CN107683335A - 用于核酸分离的自动化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于从生物样品分离和/或纯化核酸的高度自动化方法，所述方法特别适合于短于250bp的核酸并且可以在自动化***，优选基于夹座的***中，在没有蛋白水解预消化步骤的情况下进行。在进一步的方面，本发明还提供了基于所述分离和/或纯化方法的自动化核酸检测方法、以及有待用于进行所述方法的缓冲液和试剂盒。

Description

用于核酸分离的自动化方法
技术领域
本发明涉及用于从生物样品分离和/或纯化核酸的高度自动化方法，其特别适合于短于250bp的核酸并且可以在自动化***(优选基于夹座(cartridge-based)的***)中在没有蛋白水解预消化步骤的情况下进行。在进一步的方面，本发明还提供了基于所述分离和/或纯化方法的自动化核酸检测方法，以及将用于进行所述方法的缓冲液和试剂盒。
背景技术
核酸分离目前最常基于的是两个不同的原则之一。第一和较早的一个原则采用一步提取程序，借此将含有离液剂(chaotropic agent)和有机提取剂(通常为苯酚和/或氯仿)的缓冲液加入生物样品。因此，由此获得的混合物分成两相：水相(其保留核酸)，以及有机相(其保留可以丢弃的不希望的剩余物)。这种一步提取程序的重要的缺点是，首先，使用有毒和有害的物质如苯酚和/或氯仿，以及，其次，其它水溶性物质对保留核酸的水相的可能的污染。可以通过进行另外的纯化步骤来去掉这些物质，然而，这是耗时的。
第二个原则是基于在固体支撑材料如二氧化硅上的核酸的选择吸附，例如在EP0389063中所公开的，其提供实际上没有上述的缺点的核酸分离程序。简单来说，如果必要的话，上述程序涉及含有核酸的起始材料的裂解，接着在规定的条件下使所述材料接触支撑材料，以使得核酸能够结合于支撑材料。可选地，可以利用合适的溶液或缓冲液来进行洗涤和洗脱步骤。
在EP0819696中公开了以上程序的众所周知的变化，称为"Boom方案(Boomprotocol)"(Boom et al.,J.Clin.Microbiol.1990,28(3))。Boom方案涉及通过用离液缓冲液和DNA结合固相来孵育所述起始材料以从含有核酸的起始材料分离核酸。如果必要的话，离液缓冲液会影响起始材料的裂解和核酸与固相的结合。
Boom方案和在现有技术中已知的其许多变型最适合于大于1千碱基(kb)的核酸的提取和纯化，如通常具有3-10kb的长度的细菌质粒。这大概可以归因于以下事实：短链核酸(即长度小于250个核苷酸)对于固体支撑材料的吸附不如较长核酸。尽管如此，对于某些应用，短链核酸的分离或相对于长链核酸浓缩它们是所期望的，例如对于在体液中循环的短链片段化核酸的分离和检测，如在癌症患者或在妊娠期间的血液中发现的所谓的无细胞DNA(cfDNA)。
相对于长链核酸，为了优选地纯化，浓缩，或分离短链核酸，已经描述了各种方案。其中之一描述于WO2009146776(EP2285816)，其教导了，在至少一种浓度为≥2M和≤3.5M的离液剂化合物以及浓度为≥15％(v/v)和≤32％(v/v)的异丙醇的存在下，通过将它们结合于硅质支撑材料，来分离和/或纯化长度<1000nt的核酸。然而，上述程序有一个缺点：上述条件引起在生物样品中存在的蛋白质的快速沉淀，在没有适当的预处理的情况下，这可以显著削弱核酸吸附到支撑材料上并且还引起作为膜或纯化柱的这样的支撑材料的堵塞。因此，分离方案(如在EP2285816中公开的)必须先经蛋白水解处理，其涉及在高于50-60℃的温度下用蛋白酶(蛋白酶K)孵育至少15-30分钟，这是上述程序成功的关键。在离液剂和异丙醇的存在下，在接触与支撑材料以前，必须首先预消化含核酸的起始材料的事实，不仅会导致方案是更费时费力的(这会干扰它在自动***上有效实施)，而且重要地还会增加核酸降解的机会，尤其是短链核酸，而且特别是不同类型的RNA。
因此，本发明的目的是通过提供用于分离和/或纯化核酸的简单和快速的方法来解决上述缺陷，该方法不需要蛋白水解预处理并且适用于自动化。重要地，本发明的方法对于从液体活检物分离长度为<250bp的短链核酸是特别有利的，而且还可以用来分离各种细胞内和细胞外核酸物质如病毒核酸或微RNA。
发明内容
本发明在所附独立权利要求中限定。在从属权利要求中限定了优选实施方式。尤其是，本发明涉及用于从含核酸的起始材料分离和/或纯化核酸的方法，上述方法包括以下步骤：
(a)在至少一种离液剂化合物和至少一种醇的存在下，通过使含核酸的起始材料接触核酸结合载体，使核酸结合于核酸结合支撑材料；以及
(b)用洗脱溶液，如纯水或洗脱缓冲液例如TE缓冲液，可选地从核酸结合支撑材料洗脱结合的核酸；
上述方法的特征在于
(i)醇是具有4或5个碳原子的醇并且以17％(v/v)至60％(v/v)的浓度存在于步骤a)中，以及特征在于
(ii)上述至少一种离液剂化合物以1.5M至5M的浓度存在于步骤a)中。
源自Boom方案的用于分离核酸的最先进的方法是基于，在乙醇或异丙醇的存在下，核酸吸附到固相上。这些已知的方法需要生物样品的蛋白水解预消化以防止在所述条件下发生的大量的蛋白质沉淀，即使存在高浓度的离液剂。通过采用4或5个碳原子醇，本发明基本上规避了持续存在的沉淀问题并从而还使得标准蛋白水解预消化步骤的使用成为多余的。因而，在特别有利的实施方式中，本发明提供了核酸分离和/或纯化方法，其中，在使含核酸的起始材料经受步骤a)以前，没有将蛋白酶加入步骤a)，或其中没有进行与蛋白酶一起的孵育、或任何等效步骤。由于这些特点，本发明的方法特别适合于以自动化方式来进行。
