ES2262333T3

ES2262333T3 - Procedimiento para purificar particulas similares a virus de papilomavirus humano.

Info

Publication number: ES2262333T3
Application number: ES99940950T
Authority: ES
Inventors: James C. Cook, Iii
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1998-08-14
Filing date: 1999-08-10
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2019-08-10
Also published as: DE69931053T2; WO2000009671A1; NZ509610A; JP4440471B2; DE69931053D1; EP1105466A1; EP1105466B1; AU5469899A; SK2232001A3; US6602697B1; BR9913026A; HUP0103091A2; PT1105466E; CN1354787A; DK1105466T3; SI1105466T1; IL141130A0; JP2003520188A; CA2339034A1; AU760633B2

Abstract

Un procedimiento para purificar partículas similares a virus (VLP) de papilomavirus recombinante que comprende: (a) poner en contacto un lisado de células que contiene VLP parcialmente purificadas con un medio de hidroxiapatito en una columna de cromatografía en NaCl 1, 25 M bajo condiciones tales que las VLP se unen al medio de hidroxiapatito; (b) eluir las VLP unidas con una solución que comprende aniones fosfato; y (c) recuperar las VLP eluidas.

Description

Procedimiento para purificar partículas similares a virus de papilomavirus humano.

Campo de la invención

La invención se refiere a un procedimiento para fabricar y purificar partículas similares a virus (VLP) de papilomavirus (HPV), que se pueden usar como componente de vacuna.

Antecedentes de la invención

Las infecciones por papilomavirus suceden en una diversidad de animales, que incluyen seres humanos, ovejas, perros, gatos, conejos, monos, serpientes y vacas. Los papilomavirus infectan a células epiteliales, generalmente induciendo tumores epiteliales o fibroepiteliales benignos en el sitio de la infección. Los papilomavirus son agentes infecciosos específicos de especies; un papilomavirus humano no puede infectar a un animal no humano.

Los papilomavirus se pueden clasificar en distintos grupos basados en el hospedador al que infectan. Los papilomavirus humanos (HPV) se clasifican adicionalmente en más de 70 tipos basados en la homología de la secuencia de ADN (para una revisión, véase Papillomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (ed.), CRC Press, Inc., 1990). Los tipos de papilomavirus parecen ser inmunogenes de tipo específico en los que una inmunidad que neutraliza la infección de un tipo de papilomavirus no confiere inmunidad contra otro tipo de papilomavirus.

Los papilomavirus son virus de ADN pequeños (50-60 nm), sin encapsular, icosaédricos, que codifican hasta ocho genes tempranos y dos tardíos. Los marcos de lectura abierta (ORF) de los genomas de los virus se designan E1 a E7 y L1 y L2, donde "E" denota tempranos y "L" denota tardíos. L1 y L2 codifican para proteínas de cápsides de virus. Los genes tempranos (E) se asocian con funciones tales como la replicación viral y la transformación celular.

La proteína L1 es la proteína de cápside principal y tiene un peso molecular de 55-60 kDa. La proteína L2 es una proteína de cápside menor que tiene un peso molecular pronosticado de 55-60 kDa y un peso molecular aparente de 75-100 kDa según se determina por electroforesis de gel de poliacrilamida. Los datos inmunológicos sugieren que la mayor parte de la proteína L2 es interna a la proteína L1. Las proteínas L2 están altamente conservadas entre diferentes papilomavirus, especialmente los 10 aminoácidos básicos en el Terminal-C. El ORF de L1 está altamente conservado entre diferentes papilomavirus.

La proteína L1 recombinante se ha fabricado en una diversidad de hospedadores, y bajo condiciones apropiadas se auto-ensambla en partículas similares a virus (VLP), tanto sola como en combinación con L2. Las VLP son candidatas para una vacuna comercial. Sin embargo, para que sean útiles en una vacuna humana, las VLP tienen que estar altamente purificadas y exentas de contaminantes de células hospedadoras. En el pasado, se ha usado la ultrafiltración por flujo cruzado en un modo de diafiltración para eliminar biomoléculas contaminantes. Sin embargo, este procedimiento daba como resultado la degradación proteolítica de HPV L1. Sería deseable tener un procedimiento de purificación de proteína L1 que dé como resultado un producto altamente puro, no degradado.

