JP2016067312A

JP2016067312A - 軟骨分化培養液、及び軟骨組織

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Publication number: JP2016067312A
Application number: JP2014201804A
Authority: JP
Inventors: 克之山中; Katsuyuki Yamanaka; 勇介重光; Yusuke Shigemitsu; 裕大坂井; Yuudai Sakai
Original assignee: GC Corp; GC Dental Industiral Corp
Current assignee: GC Corp
Priority date: 2014-09-30
Filing date: 2014-09-30
Publication date: 2016-05-09

Abstract

【課題】間葉系幹細胞の軟骨分化を促進することができる軟骨分化培養液を提供することを目的とする。【解決手段】脂肪酸濃縮液と、ビタミン液と、ＥＡＡ（ＥｓｓｅｎｔｉａｌＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ）と、エリスロポエチンと、コンドロイチン硫酸と、ヒアルロン酸と、活性型ビタミンＤ３と、を含む軟骨分化培養液。【選択図】なし

Description

本発明は、軟骨分化培養液、及び軟骨組織に関する。

近年、幹細胞を用いた再生医療の研究が盛んに行われている。幹細胞は分化能を有し、培地組成の選択により分化をコントロールできることから、各種分野における応用が期待されている。

そして、例えば補綴歯科治療の分野においては、従来から骨造成の要求が高かった。そこで、間葉系幹細胞を軟骨分化させ、培養軟骨による骨造成技術の検討がなされるようになっている。

間葉系幹細胞の軟骨分化は、軟骨分化培養液を用いた培地中で間葉系幹細胞を培養することによりなされており、例えば非特許文献１には、α−ＭＥＭに、ＩＴＳ、ＴＧＦβ３、デキザメサゾン、アスコルビン酸を添加した培養液を用いた例が開示されている。

Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９９，２８４（５４１１）１４３−１４７

しかしながら、非特許文献１に開示されているような従来の培養液では軟骨分化が十分に促進できていなかった。

本発明は上記従来技術が有する問題に鑑みてなされたものであって、本発明の一側面では、間葉系幹細胞の軟骨分化を促進することができる軟骨分化培養液を提供することを目的とする。

本発明の一態様によれば、脂肪酸濃縮液と、
ビタミン液と、
ＥＡＡ（ＥｓｓｅｎｔｉａｌＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ）と、
エリスロポエチンと、
コンドロイチン硫酸と、
ヒアルロン酸と、
活性型ビタミンＤ_３と、を含む軟骨分化培養液を提供する。

本発明の一態様によれば、間葉系幹細胞の軟骨分化を促進することができる軟骨分化培養液を提供することができる。

以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明は、下記の実施形態に制限されることはなく、本発明の範囲を逸脱することなく、下記の実施形態に種々の変形および置換を加えることができる。

本実施形態では軟骨分化培養液の一構成例について説明する。

本実施形態の軟骨分化培養液は、脂肪酸濃縮液と、ビタミン液と、ＥＡＡ（ＥｓｓｅｎｔｉａｌＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ）と、エリスロポエチンと、コンドロイチン硫酸と、ヒアルロン酸と、活性型ビタミンＤ_３と、を含むことができる。

本発明の発明者らが、間葉系幹細胞の軟骨分化を促進することができる軟骨分化培養液について検討を行った。そして、脂肪酸濃縮液、ビタミン液、ＥＡＡ、エリスロポエチン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、及び活性型ビタミンＤ_３を含む軟骨分化培養液を用いることで間葉系幹細胞の軟骨分化を促進できることを見出した。

上述した成分のうち、脂肪酸濃縮液、ビタミン液、ＥＡＡは、細胞の培養に必要な脂肪酸、ビタミン、アミノ酸を供給するために添加しているものである。

上述した成分のうち、エリスロポエチンは赤血球の分泌を促進する成分として知られているが、本発明の発明者らの検討によると、間葉系幹細胞の軟骨分化を促進する機能も有することが見出された。

