ES2338654T5 - Amplificación de ácidos nucleicos en emulsión de perlas - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Amplificacion de acidos nucleicos en emulsion de perlas Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a metodos para amplificar acidos nucleicos de molde a partir de un numero de copia reducido hasta cantidades que permitan la secuenciacion en un soporte solido, tal como en una perla. Asimismo, la presente invencion se refiere a la eliminacion de perlas vadas, un metodo de enriquecimiento de soporte solidos que contienen acidos nucleicos amplificados.

Antecedentes

La capacidad de amplificar una pluralidad de secuencias de acidos nucleicos, tal como una biblioteca genomica o una biblioteca de ADNc, resulta cntica dada la ineficiencia de los metodos actuales de secuenciacion. Las tecnologfas de secuenciacion actuales requieren millones de copias de acido nucleico por cada reaccion de secuenciacion. Ademas, la secuenciacion de un genoma humano requerina aproximadamente diez millones de reacciones de secuenciacion diferentes. En el caso de que el material de partida fuese limitado, resultana necesaria la amplificacion del ADN inicial antes de la secuenciacion genomica. El material de partida puede ser limitado, por ejemplo si el genoma que debe secuenciarse procede de una cantidad traza de patogeno o de un paciente prenatal. Las tecnicas actuales para la amplificacion genomica in vitro implican protocolos laboriosos de clonacion y cultivo que han limitado la utilidad de la secuenciacion genomica. Otras tecnicas, tales como la PCR, aunque rapidas y fiables, no son capaces de amplificar un genoma de una manera representativa.

Aunque la PCR con cebadores aleatorios puede manipularse facilmente para amplificar una pluralidad de acidos nucleicos en una reaccion, este metodo no resulta preferente debido a que la biblioteca amplificada no es representativa de la biblioteca de partida. Es decir, en el contexto de una PCR aleatoria algunas secuencias de ADN se amplifican preferentemente a expensas de otras secuencias, de manera que el producto amplificado no representa el material de partida. Este problema de la PCR puede superarse si cada miembro individual de una biblioteca se amplifica en una reaccion separada. Sin embargo, este enfoque puede no resultar practico en el caso de que se requieran muchos miles de tubos de reaccion para el procedimiento de amplificacion, ya que una biblioteca genomica o una biblioteca de ADNc puede incluir mas de 1O0.OOO fragmentos. La amplificacion individual de cada fragmento de estas bibliotecas en una reaccion separada no resulta practica.

El documento WO 00/40712 da a conocer un metodo de separacion optica utilizado para aislar uno o mas elementos geneticos codificantes de un producto genico que presente una actividad deseada.

Descripcion resumida de la invencion

La presente invencion, tal como se menciona en las reivindicaciones adjuntas, proporciona un metodo para amplificar una pluralidad de acidos nucleicos (por ejemplo cada secuencia de una biblioteca de ADN, transcriptoma o genoma) de una manera rapida y economica en un unico tubo de reaccion. Un uso del metodo de la invencion es llevar a cabo amplificacion clonal simultanea mediante PCR asimetrica de una pluralidad de muestras (hasta varios cientos de miles) en un recipiente de reaccion. La presente invencion proporciona ademas un medio para encapsular una pluralidad de muestras de ADN individualmente en una microcapsula de una emulsion (es decir, un microrreactor), llevando a cabo la amplificacion por PCR asimetrica de la pluralidad de muestras encapsuladas de acidos nucleicos simultaneamente, y liberando dicha pluralidad amplificada de ADN de las microcapsulas para reacciones posteriores.

Se hibridan copias individuales de la especie de acido nucleico molde a perlas de captura que comprenden oligonucleotidos de captura que se unen al molde de acidos nucleicos. Las perlas se suspenden en solucion de amplificacion completa (ver el Ejemplo 2 para un ejemplo de una solucion de amplificacion) y se emulsionan para producir microrreactores (tfpicamente de 100 a 200 micrometres de diametro). A continuacion, se utiliza amplificacion por PCR asimetrica para incrementar clonalmente el numero de copia de la especie molde inicial en los microrreactores, y estas copias se unen a las perlas de captura en los microrreactores.

Una ventaja de la presente invencion es que los microrreactores permiten la amplificacion clonal y discreta simultanea de muchos moldes diferentes sin contaminacion cruzada de los productos amplificados o reactivos, o el dominio de un molde particular o conjunto de moldes (por ejemplo el sesgo de PCR). La reaccion de amplificacion, por ejemplo, puede llevarse a cabo simultaneamente con por lo menos 3.000 microrreactores por microlitro de mezcla de reaccion. Preferentemente, cada microrreactor comprende una o unas pocas especies de molde amplificado.

En diversas realizaciones de la invencion, los microrreactores presentan un tamano medio de entre aproximadamente 10 |im y aproximadamente 250 |im. En una realizacion preferente, los microrreactores presentan un diametro medio de entre aproximadamente 60 y aproximadamente 200 |im. En una realizacion mas preferente,

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los microrreactores presentan un diametro medio de aproximadamente 60 |im, tal como una media de entre 40 |im y 80 |im de diametro. En una realizacion, los microrreactores presentan un diametro medio de aproximadamente 60 |im. En otra realizacion preferente, los microrreactores presentan un volumen medio de aproximadamente 113 pl. En una realizacion todavfa mas preferente, aproximadamente 3.000 microrreactores se encuentran contenidos en un microlitro de una emulsion 1:2 de agua en aceite.

La presente invencion, tal como se menciona en las reivindicaciones adjuntas, proporciona ademas un metodo para producir una pluralidad de perlas portadoras de acidos nucleicos molde, en la que cada perla comprende hasta 1.000.000 copias o mas de una unica secuencia de acidos nucleicos. En una realizacion preferente, cada perla puede comprender mas de 20 millones de copias de un unico acido nucleico.

La presente invencion, tal como se menciona en las reivindicaciones adjuntas, proporciona ademas un metodo para enriquecer aquellas perlas que contengan el producto de la amplificacion exitosa de ADN (es decir, mediante la eliminacion de perlas que no presentan ADN unido a las mismas).

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1 Esquema de la estructura de una perla de captura de ADN.

Figuras 2A-2B Esquema de una realizacion de un procedimiento de amplificacion en emulsion de perlas.

Figura 3 Esquema de un procedimiento de enriquecimiento para eliminar perlas que no presentan ningun ADN unido a las mismas.

Figura 4 Ilustracion de dispositivo utilizado para sostener tubos en la placa de agitacion situada bajo una bomba vertical de jeringa. El dispositivo se modifico para sostener tres conjuntos de mezclas de reaccion de amplificacion en emulsion de perlas. La jeringa se cargo con la mezcla de reaccion de PCR y perlas.

Figura 5 Ilustracion de la organizacion optima de jeringas en una bomba vertical de jeringa y orientacion de los tubos de emulsion bajo las salidas de las jeringas.

Figura 6 Ilustracion de la organizacion optima del bloque impulsor de la bomba de jeringas contra los embolos de las jeringas, y orientacion optima del dispositivo sobre la placa de agitacion. Mediante la utilizacion de dicha disposicion, se expulsa el contenido de la jeringa en el aceite en emulsion bajo agitacion.

Figura 7 Ilustracion de perlas (ver las flechas) suspendidas en microrreactores individuales segun los metodos de la invencion.

Figura 8A-8C Esquema que muestra las etapas iniciales de amplificacion en emulsion de perlas utilizada conjuntamente con la secuenciacion desde dos extremos. La perla activada por NHS (figura 8A) se une a los cebadores de captura (figura 8B) y se encapsula en un microrreactor que comprende la perla de captura de ADN y molde (figura 8C).

Figura 9 Esquema que muestra las etapas de amplificacion y de captura de la amplificacion en emulsion de perlas utilizada conjuntamente con la secuenciacion desde dos extremos. El molde se amplifica mediante PCR en fase solucion y los productos de amplificacion se unen a la perla de captura de ADN.

Figura 10 Esquema que muestra las ultimas etapas de amplificacion en emulsion de perlas utilizada

conjuntamente con la secuenciacion desde dos extremos. La emulsion se rompe (figuras 10A-10B), se elimina la segunda cadena del producto de amplificacion y se utiliza el enriquecimiento para maximizar el numero de perlas unidas a producto de amplificacion (figura 10C), se hibridan los cebadores de secuenciacion (figura 10D) y se secuencia la primera cadena (figura 10E), seguido de la segunda cadena.

Descripcion detallada de la invencion

Breve vista general de la amplificacion en emulsion de perlas

Se comenta posteriormente una breve vista general de una realizacion de la invencion. A continuacion, se proporciona una descripcion mas detallada de cada etapa individual de la presente realizacion. La PCR es la tecnica de amplificacion seleccionada.

Se lleva a cabo la amplificacion en emulsion de perlas mediante la union de un molde (por ejemplo un molde de ADN) que debe amplificarse a un soporte solido, en la forma de un perla generalmente esferica. La perla se une a un gran numero de una unica especie de cebador (es decir, el cebador B en la figura 2) que es complementario a una region del molde de ADN y la amplificacion copia a partir de este molde. Las perlas se suspenden en una mezcla de reaccion acuosa y despues se encapsulan en una emulsion de agua en aceite. El ADN molde se une a la perla

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previamente a la emulsificacion.

La emulsion esta compuesta de microgotas discretas en fase acuosa, por ejemplo de diametro medio comprendido entre aproximadamente 60 y 200 |im, incluidas en una fase aceite termoestable. Cada microgota contiene solucion de reaccion de amplificacion por PCR (es decir, los reactivos necesarios para la amplificacion de los acidos nucleicos); concretamente, una mezcla de reaccion de PCR (polimerasa, sales, dNTPs; ver el Ejemplo 2 para un ejemplo) y una pareja de cebadores de PCR (cebador A y cebador B) (ver la figura 2A). Un subconjunto de la poblacion de microgotas incluye la perla de ADN y el molde. Este subconjunto de microgotas es la base para la amplificacion. Las microcapsulas restantes no contienen ADN molde y no participaran en la amplificacion. La tecnica de amplificacion es la PCR asimetrica y los cebadores de PCR pueden estar presentes en una proporcion de 8:1 o de 16:1 (es decir, 8 o 16 de un cebador a 1 del segundo cebador) para llevar a cabo una PCR asimetrica.

La reaccion de amplificacion por PCR asimetrica, puede llevarse a cabo tal como se ilustra en la vista general siguiente. En el ejemplo, se hibrida una region de la molecula de ADN (region B') a un oligonucleotido inmovilizado en una perla (cebador B). Durante el termociclado (figura 2B), el enlace entre el molde monocatenario y el cebador B inmovilizado en la perla se rompe, liberando el molde a la solucion microencapsulada circundante. La solucion de PCR contiene cebador A y cebador B en fase solucion (por ejemplo en una proporcion de 8:1 o de 16:1). Los cebadores B en fase solucion se unen facilmente a la region B' complementaria del molde debido a que la cinetica de union es mas rapida para los cebadores en fase solucion que para los cebadores inmovilizados.

En la PCR en etapa temprana, tanto la cadena A como la B se amplifican igualmente bien (figura 2C). Al alcanzar la etapa intermedia de la PCR (es decir, entre los ciclos 10 y 30), se han agotado los cebadores B, deteniendo la amplificacion exponencial. A continuacion, la reaccion entra en amplificacion asimetrica y la poblacion de amplicones resulta dominada por las cadenas A (figura 2D). En la PCR en etapa tardfa (figura 2E), tras 30 a 40 ciclos, la amplificacion asimetrica incrementa la concentracion de cadenas A en solucion. El exceso de cadenas A inicia su hibridacion a los cebadores B inmovilizados en perlas. Seguidamente las polimerasas termoestables utilizan la cadena A como molde para sintetizar una cadena B inmovilizada del amplicon unida a perla.

En la PCR en la etapa final (figura 2F), el ciclado termico continuo fuerza la hibridacion adicional a cebadores unidos a perlas. La amplificacion en fase solucion puede ser minima en esta etapa, aunque la concentracion de cadenas B inmovilizadas se incrementa. A continuacion, se rompe la emulsion y el producto inmovilizado se convierte en monocatenario mediante desnaturalizacion (por calor, pH, etc.), que elimina la cadena A complementaria. Los cebadores A se hibridan a la region A' de la cadena inmovilizada, y la cadena inmovilizada se carga con enzimas de secuenciacion, y cualquier protema accesoria necesaria. A continuacion, las perlas se secuencian utilizando tecnicas de pirofosfato conocidas (descritas, por ejemplo, en las patentes US Nos. 6.274.320, 6.258.568 y 6.210.891).

Diseno del molde

En una realizacion preferente, el molde de acidos nucleicos que debe amplificarse mediante amplificacion en emulsion de perlas es una poblacion de ADN, tal como, por ejemplo, una biblioteca de ADN genomico o una biblioteca de ADNc. Resulta preferente que cada miembro de la poblacion de ADN presente una secuencia comun de acidos nucleicos en el primer extremo y una secuencia comun de acidos nucleicos en un segundo extremo. Esto puede conseguirse, por ejemplo, ligando una primera secuencia adaptadora de ADN a un extremo y una segunda secuencia adaptadora de ADN a un segundo extremo de cada miembro de la poblacion de ADN. Muchas bibliotecas de ADN y de ADNc, en virtud de la naturaleza del vector de clonacion (por ejemplo Bluescript, Stratagene, La Jolla, CA) encajan en la descripcion de que presentan una secuencia comun en un primer extremo y una segunda secuencia comun en un segundo extremo de cada ADN miembro. El molde de acidos nucleicos puede presentar cualquier tamano que permite la PCR asimetrica in vitro. En una realizacion preferente, el molde presenta un tamano de entre aproximadamente 150 y 750 pb, tal como, por ejemplo aproximadamente 250 pb.

Union de molde de acidos nucleicos a perlas de captura

Se une un molde de acidos nucleicos monocatenarios que debe amplificarse a una perla de captura. El molde se captura en una perla previamente a la emulsificacion. Las copias de amplificacion del molde de acidos nucleicos se unen a una perla de captura. Estas uniones estan mediadas por oligonucleotidos que se encuentran unidos a la superficie de la perla. Los oligonucleotidos pueden unirse a la perla de captura de cualquier manera conocida de la tecnica.

