также конечный выпеченный продукт с улучшенными качествами.

Сила теста является важным аспектом выпечки как для применений в малом масштабе, так и в крупномасштабных применениях. Сильное тесто имеет большую устойчивость к времени замеса, времени предварительной расстойки и механическим вибрациям во время транспортировки теста, тогда как слабое тесто является менее устойчивым к этим обработкам. Сильное тесто с превосходными реологическими и разделочными свойствами образуется из муки, содержащей сильный клейковинный каркас. Мука с низким содержанием белка или плохим качеством клейковины приводит к слабому тесту.

Улучшители свойств теста хорошо известны в хлебопекарной промышленности. Добавление улучшителей свойств к тесту приводило к улучшенной машинной обрабатываемости теста и улучшенным структуре, объему, вкусу и свежести (устойчивости к черствению) хлеба. Неспецифические окислители, такие как иодаты, пероксиды, аскорбиновая кислота, бромат калия и азодикарбонамид, используют для улучшения хлебопекарных качеств муки, для получения теста с улучшенными реологическими свойствами и для получения теста с желаемыми силой и стабильностью.

Было сделано предположение, что эти улучшители свойств индуцируют образование межбелковых связей, которые усиливают клейковину и тем самым тесто. Однако применение некоторых из доступных в настоящее время химических окислителей привело к ухудшению спроса на содержащие их продукты или не было одобрено регулирующими агенствами.

Применение ферментов в качестве улучшителей свойств теста рассматривалось в качестве альтернативы химическим улучшителям свойств. Ряд ферментов использовали недавно в качестве улучшающих тесто и/или хлеб агентов, в частности ферментов, которые действуют на компоненты, присутствующие в тесте в больших количествах. Примерами таких ферментов являются амилазы, протеазы, глюкозооксидазы, гексозооксидазы, ксиланазы и (геми)целлюлазы, в том числе пентозаназы, и липазы, фосфолипазы и галактолипазы.

Выпеченные продукты готовят из теста, которое обычно изготавливают из основных ингредиентов муки, воды и, необязательно, соли. В зависимости от этих выпеченных продуктов другими необязательными ингредиентами являются сахара, ароматизаторы и т.д. Для дрожжевых (разрыхляемых) продуктов используют прежде всего хлебопекарные дрожжи, за которыми следуют такие разрыхляющие системы, как комбинация кислоты (генерирующего соединения) и бикарбоната. Для улучшения разделочных свойств теста и/или конечных свойств выпеченных продуктов прилагаются непрерывные попытки развития вспомогательных препаратов с улучшающими свойствами. Свойства теста, которые должны быть улучшены, включают в себя машинную обрабатываемость, способность сохранения газа и т.д. Свойства выпеченных продуктов, которые могут быть улучшены, включают в себя объем батона (буханки), хруст корки, структуру и мягкость мякиша, вкус и запах, и срок годности при хранении. Существующие в настоящее время вспомогательные средства могут быть подразделены на две группы: химические добавки и ферменты.

Химические добавки с улучшающими свойствами содержат химические окислители, такие как аскорбиновая кислота, бромат и азодикарбонат, восстановители, такие как Ь-цистеин и глутатион, эмульгаторы, действующие как улучшители свойств теста, такие как диацетилвинные эфиры моно/диглицеридов (ЭЛТЕМ), стеароиллактилат натрия (88Ь) или стеароиллактилат кальция (С8Ь), или действующие как размягчители мякиша, такие как моностеарат глицерина (ОМ8) и т.д., масложировые вещества, такие как триглицериды (жир) или лецитин и другие.

В настоящее время существует тенденция замены химических добавок ферментами. Последние считаются более природными соединениями и, следовательно, более приемлемыми потребителем. Подходящие ферменты могут быть выбраны из окислительных ферментов, группы, состоящей из разру

- 15 015438 шающих крахмал ферментов, разрушающих арабиноксилан и другие гемицеллюлозы ферментов, разрушающих целлюлозу ферментов, расщепляющих жировой материал ферментов и разрушающих белок ферментов.

Данное изобретение относится также к способам приготовления теста или получения выпеченного продукта, предусматривающим включение в это тесто эффективного количества оксидоредуктазы данного изобретения, которая улучшает одно или несколько свойств теста или выпеченного продукта, полученного из этого теста, относительно теста или выпеченного продукта, в которое не был включен этот полипептид.