El documento WO-A-95.31532 describe la preparación y purificación de VLP que contienen proteínas L1 y L2 pero no menciona el uso de hidroxiapatito.

Resumen de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento de purificar partículas similares a virus (VLP) de virus de papilomavirus (HPV) recombinante que comprende las etapas de: poner en contacto un lisado celular que contiene VLP parcialmente purificadas con un medio de hidroxiapatito en una columna de cromatografía en NaCl 1,25 M bajo condiciones tales que las VLP se unen al medio de hidroxiapatito; y eluir las VLP unidas con una solución que comprende aniones fosfato; y recuperar las VLP eluidas.

El procedimiento de purificación se puede usar con VLP que consisten sustancialmente en proteína L1, y también se puede usar con VLP que comprenden proteínas L1 y L2. Además, se puede usar con VLP que son quiméricas, es decir, contienen proteína L1 y una proteína L2:fusión. En general para uso en vacunas, se prefieren VLP que contengan solamente proteínas L1.

El procedimiento es aplicable a VLP de virtualmente cualquier cepa de papilomavirus. Se prefiere que se use un papilomavirus humano (HPV). Las cepas preferidas de HPV son aquellas que se sabe que producen las enfermedades y dolencias más graves, que incluyen: HPV tipo 6a, HPV tipo 6b, HPV tipo 11, HPV tipo 16, HPV tipo 18, HPV tipo 31, HPV tipo 33, y HPV tipo 45.

En general una célula hospedadora es transformada con un vector que codifica proteínas L1 o L1 y L2, o L1 y proteína L2:fusión.

Según se usa a lo largo de la memoria descriptiva y reivindicaciones, la expresión "proteína L2:fusión" significa que el ADN que codifica la proteína L2 ha sido unido operativamente a otro ADN que codifica otra proteína de HPV tal como E1, E2, E3, E4, E5, E6 o E7. La parte L2 de la proteína de fusión puede ser de longitud completa, o puede tener deleciones y/o truncaciones. Se pueden encontrar ejemplos en la solicitud provisional de patente de EE.UU. pendiente de tramitación S.N. 60/096.638 (Expediente Número 20276PV), presentada con este documento.

La célula hospedadora puede ser cualquier célula hospedadora que se cultive fácilmente, como se sabe en la técnica, que incluye levadura (Saccharomyces cerevisiae), células de insectos, células bacterianas o de mamíferos. Se prefieren particularmente las células de levaduras.

El vector también puede contener otros elementos como se sabe en la técnica, tales como elementos que controlan transcripción y translación y/o genes marcadores. Las proteínas expresadas L1, L1 y L2, o L1 y L2:fusión se ensamblarán espontáneamente en VLP. Las células hospedadoras son típicamente sometidas a lisado y el lisado celular se purifica luego parcialmente.

La etapa de purificación parcial puede incluir etapas de purificación que se usan comúnmente, y no se ve como una etapa crítica en esta invención. Por ejemplo, el lisado celular se puede someter a un procedimiento de microfiltración, y al menos a una etapa de cromatografía, tal como una cromatografía de intercambio catiónico.

Se ha encontrado, de conformidad con esta invención que una etapa de cromatografía, que usa hidroxiapatito como el medio de columna, seguida por elución con una solución tampón que contiene anión fosfato, elimina una gran cantidad de contaminantes de un lisado celular parcialmente purificado. Específicamente, se ha encontrado que se eliminan del lisado la mayor parte de las biomoléculas contaminantes, que incluye ADN, lípidos y proteínas.

De conformidad con esta invención, la preparación final purificada de VLP es generalmente al menos 75% pura, preferiblemente al menos 80% pura, y más preferiblemente al menos 90% pura, según se mide usando el análisis SDS/PAGE.

