PT1730175E - Expressão optimizada de hpv 52 l1 em levedura - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "EXPRESSÃO OPTIMIZADA DE HPV 52 Ll EM LEVEDURA"

ÂMBITO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se em geral à prevenção e/ou terapêutica de infecções por papilomavírus humano (HPV). Mais especificamente, a presente invenção refere-se a polinucleótidos sintéticos codificadores da proteína HPV 52 Ll e aos vectores recombinantes e hospedeiros que compreendem estes polinucleótidos. A presente invenção refere-se também a partículas tipo vírus (VLP) de HPV 52 (VLPs), sendo as VLPs produzidas por meio de expressão de HPV 52 Ll ou Ll + L2 recombinante em células de levedura e respectiva utilização em vacinas e composições farmacêuticas destinadas à prevenção e tratamento de infecções por HPV.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Existem mais de 80 tipos de papilomavírus humano (HPV) muitos dos quais têm sido associados a uma grande variedade de fenotipos biológicos, desde verrugas proliferativas benignas até carcinomas malignos (para informação, ver McMurray et al., Int. J. Exp. Pathol. 82(1): 15-33 (2001)). O HPV6 e HPVll são os tipos mais vulgarmente associados a verrugas benignas, condyloma acuminata não maligno e/ou displasia de baixo grau da mucosa genital ou respiratória. O HPV16 e HPV18 são os tipos de alto risco mais frequentemente associados a carcinomas in situ e invasivos 2 do cérvix, vagina, vulva e canal anal. Mais de 90% dos carcinomas cervicais estão associados a infecções de HPV16, HPV18 ou os tipos oncogénicos menos prevalentes HPV31, -33, -45, -52 e -58 (Schiffman et al., J. Natl. Câncer Inst. 85(12): 958-64 (1993)). A observação de que ADN de HPV é detectado em 90 a 100 % dos cancros cervicais proporciona fortes sinais epidemiológicos de que HPV provoca o carcinoma cervical (vide Bosch et al., J. Clin. Pathol. 55: 244-265 (2002)).

Os papilomavírus são vírus pequenos (50-60 nm), sem envelope, de ADN icosaédrico, que codificam até oito genes de expressão precoce e dois genes de expressão tardia. As grelhas de leitura aberta (open reading frames - ORFs) dos genomas virais são designadas El a E9 e LI e L2, designando "E" os precoces e "L" os tardios. LI e L2 codificam as proteínas do capsídeo do vírus, enquanto os genes E estão associados a funções, tais como a replicação virai e transformação celular. A proteína Ll é a principal proteína do capsídeo e possui um peso molecular entre 55-60 kDa. A proteína L2 é a proteína do capsídeo menor. Dados imunológicos sugerem que a maior parte da proteína L2 é interna à proteína Ll no capsídeo virai. Ambas as proteínas Ll e L2 são muito conservadas entre os diferentes papilomavírus. A expressão da proteína Ll ou uma combinação das proteínas Ll e L2 em levedura, células de insecto, células de mamífero ou bactérias conduz a uma auto-montagem de partículas de tipo vírus (VLPs) (para informação, vide Schiller e Roden, in Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds 3

Medicai Information, pp 101-12 (1996)). As VLPs são morfologicamente semelhantes a viriões e são capazes de induzir titulações elevadas de anticorpos neutralizantes quando administradas a animais ou seres humanos. Porque as VLPs não contêm o genoma virai potencialmente oncogénico, representam uma alternativa segura à utilização do virus vivo no desenvolvimento da vacina contra o HPV (para informação, vide Schiller e Hidesheim, j. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000)). Por esta razão, os genes LI e L2 foram identificados como alvos imunológicos para o desenvolvimento de vacinas profiláticas e terapêuticas para a infecção e doença por HPV. O desenvolvimento e comercialização de uma vacina contra o HPV têm sido dificultados por dificuldades associadas à obtenção de níveis de expressão elevados de proteínas do capsídeo em organismos hospedeiros transformados, limitando a produção de proteína purificada. Por conseguinte, apesar da identificação das sequências de nucleótidos de tipo selvagem codificadoras das proteínas HPV Ll, tal como proteína HPV 52 Ll seria muito desejável desenvolver uma fonte imediatamente renovável de proteína HPV Ll que utiliza sequências de nucleótidos codificadoras de HPV 52 Ll que são optimizadas para expressão na célula hospedeira pretendida. Adicionalmente seria útil produzir grandes quantidades de VLPs de HPV 52 Ll com propriedades criadoras de imunidade das proteínas activas para utilização no desenvolvimento de vacinas. 4

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a composições e métodos para desencadear ou intensificar imunidade aos produtos proteicos expressos pelos genes HPV 52 Ll. Especificamente, a presente invenção apresenta polinucleótidos codificadores da proteína HPV 52 Ll, tendo os polinucleótidos sido optimizados ao nivel dos codões para uma expressão elevada em células de levedura. Em concretizações alternativas da invenção, a sequência de nucleótidos do polinucleótido é alterada de forma a eliminar os sinais de terminação da transcrição que são reconhecidos pela levedura. A presente invenção apresenta também a partículas tipo virus HPV 52 (VLPs), sendo as VLPs produzidas por meio de expressão de HPV 52 Ll ou Ll + L2 recombinante em células de levedura e apresenta a utilização de VLPs de HPV 52 em composições imunogénicas e vacinas destinadas à prevenção e tratamento de doenças provocadas pelo HPV e cancro associado a HPV.

A presente invenção refere-se a moléculas de ADN sintético, codificadoras da proteína HPV 52 Ll. Os codões das moléculas sintéticas são concebidos para utilizarem os codões preferidos por uma célula de levedura. Numa concretização alternativa da invenção, a sequência de nucleótidos da molécula sintética é alterada de forma a eliminar os sinais de terminação da transcrição que são reconhecidos pela levedura. As moléculas sintéticas podem ser utilizadas como fonte da proteína HPV 52 Ll que se pode auto-construir em VLPs. Estes VLPs podem ser utilizados numa vacina à base de VLP.S

Uma concretização de exemplo da presente invenção inclui uma molécula de ácido nucleico sintética que 5 codifica a proteina HPV 52 Ll, tal como apresentado na SEQ ID NO:2, compreendendo a molécula de ácido nucleico mencionada uma sequência de nucleótidos que com codões optimizados para expressão elevada numa célula de levedura. São também apresentados vectores recombinantes e células hospedeiras recombinantes, tanto procariotas como eucariotas, que contêm as moléculas de ácido nucleico divulgadas ao longo desta especificação. Numa forma de concretização preferida da presente invenção, a célula hospedeira é uma célula de levedura. A presente invenção refere-se também a um processo de expressão de uma proteina HPV 52 Ll numa célula hospedeira recombinante, compreendendo: (a) introdução de um vector compreendendo um ácido nucleico codificador de uma proteína HPV 52 Ll numa célula hospedeira de levedura e (b) a cultura da célula hospedeira de levedura em condições que permitem a expressão da proteína HPV 52 Ll mencionada. A presente invenção refere-se também a um processo de expressão de uma proteína HPV 52 Ll numa célula hospedeira recombinante, compreendendo: (a) introdução de um vector compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificadora de uma proteína HPV 52 Ll numa célula hospedeira de levedura, sendo a molécula de ácido nucleico com optimização de codões para expressão óptima na célula hospedeira de levedura e (b) a cultura da célula hospedeira de levedura em condições que permitem a expressão da proteína HPV 52 Ll mencionada.

Em concretizações preferidas, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleótidos, tal como 6 apresentado na SEQ ID N0:1 (presentemente designada "sequência 52 Ll R") . A presente invenção refere-se também a partículas tipo vírus (VLPs) que são produzidas em células de levedura, métodos de produção de VLPs de HPV 52 e métodos de utilização de VLPs de HPV 52.

Numa concretização preferida da invenção, a levedura é seleccionada a partir do grupo constituído por: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyvermyces fragilis, Kluveromyces lactis e Schizosaccharomyces pombe.

Outro aspecto da presente invenção é uma VLP de HPV 52 em que a VLP é produzida por expressão recombinante de HPV 52 Ll ou HPV 52 Ll + L2 numa célula de levedura.

Ainda outro aspecto da presente invenção consiste numa VLP de HPV 52 que inclui uma proteína HPV 52 Ll produzida por um gene HPV 52 Ll com optimização de codões. Numa concretização de exemplo deste aspecto da invenção, o gene HPV 52 Ll com codões optimizados inclui uma sequência de nucleótidos, tal como apresentado na SEQ ID N0:1. A presente invenção apresenta também um método de indução de uma resposta imunitária num animal, compreendendo a administração de partículas tipo vírus HPV 52 ao animal. Numa concretização preferida as VLPs de HPV 52 são produzidas por um gene com optimização de codões.

Ainda outro aspecto da presente invenção consiste num método de prevenção ou tratamento do cancro cervical associado a HPV, compreendendo a administração a um mamífero de uma vacina compreendendo VLPs de HPV 52. Numa 7 concretização preferida deste aspecto da invenção, as VLPs de HPV 52 são produzidas em levedura. A presente invenção refere-se também a uma vacina compreendendo particulas tipo virus (VLPs) de HPV 52, em que as VLPs de HPV 52 são produzidas em levedura.

Numa concretização alternativa deste aspecto da invenção, a vacina inclui ainda VLPs de pelo menos um tipo adicional de HPV. 0 pelo menos um tipo adicional de HPV pode ser qualquer tipo de HPV de interesse, incluindo qualquer tipo de HPV descrito na técnica ou identificado mais adiante. Numa concretização preferida, o tipo HPV é um tipo que esta associado a um fenotipo clinico, tal como verrugas ou cancro cervical. Noutra concretização preferida da invenção, o pelo menos um tipo de HPV adicional é seleccionado do grupo constituído por: HPV6, HPVll, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 e HPV68. A presente invenção refere-se também a composições farmacêuticas compreendendo partículas tipo vírus de HPV 52, em que as VLPs de HPV 52 são produzidas em levedura. Além disso, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo VLPs de HPV 52 e VLPs de pelo menos um tipo de HPV adicional. Numa concretização preferida, o pelo menos um tipo de HPV adicional é seleccionado do grupo constituído por: HPV6, HPVll, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 e HPV68. A forma no singular "um", "uma" e "o", "a", tal como utilizadas ao longo da especificação e reivindicações 8 anexas, incluem as referências no plural excepto no caso de o contexto indicar expressamente o contrário.

