ES2346226T3

ES2346226T3 - Uso de la eritropoyetina para la regeneracion de tejido hepatico.

Info

Publication number: ES2346226T3
Application number: ES04804424T
Authority: ES
Inventors: Augustinus Bader
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-12-30
Filing date: 2004-12-30
Publication date: 2010-10-13
Anticipated expiration: 2024-12-30
Also published as: RU2006120458A; US20110172150A1; EP2233150A2; JP2012067117A; RU2542391C2; EP1699915B1; EP1699915A1; PL1699915T3; JP2007517001A; AU2004309083A1; DK2233150T3; JP4903580B2; PT1699915E; DK1699915T3; ES2606068T3; DE502004011252D1; US7910547B2; AU2011200538A1; EP2233150A3; RU2010105646A

Abstract

Uso de eritropoyetina (EPO) para la producción de un fármaco para la promoción de la regeneración estructural acelerada de tejido hepático después de una hepatectomía quirúrgica realizada en el caso de tumores benignos y malignos, comprendiendo la regeneración la configuración de un árbol vascular alrededor de la superficie de resección, la nueva configuración de una arquitectura normal de lobulillos hepáticos, del tejido conjuntivo interlobular, de las venas centrales y las tríadas portales, así como la consecución del tamaño inicial del hígado.

Description

Uso de la eritropoyetina para la regeneración de tejido hepático.

La presente invención se refiere al uso de eritropoyetina para la inducción del crecimiento estructural de tejido en la regeneración hepática y reivindica las prioridades de la Solicitud de Patente Alemana 103 61 813.9-41 y la Solicitud de Patente Europea 03 029 961.4.

Durante la ontogénesis se exprimen factores de crecimiento, que pueden iniciar procesos estructurales fundamentales y numéricos con respecto al número de células para la constitución de un tejido. Sin embargo, en un organismo en crecimiento o adulto se pierde en gran medida la capacidad de constituir o regenerar tejidos estructuralmente y funcionalmente intactos en el caso de daños tisulares. Se supone que la expresión reducida de factores de crecimiento que, a su vez, controlan la expresión de proteínas necesarias para la constitución de tejido, es responsable de esta reducción de capacidad regenerativa.

Sin embargo, se sabe al menos de algunos órganos que mantienen incluso en el organismo adulto una capacidad de autoregeneración, que se puede inducir por procesos de lesiones. La capacidad regenerativa del hígado, a modo de ejemplo, ya se conoce desde la antigüedad. Casi todos los demás órganos son incapaces de salvar correspondientemente de por sí defectos estructurales para recuperar el tejido original.

El hígado se encuentra en el organismo adulto por regla general en un estado de reposo, es decir, no proliferante, en el que el órgano tiene que cumplir una diversidad compleja de distintas funciones metabólicas. Sin embargo, in vivo, se estimula al hígado por la pérdida de masa celular -por ejemplo, por un daño de células hepáticas o por una intervención quirúrgica para que crezca de nuevo.

Sin embargo, en la mayoría de los casos, el tejido hepático proliferante no sustituye las estructuras funcionales y anatómicas del órgano de la manera deseada, sino, por regla general, conduce a un aumento y una hipertrofia del tejido hepático restante, hasta que se haya sustituido la masa originaria de células hepáticas. La intensidad de la respuesta de crecimiento depende de la extensión de la pérdida de tejido. El transcurso temporal de la regeneración hepática, en este caso, está correlacionado de forma inversamente proporcional, es decir, las pequeñas pérdidas de células hepáticas se sustituyen lentamente, las grandes pérdidas de células hepáticas, de forma considerablemente más rápida.

La sustitución de la masa del órgano por la proliferación celular en solitario, por tanto, no representa una base suficiente para la terapia de un paciente con un daño considerable del órgano. Por tanto, se conocen diferentes puntos de partida para la inducción de un crecimiento estructural -es decir, para un crecimiento con creación de formas- de tejidos que, sin embargo, en su totalidad todavía no han conducido a un éxito satisfactorio. Sin embargo, un crecimiento estructural de células, de este tipo, tendría una importancia considerable, particularmente para métodos terapéuticos o biotecnológicos.

En el pasado se intentó inducir el crecimiento de células mediante la administración de factores de crecimiento como, por ejemplo, "Epidermal Growth Factor" (EGF), "Vascular Endothelial Growth Factor" (VEGF) o "Hepatocyte Growth Factor" (HGF). Sin embargo, el efecto de estos factores sobre la proliferación de células primarias in vitro está limitado. Su utilización in vivo, al contrario, debido a sus posibles efectos secundarios -por ejemplo, la activación de oncogenes- no es poco problemático.

Otro punto de partida se basa en el uso de complejos extractos tisulares heterólogos, por ejemplo, de la hipófisis o del hipotálamo, para la inducción de la proliferación celular, a modo de ejemplo, de hepatocitos cultivados (véase, por ejemplo, el documento US 6.008.047). El uso de extractos tisulares animales o humanos, sin embargo, es problemático teniendo en cuenta enfermedades virales contagiosas como, por ejemplo, EEB, virus de cerdo y/u oveja, en el funcionamiento del laboratorio o en la aplicación clínica y documenta más bien los conocimientos deficientes con respecto a los procesos que forman parte en la constitución de estructuras complejas de órganos y con respecto a los factores realmente relevantes y sus potenciales de utilización y actuación. Además, los extractos se pueden definir difícilmente con respecto a su calidad, debido a que la misma depende, entre otras cosas, de la fuente y sus condiciones de cultivo.