Virtualmente se puede usar en esta invención cualquier material de columna de hidroxiapatito comercialmente disponible. Es preferible usar un hidroxiapatito cerámico con un tamaño de partícula de aproximadamente 20-50 \mum y aproximadamente un tamaño de poro de 800 Å. Un hidroxiapatito de este tipo comercialmente disponible se vende por BioRad como "Ceramic hydroxyapatite, Type II". Sin embargo, otros también son eficaces.

En la preparación de la etapa de cromatografía del procedimiento de purificación, se recomienda que la alimentación de la columna sea en un tampón con un pH de 6-8, y preferiblemente aproximadamente 7. Un tampón preferido es MOPS [ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico] 50 mM a un pH de 7,0 y que contiene también NaCl 1,25 M.

Otros sistemas tampón que también se pueden usar son evidentes para un experto corriente en la técnica e incluyen: tampones de MES [ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico]; BIS-TRIS [bis-(2-hidroxietil)-amino]tris-(hidroximetil)-metano]; ADA [ácido N-2-acetamidoiminodiacético, sal monosódica]; ACES [ácido N-2-acetamido-2-aminoetanosulfónico]; PIPES [ácido piperacina-N,N'-bis(2-etanosulfónico]; MOPSO [ácido (3-N-morfolino)-2-hidroxipropanosulfónico]; BIS-TRIS PROPANO [1,3-bis [tris(hidroximetil)metil-amino] propano]; BES [ácido N,N-bis-(2-hidroxietil)-2-amino-etanosulfónico]; TES [ácido N-tris (hidroximetil)metil)-2-amino-etanosulfónico y ácido 2-2([2-hidroxi-1,1-bis(hidroximetil)etil)amino]etanosulfónico]; HEPES [ácido N-2-hidroxietilpiperacina-N'-2-etanosulfónico]; DIPSO [ácido 3-(N,N-bis(2-hidroxietil)amino)-2-hidroxi-propanosulfónico]; TAPSO [ácido 3-(N-tris(hidroximetil)metilamino]-2-hidroxi-propanosulfónico]; TRIS [tris-(hidroximetil)-aminometano]; HEPPSO [ácido N-(2-hidroxietil)-piperacina-N'[2-hidroxi-propanosulfónico]; POPSO [ácido piperacina-N,N'-bis[2-hidroxipropanosulfónico]; EPPS [ácido N-[2-hidroxietil]-piperacina-N'-[3-propanosulfónico y HEPPS]; TEA [trietanolamina]; TRICINE [N[tris-(hidroxime-
til)metil]glicina]; BICINE [N,N-bis-(2-hidroxietil)-glicina]; TAPS [ácido 3-{[tris-(hidroximetil)metil]amino}-pro-
panosulfónico]; imidazol; HEPPS [ácido N-2-hidroxietilpiperacin-N'-3-propanosulfónico]; amida de glicina, hidrocloruro; glicilglicina; citrato; acetato; y succinato.

Se deja que se pongan en contacto las VLP parcialmente purificadas en la solución tamponada con el medio de hidroxiapatito bajo las condiciones que permiten que las VLP se unan al hidroxiapatito. Estas condiciones incluyen un amplio intervalo de temperatura; se prefiere temperatura ambiente. La velocidad de flujo también puede variar mucho, y un intervalo preferido es aproximadamente 90 cm/hora.

Después de que las VLP se han unido al hidroxiapatito, la siguiente etapa es la recuperación de las VLP purificadas del hidroxiapatito con un tampón de elución. Una solución tampón de elución preferida contiene un anión fosfato, tal como una solución de fosfato de sodio o potasio. Los intervalos molares preferidos son de aproximadamente 0,05 M a aproximadamente 1 M, siendo preferido aproximadamente 0,2 M. El pH del tampón de elución debería oscilar de aproximadamente pH 6-8, siendo preferido un pH de aproximadamente 7.

Otras ventajas del procedimiento de esta invención incluyen:

(a) no se requiere equipo ni técnicas especiales de cromatografía; (b) el procedimiento es rápido, no requiere cambios de tampón; y (c) el procedimiento proporciona un excelente rendimiento de HPV L1.