Фраза включение в тесто определяется здесь как добавление оксидоредуктазы согласно этому изобретению к тесту, любому ингредиенту, из которого должно быть приготовлено тесто, и/или любой смеси ингредиентов теста, из которой должно быть приготовлено тесто. Другими словами, оксидоредуктаза согласно этому изобретению может быть добавлена на любой стадии приготовления теста и может быть добавлена на одной, двух или более стадиях. Оксидоредуктазу согласно этому изобретению добавляют к ингредиентам теста, которое замешивают и выпекают для получения выпеченного продукта с использованием способов, хорошо известных в данной области. См., например, И.8. Ра1еп1 Νο. 4567046, ЕР-А-426211, ДР-А-60-78529, 1Р-А-62-111629 и ДР-А-63-258528.

Термин эффективное количество определяется здесь как количество оксидоредуктазы согласно этому изобретению, которое является достаточным для обеспечения измеримого действия по меньшей мере на одно представляющее интерес свойство теста и/или выпеченного продукта.

Термин улучшенное свойство определяется здесь как любое свойство теста и/или продукта, полученного из этого теста, в частности выпеченного продукта, которое улучшается действием оксидоредуктазы согласно этому изобретению, относительно теста или продукта, в которые не включена оксидоредуктаза согласно этому изобретению. Это улучшенное свойство может включать в себя, но не ограничивается ими, увеличенную силу теста, увеличенную эластичность теста, увеличенную стабильность теста, уменьшенную липкость теста, улучшенную растяжимость теста, улучшенный вкус выпеченного продукта, улучшенную устойчивость к черствению выпеченного продукта и улучшенную белизну мякиша.

Это улучшенное свойство может быть определено сравнением теста и/или выпеченного продукта, полученного с добавлением и без добавления полипептида данного изобретения, в соответствии со способами данного изобретения, которые описаны ниже в примерах. Органолептические качества могут оцениваться с использованием процедур, хорошо установленных в хлебопекарной промышленности, и могут включать в себя, например, использование дегустационной комиссии специалистов.

Термин увеличенная сила теста определяется здесь как свойство теста, которое имеет более эластичные свойства и/или требует большего усилия для формования и придания формы.

Термин увеличенная эластичность теста определяется здесь как свойство теста, которое имеет высокую тенденцию к возвращению его начальной формы после подвергания определенному физическому воздействию.

Термин увеличенная стабильность теста определяется здесь как свойство теста, которое является меньше чувствительным к механическому воздействию и, следовательно, поддерживающим его форму и объем.

Термин уменьшенная липкость теста определяется здесь как свойство теста, которое имеет меньшую тенденцию прилипания к поверхностям, например, в оборудовании для приготовления теста, которое либо оценивается эмпирически квалифицированным пекарем-лаборантом, либо измеряется с использованием анализатора структуры (например, ТАХТ2), как известно в данной области.

Термин улучшенная растяжимость теста определяется здесь как свойство теста, которое может подвергаться увеличенным деформации или растяжению без разрыва.

Термин улучшенная машинная обрабатываемость теста определяется здесь как свойство теста, которое является обычно менее липким, и/или более крепким, и/или более эластичным.

Термин увеличенная устойчивость к расстойке теста определяется как способность теста выдерживать продолжительные периоды расстойки.

Термин увеличенный объем выпеченного продукта относится к удельному объему батона хлеба (объем/масса), определенному при помощи традиционного способа определения объема хлеба с использованием рапсового семени.

Термин улучшенная структура мякиша выпеченного продукта определяется здесь как свойство выпеченного продукта с более мелкозернистыми и более тонкими клеточными стенками в мякише и/или более однородным/гомогенным распределением клеток в мякише и обычно оценивается эмпирически квалифицированным пекарем-лаборантом.

Термин улучшенная мягкость выпеченного продукта является противоположным термину крепкая консистенция теста и определяется здесь как свойство выпеченного продукта, который является более легко сжимаемым, и либо оценивается эмпирически квалифицированным пекарем-лаборантом, либо измеряется с использованием анализатора структуры (например, ТАХТ2), как известно в данной области.

- 16 015438

Термин улучшенный вкус выпеченного продукта оценивается дегустационной комиссией специалистов.

Термин улучшенная устойчивость к черствению выпеченного продукта определяется здесь как свойства выпеченного продукта, которые имеют уменьшенную скорость ухудшения параметров качества, например мягкости и/или эластичности во время хранения.

