KR20060134120A

KR20060134120A - 효모에서 ｈｐｖ 52 ｌ1의 최적화된 발현

Info

Publication number: KR20060134120A
Application number: KR1020067019673A
Authority: KR
Inventors: 재닌 티 브리안; 미켈 케이 브라운로우; 로런 디 슐츠; 캐트린 유 얀센
Original assignee: 머크 앤드 캄파니 인코포레이티드
Priority date: 2004-03-24
Filing date: 2005-03-18
Publication date: 2006-12-27
Also published as: RU2373219C2; NL300777I2; NO338055B1; CY2015052I1; AU2005230907C1; CN1934131B; RU2006137363A; IL178140A0; ATE466022T1; NZ549898A; AR048191A1; NO20064815L; SI1730175T1; JP2007530040A; LTPA2015050I1; FR15C0085I1; LU92903I2; EP1730175A1; ZA200607575B; BRPI0509079A

Abstract

본 발명은 HPV 52 L1 단백질을 암호화하는 합성 DNA 분자를 제공한다. 상세하게는, 본 발명은 HPV 52 L1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 여기서, 당해 폴리뉴클레오타이드는 효모 세포에서 고수준의 발현을 위해 코돈-최적화되어 있다. 본 발명의 대안적인 양태에서, 합성 분자의 뉴클레오타이드 서열은 효모에 의해 인지되는 전사 종결 시그날을 제거하도록 변형된다. 합성 분자를 사용하여 HPV 52 바이러스-유사 입자(VLP)를 생산하고, HPV 52 VLP를 포함하는 백신 및 약제학적 조성물을 생산할 수 있다. 본 발명의 백신은 중화 항체 및 세포-매개된 면역성을 통해 파필로마바이러스 감염에 대해 효과적인 면역학적 예방을 제공하며 또한 현존하는 HPV 감염의 치료에 유용할 수 있다.

파필로마바이러스 백신, HPV 52 L1 단백질, HPV 52 바이러스-유사 입자(VLP)

Description

효모에서 ＨＰＶ 52 Ｌ1의 최적화된 발현{Optimized expression of HPV 52 L1 in yeast}

본 발명은 일반적으로 사람 파필로마바이러스(HPV) 감염의 예방 및/또는 치료에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 HPV 52 L1 단백질을 암호화하는 합성 폴리뉴클레오타이드, 및 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터 및 숙주에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 재조합 HPV 52 Ll 또는 Ll + L2를 효모 세포에서 발현시킴으로써 생산되는 HPV 52 바이러스 유사 입자(VLP), 및 HPV 감염을 예방 및 치료하기 위한 백신 및 약제학적 조성물에 있어서 이의 용도에 관한 것이다.

사람 파필로마바이러스(HPV)는 80개 이상의 유형이 존재하며, 이들중 다수가 양성의 증식성 사마귀로부터 악성 암종에 이르는 광범위한 생물학적 표현형과 관련되어 있다[참조: McMurray et al, Int. J. Exp. Pathol. 82(1): 15-33 (2001)]. HPV6 및 HPVl1은 양성 사마귀, 비악성 첨형콘딜로마 및/또는 생식기 또는 호흡기 점막의 저-등급 형성이상과 가장 일반적으로 관련된 유형이다. HPV 16 및 HPV 18 은 자궁경부, 질, 외음 및 항문관의 자체내(in situ) 및 침습성 암종과 가장 흔히 관련된 고-위험 유형이다. 자궁경부 암종의 90% 이상이 HPV16, HPV18 또는 덜 우세한 종양발생 유형 HPV31, -33, -45, -52 및 -58의 감염과 관련된다[참조: Schiffman et al., J. Natl. Cancer Inst. 85(12): 958-64 (1993)]. HPV DNA가 자궁경부암의 90 내지 100%에서 검출된다는 관측은, HPV가 자궁경부 암종을 유발한다는 것을 강력하게 역학적으로 증명한다[참조: Bosch et al., J. Clin. Pathol. 55: 244-265 (2002)].

파필로마바이러스는 작고(50-60 nm), 외피(envelope)가 없으며, 8개 이하의 초기(early) 및 2개의 후기(late) 유전자를 암호화하는 정20면체 DNA 바이러스이다. 당해 바이러스 게놈의 개방 판독 프레임(ORF)은 El 내지 E7, 및 Ll 및 L2로 정의되는데, 여기서 "E"는 초기를, "L"은 후기를 나타낸다. Ll 및 L2는 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 반면, E 유전자는 바이러스 복제 및 세포 형질전환과 같은 작용과 관련되어 있다.

Ll 단백질은 주요 캡시드 단백질이며 분자량이 55 내지 60 kDa이다. L2 단백질은 소수의 캡시드 단백질이다. 면역학적 데이타는, 대부분의 L2 단백질이 바이러스 캡시드에서 Ll 단백질에 대해 내부에 있음을 나타낸다. Ll 및 L2 단백질 둘다는 상이한 파필로마바이러스에서 고도로 보존되어 있다.

효모, 곤충 세포, 포유동물 세포 또는 세균에서 Ll 단백질, 또는 Ll과 L2의 조합물의 발현은 바이러스-유사 입자(VLP)의 자가-조립(self assembly)을 이끈다[참조: Schiller 및 Roden, in Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds Medical Information, pp 101-12 (1996)]. VLP는 진정 비리온(authentic virion)과 형태학적으로 유사하며 동물 또는 사람내로 투여되는 경우 고 역가의 중화 항체를 유도할 수 있다. VLP는 강력한 종양발생성 바이러스 게놈을 함유하지 않으므로, 이들은 HPV 백신 개발시 살아있는 바이러스의 사용에 대한 안전한 대안을 제시한다[참조: Schiller 및 Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000)]. 이러한 이유로, Ll 및 L2 유전자는 HPV 감염 및 질병에 대한 예방학적 및 치료학적 백신의 개발을 위한 면역학적 표적물로서 확인되어 왔다.

HPV 백신 개발 및 상업화는, 정제된 단백질의 생산을 제한하는, 성공적으로 형질전환된 숙주 유기체내에서 캡시드 단백질의 높은 발현 수준의 수득과 관련된 난점으로 인하여 방해되어 왔다. 따라서, HPV 52 L1 단백질과 같은 HPV L1 단백질을 암호화하는 야생형 뉴클레오타이드 서열의 확인에도 불구하고, 의도된 숙주 세포내에서 발현시키기 위해 최적화된 HPV 52 L1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하는 조 HPV L1 단백질의 용이하게 재생가능한 공급원을 개발하는 것이 크게 요구될 수 있다. 또한, 백신 개발에서 사용하기 위한 고유의 단백질의 면역성-부여 특성을 갖는 HPV 52 Ll VLP를 다량 생산하는 것이 유용할 수 있다.

발명의 개요

본 발명은 HPV 52 Ll 유전자에 의해 발현된 단백질 생성물에 대한 면역성을 유발시키거나 이를 증진시키는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발 명은, 효모 세포내에서 고 수준으로 발현시키기 위해 코돈-최적화시킨, HPV 52 Ll 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명의 대안적인 양태에서, 당해 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열은 효모에 의해 인지되는 전사 말단 시그날을 제거하도록 변형된다. 본 발명은 또한, 효모 세포내에서 재조합 HPV 52 Ll 또는 Ll + L2를 발현시킴으로써 생산되는 HPV 52 바이러스-유사 입자(VLP)를 제공하며, HPV 질환 및 HPV-관련 암을 예방 및/또는 치료하기 위한 면역학적 조성물 및 백신에서 HPV 52 VLP의 용도를 기술한다.

본 발명은 HPV 52 L1 단백질을 암호화하는 합성 DNA 분자에 관한 것이다. 합성 분자의 코돈은 효모 세포에 바람직한 코돈을 사용하도록 설계한다. 본 발명의 대안적인 양태에서는, 합성 분자의 뉴클레오타이드 서열을 변형시켜 효모가 인지하는 전사 종결 시그날을 제거한다. 합성 분자는 HPV 52 L1 단백질의 공급원으로 사용할 수 있으며, 이는 VLP로 자가-조립될 수 있다. 상기 VLP는 VLP-계 백신에서 사용될 수 있다.

본 발명의 예시적인 양태는 서열번호 2에 제시된 HPV 52 L1 단백질을 암호화하는 합성 핵산 분자를 포함하며, 당해 핵산 분자는 효모 세포에서 고수준의 발현을 위해 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

또한, 본 명세서 전체에 기술된 핵산 분자를 함유하는 재조합 벡터 및 원핵 및 진핵 세포 둘다의 재조합 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 숙주 세포는 효모 세포이다.