Los siguientes Ejemplos no limitativos se presentan para ilustrar mejor la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de lisado parcialmente purificado

Se recolectaron células de levadura transformadas para expresar VLP y se congelaron para almacenamiento a -70ºC. La suspensión celular de levadura congelada se sacó del almacenamiento y se descongeló durante aproximadamente 3 horas a temperatura ambiente seguidas de aproximadamente 18 horas a 4ºC. Se añadió BENZONASE® (Nycomed Pharma A/S, Copenhague, Dinamarca)(2,8 x 10^{5} unidades/ml y 0,21 mg proteína/ml) a la suspensión celular hasta una concentración final de 750 unidades por gramo de peso de células húmedas, y en un experimento se redujo a 335 unidades por gramo de peso de células húmedas. Se agitaron las células durante 15 minutos, se sometieron luego a rotura celular por dos pasadas a través de un homogeneizador APV Gaulin 30CD higienizado a presiones de cámara de 99,97 MPa a 110,32 MPa, dando como resultado un 95% de rotura celular. El lisado restante se agitó suavemente durante 18 horas a 4ºC.

Clarificación por microfiltración. El lisado celular de clarificó por microfiltración de flujo cruzado en un modo de diafiltración como sigue. El lisado se transfirió a un depósito de procedimiento estéril con orificios de entrada y salida de 2,54 cm de diámetro. El microfiltro era un cartucho filtrante de fibra hueca de 0,65 micrómetros de tamaño de poro y de área superficial de 5 pies cuadrados (A/G Technologies #CFP-6-D-8A, Needham, MA) alojado en un sistema de A/G Tecnologies FlexStand® Benchtop Pilot Hollow Fiber. El concentrado se diafiltró con 3 volúmenes de Tampón de Diafiltración (a continuación) para producir el lisado clarificado. El Tampón de Diafiltración era (Na^{+}) MOPS 0,2 M, pH 7,0 + NaCl 0,4 M.

Cromatografía del lisado clarificado. El lisado clarificado se fraccionó por cromatografía de columna usando resina de cromatografía de intercambio catiónico fuerte POROS® 50HS (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) empaquetado en una columna de cromatografía. La columna se higienizó con NaOH 0,5 N previamente a su uso. La columna se equilibró con Tampón de Diafiltración de HPV [(Na^{+}) MOPS 0,2 M, pH 7,0 + NaCl 0,4 M] a temperatura ambiente. El lisado clarificado frío (4ºC) se bombeó a la columna a 125 ml/minuto y la columna se lavó con 8 volúmenes de columna de Tampón de Columna A de HPV [(Na^{+}) MOPS 0,05 M, pH 7,0 + NaCl 0,5 M] a temperatura ambiente a 125 ml/minuto con un gradiente lineal de 100% de Tampón de Columna A de HPV a 100% de Tampón de Columna B de HPV [(Na^{+}) MOPS 0,05 M, pH 7,0 + NaCl 1,5 M]. El gradiente lineal total era de 10 volúmenes de columna y se recogió en 10 fracciones de igual volumen. Después del gradiente, la columna se lavó con dos volúmenes de columna de Tampón de Columna B de HPV a temperatura ambiente a 125 ml/minuto que se recogieron en dos fracciones adicionales. Las fracciones de recogieron en botellas estériles de plástico de 2 litros y se almacenaron a 4ºC. Las fracciones que contenían el último pico absorbente de UV (A280 nm y A230 nm) en el gradiente, se acumularon conjuntamente, se filtraron usando una unidad filtrante desechable MILLIPAK-200 (Millipore, Bedford, MA) y se almacenaron a 4ºC.