Термин тесто определяется здесь как смесь муки и других ингредиентов, достаточно крепкая для замешивания или раскатывания. Тесто может быть свежим, замороженным, предварительно брикетированным или предварительно выпеченным. Получение замороженного теста описано Ки1р и Ьогепх в Егохеп апб ВеГпдега!еб Όοιίβΐΐδ апб Вабегк.

Термин выпеченный продукт определяется здесь как любой продукт, полученный из теста, мягкого или хрустящего характера. Примерами выпеченных продуктов, пшеничного, светлого или темного типа, которые могут быть выгодным образом получены по данному изобретению, являются хлеб (в частности, пшеничный хлеб, пшеничный хлеб из муки цельносмолотого зерна или хлеб из ржаной муки), обычно в форме батонов или хлебцев, хлеба в виде французского батона (багета), макаронные изделия, пита-хлеб, маленькие лепешки из кукурузной или рисовой муки, 1аео5. печенье, блины, крекеры, кулинарные изделия, корки для пирогов, Цеашеб Ьгеаб и хлеб с толстой коркой и т.п.

Оксидоредуктазы данного изобретения и/или дополнительные ферменты, подлежащие применению в способах данного изобретения, могут находиться в любой форме, подходящей для рассматриваемого применения, например в форме сухого порошка, агломерированного порошка или гранулята, в частности, непылящего гранулята, жидкости, в частности, стабилизированной жидкости, или защищенного фермента, такого как фермент, описанный в \У0 01/11974 и \У0 02/26044. Грануляты и агломерированные порошки могут быть приготовлены общепринятыми способами, например разбрызгиванием оксидоредуктазы по данному изобретению на носитель в грануляторе с псевдоожиженным слоем. Носитель может состоять из состоящих из частиц сердцевин, имеющих подходящий размер частиц. Носитель может быть растворимым или нерастворимым, например солью (такой как №1С1 или сульфат натрия), сахаром (таким как сахароза или лактоза), сахароспиртом (таким как сорбит), крахмалом, рисом, кукурузной крупой или соей. Оксидоредуктаза согласно этому изобретению может содержаться в формах медленного высвобождения. Способы получения форм медленного высвобождения хорошо известны в данной области. Добавление приемлемых в пищевых продуктах стабилизаторов, таких как сахар, сахароспирт или другой полиол, и/или молочная кислота или другая органическая кислота, в соответствии с установленными способами может, например, стабилизировать жидкие препараты ферментов.

Оксидоредуктазы согласно этому изобретению могут быть включены в содержащие дрожжи композиции, такие как описанные в ЕР-А-0619947, ЕР-А-0659344 и \У0 02/49441.

Для включения в премиксы муки предпочтительно, чтобы полипептид согласно этому изобретению находился в форме сухого продукта, например непылящего гранулята, тогда как для включения вместе с жидкостью он предпочтительно находится в жидкой форме.

Один или несколько дополнительных ферментов могут быть также включены в это тесто. Этот дополнительный фермент может быть любого происхождения, в том числе из млекопитающего и растения, и предпочтительно имеет микробное происхождение (бактериальное, дрожжевое или грибное) и может быть получен способами, обычно используемыми в данной области.

В предпочтительном варианте осуществления, дополнительным ферментом может быть амилаза, например, альфа-амилаза (применимая для обеспечения сахаров, ферментируемых дрожжами, и задержки черствения) или бета-амилаза, циклодекстрин глюканотрансфераза, пептидаза, в частности экзопептидаза (применимые в усилении вкуса), трансглутаминаза, липаза/фосфолипаза/галактолипаза (применимые для модификации липолитических соединений, присутствующих в тесте или компонентах теста), оксидоредуктаза, целлюлаза, гемицеллюлаза, в частности пентозаназа, например ксиланаза (применимая для частичного гидролиза пентозанов, которая увеличивает растяжимость теста), протеаза (применимая для размягчении клейковины, в частности, при использования муки твердых сортов пшеницы), протеиндисульфидизомераза, например протеиндисульфидизомераза, описанная в \У0 95/00636, гликозилтрансфераза, пероксидаза (применимая для улучшения консистенции теста), лакказа, катехолоксидаза или другие оксидазы, например глюкозооксидаза, гексозооксидаза, альдозооксидаза, пиранозооксидаза, липоксигеназа или оксидаза Ь-аминокислот (применимые в улучшении консистенции теста).