Sin embargo, los pocos conocimientos obtenidos a partir de las aplicaciones clásicas de los cultivos tisulares primarios tampoco se pueden transferir inmediatamente a los planteamientos del estudio técnico de tejidos. Por regla general, el estudio técnico de tejidos parte, de modo ideal, de sistemas celulares adultos específicos para un paciente, que ya están más diferenciados que las células fetales o embrionarias. Además, en el caso del estudio técnico de tejidos se trata tanto in situ como in vitro de situaciones de cultivo combinado que, en la aplicación clásica, no se tienen en cuenta. Al contrario, incluso se intenta más bien evitar cultivos combinados de células endoteliales, macrófagos y fibroblastos, tal como existen en el hígado, durante la expansión de las células hepáticas parenquimatosas, debido a que no son deseados.

A partir del documento WO 02/092013 A2 se conoce cómo administrar a un paciente, para el tratamiento de daños hepáticos, una cantidad terapéuticamente eficaz de hormonas del crecimiento (Growth Hormone, GH), para promover de este modo la capacidad regenerativa natural del hígado. De acuerdo con eso, la GH tiene el efecto de acelerar la expresión del factor de crecimiento Fox M1B en hepatocitos y, de este modo, iniciar de nuevo el crecimiento hepático.

Sin embargo, la hormona del crecimiento tiene un efecto muy amplio y, por tanto, no específico sobre el crecimiento de tejidos. Por lo tanto, por la administración de GH se producen también efectos secundarios o sobrerreacciones no deseados, por ejemplo, en forma de la denominada acromegalia, es decir, una osificación excesiva con estados óseos patológicos. Además, se ha dado a conocer mientras tanto que Fox1M se regula positivamente en carcinomas basocelulares. Las proteínas de Fox desempeñan un papel importante en la regulación de los genes del crecimiento durante la proliferación, diferenciación y la transformación, entre otras cosas, también durante la activación de las denominadas vías de señal de SONIC HEDGEHOG (Shh). Éstas, a su vez, están involucradas en la activación de carcinomas basocelulares en la piel humana. De este modo, Teh et al. podían mostrar (Cancer Research 2002, agosto 15; 62 (16): 4773-80) que la regulación positiva de FoxM1 en carcinomas basocelulares es uno de los mecanismos de iniciación esenciales, por lo que las vías de señal de SONIC HEDGEHOG ejercen efectos mitógenos en los queratinocitos basales, por lo que se produce un desarrollo del carcinoma ulcerado humano muy extendido. Este potencial tumoral de antagonistas de FoxM1 y la especificidad insuficiente y la presencia ubicua en todos los tejidos se opone por tanto a la administración de GH para la promoción de la regeneración hepática.

El documento WO 2004/001023 describe, entre otras cosas, que la EPO y TPO provocan una inducción de procesos estructurales in vivo o in vitro, pudiendo iniciar y terminar los mismos con una administración local o sistémica, particularmente cuando se inicia a través del efecto inductivo de un implante in situ a una proliferación celular localmente específica.

Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención poner a disposición un método que induce y promueve el crecimiento estructural de tejido hepático después de hepatectomías como consecuencia de tumores. Este crecimiento debe conducir preferiblemente a una capacidad de funcionamiento esencialmente funcional y estructural del tejido afectado.

De acuerdo con la invención se resuelve este objetivo por la utilización de eritropoyetina, sus derivados o análogos o partes para la regeneración hepática estructural y funcional. En una realización particularmente preferida se administra eritropoyetina (EPO) o un derivado, partes o un análogo de la misma.

Sorprendentemente, se ha demostrado que por la aplicación del factor de crecimiento hematopoyético EPO no sólo activa una proliferación de las células, sino, también un crecimiento estructural. Este crecimiento empieza particularmente en tejidos anteriormente traumatizados. El crecimiento inducido de este modo conduce in vivo a una regeneración tisular en el sentido propio de la palabra, es decir, no sólo se produce un crecimiento proliferativo, sino un crecimiento dirigido diferenciado para la constitución de estructuras complejas.

Fundamentalmente, el uso de la EPO para la regeneración tisular se basa esencialmente en dos efectos de la EPO que hasta ahora no se conocían, de hecho, por un lado, en la estimulación del crecimiento estructural de una forma sincrónica y coordenada de diferentes tipos celulares entre sí y unos con los otros (como, por ejemplo, fibroblastos, células musculares lisas con células endoteliales en la zona de los vasos junto con una nueva formación de la arquitectura de todo un vaso, teniendo en cuenta la matriz extracelular (colágeno, elastina, fibronectina, entactina)) y una complementación de la unión tisular parenquimatosa real. Esto incluye, por ejemplo, la configuración de hepatocitos con las células de Kupffer, células de Pit, de Ito y endoteliales unidas (las denominadas células no parenquimales del hígado). Además de la configuración de un árbol vascular real y sus interconexiones se induce, por tanto, una regeneración tisular en el sentido de la restitutio ad integrum.

En el hígado, esto conduce a una mezcla de capilares sinusoidales en la zona del lecho capilar y vasos vasculares de suministro y evacuación, además de la unión parenquimal real de los hepatocitos en una estructura de 3-D ordenada.