La union qmmica covalente de un oligonucleotido a una perla puede conseguirse mediante la utilizacion de agentes acoplantes estandares. Por ejemplo, puede utilizarse carbodiimida soluble en agua para unir el fosfato 5' de una secuencia de ADN a perlas de captura recubiertas con amina mediante un enlace fosfoamidato. Entre otras qmmicas de enlace para unir el oligonucleotido a las perlas se incluyen la utilizacion de N-hidroxisuccinamida (NHS) y derivados de la misma.

Pueden utilizarse oligonucleotidos que se hibriden espedficamente a secuencias unicas en el extremo del fragmento de ADN. Resulta preferente que las perlas continuen ligando los oligonucleotidos inmovilizados durante las etapas

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de los metodos de la invencion.

Cada perla de captura se disena para que presente una pluralidad de oligonucleotidos que reconocen (es decir, que sean complementarios a) una parte del molde de acidos nucleicos, y las copias de amplificacion de dicho molde. En los metodos descritos en la presente memoria, se desea la amplificacion clonal de la especie molde, de manera que resulta preferente que unicamente una unica especie de acidos nucleicos se una a una perla de captura cualquiera.

Las perlas utilizadas en la presente memoria pueden presentar cualquier tamano conveniente y fabricarse a partir de uno o mas materiales conocidos cualesquiera. Entre los ejemplos de dichos materiales se incluyen: compuestos inorganicos, polfmeros naturales y polfmeros sinteticos. Entre los ejemplos espedficos de dichos materiales se incluyen: celulosa, derivados de celulosa, resinas acnlicas, vidrio, geles de sflice, poliestireno, gelatina, polivinilpirrolidona, copolfmeros de vinilo y acrilamida, poliestireno entrecruzado con divinilbenceno o similar (tal como se describe, por ejemplo en Merrifield, Biochemistry, 3:1385-1390, 1964), poliacrilamidas, geles de latex, poliestireno, dextrano, caucho, silicio, plasticos, nitrocelulosa, esponjas naturales, geles de sflice, vidrio de poro controlado, metales, dextranos entrecruzados (por ejemplo Sephadex1TM), gel de agarosa (Sepharose1TM) y otros soportes de fase solida conocidos por el experto en la materia. En realizaciones preferentes, las perlas de captura son perlas de diametro aproximado entre 2 y 100 |im o de entre 10 y 80 |im de diametro, mas preferentemente de entre 20 y 40 |im de diametro. En una realizacion preferente, las perlas de captura son perlas de sefarosa.

Emulsificacion

Para la utilizacion con la presente invencion, se suspenden perlas de captura con acidos nucleicos de molde en una emulsion de agua en aceite estable frente al calor. Se contempla que una pluralidad de los microrreactores incluya unicamente un molde y una perla. Pueden existir muchas gotas que no contengan un molde o que no contengan una perla. De manera similar, pueden existir gotas que contengan mas de una copia de un molde. La emulsion puede formarse segun cualquier metodo conocido de la tecnica. Un metodo para crear una emulsion se describe posteriormente, aunque puede utilizarse cualquier metodo para preparar una emulsion. Estos metodos son conocidos de la tecnica e incluyen metodos adyuvantes, metodos de contraflujo, metodos de contracorriente, metodos de tambor giratorio y metodos de membrana. Ademas, el tamano de las microcapsulas puede ajustarse modificando el caudal y la velocidad de los componentes. Por ejemplo, en la adicion gota a gota, puede modificarse el tamano de las gotas y el tiempo total de adicion. Preferentemente, la emulsion contiene una densidad de aproximadamente 3.000 perlas encapsuladas por microlitro.

Se hace referencia a diversas emulsiones que resultan adecuadas para reacciones biologicas en Griffiths y Tawfik, EMBO, 22:24-35, (2003); Ghadessy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:4552-4557, (2001); patentes US No. 6.489.103 y WO 02/22869.

Se indica que Griffiths et al. (patentes US No. 6.489.103 y WO 99/02671) se refiere a un metodo para la separacion in vitro de uno o mas elementos geneticos codificantes de un producto genico que presenta una actividad deseada. Este metodo implica compartimentalizar un gen, expresar el gen y separar el gen compartimentalizado basandose en el producto expresado. En contraste con la presente invencion, el metodo de separacion por microencapsulado no resulta adecuado para el analisis paralelo de multiples microcapsulas debido a que su producto acido nucleico no se encuentra anclado y no puede anclarse. Debido a que los acidos nucleicos de Griffiths no se encuentran anclados, se mezclanan durante la demulsificacion.

La emulsion preferentemente se genera mediante la adicion de perlas a una solucion de amplificacion. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion “solucion de amplificacion” se refiere a una mezcla suficiente de reactivos necesaria para llevar a cabo la amplificacion por PCR asimetrica del ADN molde. Un ejemplo de una solucion de amplificacion por PCR se proporciona en los Ejemplos, posteriormente. En una realizacion, la mezcla de perlas y solucion de amplificacion se anade gota a gota a una mezcla de aceite biocompatible (por ejemplo aceite mineral ligero, Sigma) bajo centrifugacion y se deja que se emulsione. En otra realizacion, las perlas y la solucion de amplificacion se anaden gota a gota en un flujo cruzado de aceite biocompatible. El aceite utilizado puede suplementarse con uno o mas estabilizantes de emulsion biocompatibles. Entre estos estabilizantes de emulsion se incluyen Atlox 4912, Span 80, y otros estabilizantes adecuados comercialmente disponibles. En aspectos preferentes, la emulsion es estable al calor para permitir el ciclado termico, por ejemplo a por lo menos 94°C, a por lo menos 95°C, o a por lo menos 96°C. Preferentemente, las gotas formadas presentan un tamano comprendido entre aproximadamente 5 micrometros y aproximadamente 500 micrometres, mas preferentemente entre aproximadamente 10 micrometros y aproximadamente 350 micrometros, todavfa mas preferentemente entre aproximadamente 50 y 250 micrometros, y todavfa mas preferentemente entre aproximadamente 100 micrometros y aproximadamente 200 micrometros. Ventajosamente, la mezcla de fluido en flujo cruzado permite el control de la formacion de las gotas y la uniformidad del tamano de gota. Los presentes inventores senalan que pueden encontrarse presentes en la emulsion gotas de agua de menor tamano que no contienen perlas.

Los microrreactores deben presentar un tamano suficientemente grande para poder incluir suficientes reactivos de amplificacion para el grado de amplificacion requerido. Sin embargo, los microrreactores deben ser suficientemente pequenos para que una poblacion de microrreactores, conteniendo cada uno un miembro de una biblioteca de ADN,

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pueda amplificarse utilizando equipos de termociclado de PCR, probetas, incubadores y similares. Notablemente, la utilizacion de microrreactores permite la amplificacion de mezclas complejas de moldes (por ejemplo muestras de ADN genomico o ARN de celulas completas) sin mezclar entre sf las secuencias o sin que domine uno o mas moldes (por ejemplo sesgo de seleccion de la PCR; ver Wagner et al., 1994; Suzuki y Giovannoni, 1996; Chandler et al., 1997; Polz y Cavanaugh, 1998).

Dentro de las limitaciones indicadas anteriormente, el tamano optimo de un microrreactor puede ser de entre 100 y 200 micrometros de diametro. Los microrreactores de este tamano permitinan la amplificacion de una biblioteca de ADN que comprende aproximadamente 600.000 miembros en una suspension de microrreactores de menos de 10 ml de volumen. Por ejemplo, usando PCR, podnan incluirse 10 ml de microrreactores en 96 tubos de un termociclador convencional con capacidad para 96 tubos. En una realizacion preferente, la suspension de 600.000 microrreactores presentana un volumen inferior a 1 ml. Una suspension de menos de 1 ml puede amplificarse en aproximadamente 10 tubos de un termociclador de PCR convencional. En una realizacion todavfa mas preferente, la suspension de 600.000 microrreactores presentana un volumen inferior a 0,5 ml.

Amplificacion asimetrica

En una realizacion preferente, la amplificacion del ADN se lleva a cabo mediante PCR asimetrica. La PCR segun la presente invencion puede llevarse a cabo mediante encapsulado del acido nucleico diana con una solucion de PCR que comprenda todos los reactivos necesarios para la PCR. A continuacion, la PCR puede llevarse a cabo mediante exposicion de la emulsion a cualquier regimen adecuado de termociclado conocido de la tecnica. En una realizacion preferente, se llevan a cabo 30 a 50 ciclos, preferentemente aproximadamente 40 ciclos de amplificacion. Resulta deseable, aunque no necesario, que tras el procedimiento de amplificacion se realice uno o mas ciclos de hibridacion y extension tras los ciclos de amplificacion. En una realizacion preferente, se llevan a cabo 10 a 30 ciclos, preferentemente aproximadamente 25 ciclos de hibridacion y extension (por ejemplo tal como se describe en los ejemplos). Rutinariamente, el ADN molde se amplifica hasta inmovilizar en cada perla tfpicamente por lo menos 10.000 a 50.000.000 copias. Se reconoce que, para las aplicaciones de deteccion de acidos nucleicos, resultan necesarias menos copias de molde. Para las aplicaciones de secuenciacion de acidos nucleicos los presentes inventores prefieren que se inmovilicen en cada perla por lo menos dos millones a cincuenta millones de copias, preferentemente entre aproximadamente diez millones y treinta millones de copias del ADN molde. El experto en la materia reconocera que el tamano de la perla (y del sitio de captura en la misma) determina el numero de cebadores capturados que pueden unirse (y, de esta manera, el numero de moldes amplificados que puede capturarse en cada perla).

Diseno del cebador de PCR

La seleccion de acidos nucleicos cebadores para la amplificacion por PCR, se encuentra perfectamente dentro de las capacidades del experto en la materia. Pueden encontrarse estrategias para el diseno de cebadores en la literatura cientffica, por ejemplo en Rubin E. y A.A. Levy, Nucleic Acids Res. 24(18):3538-45, 1996; y Bucks G.A. et al., Biotechniques 27(3):528-36, 1999. En una realizacion preferente, los cebadores pueden limitarse a una longitud de 20 bases (5 tetrameros) para la smtesis eficiente de cebadores bipartitos de PCR/secuenciacion. Cada cebador puede incluir una abrazadera GC de dos bases en el extremo 5', una unica abrazadera GC en el extremo 3', y todos los cebadores pueden compartir una Tm similar (+/- 2°C). En una realizacion preferente, las estructuras de horquilla dentro de los cebadores (AG de tallos de horquillas internas > -1,9 kcal/moles) resultan fuertemente desfavorecidas en cualquiera de los cebadores disenados. En otra realizacion preferente, la dimerizacion de los cebadores tambien se encuentra controlada, de manera que se acepta como maximo un dfmero de 3 bases. Sin embargo, se permite que esto ocurra unicamente en las ultimas seis bases 3' y la AG maxima permisible para un dfmero 3' es de -2,0 kcal/mol. Preferentemente, se aplica una penalizacion a los cebadores en los que los extremos 3' son excesivamente similares a otros en el grupo. Esto impide la hibridacion cruzada entre un cebador y el complemento inverso del otro cebador.

En el caso de que los cebadores se disenen segun los criterios indicados anteriormente, la posibilidad de que existan regiones complementarias dentro del genoma de interes no constituye un gran problema, a pesar de la tolerancia informada de la PCR a apareamientos incorrectos en poblaciones de muestra complejas (Rubin E y A.A. Levy, Nucleic Acids Res. 24(18):3538-45, 1996). Aunque la probabilidad de encontrar un apareamiento perfecto con un cebador de 20 bases es extremadamente baja (420) (ver la Tabla 1), la probabilidad de encontrar apareamientos no consecutivos mas cortos se incrementa significativamente con el tamano del genoma de interes. Como consecuencia, la probabilidad de encontrar una correspondencia perfecta para una secuencia de por lo menos 10 o 20 bases es 99,35% para un genoma de adenovirus. La probabilidad de encontrar una correspondencia perfecta para una secuencia de 16 bases es de 97% para las secuencias en la base de datos de NCBI (aproximadamente 100 veces mas informacion de secuencia que el genoma de adenovirus). La probabilidad de encontrar una correspondencia perfecta para una secuencia de 17 a 20 bases es de 99% para el genoma humano (aproximadamente 3.000 millones de bases).

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Tabla 1. La probabilidad de apareamientos de secuencias perfectos para los cebadores se incrementa a medida que se reducen los requisitos de longitud de apareamiento y se incrementa el tamano del genoma de interes

Longitud de apareamiento

Probabilidad de apareamiento perfecto (1/4longitud) % de probabilidad de apareamiento en ~35K bases de adenovirus % de probabilidad de apareamiento en las 488 Mbases de la base de datos bacteriana NCBI % de probabilidad de apareamiento en ~3B bases humanas

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9,1x10-13 0,00% 0,04% 0,27%

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7,3x10-12 0,00% 0,65% 4,32%

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4,4x10-11 0,00% 5,76% 34,37%

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2,3x10-10 0,00% 35,69% 99,17%

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1,2x10-9 0,02% 97,52% >100%

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5,6x10-9 0,12% >100% >100%

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2,6x10-8 0,64% >100% >100%

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1,2x10-7 3,29% >100% >100%

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5,4x10-7 15,68% >100% >100%

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2,4x10-6 58,16% >100% >100%

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1,0x10-5 99,35% >100% >100%

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4,6x10-5 99,77% >100% >100%

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2,0x10-4 >100% >100% >100%

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8,5x10-4 >100% >100% >100%

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3,7x10-3 >100% >100% >100%

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1,6x10-2 >100% >100% >100%

4

6,4x10-2 >100% >100% >100%

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2,5x10-1 >100% >100% >100%

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7,1x10-1 >100% >100% >100%

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1

>100% >100% >100%

Sin embargo, la hibridacion cruzada de un cebador a diversas regiones del genoma resulta menos problematica de lo esperado a partir de la digestion aleatoria de ADN utilizada para formar los acidos nucleicos molde. Las regiones de hibridacion cruzada (CHRs) son bastante benignas. En primer lugar, es improbable que una CHR pueda competir con exito con el apareamiento perfecto entre los cebadores de PCR en solucion y el molde. Ademas, cualquier cebador que incluya apareamientos incorrectos en el extremo 3' presentara una desventaja competitiva significativa. Incluso en el caso de que una CHR ganase en competicion al cebador de PCR deseado, producina un producto de PCR truncado, sin sitio cadena abajo para el cebador de secuenciacion. En el caso de que el producto truncado pudiese transportarse hasta la perla de captura e inmovilizarse, podnan resultar dos situaciones. En el caso de que la CHR ganase en competencia al cebador en fase solucion, el producto inmovilizado no presentana un sitio de union de cebador de secuenciacion y resultana en un pocillo vado en la placa PicoTiter (PTP). En el caso de que la CHR ganase en competencia con el cebador unido a perla, el cebador de secuenciacion todavfa se encontrana presente y el unico efecto sena una insercion mas corta. Ninguno de estos resultados comprometena indebidamente la calidad de la secuenciacion. Dada la gran cantidad de material genomico utilizado en el procedimiento de preparacion de muestras (en la actualidad 25 |ig, que contiene 5,29x1016 copias del genoma adenovmco de 35 Kb), puede utilizarse el sobremuestreo para proporcionar fragmentos que no presentan la CHR completa, permitiendo la amplificacion por PCR estandar de la region en cuestion.