Ejemplo 2 Cromatografía de hidroxiapatito

Todas las etapas se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se equilibró previamente una columna de cromatografía (13 mm DI x 36 mm) que empaqueta hidroxiapatito cerámico, tipo II (BioRad Cat. #7320081, Hercules, CA) en MOPS 50 mM, pH 7,0 + NaCl 1,25 M. La solución de HPV parcialmente purificada del Ejemplo 1 se aplicó a la columna a una velocidad lineal de flujo de 90 cm/hora. Después de que se completó la aplicación de la muestra, se lavó la columna con ocho volúmenes de columna de tampón de equilibrado previo hasta que la densidad óptica del efluente de la columna era cercana a cero. El producto de vacuna de HPV se eluyó con un gradiente lineal de 0% a 100% de tampón de elución (fosfato sódico 0,2 M, pH 7,0 + NaCl 1,25 M), también a una velocidad lineal de flujo de 90 cm/hora. El volumen total del gradiente fue de cuatro volúmenes de columna. Se identificaron las fracciones que contenían el producto de vacuna por análisis de proteínas RIA y Bradford. La concentración de proteína del producto fue 100 \mug/ml.

Análisis: Se llevaron a cabo análisis de proteína de Bradford usando Reactivo de Análisis Coomassie Plus (Pierce, Rockford, IL) usando albúmina de suero bovino (BSA) como estándar. Se llevaron a cabo análisis de proteína de Lowry según el procedimiento de Lowry y col., 1951 J. Biol. Chem. 193:265-270 usando BSA como estándar de calibración. Se analizó antígeno por un ELISA de capa múltiple usando un anticuerpo monoclonal que reconocía un epitopo conformacional de VLP. Se revistieron placas microtituladoras con anticuerpos policlonales VLP anti-HPV de cabra. Se diluyeron muestras estándar y de prueba con PBS que contenía 1% peso/volumen de BSA, 0,1% de TWEEN-20, y 0,1% de azida de sodio y se añadieron a los pocillos donde se había capturado antígeno por los anticuerpos unidos a la placa. Se añadió anticuerpo VLP monoclonal anti-HPV L1 (Chemicon, Temecula, CA) a los pocillos para unir el antígeno capturado por los anticuerpos unidos a la placa. Los anticuerpos VLP monoclonales anti-HPV se detectaron por medio de anticuerpos IgG anti-ratón conjugados con peroxidasa de rábano picante. Se añadió un substrato cromógeno para peroxidasa de rábano picante, 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Pierce) y la absorbancia a 450 nm fue proporcional a la concentración de VLP de L1 en la muestra.

\newpage

La capacidad dinámica de la columna para el producto de vacuna fue 2,9 mg por ml de resina por Bradford, y 4,6 mg por ml de resina por RIA. La recuperación a lo largo de esta etapa fue 90% por análisis de proteína de Bradford u 82% por RIA cuando la columna se cargó al 100% de capacidad. La recuperación cayó al 63% por Bradford y al 50% por RIA cuando la columna se cargó al 8% de capacidad.

Ejemplo 3 Eliminación de otras biomoléculas

Se analizó una muestra de HPV 11 L1 preparada esencialmente como se describe en los Ejemplos 1 y 2 con respecto a la presencia de ADN usando un análisis basado en PCR. Los resultados, que se presentan en la tabla a continuación, indican que este procedimiento cromatográfico es altamente eficaz para eliminar ADN contaminante del producto final.

Muestra	proteína (\mug/ml)	ADN (pg/ml)	Relación de pg ADN/\mug proteína
Carga de Columna	107	3270	30,6
Flujo de paso (fracción #6)	<10	196	>19,6
Eluato (fracción #20)	230	<2,6	0,011

Ejemplo 4 Purificación de una VLP quimérica Purificación de VLP quiméricas de HPV Tipo 16 L1/L2_{mini}/E2 Construcción del Gen modificado L2 Vector YP3 (L2 mínimo)

Este vector retiene las secuencias codificantes para los aminoácidos amino-terminales 69 y los aminoácidos carboxi-terminales 84 (aa) de HPV 16 L2 que se fusionan en el marco por un policonector sintético que introduce sitios únicos de restricción de enzimas Not I, Sac I, y Xho I y da como resultado la inserción de un resto ácido glutámico y la mutación de un resto serina a ácido glutámico.

Se diseñaron iniciadores de PCR (Reactivos Certificados Midland) para amplificar las secuencias L2 del gen L2 nativo contenido dentro del vector, pGal110 HPV 16 L1 + L2.