Tal como utilizado ao longo da especificação e reivindicações anexas, aplicam-se as seguintes definições e abreviaturas: 0 termo "promotor" refere-se a um local de reconhecimento numa cadeia de ADN à qual se liga a ARN polimerase. 0 promotor forma um complexo de iniciação com a ARN polimerase para iniciar e accionar a actividade transcricional. 0 complexo pode ser modificado por sequências activadoras designadas "intensificadores" ou "sequências activadoras a montante" ou sequências inibidoras designadas "silenciadoras". 0 termo "vector" refere-se a um meio de introdução dos fragmentos de ADN num organismo hospedeiro ou tecido hospedeiro. Existem vários tipos de vectores, incluindo plasmídeos, vírus (incluindo adenovírus), bacteriófagos e cosmídeos. 0 termo "cassete" refere-se a um nucleótido ou sequência genética que deve ser expressa de um vector, por exemplo, a sequência de nucleótidos ou genética codificadora da proteína HPV 52 Ll. Em geral, uma cassete inclui uma sequência genética inserida num vector que, nalgumas concretizações, proporciona sequências reguladoras para expressar a sequência de nucleótidos ou genética. Noutras concretizações, a sequência de nucleótidos ou genética proporciona as sequências reguladoras para a respectiva expressão. Noutras concretizações, o vector proporciona algumas sequências reguladoras e a sequência de nucleótidos ou genética proporciona outras sequências 9 reguladoras. Por exemplo, o vector pode proporcionar um promotor para transcrição da sequência de nucleótidos ou genética e a sequência de nucleótidos ou genética proporciona uma sequência de terminação da transcrição. As sequências reguladoras que podem ser apresentadas pelo vector incluem, sem ficarem limitadas a, intensificadores, sequências de terminação da transcrição, sequências aceitadoras e dadoras de splicing, intrões, sequências de ligação de ribossomas e sequências de adição poli(A).

As designações "sequência tipo selvagem 52 Ll" e "sequência 52 Ll wt" referem-se à sequência HPV 52 Ll apresentada como SEQ ID NO:3. Embora a sequência de tipo selvagem de HPV 52 Ll tenha sido previamente descrita não é invulgar encontrar variações minimas de sequência entre os ADNs obtidos de isolados clínicos. Por conseguinte, foi isolada uma sequência de tipo selvagem de HPV 52 Ll representativa a partir de amostras clínicas que se provou anteriormente conterem ADN de HPV 52 (ver EXEMPLO 1) . A sequência tipo selvagem 52 Ll foi utilizada como sequência de referência para comparar as sequências HPV 52 Ll com codões optimizados divulgadas no presente documento (ver FIGURA 1).

As designações "HPV 52 Ll R" e "52 Ll R" referem-se a uma sequência de nucleótidos de HPV 52 Ll sintética de exemplo (SEQ ID N0:1), divulgada no presente documento, tendo a sequência sido reconstruída de forma que inclua codões que são preferidos para expressão de alto nível por uma célula de levedura. O termo "quantidade eficaz" significa que é introduzida composição de vacina suficiente para provocar níveis 10 adequados de polipeptídeo, de forma a resultar numa resposta imunitária. Um perito na especialidade reconhece que este nível pode variar.

Uma "substituição de aminoácido conservadora" refere-se à substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo de aminoácido quimicamente semelhante. Constituem exemplos destas substituições conservadoras: Substituição de um resíduo hidrófobo (isoleucina, laucina, valina ou metionina) por outro, substituição de um resíduo polar por outro resíduo polar com a mesma carga (por exemplo, arginina por lisina, ácido glutâmico por ácido aspártico). O termo "mamífero" refere-se a qualquer animal, incluindo um ser humano. "vlp" ou "LVPs" significa(m) partícula tipo vírus ou partículas tipo vírus. "sintético" significa que o gene HPV 52 LI foi criado de forma a conter uma sequência de nucleótidos que não é igual à sequência de nucleótidos presente no gene HPV 52 Ll de tipo selvagem natural indicado (52 Ll wt, SEQ ID NO:3). Como anteriormente indicado, são apresentadas moléculas sintéticas compreendendo uma sequência de nucleótidos, compreendendo codões que são preferidos para a expressão por células de levedura. As moléculas sintéticas apresentadas codificam as mesmas sequências de aminoácidos que o gene HPV 52 Ll de tipo selvagem (SEQ ID NO:2).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS 11 A FIGURA 1 apresenta um alinhamento de sequência que compara nucleótidos que foram alterados no gene HPV 52 LI sintético da presente invenção (SEQ ID NO:l, indicado como "52 Ll R") (ver EXEMPLO 2) . A sequência de referência é a sequência de tipo selvagem HPV 52 Ll (SEQ ID NO:3, indicada como "52 Ll wt"; ver EXEMPLO 1). Os nucleótidos alterados estão indicados na localização respectiva. O número de nucleótidos está contido entre parenteses. Nucleótidos idênticos na sequência reconstruída 52 Ll são indicados com pontos. A FIGURA 2 mostra o ácido nucleico de cadeia dupla HPV 52 Ll sintético reconstruído (SEQ ID NOs: 1 e 7) e um sequência de aminoácidos de código simples (SEQ ID NO:2). O número de nucleótidos está indicado à esquerda. A FIGURA 3 mostra uma Northern blot de transcrições de hpv 52 Ll wt e 52 Ll R (ver exemplo 4). 0 blot foi sondado com uma mistura de sondas de ADN geradas contra ambas as sequências 52 Ll wt e 52 Ll R. A seta à direita indica a posição prevista da transcrição integral de 52 Ll. Não foram detectadas quaisquer transcrições, seja de que comprimento, nas pistas 5 e 10 pg do ARN 52 Ll wt. Transcrições integrais são evidentes no 52 Ll R, nas duas pistas 5 e 10 pg. A FIGURA 4 mostra uma Western blot de proteínas HPV 52 Ll wt (52 wt) e 52 Ll R (52R). HPV 16 Ll foi incluído como referência (16) . Dez, cinco e dois e meio microgramas do extracto proteico de levedura total foram desnaturados e aplicados no gel de SDS-PAGE 10%. A proteína foi transferida por Western blot. A proteína HPV 52 Ll foi detectada no blot resultante utilizando anti-soro 12 policlonal de cabra anti-trpE-HPV 31 Ll que inter-reage com HPV 52 Ll e HPV 16 Ll. Os marcadores do peso molecular estão indicados em kDa à esquerda. A seta indica a posição da proteína - 55 kDa HPV 52 Ll. A FIGURA % mostra uma amostra representativa de VLPs de HPV 52 constituída por moléculas de proteína HPV 52 Ll R, descritas, tal como visualizado por microscopia de electrões de transmissão (ver EXEMPLO 7) . 0 diâmetro das partículas esféricas nesta amostra em bruto oscila entre 40 e 70 nm, apresentando algumas partículas uma série regular de capsómeros. A barra representa aproximadamente 0,1 pm.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A maioria dos carcinomas cervicais estão associados a infecções de tipos oncogénicos específicos do papilomavírus humano (HPV). A presente invenção refere-se a composições e métodos para desencadear ou intensificar imunidade a produtos proteicos expressos por genes de tipos de HPV oncogénicos. Especificamente, a presente invenção apresenta polinucleótidos codificadores de HPV 52 Ll, sendo os polinucleótidos com optimização de codões para expressão elevada numa célula de levedura. A presente invenção proporciona também partículas tipo vírus (VLPs) HPV 52 que são produzidas em levedura e revela a utilização dos polinucleótidos mencionados e VLPs em composições imunogénicas e vacinas para a prevenção e/ou tratamento de cancro associado a HPV.

Foi declarada uma sequência de nucleótidos HPV 52 L! de tipo selvagem (n° acesso Genbank NC 001592). A presente invenção apresenta moléculas de ADN sintético, 13 codificadoras da proteína HPV 52 Ll. Num aspecto da invenção, as moléculas sintéticas compreendem uma sequência de codões, em que pelo menos alguns dos codões foram alterados para utilização dos codões preferidos por uma célula de levedura para expressão de alto nível. Num aspecto alternativo da invenção, a sequência de nucleótidos da molécula sintética é alterada de forma a eliminar os sinais de terminação da transcrição que são reconhecidos pela levedura. As moléculas sintéticas podem ser utilizadas como sequência de codificação para a expressão da proteína HPV 52 Ll, que se pode auto-construir em VLPs. Estes VLPs podem ser utilizados numa vacina à base de VLP para proporcionar uma imunoprofilaxia eficaz contra uma infecção por papilomavírus, através de anticorpos neutralizantes e imunidade mediada por células. Estas vacinas à base de vlp podem também ser úteis para o tratamento de infecções por HPV já estabelecidas. A expressão de VLPs de HPV em células de levedura oferece as vantagens de ser económico e facilmente adaptável a uma produção à escala industrial em fermentadores. Além disso, o genoma da levedura pode ser facilmente alterado para garantir a selecção de levedura recombinante, transformada com crescimento e potencial de expressão intensificados. No entanto, muitas proteínas de HPV Ll, incluindo HPV 52 são expressas em células de levedura a níveis que são inferiores do que o que será desejável para uma ampliação à escala comercial (ver EXEMPLO 2).

Assim, a presente invenção refere-se a sequências genéticas de HPV 52 Ll que são "optimizadas" para expressão elevada num ambiente celular de levedura. 14

Um codão "tripleto" de quatro bases de nucleótido possíveis pode existir em mais de 60 variantes. Porque estes codões proporcionam a mensagem para apenas 20 aminoácidos diferentes (bem como iniciação e terminação de transcrição) alguns aminoácidos podem ser codificados para mais do que um codão, um fenómeno conhecido por redundância entre codões. Por razões que ainda não são completamente entendidas, os codões alternativos são se encontram uniformemente presentes no ADN endógeno dos diferentes tipos de células. Na realidade, existe aparentemente uma hierarquia natural variável ou "preferência" por certos codões em certos tipos de células. Por exemplo, o aminoácido leucina é especificado por qualquer de seis codões de ADN, incluindo CTA, Etc, CTG, CTT, TTA e TTG. Uma análise exaustiva das frequências de uso de codões no genoma para microrganismos revelou que o ADN endógeno de E. coli contém muito vulgarmente o codão CTG para a leucina, enquanto o ADN de leveduras e bolores inclui muito vulgarmente um codão TTA para a leucina. Em vista desta hierarquia, acredita-se em geral que a probabilidade de obter elevados niveis de expressão de um polipeptídeo rico em leucina por um hospedeiro E. coli irá depender até um certo ponto da frequência de utilização do codão. Por exemplo, é provável que um gene rico em codões TTA seja pobremente expresso em E. coli, enquanto que um gene rico em CTG será provavelmente altamente expresso neste hospedeiro. De modo semelhante, um codão preferido para expressão de um polipeptídeo rico em leucina em células hospedeiras de levedura seria TTA.