Rotura de la emulsion y recuperacion de perlas

Tras la amplificacion del acido nucleico molde y la union de copias de amplificacion a la perla, se “rompio” la emulsion (tambien denominada “demulsificacion” en la tecnica). Existen muchos metodos para romper una emulsion (ver, por ejemplo, la patente US No. 5.989.892 y referencias citadas en la misma) y un experto en la materia sena capaz de seleccionar un metodo apropiado. En la presente invencion, un metodo preferente para romper la emulsion utiliza aceite adicional para provocar que la emulsion se separe en dos fases. A continuacion, se elimina la fase aceite y se anade un solvente organico adecuado (por ejemplo hexanos). Tras la mezcla, se elimina la fase de aceite/solvente organico. Esta etapa puede repetirse varias veces. Finalmente, se eliminan las capas acuosas en la parte superior de las perlas. Seguidamente las perlas se lavan con una mezcla de un solvente organico y tampon de hibridacion (por ejemplo, se describe en los ejemplos un tampon de hibridacion adecuado) y despues se lavan nuevamente en tampon de hibridacion. Entre los solventes organicos adecuados se incluyen alcoholes tales como metanol, etanol y similares.

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Las perlas unidas a productos de amplificacion seguidamente pueden resuspenderse en solucion acuosa para la utilizacion, por ejemplo, en una reaccion de secuenciacion segun tecnolog^as conocidas (ver Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:5463-5467, (1977); Maxam A.M. y Gilbert W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560-564, (1977); Ronaghi M. et al., Science 281:363-365, (1998); Lysov I. et al., Dok. Akad. Nauk. SSSR 303:1508-1511, (1988); Bains W. y Smith G.C., J. Theor. Biol. 135:303-307, (1988); Drnanac R. et al., Genomics 4:114-128, (1989); Khrapko K.R. et al., FEBS Lett. 256:118-122, (1989); Pevzner P.A., J. Biomol. Struct. Dyn. 7:63-73, (1989); Southern E.M. et al., Genomics 13:1008-1017, (1992)).

En el caso de que las perlas deban utilizarse en una reaccion de secuenciacion (descrita, por ejemplo, en las patentes US Nos. 6.274.30, 6.258.568 y 6.210.891, e incorporadas in toto en la presente memoria como referencia), resulta necesario eliminar la segunda cadena del producto de PCR e hibridar un cebador de secuenciacion al molde monocatenario que se encuentra unido a la perla. La segunda cadena puede disociarse utilizando cualquiera de entre varios metodos comunmente conocidos, tales como la adicion de NaOH, la aplicacion de una fuerza ionica reducida (por ejemplo sal), la degradacion enzimatica o el desplazamiento de la segunda cadena, o el procesamiento termico. Tras esta etapa de eliminacion de la cadena, las perlas se peletizan y se descarta el sobrenadante. Las perlas se resuspenden en un tampon de hibridacion y se anade un cebador de secuenciacion u otro cebador no de amplificacion. El cebador se hibrida al producto de amplificacion monocatenario. Esto puede llevarse a cabo mediante la utilizacion de un tampon de hibridacion y condiciones de temperatura apropiados, por ejemplo segun procedimientos estandares de la tecnica.

Purificacion de las perlas

En este punto, el acido nucleico amplificado en la perla puede secuenciarse directamente en la perla o en un recipiente de reaccion diferente. En una realizacion de la presente invencion, el acido nucleico se secuencia directamente en la perla mediante la transferencia de la perla a un recipiente de reaccion y sometiendo el acido nucleico a una reaccion de secuenciacion (por ejemplo la secuenciacion de pirofosfato o la secuenciacion de Sanger). Alternativamente, las perlas pueden aislarse y el acido nucleico puede separarse de cada perla y secuenciarse. En cualquiera de los dos casos, las etapas de secuenciacion pueden llevarse a cabo en cada perla individual. Sin embargo, este metodo, aunque comercialmente viable y tecnicamente factible, podna no ser el mas efectivo debido a que muchas de las perlas seran perlas “negativas” (es decir, perlas sin acido nucleico amplificado ligado a las mismas). En estos casos, pueden utilizarse el procedimiento opcional indicado de manera general posteriormente, con el fin de eliminar las perlas negativas antes de la distribucion en las placas multipocillo (por ejemplo en placas PicoTiter).

Un porcentaje elevado de las perlas puede ser negativo en el caso de que el objeto sea minimizar el numero de perlas que se asocian a dos o mas especies diferentes de acidos nucleicos de molde. Para una secuenciacion de pirofosfato optima, cada perla debena contener multiples copias de una unica especie de acido nucleico. Esto puede llevarse a cabo mediante la maximizacion del numero total de perlas en combinacion con un unico fragmento de acido nucleico antes de la amplificacion. Por ejemplo, puede utilizarse el modelo matematico siguiente.

Para el caso general de un numero N de ADNs distribuido aleatoriamente con M numero de perlas, la poblacion relativa de perlas asociada a cualquier numero de ADNs depende de la proporcion N/M. La fraccion de perlas asociada a N ADNs, R(N), puede calcularse utilizando la distribucion de Poisson:

R(N) = exp-(N/M) x (N/M)n/N!

en la que x es el sfmbolo de multiplicacion.

La Tabla 2, a continuacion, muestra algunos valores calculados para diversos N/M (la proporcion media de fragmento de ADN a perla) y N (el numero de fragmentos asociados a una perla).

Tabla 2

N/M

0,1 0,5 1 2

R(0)

0,9 0,61 0,37 0,13

R(1)

0,09 0,3 0,37 0,27

R(N>1)

0,005 0,09 0,26 0,59

En la Tabla 2, la fila superior muestra las diversas proporciones de N/M. R(0) indica la fraccion de perlas sin ADN, R (1) indica la fraccion de perlas con un ADN (antes de la amplificacion) y R(N>1) indica la fraccion de ADN con mas de un ADN (antes de la amplificacion).

La Tabla 2 indica que la fraccion maxima de perlas asociada a un unico fragmento de ADN es 0,37 (37%) y esto ocurre a una proporcion de fragmento a perla de uno a uno. En esta mezcla, aproximadamente 63% de las perlas no puede utilizarse para la secuenciacion debido a que no se encuentran asociadas a ADN o se encuentran asociadas

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a mas de una especie de ADN. Sin embargo, el control de la proporcion de fragmento a perla requiere calculos complejos, y la variabilidad produce lotes de perlas con una fraccion significativamente menor de perlas utilizables.

Esta ineficiencia puede mejorarse significativamente separando las perlas que contienen amplicon (originado de la asociacion con por lo menos un fragmento) de aquellas sin amplicon (originadas de perlas sin fragmentos asociados). Se define “amplicon” como cualquier molecula de acidos nucleicos producida mediante una tecnica in vitro de amplificacion de acidos nucleicos. Para incrementar la eficiencia, puede llevarse a cabo la union utilizando proporciones bajas de fragmento a perla (N/M < 1). Esto minimiza el numero de perlas asociado a mas de un ADN. Puede utilizarse una etapa de separacion para eliminar la mayor parte o la totalidad de las perlas sin ADN, dejando una poblacion enriquecida de perlas con una o mas especies de ADN amplificado. Esta poblacion enriquecida puede analizarse mediante cualquier metodo de secuenciacion, tal como, por ejemplo, la secuenciacion de pirofosfato. Debido a que la fraccion de perlas con un amplicon (N = 1) se encuentra enriquecida, puede aplicarse cualquier metodo de secuenciacion mas eficientemente.

A tftulo de ejemplo, con una proporcion media de fragmento a perla de 0,1, el 90% de las perlas no portara amplicon, el 9% de las perlas portara un amplicon y el 0,5% de las perlas portara mas de un amplicon. El enriquecimiento descrito posteriormente en la presente memoria eliminara el 90% de las perlas sin amplicon, dejando una poblacion de perlas en la que la fraccion disponible para la secuenciacion (N = 1) es igual a:

1 -(0,005/0,09) = 94%

La dilucion de la mezcla de fragmento a perla, conjuntamente con la separacion de las perlas que contienen amplicon puede proporcionar un enriquecimiento de 2,5 veces sobre el metodo no enriquecido optimo. Por ejemplo, 94%/37% (ver la Tabla 2, anteriormente, N/M = 1) = 2,5. Un beneficio adicional del procedimiento de enriquecimiento descrito posteriormente en la presente memoria es que la fraccion ultima de perlas util para la secuenciacion es relativamente insensible a la variabilidad de N/M. De esta manera, los complejos calculos para derivar la proporcion N/M optima resultan innecesarios o pueden llevarse a cabo con niveles mas bajos de precision. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, los metodos de la invencion pueden adaptarse facilmente para la utilizacion por personal menos formado o para la automatizacion. Un beneficio adicional de estos metodos es que las perlas sin amplicon pueden reciclarse y reutilizarse. Aunque el reciclado no resulta necesario, puede reducir el coste o el volumen total de reactivos, de manera que el metodo de la invencion resulte mas adecuado para algunos fines tales como, por ejemplo, el muestreo portatil, el muestreo robotico a distancia y similar. Ademas, los beneficios colectivos de los metodos dados a conocer (por ejemplo la adaptacion para personal menos formado, la automatizacion y el reciclado de reactivos) reduciran el coste de los metodos. El procedimiento de enriquecimiento se describe en mas detalle posteriormente.

El procedimiento de enriquecimiento puede utilizarse para tratar perlas que han sido amplificadas en el metodo de emulsion de perlas descrito anteriormente. La amplificacion se disena de manera que cada molecula de acidos nucleicos amplificada contenga la misma secuencia en su extremo 3'. La secuencia de nucleotidos puede ser un 20- mero, aunque puede ser cualquier secuencia de 15 bases o mas, tal como 25 bases, 30 bases, 35 bases, 40 bases o mas larga. Aunque los extremos de oligonucleotidos mas largos son funcionales, no resultan necesarios. Un experto en la materia sera capaz de introducir dicha secuencia 3' en el extremo de un acido nucleico amplificado. Por ejemplo, en el caso de que se utilice PCR para la amplificacion de un ADN molde, la secuencia puede incluirse como parte de un miembro de la pareja de cebadores de PCR.

En la figura 3 se ilustra un esquema del procedimiento de enriquecimiento. En este procedimiento, se mezclo la perla ligada a amplicon con cuatro perlas vacfas para crear una mezcla de perlas de amplificacion diluida en fragmentos. En la etapa 1, se hibrido con el amplicon un cebador biotinilado complementario al extremo 3' del amplicon. En la etapa 2, se anadio ADN polimerasa y los cuatro desoxinucleotidos trifosfato (dNTPs) naturales a la mezcla de perlas y se extendio el cebador biotinilado. Esta extension sirve para fortalecer la union entre el cebador biotinilado y el ADN unido a perla. Esta etapa puede omitirse en el caso de que el enlace cebador biotinilado-ADN sea fuerte (por ejemplo en un ambiente altamente ionico). En la etapa 3, se introducen perlas recubiertas de estreptavidina susceptibles de atraccion por un campo magnetico (denominadas en la presente memoria “perlas magneticas recubiertas de estreptavidina”) en las mezclas de perlas. Las perlas magneticas se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo de Dynal (M290). Los grupos de captura de estreptavidina se unen a grupos biotina hibridados a los amplicones, uniendo de esta manera las perlas unidas a amplicon a las perlas magneticas recubiertas de estreptavidina.

En la etapa 5, se aplico un campo magnetico (representado por un iman) en un area proxima a la mezcla de reaccion, provocando que los complejos de perlas magneticas recubiertas de estreptavidina/perlas unidas a amplicon se posicionasen a lo largo de la pared del tubo mas proxima al campo magnetico. Las perlas magneticas sin union de perlas con amplicon tambien se esperaba que se posicionasen a lo largo del mismo lado. Las perlas sin amplicones permanecen en solucion. Se lavo la mezcla de perlas y las perlas no unidas al iman (es decir, las perlas vacfas) se separaron y se descartaron. En la etapa 6, la cadena extendida por el cebador biotinilado se separo de la cadena de amplicon mediante “disociacion”. Esta etapa puede llevarse a cabo, por ejemplo con calor o mediante una modificacion del pH. El calor puede ser 60°C bajo condiciones de baja salinidad (por ejemplo en un ambiente poco

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ionico, tal como 0,1xSSC). La modificacion del pH puede llevarse a cabo mediante la adicion de NaOH. A continuacion, la mezcla se lava y el sobrenadante que contiene las perlas unidas a amplicon se recupera, mientras que las perlas magneticas resultan retenidas por un campo magnetico. Las perlas enriquecidas resultantes pueden utilizarse para la secuenciacion del ADN. Se indica que el cebador en la perla de captura de ADN puede ser el mismo que el cebador de la etapa 2, anteriormente. En este caso, la hibridacion de las cadenas complementarias de amplicon-cebador (con o sin extension) es el origen de la afinidad de captura de la diana.

La pareja de biotina-estreptavidina podna sustituirse por una diversidad de parejas de captura-diana. Por ejemplo, las parejas de captura-diana pueden utilizar enlaces reversibles (por ejemplo cortables) o irreversibles. Entre los ejemplos no limitantes de enlaces reversibles se incluyen tiol-tiol, digoxigenina/anti-digoxigenina y enlaces utilizando VECTREX® avidina DLA (Vector Laboratories, Burlingame, CA), CaptAvidin'M, NeutrAvidin'M y D-destiobiotina (Molecular Probes Inc., Eugene, OR).

