ES2263382B1

ES2263382B1 - Matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de factores proangiogenicos.

Info

Publication number: ES2263382B1
Application number: ES200501182A
Authority: ES
Inventors: Jose Maria Lasso Vazquez; Paola Nava Perez
Original assignee: Fundacion para la Investigacion Biomedica del Hospital Gregorio Marañon
Current assignee: Fundacion para la Investigacion Biomedica del Hospital Gregorio Marañon
Priority date: 2005-05-16
Filing date: 2005-05-16
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2025-05-16
Also published as: US20090214613A1; EP1887080A4; EP1887080A1; ES2263382A1; WO2006123004A1; CA2608712A1

Abstract

Matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de factores proangiogénicos. La matriz comprende un gel de fibrina en el que se encuentran embebidas células endoteliales que han sido transfectadas in vitro con al menos un vector adenoviral que contiene la secuencia codificante de al menos un factor proangiogénico insertada de manera que puede sobreexpresarse en dichas células endoteliales. La inserción de dicha matriz entre un colgajo y su lecho receptor en un proceso de trasplante mejora las posibilidades de supervivencia de dicho colgajo, por ser capaz la matriz endotelizada de inducir la angiogénesis tanto en el colgajo como en el lecho receptor y mejorar así la vascularización de la zona transplantada.

Description

Matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de factores proangiogénicos.

Campo técnico

La presente invención se adscribe al campo de las matrices artificiales preparadas a partir de sustancias poliméricas presentes en la naturaleza, en las que se siembran y hacen crecer células, para su posterior utilización en intervenciones de cirugía plástica y reparadora.

Estado de la técnica

En los últimos años, el desarrollo de las técnicas microquirúrgicas, complementadas con mejores conocimientos de anatomía, ha supuesto uno de los grandes avances de los que se ha beneficiado la Cirugía Plástica y Reparadora. A pesar de ello, cuando se realizan reconstrucciones con colgajos existe un riesgo variable de necrosis de los mismos, en muchos casos por alteraciones de la vascularización. Los colgajos son tejidos propios (constituidos por piel, músculos, huesos o una combinación de los mismos) que pueden ser aportados a zonas de la anatomía en las que, por procesos oncológicos o traumáticos entre otros, se ha producido un defecto que precisa ser reconstruido. Resulta necesario utilizar colgajos cuando las pérdidas de sustancia cutánea o de tejido subcutáneo no son suturables o no pueden cicatrizar espontáneamente. El objetivo del colgajo es cerrar una pérdida de sustancia o reconstruir una estructura amputada. Un colgajo cutáneo es un segmento de piel y de tejido celular subcutáneo que conserva una vascularización autónoma a través del pedículo, con el que permanece en contacto con las estructuras profundas. El pedículo del colgajo es el puente cutáneo que irriga directamente el mismo; a veces es reducido y puede estar representado por una arteria y una o dos venas. El colgajo se denomina local cuando el tejido que lo forma se obtiene de un zona cercana al defecto que se quiere reparar, denominándose colgajo a distancia cuando los tejidos se obtienen de zonas alejadas del defecto. En este último caso, el colgajo tiene una arteria y una vena que han de ser anastomosadas a otra vena y arteria, respectivamente, de la zona anatómica donde va a ser ubicado.

Los fenómenos trombóticos, tanto en el territorio venoso como en el arterial, e incluso en la microvasculatura, son los mayores problemas a los que hay que enfrentarse a la hora de realizar una reconstrucción con colgajos, siendo su índice de aparición mayor en los colgajos a distancia, porque dependen de microsuturas de vasos de unos 2 mm a 5 mm de diámetro. En estos casos el pedículo ha de ser trasladado de su lugar de origen, y tiene que ser resuturado a unos vasos localizados cerca de la zona que se quiere reconstruir, lo cual aumenta la morbilidad del proceso. Por ello, se han buscado diversos métodos para disminuir el índice de trombosis. Existen trabajos clínicos y de investigación con fármacos que reducen el potencial trombogénico, como son los antiagregantes plaquetarios, los anticoagulantes o los agentes trombolíticos.

La angiogénesis es la formación de nuevos capilares a partir de otros ya existentes. Se trata de un proceso complejo, que puede activarse en respuesta a un daño tisular. Los factores implicados en su estimulación reciben el nombre de factores proangiogénicos; juegan un papel clave en el proceso de cicatrización de una herida, orquestando de forma decisiva la fase de neovascularización dérmica. De ellos, una parte parecen ser factores de crecimiento que tienen la capacidad de estimular in vivo la proliferación y migración de las células que intervienen en la formación de los capilares sanguíneos y en su estabilización. En el terreno de la práctica clínica en cirugía reparadora, los factores de crecimiento tienen un papel destacado a la hora de promover también la cicatrización en estados deficitarios o complicados, como ocurre en pacientes diabéticos, oncológicos, malnutridos o que han sufrido graves traumatidos, en los que el estrés conlleva la falta de todos los factores que influyen en la cicatrización y, además, suele aumentar el índice de trombosis tanto por su mal estado general como por las medicaciones, el encamamiento prolongado... En los pacientes diabéticos en particular, se produce tanto una neuropatía, que altera la función de los vasos sanguíneos, como una microangiopatía, que obstruye los capilares sanguíneos, traduciéndose esto en un déficit de perfusión tisular que conduce a una destrucción del tejido que se nutre por esos vasos, por lo que la aportación local de factores que aceleren la incorporación de, por ejemplo, un colgajo al lecho donde va a ser transplantado ayudaría a aumentar los nexos vasculares entre lecho y colgajo y a aumentar un ello el índice de supervivencia. También es importante el papel de los factores de crecimiento en la regeneración tisular, como, por ejemplo, cuando se trabaja con colgajos prefabricados.

Entre los factores de crecimiento que parecen estar implicados en la regulación de la angiogénesis pueden citarse factores de crecimiento derivados de fibroblastos (FGF), de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento transformante alfa (TFG-alfa) y el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). Además, se ha sugerido que un factor de crecimiento específico de células endoteliales, el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) es responsable de la estimulación del crecimiento y la diferenciación de las células endoteliales, y de ciertas funciones de las células diferenciadas.

La existencia del FGF (Fibrobast growth factor) fue establecida por Gospodarowicz en 1974, en el cerebro y en la pituitaria. Hoy se sabe que los FGF representan un grupo de proteínas similares que actúan como potentes mitógenos para algunas células mesodérmicas y ectodérmicas.

Los fibroblastos son las células más frecuentes del tejido conectivo y son las células de adherencia que juegan un papel importante en la ayuda del proceso de cicatrización. La estabilización del colágeno en la cicatrización está promovida por la introducción del FGF en el lecho de las heridas, lo cual parece ayudar en la viabilidad de los vasos sanguíneos y promover la actividad de los fibroblastos.

El efecto angiogénico del FGF también ha sido puesto en evidencia en otros estudios. Lu y sus colaboradores (Lu WW et al., Br J Plast Surg, 53: 225-229, 2000) observaron que en heridas tratadas con FGF hay menos isquemia y menos alteraciones en la distribución del colágeno, lo cual contribuye a una mayor capacidad de soportar tensiones y a una mayor elasticidad de los tejidos.