上述した成分のうち、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、は軟骨の基質に含まれる成分であり、間葉系幹細胞の軟骨分化を補助する機能を有する。

本実施形態の軟骨分化培養液は、従来軟骨の培養液に同時に添加されることのなかった、脂肪酸濃縮液、ビタミン液、ＥＡＡ、エリスロポエチン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、及び活性型ビタミンＤ_３を同時に含有することができる。本発明の発明者らの検討によれば、これらの成分を同時に含有することにより、本実施形態の軟骨分化培養液は特に間葉系幹細胞の軟骨分化を促進することができる。

軟骨分化培養液中のこれらの成分の含有量についても特に限定されるものではなく、任意にその含有量を選択することができる。

例えば、軟骨分化培養液中の脂肪酸濃縮液の含有量は、体積比で０．０１％以上１０％以下であることが好ましく、０．１％以上５％以下であることがより好ましい。

軟骨分化培養液中のビタミン液の含有量は、体積比で０．０１％以上１０％以下であることが好ましく、０．１％以上５％以下であることがより好ましい。

軟骨分化培養液中のＥＡＡの含有量は、体積比で０．０１％以上１０％以下であることが好ましく、０．１％以上５％以下であることがより好ましい。

軟骨分化培養液中のエリスロポエチンの含有量は、０．１ＩＵ／ｍＬ以上１０００ＩＵ／ｍＬ以下であることが好ましく、１ＩＵ／ｍＬ以上１００ＩＵ／ｍＬ以下であることがより好ましい。

軟骨分化培養液中のコンドロイチン硫酸の含有量は、０．１μｇ／ｍＬ以上１０００μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。

軟骨分化培養液中のヒアルロン酸の含有量は、０．０１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、０．１μｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。

軟骨分化培養液中の活性型ビタミンＤ_３の含有量は、０．０１ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、０．１ｎｇ／ｍＬ以上１０ｎｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。

本実施形態の軟骨分化培養液は、上述の成分以外にも任意の成分を含有することができる。

本実施形態の軟骨分化培養液は例えば、さらにヘパリンと、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃＦｉｂｒｏｂｌａｓｔＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ：塩基性線維芽細胞増殖因子）とを含有することができる。

本発明の発明者らの検討によると、ｂＦＧＦは、間葉系幹細胞の軟骨分化を促進する働きを有している。しかしながら、ｂＦＧＦは短期間に分解してしまうため、軟骨分化培養液がｂＦＧＦを含有するのみでは、間葉系幹細胞の軟骨分化を促進する観点では十分な効果を発揮することができなかった。

そこで、本発明の発明者らがさらに検討をおこなったところ、ヘパリンは、ｂＦＧＦを安定化する働きを有することが見出された。このため、ヘパリンとｂＦＧＦとを併せて含有する軟骨分化培養液は、ｂＦＧＦによる間葉系幹細胞の軟骨分化促進の効果を継続させることができ、特に間葉系幹細胞の軟骨分化を促進する機能を高めることができる。従って、上述のように本実施形態の軟骨分化培養液がｂＦＧＦを含有する場合には、同時にヘパリンも含有していることが好ましい。

軟骨分化培養液中のヘパリン、及びｂＦＧＦの含有量は特に限定されるものではなく、任意に選択することができる。例えば、軟骨分化培養液中のヘパリンの含有量は１Ｕｎｉｔ／ｍＬ以上１００００Ｕｎｉｔ／ｍＬ以下であることが好ましく、１０Ｕｎｉｔ／ｍＬ以上１０００Ｕｎｉｔ／ｍＬ以下であることがより好ましい。

また、軟骨分化培養液中のｂＦＧＦの含有量は１ｎｇ／ｍＬ以上１００００ｎｇ／ｍＬ以下であること好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ以上１０００ｎｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。

本実施形態の軟骨培養液は、さらに任意の成分を含有することができる。

本実施形態の軟骨分化培養液は、例えばさらに、ＴＧＦ−β３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−β３）と、インスリンと、ＩＴＳ＋（Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｔｅ）と、を含むことが好ましい。