As implicações dos fenómenos de preferência de codões em técnicas de ADN recombinante são manifestas e o fenómeno 15 pode servir para explicar muitos falhanços anteriores nas tentativas para atingir elevados níveis de expressão de genes exógenos em organismos hospedeiros transformados com êxito, um codão menos "preferido" pode encontrar-se repetidamente presente no gene inserido e o maquinismo de expressão da célula hospedeira pode não funcionar tão eficientemente. Este fenómenos sugere que genes sintéticos que foram concebidos para incluir os codões preferidos de uma célula hospedeira projectada proporcionam uma forma óptima de material genético estranho para prática da expressão de proteína recombinante. Assim, um aspecto da presente invenção consiste num gene HPV 52 LI com optimização de codões para expressão elevada numa célula de levedura. Numa concretização preferida da presente invenção, constatou-se que a utilização de codões alternativos codificadores da mesma sequência proteica podem remover as limitações de expressão das proteínas HPV 52 Ll por células de levedura.

De acordo com a presente invenção, os segmentos do gene HPV 52 Ll foram convertidos em sequências com sequências traduzidas idênticas mas com utilização de codões alternativos, como descrito por Sharp e Cowe (Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 7: 657-678 (1991)), que é incorporado por referência. A metodologia consiste geralmente na identificação de codões na sequência de tipo selvagem que não são vulgarmente associados a genes de leveduras muito expressos e substituição destes com codões óptimos para alta expressão em células de levedura. A nova sequência genética é depois inspeccionada para detectar sequências indesejadas geradas por estas substituições de codão (por exemplo, sequências "ATTTA", 16 criação inadvertida de locais de reconhecimento de splice de intrões, locais para enzimas de restrição indesejados, elevado teor de GC, presença de sinais de terminação da transcrição que são identificados pela levedura, etc). Sequências indesejadas são eliminadas por substituição dos codões existentes por codões diferentes para o mesmo aminoácido. A expressão aperfeiçoada dos segmentos genéticos sintéticos é depois testada.

Os métodos descritos anteriormente foram utilizados para criar segmentos de genes sintéticos para HPV 52 Ll, resultando num gene com codões optimizados para uma expressão elevada. Enquanto o procedimento anterior proporciona um resumo da nossa metodologia para a concepção de genes com codões optimizados para utilização em vacinas HPV, um perito na especialidade compreende que se pode alcançar uma eficácia de vacina ou expressão aumentada de genes semelhante com variações minimas no procedimento ou variações mínimas na sequência.

Assim, a presente invenção refere-se a um polinucleótido sintético compreendendo uma sequência de nucleótidos codificadora de uma proteína HPV 52 Ll ou um fragmento biologicamente activo ou forma mutante de uma proteína HPV 52 Ll, compreendendo a sequência de polinucleótidos codões optimizados para expressão numa célula hospedeira de levedura. As formas mutantes da proteína HPV 52 Ll incluem, sem se limitarem cL *.

Substituições conservadoras de aminoácidos, truncagens amino-terminais, truncagens carboxi-terminais, eliminações ou adições. Qualquer fragmento biologicamente activo e/ou mutante assim irá codificar uma proteína ou fragmento de proteína que mimetiza pelo menos substancialmente as 17 propriedades imunológicas da proteína HPV 52 Ll, como apresentado na SEQ ID NO:2. Os polinucleótidos sintéticos da presente invenção codificam moléculas mARN que expressam uma proteína HPV 52 Ll funcional de forma a ser útil no desenvolvimento de uma vacina terapêutica ou profilática contra HPV.

Um aspecto da presente invenção consiste numa molécula de ácido nucleico com codões optimizados que codifica a proteína HPV 52 Ll tal como apresentado na SEQ ID NO:2, compreendendo a molécula de ácido nucleico uma sequência de nucleótidos com codões optimizados para expressão elevada numa célula de levedura. Numa concretização preferida deste aspecto da invenção, a molécula de ácido nucleico inclui uma sequência de nucleótidos, tal como apresentado na SEQ ID NO:1. A presente invenção refere-se também a vectores recombinantes e células hospedeiras recombinantes, tanto procariotas como eucariotas que contêm as moléculas de ácido nucleico apresentadas ao longo desta especificação. Numa concretização preferida da presente invenção, a célula hospedeira é uma célula hospedeira de levedura. 0 ADN HPV 52 Ll sintético, respectivos equivalentes funcionais e respectivos fragmentos construídos através dos métodos descritos podem ser expressos de modo recombinante por clonagem molecular num vector de expressão contendo um promotor adequado e outros elementos reguladores da transcrição apropriados. 0 vector de expressão mencionado pode ser transferido em células hospedeiras procariotas ou eucariotas para produzir proteína HPV 52 Ll recombinante. As técnicas destas manipulações são integralmente descritas 18 na técnica (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Green Pub. Associates and Wiley-lnterscience, Nova Iorque (1988); Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, (1990), que são incorporados no presente documento na integra).

Assim, a presente invenção refere-se a um processo para a expressão da proteina HPV 52 Ll numa célula hospedeira recombinante, compreendendo: (a) introdução de um vector compreendendo um ácido nucleico codificador de uma proteina HPV 52 Ll numa célula hospedeira de levedura e (b) cultura da célula hospedeira de levedura em condições que permitem a expressão da proteina HPV 52 Ll. A presente invenção refere-se ainda a um processo para a expressão da proteina HPV 52 Ll numa célula hospedeira recombinante, compreendendo: (a) introdução de um vector compreendendo um ácido nucleico codificador de uma proteina HPV 52 Ll numa célula hospedeira de levedura, sendo a molécula de ácido nucleico com codões optimizados para expressão a um nivel óptimo na célula hospedeira de levedura e (b) cultura da célula hospedeira de levedura em condições que permitem a expressão da proteina de HPV 52 Ll mencionada. A presente invenção refere-se ainda a um processo para a expressão da proteina HPV 52 Ll numa célula hospedeira recombinante, compreendendo: (a) introdução de um vector compreendendo um ácido nucleico tal como apresentado na SEQ ID NO:l numa célula hospedeira de levedura e (b) cultura da 19 célula hospedeira de levedura em condições que permitem a expressão da proteína HPV 52 Ll.

Os genes sintéticos da presente invenção podem ser montados numa cassete de expressão que inclui sequências concebidas para proporcionar expressão eficiente da proteína HPV 52 Ll na célula hospedeira. A cassete contém preferencialmente o gene sintético que relaciona sequências de controlo transcricionais e traducionais ligadas operacionalmente ao mesmo, tal como um promotor e sequências de terminação. Numa concretização preferida, o promotor é o promotor S. cerevisiae GAL 1 embora os peritos na especialidade reconheçam que pode ser utilizado qualquer número de outros promotores de levedura conhecidos como os promotores GAL10, GAL7, ADHl, TDH3 ou PGK ou outros promotores de genes eucariotas. Um terminador transcricional preferido é o terminador S. cerevisiae ADHl embora possam ser utilizados outros terminadores transcricionais conhecidos. A combinação do promotor GALl -terminador ADJl é particularmente preferida.

Outro aspecto da presente invenção é uma partícula tipo vírus (VLP) HPV 52 produzida por expressão recombinante dos genes HPV 52 Ll ou Ll + L2 numa célula de levedura, métodos para a produção de VLPs de HPV 52 e métodos de utilização de VLPs de HPV 52. VLPs podem auto-construir-se quando Ll, a principal proteína capsídeo de papilomavírus humano e animal, é expressa em levedura, células de insecto, células de mamífero ou bactérias (para informação ver Schiller and Roden, in Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds Medicai Information, pp 101-12 (1996)). Podem também ser produzidas VLPs de HPV morfologicamente indistintas por meio de 20 expressão de uma combinação das proteínas capsídeo Ll e L2. As VLPs são constituídas por 72 pentâmeros de Ll numa estrutura icosaédrica T=7 (Baker et al., Biophys. J. 60(6): 1445-56 (1991)).

As VLPs são morfologicamente semelhantes a viriões autênticos e são capazes de induzir elevados títulos de anticorpos neutralizantes quando administradas num animal. Demonstrou-se que a imunização de coelhos (Breitburd et al., J. Virol. 69(6): 3959-63 (1995)) e cães (Suzich et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92(25): 11553-57 (1995)) com VLPs induziu anticorpos neutralizantes e protegeu contra a infecção experimental com papilomavírus. Adicionalmente, a imunização de mulheres adultas com VLPs de HPV 16 demonstrou proteger contra a infecção contra HPV 16 e neoplasia intraepitelial cervical por HPV 16 (Koutsky et al. N. Engl. J. Med. 347: 1645-51 (2002)). Porque as VLPs não contêm o genoma virai potencialmente oncogénico e podem auto-construir quando expressas a partir de um único gene constituem uma alternativa segura à utilização de vírus vivos no desenvolvimento de vacina de HPV (para informação, ver Schiller e Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000)).

Assim, a presente invenção refere-se a partículas tipo vírus constituídas por proteína Ll recombinante ou proteínas Ll + L2 recombinantes, em que a proteína recombinante é expressa numa célula de levedura.

Como anteriormente mencionado, numa concretização preferida da invenção as VLPs de HPV 52 são produzidas em levedura. Noutra concretização preferida, a levedura é seleccionado do grupo constituído por: Saccharomyces 21 cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis e Schizosaccharomyces pombe.

Outro aspecto da presente invenção é um VLP de HPV 52 que compreende uma proteína HPV 52 Ll produzida por um gene HPV 52 Ll com codões optimizados. Numa concretização preferida deste aspecto da invenção, o gene HPV 52 Ll com codões optimizados inclui uma sequência de nucleótidos, tal como apresentado na SEQ ID N0:1.

Ainda outro aspecto da presente invenção consiste num método de produção de VLPs de HPV 52 compreendendo: (a) transformação de levedura com uma molécula de ADN recombinante codificadora da proteína HPV 52 Ll ou proteínas HPV 52 Ll + L2; (b) cultura da levedura transformada em condições que permitem a expressão da molécula de ADN recombinante para produzir a proteína HPV 52 e (c) isolamento da proteína HPV 52 para produzir VLPs de HPV 52.

Numa concretização preferida deste aspecto da invenção, a levedura é transformada com um gene HPV 52 Ll com codões optimizados para produzir VLPs de HPV 52. Numa concretização particularmente preferida, o gene HPV 52 Ll com codões optimizados inclui uma sequência de nucleótidos, tal como apresentado na SEQ ID N0:1. A presente invenção apresenta também um método de indução de uma resposta imunitária num animal, compreendendo a administração de partículas tipo vírus HPV 52 ao animal. Numa concretização preferida as VLPs de HPV 52 são produzidas expressão recombinante de um gene com 22 codões optimizados codificador de HPV 52 Ll ou HPV 52 Ll + L2.