Tal como se ha descrito anteriormente, la etapa 2 del procedimiento de enriquecimiento es opcional. En el caso de que se omita la etapa 2, podna no resultar necesario separar las perlas magneticas de las perlas con amplicon ligado. Las perlas con amplicon ligado, con las perlas magneticas unidas, pueden utilizarse directamente para la secuenciacion. Por ejemplo, la separacion puede no resultar necesaria en el caso de que la secuenciacion se lleve a cabo en una placa de microtitulacion o en una placa PicoTiter y el complejo de perla con amplicon ligado-perla magnetica quepa en el interior del pocillo de la placa.

Aunque la utilizacion de perlas de captura magneticas resulta conveniente, los grupos de captura pueden comprender otras superficies ligantes. Por ejemplo, puede unirse qmmicamente estreptavidina a una superficie, tal como la superficie interior de un tubo. En este caso, la mezcla de perlas amplificadas puede hacerse fluir a traves del tubo. Las perlas con amplicon ligado tenderan a resultar retenidas hasta la “disociacion” mientras que las perlas vadas fluiran a traves del tubo. Esta disposicion puede resultar particularmente ventajosa para la automatizacion del procedimiento de preparacion de perlas.

Aunque las realizaciones descritas anteriormente resultan particularmente utiles, pueden contemplarse otros metodos para separar perlas. Por ejemplo, las perlas de captura pueden marcarse con un grupo fluorescente que provocana que el complejo de perla de captura de diana fuese fluorescente. El complejo de perla de captura de diana puede separarse mediante citometna de flujo o con un separador celular de fluorescencia. La utilizacion de perlas de captura de gran tamano permitina la separacion mediante filtracion u otras tecnicas de separacion basadas en el tamano de partfcula. Debido a que las perlas tanto de captura como con diana son capaces de formar complejos con varias perlas, resulta posible aglutinar una masa de perlas de captura de diana entrecruzadas. El gran tamano de la masa aglutinada permitina la separacion mediante el simple lavado de las perlas vadas no aglutinadas. Los metodos descritos se describen en mayor detalle en, por ejemplo, Bauer J., J. Chromatography B, 722:55-69, (1999), y en Brody et al., Applied Physics Lett. 74:144-146, (1999).

En una realizacion, la invencion comprende un metodo para amplificar uno o mas acidos nucleicos, que comprende las etapas siguientes: a) formar una emulsion de agua en aceite para crear una pluralidad de microrreactores acuosos, en la que por lo menos uno de los microrreactores comprende un unico acido nucleico molde, una unica perla capaz de unirse al acido nucleico, uniendose el molde monocatenario a la perla antes de formar la emulsion y solucion de reaccion de amplificacion que contiene los reactivos necesarios para llevar a cabo la amplificacion de acidos nucleicos, b) amplificar los acidos nucleicos en los microrreactores para formar copias amplificadas de los acidos nucleicos mediante amplificacion asimetrica, y c) unir las copias amplificadas a las perlas en los microrreactores, y tal como se define adicionalmente en la reivindicacion 1.

La solucion de reaccion de amplificacion utilizada con este metodo es una solucion de reaccion en cadena de polimerasa que comprende nucleotidos trifosfato, una polimerasa termoestable, y acidos nucleicos cebadores suspendidos en un tampon compatible con condiciones de reaccion en cadena de polimerasa. La reaccion en cadena de polimerasa es una reaccion en cadena de polimerasa asimetrica La amplificacion puede llevarse a cabo mediante amplificacion en flujo continuo.

Para la utilizacion con este metodo, una mayona de los microrreactores puede incluir un unico acido nucleico. El metodo puede ponerse en practica con por lo menos 10.000 acidos nucleicos, o con por lo menos 50.000 acidos nucleicos. Cada perla utilizada con el metodo puede utilizarse para capturar mas de 10.000 copias de amplificacion de un acido nucleico molde. En diversas realizaciones, la emulsion contiene ademas estabilizantes de emulsion. Los estabilizantes de emulsion pueden ser Atlox 4912, Span 80 o combinaciones o mezclas de los mismos. La emulsion puede ser estable frente al calor, por ejemplo a 95°C, y puede formarse mediante la adicion gota a gota a un aceite de los acidos nucleicos molde, perlas y la solucion de reaccion de amplificacion. Los microrreactores pueden presentar un tamano medio de entre 50 y 250 |im de diametro.

La invencion tambien comprende un metodo para amplificar un acido nucleico, que comprende las etapas siguientes: a) proporcionar un acido nucleico molde monocatenario que debe amplificarse, b) proporcionar un material de soporte solido que comprende una perla generalmente esferica que presenta un diametro de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 80 |im, en donde la perla es capaz de unirse al acido nucleico molde, c)

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mezclar el acido nucleico molde y la perla en una solucion de reaccion de amplificacion que contiene los reactivos necesarios para llevar a cabo una reaccion de amplificacion de acidos nucleicos en una emulsion de agua en aceite, uniendose el molde a la perla antes de formar la emulsion; d) amplificar asimetricamente el acido nucleico molde para formar copias amplificadas del acido nucleico molde, y e) unir las copias amplificadas a la perla, y tal como se define adicionalmente en la reivindicacion 14.

Opcionalmente, el metodo puede incluir una etapa de enriquecimiento para aislar perlas que se unan a copias amplificadas del acido nucleico separandolas de perlas a las que no se ha unido acido nucleico. Esta etapa de enriquecimiento puede llevarse a cabo mediante electroforesis, separacion celular o purificacion de afinidad (por ejemplo con perlas magneticas que se ligan acido nucleico). Preferentemente, por lo menos 100.000 copias de cada molecula de acido nucleico diana se unen a cada perla, por lo menos 1.000.000 copias de cada molecula de acido nucleico diana se unen a cada perla, o por lo menos 1 a 20.000.000 copias de cada molecula de acido nucleico diana se unen a cada perla. En diversos aspectos, las perlas son perlas de sefarosa y las copias amplificadas se unen a las perlas mediante una pareja de union, tal como antfgeno/anticuerpo, ligando/receptor, polihistidina/mquel o avidina/biotina. El metodo tambien puede incluir las etapas siguientes: f) separar las perlas que portan molde y perla magnetica, y g) eliminar las perlas magneticas utilizando un campo magnetico. Esta separacion puede conseguirse mediante incubacion a una temperatura superior a 45°C o mediante incubacion de las perlas portadoras de molde y las perlas magneticas en una solucion con un pH basico.

La divulgacion comprende ademas un kit para llevar a cabo la amplificacion de acidos nucleicos de un acido nucleico molde que comprende: a) una perla de captura de acidos nucleicos, b) un aceite de emulsion, c) uno o mas estabilizantes de emulsion, y d) instrucciones para utilizar el kit segun los metodos proporcionados en las reivindicaciones 1 a 14 adjuntas.

Ademas, la invencion comprende un metodo para producir una poblacion clonal de acidos nucleicos, que comprende: a) proporcionar una pluralidad de acidos nucleicos molde monocatenarios de longitud comprendida entre 50 y 800 pb y perlas capaces de unirse a los acidos nucleicos molde, b) mezclar los acidos nucleicos molde y las perlas en una solucion de reaccion biologica que contiene reactivos necesarios para amplificar los acidos nucleicos molde, y c) formar una emulsion para crear una pluralidad de microrreactores que comprenden los acidos nucleicos molde, perlas y solucion de reaccion biologica, uniendose el molde a la perla antes de formar la emulsion, en donde por lo menos uno de los microrreactores comprende un unico acido nucleico molde y una unica perla encapsulada en la solucion de reaccion biologica, en donde los microrreactores se encuentran contenidos en el mismo recipiente, y tal como se define adicionalmente en la reivindicacion 24.

Segun este metodo, los acidos nucleicos pueden transcribirse y traducirse para generar por lo menos 10.000 copias de un producto de expresion. El producto de expresion puede unirse a las perlas mediante una pareja de union seleccionada de entre el grupo que consiste de parejas de union antfgeno/anticuerpo, ligando/receptor, 6Xhis/mquel- acido nitrilotriacetico y etiqueta FLAG/anticuerpo FLAG. En determinados aspectos, el metodo produce una poblacion clonal de protemas, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y anticuerpos manipulados. La emulsion puede comprender una pluralidad de microrreactores termoestables, en la que los microrreactores presentan un diametro de entre 50 y 200 |im y comprende una solucion de reaccion biologica. La solucion de reaccion biologica puede comprende reactivos para llevar a cabo reacciones de amplificacion mediante reaccion en cadena de polimerasa o reacciones acopladas de transcripcion y traduccion. Preferentemente, una pluralidad de microrreactores comprende un acido nucleico molde, por ejemplo uno o menos acidos nucleicos molde, y uno o menos perlas que se unen a los acidos nucleicos molde.

Ejemplos

PCR EN EMULSION DE PERLAS

Los procedimientos siguientes, incluyendo la captura del ADN molde, la amplificacion del ADN, y la recuperacion de las perlas unidas al molde amplificado, pueden llevarse a cabo en un unico tubo. El formato de emulsion garantiza la separacion ffsica de las perlas en “microrreactores” de entre 100 y 200 |im dentro de este unico tubo, permitiendo de esta manera la amplificacion clonal de los diversos moldes. La inmovilizacion del producto de amplificacion se lleva a cabo mediante la extension del molde a lo largo de los oligonucleotidos unidos a las perlas de captura de ADN. Tfpicamente, el numero de copia del molde inmovilizado se encuentra comprendido entre 10 y 30 millones de copias por perla. Las perlas de captura de ADN con fijacion de multiples copias de una unica especie de acido nucleico molde se encuentran listas para la distribucion en PTPs.

Los 300.000 pocillos de 75 picolitros grabados en la superficie de la PTP proporcionan una matriz unica para la secuenciacion de ADNs molde cortos de una manera masivamente paralela, eficiente y economica. Sin embargo, ello requiere cantidades bastante grandes (millones de copias) de moldes clonales en cada pocillo de reaccion. Los metodos de la invencion permiten al usuario amplificar clonalmente especies de molde genomico monocatenarias mediante reacciones de PCR llevadas a cabo en tubos estandares o en placas de microtitulacion. Pueden mezclar copias unicas de las especies de molde y unirse a perlas de captura, resuspenderse en solucion de amplificacion por PCR completa y emulsionarse en microrreactores (de entre 100 y 200 |im de diametro), despues de lo cual la

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amplificacion por PCR asimetrica genera una amplificacion de 107 veces de la especie de molde inicial. Este procedimiento resulto mucho mas simple y mas economico que los metodos anteriores.

Ejemplo 1: union de acido nucleico molde a perlas de captura

El presente ejemplo describe la preparacion de una poblacion de perlas que preferentemente presenta unicamente un acido nucleico molde unido a las mismas. La amplificacion clonal con exito depende de la administracion de un numero controlado de especies molde (0,5 a 1) en cada perla. La administracion de un exceso de especies puede resultar en la amplificacion por PCR de una poblacion mixta de moldes, evitando la generacion de datos de secuencia con sentido, mientras que una deficiencia de especies resultara en que menos pocillos contendran molde para la secuenciacion. Esto puede reducir el grado de cobertura del genoma proporcionado por la etapa de secuenciacion. En consecuencia, resulta preferente que se determine con exactitud la concentracion de molde mediante cuantificacion replicada y que se siga el protocolo de union tal como se describe de manera general posteriormente.

Control de calidad de los moldes

El exito de la reaccion de PCR en emulsion se relaciona con la calidad de las especies de molde. Con independencia del cuidado y atencion prestados a la etapa de amplificacion, los moldes de mala calidad impediran la amplificacion exitosa y la generacion de datos de secuencia con sentido. Para evitar la perdida innecesaria de tiempo y dinero, resulta importante comprobar la calidad del material de molde antes de iniciar la tapa de PCR en emulsion del procedimiento. Preferentemente, la biblioteca debe pasar dos etapas de control de calidad antes de que se utilice en la PCR en emulsion. Debena determinarse su concentracion y la distribucion de los productos que contiene. Idealmente, la biblioteca debena ser una poblacion heterogenea de fragmentos con pocos o ningun dfmero (por ejemplo ~90 bases) adaptador visible. Ademas, la amplificacion con cebadores de PCR debena resultar en una extension del producto comprendida entre, por ejemplo, 300 y 500 pb. La ausencia de producto de amplificacion podna reflejar la incapacidad de ligar correctamente los adaptadores al molde, mientras que la presencia de una unica banda de cualquier tamano podna reflejar la contaminacion del molde.

Preparacion de la solucion de PCR

La consideracion principal en esta etapa es evitar la contaminacion de la mezcla de reaccion de PCR con amplicones dispersos. La contaminacion de las reacciones de PCR con un amplicon residual es una de las cuestiones cnticas que pueden provocar el fracaso de una secuenciacion. Para reducir la posibilidad de contaminacion, debenan seguirse practicas adecuadas en el laboratorio y la preparacion de la mezcla de reaccion debena llevarse a cabo en una sala limpia en una campana de flujo laminar tratada por UV.

Mezcla de reaccion de PCR

Para 200 |il de mezcla de reaccion de PCR (suficiente para amplificar 600.000 perlas), se combinaron los reactivos siguientes en un tubo de PCR de 0,2 ml:

Tabla 3

Solucion madre Final Microlitros

Tampon HIFI

10X 1X 20

nucleotidos tratados

10 mM 1 mM 20

Mg

50 mM 2 mM 8

BSA

al 10% al 0,1% 2

Tween 80

al 1% al 0,01% 2

Ppasa

2 U 0,003 U 0,333333

Cebador MMP1a

100 |iM 0,625 |iM 1,25

Cebador MMP1b

10 |iM 0,078 |iM 1,56

Polimerasa Taq

5 U 0,2 U 8

Agua

136,6

Total

200

El tubo se agito con vortex intensamente y se almaceno en hielo hasta la hibridacion de las perlas con molde.

Perlas de captura de ADN

1. Se transfirieron 600.000 perlas de captura de ADN desde el tubo de solucion madre hasta un tubo de microcentrifugacion de 1,5 ml. La cantidad exacta utilizada dependfa de la concentracion en perlas de reactivo

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formalizado.