ＴＧＦ−β３、インスリン、及びＩＴＳ＋についても間葉系幹細胞の軟骨分化を促進する働きを有している。このため、これらの成分を含有する軟骨分化培養液は間葉系幹細胞の軟骨分化を促進することができる。

従来の培養液において、インスリン、またはＩＴＳ＋のいずれか一方を添加することは知られていたが、両成分を同時に添加することは行われていなかった。ところが、本発明の発明者らの検討によると、インスリンと、ＩＴＳ＋と、を同時に添加することにより、間葉系幹細胞の軟骨分化を特に促進することができる。

軟骨分化培養液中のＴＧＦ−β３、インスリン、及びＩＴＳ＋の含有量は特に限定されるものではなく、任意にその含有量を選択することができる。

例えば軟骨分化培養液中のＴＧＦ−β３の含有量は０．１ｎｇ／ｍＬ以上１０００ｎｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。

また、軟骨分化培養液中のインスリンの含有量は、１μｇ／ｍＬ以上１００００μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ以上１０００μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。

軟骨分化培養液中のＩＴＳ＋の含有量は、体積比で０．１％以上１０％以下であることが好ましく、０．５％以上５％以下であることがより好ましい。

また、さらにここまで説明した成分以外にも、本実施形態の軟骨分化培養液は、抗生物質等も含有することができる。

軟骨分化培養液の基材としては例えば基礎培地を用いることができ、基材に上記成分を添加、混合することにより軟骨分化培養液とすることができる。この際用いる基礎培地の種類は特に限定されるものではなく、一般的に市販されている各種基礎培地を用いることができる。特に基礎培地としては例えばＤＭＥＭ等を好ましく用いることができる。また基礎培地は、市販品に依らなくとも、水にアミノ酸、ビタミン、ｐＨ調整剤等の各種成分を添加して作製することもできる。このとき用いる水は、微粒子、イオン微粒金属や有機物を除去した超純水であることが好ましい。勿論、水に基礎培地の成分及び、上記成分を混合することによっても本実施形態の軟骨分化培養液を作製することができる。

そして、上述の軟骨分化培養液を用いた培地中で、分化した軟骨細胞からなる軟骨組織を生成することができる。

上述の軟骨分化培養液を用いた培地中で、間葉系幹細胞を分化した軟骨細胞からなる軟骨組織を生成する場合、従来の培養液を用いた培地により間葉系幹細胞を分化した軟骨細胞からなる軟骨組織を生成する場合と比較して、軟骨基質の産生量を多くすることができる。

まず、以下の各実験例において調製した軟骨分化培養液の評価手順について説明する。
（移植細胞の準備）
移植細胞としては、以下の手順によりヒト腸骨骨髄液から採取した間葉系幹細胞を用いた。

ヒト腸骨骨髄液を採取し、αＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ、３２単位／ｍｌペンシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン）でよく懸濁し，骨髄液をほぐした後、３００ｇ、５分間遠心分離して、細胞を分離した。

前記骨髄液から約７×１０^７個の有核細胞を得た。骨髄液から採取した細胞を有核細胞数３．７５×１０^７細胞個／７５ｃｍ^２となるように培養フラスコへ播種し、３７℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培地を交換し、以後３日に１回培地を交換した。ｂＦＧＦは５日目から３ｎｇ／ｍｌで培地に添加した。１０日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン（０．０５％）＋ＥＤＴＡ（０．２ｍＭ）で５分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をＣｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｚ１シングル，コールター社製）で計測し、５，０００細胞個／ｃｍ^２の密度で細胞を播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的（コンフルエント）になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を試験に用いた。
（軟骨への分化誘導）
増殖させた細胞を２×１０^５細胞個／１ｍｌの密度で、各実験例で調製した軟骨分化培養液を用いた軟骨分化培地に懸濁させ、１５ｍｌ遠枕管に移し、５００Ｇで遠心し、ペレット（細胞塊）を得た。