Ainda outro aspecto da presente invenção consiste num método de prevenção e/ou tratamento do cancro cervical associado a HPV, compreendendo a administração a um mamífero de uma vacina compreendendo VLPs de HPV 52. Numa concretização preferida deste aspecto da invenção, as VLPs de HPV 52 são produzidas em levedura. A presente invenção refere-se também a uma vacina compreendendo partículas tipo vírus (VLPs) de HPV 52.

Numa concretização alternativa deste aspecto da invenção, a vacina inclui ainda VLPs de pelo menos um tipo adicional de HPV. Numa concretização preferida, o pelo menos um tipo de HPV adicional é seleccionado do grupo constituído por: HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59 e HPV 68.

Numa concretização preferida deste aspecto da invenção, a vacina inclui ainda as VLPs de HPV 16.

Numa concretização preferida deste aspecto da invenção, a vacina inclui ainda as VLPs de HPV 16 e as VLPs de HPV 18.

Ainda noutra concretização preferida da invenção, a vacina inclui ainda as VLPs de HPV 6, as VLPs de HPV 11, as VLPs de HPV 16 e as VLPs de HPV 18. A presente invenção refere-se também a uma composição farmacêutica compreendendo partículas tipo vírus de HPV 52. Além disso, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo VLPs de HPV 52 e VLPs de pelo 23 menos um tipo de HPV adicional. Numa concretização preferida, o pelo menos um tipo de HPV adicional é seleccionado do grupo constituído por: HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59 e HPV 68.

As composições de vacina da presente invenção podem ser utilizadas isoladamente a dosagens apropriadas que permitem uma inibição óptima da infecção por HPV 52 com toxicidade potencial mínima. Além disso, a co-administração ou administração sequencial de outros agentes poderá ser desejável. A quantidade de partículas tipo vírus que serão introduzidas num receptor da vacina irá depender da imunogenicidade do produto genético expressado. Em geral, uma dose eficaz do ponto de vista imunogénico ou profilático de cerca de 10 pg a 100 pg e preferencialmente de cerca de 20 p a 60 p de VLPs é administrada directamente no tecido muscular. A injecção subcutânea, introdução intradérmica através da pele e outros modos de administração, tal como administração intraperitoneal, intravenosa ou inalação, podem também ser contemplados. Contempla-se também o fornecimento de vacinações de reforço. É também vantajosa a administração parentérica, tal como administração intravenosa, intramuscular, subcutânea ou outros meios de administração com adjuvantes, tal como alumínio ou adjuvante alumínio da Merck, simultaneamente com ou a seguir à introdução parentérica da vacina da presente invenção.

Todas as publicações mencionadas são incorporadas por referência, com o objectivo de descrever e divulgar 24 metodologias e materiais que podem ser utilizados no contexto da presente invenção. Nada, no presente documento deve ser considerado como admissão de que a invenção não tem direito de antecipar esta divulgação em virtude de invenção anterior.

Uma vez descritas as concretizações preferidas da invenção com referência às figuras anexas, subentende-se que a presente invenção não está limitada a estas concretizações precisas e que podem ser introduzidas várias alterações e modificações na mesma por um perito na especialidade sem sair do âmbito ou espirito da presente invenção tal como definida nas reivindicações anexas.

Os seguintes exemplos ilustram a invenção, mas não limitam a invenção. EXEMPLO 1

Determinação de uma sequência de HPV 52 Ll representativa A sequência de HPV 52 Ll foi anteriormente descrita (n° de acesso Genbank NC 001592) . Contudo, não é invulgar encontrar variações mínimas de sequências entre ADNs obtidos de isolados clínicos. Para determinar uma sequência de tipo selvagem de HPV 52 Ll representativa isolou-se adn de três amostras clínicas que se provou anteriormente conterem ADN de HPV 52. As sequências HPV 52 Ll foram amplificadas numa reacção em cadeia de polimerase (PCR) com polimerase DNA Taq e os seguintes iniciadores: 5' Ll 5' -ATGTCCGTGTGGCGGCCTAGT-3'(SEQ ID NO:4) e 3'52 Bgl II 5'-GAGATCT CAATTACACAAAGTG-3' (SEQ ID NO:5). Os produtos amplificados foram sujeitos a electroforése em géis de agarose e visualizados por coloração com brometo de etídio. 25

As bandas LI de - 1500 bp foram excisadas e o ADN foi purificado utilizando Geneclean Spin Kit (Q-Bio Gene, Carlsbad, CA). O ADN foi depois ligado ao vector de clonagem TA, pCR2.1 (invitrogen). Células de E. coli TOPIOF foram transformadas com a mistura de ligação e aplicadas em placas com agar LB, com canamicina IPTG e X-gal, para selecção de colónia azul/branco. As placas foram invertidas e incubadas durante 16 horas a 37 °C.

Executou-se PCR de colónia em cinco colónias brancas, originárias de cada um dos três isolados clínicos amplificados. Os iniciadores 5' LI e 3'52 Bgl II foram utilizados numa PCR bifásica, em que a primeira fase incluiu 10 ciclos de 96 °C durante 15 segundos (desnaturação), 55 °C durante 30 segundos (emparelhamento) e 68 °C durante 2 minutos (extensão) e a segunda etapa compreendeu 35 ciclos de um programa essencialmente semelhante, com excepção da fase de emparelhamento que foi executada a 50 °C durante 30 segundos. Os produtos da PCR foram sujeitos a electroforése em géis de agarose e visualizados por coloração com brometo de etídio. Várias colónias de cada isolado clínico continham produtos amplificados com bandas de -1500 bp. As colónias foram cultivadas em meio LB com canamicina, agitando a 37 °C durante 16 horas. Foram executadas minipreparações para extrair os ADNs de plasmídeo que foram digeridos com endonucleases de restrição para demonstrar a presença do gene Ll no plasmídeo. Os fragmentos de restrição resultantes foram visualizados por electroforése em gel de agarose e coloração com brometo de etídio.

Executou-se a sequenciação do ADN nos plasmídeos contendo as inserções Ll clonadas de cada um dos três 26 isolados clínicos. 0 ADN e sequências de aminoácido traduzidas foram comparados entre si e com as sequências de HPV 52 Ll anteriormente publicadas no Genbank. A análise da sequência dos três isolados clínicos revelou que nenhuma sequência era idêntica à sequência do Genbank (n° de acesso NC 001592) . Escolheu-se o clone n° 2C de pCR2.1 HPV 52L1 para ser a sequência de HPV 52 Ll representativa e será doravante designado como a "sequência de tipo selvagem 52 Ll" (SEQ ID NO:3, ver FIGURA 1). A sequência escolhida como 52 Ll de tipo selvagem (wt) continha uma mutação pontual quando comparada com a sequência do Genbank, que consistia numa mutação silenciosa no nucleótido 1308 (adenina guanina). A sequência de aminoácidos da sequência HPV 52 Ll wt era idêntica à sequência 52 Ll do Genbank. A sequência tipo selvagem HPV 52 Ll foi amplificada com o iniciador 5' Ll Bql II (5' - GAGATCT-CACAAAACAAAATGTCCGTGTGGC - 3' (SEQ ID NO: 6)) e O iniciador 3' 52 Bgl II descrito anteriormente para adicionar extensões Bgl II. Executou-se PCR utilizando polimerase Taq. O produto de PCR foi sujeito a electroforése num gel de agarose e visualizados por coloração com brometo de etídio. A banda de ~ 1500 bp foi excisada e o ADN foi purificado utilizando Geneclean Spin Kit (Q-Bio Gene, Carlsbad, CA) . O produto PCR foi depois ligado ao vector pCR2.1 e células TOPl OF' foram transformadas com a mistura de ligação. As colónias foram cultivadas em meio LB com canamicina, agitando a 37 °C durante 16 horas. Foram executadas minipreparações para extrair o ADN de plasmídeo. O gene HPV 52 Ll foi libertado das sequências vector com digestões com endonuclease de restrição Bgl II. O ADN digerido foi sujeito a electroforése em gel de agarose e 27 visualizados por coloração com brometo de etidio. A banda Ll foi purificada com o Geneclean Kit e ligada a um vector pGALHO digerido com BamHI, desfosforilado. Células E. coli TOPIOF' foram transformadas com a mistura de ligação.

Para detectar a inserção HPV 52 Ll na orientação correcta, amplificou-se por PCR o ADN plasmideo das colónias. Foi conduzida a sequenciação de ADN para confirmar a sequência e orientação das inserções. 0 clone seleccionado foi designado pGALHO-HPV 52L1 #5. Preparou-se ADN maxiprep do clone seleccionado. Células de Saccharomyces cerevisiae foram tornadas competentes por meio de criação de esferoplastos com glusulase e transformadas com pGALllO-HPV 52L1 #5. A mistura de transformação de levedura foi colocada em placa em agar com topo de Leu-sorbitol e foi incubada invertida durante 3 a 5 dias a 30 °C. As colónias foram colhidas e incubadas com alça em placas com Leu-sorbitol. As colónias isoladas foram subsequentemente desenvolvidas em 5 ml de Leu-Ade-sorbitol 5 x com glucose a 1,6 % e galactose a 4 % em culturas em tubos de rotação a 30 °C para induzir a transcrição de HPV 52 Ll e a expressão de proteínas. EXEMPLO 2

Optimização do codão de levedura

Os codões preferidos de levedura já foram descritos (Sharp, Paul M e Cowe, Elizabeth. Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae YEAST 7: 657-678 (1991)). A expressão da proteína HPV 52 Ll wt foi detectável, no entanto, o nível de expressão da transcrição foi muito baixo e indetectável por Northern blot. Postulou-se que a 28 terminação prematura da transcrição poderia ser responsável pelos baixos níveis de expressão do gene HPV 52 Ll. Para aumentar a transcrição deste gene e garantir a produção de transcrições integrais, o gene HPV 52 Ll foi reconstruído utilizando codões preferidos da levedura. A sequência foi inspeccionada para detectar a presença de sinais de terminação da transcrição da levedura que foram que sejam reconhecidas por leveduras e estas sequências foram eliminadas por substituição com codões alternativos, enquanto conservam a mesma sequência de aminoácidos. A sequência HPV 52 Ll reconstruída, que compreende sequências com codões optimizados de levedura, continha 379 alterações de nucleótidos em comparação com a sequência HPV 52 Ll wt. A sequência resultante é designada "52 Ll R" (R reconstruída, ver FIGURA 1) . As alterações de nucleótido entre 52 Ll wt (SEQ ID N0:3) e 52 Ll R (SEQ ID N0:1) encontram-se na FIGURA 1. A sequência de aminoácidos traduzida de 58 Ll R não foi alterada (SEQ ID N0:2), ver FIGURA 2). A sequência reconstruída proporciona uma maior expressão da proteína HPV 52 Ll, o que constitui um avanço significativo em relação ao tipo selvagem empregue no desenvolvimento da vacina. A estratégia empregue para produzir o gene optimizado consistia em desenhar longos oligómeros sobrepostos sense e antisense, qua abrangiam todo o gene, substituindo nucleótidos com sequências de codão preferidas enquanto mantinham a sequência de aminoácidos. Estes oligómeros foram utilizados em vez do ADN modelo numa reacção PCR com polimerase ADN Pfu. Iniciadores de amplificação adicionais foram concebidos e utilizados para amplificar as sequências reconstruídas a partir dos oligómeros modelo. 29

As condições óptimas para amplificação eram especificas da secção, no entanto, a maiorias das reacções empregaram um programa assemelhando-se a 94 °C por 5 minutos (desnaturante) seguido de 25 ciclos de 95 °C durante 30 seg (desnaturante), 50 a 55 °C durante 30 seg (emparelhamento, 72 °C durante 1,5 minutos (extensão) seguido de uma extensão final de 72 °C durante 7 minutos e espera a 4 °C. Os produtos PCR foram examinados por electroforese em gel de agarose. Excisaram-se bandas do tamanho apropriado e o ADN foi purificado a partir da fatia de gel. Os fragmentos amplificados foram então utilizados como modelos para montar a reconstrução 1512 nt do gene HPV 52 Ll.