在进一步的方面，本发明还提供了用于用自动化***来检测核酸的自动诊断方法，上述方法包括以下步骤：
a)将含核酸的起始材料提供到自动化***；
b)依据按照上述实施方式的分离和/或纯化方法，在所述自动化***中分离和/或纯化核酸；
(c)在所述自动化***中，对在步骤(b)中分离和/或纯化的目标核酸进行PCR；以及
(d)检测在步骤(c)中的PCR中生成的目标核酸，优选还在所述自动化***上。
接着，本发明进一步提供了用于分离和/或纯化核酸的水性提取缓冲液，所述缓冲液包含：
(i)具有4或5个碳原子的醇，其浓度为20％(v/v)至65％(v/v)，优选35％(v/v)至60％(v/v)，最优选40％(v/v)至50％(v/v)；以及
(ii)至少一种离液剂化合物，其浓度为3.3M至6.7M，优选3.5M至5.5M，最优选3.7M至4.5M。
在另一优选实施方式中，本发明还提供了用于分离和/或纯化核酸的试剂盒，所述试剂盒至少包含如上所述的水性提取缓冲液。在优选实施方式中，这样的试剂盒可以为夹座(cartridge)的形式，其中在所述夹座内提供根据本发明的水性提取缓冲液。
最后，还提供了前面列出的核酸分离和/或纯化方法、自动诊断方法、水性提取缓冲液、和试剂盒(根据本发明的)在以下任何一项中的应用：
-细胞外核酸的分离和/或纯化；
-长度<250nt的短链核酸的分离和/或纯化；
-病毒核酸的分离和/或纯化，
-感染、以及病理或生理病症的诊断。
定义
如在本文中所使用的，术语"核酸'是指核糖核苷或脱氧核糖核苷的聚合物，其包含在核苷酸亚基之间的磷酸二酯键。核酸包括但不限于基因组DNA、cDNA、hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA、微RNA、片断化核酸、获自外染色体或获自亚细胞器如线粒体的核酸、以及获自可以存在于样品上或样品中的微生物或病毒的核酸。核酸可以是双链或单链、线性或圆形的。
如在本文中所使用的，术语"短链核酸"是指核糖核苷或脱氧核糖核苷的聚合物，其包含小于<250nt，优选<200nt或甚至<150nt。在其特别有利的方面之一中，本发明旨在提供用于在液体活检(如来自癌症患者的血液和血浆)中检测癌症相关突变的坚实的基础。最近的发现报告，在癌症患者的血液中循环的大多数无细胞DNA片段测量为180至200bp。应该指出的是，该尺寸与围绕核小体缠着的和在凋亡以后从细胞释放的DNA的常规尺寸相关，这还表明通过从大量死亡癌细胞被动释放，cfDNA进入血液(参见例如Jahr et al.,CancerResearch 2001；Diaz and Bardelli,J.of Clin.Onco.,2014；和Devonshire etal.Anal.Bioanal.2014)。鉴于这样的小片段的分离是技术上具有挑战性并且出于诊断原因是所期望的事实，为了本发明的目的，术语"短链核酸'和"短链核酸'将被解释为涉及尺寸低于上述规定的250nt的核酸。
如在本文中所使用的，术语"细胞外核酸类"或"细胞外核酸'应被理解为这样的核酸，其不包含在细胞中并且是指细胞外RNA以及细胞外DNA以及它们的混合物。相应的细胞外核酸还经常被称为无细胞核酸，如无细胞DNA(cfDNA)或无细胞RNA(cfRNA)。因此，细胞外核酸通常存在细胞以外或多个相互连接的细胞以外。可以例如在生物样品的无细胞部分(或一部分)中，如体液或源自体液的样品如例如血浆中，发现典型的细胞外核酸的实例。细胞外核酸包括但不限于哺乳动物细胞外核酸如例如细胞外肿瘤相关或肿瘤衍生的DNA和/或RNA、其它疾病相关的细胞外DNA和/或RNA、表观遗传修饰的DNA、胎儿DNA和/或RNA、小干扰RNA如例如miRNA和siRNA。这样的哺乳动物细胞外核酸可以存在为单核小体和寡核小体，或，通过具有核酸结合性能的蛋白质，可以结合于血细胞的表面。另外，细胞外核酸还重要地包括非哺乳动物细胞外核酸如例如病毒核酸、病原核酸(其被释放进入细胞外核酸群体，例如来自原核生物(例如，细菌)、病毒或真菌)。
在许多医疗状况和感染过程中，细胞外和/或短链核酸的水平的存在或变化的检测，对于筛查、诊断、预后、和疾病进展的监测、识别潜在的治疗靶点，以及对于监测治疗反应，是令人感兴趣的。另外，在母血中升高的胎儿DNA/RNA正用来确定例如性别鉴别，评估染色体异常，以及监测妊娠相关的并发症。除衍生自例如肿瘤细胞或胎儿的哺乳动物细胞外核酸之外，包含细胞外短链核酸的样品还可以包含不包含在细胞中的感兴趣的其它核酸，例如病原体核酸如病毒或细菌核酸。对于许多诊断应用，从样品如尤其是血液样品或源自血液的样品中有效地分离病毒或细菌核酸也是重要的。
而且，如在本文中所使用的，术语"样品"或"生物样品"旨在包括含有核酸和/或细胞材料的各种生物来源。确定来自待测试的细胞的核酸和/或细胞材料是否存在一种或多种特定标记物。包括的样品是来自细胞的培养物的样品、真核微生物或诊断样品如体液、体液沉淀物、灌洗样品、细针抽吸物、活检样品、组织样品、癌细胞、来自患者的细胞、来自组织的细胞或来自待测试和/或治疗疾病或感染的个体的体外培养细胞或法医样品。体液样品的非限制性实例包括全血、骨髓、脑脊液、腹膜液、胸膜液、淋巴液、血清、血浆、尿、乳糜、粪便、***、痰、***抽吸物、唾液、拭子样品、洗涤或灌洗液和/或刷样品。在本发明的优选实施方式中，含核酸的起始材料选自由全血样品、血清样品或血浆样品组成的组。