Como ya se ha descrito, el efecto del factor de crecimiento hematopoyético EPO se produce particularmente en tejidos y células traumatizadas. En este caso, se define el término del traumatismo como antítesis del proceso de la histogénesis (formación de tejido). Por consiguiente, se trata en el caso de un traumatismo de un proceso que contrarresta la histogénesis como proceso de formación de tejido en el organismo individual en las ubicaciones correspondientes o anula el resultado de la histogénesis. El traumatismo como daño tisular se puede iniciar por una pluralidad de acontecimientos, por ejemplo, por lesiones, inflamaciones o por enfermedades autoinmunes con autolesión. Estos daños o destrucciones tisulares inician a su vez una pluralidad de reacciones, por ejemplo, la activación de macrófagos, mastocitos y células inmunocompetentes, que secretan factores quimiotácticos, vasoactivos y promotores de cicatrización y, de este modo, regulan mecanismos sistémicos y regioselectivos.

Las ventajas del uso de la EPO abarcan la regeneración de tejidos de los cuatro tipos de tejido básico, de hecho, del tejido conjuntivo, del tejido muscular, del tejido epitelial y del tejido nervioso. Estos tejidos se derivan de forma ontogénica a partir del mesodermo (tejido conjuntivo, músculo, endotelio (como forma especial del epitelio)), el endodermo (el epitelio que reviste el tracto gastrointestinal) o el ectodermo (tejido nervioso). En el pasado se mostró que el receptor de EPO se exprime tanto sobre células de origen mesodérmico como endodérmico, así como sobre células neuronales.

En estos tejidos, el uso de EPO conduce a un reclutamiento local de la población de progenitores (células madre) específica para el tejido, la migración de las células y la diferenciación o transdiferenciación de las células en células parenquimales y estructurales. Durante y antes de esta formación de tejido se proliferan las células por la administración de EPO.

Durante la aplicación del uso de acuerdo con la invención de EPO para la regeneración hepática se puede conseguir un nuevo complemento del órgano previamente dañado hasta una completa unión tisular parenquimatosa, incluso la configuración de hepatocitos con células de Kupffer, células de Pit, de Ito y endoteliales. Por tanto, con la configuración adicional de un árbol vascular de acuerdo con la invención es posible la regeneración tisular como restitutio ad integrum.

Una ventaja particular del uso de acuerdo con al invención de EPO se basa por lo tanto en que no solamente se estimula la capilarización microscópica del tejido que se está regenerando a través de una ramificación endotelial, sino, también la regeneración parenquimal y la configuración de las estructuras de las paredes. Solamente esto conduce al resultado deseado del crecimiento tridimensional coordenado para la constitución de un órgano con capacidad de funcionamiento.

Por lo tanto, el uso de acuerdo con la invención se basa en un efecto de EPO que supera en gran medida el efecto de EPO conocido hasta ahora como factor angiogénico sobre la proliferación de células endoteliales (Journal of Nephrology 2002 15, 97 a 103). Sin embargo, debido a que las estructuras microvasculares como capilares y sinusoides consisten solamente en un revestimiento de células endoteliales y no presentan ninguna estructura propia de pared, y teniendo en cuenta el efecto angiogénico de la EPO, hasta ahora solamente se ha podido especular sobre si la EPO también podría tener cierta importancia en la formación de nuevos vasos y en la cicatrización (Journal of Nephrology 2002 15, 97 a 103). Sin embargo, no se ha producido una fundamentación de esta especulación hasta la fecha.

Por lo tanto, con respecto a lo presente es aún más importante que por primera vez se logró la verificación del efecto de la EPO sobre el crecimiento sincrónico y coordenado de los propios vasos, es decir, incluso la configuración de la estructura de pared y la regeneración parenquimal.

Una ventaja adicional del uso de EPO consiste en que el crecimiento estructural no necesita obligatoriamente una estructura tridimensional predefinida orgánica o inorgánica como punto de partida, sino, más bien crea una estructura (parcial) del órgano de novo. Por tanto, la aplicación del factor de crecimiento hematopoyético puede inducir una autoregeneración considerablemente acelerada de un tejido dañado, lo que tiene una gran importancia en la aplicación clínica-terapéutica.

En una realización particularmente ventajosa se utiliza el factor de crecimiento hematopoyético para inducir la regeneración de un tejido que presenta zonas traumáticamente dañadas. De este modo, en estas secciones de tejido no sólo se estimula un cierre de la herida por la configuración de un tejido granular con la angiogénesis que se está iniciando, sino, la formación nueva de la estructura tridimensional específica para el tejido de una matriz extracelular, por ejemplo, de colágeno, elastina, fibronectina o entactina.

De acuerdo con la invención se utilizan como factores de crecimiento hematopoyéticos EPO o sus partes, derivados o análogos. También son adecuados sus péptidos miméticos (véase a continuación).