Se conocen las funciones y las estructuras de los FGF ácido y básico. El FGF básico se localiza en el cerebro, hipófisis, retina, riñones, cuerpo lúteo, placenta, próstata, células adrenales y macrófagos. El FGF ácido se localiza en el cerebro y en la retina. Ambos estimulan la migración y la proliferación de las células endoteliales. Hay estudios que ponen de manifiesto la capacidad angiogénica y la mejoría en la viabilidad de los colgajos tratados con FGF, tanto si el mismo se inyecta subcutáneamente (Im MJ et al., Ann Plast Surg, 28: 242-245, 1992) como si se aplica de forma repetida mediante pellets de liberación retardada (Less VC et al., Br J Plast Surg 47: 349-359, 1994). En los melanomas es capaz de producir angiogénesis junto a otros factores de crecimiento (Rofstad EK et al, Cancer Res, 60: 4719-4724, 2000) y parece que podría activar la supervivencia y la ramificación de las arterias miocárdicas (Carmeliet P, Cir Res, 87: 176.178, 2000).

El VEGF, por su parte, fue descrito inicialmente como una proteína secretada por células tumorales, que incrementaba la permeabilidad de los vasos locales a las macromoléculas circulantes. Es producido por distintas células del cuerpo, entre ellas las células endoteliales, sobre las cuales actúa específicamente. Las acciones directas del VEGF son numerosas e incluyen, entre otras, un aumento de la permeabilidad de las células endoteliales. En comparación con la histamina, el VEGF es 50.000 veces más potente en cuanto a la permeabilidad vascular se refiere. La administración tópica del VEGF produce fenestraciones en el endotelio de los microvasos y capilares (Roberts WG et al., J Cell Sci, 108: 2369-2379, 1995).

Durante el proceso de cicatrización, la producción de VEGF a partir de los queratinocitos está incrementada. Esto ocurre también en las células mononucleares de la región donde se está produciendo la cicatrización (Tabú PJ et al, Plas Reconst Surg, 105: 1034-1041, 2000). En condiciones fisiológicas, su producción se induce por la disminución de la tensión tisular de oxígeno. La vida media del VEGF en condiciones normales es de 30 a 45 minutos, pero en condiciones de hipoxia su producción se prolonga durante 6-8 horas, dependiendo su nivel de producción del tejido que esté sometido a isquemia y de la extensión de tejido afectado. Su producción puede estar aumentada también en diversas patologías (Akagi K et al., Br J Can, 83: 887-891, 2000; Philipp W et al., Invest Ophtalmol Vis Sci, 41: 2514-2522, 2000).

En territorios isquémicos, las células endoteliales son capaces, en respuesta a VEGF (liberado inicialmente por células inflamatorias), de sintetizar más VEGF, así como de aumentar la densidad de receptores para este factor en sus membranas. De esta manera, en una situación de emergencia como es una isquemia, las células endoteliales se comportan a la vez como productoras y dianas de VEGF, generando así una respuesta en cadena y amplificada al factor.

En cirugía plástica se han realizado distintos experimentos con el VEGF, con el fin de mejorar la perfusión tisular. Padubiri y sus colaboradores (Padubiri A et al., Ann Plast Surg, 37: 604-611, 1996) inyectaron VEGF (como proteína recombinante) en el pedículo de un colgajo abdominal y produjeron posteriormente una isquemia del mismo. Tras 7 días, los sujetos tratados con VEGF presentaban una supervivencia de los colgajos superior a los no tratados. De forma similar, Banbury y sus colaboradores (Banbury J et al., Plast Reconstr Surg, 106: 1541-1546, 2000) demostraron que era posible mejorar la perfusión de colgajos musculares (músculo cremáster, en ratas) sometidos a isquemia, cuando en la fase subcritica se realizaba un tratamiento de los mismos con una perfusión de
VEGF.

Se han realizado también trabajos en los que se intenta buscar la mejor vía de aplicación de los factores de crecimiento. El equipo de Kryger (Kryger Z et al., Br J Plast Surg, 53: 234-239, 2000) diseñó un trabajo en ratas, con el fin de comparar distintas vías del aplicación del VEGF en colgajos. Diseñaron seis grupos de tratamiento, que se distinguían por ser tratados de la siguiente manera: una única dosis sistémica VEGF, múltiples dosis por vía sistémica, subcutánea, subfascial, tópica y un último grupo control, tratado con suero salino. Los mejores resultados se obtuvieron con el grupo tratado con múltiples dosis de VEGF por vía sistémica, a lo largo de 72 horas. El peor resultado se obtuvo con el grupo tratado con VEGF de forma tópica. También se ha empleado VEGF en colgajos prefabricados. Este factor parece acelerar la maduración de estos colgajos cuando se aplica en ratas mediante un gel de alcohol de polivinilo (Li QF et al., J Reconst Microsurg, 16: 45-50, 2000).

Aunque los resultados son prometedores, el uso de factores de crecimiento como proteínas recombinantes tiene una clara limitación, que es su corta vida media in vivo. Si bien los factores de crecimiento se necesitan sólo de forma transitoria, hasta la resolución del defecto, es fundamental para obtener un efecto terapéutico que durante dicho período la biodisponibilidad del factor esté asegurada. Una de las estrategias empleadas para vencer este obstáculo ha sido recurrir a dosis repetidas del factor en un lapso acotado (Kryger Z et al., Br J Plast Surg, 53: 234-239, 2000). Una alternativa probablemente mucho más eficaz sería aplicar el factor de crecimiento no como proteína, sino como un gen que se exprese de forma sostenida hasta que culmine el proceso.

Para ello, la introducción de las técnicas de terapia génica en el terreno de la cirugía reparadora y en la cicatrización de las heridas es de gran utilidad. Aunque las técnicas para la aplicación de la terapia génica son diversas y avanzan rápidamente, fundamentalmente se emplean vectores virales y complejos liposómicos o plásmidos (Patterson C et al., Circulation, 102: 940-942, 2000). Entre los virus con los que se está trabajando para utilizarlos en terapia génica se encuentran los adenovirus. Estos forman parte de un grupo de virus similares, de los que se conocen 47 serotipos. Los serotipos 2 y 5 son los más utilizados en terapia génica. Se trata de virus ADN de doble cadena, con cápside icosaédrica. En su ciclo, el genoma viral reside en el núcleo, como un elemento episomal. Tienen la capacidad de infectar a una amplia variedad de células.

Según Oligino (Oligino TJ et al. Clin Orth, 379S: S17-30, 2000), la eficiencia de la infección de los adenovirus es alta, en comparación con los lentinivirus o los virus adenoasociados, aunque es menor que la de los virus herpes. Los adenovirus no se integran en el genoma de las células transducidas y la duración de la expresión del transgén es transitoria, aunque muy alta. La producción a gran escala es relativamente fácil. Adenovirus portadores del gen de VEGF se han utilizado para tratar pacientes con isquemia de extremidades (Laitinen M et al., Hum Gene Ther, 9: 1481-86, 1998; Isner JM et al., Lancet, 348: 370-374, 1996), con una tolerancia buena por parte de los pacientes y sin inflamación local ni efectos adversos. La vía de aplicación fue intraarterial, aunque la presencia de barreras anatómicas, como la lámina interna o la arteriosclerosis suelen reducir su eficacia. La producción de los factores de crecimiento con esta técnica alcanza generalmente un pico a la semana de tratamiento y el efecto suele desaparecer a las cuatro semanas (Ylä-Hettuala S, Curr Opin Lipidol, 8: 72-76, 1997).