Когда один или несколько дополнительных активностей ферментов должны быть добавлены в соответствии со способами данного изобретения, эти активности могут быть добавлены отдельно или вместе с полипептидом данного изобретения, необязательно в качестве компонента (компонентов) улучшающей хлеб и/или улучшающей тесто композиции. Другие активности ферментов могут быть любым из описанных выше ферментов и могут вводиться в дозах в соответствии с установленной практикой хлебопекарного производства.

Данное изобретение относится также к способам получения выпеченного продукта, предусматривающим выпекание теста, полученного по способу данного изобретения, для получения выпеченного продукта. Выпечка этого теста для получения выпеченного продукта может выполняться с использова

- 17 015438 нием способов, хорошо известных в данной области.

Данное изобретение относится также к тесту и выпеченным продуктам, полученным, соответственно, при помощи способов данного изобретения.

Данное изобретение относится дополнительно к премиксу, например, в форме мучной композиции, для теста и/или выпеченных продуктов, приготовленных из теста, где этот премикс содержит полипептид данного изобретения. Термин премикс определяется здесь так же, как он понимается в его общепринятом значении, т.е. как смесь агентов для выпечки, обычно включающая в себя муку, которая может быть использована не только в промышленных агентах для выпечки хлеба, обычно включающих в себя муку, которая может использоваться не только в промышленных заводах/оборудованиях для выпечки хлеба, но также в пекарнях с розничным магазином-булочной. Этот премикс может быть приготовлен смешиванием полипептида или улучшающей хлеб и/или улучшающей тесто композиции этого изобретения, содержащей полипептид, с подходящим носителем, таким как мука, крахмал, сахар или соль. Этот премикс может содержать другие улучшающие тесто и/или улучшающие хлеб добавки, например любые из добавок, в том числе ферментов, упомянутых выше.

Данное изобретение дополнительно относится к хлебопекарным добавкам в форме гранулята или агломерированного порошка, которые содержат полипептид данного изобретения. Предпочтительно хлебопекарная добавка имеет узкое распределение размеров частиц с более чем 95 мас.% частиц, в диапазоне от 25 до 500 мкм.

В приготовлении теста и хлеба данное изобретение может быть использовано в комбинации с технологическими вспомогательными средствами, определенными здесь выше, такими как химические технологические вспомогательные средства, такие как окислители (например, аскорбиновая кислота), восстановители (например, Б-цистеин). фосфолипазы и/или другие ферменты, такие как модифицирующие полисахариды ферменты (например, α-амилаза, гемицеллюлаза, ветвящие ферменты и т.д.) и/или модифицирующие белок ферменты (эндопротеаза, экзопротеаза, ветвящие ферменты и т.д.).

Было также обнаружено, что белок 0X1 01 может продуцировать пероксид водорода в тесте. Он использует неожиданно по меньшей мере 9,12,13-тригидрокси-10-октадеценовую кислоту в качестве субстрата с образованием посредством этого кетодигидрокси-10-октадеценовой кислоты. Этот субстрат присутствует, например, в муке и, следовательно, делает белок 0X1 01 особенно подходящим для хлебопечения.

Применение такого фермента в хлебопечении не было известно ранее. Таким образом, данное изобретение включает в себя также применение фермента, который катализирует окисление гидроксижирной кислоты, например моногидроксижирной кислоты, или дигидроксижирной кислоты, или тригидроксижирной кислоты, такой как 9,12,13-тригидрокси-10-октадеценовая кислота, с образованием посредством этого пероксида водорода в хлебопечении. Примером подобного типа фермента является алкогольоксидаза, например оксидаза вторичных спиртов или оксидаза изоамилового спирта.

В предпочтительном варианте осуществления фермент, способный окислять гидроксижирную кислоту, объединяют с липоксигеназой и/или пероксидазой.

Данное изобретение относится также к композиции, подходящей для применения в хлебопечении, содержащей фермент, способный окислять гидроксижирную кислоту, и липоксигеназу и/или пероксидазу. Предпочтительно фермент, способный окислять гидроксижирную кислоту, способен окислять 9,12,13-тригидрокси-10-октадеценовую кислоту. Более предпочтительно, ферментом, способным окислять гидроксижирную кислоту, является белок 0X1 01, даже более предпочтительно белок, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую 8Е0 Ш N0: 013.