附图说明
现在具体参照图，需要强调的是，显示的细节是通过示例的方式并且仅为了本发明的不同实施方式的说明性讨论的目的。呈现它们是为了提供被认为是本发明的原理和概念方面的最有用的描述。在这方面，没有尝试以比本发明的基本了解所必要的更为详细地显示本发明的细节。上述描述用来向本领域技术人员说明在实践中如何可以实现本发明的多种形式，以及附图，如下所总结的，用来支持说明书，其中：
图1：显示蛋白质沉淀水平的差异，这取决于与生物样品和以高摩尔浓度存在的离液剂的混合的醇的类型。
图2：显示与硅质结合材料的DNA结合性能的差异，作为离液剂盐浓度的函数并且取决于醇的类型。
图3：显示在44％正丁醇的存在下，作为GuSCN浓度的函数，50bp(浅色条)和150bp(黑暗条)的短DNA片段的提取率。
图4：显示在没有蛋白酶处理的情况下，利用全自动核酸提取方案，对从血浆或CSF临床样品中分离的细胞外核酸进行BRAF突变分析的结果。
图5：显示在提取和分析来自全血样品的病毒RNA的过程中不同醇的性能。
图6：显示Ebola病毒RNA的全自动检测的RT-qPCR结果。
具体实施方式
本发明涉及用于从含核酸的起始材料分离和/或纯化核酸的方法，上述方法包括以下步骤：
(a)在至少一种离液剂化合物和至少一种醇的存在下，通过使含核酸的起始材料接触核酸结合载体，使核酸结合于核酸结合支撑材料；以及
(b)借助于洗脱溶液，如纯水或洗脱缓冲液例如TE缓冲液，从核酸结合支撑材料，可选地洗脱结合的核酸；
上述方法的特征在于
(i)醇是具有4或5个碳原子的醇并且以17％(v/v)至60％(v/v)的浓度存在于步骤a)中，以及特征在于
(ii)上述至少一种离液剂化合物以1.5M至5M的浓度存在于步骤a)中。
具有4或5个碳原子的醇，尤其是一元醇如丁醇和戊醇，与在生物样品中自然存在的水具有有限的溶解度，并且与它分离，形成两相体系。为此，这些醇并不和更受欢迎和很好混合与水性环境乙醇和异丙醇一样经常用于核酸分离程序。鉴于上述情况，本发明是基于两个意外的观察结果：首先，当将离液剂化合物加入所述混合物至大概1.5M或更高的摩尔浓度时，自然形成50％水和50％丁醇或戊醇混合物的两相体系合并成稳定且均匀的单相溶液(在STP1下(1标准温度和压力条件))。其次，观测到，在上述条件下，丁醇或戊醇不仅允许核酸与硅石结合，而且提供足够的疏水性条件以防止(或至少大幅减缓)在生物样品中存在的蛋白质立即聚集和沉淀。
本发明提供了实际上无蛋白沉淀的核酸提取条件，其同时允许核酸结合至常规核酸结合材料。首先，这消除了进行样品的耗时的蛋白水解预消化的需要，否则会遭受广泛的沉淀，这会堵塞核酸结合表面。其次，由于如此实现的上述程序的加速和简化，本方法还可以容易地实现自动化。作为结果，在特别优选的实施方式中，在即将使含核酸的起始材料经受步骤a)时，可以在没有将任何蛋白酶加入步骤a)的情况下，或没有进行与蛋白酶一起的任何孵育的情况下，执行本发明的方法。
通常，在本发明的方法中，通过硅石吸附，来进行核酸的结合。因此,，在通常实施方式中，核酸结合支撑材料将包含硅石，优选选自以下硅质材料的任一种：硅胶、二氧化硅、玻璃、沸石、高岭土、硅胶、陶瓷、二氧化硅膜或树脂(如在柱中)、以及具有硅石或玻璃表面的磁性颗粒。结合支撑材料可以具有本领域已知的任何形式，包括颗粒、微颗粒、凝胶、纤维、珠、膜、柱、以及其它支撑物如试管和微孔，但优选将是膜或柱。
在典型的实施方式中，根据本发明的方法通常会进一步包括至少一个，可能更多的在步骤a)和b)之间的洗涤步骤。如本领域技术人员将会理解的，固定核酸的这样的洗涤步骤是本领域众所周知的，并且常规使用不同强度的乙醇溶液，通常为50％、70％或75％，虽然还可以使用其它洗涤溶液或缓冲液。
然后可以以任何在本领域公知的方式进一步处理或分析与根据本发明的核酸结合载体结合的核酸。例如，取决于计划的后续步骤，可以使用与支撑材料结合的核酸(而没有洗脱)。为此，本方法的步骤b)被描述为可选的。
在本文提供的方法的优选实施方式中，具有4或5个碳原子的醇是一元醇，即，丁醇或戊醇，包括它们的任何同种型。因此，具有4或5个碳原子的醇优选选自由正丁醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基1-丁醇、3-甲基1-丁醇、2,2-二甲基1-丙醇、2-甲基2-丁醇、3-甲基2-丁醇、或它们的混合物组成的组。观测到这些丁醇和丙醇同种型的一些表现特别好；因此，更优选地，具有4或5个碳原子的醇选自由正丁醇、1-戊醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇、或它们的混合物组成的组。最优选地，具有4或5个碳原子的醇将可能是正丁醇。
在优选实施方式中，在步骤a)中具有4或5个碳原子的醇的浓度包含20％(v/v)至55％(v/v)，优选25％(v/v)至50％(v/v)，更优选30％(v/v)至45％(v/v)，最优选35％(v/v)至40％(v/v)。
