JP3442338B2 - Ｄｎａ分析装置、ｄｎａ塩基配列決定装置、ｄｎａ塩基配列決定方法、および反応モジュール - Google Patents
Ｄｎａ分析装置、ｄｎａ塩基配列決定装置、ｄｎａ塩基配列決定方法、および反応モジュールInfo
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- JP3442338B2 JP3442338B2 JP2000075384A JP2000075384A JP3442338B2 JP 3442338 B2 JP3442338 B2 JP 3442338B2 JP 2000075384 A JP2000075384 A JP 2000075384A JP 2000075384 A JP2000075384 A JP 2000075384A JP 3442338 B2 JP3442338 B2 JP 3442338B2
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は遺伝子診断、遺伝子
治療、遺伝子による種々物質の生産等に関連した遺伝子
あるいはＤＮＡの分析、解析に関する。特に、本発明は
パイロシーケンシングの改良およびシステムに関し、Ｄ
ＮＡ塩基配列決定方法あるいは配列モニター法、ＤＮＡ
塩基配列決定装置あるいは配列モニター装置に関する。
治療、遺伝子による種々物質の生産等に関連した遺伝子
あるいはＤＮＡの分析、解析に関する。特に、本発明は
パイロシーケンシングの改良およびシステムに関し、Ｄ
ＮＡ塩基配列決定方法あるいは配列モニター法、ＤＮＡ
塩基配列決定装置あるいは配列モニター装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】ゲノム解析計画の進展により、ＤＮＡ配
列を読みとり、病気の診断あるいは新しい有用物質の生
産を遺伝子レベルで行おうとする動きが活発化してき
た。そこでは大量のＤＮＡ試料を如何にして迅速に解析
するかが大きな課題である。ゲノム解析により基本とな
るＤＮＡ塩基配列データは整いつつあるが、それらＤＮ
Ａ配列、遺伝子の機能を調べるには、種々サンプルの配
列を調べて、既に配列決定した標準サンプルの配列と比
較する必要がある。一度に配列決定するＤＮＡの長さは
短くてもよいが、大量の種々サンプルを迅速に配列決定
し、配列の違いを見い出し生物機能との相関を調べる事
等が必要となる。
列を読みとり、病気の診断あるいは新しい有用物質の生
産を遺伝子レベルで行おうとする動きが活発化してき
た。そこでは大量のＤＮＡ試料を如何にして迅速に解析
するかが大きな課題である。ゲノム解析により基本とな
るＤＮＡ塩基配列データは整いつつあるが、それらＤＮ
Ａ配列、遺伝子の機能を調べるには、種々サンプルの配
列を調べて、既に配列決定した標準サンプルの配列と比
較する必要がある。一度に配列決定するＤＮＡの長さは
短くてもよいが、大量の種々サンプルを迅速に配列決定
し、配列の違いを見い出し生物機能との相関を調べる事
等が必要となる。
【０００３】従来、ＤＮＡ配列決定にはゲル電気泳動に
よるＤＮＡ塩基配列決定方法が用いられ、装置としてＤ
ＮＡシーケンサーが市販され広く用いられている。さら
に最近では多くのＤＮＡプローブを固体のセル上に固定
してプローブアレーとしたＤＮＡチップを用い、サンプ
ルＤＮＡとの間でハイブリダイズさせて迅速に配列を調
べる方法が注目を集め始めている。
よるＤＮＡ塩基配列決定方法が用いられ、装置としてＤ
ＮＡシーケンサーが市販され広く用いられている。さら
に最近では多くのＤＮＡプローブを固体のセル上に固定
してプローブアレーとしたＤＮＡチップを用い、サンプ
ルＤＮＡとの間でハイブリダイズさせて迅速に配列を調
べる方法が注目を集め始めている。