Após a reconstrução, a banda 1512 nt foi purificada em gel e ligada a vector pCR4 Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA). Após a ligação, foram transformadas células E. coli TOPIOF' competentes com a mistura de ligação. As colónias foram deixadas desenvolverem-se em 4 ml de LB com ampicilina e extraiu-se ADN plasmídeo das colónias por técnicas de miniprep. O ADN plasmídeo foi sequenciado para confirmar a presença das alterações de reconstrução de HPV 52 Ll desejadas. Para adicionar extensões BamHl a ambas as extremidades, reamplificou-se 52 Ll R (reconstruído) a partir de pCR4Blunt-52 Ll R. O fragmento amplificado foi clonado como anteriormente e o ADN plasmídeo resultante foi sequenciado. O plasmídeo pCR4 Blunt-52 Ll R (Bam) foi digerido com BamHl e as inserções de fragmento de ADN resultante foram sujeitas a electroforése em gel de agarose. O fragmento de HPV 52 LlR (Bam) de -1530 bp foi purificado em gel e ligado a pGALHO digerido com BamHl. Células E. coli TOPIOF (Invitrogen) foram transformadas com a mistura de ligação. 30

As colónias resultantes foram rastreadas por PCR para detectar a inserção HPV 52 LI R na orientação correcta. Confirmou-se a sequência e orientação por sequenciação de ADN. Preparou-se ADN plasmídico Maxiprep. Células de S. cerevisiae foram tornadas competentes por meio de criação de esferoplastos e foram transformadas. A transformação de levedura foi plaqueada em agar com topo de Leu-sorbitol sobre placas de agar Leu-sorbitol e foi incubada invertida durante 7 dias. As colónias foram colhidas e foram realizadas sementeiras por streaking (esgotamento) para isolamento dos clones em placas de agar com Leu-sorbitol. As colónias isoladas foram subsequentemente desenvolvidas em 5 ml de Leu-Ade-sorbitol 5 x com glucose a 1,6 % e galactose a 4 % em culturas em tubos de rotação a 30 °C para induzir a transcrição de Ll e a expressão de proteínas. Passadas 48 e/ou 72 horas, transformou-se um volume de cultura equivalente a OD600 =10 em pellets, o sobrenadante foi removido e as pellets foram congeladas e guardadas a -70 °C. EXEMPLO 3

Preparação de ARN

As pellets de células de levedura transformada induzidas a expressar HPV 52 Ll por indução com galactose foram descongeladas em gelo, suspensas em 0,8 ml de reagente de Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) e incubadas à temperatura ambiente durante 5 minutos. Adicionou-se um quinto do volume de clorofórmio ao frasco. Este foi agitado vigorosamente durante 15 segundos para misturar e foi incubado à temperatura ambiente durante 3 minutos. Após uma centrifugação de 5 minutos a 13 k rpms, a 31 fase superior foi colhida e transferida para um novo frasco. Adicionou-se 0,4 ml de isopropanol ao frasco. A mistura foi incubada durante 10 minutos à temperatura ambiente. Para agregar o ARN em pellets executou-se uma centrifugação a 13 k rpms durante 10 minutos. O sobrenadante foi decantado, a pellet de ARN foi lavado com 75 % de EtOH e foi repetida a fase de centrifugação. O sobrenadante foi decantado e a pellet de ARN foi deixada secar ao ar durante 15 minutos seguido de suspensão em água isenta de RNase. Executou-se espectrofotometria para determinar a concentração de ARN na amostra pressupondo uma leitura de A260 de 1 = 40 pg/ml de ARN quando A260/280 é 1,7 a 2,0. EXEMPLO 4

Análise Northern Blot

Preparou-se um gel de agarose-formaldeído 1,1%. Cinco e dez microgramas de ARN foram combinados com tampão desnaturante (concentrações finais: 6 % de formaldeido, 50% formamida e 0,1 x MOPS) e aqueceu-se a 65 °C durante 10 minutos. Foi adicionado um décimo de volume de gel tampão de carregamento e foi carregada a amostra no gel. Foi executada electroforése a 75 volts em 1 x tampão MOPS durante 3 horas. O gel foi lavado durante 60 minutos em 10 x SSC. O ARN foi transferido para uma membrana de nylon Hybond-N+ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) por capilaridade por mais de 16 horas em 10 x SSC. O ARN foi então fixado à membrana de nylon através de reticulação usando Stratagene UV Stratalinker função de auto- 32 reticulação (Stratagene, LA Jolla, CA) . Após fixação, a membrana de nylon foi deixada a secar ao ar. 0 kit de marcação e detecção DIG High Prime de ADN I da Roche (Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Switzerland) foi usado para marcar as sequências de ADN 52 Ll wt e 52 Ll R com DIG para ser usado como sondas para detectar ARN 52 Ll wt e 52 Ll R no Northern blot. A pré-hibridação, hibridação e desenvolvimento imunológico usando um anticorpo anti-DIG conjugado com fosfatase alcalina foram executados conforme as recomendações dos fabricantes. Rapidamente, o blot foi pré-hibridado a 37°C durante 30 minutos com agitação suave. A sonda foi desnaturada por aquecimento a 95 °C durante 5 minutos e subsequente arrefecimento em gelo. A sonda foi adicionada à solução de hibridação e aplicada à membrana durante 4 horas a 44,6 °C com agitação suave. A solução de hibridação foi então removida e o blot foi lavado 2 x durante 5 minutos e 2 x SSC com SDS 0,1 % à temperatura ambiente, seguido por uma lavagem adicional a 65 °C com 0,5 x SSC e SDS 0,1 %. O blot foi então bloqueado durante 30 minutos e o anticorpo anti-DIG conjugado com fosfatase alcalina foi aplicado a uma diluição de 1:5000 durante 30 minutos. O blot foi lavado e a presença de ARN ligado por sonda foi determinada por detecção de substrato NBT/BCIP do anticorpo anti-DIG conjugado com fosfatase alcalina. A análise inicial de HPV 52 Ll wt expresso em levedura sugere que a proteína HPV 52 Ll foi expressa, no entanto, o nível era baixo. A análise Northern blot do ARN de extractos de levedura de culturas induzidas para HPV 52 Ll wt expressado não revelou nenhum ARN HPV 52 Ll detectável. Uma vez que foi detectada algumas proteínas do tamanho apropriado, ficou claro que foram feitos algumas 33 transcrições integrais de ARN. 0 gene HPV 52 Ll foi reconstruído com sequências codão preferido de levedura e foi manipulada para omitir quaisquer possíveis locais de terminação de transcrição prematura para assegurar uma transcrição robusta. A análise Northern blot da transcrição de HPV 52 Ll R revelou que as transcrições integrais foi gerada e detectada por análise Northern blot (FIGURA 3). EXEMPLO 5

Expressão da proteína HPV 52 Ll

Pellets de levedura de células congelados de culturas induzidas de galactose equivalentes a OD600=10 foram descongeladas em gelo e suspensas em 300 μΐ de tampão de PC (100 mM de Na2HP04 e 0,5 de M NaCl, pH 7,0) com 2 mM de pmsf). Foram adicionadas contas de vidro de 0,5 mm lavadas com ácido a uma concentração de 0,5 g/tubo. Os tubos foram agitados em vortex durante 3 ciclos de 5 minutos a 4°C com um intervalo de 1 minuto. Foram adicionados 7,5 μΐ de 20% de TritonXlOO e a etapa de agitação em vortex foi repetida durante 5 minutos a 4°C. Os tubos foram colocados em gelo durante 15 minutos, seguido de centrifugação durante 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi transferido para um tubo de microcentrífuga estéril, onde foi rotulado como extracto de proteína de levedura total, datado e armazenado a -70°C. EXEMPLO 6

Análise Western Blot

Os extractos de proteína de levedura total de vinte colónias de levedura isoladas por cada construção HPV 52 Ll foram analisados por Western blot para confirmar a expressão da proteína HPV 52 Ll após indução de galactose. 34

Dez, cinco, e dois e meio microgramas de extracto de proteína de levedura total foram combinados com tampão de carregamento SDS-PAGE e aquecidos a 95°C durante 10 minutos. A proteína HPV 16 Ll, a qual é aproximadamente 55 kDa, foi incluída como um controlo positivo, em conjunto com extracto de proteína de levedura total isenta de HPV Ll como um controlo negativo (dados não apresentados). As proteínas foram carregadas num gel SDS-PAGE 10 % e sujeitas a electroforése em tampão de tris-glicina. Após separação da proteína, foram transferidas por Western do gel para nitrocelulose e o blot resultante foi bloqueado em 2 x tampão diluente (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) durante 1 hora a temperatura ambiente com oscilação. O blot foi lavado três vezes e o anti-soro de cabra anti-trpE-HPV 31 Ll, o qual inter-reage com as proteínas HPV 16 e HPV 52 Ll, foi aplicado a temperatura ambiente durante 16 horas. O blot foi então lavado três vezes e incubado com uma diluição de 1:2500 de anticorpo conjugado de HPR-anti-cabra durante 1 hora. O blot foi lavado de novo três vezes e foi aplicada detecção de substrato NBT/BCIP (Kirkegaard and Perry Laboratories) . Foram detectadas proteínas imunoreactivas como bandas púrpuras no blot.