본 발명은 또한 (a) HPV 52 L1 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 효모 숙주 세포내로 도입시키는 단계; 및 (b) HPV 52 L1 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서 효모 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 재조합 숙주 세포내에서 HPV 52 L1 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (a) HPV 52 L1 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 효모 숙주 세포내로 도입시키는 단계(여기서, 핵산 분자는 효모 숙주 세포내에서 최적 발현을 위해 코돈-최적화되어 있다); 및 (b) 상기 HPV 52 L1 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서 효모 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 재조합 숙주 세포에서 HPV 52 L1 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다.

바람직한 양태에서, 당해 핵산 분자는 서열번호 1에 제시된 뉴클레오타이드의 서열(본원에서 "52 L1 R 서열"로 정의)을 포함한다.

본 발명은 또한 효모 세포에서 생산된 HPV 52 바이러스-유사 입자(VLP), HPV 52 VLP를 생산하는 방법, 및 HPV 52 VLP를 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 효모는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베르마이세스 프라길리스(Kluyvermyces fragilis), 클루베로마이세스 락티스(Kluveromyces lactis), 및 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

본 발명의 다른 측면은 HPV 52 Ll 또는 HPV 52 Ll + L2를 효모 세포내에서 재조합 발현시켜 생산한 HPV 52 VLP이다.

본 발명의 다른 측변은 코돈-최적화된 HPV 52 L1 유전자에 의해 생산된 HPV 52 L1 단백질을 포함하는 HPV 52 VLP이다. 본 발명의 당해 측면의 예시적인 양태에서, 코돈-최적화된 HPV 52 L1 유전자는 서열번호 1에 제시된 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 HPV 52 바이러스-유사 입자를 동물에게 투여함을 포함하여, 동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, HPV 52 VLP는 코돈-최적화된 유전자에 의해 생산된다.

본 발명의 여전히 다른 측면은 HPV 52 VLP를 포함하는 백신을 포유동물에게 투여함을 포함하여, HPV-관련된 자궁경부 암을 예방 또는 치료하는 방법이다. 본 발명의 당해 측면의 바람직한 양태에서, HPV 52 VLP는 효모에 의해 생산된다.

본 발명은 또한 효모에서 생산되는 HPV 52 바이러스-유사 입자(VLP)를 포함하는 백신에 관한 것이다.

본 발명의 당해 측면의 대안적인 양태에서, 백신은 또한 하나 이상의 추가의 HPV 유형의 VLP를 포함한다. 이러한 하나 이상의 추가의 HPV 유형은 당해 분야에 기술된 특정의 HPV 유형 또는 후속적으로 확인된 것들을 포함하는, 관심있는 특정의 HPV 유형일 수 있다. 바람직한 양태에서, HPV 유형은 사마귀 또는 자궁경부 암과 같은 임상적인 표현형과 관련된 유형이다. 추가의 바람직한 양태에서, 하나 이상의 추가의 HPV 유형은 HPV6, HPVl1, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, 및 HPV68로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

본 발명은 또한 효모에서 생산되는 HPV 52 바이러스-유사 입자를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HPV 52 VLP 및 하나 이상의 추가의 HPV 유형의 VLP를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 하나 이상의 추가의 HPV 유형은 HPV6, HPVIl, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 및 HPV68로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

본 명세서 및 첨부된 청구의 범위 전체에 사용된 것으로서, 단수형 부정관사 및 정관사는 내용을 달리 명확히 정의하지 않는 한 복수의 의미를 포함한다.

본 명세서 및 첨부된 청구의 범위 전체에 사용된 것으로서, 하기 정의 및 약자가 적용된다:

용어 "프로모터"는, RNA 폴리머라제가 결합되는 DNA 쇄상의 인식 부위를 말한다. 프로모터는 RNA 폴리머라제와 개시 복합체를 형성하여 전사 활성을 개시하고 이를 유도시킨다. 당해 복합체는 "인핸서" 또는 "상류 활성화 서열(upstream activating sequence)"로 명명된 서열을 활성화시키거나, 또는 "사일런서(silencer)"라고 명명된 서열을 억제시킴으로서 변형시킬 수 있다.

용어 "벡터"는 DNA 단편을 숙주 생물체 또는 숙주 조직내로 도입시킬 수 있는 임의의 수단을 말한다. 플라스미드, 바이러스 (아데노바이러스 포함), 박테리오파지 및 코스미드를 포함하는 다양한 유형의 벡터가 존재한다.

용어 "카세트"는 벡터로부터 발현될 뉴클레오타이드 또는 유전자 서열, 예를 들면, HPV 52 L1 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 또는 유전자 서열을 말한다. 일반적으로, 카세트는 일부 양태에서 뉴클레오타이드 또는 유전자 서열을 발현시키 기 위한 조절 서열을 제공하는 벡터내로 삽입된 유전자 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 뉴클레오타이드 또는 유전자 서열은 이의 발현을 위한 조절 서열을 제공한다. 추가의 양태에서, 벡터는 일부 조절 서열 및 뉴클레오타이드를 제공하거나, 유전자 서열은 다른 조절 서열을 제공한다. 예를 들어, 벡터는 뉴클레오타이드 또는 유전자 서열을 전사하기 위한 프로모터를 제공할 수 있으며, 뉴클레오타이드 또는 유전자 서열은 전사 종결 서열을 제공한다. 벡터에 의해 제공될 수 있는 조절 서열은 인핸서, 전사 종결 서열, 스플라이스 수용체 및 공여체 서열, 인트론, 리보솜 결합 서열 및 폴리(A) 첨가 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

정의 ""52 Ll 야생형 서열" 및 "52 Ll wt 서열"은 서열번호 3으로 본원에 기술된 HPV 52 Ll 서열을 말한다. 비록 HPV 52 Ll 야생형 서열이 앞서 기술되었다 할지라도, 임상 분리체로부터 수득된 DNA사이에 소수의 서열 변이를 발견하는 것을 일반적이지 않다. 따라서, 대표적인 HPV 52 Ll 야생형 서열은 HPV 52 DNA를 함유하는 것으로 이미 밝혀진 임상 샘플로부터 분리하였다(참조: 실시예 1). HPV 52 Ll 야생형 서열은 본원에 기술된 코돈-최적화된 HPV 52 Ll 서열을 비교하기 위한 참조 서열로서 사용되었다(참조: 도 1).

정의 "HPV 52 Ll R" 및 "52 Ll R"은 본원에 기술된 예시적인 합성 HPV52 Ll 뉴클레오타이드 서열(서열번호 :1)을 말하며, 여기서, 당해 서열은, 이것이 효모 세포에 의한 고-수준 발현에 바람직한 코돈을 포함하도록 재구성되었다.

용어 "유효량"은 적절한 수준의 폴리펩타이드를 생산하도록 도입됨으로써 면역 반응을 초래하기에 충분한 백신 조성물을 의미한다. 당해 분야의 숙련가는, 당 해 수준이 변할 수 있음을 인지한다.

"보존적 아미노산 치환"은 다른, 화학적으로 유사한, 아미노산 서열에 의한 하나의 아미노산 잔기의 대체를 말한다. 이러한 보존적 치환의 예는 다른 것에 대한 하나의 소수성 잔기 (이소루이신, 루이신, 발린 또는 메티오닌)로의 치환; 동일한 전하의 다른 극성 잔기에 대한 하나의 극성 잔기로의 치환(예: 라이신을 아르기닌으로; 아스파르트산을 글루탐산으로)을 말한다.

용어 "포유동물"은 사람을 포함하는 모든 포유동물을 말한다.

"VLP" 또는 "VLPs"는 바이러스-유사 입자 또는 바이러스-유사 입자들을 의미한다.

"합성"은, 천연적으로 존재하는 야생형 HPV 52 L1 유전자((52 Ll wt, 서열번호 3)에 존재하는 뉴클레오타이드의 서열과 동일하지 않는 뉴클레오타이드의 서열을 함유하도록 HPV 52 L1 유전자가 제조됨을 의미한다. 위에 기술한 바와 같이, 효모 세포에 의한 발현에 바람직한 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 합성 분자가 제공된다. 본원에 제공된 합성 분자는 야생형 HPV 52 L1 유전자(서열번호 2)와 동일한 아미노산 서열을 암호화한다.

도 1은 본 발명의 합성 HPV 52 L1 유전자(서열번호 1, "52 L1 R"로서 나타냄)내에서 변형된 뉴클레오타이드와 비교되는 서열 정렬을 나타낸다(참조: 실시예 2). 참조 서열은 52 L1 야생형 서열(서열번호 3, "52 Ll wt"으로 나타냄; 실시예 1 참조). 변형된 뉴클레오타이드가 이들의 상응하는 위치에서 나타나 있다. 뉴클레오타이드 번호는 괄호안에 포함된다. 52 L1 재구성 서열내 동일한 뉴클레오타이드는 점으로 나타낸다.