【０００４】一方、上記の方法とは異なる配列決定法も
提案されて、パイロシーケンシングと呼ばれている。パ
イロシーケンシングではＤＮＡが相補鎖合成するときに
反応産物として放出されるピロリン酸をＡＴＰに変え、
ルシフェラーゼを用いてルシフェリンを光らせることで
ＤＮＡ相補鎖合成をモニターして配列決定する。パイロ
シーケンシングは、安価であり、迅速に大量のサンプル
を同時に配列決定できるため、ＤＮＡの高スループット
モニターとして有望な方法である。
提案されて、パイロシーケンシングと呼ばれている。パ
イロシーケンシングではＤＮＡが相補鎖合成するときに
反応産物として放出されるピロリン酸をＡＴＰに変え、
ルシフェラーゼを用いてルシフェリンを光らせることで
ＤＮＡ相補鎖合成をモニターして配列決定する。パイロ
シーケンシングは、安価であり、迅速に大量のサンプル
を同時に配列決定できるため、ＤＮＡの高スループット
モニターとして有望な方法である。
【０００５】報告されているパイロシーケンシングを簡
単に要約する。用いる装置はいわゆる発光光度計であ
る。サンプルＤＮＡ、相補鎖合成の起点を決定するプラ
イマー、ＤＮＡ合成酵素、反応基質として加えられ、未
反応であったｄＮＴＰを分解する酵素アピラーゼ、ピロ
リン酸をＡＴＰに変換するスルフリラーゼ、ルシフェリ
ン、ルシフェリンとＡＴＰの反応に関与するルシフェラ
ーゼ等の試薬をタイタープレートにいれる。この段階で
は合成反応の基質であるｄＮＴＰが存在しないので相補
鎖合成はスタートしない。４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ）をインクジェット方式
により反応部の上部から順番に加える。相補鎖合成され
るべき順番の塩基種がｄＣＴＰであるときには、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰを加えても反応は起こらない。
しかし、ｄＣＴＰが添加されると反応がおこり、相補鎖
が１つ伸長してピロリン酸（ＰＰｉ）が放出される。ピ
ロリン酸はＡＴＰスルフリラーゼによりＡＴＰに変えら
れ、ルシフェラーゼの存在の下でルシフェリンと反応し
て燐光を放出する。この燐光を二次電子増倍管等により
検出する。余分なｄＣＴＰあるいは反応しなかったｄＮ
ＴＰはアピラーゼにより分解され、以後に繰り返される
ｄＮＴＰ注入とそれによる反応には影響しない形に変え
られる。４種のｄＮＴＰは順番に繰り返し加えられ、そ
のときに発する燐光の有無により１つずつ配列を決定す
る。この一連の反応は図３に示される（Ronaghi,M.ら,
Science 281, 363-365 (1998)参照のこと）。
単に要約する。用いる装置はいわゆる発光光度計であ
る。サンプルＤＮＡ、相補鎖合成の起点を決定するプラ
イマー、ＤＮＡ合成酵素、反応基質として加えられ、未
反応であったｄＮＴＰを分解する酵素アピラーゼ、ピロ
リン酸をＡＴＰに変換するスルフリラーゼ、ルシフェリ
ン、ルシフェリンとＡＴＰの反応に関与するルシフェラ
ーゼ等の試薬をタイタープレートにいれる。この段階で
は合成反応の基質であるｄＮＴＰが存在しないので相補
鎖合成はスタートしない。４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ）をインクジェット方式
により反応部の上部から順番に加える。相補鎖合成され
るべき順番の塩基種がｄＣＴＰであるときには、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰを加えても反応は起こらない。
しかし、ｄＣＴＰが添加されると反応がおこり、相補鎖
が１つ伸長してピロリン酸（ＰＰｉ）が放出される。ピ
ロリン酸はＡＴＰスルフリラーゼによりＡＴＰに変えら