Em todos os casos, a proteína HPV 52 Ll foi detectada como uma banda imunoreactiva distinta na nitrocelulose correspondente a aproximadamente 55 kDa. (FIGURA 4) A intensidade da banda HPV 52 Ll R (pista 2,5 pg) pareceu ser significativamente maior do que a banda HPV 52 Ll wt (10 pg) . Era evidente de que quando reconstruído, o nível de expressão de HPV 52 Ll R com codões optimizados aumentou 35 mais de quatro vezes, o que é o limite da comparação directa no Western blot. EXEMPLO 7

Microscopia de electrões de transmissão

Para demonstrar que a proteína 52 Ll estava de facto a auto-construir-se para formar capsómeros Ll pentamérica, os quais por sua vez se auto-constroem em partículas tipo vírus, um extracto de proteína HPV 52 Ll R parcialmente purificada foi sujeito a microscopia de electrões de transmissão (TEM).

Foram desenvolvidas leveduras sob fermentação em pequena escala e transformado em pellets. As pellets resultantes foram sujeitas a tratamentos de purificação. As pellets e os extractos de levedura clarificados foram analisados por immunoblot para demonstrar expressões de proteína HPV 52 Ll e retenção através do procedimento de purificação. Extractos de levedura clarificados foram então sujeitos a centrifugação sobre um colchão de sucrose 45% e a pellet resultante foi suspensa em tampão para análise de VLP de HPV 52 Ll por TEM. É apresentada na FIGURA 5 uma amostra representativa do VLP de HPV 52 Ll R produzido. 0 diâmetro das partículas esféricas nesta amostra bruta oscilava desde entre 40 e 70 nm com algumas partículas apresentando uma matriz regular de capsómeros.

LISTA DE SEQUÊNCIAS 36 <110> Merck & Co., Inc.

<120> EXPRESSÃO OPTIMIZADA DE hpv 52 Ll EM LEVEDURA

<130> 21571 PCT <150> 60/555926 <151 >2004-03-24 <160> 7

<170> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> 1 <211> 1512 <212> ADN

<213> Sequência artificial <220> <223> HPV52L1R 1 37 <4 Ο 0> atgtccgtct ggagaccatc cgaagctact gttgtctcta ccgacgaata cgtctccaga agattgttga ctgtcggtca cccatacttc aagaaggtct tggttccaaa ggtctctggt ccagacccaa acaagttcgg tttcccagac ttggtctggg cttgtactgg tttggaaatc tctggtcacc cattgttgaa caagttcgac aagccaggta tcgataacag agaatgtttg atcttgggtt gtaagccacc aatcggtgaa aactctggta acccaggtga ctgtccacca ggtgacatgg tcgacactgg tttcggtfcgt tccgacgtcc caatcgacat ctgttcctct gcttctgaac catacggtga ctccttgttc agacacttct tcaacagagc tggtaccttg caaggttcca actctggtaa cactgctact tctggttcca tggtcacctc cgaatcccaa gctcaaggtc acaacaacgg tatctgttgg actactaçat ctactaacat gaccttgtgt aacgaaaact tcaaggaata cttgagacac caattgfcgta agatcacctt gaccgctgac actatcfctgg aagactggca attcggtttg acttacagat tcgtcacttc cactgctatc aâggaagacc cattgaagga ctacatgttc gctgacttgg accaattccc attgggtaga agaccaaagt tgaagagacc agctagctct gtcaagagat aa gtctacttgc caccagttcc agtctctaag 60 acctccatct actactacgc tggttcctct 120 tct&tcaaga acacctcctc cggtaacggt 180 ttgcaataca gagtcttcag aatcaagttg 240 actagtttct acaacccaga aactcaaaga 300 ggtagaggtc aaccattggg tgtcggtatc 360 gacactgaaa cctctaacaa gtacgctggt 420 tctatggact acaagcaaac tcaattgtgt 480 cactggggta agggtactcc atgtaacaac 540 ttgcaattga tcaactccgt catccaagac 600 atggacttca acaccttgca agcttctaag 660 gtctgtaagt acccagacta cttgcaaatg 120 ttcttcttga gaagagaaca aatgttcgtc 180 ggtgacccag ttccaggtga cttgtacatc 840 gtccaatcct ctgctttctt cccaactcca 900 ttgttcaaca agccatactg gttgcaaaga 960 ggtaaccaat tgttcgtcac cgtcgtcgac 1020 gctgaagtca agaaggaatc cacctacaag 1080 ggtgaagaat tcgacttgca attcatcttc 1140 gtcatgactt acatccacaa gatggacgct 1200 actccaccac catccgcttc cttggaagac 1260 acctgtcaaa agaacactcc accaaagggt 1320 tgggaagtcg acttgaagga aaagttctct 1380 aagttcttgt tgcaagctgg tttgcaagct 1440 gctccaagaa cttccaccaa gaagaagaag 1500 1512

<210> 2 <211 >503 <212> PRT <213> Papilomavírus humano tipo 52 <400>2

Met Ser Vai Trp Arg Pro Ser Glu Ala Thr Vai Tyr Leu Pro Pro Vai 15 10 15 38

Pro Gly Ser Lys vai Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ser Arg Thr Ser 20 25 30 Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr val Gly His Pro 35 40 45 Tyr Phe Ser Ile Lys Asn Thr Ser Ser Gly Asn Gly Lys Lys val Leu 50 55 60 Vai Pro Lys Vai Ser Gly Leu Gin Tyr Arg Val Phe Arg Ile Lys Leu £5 70 75 80 Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro 85 90 95 Glu Thr Gin Arg Leu Val Trp Ala Cys Thr Gly Leu Glu Ile Gly Arg 100 105 110 Gly Gin Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn lys 115 120 125 Phe Asp Asp Thr Glu Thr Ser Asn Lys Tyr Ala Gly Lys Pro Gly Ile 130 135 140 Asp Asn Arg Glu Cys Leu Ser Met Asp Tyr Lys Gin Thr Gin Leu Cys 145 150 155 160 Ile Leu Gly Cys Lys Pro Pro He Gly Glu HiS Trp Gly Lys Gly Thr 165 170 175 Pro Cys Asn Asn Asn Ser Gly Asn Pro Gly ASp Cys Pro Pro Leu Gin 180 185 190 Leu Ile Asn Ser Val Ile Gin Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe 195 200 205 Gly Cys Met Asp Phe Asn Thr Leu Gin Ala Ser Lys Ser Asp Val Pro 210 215 220 Ile Asp Ile Cys Ser Ser Val Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gin Met 225 230 235 240 Ala Ser Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu 245 250 255 Gin Met Phe val Arg His Phe Phe Asn Arg Ala Gly Thr Leu Gly Asp 260 265 270 Pro Vai Pro Gly Asp Leu Tyr Ile Gin Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr 275 280 285 Ala Thr Vai Gin Ser Ser Ala Phe Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met 290 295 300 Vai Thr Ser Glu Ser Gin Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gin Arg 305 310 315 320 Ala Gin Gly Hls Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gin Leu Phe Val 325 330 335 Thr Vai Vai Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu Cys Ala Glu 340 345 350 Vai Lys Lys Glu Ser Thr Tyr Lys Asn Glu Asn Phe Lys Glu Tyr Leu 355 360 365 Arg His Gly Glu Glu Phe Asp Leu Gin Phe Ile Phe Gin Leu Cys Lys 370 37 5 380 Ile Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Lys Met Asp Ala 385 390 395 400 Thr Ile Leu Glu Asp Trp Gin Phe Gly Leu Thr Pro Pro Pco Ser Ala 405 410 415 Ser Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Thr Ala Ile Thr Cys 420 425 430 Gin Lys Asn Thr Pro Pro Lys Gly Lys Glu Asp Pro Leu Lys ASp Tyr 435 440 445 Met Phe Trp Glu Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Αβρ 450 455 460 Gin Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gin Ala Gly Leu Gin Ala 465 470 475 480 Arg Pro Lys Leu Lys Arg Pro Ala Ser Ser Ala Pro Arg Thr Ser Thr 485 490 495 Lys Lys Lys Lys val Lys Arg 39

<210> 3 <211> 1512 <212> ADN <213> Papilomavírus humano tipo 52 < 4 0 0 > 3 atgtccgtgt ggcggcctag tçaggecact gttgtaagca ctgatgagta tgtgtctcgc cgattactaa cagtaggaca tccctatttt aaaaaagttt tagttcccaa ggtgtctggc ccggacccta ataaatttgg ttttccagat ttggtgtggg cctgtacagg cttggaaatt agtgggcatc ctttattaaa caagtttgat aaacctggta tagataatag ggaatgttta attttaggat gcaaacctcc tataggtgaa aattcaggaa atcctgggga ttgtcctccc ggggacatgg tagatacagg atttggttgc agtgatgtgc ccattgatat atgtagcagt gctagcgagc catatggtga cagtttgttc agacactttt ttaatagggc cggtacctta caagggtcta actctggcaa tactgccact agtggttcta tggtaacctc agaatcccaa gcgcagggcc acaataatgg catatgttgg accactcgta gcactaacat gactttatgt aatgaaaatt ttaaggaata ccttcgtcat caattgtgca aaattacatt aacagctgat actattttag aggactggca atttggcctt acatacagat ttgtcacttc tactgctata aaggaagatc ctttaaagga ctatatgttt gcagatttag atcagtttcc tttaggtagg aggcccaaac taaaacgccc tgcatcatcg gttaaaaggt aa gtgtacctgc ctcctgtacc tgtctctaag 60 acaagcatct attattatgc aggcagttct 120 tctattaaaa acaccagtag tggtaatggt 180 ctgcaataca gggtatttag aattaaattg 24 0 acatcttttt ataacccaga aacccaaagg 300 ggtaggggac agcctttagg tgtgggtatt 360 gatactgaaa ccagtaacaa atatgctggt 420 tctatggatt ataagcagac tcagttatgc 480 cattggggta agggaacccc ttgtaataat 540 ctacagctca ttaacagtgt aatacaggat 600 atggatttta ataccttgca agctagtaaa 660 gtatgtaagt atccagatta tttgcaaatg 720 ttttttctta gacgtgagca aatgtttgtt 780 ggtgaccctg tgccaggtga tttatatata 840 gtacaaagca gtgctttttt tcctactcct 900 ttatttaata aaccgtactg gttacaacgt 960 ggcaatcagt tgtttgtcac agttgtggat 1020 gctgaggtta aaaaggaaag cacatataaa 1080 ggcgaggaat ttgatttaca atttattttt 1140 gttatgacat acattcataa gatggatgcc 1200 accccaccac cgtctgcatc tttggaggac 1260 acttgtcaaa aaaacacgcc acctaaagga 1320 tgggaggtgg atttaaaaga aaagttttct 1380 aagtttttgt tacaggcagg gctacaggct 1440 gccccacgta cctccacaaã gaagaaaaag 1500 1512