도 2는 재구성된 합성 HPV 52 Ll 이본쇄 핵산(서열번호 1 및 7) 및 단일 코드 아미노산 서열(서열번호 2)를 나타낸다. 뉴클레오타이드 번호는 좌측에 나타낸다.

도 3은 HPV 52 Ll wt 및 HPV 52 Ll R 전사체의 노던 블롯을 나타낸다(참조: 실시예 4). 블롯은 52 Ll wt 및 52 Ll R 서열 둘다에 대해 생성된 DNA 프로브의 혼합물을 사용하여 프로브하였다. 우측의 화살표는 전장 52 Ll 전사체의 예측된 위치를 나타낸다. 52 Ll wt RNA의 5 및 10 μg 레인에서 어떠한 길이의 전사체로 검출되지 않았다. 전장 전사체는 5 및 10 μg 레인 둘다에서 52 L1 R내에 명백하다.

도 4는 HPV 52 Ll wt (52 wt) 및 52 Ll R (52R) 단백질의 웨스턴 블롯을 나타낸다. HPV 16 Ll은 참조물질(16)로서 포함되었다. 총 효모 단백질 추출물의 10, 5 및 2와 1/2 마이크로그램을 변성시켜 10% SDS-PAGE 겔에 적용하였다. 단백질을 웨스턴(Western)-이동시켰다. HPV 52 Ll 단백질을 HPV 52 Ll 및 HPV 16 Ll과 교차-반응하는 효모-흡착된 항-trpE-HPV 31 Ll 염소 폴리클로날 항혈청을 사용하여 수득되는 블롯상에서 검출하였다. 분자량 마커는 좌측상에 kDa로 나타낸다. 화살표는 ~ 55 kDa HPV 52 Ll 단백질의 위치를 나타낸다.

도 5는 투과 전자 현미경으로 가시화된 것으로서, 본원에 기술된 HPV 52 Ll R 단백질 분자로 구성된 HPV 52 VLP의 대표적인 샘플을 나타낸다(참조: 실시예 7). 당해 조 샘플에서 구형 입자의 직경은 40 및 70 nm의 범위이었으며 일부 입자는 캡소미어(capsomere)의 규칙적인 배열을 나타내었다. 바아(bar)는 대략 0.1 μm를 나타낸다.

자궁경부 암종의 대부분은 특정의 종양발생 유형의 사람 파필로마바이러스(HPV)의 감염과 관련되어 있다. 본 발명은 종양발생 HPV 유형의 유전자에 의해 발현된 단백질 생성물에 대해 면역성을 유발하거나 증진시키는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은, 효모에서 고수준의 발현을 위해 코돈-최적화된, HPV 52 L1을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명은 또한 효모에서 생산되는 HP52 바이러스-유사 입자(VLP)를 제공하며, HPV-관련 암을 예방 및/또는 치료하기 위한 면역원성 조성물 및 백신에서 상기 폴리뉴클레오타이드 및 VLP의 용도를 기술한다.

야생형 HPV52 L1 뉴클레오타이드 서열은 보고되어 있다(젠뱅크(GenBank) 수탁번호 제NC 001592). 본 발명은 HPV52 L1 단백질을 암호화하는 합성 DNA 분자를 제공한다. 본 발명의 하나의 측면에서, 합성 분자는, 적어도 일부의 코돈은 고수준의 발현을 위해 효모 세포에 바람직한 코돈을 사용하도록 변형된 코돈 서열을 포함한다. 본 발명의 대안적인 측면에서, 합성 분자의 뉴클레오타이드 서열은 효모에 의해 인지되는 전사 종결 시그날을 제거하도록 변형된다. 합성 분자는 VLP로 자가 조립될 수 있는 HPV52 L1 단백질 발현용 암호화 서열로서 사용될 수 있다. 상기 VLP는 VLP-계 백신에 사용되어 중화 항체 및 세포-매개된 면역성을 통해 파필로마바이러스 감염에 대해 효과적인 면역학적 예방을 제공할 수 있다. 이러한 VLP-계 백신은 또한 이미 확립된 HPV 감염을 치료하는데 유용할 수 있다.

효모 세포에서 HPV VLP의 발현은 비용-효율적이고 발효기내 대규모 성장에 용이하게 채택할 수 있는 장점을 부여한다. 또한, 효모 게놈은 용이하게 변형시켜, 성장 및 발현 효능이 증가된 재조합의 형질전환된 효모를 확실히 선택할 수 있다. 그러나, HPV52 L1을 포함하는 많은 HPV L1 단백질은 상업적 규모에 요구되는 것보다 적은 수준으로 효모 세포에서 발현된다(참조: 실시예 2).

따라서, 본 발명은 효모 세포 환경내에서 고수준의 발현을 위해 "최적화"된 HPV52 L1 유전자 서열에 관한 것이다.

4개의 가능한 뉴클레오타이드 염기의 "삼중(triplet)" 코돈은 60개를 넘는 변이체 형태로 존재할 수 있다. 이러한 코돈은 단지 20개의 상이한 아미노산에 대한 전령(및 전사 개시 및 종결)을 제공하므로, 일부 아미노산은 코돈 중복(codon redundancy)로 알려진 현상인, 하나 이상의 코돈에 의해 암호화될 수 있다. 원인들이 완벽하게 이해되어 있지 않은 이유로 인해, 대안적인 코돈이 상이한 유형의 세포의 내인성 DNA내에 균일하게 존재하지는 않는다. 게다가, 특정 유형의 세포내에 특정 코돈에 대해 가변성의 위계(hierarchy) 또는 "선호(preference)"를 나타내는 경향이 있다. 한가지 예로서, 아미노산 루이신은 CTA, CTC, CTG, CTT, TTA 및 TTG를 포함하는 특정의 6개의 DNA 코돈에 의해 특정된다. 미생물에 대한 게놈 코돈 사용 빈도의 철저한 분석은, 이. 콜라이(E. coli)의 내인성 DNA가 CTG 루이신을 규정하는 코돈을 가장 일반적으로 함유하는 반면, 효모 및 점균류의 DNA는 TTA 루이신을 특정하는 코돈을 가장 일반적으로 포함한다. 이러한 위계의 측면에서, 이. 콜라이 숙주에 의한 루이신이 풍부한 폴리펩타이드의 고수준의 발현을 수득할 가능성은 코돈 사용의 빈도에 어느 정도 의존할 것으로 여겨진다. 예를 들어, TTA 코돈에서 유전자의 풍부성은 이. 콜라이내에서 저조하게 발현될 것인 반면, CTG가 풍부한 유전자는 아마도 당해 숙주에서 고수준으로 발현될 것으로 여겨진다. 유사하게, 루이신이 풍부한 폴리펩타이드의 효모 숙주 세포내 발현을 위한 바람직한 코돈은 TTA일 수 있다.

재조합 DNA 기술에서 코돈 선호 현상의 암시는 명백하며, 당해 현상은 성공적으로 형질전환된 숙주 생물체내에서 외인성 유전자의 고수준의 발현을 달성하기 위한 이전의 많은 실패를 설명할 수 있는데, 즉 덜 "선호된" 코돈은 삽입된 유전자내에 반복적으로 존재할 수 있고 발현용 숙주 세포 기관이 효율적으로 작동하지 않을 수 있다. 이러한 현상은, 계획된 숙주 세포의 선호 코돈을 포함하도록 설계된 합성 유전자가 재조합 단백질 발현을 실시하기 위한 외래 유전 물질의 최적 형태를 제공함을 제안한다. 즉, 본 발명의 하나의 측면은 효모 세포에서 고수준의 발현을 위해 코돈-최적화된 HPV52 L1 유전자이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 동일한 단백질 서열을 암호화하는 대안적인 코돈의 사용은 효모 세포에 의해 HPV52 L1 단백질의 발현시 제한을 제거할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

본 발명에 따라서, HPV52 L1 유전자 분절은, 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: Sharp 및 Cowe의 Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 7: 657-678 (1991)]에 기술한 바와 같이, 대안적인 코돈이 사용되었으나 동일하게 해독된 서열을 지니는 서열로 전환되었다. 일반적으로 당해 방법은 고도 발현된 효모 유전자와 통상적으로 관련되지 않은 야생형 서열에서 코돈을 확인하는 단계 및 이들을 효모 세포내에서 높은 발현을 위한 최적 코돈으로 대체하는 단계로 이루어진다. 이후에, 새로운 유전자 서열을 이러한 코돈 치환(예를 들면, "ATTTA" 서열, 인트론 스플라이스 인지 부위의 우연한 생성, 원치않는 제한 효소 부위, 고 GC 함량, 효모에 의해 인지되는 전사 종결 시그날의 존재 등)에 의해 생성된 원치않는 서열에 대해 조사한다. 바람직하지 않은 서열은 존재하는 코돈을 동일한 아미노산을 암호화하는 상이한 코돈으로 치환시켜 제거한다. 합성 유전자 분절은 이후에 개선된 발현에 대해 시험한다.