れ、ルシフェラーゼの存在の下でルシフェリンと反応し
て燐光を放出する。この燐光を二次電子増倍管等により
検出する。余分なｄＣＴＰあるいは反応しなかったｄＮ
ＴＰはアピラーゼにより分解され、以後に繰り返される
ｄＮＴＰ注入とそれによる反応には影響しない形に変え
られる。４種のｄＮＴＰは順番に繰り返し加えられ、そ
のときに発する燐光の有無により１つずつ配列を決定す
る。この一連の反応は図３に示される（Ronaghi,M.ら,
Science 281, 363-365 (1998)参照のこと）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】現状のパイロシーケン
シングではｄＮＴＰ注入にインクジェットノズルを用い
ており、インクジェットノズル等の制御部等を含めると
かなりの装置容積を必要とするという問題がある。ま
た、試料となる目的ＤＮＡは１本鎖状として反応部に入
れる必要があり、試料調製に手間がかかるという問題が
ある。目的ＤＮＡ以外に相補鎖合成するＤＮＡが存在す
ると配列決定できない。配列決定可能な長さは報告され
ている限りでは２０塩基〜３０塩基である。これは配列
決定がステップ反応によっているためであり、反応の収
率が配列決定可能な塩基長に大きく影響する。
シングではｄＮＴＰ注入にインクジェットノズルを用い
ており、インクジェットノズル等の制御部等を含めると
かなりの装置容積を必要とするという問題がある。ま
た、試料となる目的ＤＮＡは１本鎖状として反応部に入
れる必要があり、試料調製に手間がかかるという問題が
ある。目的ＤＮＡ以外に相補鎖合成するＤＮＡが存在す
ると配列決定できない。配列決定可能な長さは報告され
ている限りでは２０塩基〜３０塩基である。これは配列
決定がステップ反応によっているためであり、反応の収
率が配列決定可能な塩基長に大きく影響する。
【０００７】パイロシーケンシングを活用したシステム
として、手のひらサイズのＤＮＡシーケンサー、遺伝子
診断あるいは比較解析用大量解析用ＤＮＡシーケンサ
ー、あるいはＤＮＡ変異分析システム等が考えられる。
しかし、これらシステムの実現には、（１）いかに簡単
で安価な小型装置を実現するか。（２）いかにして分析
対象試料調製の手間を省き、かつ種々サンプルを同時に
簡単に分析するか。（３）いかにして反応を均一に進
め、反応収率をあげるか。等の種々の技術課題の解決が
必要である。このような課題を克服した小型で安価な装
置と、より簡便なサンプル調製を可能とし、必要に応じ
て長い塩基配列をも決定できるシステムの開発が望まれ
ていた。
として、手のひらサイズのＤＮＡシーケンサー、遺伝子
診断あるいは比較解析用大量解析用ＤＮＡシーケンサ
ー、あるいはＤＮＡ変異分析システム等が考えられる。
しかし、これらシステムの実現には、（１）いかに簡単
で安価な小型装置を実現するか。（２）いかにして分析
対象試料調製の手間を省き、かつ種々サンプルを同時に
簡単に分析するか。（３）いかにして反応を均一に進
め、反応収率をあげるか。等の種々の技術課題の解決が
必要である。このような課題を克服した小型で安価な装
置と、より簡便なサンプル調製を可能とし、必要に応じ
て長い塩基配列をも決定できるシステムの開発が望まれ
ていた。
【０００８】本発明の目的は、小型で簡便な構成のＤＮ
Ａ塩基配列決定装置あるいは配列モニター装置を提供す
ること、試料調製が簡便にできるＤＮＡ塩基配列決定方
法あるいは配列モニター方法を提供することにある。
Ａ塩基配列決定装置あるいは配列モニター装置を提供す
ること、試料調製が簡便にできるＤＮＡ塩基配列決定方
法あるいは配列モニター方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明では、反応セル
（反応槽）とｄＮＴＰ供給路をマイクロ加工により形成