<210> 4 <211 >21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador PCR <400>4 40

atgtccgtgt ggcggcctag t 21 <210> 5 <211 >22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador PCR <400>5

gagatctcaa ttacacaaag tg 22 <210> 6 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador PCR <400>6

gagatctcac aaaacaaaat gtccgtgtgg c 31 <210> 7 <211> 1512 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> 52L1R antisense <400>7 41 tacaggcaga cctctggtag gcttcgatga cagatgaacg gtggtcaagg tcagagattc 60 caacagagat ggctgcttat gcagaggtct tggaggtaga tgatgatgcg accaaggaga 120 tctaacaact gacagccagt gggtatgaag agatagttct tgtçgaggag gccattgcca 180 ttcttccaga accaaggttt ccagagacca aacgttatgt ctcagaagtc ttagttcaac 240 ggtctgggtt tgttcaagcc aaagggtctg tgatcaaaga tgttgggtct ttgagtttct 300 aaccagaccc gaacatgacc aaacctttag ccatctccag ttggtaaccc acagccatag 360 agaccagtgg gtaacaactt gttcaagctg ctgtgacttt ggagattgtt catgcgacca 420 ttcggtccat agctattgtc tcttacaaac agatacctga tgttcgtttg agttaacaca 480 tagaacccaa cattcggtgg ttagccactt gtgaccccat tcccatgagg tacattgttg 540 ttgagaccat tgggtccact gacaggtggt aacgttaact agttgaggca gtaggttctg 600 ccactgtacc agctgtgacc aaagcçaaca tacctgaagt tgtggaacgt tcgaagattc 660 aggctgcagg gttagctgta gacaaggaga cagacattca tgggtctgat gaacgtttac 720 cgaagacttg gtatgccact gaggaacaag aagaagaact cttctcttgt ttacaagcag 780 tctgtgaaga agttgtctcg accatggaac ccactgggtc aaggtccact gaacatgtag 840 gttccaaggt tgagaccatt gtgacgatga caggttagga gacgaaagaa gggttgaggt 900 âgaccaaggt accagtggag gcttagggtt aacaagttgt tcggtatgac caacgtttct 960 cgagttccag tgttçttgcc atagacaacc ccattggtta acaagcagtg gcagcagctg 1020 tgatgatcta gatgattgta ctggaacaca cgacttcagt tcttecttag gtggatgttc 1080 ttgcttttga agttccttat gaactctgtg ccacttctta agctgaacgt taagtagaag 1140 gttaacacat tctagtggaa ctggcgactg cagtactgaa tgtaggtgtt ctacctgcga 1200 tgatagaacc ttctgaccgt taagccaaac tgaggtggtg gtaggcgaag gaaccttctg 1260 tgaatgtcta agcagtgaag gtgacgatag tggacagttt tcttgtgagg tggtttccca 1320 ttccttctgg gtaacttcct gatgtacaag acccttcagc tgaacttcct tttcaagaga 1380 cgactgaacc tggttaaggg taacccatct ttcaagaaca acgttcgacc aaacgttcga 1440 tctggtttca acttctctgg tcgatcgaga cgaggttctt gaaggtggtt cttcttcttc 1500 cagttctcta tt 1512 42

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista das referências citadas pelo requerente serve apenas para conveniência do leitor. Não faz parte do documento da patente europeia. Apesar da compilação cuidadosa das referências, os erros ou as omissões não podem ser excluídos e o IEP rejeita toda a responsabilidade a este respeito.

Documentos de patente citados na descrição: US 60555926 B [0093]

Literatura, não relacionada com patentes, citada na descrição:

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Lisboa, 21/06/2010

Claims (16)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína HPV 52 Ll conforme apresentada na SEQ ID NO:2, sendo que a sequência de ácido nucleico compreende uma sequência nucleotídica conforme apresentada na SEQ ID NO:l.

2. Vector que compreende a molécula de ácido nucleico da reivindicação 1.

3. Célula hospedeira que compreende o vector da reivindicação 2.

4. Célula hospedeira da reivindicação 3, em que a célula hospedeira é uma célula de levedura.

5. Célula hospedeira da reivindicação 4 em que a célula de levedura é seleccionada do grupo constituído por: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis e Schizosaccharomyces pombe.

6. Célula hospedeira da reivindicação 4, em que a célula hospedeira é Saccharomyces cerevisiae.

7. Método de produção das partículas tipo vírus (VLPs) de HPV 52 Ll que compreende: (a) a transformação de uma levedura com uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1; 2 (b) a cultura da levedura transformada em condições que permitem a expressão da molécula de ácido nucleico para produzir uma proteína de papilomavírus recombinante e (c) o isolamento da proteína de papilomavírus recombinante para produzir VLPs de HPV 52 Ll.

8. Método de preparação de uma vacina para tratamento ou prevenção de cancro cervical associado a HPV, sendo que o método mencionado compreende a produção de VLPs de HPV 52 Ll pelo método da reivindicação 7.

9. Método da reivindicação 8, em que a vacina inclui ainda VLPs de pelo menos um tipo adicional de HPV.

10. Método da reivindicação 9, em que pelo menos um tipo de HPV adicional é seleccionado do grupo constituído por: HPV6, HPVll, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 e HPV68.