在进一步的优选方面，上述至少一种离液剂化合物是强离液剂化合物，即，包含任何的强离液剂阴离子基团如SCN-、NCS-、NO3 -、ClO4 -、或Cl3CCOO-；和/或包含任何的强离液剂阳离子基团如胍鎓。优选地，离液剂化合物选自硫氰酸盐、异氰酸盐、高氯酸盐、或它们的混合物。最优选地，它将是硫氰酸胍鎓或异硫氰酸胍鎓。然而可替换地，它还可以是较弱的离液剂，例如碘化钠、高氯酸钠、盐酸胍、乙酸锂等(在较高的浓度下提供)。
在优选实施方式中，在本发明的方法的步骤a)中离液剂化合物的浓度为2M至4.5M，在一些实施方式中，优选2.5M至4M，或更优选3M至3.5M。
由于其能够提供用于有效分离短于<250bp的核酸的条件，所以本发明的方法还提供了分离/纯化无细胞循环核酸的有效方式，如源自凋亡或坏死细胞或在细胞内信号作用期间由各种细胞类型特意排出的双链或单链DNA或RNA。可以例如在液体活检中检测这样的短链DNA或RNA并表示生理或病理状态，如妊娠，发生例如病毒感染、发炎、或癌症。因而，在优选实施方式中，本方法用于分离和/或纯化短链核酸，在本文中定义为具有小于250nt(<250nt)的长度，优选约或小于200nt的尺寸。
沿着这些路线，在优选实施方式中，经受本发明的方法的含核酸的起始材料是生物样品，优选选自由以下各项组成的组的液体生物样品：全血、血清、血浆、脑脊液(CSF)、尿、眼泪、唾液、汗液、呕吐物、粪便、***、或血沉棕黄层(buffy coat)组成的组。所有上述事物能够容易地用来筛查存在于上述样品的无细胞基质中，或在存在于悬浮在所述基质中的细胞之间的细胞内基质中或在上述细胞的表面上的细胞外核酸的存在/类型。在最优选的实施方式中，材料选自由全血、血清、血浆、脑脊液(CSF)、和尿组成的组。
然而，应该指出在可能的实施方式中，本方法还允许分离细胞内核酸，如基因组DNA、不同的细胞RNA类型、小RNA如尤其是微RNA，以及细胞内病原体的核酸，如病毒或原生动物例如疟原虫(Plasmodium)。在这样的实施方式中，经受本发明的方法的含核酸的起始材料可以是任何细胞来源如组织样品、细胞颗粒(pellet)，以及优选是在任何液体(如PBS或其它缓冲液)中细胞悬浮液。
在进一步优选的实施方式中，本方法还可以用于检测致病病毒核酸，尤其是在哺乳动物体液中存在的致病病毒核酸(在它们的无细胞部分中或仍然在它们的宿主细胞内)。按照根据本方法进行的核酸分离/纯化可以检测的致病病毒的实例是负链RNA包膜病毒如埃博拉病毒。因此，在可能的实施方式中，含核酸的起始材料是全血并且进行本方法以分离和/或纯化埃博拉病毒的RNA。
在本发明的一个特定方面，在≧4℃并且≦40℃的温度下，优选≧15℃并且≦25℃，进行本方法的步骤a)，更优选步骤a)和b)。在本质上，反应不是特别温度敏感的，因而提供相对于现有技术中已知的分离程序的进一步的优点。这允许甚至在热带地区中，在正常室温下进行上述方法，无需存在任何专门的温度调节***。
因此，本方法不仅具有强劲性(robust)和在室温(约20℃)下可进行的优点，而且容易适应全自动化。因而，在需要最少的处理和不需要高级实验室技能的有利的实施方式中，用自动化***来进行本发明的方法。适宜的自动化***在本领域中是公知的并且包括例如Biocartis NV平台Idylla。因而，在进一步有利的实施方式中，提供了方法，其中优选用夹座来进行步骤a)和b)，其中上述夹座可与上述自动化***接合并且可从上述自动化***移除。上述夹座的一个实例可以见EP1904234。
沿着这些路线，在进一步的方面，本发明提供了用自动化***来检测核酸的自动诊断方法，上述方法包括以下步骤：
a)将含核酸的起始材料提供到自动化***；
b)用所述自动化***，依据按照上述实施方式的分离和/或纯化方法来分离和/或纯化核酸；
(c)用所述自动化***，对在步骤(b)中分离和/或纯化的目标核酸进行扩增；以及
(d)优选还用所述自动化***，来检测在步骤(c)中扩增的目标核酸。
在优选实施方式中，将利用PCR来进行在步骤(c)中的扩增。然而，它还可以利用可替代的核酸扩增方法如更近期的等温方法，包括转录介导的扩增(TMA)、环介导扩增、基于核酸序列的扩增、链置换扩增。或多重置换扩增来进行。可替换地，步骤(c)代替涉及目标核酸的扩增，可以涉及生成来自在步骤(b)中分离和/或纯化的所述目标核酸的信号并根据任何在本领域公知的技术来扩增所述信号。在这种情况下，以下步骤(d)将涉及优选还用所述自动化***来检测在步骤(c)中扩增的信号。与根据本发明的方法的上述实施方式相容的上述信号扩增技术的实例是支链DNA测定(bDNA)，其可以例如用于评估在样品中的病毒载量。
在所述自动诊断方法的特别优选的实施方式中，在步骤a)和b)之间或在步骤b)期间，没有用蛋白酶来进行孵育。
在优选实施方式中，在本自动诊断方法的步骤c)中进行的PCR是定量PCR(qPCR)。
在另一优选实施方式中，与以上实施方式相容，提供了自动诊断方法，其中用可与自动化***接合和可从自动化***移除的夹座来进行至少步骤(b)和(c)。
在一种实施方式中，本自动诊断方法允许检测细胞外核酸如病毒核酸或肿瘤衍生或胎儿循环DNA。
与后面的实施例一致，在第二优选实施方式中，上述自动诊断方法还允许检测长度<250nt的短链核酸，优选等于或小于约200nt，如微RNA、或短双链(ds)DNA片段如前述肿瘤衍生或胎儿循环DNA。