상기 기술된 방법을 사용하여 HPV52 L1에 대한 합성 유전자 분절을 제조하여, 고수준의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 유전자를 생성시켰다. 상기 과정이 HPV 백신에서 사용하기 위한 코돈-최적화된 유전자를 설계하기 위한 본 출원인의 방법의 요약을 제공한다 해도, 당해 분야의 숙련가들은, 유사한 백신 효능 또는 유전자의 증가된 발현이 상기 방법에 있어서의 약간의 변화 또는 서열내 약간의 변화에 의해 달성될 수 있음을 이해한다.

따라서, 본 발명은 HPV52 L1 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 합성 폴리뉴클레오타이드, 또는 HPV52 L1 단백질의 생물학적 활성 단편 또는 돌연변이체 형태에 관한 것이며, 당해 폴리뉴클레오타이드 서열은 효모 숙주 세포내에서 발현시키기 위해 최적화된 코돈을 포함한다. HPV52 L1 단백질의 이러한 돌연변이체 형태는 보존적 아미노산 치환, 아미노-말단 절단(truncation), 카복시-말단 절단, 결실 또는 첨가를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 모든 이러한 생물학적으로 활성인 단편 및/또는 돌연변이체도 서열번호 2에 제시된 HPV52 L1 단백질의 면역학적 특징을 적어도 실질적으로 모사하는 단백질 또는 단백질 단편을 암호화할 것이다. 본 발명의 합성 폴리뉴클레오타이드는 작용성 HPV52 L1 단백질을 발현하는 mRNA 분자를 암호화함으로써 치료학적 또는 예방학적 HPV 백신의 개발에 유용하다.

본 발명의 하나의 측면은 서열번호 2에 제시된 HPV52 L1 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 핵산 분자이며, 당해 핵산 분자는 효모 세포내에서 고수준의 발현을 위해 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명의 당해 측면의 바람직한 양태에서, 핵산 분자는 서열번호 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 본 명세서 전체에서 기술된 핵산 분자를 함유하는, 진핵 또는 원핵 세포 둘다의 재조합 숙주 세포 및 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 숙주 세포는 효모 숙주 세포이다.

본원에 기술된 방법을 통해 작제된 합성 HPV52 L1 DNA, 이의 작용 등가물, 및 이의 단편은, 적합한 프로모터 및 기타 적절한 전사 조절 요소를 함유하는 발현 벡터내로 분자 클로닝함으로써 재조합적으로 발현시킬 수 있다. 이러한 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 숙주 세포내로 전달되어 재조합체 HPV52 L1 단백질을 생산할 수 있다. 이러한 조작의 기술은 본원에 이의 전문이 참조로 인용된 문헌[참조: Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Green Pub. Associates 및 Wiley-Interscience, New York (1988); Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1990)]에 완전히 기술되어 있다.

즉, 본 발명은 (a) HPV52 L1 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 효모 숙주 세포내로 도입시키는 단계; 및 (b) 상기 HPV52 L1 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서 효모 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 재조합체 숙주 세포에서 HPV52 L1 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, (a) HPV52 L1 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 효모 숙주 세포내로 도입시키는 단계(여기서, 핵산 분자는 효모 숙주 세포내에서 최적 발현을 위해 코돈-최적화되어 있다); 및 (b) 상기 HPV52 L1 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서 효모 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 재조합 숙주 세포내에서 HPV52 L1 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, (a) 서열번호 1에 제시된 핵산을 포함하는 벡터를 효모 숙주 세포내로 도입시키는 단계; 및 (b) 상기 HPV52 L1 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서 효모 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 재조합 숙주 세포내에서 HPV52 L1 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 합성 유전자는 숙주 세포내에서 HPV52 L1 단백질이 효율적으로 발현되도록 설계된 서열을 포함하는 발현 카세트내로 조립시킬 수 있다. 카세트는 바람직하게는 프로모터 및 종결 서열과 같이, 이에 작동적으로 연결된 관련된 전사 및 해독 조절 서열을 지닌 합성 유전자를 함유한다. 바람직한 양태에서, 프로모터는 에스. 세리비지아에(S. cerevisiae) GAL1 프로모터이지만, 당해 분야의 숙련가들은, GALlO, GAL7, ADHl, TDH3 또는 PGK 프로모터와 같은 다수의 다른 공지된 효모 프로모터, 또는 다른 진핵세포 유전자 프로모터가 사용될 수 있음을 인지하고 있다. 비록 다른 공지된 전사 터미네이터가 또한 사용될 수 있다고 해도, 바람직한 전사 터미네이터는 에스. 세레비지아에 ADH1 터미네이터이다. GAL1 프로모터-ADH1 터미네이터의 조합이 특히 바람직하다.

본 발명의 다른 측면은 효모 세포내에서 HPV 52 L1 또는 L1 + L2 유전자를 재조합적으로 발현시켜 생산한 HPV 52 바이러스-유사 입자(VLP), HPV 52 VLP를 생산하는 방법, 및 HPV 52 VLP를 사용하는 방법이다. VLP는, 사람 및 동물 파필로마바이러스의 주요 캡시드 단백질인, L1이 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포 또는 세균에서 발현되는 경우에 자가-조립할 수 있다[참조: Schiller 및 Roden, in Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds Medical Information, pp 101-12 (1996)]. 또한, 형태학적으로 식별할 수 없는 HPV VLP는 L1 및 L2 캡시드 단백질의 조합물을 발현시킴에 의해 생산할 수 있다. VLP는 T=7 정20면체 구조에서 L1의 72개 펜타머로 구성되어 있다[참조: Baker et al., Biophys. J. 60(6): 1445-56 (1991)].

VLP는 진정 비리온과 형태학적으로 유사하며 동물에게 투여시 고 역가의 중화 항체를 유도할 수 있다. VLP를 사용한 토끼의 면역화[참조: Breitburd et al., J. Virol. 69(6): 3959-63 (1995)] 및 개의 면역화[참조: Suzich et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(25): 11553- 57 (1995)]는 둘다 중화 항체를 유도하고 실험적인 파필로마바이러스 감염을 예방하는 것으로 밝혀졌다. 또한, HPV 16 VLP를 사용한 성인 여성의 면역화는 HPV 16 감염 및 HPV 16 자궁경부 상피내 신생물을 예방하는 것으로 밝혀졌다[참조: Koutsky et al. N. Engl. J. Med. 347: 1645-51 (2002)]. VLP는 잠재적으로 종양유발 바이러스 게놈을 함유하지 않으며 단일의 유전자로부터 발현되는 경우 자가-조립될 수 있으므로, 이들은 HPV 백신 개발에 있어서 살아있는 바이러스의 사용에 대한 안전한 대안이다[참조: Schiller 및 Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000)].

따라서, 본 발명은, 효모 세포내에서 발현되는 HPV 52의 재조합 Ll 단백질 또는 재조합 Ll + L2 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자에 관한 것이다.

위에서 기술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 양태에서, HPV 52 VLP는 효모에서 생산된다. 추가의 바람직한 양태에서, 효모는 사카로마이세스 세레비지아에, 한세눌라 폴리모르파, 피키아 파스토리스, 클루이베로마이세스 프라길리스, 클루이베로마이세스 락티스 및 스퀴조사카로마이세스 폼베로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

본 발명의 다른 측면은 코돈-최적화된 HPV 52 L1 유전자에 의해 생산된 HPV 52 L1 단백질을 포함하는 HPV 52 VLP이다. 본 발명의 당해 측면의 바람직한 양태에서, 코돈-최적화된 HPV 52 L1 유전자는 서열번호 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 여전히 다른 측면은 (a) HPV 52 L1 단백질 또는 HPV 52 L1 + L2 단백질을 암호화하는 재조합 DNA 분자로 효모를 형질전환시키는 단계; (b) 형질전환된 효모를 재조합체 DNA 분자의 발현을 허용하는 조건하에 배양하여 재조합체 HPV 52 단백질을 생산하는 단계; 및 (c) 재조합체 HPV 52 단백질을 분리하여 HPV 52 VLP를 생산하는 단계를 포함하는, HPV 52 VLP를 생산하는 방법이다.