11. Método da reivindicação 10, em que o pelo menos um tipo de HPV inclui HPV 16.

12. Método da reivindicação 11, em que a vacina inclui ainda VLPs de HPV18.

13. Método da reivindicação 12, em que a vacina inclui ainda VLPs de HPV6 e VLPs de HPVll.

14. Método da reivindicação 12 ou 13, em que a vacina inclui ainda VLPs de HPV31. 3

15. Método da reivindicação 14, em que a vacina inclui ainda VLPs de HPV45.

16. Método da reivindicação 15, em que a vacina inclui ainda VLPs de HPV58. Lisboa, 21/06/2010 1/7 Alinhamento da Sequência de Nucleótidos HPV 52 Ll 52 Ll wt 52 Ll R ( D ATGTCCGTGTG6CGGCCTAGTGAGGCCACTGTGTACCTGCCTCCTGTACC ........C.. .A.A. .ATCC. .A. J... .C.. .T... .A. .A.. .T.. 52 Ll wt 52 Ll R ( 51) TGTCTCTAAGG1TGTAAGCACTGATGAGTATGTGTCTCGCACAAGCATCT A............CTCT..C..C..A..C. .C..CA.A..CTC....... 52 Ll wt 52 Ll R ( 101) ATTATTATGCAGGCAGTTCTCGATTACTAACAGTAGGACATCCCTATTfT .C. .C. .C. .T. .TTCC.. .A... .GT.G. .T. .C. .T. .C. .A. .C. .C 52 Ll wt 52 Ll R ( 151) TCTATTAAAAACACCAGTAGTGGTAATGGTAAAAAAGTTTTAGTTCCCAA .....C, ,G......TCCTCC.....C.....G..G..C..G.....A.. 52 Ll wt 52 Ll R ( 201) GGTGTCTGGCCTGCAATACAGGGTATTTAGAATTAAATTGCCGGACCCTA ...C.....Π..........A..C..C.....C..G.....A.....A. 52 Ll wt 52 Ll R ( 251) ATAAATTTGGTTTTCCAGATACATCTmTATAACCCAGAAACCCAAAGG .C..G..C.....C.....C..TAG...C. .C...........T.....A 52 Ll wt 52 Ll R ( 301) TTGGTGTGGGCCTGTACAGGCTTGGAAATTGGTAGGGGACAGCCTTTAGG .....C.....T.....T..T........C_____A..T..A..A..G.. 52 Ll wt 52 Ll R ( 351) TGTGGGTATTAGTGGGC AT CCTTTATTAAACAAGITT GAT GATACT GAAA ...C.....CTC...T..C..A..G..G..-.....C..C..C....... 52 Ll wt 52 Ll R ( 401) CCAGTAACAAATATGCTGGTAAACCTGGTATAGATAATAGGGAATGTTTA ..TC......G..C........G..A-----C.....C..A....... ,G 52 Ll wt 52 Ll R ( 451) TCTATGGATTATAAGCAGACTCAGTTATGCATTTTAGGATGCAAACCTCC ........C..C.....A.....A..G..T..C..G..T..T..G..A.. 52 Ll wt 52 Ll R ( 501) TATAGGTGAACATTGGGGTAAGGGAACCCCTTGTAATAATAATTCAGGAA A..C........C...........T..T..A.....C..C..C..T..T. 52 Ll wt 52 Ll R ( 551) ATCCTGGGGATTGTCCTCCCCTACAGCTCATTAACAGTGTAATACAGGAT .C..A..T..C.....A..AT.G..AT.G..C...TCC..C..C..A..C 52 Ll wt 52 Ll R ( 601) GGGGACATGGTAGATACAGGATTTGGTTGCATGGATTTTAATACCTTGCA ..T........C..C..T..T..C.....T_____C..C..C........ FIG.1A 2/7 2/7 52 LI wt 52 LI R ( 651) 52 LI wt 52 LI R ( 701) 52 LI wt 52 LI R í 751) 52 LI wt 52 LI R ( 801) 52 LI wt 52 LI R ( 851) 52 LI wt 52 LI R ( 901) 52 LI wt 52 LI R ( 951) 52 LI wt 52 LI R (1001) 52 LI wt 52 LI R (1051) 52 LI wt 52 LI R (1101) 52 LI wt 52 LI R (1151) 52 LI wt 52 LI R (1201) 52 LI wt 52 LI R (1251) AGCTAGTAAAAGTGATGTGCCCAnGATATATGTAGCAGTGTATGTAAGT ....TC...GTCC..C..C..A..C..C..C...TC.TC... C....... ATCCAGATTATTTGCAAATGGCTAGCGAGCCATATGGTGAC/^GTTTGnC .C.....C..C............TCT..A.....C......rcc...... TTTTnCTTAGACGTGAGCAAATGTnGnAGACACTTÍTTTAATAGGGC ..C..CT.G...A.A..A........C..C........C..C ..C..A.. CGGTACCTTAGGTGACCCTGTGCCAGGTGATTTATATATACAAGGGTCTA T........G........A..T........C..G..C..C.....T..C. ACTCTGGCAATACTGCCACTGTACAAAGCAGTGCTTTTTTTCCTACTCCT .......T..C.....T.....C...TC.TC......C..C. .A.....A AGTGGTTCTATGGTAACCTCAGAATCCCAATTATTTAATAAACCGTACTG TC......C.....C.....C...........G..C..C..G..A..... GTTACAACGTGCGCAGGGCCACAATAATGGCATATGTTGGGGCAATCAGT .. ,G.. .A.A. ,T. .A. J.....C..C. J..C........7..C..A. TGTTTGTCACAGTTGTGGATACCACTCGTAGCACTAACATGACTTTATGT ____C.....C..C..C..C. .T...A.ATCT...........C. .G... GCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATATAAAAATGAAAATTTT>\AGGAATA .....A..C..G......TC...C..C..G..C.....C..C........ CÍTrCGTWTGQCGAGGMTTTGATnACAArrTATTTTTCAAÍTGTGCA .T.GA.A..C..T..A.....C..C..G.....C..C..C........T. AAATTACATTAACAGCTGATGTTATGACATACATTCATAAGATGGATGCC .G..C..C..G..C.....C..C.....T.....C..C........C..T ACTATTTTAGAGGACTGGCAATTTGGCCTTACCCCACCACCGTCTGCATC ......C..G..A...........C. .TT.G. .T........A . ,C. ,T., TTTGGAGGACACATACAGATTTGTCACTTCTACTGCTATAACITGTCAAA C.....A.....T........C........C........C..C....... FIG.1A 3/7 52 Ll wt 52 Ll R (1301) AAAACAC6CCACCTAAAGGAAAG6MGATCCTTTAMGGACTAT/LTGTTT .G.....T.....A..G..T........C..A..G......C.......C 52 Ll wt 52 Ll R (1351) TGGGAGGTGGAlTTAAAAGAAAAGTTITCTGCAGATrTAGATCAGTTTCC .....A..C..C..G..G........C.....T..C..G..C..A..C.. 52 Ll wt 52 Ll R (1401) TTTAGGTAGGAAGTTTTTGTTACAGGCAGGGCTACAGGCTAGGCCCAAAC A. .G.... .A.....C.....G. .A. .T. .TT.G. .A.....A. .A. ,GT 52 Ll wt 52 Ll R (1451) TAAAACGCCCTGCATCATCGGCCCCACGTACCTCCACAAAGAAGA/iAAAG .G..GA.A..A..TAGC..T..T...A.A..T.....C........G... 52 Ll wt 52 Ll R (1501) GTTAAAAGGTAA (SEQ ID NO:3) ..C..G..A...(SEQ ID N0:1) FIG.1C Sequências de Nucleótidos e Aminoácidos de HPV 52 Ll R 4/7 MSVW RPS EAT VYLP PVP ATGTCCGTCT GGAGACCATC CGAAGCTACT GTCTACTTGC CACCAGTTCC TACAGGCAGA CCTCTGGTAG GCTTCGATGA CAGATGAACG GTGGTCAAGG G S K VVST DEY V S R TSIY AGTCTCTAAG GTTGTCTCTA CCGACGAATA CGTCTCCAGA ACCTCCATCT TCAGAGATTC CAACAGAGAT GGCTGCTTAT GCAGAGGTCT TGGAGGTAGA YYA GSS RLLT VGH PYF ACTACTACGC TGGTTCCTCT AGATTGTTGA CTGTCGGTCA CCCATACTTC TGATGATGCG ACCAAGGAGA TCTAACAACT GACAGCCAGT GGGTATGAAG SIKN TSS GNG KKVL VPK TCTATCAAGA ACACCTCCTC CGGTAACGGT AAGAAGGTCT TGGTTCCAAA AGATAGTTCT TGTGGAGGAG GCCATTGCCA TTCTTCCAGA ACCAAGGTTT VSG LQYR V FR I K L PDPN GGTCTCTGGT TTGCAATACA GAGTCTTCAG AATCAAGTTG CCAGACCCAA CCAGAGACCA AACGTTATGT CTCAGAAGTC TTAGTTCAAC GGTCTGGGH KFG FPD TSFY NPE TQR ACAAGTTCGG TTTCCCAGAC ACTAGTTTCT ACAACCCAGA AACTCAAAGA TGTTCAAGCC AAAGGGTCTG TGATCAAAGA TGTTGGGTCT TTGAGTTTCT LVWA CTG LEI GRGQ PLG HGGTCTGGG CTTGTACTGG TTTGGAAATC GGTAGAGGTC AACCATTGGG AACCAGACCC GAACATGACC AAACCTTTAG CCATCTCCAG TTGGTAACCC VG1 SGHP LLN KFD DTET TGTCGGTATC TCTGGTCACC CATTGTTGAA CAAGTTCGAC GACACTGAAA ACAGCCATAG AGACCAGTGG GTAACAACTT GTTCAAGCTG CTGTGACTTT SNK YAG KPGI DNR ECL CCTCTAACAA GTACGCTGGT AAGCCAGGTA TCGATAACAG AGAATGTTTG GGA(^Gn catgcgacca ttcggtccat agctattgtc tchacaaac SMDY KQT QLC ILGC KPP TCTATGGACT ACAAGCAAAC TCAATTGTGT ATCTTGGGTT GTAAGCCACC AGATACCTGA TGTTCGTTTG AGTTAACACA TAGAACCCAA CATTCGGTGG I G . E HWGK GTP CNN NSGN AATCGGTGAA CACTGGGGTA AGGGTACTCC ATGTAACAAC AACTCTGGTA HAGCCACn GTGACCCCAT TCCCATGAGG TACATTGTTG TTGAGACCAT PGD CPP LQLI NSV I Q D ACCCAGGTGA CTGTCCACCA TTGCAATTGA TCAACTCCGT CATCCAAGAC TGGGTCCACT GACAGGTGGT AACGTTAACT AGTTGAGGCA GTAGGTTCTG GDMV DTG FGC HDFN TLQ GGTGACATGG TCGACACTGG TTTCGGTTGT ATGGACTTCA ACACCTTGCA CCACTGTACC AGCTGTGACC AAAGCCAACA TACCTGAAGT TGTGGAACGT FIG.2A 5/7 ASK SDVP I D I CSS V C K Y AGCTTCTAAG TCCGACGTCC CAATCGACAT CTGTTCCTCT GTCTGTAAGT TCGMGATTC AGGCTGCAGG GTTAGCTGTA GACAAGGAGA CAGACATTCA PDY LQM ASEP YGD SLF ACCCAGACTA CTTGCAAATG GCTTCTGAAC CATACGGTGA CTCCTTGTTC TGGGTCTGAT GAACGTTTAC CGAAGACTTG GTATGCCACT GAGGAACAAG FFLR REQ M F V RHFF NRA TTCTTCTTGA GAAGAGAACA AATGTTCGTC AGACACTTCT TCAACAGAGC AAGAAGAACT CTTCTCTTGT TTACAAGCAG TCTGTGAAGA AGTTGTCTCG GTL GDPV PGD LYI QGSN TGGTACCTTG GGTGACCCAG TTCCAGGTGA CTTGTACATC CAAGGTTCCA ACCATGGAAC CCACTGGGTC MGGTCCACT GAACATGTAG GTTCCAAGGT SGN TAT VQSS AFF PTP ACTCTGGTAA CACTGCTACT GTCCAATCCT CTGCTTTCTT CCCAACTCCA TGAGACCATT GTGACGATGA CAGGTTAGGA GACGAAAGAA GGGTTGAGGT SGSH VTS ESQ LFNK PYW TCTGGTTCCA TGGTCACCTC CGAATCCCAA TTGTTCAACA AGCCATACTG AGACCAAGGT ACCAGTGGAG GCTTAGGGTT AACAAGTTGT TCGGTATGAC LQR AQGH NNG ICW GN.QL GTTGCAAAGA GCTCAAGGTC ACAACAACGG TATCTGTTGG GGTAACCAAT CAACGTTTCT CGAGTTCCAG TGTTGTTGCC ATAGACAACC CCATTGGTT/V F V T V V D TTRS TNM TLC TGTTCGTCAC CGTCGTCGAC ACTACTAGAT CTACTAACAT GACCTTGTGT ACAÀGCAGTG GCAGCAGCTG TGATGATCTA GATGATTGTA CTGGAACAC/V AEVK KES T ϊ K NENF KEY GCTGAAGTCA AGAAGGAATC CACCTACAAG AAC6AAAACT TCAAGGAATA CGACTTCAGT TCTTCCTTAG GTGGATGTTC TTGCTnTGA AGTTCCTTAT L R K GEEF DLQ FIF QLCK. CTTGAGACAC GGTGAAGAAT TCGACTTGCA ATTCATCTTC CAATTGTGTA GAACTCTGTG CCACHCnA AGCTGAACGT TAAGTAGAAG GTTAACACAT ITL TAD VHTY 1HK M D A AGATCACCTT GACCGCTGAC GTCATGACTT ACATCCACAA GATGGACGCT TCTAGTGGAA CTGGCGACTG CAGTACTGAA TGTAGGTGTT CTACCTGCGA TILE DWQ FGL TPPP SAS ACTATCTTGG AAGACTGGCA ATTCGGTTTG ACTCCACCAC CATCCGCTTC TGATAGAACC TTCTGACCGT TAAGCCAAAC TGAGGTGGTG GTAGGCGAAG LED TYRF VTS T A I T C Q K CTTGGAAGAC ACTTACAGAT TCGTCACTTC CACTGCTATC ACCTGTCAAA GAACCTTCTG TGAATGTCTA AGCAGTGAAG GTGACGATAG TGGACAGTTT FIG.2B 6/7 ΝΤΡ Ρ Κ G KEDP LKD YMF 1301 AGAACACTCC ACCAAAGGGT AAGGAAGACC CATTGAAGGA CTACATGTTC TCTTGTGAGG TGGTTTCCCA TTCCTTCTGG GTAACTTCCT GATGTACAAG WEVD LKE KFS ADLD QFP 1351 TGGGAAGTCG ACTTGAAGGA AAAGTTCTCT GCTGACTTGG ACCAAHCCC ACCCTTCAGC TGAACTTCCT TTTCAAGAGA CGACTGAACC TGGTTAAGGG LGR KFLL QAG LQA RPKL 1401 ATTGGGTAGA AAGTTCTTGT TGCAAGCTGG TTTGCAAGCT AGACCAAAGT TAACCCATCT TTCAAGAACA ACGTTCGACC AAACGTTCGA TCTGGTTTCA KRP ASS APRT STK KKK 1451 TGAAGAGACC AGCTAGCTCT GCTCCAAGAA C1TCCACCAA GAAGAAGAAG ACTTCTCTGG TCGATCGAGA CGAGGTTCH GAAGGTGGTT CTTCTTCTTC V K R * (SEQ ID NO:2) 1501 GTCAAGAGAT AA (SEQ IO NO:l) CAGTTCTCTA π (SEQ ID NO:7) FIG.2C Expressão de HPV 52 Ll wt e Transcritos de HPV 52 Ll R 52wt 52wt 5 \iQ 10 52R 52R 5μ0 10 μ9

mARN Ll integral FIG.3 Análise Western Blot da Proteína HPV 52 Ll 7/7 _52 R 52 wt 16 ' i t ” ~\ r -·\ 10 μ9 5 μ9 2.5 μ9 10 μ9 5 μά 2.5 μς 10 Mg

FIG.4 Microscopia Electrónica de Transmissão de VLPs Constituídas por Moléculas de Proteína HPV 52 Ll R

FIG.5