Другое применение оксидоредуктаз в соответствии с данным изобретением является применением в области применений в молочном хозяйстве.

Обработка нагреванием молока всегда сопровождается некоторой степенью реакций Майяра, приводящих к развитию слегка коричневатого цвета обработанного молока. Хотя в некоторых случаях это может быть желательным (например, в кондитерских изделиях (ирисе) или карамели), обычно побурение является нежелательным. Реакция Майяра является результатом реакции редуцирующих сахаров, присутствующих в молоке, в особенности лактозы, глюкозы и лактозы, со свободными аминогруппами, которые присутствуют в молочных белках, таких как казеины или сывороточные белки.

Оксидоредуктаза 0X1 01 - 06 в соответствии с данным изобретением может быть использована для уменьшения реакции Майяра в молоке, полученных из молока продуктах или пищевых продуктах, содержащих такие полученные из молока продукты, при увеличенных температурах. Примером такой обработки является пастеризация молока для увеличения его стабильности при хранении. При низкотемпературной продолжительной пастеризации (БТБР), также называемой пастеризацией в ванне, молоко обычно выдерживают при 62,8°С в течение не менее чем 30 мин. В непрерывных процессах используют высокотемпературную краткосрочную пастеризацию (НТ8Т), в которой молоко выдерживают при не менее чем 71,7°С в течение минимально 15 с (или в эквивалентных условиях при более высокой температуре в течение более короткого периода времени). Более недавно развитой является пастеризация с ультранагреванием (ИНТ), в которой молоко нагревают по меньшей мере до 135°С в течение минималь

- 18 015438 но 1 с. Обработка ИНТ, но в меньшей степени также и обработка ЬТЬР и НТ8Т, требует очень строгого контроля температуры и процесса.

Другим примером подходящего применения для использования оксидоредуктазы данного изобретения является сырная паста на верхней части пиццы. Во многих случаях в лицевых отделках пиццы используют сыр типа Моцарелла. В этой области моцареллой называют пасту П1е1а. Многие производители пиццы выпекают пиццу при температурах >260°С. При таких высоких температурах склонность сыра к побурению стала конкретной проблемой производства моцареллы, так как производители моцареллы должны поставлять сыр, который не будет образовывать черных пузырей и коричневых зон при выпекании при этих высоких температурах. Этот эффект побурения обычно создавался остаточными количествами лактозы и особенно галактозы. В этой области известно, что существует коэффициент сильной корреляции между уровнями галактозы и цветом запеченного сыра, и в литературе упоминаются многочисленные попытки уменьшения уровня галактозы и лактозы в моцарелле. Эти уровни наиболее трудно контролировать и/или они могут увеличивать расходы или уменьшать выход.

Применение оксидоредуктазы по данному изобретению перед обработкой нагреванием уменьшает реакции Майяра, создавая эффективный способ контроля побурения молока во время обработки при повышенных температурах. Оксидоредуктазу данного изобретения предпочтительно добавляют на ранней стадии обработки молока, чтобы дать этому ферменту максимальное время для окисления редуцирующих сахаров. Поскольку этот фермент зависит от доступности кислорода, это раннее добавление является предпочтительным для создания возможности вхождения кислорода во время обработки молока и, следовательно, возможности высокого уменьшения уровней концентрации редуцирующих сахаров. Оксидоредуктаза по данному изобретению имеет широкую субстратную специфичность, делая возможным окисление широкого диапазона редуцирующих сахаров. Для применения в производстве молочных продуктов или содержащих молочные продукты пищевых продуктах оксидоредуктаза по данному изобретению способна эффективно окислять лактозу, глюкозу и галактозу.

Этот фермент может быть контактирован с более твердыми пищевыми продуктами, например с сыром, несколькими путями. Сыр может быть контактирован с этим ферментом во время процесса приготовления сыра добавлением фермента на некоторой стадии в процессе приготовления (например, добавлением к молоку сыра), что приводит к включению этого фермента в сырный матрикс. Этот фермент станет активным в присутствии кислорода; это может происходить до некоторой степени в самом сыре, но будет наиболее сильным во время и/или после обработки сыра, такой как нарезание или измельчение сыра на терке, которые приводят к значительному увеличению открытой для воздуха поверхности сыра и воздействия кислорода. Альтернативно, этот фермент может быть нанесен в виде спрея на содержащий сыр пищевой продукт перед нагреванием, предотвращая посредством этого реакции Майяра на поверхности, которая является местом, где реакции Майяра осуществляются в наибольшей степени. В этом случае фермент может быть обеспечен в растворе или дисперсии и нанесен в виде спрея на пищевой продукт. Раствор/дисперсия может содержать этот фермент в количествах 1-50 единиц ОХ1 01 - ОХ1 06/мл. Альтернативно, фермент может быть добавлен в сухой форме, такой как порошок.