在替代实施方式中，本发明的自动诊断方法允许检测潜在地存在于含核酸的起始材料的细胞部分以及细胞外部分中的病毒核酸。在所述自动诊断方法的特别优选的实施方式中，检测的核酸是埃博拉病毒的核酸。在有利的实施方式中，埃博拉病毒的核酸是埃博拉RNA。在这种实施方式中，在步骤c)中进行的PCR优选是逆转录酶PCR(RT-PCR)，最优选定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)。在这种情况下，含核酸的起始材料将最优选是全血；然而，它还可以是另一种体液如呕吐物、粪便、尿、汗液、***等。
离液剂盐如GuSCN不溶解于丁醇或戊醇。因此，为了实现本发明的核酸分离/纯化条件，可以将离液剂化合物直接溶解于液体样品如血浆、血清、或CSF，其后可以添加适当的4或5个碳原子的醇。然而，更方便地，通过混合生物样品与水性提取缓冲液或将它悬浮在水性提取缓冲液中来产生分离/纯化条件，其中水性提取缓冲液包含离液剂和具有4或5个碳原子的醇(在较高的浓度下)。
因而，在进一步的方面，本发明还提供了用于分离和/或纯化核酸的水性提取缓冲液，所述缓冲液包含
(i)具有4或5个碳原子的醇，浓度为20％(v/v)至65％(v/v)，优选35％(v/v)至60％(v/v)，最优选40％(v/v)至50％(v/v)以及
(ii)至少一种离液剂化合物，浓度为3.3M至6.7M，优选3.5M至5.5M，最优选3.7M至4.5M。
因为这种水性提取缓冲液将用于本发明的方法，本文还施加如提到的同样优选的4或5个碳原子醇和离液剂。因而，具有4或5个碳原子的醇优选选自由正丁醇、1-戊醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇、或它们的混合物组成的组，以及最优选是正丁醇。类似地，包含在本提取缓冲液中的至少一种离液剂化合物优选选自硫氰酸盐、异氰酸盐、高氯酸盐、氢氯化物、或它们的混合物；以及最优选是硫氰酸胍鎓或异硫氰酸胍鎓。
在下一个方面，本发明还提供了用于从含核酸的起始材料分离和/或纯化核酸的试剂盒，优选短链和/或细胞外、或病毒核酸，上述试剂盒至少包含根据本发明的提取缓冲液。本发明的这样的试剂盒还可以包含典型的附加要素作为试剂盒的使用说明，但有利地将进一步包含任何或全部以下项：
(a)适用于结合核酸的核酸结合支撑材料，如硅质材料；
(b)洗涤液如洗涤缓冲液；
(c)洗脱溶液如洗脱缓冲液。
在优选实施方式中，试剂盒包含夹座，其可与选择的自动***接合，其中在夹座内提供至少本发明的提取缓冲液。
在进一步优选的实施方式中，柱体进一步包括核酸分离和/或纯化室，其包含核酸结合支撑材料，其中所述核酸分离和/或纯化室安放或容纳所述提取缓冲液或与容纳所述提取缓冲液的另一个夹座室流体连通。优选地，这样的夹座进一步包括与核酸分离和/或纯化室流体连通的附加室，所述附加室包含例如洗涤液或洗脱溶液等。
最后，在另一方面，本发明提供了本发明的分离/纯化方法、上述提取缓冲液、和试剂盒应用于以下任何一项：
-分离和/或纯化细胞外核酸，如尤其是这样的核酸，其来自病原体如病毒，来自外染色体，以及胎儿或肿瘤衍生的核酸；
-分离和/或纯化长度<250nt的短链核酸，最优选等于或小于约200nt；
-分离和/或纯化病毒核酸，如埃博拉病毒RNA；
-诊断感染(例如病毒、细菌、真菌、或原生动物感染)、病理(例如癌症)、或生理(例如妊娠)状况。
然而，可以发现在诊断领域以外的其它应用领域，例如在法医学或其中短链核酸的纯化是至关重要的其它领域中。
在优选实施方式中，上面列出的用途应用于含核酸的起始材料，其选自液体活检样品，如全血样品、血清样品、血浆样品、CSF样品，或应用于不同类型的生物液体样品如尿样品。
与上述事物一致，在本发明的一个特定方面，本发明的核酸分离/纯化方法、提取缓冲液、和试剂盒用于自动***，例如夹座***。
实施例
本发明是基于意外的发现：在摩尔浓度高于至少1.5M的离液剂的存在下，比乙醇和异丙醇更疏水以及通常不与水混合的醇特别适合于进行基于二氧化硅吸附的核酸提取。
依据Boom方案，已经知道在醇如乙醇或异丙醇的存在下，有利于核酸与硅石的结合。然而，当以需要的浓度存在时，这两种醇均会引起蛋白质的立即聚集，从而导致二氧化硅膜的不可逆堵塞和核酸的非特异性捕获。作为结果，在典型的Boom方案中，需要广泛的蛋白酶消化以充分地降低肽长度并因而防止这种阻碍。
通过提供用于从含蛋白质和核酸的起始材料进行核酸分离和/或纯化的方法，本发明规避了蛋白酶处理步骤的必要性，其中，在浓度为1.5M至5M的至少一种离液剂化合物和浓度为17％(v/v)至60％(v/v)的具有4或5个碳原子的至少一种醇的存在下，使所述含蛋白质和核酸的起始材料接触核酸结合支撑材料。
在摩尔浓度的此范围内的离液剂的作用是首先提供4或5个碳原子醇与水(添加或存在于含核酸的起始材料中，例如生物样品)的混合，其次，提供足够的离液作用(chaotropic action)以将在含核酸的起始材料中存在的蛋白质变性，并因而在某种程度上使得它们失活。如果分离的核酸是RNA，则后者是特别重要的，其将被在大多数生物样品中的大量的RNA酶立即靶向和消化。
另一方面，具有4或5个碳原子的醇，优选为丁醇或戊醇的作用是首先提供使核酸能够结合至支撑材料(通常为硅石)的条件，以及其次，同时保持变性蛋白质足够可溶，以免干扰核酸与支撑物的有效结合。因此，在给定核酸分离条件中丁醇和/或戊醇的选择性使用会显著地降低蛋白质沉淀，因而使借助于蛋白酶的预处理成为多余的。