Los iniciadores I (5'-CTT CCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGC-3'; ID SEC Nº 1) y C (5'-CTC GAG CTC GCG GCC GCC TGT ACC CGA CCC-3'; ID SEC Nº 2) amplificaron una secuencia de 265 bp que codifica el amino-terminal 69 aa y 23 bp de la secuencia sin trasladar aguas arriba que incluye un sitio de restricción de enzima Sma I. El iniciador C modificó y extendió la región que codifica el amino-terminal de L2 y anexó los sitios de restricción de enzimas Not I, Sac I, y Xho I aguas abajo de las secuencias que codifican L2.

Los iniciadores A (5'-GCG GCC GCG AGC TCG AGG GTT ATA TTC CTG CAA ATA CAA-3'; ID SEC Nº 3), C Y D (5'-CCC TCC AGA TCT CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATC TG-3'; ID SEC Nº 4) amplificaron una secuencia de 285 bp que codifica el carboxi-terminal 84 aa de L2 más 6 bp que añadió un sitio de restricción de enzima Bgl II. El iniciador A también anexó una secuencia de 17 bp que contenía sitios Not I, Sac I, y Xho I aguas arriba de la secuencia que codifica L2.

El constructo de la expresión de L2 mínima se ensambló a través de secuencias complementarias añadidas por los iniciadores A y C. Los productos de ADN aislados de las reacciones de amplificación I/C y A/D anteriores fueron usados ambos en una reacción PCR que incluyó óligos I y D como iniciadores de amplificación. Para facilitar la unión de los fragmentos a través de su secuencia complementaria de 17 bp, se llevaron a cabo tres ciclos PCR con la temperatura de recocido a 37ºC, seguidos de 15 ciclos a 57ºC. El producto de amplificación resultante se ligó en extremo romo en pcrScript (Stratagene, La Jolla) y se transformó en células XL-1 Azul MRF' (Stratagene, La Jolla). Se identificaron clones positivos por PCR usando iniciadores I y D, y se confirmaron por análisis de digestión con restricción. La construcción se verificó luego por análisis de secuencia automatizado (Perkin Elmer, Inc., Foster City, CA).

Se sometió luego a digestión ADN plásmido de un aislado apropiado con Sma I y Bgl II; un fragmento de aproximadamente 0,5 kilobase (kb) de pares se purificó en gel y se ligó con 14 kb del fragmento de vector Sma I y Bgl II pGAL110 HPV 16 L1. Se transformaron células competentes DH5 de E. coli (Gibco BRL, Rockville, MD) con la mezcla de ligación y se seleccionaron transformantes sobre placas de ampicilina LB (Remel, Lenexa, KS). Se tamizaron inicialmente clones por PCR en la que se usaron iniciadores D e I para amplificar porciones de L2; se confirmaron luego los clones apropiados por análisis de digestión con restricción. Se verificó el clon candidato YP3#1 por análisis de secuencia como anteriormente.

Se empleó luego YP3#1 como el constructo de columna vertebral en el que se insertaron las estructuras de lectura abierta de los genes que codifican HPV 16 E1, E2 o E7.

Inserción de Genes que codifican proteína de HPV E

El gen que codifica HPV16 E2 se obtuvo por amplificación PCR de muestra clínica positiva de HPV16 que fue luego insertada directamente en el vector subclonante pCRII (Stratagene, La Jolla, CA) y se verificó la secuencia como anteriormente. La secuencia del gen E2 se modificó luego de la siguiente manera:

1) En la estructura se añadieron secuencias de ADN que contenían Xho I, Nae I, Not I a la parte amino-terminal de E2. Adicionalmente se añadieron secuencias que contenían Not I, Nae I y Xho I a la parte carboxilo-terminal de E2 para facilitar la inserción dentro de E2 en los sitios Not I, Xho I.

2) Las secuencias de ADN se alteraron por mutagénesis PCR para codificar restos alanina, codificar en los restos ácido glutámico 39 e isoleucina 73. Esto se diseñó para inactivar la función proteína E2.

El gen modificado HPV16 E2 anteriormente descrito se sometió a digestión con Not I, Xho I y se ligó con el vector YP3#1 sometido a digestión de modo similar. Los transformantes que contenían las secuencias E2 propiamente insertadas se seleccionaron por PCR y se verificó la secuencia.