Фермент, в сухой или в жидкой форме, может быть добавлен отдельно или в комбинации с другими добавками.

Неожиданно было обнаружено, что применение оксидоредуктазы этого изобретения может также уменьшать рост аэробных микроорганизмов в молоке, способствуя таким образом консервированию свежего молока. В таких случаях оксидоредуктаза может быть использована в качестве антимикробного агента в применениях для молочных продуктов, например в молоке, полученных из молока продуктах или пищевых продуктах, содержащих такие продукты.

Дополнительное преимущество применения оксидоредуктазы данного изобретения заключается в том, что образуются пероксиды. Известно, что такие пероксиды могут реагировать с белками, приводя к сшиванию белков (см., например, ЬА. Сеггагб, Тгепбк ίη Еооб 8аепсе & 1ес1то1оду (2002), 13, 391-399). Однако степень сшивания зависит от количества генерируемого пероксида водорода. Неожиданно оксидоредуктазы по этому изобретению способны к существенному сшиванию белков в молоке. Степень сшивания зависит также от предобработки субстрата, количества кислорода, доступного для окислениявосстановления и т.д. Сшивание белков имеет то преимущество, что продукты, содержащие сшитые белки, имели измененные структурные свойства, например водоудерживающую способность гелей, образованных из таких сшитых белков.

Примеры

Пример 1. Реологические тесты

По всему свету пекари используют фаринограф и экстенсограф для оценки реологических и технологических свойств теста.

Действие оксидоредуктазы на реологические свойства теста может быть измерено стандартными способами в соответствии с 1п1егпа11опа1 Аккоаайоп о£ Сегеа1 СйетщЦу (1СС) и Не Атепсап АккошаБоп о£ Сегеа1 СйетщЦу (ААСС), включающими в себя Кар1б УЬсо Апа1укег, способ с использованием фаринографа (ААСС 54-2, 1СС 115) и экстенсографа (ААсС 54-10, 1СС 114).

- 19 015438

Действительно, способ с использованием экстенсографа измеряет относительную силу теста. Сильное тесто дает более высокую и, в некоторых случаях, более длинную кривую экстенсографа, чем слабое тесто. Способ ААСС 54-10 определяет экстенсограф следующим образом: экстенсограф регистрирует кривую деформации растяжения для испытуемого куска теста, пока он не разрывается. Характеристики кривых деформации растяжения или экстенсограммы используют для оценки общего качества муки и его реакций на улучшающие агенты.

Способ с использованием фаринографа определяет поглощение воды конкретной мукой и устойчивость при замесе полученного теста. Более хорошие разновидности хлебопекарной муки и тесто будут обнаруживать более высокие величины фаринографа. Если конкретная мука обнаруживает относительно высокое поглощение воды и устойчивость при замесе полученного теста является хорошей, то кривая фаринографа показывает сохранение большей части, если не всей, начальной высоты на протяжении времени. Машинная обрабатываемость и хлебопекарное качество такого теста, по-видимому, являются превосходными. Способ ААСС 54-12 определяет фаринограф следующим образом: фаринограф измеряет и регистрирует устойчивость теста при замесе. Он используется для оценки абсорбции муки и для определения стабильности и других характеристик теста во время замеса.

Пример 2. Измерение содержания свободных тиолов теста

Действие окислительно-восстановительного фермента на образование поперечных сшивок тиоловых групп может исследоваться измерением содержания свободных тиоловых групп в тесте. Этот способ описан в Сегеа1 Сйет1кбу, 1983, 70, 22-26. Этот способ основан на принципе, что 5,5'-дитио-бис(2нитробензойная кислота) (ΌΤΝΒ) взаимодействует с тиоловыми группами в тесте с образованием сильноокрашенного аниона 2-нитро-5-меркаптобензойной кислоты, который измеряют спектрофотометрически при 412 нм.