Otra estrategia para utilizar los adenovirus como vectores para suministrar material genético a células promotoras de la angiogénesis se describe en el documento WO 02/36131, en el que se promueve la transfección de dos vectores adenovirales, que contienen cada uno de ellos una forma diferente del VEFG (VEGF-B_{167} y VEGF-A), mediante su inyección en orejas de ratones. Como en los casos de utilización de adenovirus portadores de VEGF mencionados en el párrafo anterior, la transfección se produce in vivo, por lo que la acción promotora de la angiogénesis, aunque se supone en células endoteliales, es realmente inespecífica; se realizan inyecciones de los adenovirus en los vasos sanguíneos de la zona a tratar, por lo que se puede producir una diseminación sistémica, con posibles efectos adversos; además, aunque se produce una síntesis de VEGF elevada en las primeras horas (24- 48 horas), el efecto no es mantenido, para lo cual se requerirían inoculaciones repetidas de los adenovirus a lo largo de varios días, con la consiguiente incomodidad para el hipotético paciente.

Sería importante disponer de un método de administración de factores angiogénicos codificados por virus portadores en el que la transfección se produjera in vitro, con lo que se conseguiría que dicha transfección fuera específica para células endoteliales y se evitaría la inyección de los virus en los vasos sanguíneos. Además, sería muy conveniente que ese método permitiera que la liberación del VEGF (u otro factor proangiogénico) se mantuviera a lo largo de días con una única inoculación de los vectores virales, posibilitando que el factor proangiogénico estuviera disponible en cantidades suficiente durante todo el período de tiempo que se necesitara promover la angiogénesis, pero sin requerir incómodas dosis repetidas de dicho vector. Para ello, las matrices de geles de fibrina en las que se hacen crecer células representan un vehículo muy adecuado. La fibrina proporciona, una buena base para el crecimiento de las células tanto dérmicas como epidérmicas, por lo que esta proteína ha sido bastante utilizada como soporte sobre el cual cultivar queratinocitos (Ronfard et al. Burns 17:181-184, 1991). Como la fibrina no interfiere con el posterior desarrollo de la correcta unión dermo/epidérmica entre el lecho de una herida y los queratinocitos cultivados, ha sido ampliamente utilizada como sistema de transporte para los mencionados queratinocitos con el objeto de reparar lesiones cutáneas (Pellegrini et al., Transplantation 68: 868-879, 1999; Kaiser y Stark, Burns 20: 23-29, 1994).

La fibrina ha sido utilizada también como base dérmica destinada a la producción de grandes superficies de piel cultivada (Meana et al., Burns 24: 621-630, 1998). En el interior de los geles de fibrina, los fibroblastos sembrados son capaces de crecer. Al mismo tiempo, estos fibroblastos se comportan como inductores del crecimiento de los queratinocitos, de forma que, sembrando fibroblastos y un número muy limitado de queratinocitos cultivados sobre un gel de fibrina, se obtienen en pocos días epitelios confluentes estratificados muy similares a los epitelios humanos normales (Patente española ES2132027). Tal como se describe en la solicitud de patente europea EP1375647, el resultado puede mejorarse utilizando plasma humano como base fundamental de la matriz extracelular, que incluye en su composición plaquetas, resuspendiendo en el mismo fibroblastos dérmicos para obtener una dermis artificial tras la coagulación del plasma, dermis sobre la cual se siembran queratinocitos que se adhieren, migran y crecen de forma que, en unos días, se obtiene un tejido constituido por dos partes, una superior, constituida por células epiteliales estratificadas, y una inferior, constituida por una matriz extracelular densamente poblada de fibro-
blastos.

Con el fin de utilizar análogos de piel similares a los anteriormente descritos en procesos de trasplante en los que se intenta reemplazar con dichos análogos secciones de piel dañadas, se ha probado con distintas estrategias en las que se intenta incrementar la presencia de sustancias que intervienen en la angiogénesis con el propósito de mejorar las posibilidades de éxito del trasplante de piel artificial. Así, por ejemplo, se ha descrito la introducción en dermis artificiales de microesferas recubiertas del factor de crecimiento FGF (Kawai K et al., Biomaterials 21: 489-499, 2000) o la inducción de la producción de proteínas recombinantes implicadas en la angiogénesis mediante la modificación genética de queratinocitos con vectores retrovirales portadores de genes de, por ejemplo, la hormona leptina (WO 03/002154), VEGF (Supp et al., J Invest Dermatol 114: 5-13, 2000; Del Río M et al., Gene Therapy 6: 1734-1741, 1999) o FGF (Erdag G et al., Molecular Therapy, 10: 76-85, 2004) o mediante la modificación genética de fibroblastos con vectores portadores de genes que expresan TGF (WO 02/030443) u otros factores angiogénicos (WO 03/095630). Sin embargo, no hay descritos casos en los que la modificación de células incluidas o crecidas sobre una matriz de fibrina se haya producido con adenovirus ni casos en los que las células modificadas genéticamente y que se hacen crecer en una matriz de fibrina sean células endoteliales. Lo más próximo a este último caso sería la estrategia descrita en el documento US5674722, en el que se describe la transfección de células endoteliales para que sinteticen alguna proteína sin especificar, utilizando como vectores, no adenovirus, sino retrovirus; la finalidad descrita para las células transfectadas, además, no es su cultivo en una matriz de fibrina, sino recubrir con ella un material sintético al que se le ha dado forma de vaso sanguíneo. Salvo en este último caso, en todos los demás trabajos citados el propósito final de la matriz con células generada es la obtención de un análogo de piel que sea trasplantado como tal a pacientes con lesiones, sin describir en ningún caso su inserción conjuntamente con un colgajo obtenido directamente de la anatomía del paciente a tratar.

La presente invención, sin embargo, propone una estrategia distinta: el desarrollo de puentes vascularizados constituidos por matrices de geles de fibrina invadidas por células endoteliales, superproductoras de factores proangiogénicos por haber sido transfectadas in vitro con vectores adenovirales que contienen genes que los codifican, con el propósito de que la matriz de fibrina que contiene células endoteliales actúe como un puente que se insertaría entre colgajos de cualquier composición (piel, músculos, huesos o una combinación de los mismos) y la parte anatómica necesitada de reconstrucción, para facilitar el éxito del proceso de implante. Gracias a la utilización de dicha matriz endotelizada como puente vascularizado, se acelera la incorporación del colgajo cutáneo, muscular u óseo al lecho receptor, por aumentar la angiogénesis tanto en los tejidos trasplantados, como en el propio lecho receptor, ventaja esta última que es especialmente importante en sujetos diabéticos, malnutridos, que han sufrido graves traumatismos o que han sido tratados con radioterapia (por ejemplo, mujeres mastectomizadas, con tratamiento de radioterapia, que van a ser reconstruidas con un colgajo libre musculocutáneo); sujetos en los que los índices de fallos en los colgajos suele ser mayor, porque los tejidos están peor irrigados, tal como se explicó anteriormente, siendo de especial importancia en estos casos un medio como la matriz de fibrina endotelizada de la invención que facilite la formación de puentes vasculares entre un colgajo y el lecho receptor. Al colocar entre el colgajo y el lecho radiado la matriz del gel de fibrina con las células endoteliales, la angiogénesis producida por el gel afectaría a ambos por igual y se establecerían puentes vasculares entre los dos tejidos en las primeras horas tras la intervención. Además, el efecto angiogénico es un efecto local y más específico que el obtenido al realizar inyecciones en los vasos sanguíneos de adenovirus portadores de genes codificantes de factores de crecimiento, evitando el riesgo de diseminaciones sistémicas, por haberse realizado la transfección específicamente de células endoteliales con los vectores adenovirales in vitro, previamente a la obtención y colocación del puente vascularizado. La liberación del factor de crecimiento, por otro lado, se mantiene a lo largo de días, y no son necesarias repeticiones de dosis, lo cual resulta más cómodo para el paciente. Además, a diferencia de lo que sucedería si los vectores utilizados derivaran de retrovirus, la utilización de vectores adenovirales elimina el riesgo de que, conjuntamente con los retrovirus inactivados generados para actuar como portadores de las secuencias codificantes de interés, se empaquete material genético de retrovirus sin inactivar y, por tanto, con potencial para integrarse en la célula hospedadora de forma estable interrumpiendo genes de interés o cuya interrupción podría dar lugar a un proceso oncogénico.