2. Las perlas se peletizaron en una minicentnfuga de laboratorio y se separo el sobrenadante.

3. Se llevaron a cabo las etapas 4 a 11 en una sala limpia de PCR.

4. Las perlas se lavaron con 1 ml de tampon de hibridacion 1X.

5. Las perlas de captura se peletizaron en la microcentnfuga. El tubo se giro 180° y se centrifugo nuevamente.

6. La totalidad excepto 10 |il del sobrenadante se extrajeron del tubo que contema las perlas. Las perlas no resultaron perturbadas.

7. Se anadio 1 ml de tampon de hibridacion 1X y esta mezcla se incubo durante 1 minuto. A continuacion, las perlas se peletizaron tal como en la etapa 5.

8. Se extrajo del tubo la totalidad del material excepto aproximadamente 100 |il.

9. Las perlas restantes y la solucion se transfirieron a un tubo de PCR.

10. El tubo de 1,5 ml se lavo con 150 |il de tampon de hibridacion 1X mediante pipeteado varias veces. Se anadio lo anterior al tubo de PCR que contema las perlas.

11. Las perlas se peletizaron tal como en la etapa 5 y se extrajo la totalidad excepto 10 |il de sobrenadante, procurando no perturbar el pellet de perlas.

12. Se extrajo una alfcuota de ADN molde monocatenario cuantificado (ADNsst). La concentracion final era de 200.000 moleculas de ADNsst/|il.

13. Se anadieron 3 |il del ADNsst diluido al tubo de PCR que contema las perlas. Esto era equivalente a 600.000 copias de ADNsst.

14. El tubo se agito con vortex suavemente para mezclar el contenido.

15. El ADNsst se hibrido a las perlas de captura en un termociclador de PCR con el programa 80Anneal almacenado en la carpeta EPCR del termociclador MJ, utilizando el protocolo siguiente:

• 5 minutos a 65°C,

• reduccion de 0,1°C/s hasta 60°C,

• mantenimiento a 60°C durante 1 minuto,

• reduccion de 0,1°C/s hasta 50°C,

• mantenimiento a 50°C durante 1 minuto,

• reduccion de 0,1°C/s hasta 40°C,

• mantenimiento a 40°C durante 1 minuto,

• reduccion de 0,1°C/s hasta 20°C, y

• mantenimiento a 10°C hasta la etapa siguiente.

En la mayona de casos, las perlas se utilizaron para la amplificacion inmediatamente despues de la union de molde.

En el caso de que las perlas no se utilizaran inmediatamente, debenan almacenarse en la solucion de molde a 4°C

hasta necesitarlas. Tras el almacenamiento, las perlas se trataron de la manera siguiente.

16. Tal como en la etapa 6, las perlas se extrajeron del termociclador, se centrifugaron y se extrajo el tampon de hibridacion sin perturbar las perlas.

17. Las perlas se almacenaron en un cubo de hielo hasta la emulsificacion (Ejemplo 2).

18. Las perlas de captura inclman, de media, 0,5 a 1 copias de ADNsst unido a cada perla, y se encontraban listas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

para la emulsificacion.

Ejemplo 2: emulsificacion

El presente ejemplo describe como crear una emulsion de agua en aceite termoestable que contiene

aproximadamente 3.000 microrreactores de PCR por microlitro. A continuacion se describe de manera general un

protocolo para la preparacion de la emulsion.

1. Se anadieron 200 |il de solucion de PCR a las 600.000 perlas (ambos componentes del Ejemplo 1).

2. La solucion se pipeteo varias veces para resuspender las perlas.

3. Se dejo incubar la mezcla de perlas para PCR a temperatura ambiente durante 2 minutos para equilibrar las perlas con la solucion de PCR.

4. Se anadieron 400 |il de aceite de emulsion a un tubo de microcentnfuga de 2 ml irradiado con UV.

5. Se anadio una barra de agitacion magnetica de 1/4'' “libre de amplicones” al tubo de aceite de emulsion.

Se preparo una barra de agitacion libre de amplicones de la manera siguiente. Se utilizo una barra de agitacion

grande para sostener una barra de agitacion de 1/4''. A continuacion, la barra de agitacion:

• se lavo con DNA-Off (por goteo o por pulverizacion),

• se enjuago con agua picopura,

• se seco con el borde de una toalla de papel Kimwipe, y

• se irradio con UV durante 5 minutos.

6. Se extrajo la insercion magnetica de un soporte de tubos Dynal MPC-S. El tubo de aceite de emulsion se acoplo al soporte para tubos. El tubo se fijo en el centro de una placa de agitacion con el dial a 600 rpm.

7. El tubo se agito con vortex intensamente para resuspender las perlas. Esto garantizo que se produda una agregacion minima de las perlas.

8. Utilizando una pipeta P-200, se anadio gota a gota la mezcla de perlas para PCR al aceite bajo agitacion a una tasa de aproximadamente una gota cada 2 segundos, permitiendo que cada gota bajase hasta el nivel de la barra de agitacion magnetica y se emulsificase antes de anadir la gota siguiente. La solucion se convirtio en un lfquido blanco lechoso homogeneo con una viscosidad similar a la mayonesa.

9. Tras la adicion de la mezcla de perlas para PCR entera, se dieron unos cuantos golpecitos al tubo de microcentnfuga para mezclar cualquier aceite en la superficie de la emulsion lechosa.

10. Se continuo con la agitacion durante 5 minutos mas.

11. Se repitieron las etapas 9 y 10.

12. Se extrajo la barra de agitacion del material emulsificado extrayendolo del tubo con una barra de agitacion mas grande.

13. Se extrajeron 10 |il de la emulsion y se situaron sobre un portaobjetos de microscopfa. Se cubrio la emulsion con un cubreobjetos y se inspecciono la emulsion a una magnificacion de 50X (ocular de 10X y lente objetivo de 5X). Se esperaba que una “buena” emulsion incluyese principalmente perlas individuales en gotas aisladas (microrreactores) de solucion de PCR en aceite.

14. Se preparo una mezcla de aceite en emulsion adecuada con estabilizantes de emulsion, de la manera siguiente. Los componentes de la mezcla en emulsion se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4

Ingrediente

Cantidad requerida Fuente Numero de ref.

Aceite mineral ligero de Sigma

94,5 g Sigma M-5904

Atlox 4912

1 g Uniqema NA

Span 80

4,5 g Uniqema NA

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La mezcla de aceite en emulsion se preparo mediante precalentamiento de Atlox 4912 a 60°C en un bano de agua. A continuacion, se anadieron 4,5 gramos de Span 80 a 94,5 gramos de aceite mineral para formar una mezcla. A continuacion, se anadio a la mezcla un gramo del Atlox 4912 precalentado. Las soluciones se introdujeron en un recipiente cerrado y se mezclaron mediante agitacion e inversion. Cualquier indicio de que Atlox sedimentaba o solidificaba se remedio mediante calentamiento de la mezcla a 60°C, seguido de agitacion adicional.

Ejemplo 3: amplificacion

El presente ejemplo describe la amplificacion del ADN molde en la mezcla en emulsion de perlas. Segun el presente protocolo de la invencion, la duracion de la etapa de amplificacion del ADN del procedimiento es de entre 3 y 4 horas. Tras completar la amplificacion, la emulsion puede dejarse en el termociclador durante 12 horas como maximo antes de iniciar el procedimiento de aislamiento de las perlas. Se llevo a cabo el termociclado de PCR introduciendo 50 a 100 |il de la mezcla de reaccion emulsificada en camaras de reaccion PCR individuales (es decir, tubos para PCR). Se llevo a cabo la PCR de la manera siguiente:

1. Se transfirio la emulsion en cantidades de entre 50 y 100 |il a aproximadamente 10 tubos para PCR

individuales o a una placa de 96 pocillos utilizando una unica punta de pipeta. Para esta etapa, la emulsion de

agua en aceite era altamente viscosa.

2. Se sello la placa, o se cerraron los tubos para PCR con los tapones, y los recipientes se introdujeron en un termociclador MJ con o sin adaptador de placa de 96 pocillos.

3. El termociclador de PCR se programo para que ejecutase el programa siguiente:

• 1 ciclo (4 minutos a 94°C) - inicio en caliente,

• 40 ciclos (30 segundos a 94°C, 30 segundos a 58°C, 90 segundos a 68°C),

• 25 ciclos (30 segundos a 94°C, 6 minutos a 58°C), y

• almacenamiento a 14°C.

4. Tras completar la reaccion de PCR, el material amplificado se extrajo con el fin de llevar a cabo la rotura de la emulsion y la recuperacion de las perlas.

Ejemplo 4: rotura de la emulsion y recuperacion de las perlas

El presente ejemplo describe como romper la emulsion y recuperar las perlas con molde amplificado sobre las mismas. Preferentemente, la emulsion posterior a la PCR debe seguir intacta. La fase inferior de la emulsion debena, segun la inspeccion visual, seguir siendo una suspension blanca lechosa. En el caso de que la solucion se transparente, la emulsion podna haberse resuelto parcialmente en sus fase acuosas y aceitosa, y probablemente muchas de las perlas presentaran una mezcla de moldes. En el caso de que la emulsion se haya roto en uno o dos de los tubos, estas muestras no debenan agruparse con las demas. En el caso de que la emulsion se haya roto en todos los tubos, no debena continuarse el procedimiento.

1. Todas las reacciones de PCR a partir de la muestra original de 600 |il se agruparon en un unico tubo de microcentrifugacion de 1,5 ml utilizando una unica punta de pipeta. Tal como se ha indicado anteriormente, la emulsion era bastante viscosa. En algunos casos, se repitio el pipeteado varias veces para cada tubo. Se transfirio la maxima cantidad posible de material al tubo de 1,5 ml.

2. El material emulsificado restante se recupero de cada tubo para PCR mediante la adicion de 50 |il de aceite mineral Sigma en cada muestra. Utilizando una unica punta de pipeta, se mezclo cada tubo mediante pipeteado varias veces para resuspender el material restante.

3. Este material se anadio al tubo de 1,5 ml que contema la mayor parte del material emulsificado.

4. La muestra se agito con vortex durante 30 segundos.

5. La muestra se agito durante 20 minutos en el tubo de microcentnfuga de laboratorio a 13,2 Krpm en la microcentnfuga Eppendorf.

6. La emulsion se separo en dos fases con una gran interfase blanca. Se extrajo la maxima cantidad posible de la fase superior de aceite transparente. El material turbio se dejo en el tubo. Con frecuencia, una capa blanca separaba las capas aceitosa y acuosa. Con frecuencia se observaron perlas peletizadas en el fondo del tubo.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7. Se elimino la capa acuosa en la parte superior de las perlas y se guardo para su analisis (analisis en gel, Agilent 2100, y Taqman). En el caso de que persistiese una interfase de material blanco en la parte superior de la capa acuosa, se extrafan 20 microlitros de la capa acuosa subyacente. Esto se llevo a cabo atravesando el material de la interfase con una punta de pipeta y succionando la solucion de la parte inferior.

8. En la campana de humos de la sala de fabricacion de PTP y de qmmica superficial, se anadio 1 ml de hexanos al resto de la emulsion.

9. La muestra se agito con vortex durante 1 minuto y se centrifugo a velocidad maxima durante 1 minuto.

10. En la campana de humos de la sala de fabricacion de PTP y qmmica superficial, se extrajo la fase superior de aceite/hexano y se introdujo en el recipiente para residuos organicos.

11. Se anadio 1 ml de tampon de hibridacion 1X en etanol al 80% a la fase acuosa restante, interfase y perlas.

12. La muestra se agito con vortex durante 1 minuto o hasta la disolucion de la sustancia blanca.

13. La muestra se centrifugo durante 1 minuto a alta velocidad. El tubo se hizo girar 180 grados y se centrifugo nuevamente durante 1 minuto. Se extrajo el sobrenadante sin perturbar el pellet de perlas.

14. Las perlas se lavaron con 1 ml de tampon de hibridacion 1X que contema Tween-20 al 0,1% y se repitio esta etapa.

Ejemplo 5: extraccion de cadenas unicas e hibridacion de cebadores

En el caso de que las perlas deban utilizarse en una reaccion de secuenciacion basada en pirofosfato, resulta

necesario eliminar la segunda cadena del producto de PCR e hibridar un cebador de secuenciacion al molde de una

sola cadena que se encuentra unido a la perla. El presente ejemplo describe un protocolo para llevar a cabo lo

anterior.

1. Las perlas se lavaron con 1 ml de agua y se centrifugaron dos veces durante 1 minuto. El tubo se hizo girar 180° entre centrifugaciones. Tras la centrifugacion, se elimino la fase acuosa.

2. Las perlas se lavaron con 1 ml de EDTA 1 mM. El tubo se centrifugo tal como en la etapa 1 y se elimino la fase acuosa.

3. Se anadio 1 ml de NaOH 0,125 M y se incubo la muestra durante 8 minutos.

4. La muestra se agito con vortex brevemente y se introdujo en una microcentnfuga.

5. Tras 6 minutos, las perlas se peletizaron tal como en la etapa 1 y se elimino la maxima cantidad posible de solucion.

6. Al completarse la incubacion de 8 minutos con NaOH, se anadio 1 ml de tampon de hibridacion 1X.

7. La muestra se agito con vortex brevemente, y las perlas se peletizaron tal como en la etapa 1. Se elimino la maxima cantidad posible de sobrenadante y se anadio 1 ml adicional de tampon de hibridacion 1X.

8. La muestra se agito con vortex brevemente, las perlas se peletizaron tal como en la etapa 1, y se extrajeron 800 |il de tampon de hibridacion 1X.

9. Las perlas se transfirieron a un tubo para PCR de 0,2 ml.

10. Las perlas se transfirieron y se elimino la maxima cantidad posible de tampon de hibridacion, sin perturbar las perlas.

11. Se anadieron 100 |il de tampon de hibridacion 1X.

12. Se anadieron 4 |il de cebador de secuenciacion 100 |iM. La muestra se agito con vortex inmediatamente antes de la hibridacion.

13. La hibridacion se llevo a cabo en un termociclador MH utilizando el programa “80Anneal”.

14. Las perlas se lavaron tres veces con 200 |il de tampon de hibridacion 1X y se resuspendieron con 100 |il de tampon de hibridacion 1X.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

15. Las perlas se contaron en un hemocitometro Hausser. Tfpicamente se recuperaron entre 300.000 y 500.000 perlas (3.000 a 5.000 perlas/|il).