遠枕管のフタをゆるめ、３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養した。２日目で軟骨分化培地を交換し、以後２日に１回培地を交換し、４週間培養して軟骨へと分化誘導した。

なお、培地を交換する際には、各実験例で調製した軟骨分化培養液を用いている。
（評価方法）
上述のように各実験例の軟骨分化培養液を用いて軟骨へと分化誘導した後、以下の２つの手法により評価を行った。
＜病理組織学的評価＞
各実験例の軟骨分化培養液により培養した組織を１０％ホルマリン中性緩衝溶液で２日間固定した後にパラフィン包埋し、ミクロトームにて厚さ５μｍに切り出し、トルイジンブルー染色を行った。そして、光学顕微鏡下にて観察を行い染色の有無を確認した。

後述する表に示した各実験例の評価結果のうち×は染色が無かったことを、すなわち軟骨組織が確認されなかったことを示している。

そして、後述する表に示した各実験例の評価結果のうち、〇については染色があったことを、すなわち軟骨組織が確認されたことを示している。染色があった試料については、トルイジンブルー染色にて赤紫色に染まるメタクロマジー（異調性）陽性の軟骨基質が多く沈着した成熟した軟骨組織である事を確認した。
＜生物学的評価＞
培養した組織をパパイン水溶液で消化したサンプルをＧＡＧ定量キットおよびＤＮＡ定量キットで定量し、単位ＤＮＡあたりのグリコサミノグリカン量を算定し、別途細胞数とＤＮＡ量の関係を計測した結果より単位細胞あたりのグリコサミノグリカン量を定量した。ＩＩ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲンはＥＬＩＳＡにより定量し、同様に単位細胞あたりの数値として算出した。

なお、評価は以下の表１に示す成分からなる培養液を軟骨分化培養液として用いて、上述の手順と同様にして軟骨組織を培養し、培養した軟骨組織について同様にして分析した結果を基準として、後述する評価式に基づいて行った。なお、表１に示す成分からなる培養液は、既述の非特許文献１（より具体的には非特許文献１の参考文献１９も参照）に開示された培養液の組成を示している。また、表１中ＤＭＥＭの添加量を残部としているが、これはＤＭＥＭが軟骨分化培養液を１ｍｌ調製した場合の残部であることを示している。

評価は具体的には、（１）単位細胞あたりのグリコサミノグリカン量、及び（２）ＩＩ型コラーゲン比率（ＩＩ／（Ｉ＋ＩＩ）×１００（％））を算出し、その結果について、以下の評価式に基づいて基準値と、各実験例の結果とを比較して〇〜××で評価している。

なお、単位細胞あたりのグリコサミノグリカン量、及びＩＩ型コラーゲン比率は数値が大きいほど軟骨分化が促進されていることを意味する。

以下の評価式中Ｃｔｒｌが表１に示した培養液を用いて培養した軟骨組織についての評価結果を、Ｅｘが各実験例で調製した培養液を用いて培養した軟骨組織についての評価結果を示している。
○ ： Ctrl ＜＜＜ Ex （実験結果（Ｅｘ）がコントロール（Ｃｔｒｌ）の１．２倍以上）
△ ： Ctrl ＜ Ex （実験結果（Ｅｘ）がコントロール（Ｃｔｒｌ）の１．０５倍以上１．２倍未満）
× ： Ctrl ＝ Ex （実験結果（Ｅｘ）がコントロール（Ｃｔｒｌ）の１倍以上１．０５倍未満）
×× ： Ctrl ＞ Ex （実験結果（Ｅｘ）がコントロール（Ｃｔｒｌ）未満）
いずれの実験例においても（１）単位細胞あたりのグリコサミノグリカン量についての評価と、（２）ＩＩ型コラーゲン比率（ＩＩ／（Ｉ＋ＩＩ）×１００（％））についての評価とは同じ評価となった。このため、表７、表８の生物学的評価の欄で１つの結果として示している。