En el caso de los factores de crecimiento hematopoyéticos se trata de proteínas de haz de cuatro hélices con giro a la izquierda con una orientación arriba-arriba-abajo-abajo con dos bucles abarcadores que unen las dos primeras y las dos últimas estructuras de hélice entre sí (Livnah O. et al., Science 1999, 283 (5404): 987-90 y Ultsch M. H. et al., Blood 1995, 86 (2): 540-7. Los respectivos dominios de RBD (dominios que enlazan receptores) poseen una homología pronunciada con EPO. La trombopoyetina, eritropoyetina y hormonas del crecimiento se enlazan con el complejo de receptores de MPL. En la publicación de Youssoufianh et al. en Blood 1993, 819 2223 bis 36, Structure function and activation of the Erythropoietin receptor se describe una dimerización productiva. La eritropoyetina y trombopoyetina, los péptidos miméticos (EMP y DMP) y, además, moléculas pequeñas no peptídicas asimismo son funcionales, aunque sea a una base molar más baja (publicaciones: Wrighton NC et al. Small peptides as mimetics of the protein hormone erythropoietin Science 1996, 273 (5274) 458-64 y Cwirla S. E. et al. Peptide agonist of the thrombopoeitin receptor as potent as the natural cytokine, Science 1997, 27653191696-9 y Qureshi S. A. et al. Mimicry of Erythropoietin by non peptid molecules, Proceedings National Academy of Sciences PNAS USA 1999, (9621): 12156-61). El enlace de EMP 1 con el receptor se produce en sitios de enlace, que son homólogos de los puntos de acceso de las uniones de receptores de hormonas del crecimiento. Las secuencias estructurales de trombopoyetina se describen con detalle en el documento EP 1 201 246 A2. Las secuencias estructurales de la eritropoyetina se describen con detalle en la Solicitud de Patente Europea EP 84 308 654.7.

En una realización particularmente ventajosa se usa EPO que estimula in vivo la formación de eritrocitos así como la división celular y la diferenciación de células precursoras de eritrocitos. La EPO se puede aislar de orina o producir de forma recombinante. La producción de una EPO humana recombinante es objeto del documento WO 86/03520. Además, la EPO es objeto de los documentos EP 0 148 605, EP 0 205 564, EP 0 209 539, EP 0 267 678 o EP 0 411 678.

Sin embargo, se pueden utilizar también derivados de la EPO nativa o recombinante. De esta manera, a modo de ejemplo, se conoce un derivado de EPO (documento EP 0 640 619 B1), que presenta sitios adicionales de glicosilación y, por tanto, una proporción más alta de hidratos de carbono con 22 restos de ácido siálico. La ventaja de esta modificación consiste en que, con una proporción elevada de ácido siálico, se aumenta el periodo de semidesintegración de la EPO en el plasma, debido a que solamente una EPO no sializada se puede enlazar con el receptor de galactosa involucrado en la disgregación de EPO en el hígado. Este derivado de EPO -que se conoce con la abreviatura de NESP (Novel Erythropoiesis Stimulating Protein o darbepoetina)- presenta, eso sí, en comparación con la EPO recombinante una secuencia de aminoácidos modificada en cinco posiciones. Sin embargo, corresponde, con respecto a su efecto sobre la estimulación de la formación de eritrocitos, esencialmente a la EPO nativa o recombinante (Fisher, J. W.: Erythropoietin: Physiology and Pharmacology Update. Erythropoietin 2003, 1-14). Se hace referencia al documento EP 0 640 619 B1 en todo su alcance con respecto a la estructura y la producción de la NESP.

La NESP también se puede conjugar químicamente, para una prolongación adicional del periodo de semidesintegración in vivo, ventajosamente, con polietilenglicol (PEG), sin que esto conlleve una modificación de la actividad biológica. Se conoce una NESP modificada de esta manera por el documento WO 01/76640, al que se hace referencia en todo su alcance con respecto a la estructura y la puesta a disposición de este derivado de EPO.

A partir de los documentos WO 02/49673 A2 y WO 01/02017 A2 se conocen asimismo derivados pegilados de la EPO que, además del periodo de semidesintegración prologando en plasma, también muestran una eficacia clínica más alta. Con esta finalidad, se introducen, a modo de ejemplo, por una mutagénesis dirigida de 1 a 6 sitios de glicosilación adicionales en la secuencia de aminoácidos de EPO. También se puede utilizar este derivado de acuerdo con la invención.

De acuerdo con la invención, la EPO se puede utilizar tanto en su forma humana como no humana.

Los factores de crecimiento hematopoyéticos se pueden utilizar ventajosamente también para el desarrollo de cultivos tisulares in vitro. Con esta finalidad, se cultivan las células en dispositivos y métodos particularmente adecuados para el tejido, a modo de ejemplo, sobre una rejilla con una estructura de malla cortante con un tamaño de 500 m, para permitir que se produzcan continuamente nuevos agregados secundarios de hepatocitos. Las combinaciones de EPO con GH son ventajosas, particularmente in vitro.

Particularmente, se pueden utilizar sistemas de bombeo sin contacto, automáticos o controlados manualmente que, por ejemplo, consisten en bombas de émbolo o producen corrientes dirigidas, producidas de forma magnética o por la compresión por aire comprimido de tubos flexibles. Con la presencia de células endoteliales se puede producir, por la tensión de cizalla en un birreactor sometido a perfusión, una confluencia espontánea de las células endoteliales sobre las superficies de los agregados, lo que puede ser ventajoso para la utilización posterior.

Para el encapsulado son adecuados los materiales apropiados que conoce un experto en la materia, en los que se integran, a modo de ejemplo, formas estructuradas o espacios que posibilitan una estructura de crecimiento o un aumento in situ. De forma alternativa se puede prescindir de la cápsula y, a modo de ejemplo, con la presencia de células endoteliales se puede conseguir una endotelización y, por lo tanto, una hemocompatibilidad óptima.