Se empleó la misma estrategia para los genes que codifican HPV16 E1 y HPV16 E7. Para E1, se alteró glicina 482 a ácido aspártico; para E7, cisteína 24 y ácido glutámico 26 fueron ambos cambiados a glicina para inactivar la función de la proteína. Los constructos resultantes se emplearon luego para transformar levadura para análisis de expresión.

Ejemplo 5 Identificación y crecimiento de levadura que expresa VLP quimérico

Se usaron ADN plásmido de YP3#1 y derivados descritos anteriormente para transformar Saccharomyces cerevisiae (MAT\alpha, leu2-04, prb1::HIS3, mnn9::URA3, cirº) por el procedimiento de esferoplasto (Hinnen y col. 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933). Los esferoplastos transformados fueron colocados en placas sobre medio selectivo (leucina minus) (Remel, Lenexa, KS). Se aislaron clones a través de dos rondas de selección de colonia única. Se hicieron crecer pequeños cultivos líquidos de los clones candidatos hasta alta densidad celular en medio que contiene galactosa. Se prepararon extractos brutos por agitación vigorosa con bolas de vidrio seguida de centrifugación. Los extractos clarificados se analizaron respecto a expresión de L1, el componente L2, y VLP por diversos procedimientos que incluyeron SDS PAGE, ELISA, inmunodetección, y EIA, usando anticuerpos monoclonales o antisueros policlonales específicos que reconocen L1, o L2, o los términos amino o carboxi de L2, o L1 VLP, o E1, o E2, o E7, o cualquier otra proteína o péptido fusionado al L2 modificado. Los clones que expresaron el componente L2 y formaron VLP fueron seleccionados para caracterización adicional. Cultivos de un litro o de 16 litros de los clones seleccionados se hicieron crecer en medio que contiene galactosa para preparación a gran escala de VLP quimérico.

Los sedimentos de células se almacenaron congelados a -70ºC. Se descongelaron las células congeladas (peso húmedo = 148 g) y se resuspendieron en 740 ml de "Tampón de Rotura" (MOPS 200 mM, pH 7, CaCl_{2} 1 mM) para dar una suspensión de aproximadamente 20% (peso/volumen). Se añadió la nucleasa BENZONASE® (Nycomed Pharma) a 750 unidades/g de peso de células secas. La suspensión de células se rompió a una presión de aproximadamente 131 MPa por 5 pasadas en un microfluidizador M110-Y (Microfluidics Corp., Newton, MA). Se recogió la suspensión de células y se mantuvo sobre hielo durante la rotura. El análisis de hematocrito indicó >80% de rotura.

Se clarificó por microfiltración el lisado de células envejecidas a través de un cartucho de fibra hueca de tamaño de poro de 0.65 micrómetros (A/G Tecnologies) usando un aparato de microfiltración de flujo tangencial que se hizo funcionar en modo de diafiltración. El lisado se diafiltró con tres volúmenes de citrato sódico 0,25 M, MOPS 0,2 M, pH 7,0. El antígeno pasó a través de la membrana y se recogió en el permeado.

La fracción de permeado diafiltrada a 0,65 mm (3,9 l) se cargó en una columna de 325 ml (11,2 cm DI x 3,3 cm) de resina POROS® 50HS (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA) equilibrada en MOPS 200 mM, pH 7, citrato sódico 250 mM. La columna se lavó con 8 volúmenes de MOPS 50 mM, NaCl 0,5 M, fosfato sódico 5 mM, pH 7 y se eluyó con un gradiente lineal de 10 volúmenes de NaCl de 0,5 hasta 1,5 M en el mismo tampón. El flujo de salida y las fracciones de lavado se recogieron a granel mientras que se recogieron fracciones de 1 volumen durante la elución. Se analizaron las fracciones de la columna por inmunotransferencia y SDS-PAGE con detección coloidal Coomassie. Se acumularon conjuntamente las fracciones que contenían predominantemente proteína p55.