본 발명의 당해 측면의 바람직한 양태에서, 효모는 코돈-최적화된 HPV 52 L1 유전자로 형질전환시켜 HPV 52 VLP를 생산한다. 특히 바람직한 양태에서, 코돈-최적화된 HPV 52 L1 유전자는 서열번호 1에 제시된 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 HPV 52 바이러스-유사 입자를 동물에게 투여함을 포함하여, 동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, HPV 52 VLP는 HPV 52 L1 또는 HPV 52 L1 + L2를 암호화하는 코돈-최적화된 유전자를 재조합적으로 발현시켜 생산한다.

본 발명의 여전히 다른 측면은 HPV 52 VLP를 포함하는 백신을 포유동물에게 투여함을 포함하여, HPV-관련 자궁경부 암을 예방 및/또는 치료하는 방법이다. 본 발명의 당해 측면의 바람직한 양태에서, HPV 52 VLP는 효모내에서 생산된다.

본 발명은 또한 HPV 52 바이러스-유사 입자(VLP)를 포함하는 백신에 관한 것이다.

본 발명의 당해 측면의 대안적인 양태에서, 백신은 또한 하나 이상의 추가의 HPV 유형의 VLP를 포함한다. 바람직한 양태에서, 하나 이상의 추가의 HPV 유형은 HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59, 및 HPV 68로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

본 발명의 당해 측면의 바람직한 양태에서, 백신은 또한 HPV 16 VLP를 포함한다.

본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 백신은 또한 HPV 16 VLP 및 HPV 18 VLP를 포함한다.

본 발명의 여전히 다른 바람직한 양태에서, 백신은 또한 HPV 6 VLP, HPV 11 VLP, HPV 16 VLP 및 HPV 18 VLP를 포함한다.

본 발명은 또한 HPV 52 바이러스-유사 입자를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HPV 52 VLP 및 하나 이상의 추가의 HPV 유형의 VLP를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 하나 이상의 추가의 HPV 유형은 HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59, 및 HPV 68로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

본 발명의 백신 조성물은 최소의 잠재적인 독성으로 HPV 52 감염을 최적 억제하도록 하기에 적절한 용량에서 단독으로 사용될 수 있다. 또한, 다른 제제의 공동-투여 또는 연속 투여도 바람직할 수 있다.

백신 수용체내로 도입될 바이러스-유사 입자의 양은 발현된 유전자 생성물의 면역원성에 의존할 것이다. 일반적으로, 약 10 μg 내지 100 μg, 및 바람직하게는 약 20 μg 내지 60 μg의 VLP의 면역학적 또는 예방학적 유효 투여량을 근육 조직내로 직접 투여한다. 피하 주사, 피내 도입, 피부를 통한 인상(impression), 및 복강내, 정맥내 또는 흡입 전달과 같은 다른 투여 유형이 또한 고려된다. 부스터(booster) 백신접종이 제공될 수 있다는 것도 또한 고려된다. 본 발명의 백신의 비경구 도입과 동시에 또는 후속적으로, 정맥내, 근육내, 피하와 같은 비경구 투여, 또는 명반(alum) 또는 머크 명반 애주번트와 같은 애주번트를 사용한 기타 투여 수단이 또한 유리하다.

본원에 언급된 모든 공보는 본 발명과 함께 사용될 수 있는 방법 및 물질을 기술하고 기재할 목적으로 참조로 인용된다. 본원의 어느 것도, 본 발명이 선행 발명에 의해 공개된 것에 선행하는 권리를 인정하는 것으로 고려되어서는 안된다.

본 발명의 바람직한 양태를 첨부되는 도면을 참조로 기술하였지만, 본 발명이 이러한 상세한 양태로 한정되지 않으며, 다양한 변화 및 변형이 첨부된 청구의 범위에 정의한 것으로서 본 발명의 영역 또는 취지에 벗어남이 없이 당해 분야의 숙련가에 의해 수행될 수 있음은 이해되어야 한다.

하기에 실시예를 나열하나, 이로써 본 발명을 한정하지는 않는다.

실시예 1

대표적인 HPV 52 Ll 서열의 측정

HPV 52 Ll 서열은 앞서 기술되어 있다(젠뱅크 수탁 번호 제NC 001592호). 그러나, 임상적 분리체로부터 수득된 DNA 사이에 소수의 서열 변형을 발견하는 것은 일반적이지 않다. 대표적인 HPV 52 Ll 야생형 서열을 측정하기 위하여, DNA를 HPV 52 DNA를 함유하는 것으로 아미 밝혀진 3개의 임상 샘플로부터 분리하였다. HPV 52 Ll 서열을 Taq DNA 폴리머라제 및 다음 프라이머: 5' Ll 5' - A T G T C C G T G T G G C G G C C T A G T - 3'(서열번호 4) 및 3'52 Bgl II 5' - G A G A T C T C A A T T A C A C A A A G T G- 3' (서열번호 5)를 사용하여 폴리머라제 쇄 반응(PCR)로 증폭시켰다. 증폭된 생성물을 아가로즈 겔상에서 전기영동시키고 에티디움 브로마이드 염색으로 가시화하였다. 약 1500 bp Ll 밴드를 절개하고 DNA를 진클린 스핀 키트(Geneclean Spin Kit)(Q-Bio Gene 제조원, 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 사용하여 정제하였다. 이후에, DNA를 TA 클로닝 벡터, pCR2.1(Invitrogen 제조원)에 연결하였다. TOPlOF 이. 콜라이 세포를 연결 혼합물로 형질전환시키고 가나마이신 및 IPTG와 청색/백색 콜로니 선택을 위한 X-gal이 들어있는 LB 아가상에 플레이팅하였다. 플레이트를 역으로 하여 37℃에서 16시간 동안 항온배양하였다.

콜로니 PCR을 증폭된 3개의 임상 분리체 각각으로부터 기원하는 5개의 백색 콜로니상에서 수행하였다. 5' Ll 및 3' 52 BgI II 프라이머를 2단계 PCR에서 사용하며, 이때, 제1 단계는 96℃에서 15초(변성화), 55℃에서 30초(어닐링) 및 68℃에서 2분(연장)의 10 주기를 포함하며, 제2 단계는, 어닐링 단계를 50℃에서 30초동 안 수행하는 것을 제외하고는 실질적으로 유사한 프로그램의 35 주기를 포함한다. PCR 생성물을 아가로즈 겔상에서 전기영동하고 에티디움 브로마이드 염색으로 가시화하였다. 각각의 임상 분리체로부터의 몇몇 콜로니는 약 1500bp 밴드의 증폭된 생성물을 함유하였다. 당해 콜로니를 가나마이신이 들어있는 LB 배지속에서 항온배양하고, 37℃에서 16시간 동안 진탕시켰다. 미니프렙(miniprep)을 수행하여 플라스미드 DNA를 추출하고, 이를 제한 엔도뉴클레아제로 분해하여 플라스미드내 L1 유전자의 존재를 입증하였다. 수득되는 제한 단편을 아가로즈 겔 전기영동 및 에티디움 브로마이드 염색으로 관찰하였다.

DNA 서열분석을 3개의 임상 분리체 각각으로부터 클로닝된 L1 삽입체를 함유하는 플라스미드상에서 수행하였다. DNA 및 해독된 아미노산 서열을 서로 비교하고, 이미 공개된 젠뱅크 HPV 52 L1 서열과 비교하였다. 3개의 임상 분리물의 서열 분석은, 어떠한 서열도 젠뱅크 서열(수탁 번호 제NC 001592호)와 동일하지 않음을 나타내었다. pCR2.1 HPV 52Ll 클론 #2C을 선택하여 대표적인 HPV 52 Ll 서열로 정하고 본원에서 "52 Ll 야생형 서열"(서열번호 3, 참조: 도 1)로 지칭한다. 52 Ll 야생형(wt)으로서 선택된 서열은 젠뱅크 서열과 비교하여 1개의 점(point) 돌연변이를 함유하며, 이는 뉴클레오타이드 1308번에서 사일런트 돌연변이(아데닌 → 구아닌)로 이루어진다. HPV 52 Ll wt 서열의 아미노산 서열은 52 Ll 젠뱅크 서열과 동일하였다.