Пример 3. Пробная нестандартная мини-выпечка

Пробную нестандартную мини-выпечку использовали для определения повышения силы клейковины. Для детектирования действия ферментов на повышение силы клейковины добавление химических окислительных агентов опускали. Все испытания выполняли в двух повторностях.

Рецепт

Ингредиенты

180 г

Мука КоПЫ (МепеЬа)

Мука 1Ыз (МепеЬа)

Свежие дрожжи (Копт§з§1з1)

Вода 59%

Соль 2% г

4,6 г

118 г

4г

Грибная амилаза Вакегуте Р500

Ксиланаза Вакегуте Н8Р6000

м.д.

м.д.

Процесс

Стадия процесса

Замес смеситель Ρϊη 6 мин 15 сек

Отвешивание х 150 г

Первое испытание

Формование афиайтепТ 16

Конечное испытание

Выпекание мин, комнатная температура тестоформующая машина Вейгапб збск пюиШег мин, 32°С, 85% относ.влажн.

мин при 240/235°С, 0,2 л пара

Мерой стабильности теста является отношение высота/ширина. При выпекании подового хлеба, в отсутствие окислительных агентов, это тесто не является стабильным и становится плоским и широким. Те же самые характеристики обнаружены в конечном (готовом) хлебе. Добавление ферментов, которые улучшают стабильность теста, приводит к более высокому отношению высота/ширина.

Во время технологического процесса производства хлеба качество хлеба оценивает пекарь. Отношения высота/ширина измеряют линейкой. Результаты оценивают статистически при помощи АN0VА, 8(а(цгарН1ск р1ик 5.1.

Пример 3.1

Оксидоредуктазы, имеющие аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕО Ш N0: 013, 014, 015, 016, 017 и 018, испытывали в пробных нестандартных мини-выпечках. Все испытания выполняли в двух повторностях. Все ферменты вводили в виде концентратов ультрафильтрации и испытывали при 5 мг общего белка на кг муки. Отрицательным контролем было тесто без добавления оксидоре

- 20 015438 дуктазы. Аскорбиновую кислоту (68 мМ) брали параллельно в качестве эталона. Результаты:

Отношение высота/ширина

0,55 а*

0,65 с

0,59 Ъ

0,59 Ъ

0,59 Ь

0,60 Ь

0,61 ъ

0,66 с

Добавление

Без оксидоредуктазы

ЗЕО ГО N0:013

8ЕС) ГО N0:014

Ж) ГО N0:015

8Е() ГО ΝΟ: 016

8Е<2 ГО N0:017

8Е<2 ГО ΝΟ: 018

Аскорбиновая кислота

Результаты с разными буквами являются статистически значимыми различиями при уровне доверия 90,0%. Способом, используемым для различения среди средних величин, является процедура наименьшего значимого различия Фишера (Ъ8Э).

Ясно видно, что батоны, содержащие оксидоредуктазы данного изобретения, обнаруживают лучшее отношение высота/ширина, чем батоны, не содержащие этих ферментов.

Пример 3.2

Действие доз фермента, содержащего аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 013, на отношение высота/ширина испытывали в пробных нестандартных мини-выпечках. Испытывали три дозы: 1, 2 и 3 мг общего белка/кг муки. Отрицательным контролем было тесто без добавления оксидоредуктазы. Аскорбиновую кислоту (68 мМ) брали параллельно в качестве эталона.

Результаты:

Доза ЗЕрГО N0:013 (мг общего белка/кг муки)

О

Отношение высота/ширина

0,63 а*

0,68 Ь

0,70 Ьс

0,72 с

Доза аскорбиновой кислоты (мг/кг)

0,72 с

Результаты с разными буквами являются статистически значимыми различиями при уровне доверительности 90,0%. Способом, используемым для различения среди средних величин, является процедура наименьшего значимого различия Фишера (Б8Э).

Найдено, что оксидоредуктаза согласно данному изобретению обнаруживает хорошую реакцию доза-ответ в отношении высота/ширина в нестандартных мини-выпечках. В сравнении с результатами примера 3.1 эти абсолютные величины отношений высота/ширина являются более высокими в этом испытании. Это связано с тем фактом, что испытание примера 3.1 выполнено с мукой из урожая 2005 г., а примера 3.2 с мукой урожая 2006 г.