Descripción de la invención

La invención se refiere a una matriz endotelizada destinada a ser utilizada como puente vascularizado, compuesta por un gel de fibrina, que mantiene en su interior células endoteliales capaces de sintetizar VEGF y/o FGF en condiciones en las que no estaría inducida su síntesis en condiciones normales, por haber sido transfectadas in vitro con vectores adenovirales portadores de genes que codifican dichas proteínas. Gracias a esos genes transfectados, estas células endoteliales expresarán cantidades de VEGF superiores a las que se producirían en el proceso angiogénico normal que se desarrollaría en un individuo receptor de un colgajo en un proceso normal de trasplante, por lo que han sido calificadas como "superproductoras" de factores angiogénicos en la presente memoria.

El objeto de su desarrollo es recrear en el laboratorio, de un modo altamente eficiente, una situación similar a la que ocurre in vivo en un territorio isquémico, pues dicha matriz invadida por células endoteliales mimetizaría las primeras etapas de migración y proliferación que ocurren in vivo en una zona isquémica. Una vez obtenida, el objetivo final de la matriz endotelizada en su inserción como elemento intermedio entre un colgajo utilizado en un proceso de reconstrucción y el lecho receptor que lo recibe, de forma que, tras el trasplante, la matriz insertada a modo de puente vascularizado actúe en el individuo receptor como un fuerte inductor de la angiogénesis. Para aumentar el rendimiento del sistema, las células endoteliales, antes de ser ensambladas en la matriz, se convierten en superproductoras de factores proangiogénicos (VEGF y/o FGF) mediante un protocolo de transferencia génica con vectores adenovirales portadores de su secuencia codificante y elementos de control que permiten su expresión en células endoteliales. La matriz empleada, un gel de fibrina, se comportan como un soporte óptimo tanto para la proliferación y la migración celular como para la producción de los factores.

Este sistema, que conjuga la introducción de células endoteliales en la matriz con la producción in situ sostenida (pero por un tiempo acotado) de factores proangiogénicos, representa una clara ventaja frente a la administración tópica o sistémica de factores de crecimiento como proteínas recombinantes o la inyección de vectores adenovirales que contienen genes que codifican dichas proteínas recombinantes con el propósito de lograr un proceso de transfección in vivo.

También es un objeto de la presente invención un método para la producción de dicha matriz de fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico por haber sido parte o la totalidad de sus células endoteliales transfectada in vitro con uno o más vectores adenovirales que comprenden en su secuencia al menos un gen correspondiente a un factor proangiogénico, que comprende las etapas de:

a): obtener células endoteliales individualizadas tras haber sido aisladas de un mamífero y cultivadas in vitro;

b): transfectar in vitro parte o la totalidad de dichas células endoteliales con uno o más vectores adenovirales distintos que comprenden en su secuencia al menos un gen correspondiente a un factor proangiogénico insertado de tal forma que el gen es capaz de expresarse en células endoteliales;

c): mezclar el medio que contiene las células endoteliales transfectadas en la etapa anterior con una solución que contenga fibrinógeno y provocar la gelificación del fibrinógeno por formación de fibrina;

d): dejar reposar la mezcla de la etapa anterior en un recipiente adecuado para que se produzca la formación de la matriz de gel de fibrina en la que hayan quedado embebidas las células endoteliales transfectadas con los vectores adenovirales.

Es igualmente objeto de la invención el utilizar la matriz endotelizada superproductora de factores proangiogénicos como puente vascularizado a insertar entre un colgajo y un lecho receptor del mismo, para mejorar la supervivencia de dicho colgajo.

En una realización preferida de la invención, la matriz de fibrina endotelizada superproductora de factores angiogénicos se diseñaría con el propósito de que el individuo receptor para el que está prevista fuera un ser humano.

En una realización de la invención, el individuo del que proceden tanto las células endoteliales como el fibrinógeno a partir del cual se origina la fibrina es el mismo que aquel que está previsto como individuo receptor de la matriz endotelizada, siendo la matriz totalmente autóloga.

En otra realización de la invención, la matriz no es autóloga, siendo posibles individuos diferentes al previsto como receptor de la matriz como donantes de las células endoteliales y/o del fibrinógeno. Incluso los individuos donante y receptor pueden llegar a pertenecer a especies distintas.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 presenta una representación esquemática de un colgajo disecado. (1): colgajo; (2): lecho avascular; (3): arteria; (4): vena.

La Figura 2 presenta una representación esquemática de la forma en la que se colocarían el colgajo (1) y la matriz endotelizada (5) que actuaría como puente vascularizado con respecto al lecho receptor (2). Se representan de nuevo en el colgajo una arteria (3) y una vena (4).

La Figura 3 es una fotografía en la que se muestra el diseño del colgajo, en la cara dorsal de la oreja de un conejo y con el eje centrado en los vasos caudales intermedios. La matriz endotelizada se está distribuyendo sobre el cartílago situado bajo el colgajo.

La Figura 4 muestra tinciones inmunohistoquímica de CD32 en sujetos tratados (parte a) y sujetos control (b) a 500 aumentos.

La Figura 5 muestra una fotografía de vasos de un individuo receptor de un colgajo, tratado con la matriz de gel de fibrina endotelizada de la invención, con una reacción positiva respecto al VEGF en sus células endoteliales.

Descripción detallada de la invención

La presente invención, por tanto, proporciona una matriz de fibrina que mantiene en su interior células endoteliales transfectadas con vectores adenovirales y superproductoras por ello de VEGF y/o FGF, matriz que se prepara con la finalidad de ser utilizada como puente vascularizado de conexión entre el lecho receptor y un colgajo.