La administración de EPO conduce en solitario, o en el caso de defectos estructurales mayores también junto con materiales de armazón, a una sustitución tisular biológica. Estos materiales de sustrato pueden estar previamente poblados, in vitro o de manera extracorpórea, ser moldeables biológicamente (biodegradables) y se parecen, con respecto a su estructura microscópica y macroscópica y de forma bioquímica, en el caso ideal, en la mayor medida posible a la estructura que se tiene que sustituir. La cercanía o identidad bioquímica incluye una reconstrucción de la composición in vivo por colágenos y proteínas de matriz (elastina, fibronectina y todos los componentes de matriz del cuerpo en una imprimación específica para el tejido, como se conoce).

Las células madre se pueden obtener a partir de diferentes fuentes presentes en el cuerpo del paciente: médula ósea, sangre periférica, tejido adiposo y el propio tejido, sangre o tejido de cordón umbilical. Las células madre alógenas se pueden conseguir correspondientemente, sin embargo, conllevan desventajas inmunológicas. Se pueden usar células embrionarias no humanas, sin embargo, conllevan las desventajas correspondientes.

El método es particularmente adecuado para células adultas, es decir, células diferenciadas primariamente, que ya no posean ningún fenotipo embrional o fetal. Son particularmente adecuadas como células adultas humanas, a modo de ejemplo, células progenitoras adultas y células específicas para un tejido, preferiblemente hepatocitos.

Es particularmente ventajoso utilizar la invención de forma local in vivo. Con esta finalidad, se pueden aplicar los factores de crecimiento, por ejemplo, sobre la superficie de resección de un órgano (hígado). Se pueden aplicar de forma tópica o por medio de la ayuda de un catéter de forma local o sistémica. En el caso de una hepatectomía se pueden aplicar de forma alternativa o complementaria antes, durante o después de la intervención. Asimismo es posible inyectar los factores de crecimiento (por ejemplo, para la promoción de la regeneración cartilaginosa) directamente en el tejido o la articulación afectada. De este modo, los factores de crecimiento pueden actuar a través del líquido sinovial directamente sobre la formación de una nueva estructura cartilaginosa.

En una realización adicional se pueden administrar, además de los factores de crecimiento hematopoyéticos, uno o varios de los siguientes factores de crecimiento: "se pueden usar el factor de Crecimiento de Transformación beta" (TGF beta), prostaglandina, factor estimulante de colonias de granulocitos (y macrófagos) (G(M)-CSF (del inglés Granulocyte (Macrophage) Colony-Stimulating Factor)), "Hormona de Liberación de la Hormona del Crecimiento" (GHRH), "Hormona de Liberación de Tirotroina" (TRH), "Hormona de Liberación de Gonadotropina" (GnRH), "Hormona de Liberación de Corticotropina" (CRH), dopamina, "Hormona Antidurética" (ADH), oxitocina, prolactina, adrenocorticotropina, tropina de células beta, luteotropina y/o vasopresina o, adicionalmente, uno o varios factores de regeneración nerviosa, preferiblemente "factor de crecimiento nervioso" (NGF) y/o uno o varios factores de regeneración vascular, preferiblemente "Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular" (VEGF) y/o "Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas" (PDGF).

Los factores de crecimiento hematopoyéticos se pueden aplicar de forma parenteral como esferas microscópicas inyectables, partículas erosionables, compuestos de polímero (con polipéptido, ácido poliglicólico), liposomas y pequeñas partículas. Asimismo, son posibles aparatos de suministro de fármaco inyectables o implantables. Las sustancias también se pueden inhalar, inyectar de forma subcutánea o intramuscular o, para la aplicación tópica, administrarse como un parche cutáneo.

Se sabe que a partir de proteínas se pueden preparar preparaciones mezcladas. Son posibles suspensiones, emulsiones-gel, compuestos de sólidos, los polvos deshidratados y liofilizados. Los factores de crecimiento se pueden absorber sobre partículas o encapsularse.

Puede ser particularmente ventajoso utilizar células madre (progenitoras en el sentido propio de la palabra) junto con EPO para la regeneración tisular, para acelerar de este modo considerablemente el reclutamiento de las células tisulares de los 4 tipos de tejido básico para el proceso de regeneración. La EPO, así como los otros factores que se han mencionado, se puede aplicar de forma mezclada con células madre y, por ejemplo, adhesivo de fibrina como matriz de sustrato. Cuando sea necesario, se puede omitir la matriz de sustrato o sustituirse por una matriz de sustrato previamente estructurada y moldeada de forma más intensa. Los factores se pueden administrar también sin ninguna matriz de sustrato biológica, por ejemplo, solamente en una suspensión acuosa, de forma sistémica o tópica.

La administración de acuerdo con la invención de EPO mejora esta regeneración tisular por una imprimación específica para el tejido de las células madre y una diferenciación después de una proliferación e integración, y coordina el crecimiento con respecto a los tipos de tejido básico.

I. Áreas de aplicación Hígado

Después de infecciones virales del hígado (por ejemplo, hepatitis A, B, C, D) se pueden producir defectos de regeneración del hígado. La cirrosis hepática representa el periodo terminal de un defecto de la regeneración del hígado, en cuyo caso se ha producido una sustitución con tejido conjuntivo de las células parenquimatosas, debido a que la regeneración propia del cuerpo no puede seguir el paso de la velocidad de un daño debido a los efectos noccivos de una regeneración continua.