次に、各実験例における軟骨分化培養液の調製手順について説明する。例１、例１０〜例３７が実施例、例２〜例９が比較例となる。

なお、以下の各実験例においてＩＴＳ＋、脂肪酸濃縮液、ビタミン液、ＥＡＡとしては表２〜表５に示した成分を含有する試薬を用いている。表２がＩＴＳ＋、表３が脂肪酸濃縮液、表４がビタミン液、表５がＥＡＡの組成をそれぞれ示している。

［例１〜例９］
以下の表６に示した共通成分と、各実験例について表７に示した各成分とを混合することにより軟骨分化培養液を調製した。

すなわち、例えば例１の場合には、表６に示した共通成分と、表７に示した脂肪酸濃縮液１％と、ビタミン液０．５％と、ＥＡＡ１％と、エリスロポエチン１５ＩＵ／ｍＬと、コンドロイチン硫酸２０μｇ／ｍＬと、ヒアルロン酸１μｇ／ｍＬと、活性型ビタミンＤ_３を０．５ｎｇ／ｍＬとの割合で混合して軟骨分化培養液を調製した。

なお、脂肪酸濃縮液、ビタミン液、ＥＡＡの単位は体積比での百分率を示しており、共通成分を含む軟骨分化培養液全体に対する比率を示している。

また、表６においてＤＭＥＭの添加量を残部としているが、これはＤＭＥＭが、軟骨分化培養液を１ｍｌ調製した場合の残部であることを示している。

得られた軟骨分化培養液を用いて上述の手順により軟骨への分化誘導を行った後、培養した軟骨組織について上述の評価を行った。結果を表７に示す。

以上に示した実験例のうち、例１と、例２〜例８と、を比較すると例１では生物学的評価が〇になっているのに対して、例２〜８では×になっていた。この結果から、例１では間葉系幹細胞の軟骨分化が特に促進されていることが確認できた。

表７に示すように、例１の軟骨分化培養液は、脂肪酸濃縮液と、ビタミン液と、ＥＡＡと、エリスロポエチンと、コンドロイチン硫酸と、ヒアルロン酸と、活性型ビタミンＤ_３とを同時に含んでいる。これに対して。例２〜例８の軟骨分化培養液は、上述の成分のうち、いずれか１つの成分を含んでいない。

これらの結果から、上述の成分をすべて含む例１の軟骨分化培養液を用いた培地を使用することにより、各成分が相乗的に働き、間葉系幹細胞の軟骨分化を特に促進できることを確認できた。

また、特に上述の成分をいずれも含んでいない例９は、生物学的評価が××となっており、例２〜例８よりもさらに間葉系幹細胞の軟骨分化を促進する効果が大きく劣ることを確認できた。

［例１０〜例３７］
上述の表６に示した共通成分と、各実験例について表８に示した各成分とを混合した点以外は、例１と同様にして軟骨分化培養液を調製した。そして、得られた軟骨分化培養液を用いて上述の手順により軟骨への分化誘導を行った後、培養した軟骨組織について上述の評価を行った。結果を表８に示す。

例１０、例１１と、例２とを比較すると、例２は生物学的評価が×となっているのに対して、例１０、例１１は△となっており、例１０、例１１の方が軟骨分化を促進する効果が優れていることを確認できた。ただし、例１と例１０、例１１とを比較すると、例１の生物学的評価は〇であることから、例１の方がより軟骨分化を促進する効果に優れていること確認できた。

また、例２４〜例３７においては生物学的評価が〇になることを確認できた。

これらの結果から軟骨分化培養液は、脂肪酸濃縮液を体積比で０．０１％以上１０％以下含有することが好ましいことを確認できた。

例１２、例１３と、例３とを比較すると、例３は生物学的評価が×となっているのに対して、例１２、例１３は△となっており、例１２、例１３の方が軟骨分化を促進する効果が優れていることを確認できた。ただし、例１と例１２、例１３とを比較すると、例１の生物学的評価は〇であることから、例１の方がより軟骨分化を促進する効果に優れていること確認できた。