在图1中很好地证明了上述能力，其显示与大量的硫氰酸胍鎓(GuSCN)混合并分成1ml的三个重复的血浆样品，然后各自用相应的醇来稀释两次，其中上述相应的醇选自(1)乙醇(标记为"etOH")、(2)异丙醇(标记为"propOH")、和(3)丁醇(标记为"butOH")。在添加相应的醇至50％的最终浓度以后，在这些重复中的最终GuSCN浓度是约2M。如从图1可以看出，与乙醇或异丙醇混合的血浆-GuSCN溶液变得明显浑浊，这是由于在室温下几乎立即的和严重的蛋白质沉淀。相反地，如通过容易看到的在含有样品的管上的标度所证明的，在与丁醇的血浆-GuSCN混合物中没有形成沉淀物。对于在与水和血浆或全血混合的GuSCN和丁醇或戊醇的上述特定浓度范围内的其它测试，后者一般都是正确的，包括例如2.9M GuSCN和50％正丁醇、2.9M和51％叔丁醇、3.7M GuSCN和32％的1-戊醇、3.2M GuSCN和38％的1-戊醇、2.9M GuSCN和46％的3-戊醇。在这些溶液中形成的沉淀物的类型(如果可见)，自然取决于测试生物样品中蛋白质的密实性(例如全血是比血浆更具挑战性的材料)。然而，一般来说，它们是透明的并且有时仅可以在离心以后才看到。
接下来的步骤是，在乙醇、异丙醇或丁醇的存在下，比较在用不同浓度的离液剂处理的血浆样品中存在的核酸与硅质支撑材料结合的能力。为了要做到这一点，首先汇集几种血浆样品，分为重复部分，其含有58％的三种醇之一和不同浓度的GuSCN(浓度选自1.1M、2.2M、3.3M、4.4M和5.5M)。对于每种醇，选择样品的一种血浆和58％醇被保持作为没有添加GuSCN的结合对照(样品"0.0")。然后，借助于用不同的荧光染料(Texas Red和Atto647N)标记的50和150bp的小寡聚物来掺加(spike)和涡旋每个所述制备的血浆/GuSCN/醇混合物。测量每个混合物的荧光值，其后用二氧化硅柱对所有混合物进行核酸分离。然后在TE缓冲液中洗脱二氧化硅吸附的核酸，接着在流通(flow-through)中的第二次荧光测量。图2示出，当针对TE归一化时，在测试样品(x轴)中第二次测量与第一次测量的相对荧光值(y轴)。结果显示，为使DNA通过二氧化硅膜，事实上不需要离液剂，只要存在至少50％的乙醇或丙醇。对于这些醇，在所有GuSCN浓度下观测到强沉淀，以及在没有GuSCN下或在1.1M GuSCN下DNA产率是最高，其中沉淀是最低的。另一方面，对于丁醇，在没有GuSCN下以及仍然在1.1MGuSCN下，观测到两个单独的液相，其可以解释柱的较差的提取效率。然而，在2.2M和更高的GuSCN浓度下，血浆-丁醇混合物是均匀且透明的溶液并且导致与相应的乙醇或异丙醇混合物相比，好得多的DNA提取率。后者(乙醇或异丙醇混合物)可能可以被解释为由于在乙醇和异丙醇样品中在较高的GuSCN浓度下更强的蛋白质沉淀，这可能引起核酸被捕获在蛋白质复合物中并堵塞二氧化硅膜。相比之下，在丁醇处理的血浆中，至少直至4.4M的GuSCN浓度，没有观测到蛋白质沉淀。
为了确定作为离液剂浓度的函数的短链DNA与二氧化硅膜结合的效率，如上所述的，制备了8个血浆和44％正丁醇样品(含有不同浓度的GuSCN(从0.6M至2.5M))，以及用少量的两种不同标记的尺寸为50bp(用Texas Red标记)和150bp(用Atto647N标记)的寡聚物加以掺加(spike)。将样品直接(即，在没有蛋白酶处理的情况下)加载到二氧化硅柱上，其后用500ul TE来洗脱结合的核酸。为了辨别在流通(flow-through)中的回收的50bp和150bp寡聚物片段，利用琼脂糖凝胶电泳，按尺寸来分辨(resolve)样品。对于如图3所示的这两种片段，在其适当的发射波长处，对于每种片段，测量荧光，以及通过相对于在TE中的输入荧光归一化，将荧光表示为相对荧光结果，其中较淡条显示较短的50bp片段的回收率以及较暗条则显示稍长的150bp片段的回收率。有时观测到高于100％的值并且仅仅是归一化和对这两种荧光测量的实验可变性(variability)的结果。然而，可以清楚地看出趋势：结果显示随着离液剂的浓度增加，较短的50bp片段和150bp片段的结合量增加。对于增加的醇浓度，观测到类似的发现，其还有利于较短片段的优先分离(数据未示出)。
掺加(spike)到血浆的短(50bp和150bp)寡聚物片段的上述分离显示本发明的方法不仅允许从复杂的生物样品有效检索(retrieval)甚至很短链核酸，而且它允许消除蛋白酶处理，其在最先进的方案中是需要的以避免核酸结合载体的堵塞或以其它方式的阻塞。后者因而赋予相对于已知的基于乙醇或异丙醇的核酸提取的主要优点，其中在高温下耗时的蛋白酶消化(通常约1小时)是绝对必要的。因此，根据本发明的核酸分离和/或纯化方法、以及本文提供的提取缓冲液和试剂盒，还可以用于使用自动化***，例如基于夹座的***的完全自动化的DNA或RNA提取。