Después de traumatismos e intervenciones quirúrgicas, por ejemplo, con resecciones de tumores del hígado, se produce una pérdida aguda de tejido viable y una destrucción de tejido.

De acuerdo con la invención, después de la administración de EPO se produce una regeneración acelerada de los hepatocitos y células no parenquimáticas del hígado hasta una restitutio ad integrum. Para esto, es característica la nueva configuración de una arquitectura normal de lobulillos hepáticos, la nueva configuración del tejido conjuntivo interlobular, de las venas centrales y las tríadas portales: en ese lugar, se recuperan de forma reconocible las vías biliares, vasos linfáticos, el tejido conjuntivo periportal, arterias y la vena interlobularis, además de las células
hepáticas.

Se recupera la configuración específica del entramado interlobular de fibras de reticulina y los sinusoides hepáticos. La constitución histológica, después de la regeneración, muestra la típica estructura columnar. Las fenestraciones en la zona de las células endoteliales indican una típica característica hepática. Después de un traumatismo, son células iniciadoras importantes las células de Kupffer, que liberan IL-6, IL-1 y TNF-alfa.

La administración de EPO conduce a procesos de regeneración considerablemente más elevados incluso en comparación con tejido hepático de hígados ontogenéticamente jóvenes. Se consiguen aumentos in vitro en un factor de 10 a 30.

II. Ejemplos de realización 1. Trasplante celular Hepatocitos

Las células hepáticas se aíslan por la digestión de colagenasa de la manera habitual a partir de órganos que no se pueden trasplantar o partes resecadas del hígado. (Bader, A., Rinkes, I. H. B., Closs, I. E., Ryan, C. M., Toner, M., Cunningham, J. M., Tompkins, G. R., Yarmush, M. L. (1992) A stable long-term hepatocyte culture system for studies of physiologic processes: Cytokine stimulation of the acute phase response in rat and human hepatocytes. Biotechnol Prog. 8, 219-225).

Las células aisladas o previamente cultivadas se almacenan en nitrógeno líquido. Después de descongelar las células de acuerdo con protocolos conocidos (Karim, N., Allmeling, C., Hegstler, J.-G., Havrich, A., Bader, A. (2000) Diazepam metabolism and albumin secretion of porcine hepatocytes in collagen-sandwich after cryopreservation. Biotechnol Letters 22: 1647-1652) se mezclan la suspensión/los cultivos de hepatocitos con 100-150 UI/kg de peso corporal de epoetina alfa (con referencia al receptor). Con esta finalidad, se añade epoetina alfa en una disolución estéril con un volumen de 1-1,5 ml a 10 ml de una suspensión de hepatocitos con una concentración de 2-10 millones de células/ml.

Esta suspensión se inyecta lentamente de forma intraportal (1 ml/minuto). La suspensión se puede mezclar adicionalmente con 1000 UI de heparina, para evitar la formación de trombosis.

De forma alternativa, la mezcla de células/EPO se puede inyectar también debajo de la cápsula fibrosa perivascular del hígado o directamente en el parénquima hepático en varios sitios. Con esta finalidad, se recomienda aumentar la concentración de los hepatocitos en un factor de 2-5 y reducir el volumen inyectado de forma correspondiente.

Los canales de punción se cierran con un adhesivo de fibrina habitual en el mercado (Baxter Tissucol). De forma alternativa, se puede usar un taponamiento con tela no tejida de colágeno. Para el taponamiento se puede utilizar asimismo la disolución de epoetina alfa. Hay que tener cuidado de que el taponamiento siga permaneciendo seco en el sitio de adhesión.

El adhesivo de fibrina representa una mezcla de 2 componentes. Habitualmente, un componente consiste en fibrinógeno y, el otro, en una disolución de activación con Ca^{++} e inhibidores de proteinasa (por ejemplo, Aprotinina). A la disolución de activación se le puede añadir epoetina alfa, mezclándose para conseguir una concentración terminal de 100-150 UI/kg de peso corporal.

De forma análoga, se pueden usar células madre de médula ósea, tejido adiposo, un parénquima específico o sangre (producto limpiado de una capa leucoplaquetaria, células positivas para CD 34, sangre del cordón umbilical y células mesenquimáticas del tejido del cordón umbilical.

De forma paralela al trasplante celular en zonas dañadas de forma isquémica, tóxica, infecciosa o mecánica (traumática), las células se pueden introducir en un adhesivo de fibrina o plasma autólogo y se puede inducir la polimerización añadiendo epoetina alfa (100-150 UI/kg de peso corporal).

De forma paralela a esto se puede iniciar una administración de, respectivamente, 10000 UI de EPO s.c, de manera que en total se aplican 40000 UI en el transcurso de una semana.

El resultado es una regeneración tisular aumentada en un factor de 2-3, que conduce a una reparación estructural.

2. Administración posoperatoria

La epoetina alfa se añade en este caso con una concentración de 100-150 UI/kg de peso corporal.

Por la administración de EPO se produce un aumento endógeno de la hormona del crecimiento en un factor de 2, por lo que se acelera la generación tisular después de una cirugía. La restitutio ad integrum se produce aproximadamente 1-2 semanas antes en comparación con pacientes tratados sin la administración de EPO.

La EPO también se puede administrar después de un trasplante por bipartición hepática o un trasplante de hígado para la inducción de la regeneración hepática.