16. Las perlas se almacenaron a 4°C y podnan utilizarse para la secuenciacion durante 1 semana.

Ejemplo 6: etapa opcional de enriquecimiento

Las perlas se enriquecieron para perlas que contienen amplicon utilizando el procedimiento siguiente. El enriquecimiento no resulta necesario, pero podna utilizarse para hacer mas eficientes tecnicas posteriores de biologfa molecular, tales como la secuenciacion de ADN.

Se anadieron cincuenta microlitros de cebador de secuenciacion-biotina 10 |iM (total: 500 pmoles) a las perlas de sefarosa que contema amplicones del Ejemplo 5. Las perlas se introdujeron en un termociclador. El cebador fue hibridado con el ADN en la perla por el programa de hibridacion del termociclador del Ejemplo 2.

Tras la hibridacion, las perlas de sefarosa se lavaron tres veces con tampon de hibridacion que contema Tween-20 al 0,1%. Las perlas, que ahora contienen fragmentos de ADNss hibridados con cebadores de secuenciacion-biotina, se concentraron mediante centrifugacion y se resuspendieron en 200 |il de tampon de union BST. Se anadieron 10 microlitros de 50.000 unidades/ml de polimerasa Bst a las perlas resuspendidas y se introdujo el recipiente que contema las perlas en un agitador durante cinco minutos. Se anadieron dos microlitros de mezcla de dNTP 10 mM (es decir, 2,5 |il de cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP 10 mM) y la mezcla se incubo durante 10 minutos adicionales a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron tres veces con tampon de hibridacion que contema Tween-20 al 0,1% y se resuspendieron en el volumen original de tampon de hibridacion.

Cincuenta microlitros de perlas Dynal recubiertas de estreptavidina (Dynal Biotech INc., Lake Success, NY; perlas M270 o MyOneTM a una concentracion de 10 mg/ml) se lavaron tres veces con tampon de hibridacion que contema Tween-20 al 0,1% y se resuspendieron en el volumen original de tampon de hibridacion que contema Tween-20 al 0,1%. A continuacion, se anadio la mezcla de perlas Dynal a las perlas de sefarosa resuspendidas. La mezcla se agito con vortex y se introdujo en un agitador durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Las perlas se recogieron en el fondo del tubo de ensayo mediante centrifugacion a 2.300 g (500 rpm para la centnfuga Eppendorf 5415D). Las perlas se resuspendieron en el volumen original de tampon de hibridacion que contema Tween-20 al 0,1%. La mezcla, en un tubo de ensayo, se introdujo en un separador magnetico (Dynal). Las perlas se lavaron tres veces con tampon de hibridacion que contema Tween-20 al 0,1% y se resuspendieron en el volumen original en el mismo tampon. Las perlas sin amplicones se eliminaron mediante etapas de lavado, tal como se ha indicado anteriormente. Unicamente se retuvieron las perlas de sefarosa que conteman los fragmentos de ADN apropiados.

Las perlas magneticas se separaron de las perlas de sefarosa mediante la adicion de 500 |il de NaOH 0,125 M. La mezcla se agito con vortex y se separaron las perlas magneticas mediante separacion magnetica. Las perlas de sefarosa que quedaban en solucion se transfirieron a otro tubo y se lavaron con 400 |il de Tris-acetato 50 mM hasta estabilizar el pH a 7,6.

Ejemplo 7: secuenciacion de acidos nucleicos mediante PCR en emulsion de perlas

Se llevo a cabo el experimento siguiente para someter a ensayo la eficacia de la PCR en emulsion de perlas. Para el presente protocolo, se unieron covalentemente 600.000 perlas de sefarosa, con un diametro medio de entre 25 y 35 |im (tal como son suministradas por el fabricante) a cebadores de captura a una proporcion de 30 a 50 millones de

copias por perla. Las perlas con cebadores de captura covalentemente unidos se mezclaron con 1,2 millones de

copias de ADN monocatenario de una biblioteca de adenovirus. Los constructos de biblioteca inclrnan una secuencia que era complementaria al cebador de captura en las perlas.

La biblioteca de adenovirus se hibrido a las perlas utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. A

continuacion, las perlas se resuspendieron en solucion de PCR completa. La solucion de PCR y las perlas se

emulsionaron en 2 volumenes de aceite de emulsificacion bajo centrifugacion utilizando el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 2. Las perlas emulsificadas (encapsuladas) se sometieron a amplificacion mediante PCR tal como se indica de manera general en el Ejemplo 3. La emulsion se rompio tal como se indica de manera general en el Ejemplo 4. El ADN en las perlas se separo en cadenas individuales, y se hibrido cebador de secuenciacion utilizando el procedimiento del Ejemplo 5.

A continuacion, se secuenciaron 70.000 perlas simultaneamente mediante secuenciacion basada en pirofosfato utilizando un secuenciador pirofosfato de 454 Life Sciences (New Haven, CT) (ver solicitud copendiente de Lohman et al., presentada simultaneamente con la presente, titulada “Methods of Amplifying and Sequencing Nucleic Acids”, USSN 60/476, presentada el 6 de junio de 2003). Se secuenciaron multiples lotes de 70.000 perlas y los datos se proporcionan en la Tabla 5, a continuacion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Tabla 5

Tolerancia de error de alineacion

Alineaciones Cobertura Error de lectura inferido

Ninguna

Individual Multiple Unica

0%

47.916 1.560 1.110 54,98% 0,00%

5%

46.026 3.450 2.357 83,16% 1,88%

10%

43.474 6.001 1 3.742 95,64% 4,36%

La Tabla 5 muestra los resultados obtenidos del analisis BLAST de comparacion de las secuencias obtenidas del secuenciador pirofosfato con la secuencia de adenovirus. La primera columna muestra la tolerancia de error utilizada en el programa BLAST. La ultima columna muestra el error real determinado mediante comparacion directa con la secuencia conocida.

PCR EN EMULSION DE PERLAS PARA LA SECUENCIACION DESDE DOS EXTREMOS

Ejemplo 8: control de calidad de moldes

Tal como se ha indicado anteriormente, se ha encontrado que el exito de la reaccion de PCR en emulsion se relaciona con la calidad de la especie molde monocatenaria. Por consiguiente, la calidad del material de molde se evaluo mediante dos controles de calidad independientes antes de iniciar el protocolo de PCR en emulsion. En primer lugar, se corrio una alfcuota del molde monocatenario en el 2100 BioAnalyzer (Agilient). Se utilizo un PicoChip de ARN para verificar que la muestra inclrna una poblacion heterogenea de fragmentos, de tamano comprendido entre aproximadamente 200 y 500 bases. En segundo lugar, se cuantifico la biblioteca utilizando el ensayo de fluorescencia RiboGreen en un fluonmetro de placas Bio-Tek FL600. Las muestras que se determino que presentaban concentraciones de ADN inferiores a 5 ng/|il se consideraron excesivamente diluidas para ser utilizadas.

Ejemplo 9: sintesis de perlas de captura de ADN

Se extrajeron de la columna perlas empaquetadas de una columna de afinidad HP de sefarosa activada con 1 ml de N-hidroxisuccinimida (NHS) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Las perlas de tamano comprendido entre 30 y 25 |im se seleccionaron mediante pase seriado a traves de secciones de filtro de malla de 30 y 25 |im de poro (Sefar America, Depew, NY, USA). Las perlas que pasaron a traves del primer filtro, pero que resultaron retenidas por el segundo se recogieron y se activaron tal como se describe en la literatura del producto (Amersham Pharmacia n° de protocolo 71700600AP). Se obtuvieron dos cebadores de captura largos diferentes marcados con amina HEG (hexaetilenglicol), correspondientes al extremo 5' de las cadenas sentido y antisentido del molde que debfa amplificarse (espaciadores 5'-amina-3-HEG gcttacctgaccgacctctgcctatcccctgttgcgtgtc-3'; SEC ID n° 1, y espaciadores 5'-amina-3-HEG ccattccccagctcgtcttgccatctgttccctccctgtc-3'; SEC ID n° 2) (IDT Technologies, Coralville, IA, USA). Se disenaron los cebadores para capturar ambas cadenas de los productos de amplificacion. Los cebadores de captura se disolvieron en tampon fosfato 20 mM, pH 8,0, para obtener una concentracion final de 1 mM. Se unieron tres microlitros de cada cebador a las perlas tamizadas de entre 30 y 25 |im. A continuacion, las perlas se almacenaron en un tampon de almacenamiento de perlas (Tris 50 mM, Tween al 0,02% y azida sodica al 0,02%, pH 8). Las perlas se cuantificaron con un hemocitometro (Hausser Scientific, Horsham, PA, USA) y se almacenaron a 4°C hasta su utilizacion.

Ejemplo 10: preparacion y formulacion de mezcla de reaccion PCR

Al igual que con cualquier tecnica de amplificacion de moleculas individuales, la contaminacion de las reacciones con amplicones foraneos o residuales procedentes de otros experimentos podna interferir con una secuenciacion. Para reducir la probabilidad de contaminacion, se preparo la mezcla de reaccion de PCR en una campana de flujo laminar tratada con UV situada en una sala limpia para PCR. Por cada reaccion de PCR en una emulsion de 600.000 perlas se mezclaron en un tubo de 1,5 ml los reactivos siguientes: 225 |il de mezcla de reaccion (tampon HiFi Platinum 1X (Invitrogen), dNTPs 1 mM, MgSO4 2,5 mM (Invitrogen), BSA al 0,1%, Tween al 0,01%, 0,003 U/|il de PPi-asa termoestable (NEB), 0,125 |iM de cebador directo (5'-gcttacctgaccgacctctg-3'; SEC ID n° 3) y 0,125 |iM de cebador inverso (5'-ccattccccagctcgtcttg-3'; SEC ID n° 4) (IDT Technologies, Coralville, IA, USA) y 0,2 U/|il de polimerasa Taq Hi-Fi Platinum 0,2 U/|il (Invitrogen). Se extrajeron veinticinco microlitros de la mezcla de reaccion y se almacenaron en un tubo individual para PCR de 200 |il para la utilizacion como control negativo. Se almacenaron en hielo tanto la mezcla de reaccion como los controles negativos hasta la utilizacion.

Ejemplo 11: union de especies de molde a perlas de captura de ADN

La amplificacion clonal con exito del ADN para la secuenciacion se refiere al transporte de un numero controlado de especies de molde hasta cada perla. Para los experimentos descritos posteriormente en la presente memoria, se determino que la concentracion de molde diana tipica era de 0,5 copias de molde por perla de captura. A esta concentracion, la distribucion de Poisson dicta que 61% de las perlas no presentan molde asociado, que 30%

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

presentan una especie de molde y 9% presenta dos o mas especies de molde. El transporte de un exceso de especies puede resultar en la union y posterior amplificacion de una poblacion mixta (2 o mas especies) en una perla individual, evitando la generacion de datos de secuencia con sentido. Sin embargo, el transporte de un numero excesivamente bajo de especies resultara en menos pocillos que contengan molde (una especie por perla), reduciendo el grado de cobertura de la secuenciacion. En consecuencia, se considero que era importante la concentracion de molde de la biblioteca monocatenaria.

Se hibridaron moleculas de acidos nucleicos de molde a cebadores complementarios en las perlas de captura de ADN mediante el metodo siguiente, puesto en practica en una campana de flujo laminar tratada con UV. Se transfirieron a un tubo para PCR de 200 |il seis cientas mil perlas de captura de ADN suspendidas en tampon de almacenamiento de perlas (ver el Ejemplo 9, anteriormente). El tubo se centrifugo en una minicentnfuga de laboratorio durante l0 segundos, se hicieron girar 180° y se centrifugaron durante 10 segundos adicionales para garantizar una formacion uniforme del pellet. Se extrajo el sobrenadante y las perlas se lavaron con 200 |il de tampon de hibridacion (Tris 20 mM, pH 7,5 y acetato de magnesio 5 mM). El tubo se agito con vortex durante 5 segundos para resuspender las perlas, y las perlas se peletizaron tal como se ha indicado anteriormente. Se extrajo la totalidad menos 10 |il del sobrenadante en la parte superior de las perlas, y se anadieron 200 |il adicionales de tampon de hibridacion. Las perlas se agitaron con vortex nuevamente durante 5 segundos, se dejaron reposar durante 1 minuto y despues se peletizaron tal como se ha indicado anteriormente. Se descarto la totalidad menos 10 |il del sobrenadante.

A continuacion, se anadieron a las perlas 1,5 |il de 300.000 moleculas/^l de biblioteca de moldes. El tubo se agito con vortex durante 5 segundos para mezclar el contenido y los moldes se hibridaron a las perlas en un programa de desnaturalizacion/hibridacion controlada en un termociclador MJ. El programa permitio la incubacion durante 5 minutos a 80°C, seguido de una reduccion de 0,1°C/s hasta 70°C, la incubacion durante 1 minuto a 70°C, la reduccion de 0,1°C/s hasta 60°C, el mantenimiento a 60°C durante 1 minuto, la reduccion de 0,1°C/s hasta 50°C, el mantenimiento a 50°C durante 1 minuto, la reduccion de 0,1°C/s hasta 20°C y el mantenimiento a 20°C. Tras completar el procedimiento de hibridacion, se extrajeron las perlas del termociclador, se centrifugaron tal como se ha indicado anteriormente y se decanto cuidadosamente el tampon de hibridacion. Las perlas de captura inclrnan, de media, 0,5 copias de ADN molde monocatenario unido a cada perla, y se almacenaron en hielo hasta que fueron utilizadas.