Se analizó el acumulado 50HS respecto a la proteína total por análisis BCA (Pierce). Sobre la base de la proteína total (168 g), se rellenó una columna de hidroxiapatito cerámico (HA) Tipo II (Bio-Rad) para dar 1 ml de resina/2 mg de proteína. Esta columna era de 2,6 cm DI x 15,7 cm. La columna se equilibró en MOPS 50 mM, pH 7, NaCl 1,25 M, fosfato sódico 5 mM. El acumulado 50HS (770 ml) se filtró a 0,22 mm y se aplicó a la columna HA a una velocidad de flujo de 113 cm/hr. El flujo de salida se recogió a granel. La columna HA se lavó con 5 volúmenes de tampón de equilibrado y se eluyó con un gradiente lineal de 8 volúmenes de fosfato sódico de 5 hasta 200 mM, pH 7 en NaCl 1,25 M. Las fracciones recogidas durante la elución se analizaron por inmunotransferencia y SDS-PAGE con detección coloidal Coomassie. Las fracciones que mostraban pureza y enriquecimiento de proteína L1 similares se acumularon conjuntamente. Las fracciones acumuladas conjuntamente se filtraron asépticamente a través de una membrana de 0,22 mm y se almacenaron a 4ºC.

Se analizaron las retenciones y el producto del procedimiento respecto a HPV 16 L1 usando un EIA específico y respecto a proteína por análisis BCA. El rendimiento final del producto purificado fue de 27 mg de proteína con una actividad específica de 1,00 mg L1/mg de proteína. El microscopio electrónico confirmó la presencia de partículas intactas de VLP con un diámetro medio de 32 nm. Para el análisis de pureza SDS-PAGE, se concentró una parte alícuota del producto final por precipitación de TCA y se analizó por inmunotransferencia y SDS-PAGE con detección coloidal Coomassie. La cuantificación de L1 se hizo usando una carga de 2,5 mg y los contaminantes de levadura se cuantificaron a una carga de 20,0 mg. Por medio de densitometría se mostró que la proteína L1 era >94% homogénea. La co-purificación de L1 y L2_{mini}/E2 se demostró por análisis específico de inmunodetección de las fracciones del procedimiento.

Claims

1. Un procedimiento para purificar partículas similares a virus (VLP) de papilomavirus recombinante que comprende:

(a) poner en contacto un lisado de células que contiene VLP parcialmente purificadas con un medio de hidroxiapatito en una columna de cromatografía en NaCl 1,25 M bajo condiciones tales que las VLP se unen al medio de hidroxiapatito;

(b) eluir las VLP unidas con una solución que comprende aniones fosfato; y

(c) recuperar las VLP eluidas.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que las VLP consisten esencialmente en proteína L1.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que las VLP son VLP de papilomavirus humano (HPV).

4. Un procedimiento según la reivindicación 3, en el que las VLP se seleccionan entre el grupo constituido por: HPV tipo 6a, HPV tipo 6b, HPV tipo 11, HPV tipo 16, HPV tipo 18, HPV tipo 31, HPV tipo 33, y HPV tipo 45.

5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que las VLP eluidas son al menos 75% puras.

6. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que las VLP eluidas son al menos 90% puras.

7. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que las VLP comprenden proteína L1 y una proteína L2:fusión, en el que la proteína L2 se une operativamente a una proteína E1, E2, E3, E4, E5, E6 o E7 de HPV.

8. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que la proteína L2:fusión tiene una parte de L2 que es menor que la longitud completa.

9. Un procedimiento de fabricación de un producto VLP de papilomavirus humano purificado, adecuado para uso en una vacuna humana que comprende:

(a) purificar parcialmente un lisado de células, en el que el lisado de células es de células de levadura que han sido transformadas para expresar VLP de HPV L1;

(b) poner en contacto el lisado de células que contienen VLP parcialmente purificadas con un medio de hidroxiapatito en una columna de cromatografía en NaCl 1,25 M bajo condiciones tales que las VLP se unen al medio de hidroxiapatito;

(c) eluir las VLP unidas con una solución que comprende aniones fosfato; y

(d) recuperar las VLP eluidas.