Las células endoteliales se han extraído previamente de venas periféricas de un individuo de la misma especie, que puede ser el propio sujeto a tratar, y se cultivan y modifican genéticamente para finalmente embeberlas en una matriz de gel de fibrina obtenido a partir de plasma, habitualmente también del propio paciente. La modificación genética de las células endoteliales se produce con adenovirus portadores de los genes VEGF y/o FGF, de tal manera que in vivo se comportan como biorreactores de dichos factores sólo por un tiempo limitado, mientras sobrevivan en el gel de fibrina dichas células transfectadas con el vector derivado de adenovirus. Esta matriz endotelizada y superproductora de factores proangiogénicos tiene la misión de actuar como puente vascularizado para inducir el desarrollo de un plexo vascular funcional entre el colgajo y el lecho receptor, con el fin de acelerar la adaptación entre ambos. La matriz de gel de fibrina proporciona el ambiente adecuado para que en ella se generen y acumulen los factores de crecimiento.

Las ventajas de la utilización como puente vascularizado de una matriz endotelizada compuesta por una matriz de gel de fibrina en la que están embebidas células endoteliales que son superproductoras de factores proangiogénicos por haber sido transfectadas in vitro con vectores adenovirales que contienen genes que codifican dichos factores proangiogénicos son las siguientes:

-: La matriz de gel de fibrina permite el crecimiento y migración de células endoteliales en su interior. Dentro de esta matriz, las células endoteliales modificadas genéticamente son capaces, in vitro, de secretar factores de crecimiento proangiogénicos (VEGF y FGF) y de organizarse formando microcapilares antes de ser trasplantadas.

-: Después del trasplante de este puente vascularizado, colocado entre el lecho receptor y el colgajo, los factores de crecimiento producidos por las células modificadas genéticamente son capaces de inducir además la proliferación y migración de neovasos tanto en el lecho receptor como en el propio colgajo. Las células endoteliales de la matriz vascularizada actuarían como puente entre ambos, acabando muchas de ellas por ser incluidas como parte del estroma vascular que unirá el tejido trasplantado al lecho receptor, lo que, en su conjunto, incrementa las posibilidades de éxito en la reconexión del colgajo.

-: El aumento de la angiogénesis en los tejidos trasplantados permite la aceleración de la incorporación al lecho receptor de un colgajo cutáneo, muscular, óseo o de combinaciones de estos tejidos.

-: La utilización de esta matriz endotelizada a modo de puente vascularizado es de gran utilidad no sólo para la atenuación de fenómenos trombóticos que puedan poner en peligro la supervivencia de los colgajos, sino también para el tratamiento de colgajos que tuvieran que ser utilizados para reconstruir zonas tratadas con radioterapia, colgajos en pacientes diabéticos o fumadores (que suelen presentar problemas micro y/o macrovasculares) e incluso para elaborar colgajos prefabricados.

-: El hecho de que la modificación genética de las células endoteliales se produzca mediante una transfección in vitro, previa al trasplante de la matriz, asegura que la incorporación del material genético se produce específicamente en las células que se desea y supone una clara ventaja respecto a la inyección de vectores virales in vivo, porque disminuye el riesgo de diseminaciones sistémicas, permite un efecto de liberación de factores de crecimiento mantenido durante días y no requiere repeticiones de dosis.

-: La utilización de adenovirus como vectores portadores supone también una ventaja respecto al uso de retrovirus, pues se elimina el riesgo de un posible empaquetamiento conjuntamente con los vectores inactivados de material genético con potencial oncogénico y su posible integración en la célula hospedadora de forma estable e interrumpiendo otros genes.

-: La posibilidad de que todos los componentes de la matriz endotelizada sean de origen autólogo permite que, en esos casos, la inserción de la matriz a modo de puente endotelizado y del correspondiente colgajo pueda realizarse sin ser necesaria la inmunosupresión de los sujetos tratados.

-: Por otro lado, la flexiblidad dentro del método de obtención de la matriz endotelizada permite que tanto el suero utilizado para formar el gel de fibrina como las células endotelizadas que son transfectadas y embebidas en la matriz puedan proceder de un individuo diferente a aquel al que se le va a insertar el colgajo. Incluso la especie de la cual procede el fibrinógeno origen de la matriz de fibrina puede ser diferente. Esto abre la posibilidad de que las matrices estén preparadas de antemano cuando se necesiten con urgencia, aunque en estos casos si sería recomendable proceder a la inmunosupresión de los sujetos en los que se coloque la matriz endotelizada a modo de puente vascularizado.

Para conseguir esto, es necesario producir células endoteliales, transfectadas in vitro con un vector adenoviral que permite la expresión de VEGF y/o FGF. Dichas células endoteliales se extraen del sistema nervioso periférico, preferiblemente de la vena safena, del donante. Si se desea que la matriz endotelizada sea totalmente autóloga, el donante tendrá que ser el propio individuo que necesita el colgajo. Los vasos extraídos son enviados en un frasco de transporte con DMEM y solución antiséptica al laboratorio para su cultivo y preparación, utilizando, por ejemplo, el método descrito por Del Río et al., Br J Pharmacol, 120:1360-1366, 1997. Siguiendo este método, las células endoteliales son cultivadas en un medio adecuado, como puede ser medio modificado de Dulbecco:Ham's F 12 (1:1) que contiene FCS al 10% suplementado con glutamax I, 100 UI/ml de penicilina G, 100 \mug/ml de estreptomicina y 0,25 \mug/ml de amfotericina B.

La transferencia genética in vitro se realiza con cultivos confluyentes mediante incubación con el/los vectores adenovíricos que portan los genes que codifican los factores de crecimiento (VEGF, FGF) en un medio pobre en suero. Después de dos lavados con PBS, las células son incubadas en un medio de cultivo adecuado, como puede ser Dulbecco:Ham's F 12 (1:1), durante un tiempo conveniente que, en el caso de seres humanos, sería de aproximadamente 24 horas. Posteriormente, para obtener las células individuales que van a formar parte de la matriz endotelizada, se las trata con tripsina/EDTA.

Para preparar la matriz endotelizada, puede utilizarse el método descrito previamente en la solicitud de patente internacional WO 02/072800. En él, se parte de plasma, con plaquetas y fibroblastos, que gelifica mediante la adición de Ca^{2+}. A diferencia del caso del documento citado, en la presente invención no se resuspenden fibroblastos en la matriz de fibrina, ni se siembran en ella queratinocitos, sino que el tipo celular que se resuspende en la matriz son las células endoteliales cuya obtención se describe en el párrafo anterior, que están modificadas genéticamente. De esta manera, la matriz de gel de fibrina de la presente invención no actúa sólo como soporte celular, sino que sirve también como vehículo de factores terapéuticos producidos por las células.

La matriz de fibrina se puede obtener también a partir de su precursor sanguíneo, el fibrinógeno, de crioprecipitados de plasma. Los crioprecipitados se obtienen de acuerdo con los estándares de la Asociación Americana de Bancos de Sangre (Walker RH (ed) Technical Manual, American Association of Blood Banks, Bethesda, MD; 1993; pags. 728-730).

El individuo del que se extrae el plasma puede o no ser aquel en el que se va a insertar el colgajo y, con él, la matriz endotelizada superproductora de factores proangiogénicos. Se prefiere que el individuo sea el mismo si se quiere evitar la necesidad de someter al receptor del colgajo a un tratamiento inmunosupresor. En caso de no ser este un factor primordial, el plasma puede proceder no sólo de un individuo distinto, sino también de una especie diferente. Así, la fuente de fibrinógeno pueden ser, por ejemplo, crioprecipitados de plasma porcino.