HPV 52 Ll 야생형 서열을 5' Ll BgI H 프라이머(5' - G A G A T C T C A C A A A A C A A A A T G T C C G T Q T G G C - 3' (서열번호 6) 및 Bgl II 연장물을 가하기 위해 위에서 기술된 3' 52 Bgl II 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. PCR을 Taq 폴리머라제를 사용하여 수행하였다. PCR 생성물을 아가로즈 겔상에서 전기영동하고 에티디움 브로마이드 염색으로 가시화하였다. 약 1500 bp 밴드를 절개하고 DNA를 진클린 스핀 키트(Q-Bio Gene 제조원, 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 사용하여 정제하였다. 이후에, PCR 생성물을 pCR2.1 벡터에 연결하고 TOPlOF' 세포를 당해 연결 혼합물로 형질전환시켰다. 백색 콜로니를 가나마이신이 들어있는 LB 배지속에서, 37℃로 16시간 동안 진탕하며 항온배양하였다. 미니프렙을 수행하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. HPV 52 Ll 유전자를 Bgl II 제한 엔도뉴클레아제 분해로 벡터 서열로부터 방출시켰다. 분해된 DNA를 아가로즈 겔 전기영동에 적용시켜 에티디움 브로마이드 염색으로 관찰하였다. L1 밴드를 진클린 키트를 사용하여 정제하고 탈포스포릴화된 BamHI-분해된 pGAL110 벡터에 연결시켰다. TOPlOF' 이. 콜라이 세포를 연결 혼합물로 형질전환시켰다. 정확한 배양의 HPV 52 Ll 삽입물을 스크리닝하기 위해 콜로니로부터의 플라스미드 DNA를 PCR-증폭시켰다. DNA 서열분석을 수행하여 삽입체의 서열 및 배향을 확인하였다. 선택한 클론을 pGAL110-HPV 52Ll #5로 명명하였다. 선택된 클론으로부터 맥시프렙(Maxiprep) DNA를 제조하였다. 사카로마이세스 세레비지아에 세포를 글루술라제를 사용한 스페로플라스팅(spheroplasting)으로 컴피턴트(competent) 세포로 만들고, pGALl10-HPV 52Ll #5를 사용하여 형질전환시켰다. 효모 형질전환 혼합물을 Leu^- 소르비톨 플레이트상에서 Leu^- 소르비톨 상단-아가 속에 플레이팅하고 30℃에서 3 내지 5일 동안 뒤집어 항온배양하였다. 콜로니를 집어내어 Leu^- 소르비톨 플레이트상에서 분리를 위해 스트리킹(streaking)하였다. 분리된 콜로니를 후속적으로 30℃에서 회전하는 튜브 배양물 중 1.6% 글루코즈 및 4% 갈락토즈가 들어있는 5ml 들이의 5X Leu^- Ade^- 소르비톨 속에서 성장시켜 HPV52 L1 전사 및 단백질 발현을 유도시켰다.

실시예 2

효모 코돈 최적화

효모에 바람직한 코돈은 기술되어 있다[참조: Sharp, Paul M 및 Cowe, Elizabeth. Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae YEAST 7: 657-678 (1991)]. HPV 52 Ll wt 단백질의 발현은 검출가능하나, 전사 수준이 매우 낮으며 노던 블롯으로 검출가능하지 않았다. 예비-성숙 전사 종결이 HPV 52 L1 유전자의 낮은 발현 수준의 원인일 수 있는 것으로 추정되었다. 당해 유전자의 전사를 증가시키고 전장 전사체가 생산되도록 하기 위해, HPV 52 Ll 유전자를 효모에 바람직한 코돈을 이용하여 재구성하였다. 당해 서열을 효모에 의해 인지되는 효모 전사 종결 시그날의 존재에 대해 검사하고, 이들 서열을 대안 코돈으로 치환시켜 제거하며 동일한 아미노산 서열은 보존시켰다. 효모 코돈-최적화된 서열을 포함하는 재구성된 HPV 52 Ll 서열은 HPV 52 Ll wt 서열과 비교하여 379개 뉴클레오타이드 변형을 함유하였다. 수득되는 서열은 본원에서 "52 Ll R"(R = 재구성, 참조: 도 1)로 지칭하였다. 52 Ll wt(서열번호 3)와 52 Ll R(서열번호 1) 서열 사이의 뉴클 레오타이드 변형은 도 1에 나타낸다. 58 Ll R의 해독된 아미노산 서열은 변경되지 않았다(서열번호 2, 참조: 도 2). 재구성된 서열은 증가된 HPV 52 Ll 단백질 발현을 제공하며, 이는 백신 개발시 사용하기 위한 야생형보다 현저히 앞선 것이다.

최적화된 유전자를 생산하기 위해 사용된 방법은, 뉴클레오타이드를 효모에 바람직한 코돈 서열로 치환하면서 아미노산 서열을 유지하도록, 유전자를 포괄하는 긴 중첩 센스 및 안티센스 올리고머를 설계하는 것이다. 이들 올리고머는 pfu DNA 폴리머라제를 사용한 PCR 반응에서 주형 DNA 대신 사용하였다. 추가의 증폭 프라이머를 설계하여 주형 올리고머로부터 재구성된 서열을 증폭시키는데 사용하였다.

증폭을 위한 최적 조건은 절편-특이적이나; 대부분의 반응은 94℃에서 5분 동안(변성)에 이어, 95℃에서 30초(변성), 50 내지 55℃에서 30초(어닐링), 72℃에서 1.5분(연장)의 25 주기에 이어, 72℃에서 7분의 최종 연장 및 4℃ 유지와 유사한 프로그램을 사용하였다. PCT 생성물을 아가로즈 겔 전기영동으로 시험하였다. 적절한 크기의 밴드를 절단하고 DNA를 겔 절편으로부터 정제하였다. 이후에 증폭된 단편을 주형으로 사용하여 1512nt 재구성 HPV 52 L1 유전자를 조립하였다.

재구성에 이어, 1512nt 밴드를 겔 정제하고 pCR4 Blunt 벡터(Invitrogen 제조원, 캘리포니아주 칼스바드 소재)에 연결하였다. 연결한 후, 컴피턴트 이. 콜라이 TOP10 세포를 연결 혼합물로 형질전환시켰다. 콜로니를 암피실린이 들어있는 4ml LB속에서 성장시키고 플라스미드 DNA를 미니프렙 기술에 의해 콜로니로부터 추출하였다. 플라스미드 DNA를 서열분석하여 바람직한 HPV 52 Ll 재구성 변화를 확인하였다. 말단 둘다에 BamHI 연장물을 가하기 위해, 52 Ll R(재구성물)을 pCR4Blunt-52 Ll R로부터 재-증폭시켰다. 증폭된 단편을 상기와 같이 클로닝하고 수득되는 플라스미드 DNA를 서열분석하였다. 플라스미드, pCR4 Blunt-52 Ll R (Bam)을 BamHI로 분해하고 수득되는 DNA 단편 삽입물을 아가로즈 겔상에서 전기영동하였다. 약 -1530 bp의 HPV 52 Ll R(Bam) 단편을 겔 정제하고 BamHI-분해된 pGALl10에 연결하였다. TOPlOF' 이. 콜라이(Invitrogen 제조원) 세포를 연결 혼합물을 사용하여 형질전환시켰다.

수득되는 콜로니를 정확한 배향의 HPV 52 Ll R 삽입물에 대해 PCR로 스크리닝하였다. 서열 및 배향은 DNA 서열분석으로 확인하였다. 맥시프렙 플라스미드 DNA를 제조하였다. 에스. 세레비지아에 세포를 스페로플라스팅으로 컴피턴트화시키고 형질전환시켰다. 효모 형질전환체를 Leu^- 소르비톨 아가 플레이트상에서 Leu^- 소르비톨 상단-아가 속에 플레이팅하고 뒤집어 7일 동안 항온배양하였다. 콜로니를 집어내어 Leu^- 소르비톨 아가 플레이트상에서 클론 분리를 위해 스트리킹하였다. 후속적으로, 분리된 콜로니를 회전 튜브 배양물내 5 ml들이의 5X Leu^- Ade^- 소르비톨과 1.6% 글루코즈 및 4% 갈락토즈속에서 30℃로 성장시켜 L1 전사 및 단백질 발현을 유도하였다. 48 및/또는 72시간 후, OD₆₀₀ = 10과 동일한 배양 용적을 펠릿화하고, 상층액을 제거하고 펠릿을 동결시키고 -70℃에서 저장하였다.