Después de un trasplante de hígado puede ocurrir que el tejido trasplantado -o, en el caso de donantes vivos- el tejido restante no esté disponible suficientemente rápido y con una masa suficiente como tejido activo. En este caso, ya 24 h antes de la cirugía y en el momento de la cirugía y después en intervalos de 24 horas se pueden administrar 100-150 UI/kg de peso corporal de epoetina alfa. De este modo, se produce una regeneración hepática considerablemente acelerada, en la que de forma posoperatoria, particularmente en el 4º-5º día, se puede diagnosticar un aumento del volumen por ultrasonidos.

3. Administración después de una hepatectomía quirúrgica en el caso de tumores benignos y malignos

En el caso de una hepatectomía extensa existe la necesidad de conseguir una regeneración acelerada, debido a que la disposición de una masa celular suficiente es importante para la supervivencia del paciente. Después de una resección quirúrgica se puede administrar, por administración sistémica, 100-150 UI/kg de peso corporal de epoetina alfa o una cantidad correspondiente para una aplicación tópica (en adhesivo de fibrina o plasma).

Cuando se sospecha que existe una afección tumoral persistente o metástasis tumorales que no se pueden resecar, se pueden administrar tanto de forma sistémica como tópica, de acuerdo con el tipo del tumor y el pronóstico, agentes citostáticos habituales en combinación con EPO.

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Después de la resección y administración de EPO, en el grupo tratado se produce un crecimiento acelerado del tamaño del 30% con respecto a un grupo no tratado. Sobre todo los hepatocitos de las superficies de resección entran de forma potenciada en el proceso de crecimiento estructural. Se produce una configuración completa del árbol vascular y del tejido que se sitúa alrededor del mismo. En este caso, los hepatocitos se disponen del modo típico correspondiente al órgano normal en lóbulos con vascularización, plaquetas celulares con células no parenquimatosas (células de Kupffer, de Pit, de Ito y endoteliales).

Se produce un crecimiento sistémico del tamaño. El crecimiento del tamaño termina cuando se consigue el tamaño inicial.

El grupo con la administración de EPO perioperatoria presenta ya en el día 1-2 después de la operación un valor de Hb aproximadamente 0,5 g/dl más alto. Esto se debe evaluar como una señal del efecto conocido de la EPO. Sin embargo, de forma paralela se produce una regeneración hepática. En este caso, no sólo proliferan los hepatocitos, sino todos los tipos celulares y, sobre todo, también las estructuras del tejido conjuntivo, que representa el armazón arquitectónico del hígado.

Ejecución del Ensayo

Se dividieron 28 cerdos hembra (peso 40,0-62,0 kg) de acuerdo con el principio aleatorio en tres grupos. La retirada parcial del hígado en el lado izquierdo se realizó con la técnica de la endoscopia abdominal.

Al grupo de control (n=16) no se administró EPO. Se administró al grupo 2 (n=6) una combinación de 10.000 unidades de EPO y un medio de obturación de fibrina (Quixil) localmente sobre la superficie de la hepatectomía. El grupo 3 se trató de la misma forma; sin embargo, los cerdos recibieron de forma adicional al tratamiento local con EPO 10.000 unidades de EPO de forma sistémica el día 0, 3, 7 y 11.

Se extrajeron muestras de hígado de la pieza de hígado recortada el día 0, 24 horas después de la resección de una zona 1 cm debajo de la superficie de resección, y 14 días después de la resección debajo de la superficie de resección y del lóbulo lateral derecho.

Para la identificación del antígeno Ki-67, PCNA (proliferating cell nuclear antigen = ANCP antígeno nuclear de células en proliferación) y apoptosis, se realizó el ensayo de inmunoperoxidasa con estreptavidina-biotina en el tejido hepático fijado con formalina e incluido en cera de parafina.

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(Tabla pasa a página siguiente)

Resultados

1

4. Endoprótesis o implantes optimizados (Ejemplo de comparación)

Los implantes pueden estar constituidos por materiales biológicamente degradables pero también permanentes. Un ejemplo para esto son endoprótesis metálicas, por ejemplo, en la zona de la cadera. Después de la producción de la forma metálica sin acabar, se consigue una estructuración microscópica por abrasión, un ataque químico o un tratamiento láser. De este modo, se pueden producir porosidades abiertas y asperezas en el intervalo de 1 a 50-60 \mum.

Estas estructuras se cargan posteriormente sobre una disolución de fosfato tricálcico beta de fase pura, de manera que se consigue un recubrimiento homogéneo de la superficie. Después, las estructuras se someten de forma ideal a un proceso de sinterización adicional, para fijar las estructuras de beta-TCP (del inglés tricalcium phosphate).

En las estructuras minerales, se pueden incorporar sales/azúcares solubles o inducir la formación de gas para conseguir porosidades interconectadas adicionales. Después de este proceso de fabricación, las estructuras se impriman o recubren con el factor de crecimiento de acuerdo con la invención o sus derivados, partes o análogos. Se pueden colocar depósitos de forma correspondiente en las superficies, llenándose las cavidades con EPO o usándose sustancias de liberación lenta. De forma alternativa, se puede recubrir directamente el implante que se ha retirado de forma estéril del embalaje antes del implante con EPO o sus análogos.

De este modo, se produce un proceso mejorado de unión tisular con el implante. El hueso se une de forma macrovascular y el implante se integra de forma acelerada y más sostenible en los huesos.