En cualquiera de los casos, para producir el gel de fibrina, a la solución con fibrinógeno se le añade DMEM que contiene FCS al 1% y las células endoteliales ya transfectadas. Posteriormente se induce la gelificación mediante la adición de CaCl_{2} y trombina. Finalmente, se vierte la mezcla sobre una placa de cultivo u otro recipiente adecuado y se deja solidificar a la temperatura adecuada, que será de 37ºC para el caso de geles de fibrina procedentes de seres humanos. El gel formado se cubre con medio de cultivo adecuado, (por ejemplo, Dulbecco: Ham's F 12 (1:1) y se trasplanta entre 24-48 horas después sobre el lecho receptor del colgajo, para que actúe como puente vascularizado entre ambos. Una vez colocado el colgajo sobre la matriz endotelizada, se suturan los bordes del mismo al propio lecho, de manera que la matriz endotelizada quede homogéneamente distribuida entre
ambos.

Tal como se describe con más detalle a continuación en el correspondiente ejemplo, los experimentos quirúrgicos realizados en animales, concretamente en conejos, verifican la validez del método y su utilidad para aumentar la supervivencia de colgajos insertados. Además, el análisis estadístico reveló que la densidad capilar y la expresión de VEGF fueron significativamente mejores en los sujetos tratados al realizar un análisis estadístico.

Ejemplo Preparación de las células endoteliales

Las células endoteliales utilizadas para quedar albergadas en la matriz de fibrina fueron células endoteliales de aorta de conejo albino neozelandés. El cultivo de las mismas se efectuó tras hacer una extracción de la arteria aorta de estos conejos en condiciones estériles y dentro de un medio de cultivo (DMEM al 5%, con antibiótico y antifúngico). Las células fueron cultivadas en un medio modificado de Dulbecco: Ham's F 12 (1:1), que contiene FCS al 10%, suplementado con glutamax I, 100 UI/ml de penicilina G, 100 \mug/ml de estreptomicina y 0.25 \mug/ml de amfotericina B.

En el estudio se utilizaron células que había sido sometidas como máximo a tres pases durante su cultivo. La transferencia genética in vitro se realizó en cultivos confluentes, mediante incubación durante 3 horas a 37ºC con un vector adenovírico del grupo C, que incluía un gen del VEGF A165, capaz de expresarse en células endoteliales en un medio pobre en suero. Después de dos lavados con PBS, las células fueron incubadas en un medio de crecimiento durante 24 horas y posteriormente tratadas con tripsina/EDTA, para obtener células individuales.

Preparación de las matrices de fibrina endotelizadas

Los geles de fibrina que contenían las células transfectadas se prepararon según el protocolo para geles de fibrina-fibroblastos descrito en la solicitud de patente internacional WO 02/072800, con modificaciones. En primer lugar, como recurso para obtener la fibrina se utilizó fibrinógeno de crioprecipitados de plasma porcino. Los crioprecipitados fueron obtenidos de acuerdo a los estándares de la Asociación Americana de bancos de sangre. Para producir el gel de fibrina, 3 ml de la solución de fibrinógeno se añadieron a 12 ml de DMEM al 10% FCS, con 5 x 10^{5} células endoteliales transfectadas. Posteriormente se añadió 1 ml de Cl_{2}Ca (0,025 mM, Sigma) con 11 UI de trombina bovina (Sigma). Finalmente, se vertió la mezcla en un recipiente de cultivo de 75 cm^{2} y se dejó que solidificara a 37ºC. El gel se cubrió con medio de cultivo para ser utilizado a las 24 horas, manteniéndolo durante ese intervalo de tiempo en un frigorífico a 4ºC.

Procedimiento quirúrgico

Los animales en los que se insertaron colgajos fueron también conejos albinos neozelandeses, aunque no se utilizaron aquellos individuos de los que se habían obtenido las células endoteliales. Tanto por esta razón, como por la utilización de plasma porcino como fuente de fibrina, fue necesario provocar inmunosupresión en los sujetos tratados, que en este caso se llevó a cabo con Sandimmune® (Novartis Pharmaceuticals), mediante una dosis intraperitoneal el día previo a la intervención, de 25 mg/kg. Esta dosis fue repetida a diario en todos los sujetos del estudio, hasta el día del sacrificio.

En cuanto a la obtención de los colgajos, se diseñaron colgajos axiales de la región dorsal de la oreja de cada conejo, basándose en la rama intermedia de la arteria y vena auricular caudal. El borde proximal de cada colgajo quedó situado unos 4 cm distal a la confluencia de la vena intermedia caudal auricular con la propia vena caudal de la oreja. En condiciones de asepsia y antisepsia, se infiltraron los bordes con anestésico local y se realizó una incisión de los bordes con bisturí, procurando no seccionar el pedículo vascular. En el borde distal del colgajo, tras aislar los vasos centrales, se efectuó una electrocoagulación de los mismos. Con ayuda de unas tijeras romas, se separó el colgajo del tejido cartilaginoso, respetando las inserciones de los vasos centrales al pericondrio. Posteriormente, con la ayuda de bisturí, se levantó todo el colgajo en dirección proximal. Con una incisión con bisturí, se accedió a los vasos del colgajo axial en la zona proximal, hasta la confluencia de la vena intermedia caudal con la propia vena caudal. En ese momento se procedió a coagular la vena caudal, para evitar que hubiera alguna interferencia de este vaso con el vaso axial del colgajo. Se efectuó acto seguido la despericondrización del cartílago en la zona expuesta. Con la ayuda de gafas lupa e instrumental microquirúrgico, se aislaron los vasos sanguíneos y se seccionaron los filetes nerviosos que acompañan a los vasos centrales, porque éstos poseen pequeños vasos acompañantes, que podrían nutrir por sí solos al propio colgajo.

La matriz de fibrina endotelizada se manipuló en una campana de flujo laminar, para despegarlo del recipiente de cristal que lo contenía, con la ayuda de una espátula. Posteriormente se cubrió la cápsula con papel estéril y se transportó al quirófano para su colocación sobre el cartílago desprovisto de pericondrio. Se procuró que la distribución de la matriz fuese lo más homogénea posible. Sobre ella se colocó el colgajo. Con la ayuda de una sutura de seda (4/0), se procedió a suturar los bordes del mismo y la incisión realizada para exponer los vasos. Un ejemplo de disposición final se muestra en la Figura 3.

Una vez operados, los animales fueron devueltos a sus jaulas.

El último tiempo quirúrgico consistió en seccionar los vasos del colgajo axial. Para ello, se realizó de nuevo el mismo procedimiento anestésico, aunque en este caso, la infiltración con lidocaína al 2% se practicaba a 1/2 cm del borde proximal del colgajo. Con un bisturí se hizo una incisión sobre la propia cicatriz quirúrgica y con la ayuda de un clamp de microcirugía se cortó el flujo arterial y venoso. A continuación, se seccionaron y ligaron los vasos. En los grupos I (control) y II (tratados con la matriz productora de VEGF), este procedimiento se llevó a cabo a los 5 días de la fecha de levantamiento del colgajo. En los grupos III (control) y IV (tratados con la matriz productora de VEGF), la sección se efectuaba a las 48 horas de realizarse la cirugía inicial.

Tratamiento de los animales operados

Una vez devueltos los animales a sus jaulas tras la primera intervención, se procedió a realizar una evaluación diaria de cada sujeto, anotando datos sobre del color de los colgajos y su consistencia al tacto.