Ejemplo 12: emulsificacion

El procedimiento de emulsificacion crea una emulsion termoestable de agua en aceite que contiene 10.000 microrreactores de PCR discretos por microlitro. Esta sirve como matriz para la amplificacion clonal de las moleculas individuales de la biblioteca de dianas. La mezcla de reaccion y las perlas de captura de ADN para una unica reaccion se emulsificaron de la manera siguiente. En una campana de flujo lamina tratada con UV, se anadieron 200 |il de solucion para PCR (del Ejemplo 10) al tubo que contema 600.000 perlas de captura de ADN (del Ejemplo 11). Las perlas se resuspendieron mediante pipeteado repetido. A continuacion, se incubo la mezcla de perlas para PCR a temperatura ambiente durante por lo menos 2 minutos, permitiendo que las perlas se equilibrasen con la solucion de PCR. Simultaneamente, 450 |il de aceite de emulsion (Span 80 al 4,5% (p/p), Atlox 4912 al 1% (p/p) (Uniqema, Delaware) en aceite mineral ligero (Sigma)) se dividio en alfcuotas en un tubo de centnfuga de 2 ml de tapon plano (Dot Scientific) que contema una barra de agitacion magnetica de % pulgada esteril (Fischer). Este tubo seguidamente se introdujo en un dispositivo de soporte de tubos de plasticos disenado al efecto, que despues se centro en una placa caliente de agitacion digital Fisher Isotemp (Fisher Scientific) con el dial fijo en 450 rpm.

La solucion de perlas para PCR se agito con vortex durante 15 segundos para resuspender las perlas. A continuacion, la solucion se aspiro en una jeringa plastica desechable de 1 ml (Benton, Dickinson) acoplada a una aguja de jeringa de seguridad de plastico (Henry Schein). La jeringa se introdujo en una bomba de jeringa (Cole- Parmer) modificada con una unidad de base de aluminio que orientaba la bomba verticalmente y no horizontalmente (por ejemplo figuras 4 a 6). El tubo con el aceite en emulsion se alineo con la placa de agitacion de manera que se encontrase centrado bajo la aguja de la jeringa de plastico y la barra de agitacion magnetica girase correctamente. Se fijo la bomba de jeringa para que dispensase 0,6 ml a una tasa de 5,5 ml/hora. Se anadio la solucion de perlas para PCR al aceite en emulsion gota a gota. Se procuro garantizar que las gotas no entrasen en contacto con las paredes del tubo a medida que cafan en el aceite en rotacion.

Tras la formacion de la emulsion, se procuro minimizar la agitacion de la emulsion tanto durante el procedimiento de emulsificacion como durante las etapas de division en alfcuotas posteriores a la emulsificacion. Se encontro que la agitacion con vortex, el pipeteado rapido o la mezcla excesiva podfan provocar la rotura de la emulsion, destruyendo los microrreactores discretos. Durante la formacion de la emulsion, las dos soluciones se convirtieron en mezclas blancas lechosas homogeneas con la viscosidad de la mayonesa. Se vacio el contenido de la jeringa en el aceite en rotacion. A continuacion, se retiro el tubo de emulsion del dispositivo de soporte y se golpeo suavemente con los dedos hasta desaparecer cualquier capa de aceite residual en la parte superior de la emulsion. Se coloco nuevamente el tubo en el dispositivo de soporte y se agito utilizando la barra de agitacion magnetica durante un minuto adicional. Se saco la barra de agitacion de la emulsion pasando una herramienta de extraccion magnetica

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por el exterior del tubo, y se descarto.

Se extrajeron veinte microlitros de la emulsion procedentes de la parte intermedia del tubo mediante la utilizacion de un pipeteador P100 y se pusieron sobre un portaobjetos de microscopfa. Se utilizaron las puntas de pipeta mas grandes para minimizar las fuerzas de cizalla. Se inspecciono la emulsion a una magnificacion de 50X para comprobar que comprendfa predominantemente perlas individuales en microrreactores de solucion para PCR en aceite de 30 a 150 micrometros de diametro (figura 7). Tras el examen visual, se amplificaron inmediatamente las emulsiones.

Ejemplo 13: amplificacion

La emulsion se dividio en alfcuotas en 7 a 8 tubos para PCR separados. Cada tubo inclma aproximadamente 75 |il de la emulsion. Se sellaron los tubos y se introdujeron en un termociclador MJ conjuntamente con los 25 |il de control negativo indicados anteriormente. Se utilizaron los tiempos de ciclado siguientes: 1 ciclo de incubacion durante 4 minutos a 94°C (inicio en caliente), 30 ciclos de incubacion durante 30 segundos a 94°C y 150 segundos a 68°C (amplificacion), y 40 ciclos de incubacion durante 30 segundos a 94°C, y 360 segundos a 68°C (hibridacion y extension). Tras completar el programa de PCR, se extrajeron los tubos y se rompieron inmediatamente las emulsiones o se almacenaron las reacciones a 10°C durante como maximo 16 horas antes de iniciar el procedimiento de rotura.

Ejemplo 14: rotura de la emulsion y recuperacion de las perlas

Tras la amplificacion, se examinaron las emulsiones para rotura (separacion de las fases de aceite y de agua). Las emulsiones no rotas se agruparon en un unico tubo de microcentrifugacion de 1,5 ml, mientras que las emulsiones rotas, encontradas ocasionalmente, se descartaron. Debido a que las muestras de emulsion eran bastante viscosas, quedaron cantidades significativas en cada tubo para PCR. La emulsion que quedaba en los tubos se recupero mediante la adicion de 75 |il de aceite mineral en cada tubo para PCR y el pipeteado de esta mezcla. La mezcla se anadio al tubo de 1,5 ml que contema la mayor parte del material emulsificado. A continuacion, se agito con vortex el tubo de 1,5 ml durante 30 segundos. Seguidamente, el tubo se centrifugo durante 20 minutos en la microcentnfuga de laboratorio a 13,2 Krpm (velocidad maxima).

Tras la centrifugacion, la emulsion se separo en dos fases con una gran interfase blanca. La fase aceitosa transparente en la parte superior se descarto, mientras que el material turbio de interfase se dejo en el tubo. En una campana de humos qmmica, se anadio 1 ml de hexanos a la fase inferior y a la capa de interfase. La mezcla se agito con vortex durante 1 minuto y se centrifugo a velocidad maxima durante 1 minuto en una microcentnfuga de laboratorio. La fase superior de aceite/hexano se extrajo y se descarto. A continuacion, se anadio 1 ml de etanol al 80%/tampon de hibridacion 1X a la fase acuosa, interfase y perlas restantes. Esta mezcla se agito con vortex durante 1 minuto o hasta que el material blanco de la interfase se hubiese disuelto. Seguidamente la muestra se centrifugo en una microcentnfuga de laboratorio durante 1 minuto a velocidad maxima. Se giro el tubo 180 grados y se centrifugo nuevamente durante un minuto adicional. A continuacion, se extrajo cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el pellet de perlas.

El pellet blanco de perlas se lavo dos veces con 1 ml de tampon de hibridacion que contema Tween-20 al 0,1%. Se descarto la solucion de lavado y las perlas se peletizaron despues de cada lavado tal como se ha indicado anteriormente. El pellet se lavo con 1 ml de agua picopura. Las perlas se peletizaron mediante el metodo de centrifugacion-giro-centrifugacion utilizado anteriormente. Se extrajo cuidadosamente la fase acuosa. Seguidamente se lavaron las perlas con 1 ml de EDTA 1 mM tal como se ha indicado anteriormente, excepto que las perlas se agitaron con vortex brevemente a una velocidad intermedia durante 2 segundos antes de peletizar y retirar el sobrenadante.

El ADN amplificado, inmovilizado sobre las perlas de captura, se sometio a tratamiento para obtener ADN monocatenario. Se extrajo la segunda cadena mediante incubacion en una solucion de disociacion basica. Posteriormente se anadio a las perlas un ml de solucion de disociacion (NaOH 0,125 M, NaCl 0,2 M). El pellet se resuspendio mediante agitacion con vortex a velocidad intermedia durante 2 segundos y el tubo se introdujo en un agitador orbital para tubos Thermolyne LabQuake durante 3 minutos. A continuacion, las perlas se peletizaron tal se ha indicado como anteriormente, y se extrajo cuidadosamente el sobrenadante y se descarto. La solucion residual de disociacion se neutralizo mediante la adicion de 1 ml de tampon de hibridacion. Seguidamente, las perlas se agitaron con vortex a velocidad intermedia durante 2 segundos. Las perlas se peletizaron y el sobrenadante se extrajo tal como se ha indicado anteriormente. Se repitio el lavado con tampon de hibridacion, excepto en que unicamente se extrajeron 800 |il del tampon de hibridacion tras la centrifugacion. Las perlas y el tampon de hibridacion remanente se transfirieron a un tubo para PCR de 0,2 ml. Las perlas se utilizaron inmediatamente o se almacenaron a 4°C durante, como maximo, 48 horas antes de continuar con el procedimiento de enriquecimiento.

Ejemplo 15: enriquecimiento en perlas

La masa de perlas inclma perlas sin cadenas de ADN inmovilizadas amplificadas, y perlas vacfas o nulas. Tal como

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se ha indicado anteriormente, se calculo que 61% de las perlas no presentaba ADN molde durante el procedimiento de amplificacion. Se realizo un enriquecimiento para aislar selectivamente las perlas que presentaban ADN molde, maximizando de esta manera la eficiencia de la secuenciacion. A continuacion, se describe el procedimiento de enriquecimiento en detalle.

Las perlas con ADN monocatenario del Ejemplo 14 se peletizaron mediante el metodo de centrifugacion-giro- centrifugacion y se extrajo la maxima cantidad posible de sobrenadante sin perturbar las perlas. Se anadieron quince microlitros de tampon de hibridacion a las perlas, seguido de 2 |il de cebador de enriquecimiento de 40 bases biotinilado 100 |iM (espaciadores 5'-biotina-tetraetilenglicol ccattccccagctcgtcttgccatctgttccctccctgtctcag-3'; SEC ID n° 5). El cebador era complementario a la combinacion de sitios de amplificacion y secuenciacion (cada uno de 20 bases de longitud) en el extremo 3' del molde inmovilizado en una perla. La solucion se mezclo con vortex a velocidad intermedia durante 2 segundos, y los cebadores de enriquecimiento se hibridaron a las cadenas de ADN inmovilizadas utilizando un programa de desnaturalizacion/hibridacion controladas en un termociclador MJ. El programa consistfa de los tiempos de ciclado y temperaturas siguientes: incubacion durante 30 segundos a 65°C, reduccion de 0,1°C/s hasta 58°C, incubacion durante 90 segundos a 58°C, y mantenimiento a 10°C.

Aunque los cebadores se hibridaban, se resuspendieron las perlas recubiertas de estreptavidina Dynal MyOneTM haciendo girar suavemente los tubos. A continuacion, se anadieron 20 |il de las perlas MyOneTM a un tubo de microcentnfuga de 1,5 ml que contema 1 ml de lfquido potenciador (NaCl 2 M, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5). La mezcla de perlas MyOne se agito con vortex durante 5 segundos y el tubo se introdujo en un iman MPC-S de Dynal. Las perlas paramagneticas se peletizaron contra las paredes del tubo de microcentnfuga. Se extrajo cuidadosamente el sobrenadante y se descarto sin perturbar las perlas MyOneTM. Se retiro el tubo del iman y se anadieron 100 |il de lfquido potenciador. El tubo se agito con vortex durante 3 segundos para resuspender las perlas y se almaceno en hielo hasta su utilizacion.

Tras completar el programa de hibridacion, se anadieron 100 |il de tampon de hibridacion al tubo para PCR que contema las perlas de captura de ADN y el cebador de enriquecimiento. El tubo se agito con vortex durante 5 segundos y el contenido se transfirio a un tubo fresco de microcentnfuga de 1,5 ml. El tubo para PCR en el que se hibridaba el cebador de enriquecimiento con las perlas de captura se lavo una vez con 200 |il de tampon de hibridacion, y se anadio la solucion de lavado al tubo de 1,5 ml. Las perlas se lavaron tres veces con 1 ml de tampon de hibridacion, se agitaron con vortex durante 2 segundos y se peletizaron tal como se ha indicado anteriormente. Se extrajo cuidadosamente el sobrenadante. Tras el tercer lavado, las perlas se lavaron dos veces con 1 ml de lfquido potenciador helado. Las perlas se agitaron con vortex, se peletizaron y se extrajo el sobrenadante tal como se ha indicado anteriormente. Las perlas se resuspendieron en 150 |il de liquido potenciador helado. El lfquido potenciador y la solucion de perlas se anadieron a las perlas MyOne™ lavadas.

La mezcla de perlas se agito con vortex durante 3 segundos y se incubo a temperatura ambiente durante 3 minutos en un agitador orbital para tubos LabQuake. Las perlas MyOne™ recubiertas de estreptavidina se unieron a los cebadores de enriquecimiento biotinilados que se encontraban hibridados a moldes inmovilizados en las perlas de captura de ADN. A continuacion, las perlas se centrifugaron a 2.000 rpm durante 3 minutos, despues de lo cual se agitaron con vortex aplicando pulsos de 2 segundos hasta la resuspension. Las perlas resuspendidas se dejaron sobre hielo durante 5 minutos. Seguidamente, se anadieron 500 |il de lfquido potenciador fno a las perlas y el tubo se inserto en un iman MPC-S de Dynal. Las perlas se dejaron en reposo durante 60 segundos, para permitir que se produjese la peletizacion contra el iman. A continuacion, se retiro cuidadosamente el sobrenadante con exceso de MyOne™ y perlas de captura de ADN nulas y se descarto.

El tubo se saco del iman MPC-S y se anadio 1 ml de lfquido potenciador fno a las perlas. Las perlas se resuspendieron con golpecitos suaves de los dedos. Resultaba importante no someter a agitacion con vortex a las perlas en este punto, debido a que la mezcla vigorosa podna romper el enlace entre las perlas MyOne™ y las perlas de captura de ADN. Se devolvieron las perlas al iman y se elimino el sobrenadante. Este lavado se repitio tres veces mas para garantizar la eliminacion de todas las perlas de captura nulas. Para extraer los cebadores de enriquecimiento hibridados y las perlas MyOne™, las perlas de captura de ADN se resuspendieron en 400 |il de solucion de disociacion, se agitaron con vortex durante 5 segundos y se peletizaron con el iman. El sobrenadante con las perlas enriquecidas se transfirio a un tubo de microcentnfuga de 1,5 ml separado. Para la maxima recuperacion de perlas enriquecidas, se anadio al tubo que contema las perlas MyOneTM una segunda alfcuota de 400 |il de solucion de disociacion. Las perlas se agitaron con vortex y se peletizaron tal como se ha indicado anteriormente. Se extrajo el sobrenadante del segundo lavado y se agrupo con el primer bolo de perlas enriquecidas. El tubo de perlas MyOne™ ya utilizadas se descarto.