为了检验上述事物，在Biocartis Idylla BRAF Mutation Test微流体夹座内包括包含44％正丁醇和3.7M GuSCN的水性提取缓冲液，来代替目前在市售Idylla BRAFMutation Test夹座中存在的标准裂解缓冲液。分别将1ml血浆和1ml的CSF(获自具有证实的BRAF V600E突变的黑素瘤患者)，提供到两个这样的改进的Idylla BRAF Mutation Test夹座的样品接收室，之后关闭夹座并进料至Idylla自动化平台，之后自动执行所有后续步骤。尤其是，两个BRAF Test夹座均配置成在样品裂解和核酸提取步骤期间将5.5ml的44％正丁醇和3.7M GuSCN提取缓冲液与相应的临床样品混合。用包含90％乙醇的洗涤缓冲液来洗涤膜结合的核酸，然后用1×PCR缓冲液(50mM KCl，3mM MgCl2，10mM Tris pH 8.6，在25℃下)来从膜上洗脱并经受多重qPCR(其旨在检测wt BRAF、BRAF V600E和BRAF V600K/R)。并行地，为了评估在Idylla夹座上的肿瘤来源的循环DNA的上述自动核酸提取的效率，还利用有效的市售的GuSCN和基于异丙醇的核酸提取试剂盒来从相同样品提取核酸。根据制造商的说明，用柱手动进行提取，所述制造商的说明包括在60℃下蛋白酶K孵育1小时，这是由于以下事实：(i)在所述方案中使用的容积超过夹座的容量，以及还因为(ii)没有蛋白酶K消化，提取不能继续，这是由于广泛的沉淀引起柱或膜堵塞。在手动提取以后，将从血浆和CSF纯化的核酸直接加载到BRAF Mutation Test夹座上并通过如上所述的qPCR加以分析。对血浆和CFS样品进行的两种提取策略的结果均示于图4。用夹座的全自动化分析和半自动化的(手动台式提取，接着在夹座上qPCR分析)方案产生可比的结果并且成功检测在血浆中以及在CSF中的BRAF V600E突变。
以上结果证明本发明的方法适合用于从人样品分离很短和细胞外DNA，其中利用二氧化硅吸附原理而无需用蛋白酶来预处理所述样品。消除蛋白酶处理(其通常在高温下进行)，对于旨在分离和/或纯化RNA的方案是特别期望的(相比于DNA，RNA更容易降解)。因此，还已经测试本发明的方法，用于分离和检测在人全血样品中的埃博拉病毒的单链RNA。
要做到这一点，作为第一步骤，测试了不同的提取缓冲液(包含不同的含有4或5个碳原子的醇和不同浓度的GuSCN)。应该指出的是，血液，作为起始材料，是非常复杂的，这是由于富含蛋白质含量以及还有各种复合物，如血红素基团(heme group)。此外，血液富有RNA酶，其决定了提取缓冲液应优选具有高浓度的离液剂以提供快速蛋白质变性，从而保护感兴趣的病毒RNA。测试的不同醇-GuSCN溶液包括(1)57％正丁醇和3.3M GuSCN；(2)37％的1-戊醇和4.2M GuSCN；(3)43％的1-戊醇和3.7M GuSCN；(4)56％的3-甲基-1-丁醇(异戊醇)和2.8M GuSCN；(5)58％叔丁醇和3.3M GuSCN；以及(6)53％的3-戊醇和3.5M GuSCN。首先，使1.5ml的每种所述提取缓冲液与200ul人血液样品混合，之后将提取缓冲液/血液混合物加载到具有真空装置的二氧化硅旋转柱上，以测定相应的混合物流过柱长度的时间。相比于以前测试的乙醇或异丙醇和GuSCN混合物，以及除含有异戊醇的混合物以外，没有发生柱堵塞。关于含有异戊醇的混合物，其中确实在一定程度上发生堵塞，应该指出的是，它是包含最低GuSCN浓度的混合物。然后，用没有RNA酶的水来洗脱结合于柱的核酸，之后，借助于Ebola特异性引物和探针，对它们进行逆转录酶定量PCR(RT-qPCR)。对于上面列出的核酸提取条件的原始RT-qPCR曲线示于图5并且证明本发明的方法同样适合于RNA分离。
作为下一个步骤，用Idylla平台，以全自动设置，测试了埃博拉病毒RNA分离和检测方案。上述方案旨在限制在单个一次性塑料夹座中对潜在感染性血液样品所进行的所有的处理步骤。首先，将待测试的约200ul全血样品送入夹座，之后关闭夹座，加载到Idylla仪器上。在其中，在夹座内，使样品与过量的含有4M GuSCN和22％的butOH的水性提取缓冲液混合。在这些条件下，样品组分(包括其中潜在地包含的病毒颗粒)被裂解，以及核酸被吸附到二氧化硅提取膜上。随后从二氧化硅膜洗涤过量的细胞碎片和蛋白质，然后利用没有RNA酶的水来洗脱核酸。随后，将这样纯化的RNA反转录成cDNA，同时仍然在夹座内，然后，利用Ebola特异性引物和探针，对其进行qPCR。获自上述方案的结果示于图6，其中在左边的图显示针对Ebola阴性样品所获得的原始qPCR曲线，而在右边的图则显示针对Ebola阳性对照的曲线。

Claims (15)

1.一种用于从含核酸的起始材料分离和/或纯化核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在至少一种离液剂化合物和至少一种醇的存在下，通过使所述含核酸的起始材料与核酸结合载体接触，使所述核酸结合于核酸结合支撑材料；以及
(b)可选地使用洗脱缓冲液从所述核酸结合支撑材料洗脱结合的核酸；
所述方法的特征在于
(i)所述醇是具有4或5个碳原子的醇并且以17％(v/v)至60％(v/v)的浓度存在于步骤a)中，以及
(ii)所述至少一种离液剂化合物以1.5M至5M的浓度存在于步骤a)中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，没有将蛋白酶加入步骤a)，或在即将使所述含核酸的起始材料经受步骤a)时，没有用蛋白酶(或其它等效蛋白酶预处理)进行孵育。