これらの結果から軟骨分化培養液は、ビタミン液を体積比で０．０１％以上１０％以下含有することが好ましいことを確認できた。

例１４、例１５と、例４とを比較すると、例４は生物学的評価が×となっているのに対して、例１４、例１５は△となっており、例１４、例１５の方が軟骨分化を促進する効果が優れていることを確認できた。ただし、例１と例１４、例１５とを比較すると、例１の生物学的評価は〇であることから、例１の方がより軟骨分化を促進する効果に優れていること確認できた。

これらの結果から軟骨分化培養液は、ＥＡＡを体積比で０．０１％以上１０％以下含有することが好ましいことを確認できた。

例１６、例１７と、例５とを比較すると、例５は生物学的評価が×となっているのに対して、例１６、例１７は△となっており、例１６、例１７の方が軟骨分化を促進する効果が優れていることを確認できた。ただし、例１と例１６、例１７とを比較すると、例１の生物学的評価は〇であることから、例１の方がより軟骨分化を促進する効果に優れていること確認できた。

これらの結果から軟骨分化培養液は、エリスロポエチンを０．１ＩＵ／ｍＬ以上１０００ＩＵ／ｍＬ以下含有することが好ましいことを確認できた。

例１８、例１９と、例６とを比較すると、例６は生物学的評価が×となっているのに対して、例１８、例１９は△となっており、例１８、例１９の方が軟骨分化を促進する効果が優れていることを確認できた。ただし、例１と例１８、例１９とを比較すると、例１の生物学的評価は〇であることから、例１の方がより軟骨分化を促進する効果に優れていること確認できた。

これらの結果から軟骨分化培養液は、コンドロイチン硫酸を０．１μｇ／ｍＬ以上１０００μｇ／ｍＬ以下含有することが好ましいことを確認できた。

例２０、例２１と、例７とを比較すると、例７は生物学的評価が×となっているのに対して、例２０、例２１は△となっており、例２０、例２１の方が軟骨分化を促進する効果が優れていることを確認できた。ただし、例１と例２０、例２１とを比較すると、例１の生物学的評価は〇であることから、例１の方がより軟骨分化を促進する効果に優れていること確認できた。

これらの結果から軟骨分化培養液は、ヒアルロン酸を０．０１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下含有することが好ましいことを確認できた。

例２２、例２３と、例８とを比較すると、例８は生物学的評価が×となっているのに対して、例２２、例２３は△となっており、例２２、例２３の方が軟骨分化を促進する効果が優れていることを確認できた。ただし、例１と例２２、例２３とを比較すると、例１の生物学的評価は〇であることから、例１の方がより軟骨分化を促進する効果に優れていること確認できた。

これらの結果から軟骨分化培養液は、活性型ビタミンＤ_３を０．０１ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下含有することが好ましいことを確認できた。

Claims

脂肪酸濃縮液と、
ビタミン液と、
ＥＡＡ（ＥｓｓｅｎｔｉａｌＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ）と、
エリスロポエチンと、
コンドロイチン硫酸と、
ヒアルロン酸と、
活性型ビタミンＤ_３と、を含む軟骨分化培養液。
前記脂肪酸濃縮液の含有量が体積比で０．０１％以上１０％以下、
前記ビタミン液の含有量が体積比で０．０１％以上１０％以下、
前記ＥＡＡの含有量が体積比で０．０１％以上１０％以下、
前記エリスロポエチンの含有量が０．１ＩＵ／ｍＬ以上１０００ＩＵ／ｍＬ以下、
前記コンドロイチン硫酸の含有量が０．１μｇ／ｍＬ以上１０００μｇ／ｍＬ以下、
前記ヒアルロン酸の含有量が０．０１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下、
前記活性型ビタミンＤ_３の含有量が０．０１ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下である請求項１に記載の軟骨分化培養液。
請求項１または２に記載された軟骨分化培養液を用いた培地中で、分化した軟骨細胞からなる軟骨組織。