Transcurridos 4 días tras realizarse la sección de los vasos, se tomaron fotografías de los mismos y, a los 6 días, se procedió a sacrificar a los animales con una sobredosis de pentotal sódico, por vía endovenosa.

En ese momento se extrajeron los colgajos y se introdujeron en recipientes con formol tamponado al 10%. A las 48 horas, se seleccionaron tres porciones de cada colgajo, de las zonas proximal, medial y distal respectivamente, orientadas de forma que los vasos centrales ocupasen el centro de la pieza histológica, y se incluyeron en parafina.

Valoración macroscópica y microscópica

La superficie del colgajo que era viable se evaluó por planimetría, expresando los valores obtenidos en cifras porcentuales. Dicha planimetría se efectuó el día anterior al sacrificio del animal.

De los bloques de parafina se realizaron cortes de 3-4 \mum, que se montaron en portaobjetos silanizados, con carga positiva superficial y gap capilaridad de 75 \mum (ProbeOn^{TM} Plus Slides. Catálogo nº 15-188-52. Fischer Biotech^{c} y ChemMate^{TM} Capillary Gap Plus Slides. Código S2024. DAKO A/S Biotek Solutions). Taras desparafinización e hidratación, los cortes se lavaron en tampón Tris salino (TBS) (Tris-HCl 0,05 M; NaCl 0,5 M; pH 7,36). La actividad peroxidasa endógena se bloqueó mediante peróxido de hidrógeno al 3% en alcohol metílico durante 30 minutos.

Con la intención de exponer el mayor número de epítopos posibles, desplegando las proteínas por desnaturalización, las secciones se sometieron a un pretratamiento con calor en horno microondas a 750 watios, sumergidos en tampón citrato (ácido cítrico 0,01 M, pH 7), durante cuatro períodos de cinco minutos, dejando enfriar posteriormente a temperatura ambiente.

El bloque de la tinción inespecífica de fondo se realizó mediante la incubación en suero normal de cabra no-inmune (código NGS-1, Universidad de Navarra, Pamplona), diluido a 1:20, durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Los cortes se incubaron con los anticuerpos anti-CD31 (anticuerpo monoclonal de ratón anti CD31. Código M 0823. DAKO) con una dilución 1/100, y anti VEGF (VEGF(C-1): SC-7269. Santa Cruz Biotechnology, Inc). La proteína CD31 es específica de las membranas de las células endoteliales; por tanto, las tinciones que permitan detectar aquellos lugares a los que se unan los anticuerpos anti-CD31 muestran la visualización de las paredes de vasos sanguíneos y, por tanto, la presencia de éstos.

Tras lavar en TBS (Tris-HCL 0,05 M; NaCl 0,5 M; pH 7,36) se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente, con el producto EnVision^{TM}, peroxidasa (DAKO EnVision^{TM}. Código Nº: K4003 anti-conejo; Código Nº: K4001 anti-ratón) prediluido.

Después de un lavado final en TBS (Tris-HCl 0,05 M; NaCl 0,5 M; pH 7,36), el producto de la reacción de la peroxidasa se visualizó utilizando una solución de 3,3'-diaminobencidina (DAB) preparada comercialmente en una solución cromógena, con un tampón de imidazol-HCl a pH 7,5 y peróxido de hidrógeno (DAKO^{c} Liquid DAB+Large Volume Substrate-Chromogen Solution. Código Nº: K3468), incubándolo durante cinco a treinta minutos, a temperatura ambiente y prediluido.

Un patólogo se encargó de realizar la valoración de las preparaciones histológicas que estaban teñidas con hematoxilina-eosina y tinciones de inmunohistoquímica (CD31 y VEGF).

En las tinciones de CD31, se efectuó un recuento de vasos, a 500 aumentos, en 6 campos distintos y se expresó el valor medio de los mismos. Se descartaron aquellas zonas en las que había un foco inflamatorio y se valoraron las zonas en las que no había una distorsión del tejido subcutáneo entre los propios anejos cutáneos y el cartílago. La Figura 4 muestra ejemplos de estas tinciones inmunohistoquímicas de CD31 en sujetos tratados (a) y sujetos control (b). Los resultados de los recuentos se muestran posteriormente en la Tabla 1, que corroboran que se da una mayor formación de vasos sanguíneos en los sujetos tratados con la matriz de la invención con respecto a los sujetos de los grupos controles. Los parámetros estadísticos relacionados se muestran en las Tablas 2 y 3.

En cuanto al VEGF, se consideraron como positivos aquellos vasos en los que se teñía el citoplasma de las células endoteliales. El recuento se hizo dándole un valor numérico al total de vasos que se teñían con el anticuerpo en cada preparación. Un ejemplo de tinción de vasos con una reacción positiva respecto al VEGF en células endoteliales de un individuo tratado con la matriz de gel de fibrina endotelizada de la invención se muestra en la Figura 5, donde la aparición de células teñidas demuestra la presencia de VEGF y, por tanto, que está siendo efectivamente sintetizado. Los resultados de los recuentos de células endoteliales teñidas se muestran posteriormente en la Tabla 1. Los parámetros estadísticos relacionados aparecen en las Tablas 2 y 3.

Resultados

La Tabla 1 presentada a continuación indica los datos de las medias y desviaciones estándar correspondientes a los datos de supervivencia, tinciones de CD31 y tinciones de VEGF.

TABLA 1 Valores de medias y desviaciones estándar correspondientes a los datos de supervivencia, tinción de CD31 y tinción de VEGF

	Media/Desviación estándar
	Supervivencia	CD31	VEGF
	(%)	Vasos/campo*	Células
		500	endoteliales/corte
Sección a los 5 Días	Grupo I (control)	51,25/45,88	5,56/3,18	0,87/1,12
	Grupo II (tratamiento)	95,62/4,95	13,20/4,54	5,62/3,73
Sección a las 48 Horas	Grupo III (Control)	2,50/7,07	2,34/4,56	0,37/1,06
	Grupo IV (tratamiento)	55,62/38,95	5,56/3,18	3,06/2,95

A continuación, en las Tablas 2 y 3, se indican los datos correspondientes a los parámetros estadísticos relacionados con los resultados anteriores, concretamente los relativos al análisis de Kruskal Wallis (Tabla 2) y al de U Mann Whitney (Tabla 3).

El análisis de la varianza (ANOVA) es una técnica de análisis de datos para examinar la significación de los factores (variables independientes) en un modelo multifactorial. El modelo unifactorial puede ser obtenido desde una generalización de un test de dos muestras. Es decir, un test de dos muestras es aquel que parte desde la hipótesis de que las medias de dos poblaciones son equitativas. El test de ANOVA valora la hipótesis que defiende que las medias de un número "x" de poblaciones son iguales.

El test de Kruskal Wallis puede ser utilizado como ANOVA. Se trata de un test no paramétrico que se emplea cuando las condiciones para asumir el test de ANOVA no pueden ser aplicadas, por tanto, para contrastar la hipótesis de que un número de muestras de diferente tamaño tienen origen en la misma población. En resumen, el test de Kruskal-Wallis es un método no paramétrico para evaluar la hipótesis de que varias poblaciones tienen la misma distribución continua versus la alternativa de que los resultados tienden a ser distintos en una o más de las poblaciones.