3.根据权利要求1或2所述的方法，具有4或5个碳原子的所述醇是一元醇，优选选自由正丁醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基1-丁醇、3-甲基1-丁醇、2,2-二甲基1-丙醇、2-甲基2-丁醇、3-甲基2-丁醇、或它们的混合物组成的组，更优选选自由正丁醇、1-戊醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇、或它们的混合物组成的组，最优选是正丁醇。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述具有4或5个碳原子的醇以20％(v/v)至55％(v/v)的浓度存在于步骤a)中，优选25％(v/v)至50％(v/v)，更优选30％(v/v)至45％(v/v)，最优选35％(v/v)至40％(v/v)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述至少一种离液剂化合物选自硫氰酸盐、异氰酸盐、高氯酸盐、氢氯化物、或它们的混合物；以及优选是硫氰酸胍鎓。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述至少一种离液剂化合物以2M至4.5M的浓度存在于步骤a)中，优选2.5M至4M，更优选3M至3.5M。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述含核酸的起始材料是选自由以下各项组成的组的液体生物样品：全血、血清、血浆、脑脊液(CSF)、和尿。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，在自动化***上进行所述方法，其中在可拆卸夹座上进行步骤a)和b)。
9.一种用于检测目标核酸的自动诊断方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将含核酸的起始材料提供到自动化***中，
(b)根据权利要求1-6所述的分离和/或纯化方法，在所述自动化***中分离和/或纯化核酸；
(c)在所述自动化***中对在步骤(b)中分离和/或纯化的目标核酸进行扩增；以及
(d)检测在步骤(c)中扩增的所述目标核酸。
10.根据权利要求9所述的自动诊断方法，其中，在夹座上进行至少所述步骤(b)和(c)。
11.一种用于分离和/或纯化核酸的水性提取缓冲液，所述缓冲液包含
(i)具有4或5个碳原子的醇，优选是正丁醇，浓度为20％(v/v)至65％(v/v)，优选35％(v/v)至60％(v/v)，最优选40％(v/v)至50％(v/v)以及
(ii)至少一种离液剂化合物，浓度为3.3M至6.7M，优选3.5M至5.5M，最优选3.7M至4.5M。
12.一种用于从含有核酸的起始材料分离和/或纯化具有长度<250nt的细胞外核酸和/或短链核酸的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求11所述的提取缓冲液。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中，在与自动化***可接合的夹座内提供所述提取缓冲液。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中，所述夹座进一步包括核酸分离和/或纯化室，所述核酸分离和/或纯化室包含适用于结合核酸的核酸结合支撑材料，所述核酸分离和/或纯化室容纳所述提取缓冲液或与容纳所述提取缓冲液的另一室流体连通。
15.权利要求1-8中任一项所述的方法、权利要求11所述的提取缓冲液、或权利要求12-14中任一项所述的试剂盒用于以下任一项的用途
-分离和/或纯化细胞外核酸，
-分离和/或纯化长度<250nt的短链核酸，最优选<100nt；
-分离和/或纯化病毒核酸，
-诊断感染、病理病症、或生理病症。
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Application publication date: 20180209

Assignee: Guangzhou Wanfu catis Biotechnology Co., Ltd

Assignor: Wanfu Cadiz Co., Ltd

Contract record no.: X2020990000658

Denomination of invention: Automated methods for nucleic acid separation

License type: Common License

Record date: 20201203

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Address after: Mechelen

Applicant after: Baiocatis biology Co.,Ltd.

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Applicant before: BIOCARTIS N.V.