De forma parecida se pueden preparar implantes en la zona de la boca, mandíbula y cara (implantes dentales).

Es posible una unión con una populación celular en biorreactores con células madre.

Los implantes biológicos (vasos, válvulas cardiacas, piel) y membranas se pueden recubrir asimismo con EPO o GH o TPO.

5. Tratamiento de la osteoporosis (Ejemplo de comparación)

Los gránulos de fosfato tricálcico recubiertos por EPO se introducen mediante una punción con aguja en cuerpos vertebrales deficitarios/defromados en una disolución autóloga de plasma. En ese lugar, los gránulos se reconstruyen de forma acelerada en huesos endógenos y el proceso de degeneración se transforma en un efecto anabólico.

El efecto se puede usar también en el caso de cuerpos vertebrales en riesgo agudo de una rotura. Una combinación con un proceso de populación preferiblemente con células madre de la médula ósea autóloga o el periostio y sangre y/o tejido adiposo.

6. Indicación en regeneración cartilaginosa (Ejemplo de comparación)

Las células cartilaginosas representan tejidos intensamente braditróficos. Por un traumatismo regional y abrasión se producen procesos de inflamación, que pueden terminar en una artritis. La administración de EPO en la cavidad articular o de forma sistémica y/o en combinación con trasplantes celulares de condrocitos o cilindros osteocondriales promueve la regeneración tisular y la nueva conformación estructural. Es posible la administración combinada sistémica o subcutánea de 10000 UI/día.

7. Indicación en enfermedades cutáneas (Ejemplo de comparación)

De acuerdo con la invención, las heridas que se curan difícilmente se recubren con EPO o TPO (derivados, análogos, partes)después de la preparación del lecho de la herida de acuerdo con la invención. Para esto, se realiza preferentemente un desbridamiento mecánico. Se introducen en los coágulos de sangre 10 000 UI de EPO. Este proceso se puede repetir hasta que se haya limpiado el fondo de la herida.

El crecimiento estructural empieza después de 2-3 días y conduce a una configuración acelerada de un tejido de granulación.

8. Indicación en enfermedades intestinales inflamatorias (Ejemplo de comparación)

En el caso de fenómenos de inflamación del tracto intestinal con pérdida de peso y anemia se ha demostrado que la anemia no es un fenómeno secundario debido a la mala absorción entérica, sino que puede ser un síntoma concomitante de una carencia originaria de EPO. La administración de EPO en una cantidad de 10.000 UI/día conduce a una mejora de la recuperación intestinal/regeneración.

9. Indicación en regeneración neuronal (Ejemplo de comparación)

Después de la separación de la médula espinal, la EPO conduce a un crecimiento estructural de las neuronas y la nueva ramificación de los axones. La administración de vitamina C tiene un efecto auxiliar.

La EPO se puede administrar de forma regional junto con un adhesivo de fibrina/plasma autólogo y/o células madre propias del cuerpo (médula ósea, sangre CD 34, células adiposas, periostio, cordón umbilical).

10. Indicación en Parkinson/ejemplo de una enfermedad crónica con reacción de inflamación ya disminuida (Ejemplo de comparación)

Los macrófagos autólogos, que se activaron por la estimulación con partículas degradables, se integran de forma estereotáctica en áreas degeneradas. De forma paralela a esto se inyecta EPO (10 000 UI) junto con células madre autólogas (0,3 ml) en el área. De forma paralela a esto se administra EPO durante 2 semanas de forma sistémica. Este principio de estimulación de la inducción de una inflamación por macrófagos también se puede utilizar en el caso de otras enfermedades crónicas en las que no existe un traumatismo agudo o una reacción de inflamación aguda.

11. Cicatrización después de lesión por quemadura (Ejemplo de comparación)

En 8 pacientes lesionados con quemaduras, las quemaduras se curaron con la administración de EPO, con una rapidez un 50% mayor que el sitio de trasplante cutáneo de un donante. Se curaron heridas por quemadura profundas de segundo grado (grado 2B) en la cara sin la formación de cicatrices cuando se administró EPO a los pacientes. Sin la administración de EPO, las heridas de este tipo se curaron con la formación de cicatrices.

Claims

1. Uso de eritropoyetina (EPO) para la producción de un fármaco para la promoción de la regeneración estructural acelerada de tejido hepático después de una hepatectomía quirúrgica realizada en el caso de tumores benignos y malignos, comprendiendo la regeneración la configuración de un árbol vascular alrededor de la superficie de resección, la nueva configuración de una arquitectura normal de lobulillos hepáticos, del tejido conjuntivo interlobular, de las venas centrales y las tríadas portales, así como la consecución del tamaño inicial del hígado.

2. Uso de EPO de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el fármaco está previsto para la aplicación tópica o sistémica.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el fármaco está previsto para la aplicación combinada con un agente citostático.

4. Eritropoyetina (EPO) para el uso en un método para la regeneración estructural acelerada de tejido hepático después de una hepatectomía quirúrgica realizada en el caso de tumores benignos y malignos, comprendiendo la regeneración la configuración de un árbol vascular alrededor de la superficie de resección, la nueva configuración de una arquitectura normal de lobulillos hepáticos, del tejido conjuntivo interlobular, de las venas centrales y las tríadas portales, así como la consecución del tamaño inicial del hígado.

5. EPO de acuerdo con la reivindicación 4, para el uso tópico o sistémico.