Claims (29)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенный полинуклеотид, гибридизующийся с полинуклеотидом любой из 8ЕЦ ΙΌ N0: 001 006 или 8ЕО ΙΌ N0: 007 - 012.
2. 2. Выделенный полинуклеотид по п.1, гибридизующийся при условиях высокой строгости с полинуклеотидом любой из 8ЕЦ ΙΌ N0: 001 - 006 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 007 - 012.
3. 3. Выделенный полинуклеотид по п.1 или 2, получаемый из мицелиального гриба.
4. 4. Выделенный полинуклеотид п.3, получаемый из АкрегдШик шдег.
5. 5. Выделенный полинуклеотид, кодирующий оксидоредуктазу, содержащую любую из аминокислотных последовательностей 8ЕЦ ΙΌ N0: 013 - 018 или функциональные эквиваленты любой из них.
6. 6. Выделенный полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один функциональный домен оксидоредуктазы, содержащей любую из аминокислотных последовательностей 8ЕЦ ΙΌ N0: 013 - 018 или функциональные эквиваленты любой из них.
7. 7. Выделенный полинуклеотид, содержащий любую из нуклеотидных последовательностей 8ЕЦ ΙΌ N0: 001 - 006 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 007 - 012 или функциональные эквиваленты любой из них.
8. 8. Выделенный полинуклеотид, состоящий из любой из 8ЕЦ ΙΌ N0: 001 - 006 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 007 - 012.
9. 9. Вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность по пп.1-8.
10. 10. Вектор по п.9, где указанная полинуклеотидная последовательность по пп.1-8 функционально связана с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии указанной полинуклео

    - 21 015438 тидной последовательности в подходящей клетке-хозяине.
11. 11. Вектор по п.10, где указанной клеткой-хозяином является мицелиальный гриб.
12. 12. Способ получения полинуклеотида по пп.1-8 или вектора по пп.9-11, предусматривающий стадии культивирования клетки-хозяина, трансформированной указанным полинуклеотидом или указанным вектором, и выделения указанного полинуклеотида или указанного вектора из указанной клетки-хозяина.
13. 13. Выделенная оксидоредуктаза с аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0: 013-018 или функциональными эквивалентами любой из них.
14. 14. Выделенная оксидоредуктаза по п.13, получаемая из АкрегдШик шдег.
15. 15. Выделенная оксидоредуктаза, получаемая экспрессией полинуклеотида по пп.1-8 или вектора по пп.9-11 в подходящей клетке-хозяине, например АкрегдШик шдег.
16. 16. Рекомбинантная оксидоредуктаза, содержащая функциональный домен любой из оксидоредуктаз по пп.13-15.
17. 17. Способ получения оксидоредуктазы по любому из пп.13-16, предусматривающий стадии трансформации подходящей клетки-хозяина выделенным полинуклеотидом по пп.1-8 или вектором по пп.911, культивирования указанной клетки при условиях, позволяющих экспрессию указанного полинуклеотида, и при необходимости очистки кодируемого полипептида из указанной клетки или культуральной среды.
18. 18. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по пп.1-8 или вектор по пп.9-11.
19. 19. Рекомбинантная клетка-хозяин, экспрессирующая полипептид по пп.13-16.
20. 20. Очищенные антитела, реактивные с оксидоредуктазой по пп.13-16.
21. 21. Способ приготовления теста, предусматривающий добавление оксидоредуктазы по любому из пп.13-16.
22. 22. Способ получения выпеченного продукта из теста, приготовленного способом по п.21.
23. 23. Применение оксидоредуктазы по любому из пп.13-16 для получения теста и/или выпеченного из него продукта.
24. 24. Применение оксидоредуктазы по любому из пп.13-16 для получения молочных продуктов.
25. 25. Применение оксидоредуктазы по любому из пп.13-16 для уменьшения реакций Майяра в молочных продуктах.
26. 26. Применение оксидоредуктазы по любому из п.13-16 для предотвращения реакций Майяра в молочных продуктах.
27. 27. Применение оксидоредуктазы по любому из пп.13-16 в качестве антимикробного агента в молочных продуктах.
28. 28. Применение по п.27, отличающееся тем, что этот антимикробный агент используют для системы лактопероксидазы-тиоцианата в молоке.
29. 29. Применение по любому из пп.24-27, отличающееся тем, что молочными продуктами являются молоко или сыр.