실시예 3

RNA 제조

갈락토즈 유도에 의해 HPV 52 L1을 발현하도록 유도시킨 형질전환된 효모의 세포 펠릿을 빙상에서 해동시키고, 0.8ml의 트리졸(Trizol) 시약[라이프 테크놀로지스((Life Technologies) 제조원, 기브코 비알엘(Gibco BRL) 제조원]속에 현탁시키고 실온에서 5분 동안 항온배양하였다. 1/50 용적의 클로로포름을 바이알에 가하였다. 이후에, 이를 15초 동안 격렬하게 진탕시켜 혼합하고 실온에서 3분 동안 항온배양하였다. 13k rpm에서 5분 원심분리한 후, 상부 상을 수집하고 새로운 바이알에 이전시켰다. 0.4ml의 이소프로판올을 바이알에 가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 항온배양하였다. RNA를 펠릿화하기 위해, 원심분리를 13k rpm에서 10분 동안 수행하였다. 상층액을 경사분리하고, RNA 펠릿을 75% EtOH로 세척하고 원심분리 단계를 반복하였다. 상층액을 경사분리하고, RNA 펠릿을 15분 동안 공기 건조시킨 후 RNase가 부재하는 수중에 현탁시켰다. 분광광도 측정법을 수행하여 A_260/280이 1.7 내지 2.0인 경우 A_26O 판독 1을 4O μg/ml RNA로 추정하여 샘플내 RNA 농도를 측정하였다.

실시예 4

노던 블롯 분석

1.1% 아가로즈 포름알데하이드 겔을 주조하였다. 5 및 10 마이크로그램의 RNA를 변성 완충액(최종 농도: 6% 포름알데하이드, 50% 포름알데하이드 및 0.1 x MOPS)과 합하고 65℃로 10분 동안 가열하였다. 1/10 용적의 겔 충전 완충액을 가 하고 샘플을 겔 상에 충전하였다. 전기영동을 75 볼트로 1 x MOPS 완충액속에서 약 3시간 동안 수행하였다. 당해 겔을 60분 동안 10 x SSC속에서 세척하였다.

RNA를 하이본드(Hybond)-N + 나일론 막(Amersham Biosciences 제조원, 뉴저지주 피츠카타웨이 소재)에 모세 작용으로 16시간에 걸쳐 10 x SSC 속에서 이전시켰다. 이후에 RNA를 나일론 막에 스트라타젠 UV 스트라타링커(Stratagene UV Stratalinker) 자동 가교결합 작용[스트라타젠(Stratagene) 제조원, 캘리포니아주 라 졸라 소재]을 사용하여 가교결합시킴으로써 고정시켰다. 고정 후, 나일론 막을 공기 건조시켰다.

로슈 DIG 하이 프라임 DNA 라벨링 및 검출 키트 I[Roche DIG high Prime DNA Labeling and Detection Kit: 호프만-라 로슈 엘티디(Hoffmann-La Roche Ltd.) 제조원, 스위스 바젤 소재]을 사용하여 52 Ll wt 및 52 Ll R DNA 서열을 노던 블롯상에서 52 Ll wt 및 52 Ll R RNA를 검출하기 위한 프로브로서 사용될 DIG로 표지하였다. 예비-하이브리드화, 하이브리드화 및 항-DIG 알칼린 포스파타제-접합된 항체를 사용한 면역학적 개발을 제조업자 추천에 따라 수행하였다. 요약하면, 블롯을 37℃에서 30분 동안 온화하게 진탕시키면서 예비-하이브리드화하였다. 당해 프로브를 95℃에서 5분동안 가열하고 후속적으로 빙상에서 급랭시킴으로써 변성시켰다. 당해 프로브를 하이브리드화 용액에 가하고 온화하게 진탕시키면서 44.6℃에서 4시간 동안 막에 적용시켰다. 하이브리드화 용액을 제거하고 당해 블롯을 5분 동안 2 x SSC속에서 0.1% SDS를 사용하여 실온에서 2회 세척한 후, 65℃에서 0.5 x SSC 및 0.1% SDS로 추가로 세척하였다. 이후에, 블롯을 30분 동안 차단시키고 항-DIG 알 칼린 포스파타제-접합된 항체를 1:5000 희석으로 30분 동안 적용시켰다. 당해 블롯을 세척하고 프로브-결합된 RNA의 존재를 알칼린 포스파타제 접합된 항-DIG 결합된 항체의 NBT/BCIP 기질 검출로 측정하였다.

HPV 52 Ll wt를 발현하는 효모의 초기 분석은, HPV 52 Ll 단백질이 발현되나, 수준이 낮음을 제안하였다. HPV 52 Ll wt를 발현시키기 위해 유도된 배양물의 효모 추출물로부터의 RNA의 노던 블롯 분석은 어떠한 검출가능한 HPV 52 Ll RNA도 나타내지 않았다. 적절한 크기의 일부 단백질이 검출되었으므로, 일부 전장 RNA 전사체가 제조되었음은 명백하였다. HPV52 L1 유전자를 효모가 선호하는 코돈 서열을 사용하여 재구성시키고, 가공하여, 왕성하게 전사하도록 어떠한 가능한 미성숙 전사 종결 부위도 제거하였다. HPV 52 Ll R 전사체의 노던 블롯 분석은, 전장 전사체가 생성되며 노던 블롯 분석에 의해 검출가능함을 나타내었다(도 3).

실시예 5

HPV 52 Ll 단백질 발현

OD₆₀₀= 10과 동등한 갈락토즈-유도된 배양물의 동결된 효모 세포 펠릿을 빙상에서 해동시키고 2mM PMSF가 들어있는 300 μl의 PC 완충액(100 mM Na₂HPO₄ 및 0.5 M NaCl, pH 7.0)속에 현탁시켰다. 산으로 세척한 0.5mm 유리 비드를 약 0.5g/튜브의 농도로 가하였다. 당해 튜브를 4℃에서 5분 및 1분 휴식의 3회 주기 동안 와동시켰다. 7.5μl의 20% 트리톤XlOO을 가하고 와동 단계를 40℃에서 5분 동안 반복 하였다. 당해 튜브를 빙상에 15분 동안 둔 후, 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 멸균 미세원심분리 튜브에 이전시키고, 이를 총 효모 단백질 추출물로서 표지하고, 날짜를 기입하여, -70℃에서 저장하였다.

실시예 6

웨스턴 블롯 분석

각각의 HPV 52 L1 작제물에 대한 20개의 분리된 효모 콜로니로부터의 총 효모 단백질 추출물을 웨스턴 블롯으로 분석하여 갈락토즈 유도후 HPV 52 Ll 단백질의 발현을 확인하였다.

10, 5, 및 2 및 1/2 마이크로그램의 총 효모 단백질 추출물을 SDS-PAGE 충전 완충액과 합하고 95℃로 10분 동안 가열하였다. 대략 55kDa인 HPV 16 Ll 단백질을 네가티브 대조군(데이타는 나타내지 않음)으로서의 HPV Ll-부재 전체 효모 단백질 추출물과 함께, 양성 대조군으로서 포함시켰다. 단백질을 10% SDS-PAGE 겔상에 충전하고 트리스-글리신 완충액속에서 전기영동하였다. 단백질 분리 후, 단백질을 겔로부터 니트로셀룰로즈로 웨스턴-이전시키고 수득되는 블롯을 1x 희석 완충액[키르커가르트 앤드 페리 래보러토리즈(Kirkegaard and Perry Laboratories) 제조원, 메릴랜드주 게이더스부르그 소재] 속에서 1시간 동안 실온으로 흔들면서 차단시켰다. 블롯을 3회 세척하고 HPV 16 및 HPV 52 L1 단백질과 교차-반응하는 효모 흡착된 염소 항-trpE-HPV 31 Ll 혈청을 실온에서 16시간 동안 적용시켰다. 이후에, 블롯을 3회 세척하고 1:2500 희석의 항-염소-HRP 접합된 항체와 함께 1시간 동안 항 온배양하였다. 블롯을 다시 3회 세척하고 NBT/BCIP 검출 기질(키르커가르트 앤드 페리 래보러토리즈 제조원)을 적용시켰다. 면역반응성 단백질을 보라색 밴드로서 블롯상에서 검출하였다.

모든 경우에, HPV 52 Ll 단백질은 대략 55kDa에 상응하는 니트로셀룰로즈상에서 명확한 면역반응성 밴드로서 검출되었다(참조: 도 4). HPV 52 Ll R 밴드(2.5 μg 레인)의 강도는 HPV 52 Ll wt 밴드(1O μg)보다 현저히 높은 것으로 여겨진다. 재구성시, 코돈-최적화된 HPV 52 Ll R의 발현 수준은 4배 더 증가하며, 이는 웨스턴 블롯상에서 직접적인 비교를 제한한다.

실시예 7

투과 전자 현미경

52L1 단백질이 펜타머-L1 캡소머를 형성하기 위해 실제로 자가-조립하여, 궁극적으로 바이러스-유사 입자로 자가-조립하는지를 입증하기 위하여, 부분 정제된 HPV 52 Ll R 단백질 추출물을 투과 전자 현미경(TEM)에 적용시켰다.