TABLA 2 Parámetros de Kruskal Wallis

Kruskal Wallis	Supervivencia	CD31	VEGF
\chi^{2}	15,50	17,11	16,38
p	0,001	0,001	0,001

En el caso de la Tabla 3, la prueba de la "U" de Mann-Whitney es una prueba estadística no paramétrica que se usa cuando la muestra es pequeña o la distribución de los datos en la población es libre (los datos no proceden de poblaciones normales y con igualdad de varianzas). Esta prueba contrasta si dos muestras de dos subpoblaciones tienen la misma distribución. Las observaciones de ambos grupos se combinan y clasifican con respecto al rango promedio asignado en caso de producirse empates. Si la posición de las poblaciones es idéntica, deberán mezclarse aleatoriamente los rangos en ambas muestras.

TABLA 3 Análisis de U Mann Whitney

100

Por tanto, según estos datos, en los sujetos tratados se encontró una supervivencia de los colgajos cercana al 50% a pesar de prescindir del pedículo a las 48 horas de ser intervenidos (Grupo IV), hecho que facilita que el colgajo se necrose, porque el flujo sanguíneo del colgajo depende del pedículo. La supervivencia aumentaba hasta el 95% si se realizaba la sección del pedículo a los 5 días (protocolo A). En los sujetos no tratados, la supervivencia no llegaba al 3% tras seccionar el pedículo a las 48 horas.

Los resultados que reflejan la densidad capilar y la expresión de VEGF fueron también significativamente mejores en los sujetos tratados.

Claims

1. Una matriz artificial de gel de fibrina endotelizada en cuyo interior se encuentran embebidas células endoteliales que, en parte o en su totalidad, han sido transfectadas in vitro con uno o más vectores adenovirales que comprenden en su secuencia al menos un gen correspondiente a un factor proangiogénico capaz de superexpresarse en dichas células endoteliales transfectadas.

2. Una matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico según la reivindicación 1, en la que las células endoteliales proceden del sistema venoso de un mamífero.

3. Una matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico según la reivindicación 2, en la que las células endoteliales proceden concretamente de la vena safena.

4. Una matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico según la reivindicación 1, en la que las células endoteliales proceden del sistema arterial de un mamífero.

5. Una matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico según la reivindicación 4, en la que las células endoteliales proceden concretamente de la arteria aorta.

6. Una matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el gel de fibrina se ha formado a partir de fibrinógeno presente en plasma sanguíneo de un mamífero.

7. Una matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el gel de fibrina se ha formado a partir de fibrinógeno de crioprecipitados de plasma de un mamífero.

8. Una matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que al menos un vector adenoviral utilizado para transfectar las células endoteliales comprende en su secuencia nucleotídica la secuencia codificante del factor de crecimiento VEGF capaz de superexpresarse en dichas células endoteliales.

9. Una matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que al menos un vector adenoviral utilizado para transfectar las células endoteliales comprende en su secuencia nucleotídica la secuencia codificante del factor de crecimiento FGF capaz de expresarse en dichas células endoteliales.

10. Un método para obtener una matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico, caracterizado porque comprende las etapas de:

b): transfectar in vitro parte o la totalidad de dichas células endoteliales con uno a más vectores adenovirales distintos que comprenden en su secuencia al menos un gen correspondiente a un factor proangiogénico capaz de sobreexpresarse en dichas células endoteliales;

11. Un método para obtener una matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproducta de al menos un factor proangiogénico según la reivindicación 10, en el que la gelificación del fibrinógeno por formación de fibrina se provoca mediante la adición de CaCl_{2} y trombina.

12. Un método para obtener una matriz de gel de fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico según cualquiera de las reivindicaciones 10 ó 11, en el que las células endoteliales proceden del sistema venoso de un mamífero.

13. Un método para obtener una matriz de gel de fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor proan-
giogénico según la reivindicación 12, en el que las células endoteliales proceden concretamente de la vena safena.

14. Un método para obtener una matriz de gel de fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico según cualquiera de las reivindicaciones 10 ó 11, en el que las células endoteliales proceden del sistema arterial de un mamífero.

15. Un método para obtener una matriz de gel de fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor proan-
giogénico según la reivindicación 14, en el que las células endoteliales proceden concretamente de la arteria aorta.

16. Un método para obtener una matriz de gel de fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en el que el gel de fibrina se ha formado a partir de fibrinógeno presente en plasma sanguíneo de un mamífero.

17. Un método para obtener una matriz de gel de fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en el que el gel de fibrina se ha formado a partir de fibrinógeno de crioprecipitados de plasma de un mamífero.

18. Un método para obtener una matriz de gel de fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, en el que al menos un vector adenoviral utilizado para transfectar las células endoteliales comprende en su secuencia nucleotídica la secuencia codificante del factor de crecimiento VEGF capaz de superexpresarse en dichas células endoteliales.

19. Un método para obtener una matriz de gel de fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, en el que al menos un vector adenoviral utilizado para transfectar las células endoteliales comprende en su secuencia nucleotídica la secuencia codificante del factor de crecimiento FGF capaz de expresarse en dichas células endoteliales.

20. Uso de una matriz de gel de fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 como puente vascularizado que se inserta entre un colgajo y el lecho receptor del mismo en un proceso de trasplante entre mamíferos, con el fin de mejorar la supervivencia de dicho colgajo.

21. Uso según la reivindicación 20 en que las células endoteliales presentes en la matriz del gel de fibrina proceden de un individuo distinto al que recibe el colgajo.

22. Uso según la reivindicación 20 en que las células endoteliales presentes en la matriz de gel de fibrina proceden del mismo individuo que recibe el colgajo.

23. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22 en que el individuo del que proceden las células endoteliales presentes en la matriz del gel de fibrina es un mamífero no humano.

24. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23 en que el individuo que recibe el colgajo es un ser humano.

25. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23 en que el individuo que recibe el colgajo es un mamífero no humano.

26. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25 en que el gel de fibrina de la matriz artificial se ha formado a partir del fibrinógeno presente en plasma sanguíneo de un individuo distinto al que recibe el colgajo.

27. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25 en que el gel de fibrina se ha formado a partir del fibrinógeno presente en plasma sanguíneo del mismo individuo que recibe el colgajo.

28. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 26 ó 27 en que el individuo del que procede el plasma sanguíneo del que se obtiene el fibrinógeno que forma el gel de fibrina de la matriz artificial es un mamífero no humano.

29. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28 en que el individuo que recibe el colgajo es un ser humano.

30. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28 en que el individuo que recibe el colgajo es un mamífero no humano.

31. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25 en, que el gel de fibrina de la matriz artificial se ha formado a partir del fibrinógeno presente en crioprecipitados de plasma sanguíneo de un individuo distinto al que recibe el colgajo.

32. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25 en que el gel de fibrina se ha formado a partir del fibrinógeno presente en crioprecipitados de plasma sanguíneo del mismo individuo que recibe el colgajo.

33. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 32 en que el individuo del que procede el crioprecipiado de plasma sanguíneo del que se obtiene el fibrinógeno que forma el gel de fibrina de la matriz artificial es un mamífero no humano.

34. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33 en que el individuo que recibe el colgajo es un ser humano.

35. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33 en que el individuo que recibe el colgajo es un mamífero no humano.