El tubo de microcentnfuga de perlas de captura de ADN enriquecidas se introdujo en el iman MPC-S de Dynal para peletizar cualquier perla MyOne™ residual. Las perlas enriquecidas en el sobrenadante se transfirieron a un segundo tubo de microcentnfuga de 1,5 ml y se centrifugaron. Se retiro el sobrenadante y las perlas se lavaron 3 veces con 1 ml de tampon de hibridacion para neutralizar la solucion residual de disociacion. Tras el tercer lavado, se extrajeron 800 |il del sobrenadante, y las perlas y solucion remanentes se transfirieron a un tubo para PCR de 0,2 ml. Las perlas enriquecidas se centrifugaron a 2.000 rpm durante 3 minutos y se decanto el sobrenadante. A

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continuacion, se anadieron 20 |il de tampon de hibridacion y 3 |il de dos cebadores de secuenciacion 100 |iM diferentes (5'-ccatctgttccctccctgtc-3'; SEC ID n° 6, y 5'-cctatccctgttgcgtgtc-3' fosfato; SEC ID n° 7). El tubo se agito con vortex durante 5 segundos y se introdujo en un termociclador MJ para someterlo al programa de hibridacion en 4 etapas siguiente: incubacion durante 5 minutos a 65°C, reduccion de 0,1°C/s hasta 50°C, incubacion durante 1 minuto a 50°C, reduccion de 0,1°C/s hasta 40°C, mantenimiento a 40°C durante 1 minuto, reduccion de 0,1°C/s hasta 15°C y mantenimiento a 15°C.

Tras completar el programa de hibridacion, se extrajeron las perlas del termociclador y se peletizaron mediante centrifugacion durante 10 segundos. Se hizo girar el tubo 180° y se centrifugo durante 10 segundos adicionales. Se decanto el sobrenadante y se descarto, y se anadieron 200 |il de tampon de hibridacion al tubo. Las perlas se resuspendieron con una segunda agitacion con vortex de 5 segundos y se peletizaron tal como se ha indicado anteriormente. Se extrajo el sobrenadante y las perlas se resuspendieron en 100 |il de tampon de hibridacion. En este punto se cuantificaron las perlas utilizando un contador Coulter Multisizer 3 (Beckman Coulter). Las perlas se almacenaron a 4°C y fueron estables durante por lo menos 1 semana.

LISTADO DE SECUENCIA

<110> Berka, Jan

Chen, Yi-Ju

Leamon, John H.

Lefkowitz, Steve

Lohman, Kenton

Makhijani, Vinod

Sarkis, Gary J.

Rothberg, Jonathan

Weiner, Michael

Srinivasan, Maithreyan

<120> Amplificacion de acidos nucleicos en emulsion de perlas

<130> 21465-508 UTIL

<150> documento US n° 60/443.471

<151> 2003-01-29

<150> documento US n° 60/465.071

<151> 2003-04-23

<150> documento US n° 60/476.592

<151> 2003-06-06

<150> documento US n° 60/476.504

<151> 2003-06-06

<150> documento US n° 60/476.592

<151> 2003-06-06

<150> documento US n° 60/476.602

<151> 2003-06-06

<150> documento US n° 60/497.985

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<151> 2003-08-25 <160> 7

<170> PatentIn version 3.2

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<212> ADN

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<223> oligonucleotido <400> 1

gcttacctga ccgacctctg cctatcccct gttgcgtgtc 40

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<212> ADN

<213> Artificial

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<223> oligonucleotido <400> 2

ccattcccca gctcgtcttg ccatctgttc cctccctgtc 40

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<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotido <400> 3

gcttacctga ccgacctctg <210> 4 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <220>

<223> Oligonucleotido

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<400> 4

ccattcccca gctcgtcttg <210> 5

<211> 44 <212> ADN <213> Artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 5

ccattcccca gctcgtcttg ccatctgttc cctccctgtc tcag

<210> 6

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotido <400> 6 ccatctgttc cctccctgtc <210> 7

<211> 20 <212> ADN <213> Artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 7

cctatcccct gttgcgtgtc

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Claims (25)

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2. 2.

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3. 3.

   35 4.
4. 5.

   40 6.
5. 7.
6. 8. 45
7. 9.

   50 10.
8. 11.
9. 12.

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10. 13.

    60 14.

    65

    REIVINDICACIONES

    Metodo para la amplificacion de uno o mas acidos nucleicos sobre una perla, que comprende las etapas siguientes:

    (a) formar una emulsion de agua en aceite para crear una pluralidad de microrreactores acuosos, en la que por lo menos uno de los microrreactores comprende un acido nucleico molde monocatenario, una unica perla con una primera poblacion que comprende una pluralidad de moleculas de una primera especie de cebador dispuesta sobre la misma, uniendose el molde de acido nucleico monocatenario a la perla antes de formar la emulsion, y una solucion de reaccion de amplificacion que comprende una segunda poblacion que comprende una pluralidad de moleculas de la primera especie de cebador, una pluralidad de moleculas de una segunda especie de cebador, y reactivos necesarios para llevar a cabo la amplificacion de acidos nucleicos, en donde la primera especie de cebador es capaz de unirse al acido nucleico molde monocatenario, la segunda especie de cebador es capaz de unirse a una cadena complementaria del acido nucleico molde monocatenario, y la concentracion de la segunda especie de cebador es mayor que la de la segunda poblacion de la primera especie de cebador en la solucion de reaccion de amplificacion,

    (b) amplificar asimetricamente el molde de acido nucleico monocatenario y la cadena complementaria a la cadena molde en la solucion de reaccion de amplificacion, para formar una poblacion de copias amplificadas del acido nucleico molde monocatenario, en el que la amplificacion asimetrica se lleva a cabo mediante reaccion en cadena de polimerasa asimetrica; y

    (c) unir una pluralidad de las copias amplificadas asimetricamente de acido nucleico molde monocatenario a la primera poblacion de la primera especie de cebador sobre la perla en el microrreactor, en el que una cadena complementaria unida a perla se extiende a partir de la primera especie de cebador.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que una mayona de los microrreactores incluye un unico acido nucleico.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicha solucion de reaccion de amplificacion es una solucion de reaccion en cadena de polimerasa que comprende ademas nucleotidos trifosfato, una polimerasa termoestable, y tampon compatible con las condiciones de reaccion en cadena de polimerasa.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicha emulsion contiene ademas estabilizantes de emulsion.

    Metodo segun la reivindicacion 4, en el que dichos estabilizantes de emulsion se seleccionan de entre el grupo que consiste de Atlox 4912, Span 80 y combinaciones y mezclas de los mismos.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicha emulsion es termoestable.

    Metodo segun la reivindicacion 6, en el que dicha emulsion es termoestable hasta 95°C.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la amplificacion se lleva a cabo mediante amplificacion en flujo continuo.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la emulsion se forma mediante la adicion gota a gota de los acidos nucleicos molde, perlas y solucion de reaccion de amplificacion en un aceite.

    Metodo segun la reivindicacion 1, puesto en practica con por lo menos 10.000 acidos nucleicos.

    Metodo segun la reivindicacion 1, puesto en practica con por lo menos 50.000 acidos nucleicos.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que los microrreactores presentan un tamano medio comprendido entre 50 y 250 |im de diametro.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que cada perla se una a mas de 10.000 copias amplificadas asimetricamente del acido nucleico molde monocatenario.

    Metodo para la amplificacion de un acido nucleico, que comprende las etapas siguientes:

    (a) proporcionar un acido nucleico molde monocatenario que debe amplificarse;

    (b) proporcionar un material de soporte solido que comprende una perla generalmente esferica que presenta un diametro de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 80 |im, en el que la perla comprende una pluralidad de moleculas de una primera poblacion de una primera especie de cebador

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    dispuesta sobre las mismas y que es capaz de unirse al acido nucleico molde,

    (c) mezclar los acidos nucleicos de molde y las perlas en una solucion de reaccion de amplificacion que comprende una pluralidad de moleculas de una segunda poblacion de la primera especie de cebador, una segunda especie de cebador y reactivos necesarios para llevar a cabo una reaccion de amplificacion de acidos nucleicos en una emulsion de agua en aceite, uniendose el molde de acido nucleico monocatenario a la perla antes de formar la emulsion, en donde la primera especie de cebador es capaz de unirse al acido nucleico molde monocatenario, la segunda especie de cebador es capaz de unirse a una cadena complementaria del acido nucleico molde monocatenario, y la concentracion de la segunda especie de cebador es mayor que la de la segunda poblacion de la primera especie de cebador en la solucion de reaccion de amplificacion,

    (d) amplificar asimetricamente el acido nucleico molde monocatenario y la cadena complementaria del acido nucleico molde monocatenario en la solucion de reaccion de amplificacion presente en la fase acuosa de la emulsion de agua en aceite utilizando la segunda poblacion de la primera especie de cebador y la segunda especie de cebador para formar una poblacion de copias amplificadas del acido nucleico molde monocatenario, en el que la amplificacion asimetrica se lleva a cabo mediante reaccion en cadena de polimerasa asimetrica; y

    (e) unir una pluralidad de las copias asimetricamente amplificadas del acido nucleico molde monocatenario a la primera poblacion de la primera especie de cebador sobre la perla, en donde una cadena complementaria unida a una perla se extiende a partir de la primera especie de cebador.
11. 15. Metodo segun la reivindicacion 1 o 14, que comprende ademas la etapa de enriquecer en perlas que se unen a copias amplificadas del acido nucleico respecto a perlas a las que no se une ningun acido nucleico, seleccionando la etapa de enriquecimiento de entre el grupo que consiste de purificacion por afinidad, electroforesis y separacion celular.
12. 16. Metodo segun la reivindicacion 15, en el que la etapa de enriquecimiento se lleva a cabo mediante purificacion por afinidad con perlas magneticas que se unen a acidos nucleicos.
13. 17. Metodo segun la reivindicacion 1 o 14, en el que se unen a cada perla por lo menos 100.000 copias de cada molecula de acido nucleico diana.
14. 18. Metodo segun la reivindicacion 1 o 14, en el que se unen a cada perla por lo menos 1.000.000 de copias de cada molecula de acido nucleico diana.
15. 19. Metodo segun la reivindicacion 1 o 14, en el que se unen a cada perla por lo menos 1 a 20.000.000 de copias de cada molecula de acido nucleico diana.
16. 20. Metodo segun la reivindicacion 1 o 14, en el que las perlas son perlas de sefarosa.
17. 21. Metodo segun la reivindicacion 16, que comprende ademas las etapas siguientes: separar las perlas portadoras de molde y las perlas magneticas, y

    extraer las perlas magneticas con un campo magnetico.
18. 22. Metodo segun la reivindicacion 21, en el que la separacion se lleva a cabo mediante incubacion a una temperatura superior a 45°C o mediante la incubacion de las perlas portadoras de molde y las perlas magneticas en una solucion con un pH basico.
19. 23. Metodo para la produccion de una poblacion clonal de acidos nucleicos, que comprende:

    (a) proporcionar una pluralidad de acidos nucleicos molde monocatenarios de longitud comprendida entre 150 y 750 pb, y perlas, comprendiendo, cada una, una primera poblacion de una pluralidad de moleculas de una primera especie de cebador dispuesta sobre las mismas,

    (b) mezclar los acidos nucleicos molde monocatenarios y las perlas en una solucion de reaccion de amplificacion que comprende una segunda poblacion de una pluralidad de moleculas de la primera especie de cebador, una pluralidad de moleculas de una segunda especie de cebador y reactivos necesarios para amplificar los acidos nucleicos de molde, y una concentracion de la segunda especie de cebador superior a la de la segunda poblacion de la primera especie de cebador en la solucion de reaccion de amplificacion, en donde la primera especie de cebador es capaz de unirse al acido nucleico molde monocatenario y la segunda especie de cebador es capaz de unirse a una cadena complementaria del acido nucleico molde monocatenario,

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    (c) formar una emulsion para crear una pluralidad de microrreactores que comprende acidos nucleicos molde, perlas y solucion de reaccion de amplificacion, uniendose el acido nucleico monocatenario a la perla antes de formar la emulsion, en donde por lo menos uno de los microrreactores comprende un acido nucleico molde y una unica perla encapsulada en la solucion de reaccion de amplificacion, en donde los microrreactores se encuentran contenidos en el mismo recipiente,

    (d) amplificar asimetricamente el acido nucleico molde monocatenario y la cadena complementaria del acido nucleico molde monocatenario en la solucion de reaccion de amplificacion utilizando la segunda poblacion de la primera especie de cebador y la segunda especie de cebador para formar una poblacion de copias amplificadas del acido nucleico molde monocatenario, en el que la amplificacion asimetrica se lleva a cabo mediante reaccion en cadena de polimerasa asimetrica; y

    (e) unir una pluralidad de las copias amplificadas asimetricamente del acido nucleico molde monocatenario a la primera poblacion de la primera especie de cebador sobre la perla, en donde se extiende una cadena complementaria unida a perla a partir de la primera especie de cebador.
20. 24. Metodo segun la reivindicacion 23, que comprende ademas transcribir y traducir los acidos nucleicos para generar por lo menos 10.000 copias de un producto de expresion.

    20
21. 25. Metodo segun la reivindicacion 24, en el que dicho producto de expresion se encuentra unido a dichas perlas mediante una pareja de union seleccionada de entre el grupo que consiste de las parejas de union antigeno/anticuerpo, ligando/receptor, 6Xhis/mquel-acido nitriloacetico y etiqueta FLAG/anticuerpo de FLAG.

    25
22. 26. Metodo segun la reivindicacion 24, en el que el metodo produce una poblacion clonal de protemas.
23. 27. Metodo segun la reivindicacion 26, en el que las protemas se seleccionan de entre el grupo que consiste de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y anticuerpos manipulados.

    30
24. 28. Metodo segun la reivindicacion 1 o 14, en el que el metodo comprende ademas las etapas siguientes:

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25. 29.

    40

    • romper los microrreactores acuosos para liberar por lo menos una de las perlas unidas a acido nucleico, comprendiendo la solucion de reaccion de amplificacion productos de amplificacion no unidos, y

    • recuperar las perlas unidas a acido nucleico.

    Metodo segun la reivindicacion 1 o 14, en el que, en la etapa (b) o (d), respectivamente, la solucion de reaccion se encuentra empobrecida en moleculas de la segunda poblacion de la primera especie de cebador.