효모를 소규모의 발효하에 성장시키고 펠릿화하였다. 수득되는 펠릿을 정제 처리에 적용시켰다. 펠릿 및 정화된 효모 추출물을 면역블롯으로 분석하여 HPV 52 Ll 단백질 발현 및 정제 과정 전체에서의 보유를 입증하였다. 이후에, 정화된 효모 추출물을 원심분리에 45%-슈크로즈 큐션위에 적용시키고 수득되는 펠릿을 TEM에 의한 HPV 52 Ll VLP의 분석을 위해 완충액속에 현탁시켰다.

생산된 HPV 52 Ll R VLP의 대표적인 샘플을 도 5에 나타낸다. 당해 조 샘플 중 구형 입자의 직경은 40 내지 70nm의 범위이었으며 일부 입자는 규칙적인 캡소머 배열을 나타내었다.

<110> Merck & Co., Inc. <120> Optimized expression of HPV 52 L1 in yeast <130> 21571 PCT <150> US 60/555926 <151> 2004-03-24 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1512 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV52L1R <400> 1 atgtccgtct ggagaccatc cgaagctact gtctacttgc caccagttcc agtctctaag 60 gttgtctcta ccgacgaata cgtctccaga acctccatct actactacgc tggttcctct 120 agattgttga ctgtcggtca cccatacttc tctatcaaga acacctcctc cggtaacggt 180 aagaaggtct tggttccaaa ggtctctggt ttgcaataca gagtcttcag aatcaagttg 240 ccagacccaa acaagttcgg tttcccagac actagtttct acaacccaga aactcaaaga 300 ttggtctggg cttgtactgg tttggaaatc ggtagaggtc aaccattggg tgtcggtatc 360 tctggtcacc cattgttgaa caagttcgac gacactgaaa cctctaacaa gtacgctggt 420 aagccaggta tcgataacag agaatgtttg tctatggact acaagcaaac tcaattgtgt 480 atcttgggtt gtaagccacc aatcggtgaa cactggggta agggtactcc atgtaacaac 540 aactctggta acccaggtga ctgtccacca ttgcaattga tcaactccgt catccaagac 600 ggtgacatgg tcgacactgg tttcggttgt atggacttca acaccttgca 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1500 gtcaagagat aa 1512 <210> 2 <211> 503 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 52 <400> 2 Met Ser Val Trp Arg Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 1 5 10 15 Pro Gly Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ser Arg Thr Ser 20 25 30 Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly His Pro 35 40 45 Tyr Phe Ser Ile Lys Asn Thr Ser Ser Gly Asn Gly Lys Lys Val Leu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile Lys Leu 65 70 75 80 Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro 85 90 95 Glu Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Thr Gly Leu Glu Ile Gly Arg 100 105 110 Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys 115 120 125 Phe Asp Asp Thr Glu Thr Ser Asn Lys Tyr Ala Gly Lys Pro Gly Ile 130 135 140 Asp Asn Arg Glu Cys Leu Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys 145 150 155 160 Ile Leu Gly Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Thr 165 170 175 Pro Cys Asn Asn Asn Ser Gly Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Gln 180 185 190 Leu Ile Asn Ser Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe 195 200 205 Gly Cys Met Asp Phe Asn Thr Leu Gln Ala Ser Lys Ser Asp Val Pro 210 215 220 Ile Asp Ile Cys Ser Ser Val Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met 225 230 235 240 Ala Ser Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu 245 250 255 Gln Met Phe Val Arg His Phe Phe Asn Arg Ala Gly Thr Leu Gly Asp 260 265 270 Pro Val Pro Gly Asp Leu Tyr Ile Gln Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr 275 280 285 Ala Thr Val Gln Ser Ser Ala Phe Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met 290 295 300 Val Thr Ser Glu Ser Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg 305 310 315 320 Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val 325 330 335 Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu Cys Ala Glu 340 345 350 Val Lys Lys Glu Ser Thr Tyr Lys Asn Glu Asn Phe Lys Glu Tyr Leu 355 360 365 Arg His Gly Glu Glu Phe Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys 370 375 380 Ile Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Lys Met Asp Ala 385 390 395 400 Thr Ile Leu Glu Asp Trp Gln Phe Gly Leu Thr Pro Pro Pro Ser Ala 405 410 415 Ser Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Thr Ala Ile Thr Cys 420 425 430 Gln Lys Asn Thr Pro Pro Lys Gly Lys Glu Asp Pro Leu Lys Asp Tyr 435 440 445 Met Phe Trp Glu Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp 450 455 460 Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Gln Ala 465 470 475 480 Arg Pro Lys Leu Lys Arg Pro Ala Ser Ser Ala Pro Arg Thr Ser Thr 485 490 495 Lys Lys Lys Lys Val Lys Arg 500 <210> 3 <211> 1512 <212> DNA <213> Human Papillomavirus Type 52 <400> 3 atgtccgtgt ggcggcctag tgaggccact gtgtacctgc ctcctgtacc tgtctctaag 60 gttgtaagca ctgatgagta tgtgtctcgc acaagcatct attattatgc aggcagttct 120 cgattactaa cagtaggaca tccctatttt tctattaaaa acaccagtag tggtaatggt 180 aaaaaagttt tagttcccaa ggtgtctggc ctgcaataca gggtatttag aattaaattg 240 ccggacccta ataaatttgg ttttccagat acatcttttt ataacccaga aacccaaagg 300 ttggtgtggg cctgtacagg cttggaaatt ggtaggggac agcctttagg tgtgggtatt 360 agtgggcatc ctttattaaa 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Claims

효모 세포에서 고수준의 발현을 위해 코돈-최적화된, 서열번호 2에 제시된 HPV52 L1 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
제1항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제2항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제3항에 있어서, 효모 세포인 숙주 세포.
제4항에 있어서, 효모 세포가 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베로마이세스 프라길리스(Kluyveromyces fragilis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 숙주 세포.
제4항에 있어서, 숙주 세포가 사카로마이세스 세레비지아에인 숙주 세포.
제1항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 1에 제시된 뉴클레오타이 드 서열을 포함하는 핵산 분자.
효모에서 생산된 HPV 52의 재조합 L1 단백질 또는 재조합 L1 + L2 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자(VLP).
제8항에 있어서, 재조합 L1 단백질 또는 재조합 L1 + L2 단백질이 코돈-최적화된 HPV 52 L1 핵산 분자에 의해 암호화된 VLP.
제9항에 있어서, 코돈-최적화된 핵산 분자가 서열번호 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 VLP.
(a) HPV 52 L1 단백질 또는 HPV 52 L1 + L2 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 DNA 분자로 효모를 형질전환시키는 단계;

(b) 코돈-최적화된 DNA 분자의 발현을 허용하는 조건하에 형질전환된 효모를 배양하여 재조합체 파필로마바이러스 단백질을 생산하는 단계; 및

(c) 재조합체 파필로마바이러스 단백질을 분리하여 제9항에 따른 VLP를 생산하는 단계

를 포함하는, 제9항에 따른 VLP의 생산 방법.
제9항에 따른 VLP를 포함하는 백신.
제9항에 따른 VLP를 포함하는 약제학적 조성물.
제12항에 따른 백신을 포유동물에게 투여함을 포함하여, HPV 감염을 예방하는 방법.
제11항에 따른 VLP를 동물에게 투여함을 포함하여, 동물에서 면역 반응을 유도하는 방법.
제9항에 있어서, 효모가 사카로마이세스 세레비지아에, 한세눌라 폴리모르파, 피키아 파스토리스, 클루이베로마이세스 프라길리스, 클루이베로마이세스 락티스 및 쉬조사카로마이세스 폼베로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 바이러스-유사 입자.
제16항에 있어서, 효모가 사카로마이세스 세레비지아에인 바이러스-유사 입자.
제12항에 있어서, 하나 이상의 추가의 HPV 유형의 VLP를 추가로 포함하는 백신.
제18항에 있어서, 하나 이상의 추가의 HPV 유형이 HPV6, HPVl1, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, 및 HPV68로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 백신.
제19항에 있어서, 하나 이상의 HPV 유형이 HPV16을 포함하는 백신.
제20항에 있어서, HPV18 VLP를 추가로 포함하는 백신.
제21항에 있어서, HPV6 VLP 및 HPV11 VLP를 추가로 포함하는 백신.
제22항에 있어서, HPV31 VLP를 추가로 포함하는 백신.
제21항에 있어서, HPV31 VLP를 추가로 포함하는 백신.
제23항에 있어서, HPV45 VLP를 추가로 포함하는 백신.
제24항에 있어서, HPV45 VLP를 추가로 포함하는 백신.
제26항에 있어서, HPV58 VLP를 추가로 포함하는 백신.
제25항에 있어서, HPV58 VLP를 추가로 포함하는 백신.