しモジュール化し、加圧により簡単にｄＮＴＰの供給を
可能とし、必要な装置あるいはシステムの物理的なサイ
ズを低減可能とした。インクジェット等にかえて簡単な
構成の試薬導入手段により、効率的な供給方法で必要十
分量のｄＮＴＰを反応領域に試薬を注入できるので、小
型、軽量、安価な装置が容易に実現できる。
（反応槽）とｄＮＴＰ供給路をマイクロ加工により形成
しモジュール化し、加圧により簡単にｄＮＴＰの供給を
可能とし、必要な装置あるいはシステムの物理的なサイ
ズを低減可能とした。インクジェット等にかえて簡単な
構成の試薬導入手段により、効率的な供給方法で必要十
分量のｄＮＴＰを反応領域に試薬を注入できるので、小
型、軽量、安価な装置が容易に実現できる。
【００１０】さらに、種々プライマーを固体表面あるい
はビーズ等に固定して２本鎖ＤＮＡサンプルをプライマ
ーにハイブリダイズすることでターゲットとなるＤＮＡ
を取り出し、簡単にかつ必要十分な量だけＤＮＡサンプ
ルを供給しうるようにした。１本鎖にすることなく目的
ＤＮＡを反応部に注入するので、簡便な試料調製により
配列決定反応ができる。
はビーズ等に固定して２本鎖ＤＮＡサンプルをプライマ
ーにハイブリダイズすることでターゲットとなるＤＮＡ
を取り出し、簡単にかつ必要十分な量だけＤＮＡサンプ
ルを供給しうるようにした。１本鎖にすることなく目的
ＤＮＡを反応部に注入するので、簡便な試料調製により
配列決定反応ができる。
【００１１】さらに、長いＤＮＡの配列解析ができるよ
う、反応を十分進ませるために、反応槽を振動素子と接
触させ、加えられたｄＮＴＰを反応液と十分混合するよ
うに反応部の構造を工夫した。注入されたｄＮＴＰを撹
拌することにより反応収率をあげることができる。
う、反応を十分進ませるために、反応槽を振動素子と接
触させ、加えられたｄＮＴＰを反応液と十分混合するよ
うに反応部の構造を工夫した。注入されたｄＮＴＰを撹
拌することにより反応収率をあげることができる。
【００１２】本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法、装置で
は、ＤＮＡ相補鎖合成するときに生成するピロリン酸を
ＡＴＰに変換し、ルシフェラーゼを用いてルシフェリン
を光らせ、発生した光を検出することにより、取り込ま
れた核酸の種類を知り塩基配列決定する。反応部に４種
のｄＮＴＰを順次供給するが、これを毛細管あるいは細
溝により試薬溜と反応部を連結して加圧して行なう。本
発明によれば、手のひらサイズのＤＮＡ配列決定装置を
作成でき、複数の反応槽を小さな領域に設けることによ
り、多種類ＤＮＡの同時解析が可能となる。
は、ＤＮＡ相補鎖合成するときに生成するピロリン酸を
ＡＴＰに変換し、ルシフェラーゼを用いてルシフェリン
を光らせ、発生した光を検出することにより、取り込ま
れた核酸の種類を知り塩基配列決定する。反応部に４種
のｄＮＴＰを順次供給するが、これを毛細管あるいは細
溝により試薬溜と反応部を連結して加圧して行なう。本
発明によれば、手のひらサイズのＤＮＡ配列決定装置を
作成でき、複数の反応槽を小さな領域に設けることによ
り、多種類ＤＮＡの同時解析が可能となる。
【００１３】すなわち本発明は、以下の（１）〜（２
６）を提供する。 （１） 鋳型DNAの相補鎖を合成する際にできるピロリ
ン酸をATPに変換し、これをルシフェラーゼなどの酵素
の存在下でルシフェリンに作用させ、得られる燐光を検
出することで相補鎖合成をモニターし、DNA配列情報を
得るＤＮＡ塩基配列決定方法において、４種のdNTPを、
反応液と接し得るそれぞれ異なる毛細管あるいは細溝を
通して加圧により反応部に供給する事を特徴とする上記
方法。
６）を提供する。 （１） 鋳型DNAの相補鎖を合成する際にできるピロリ
ン酸をATPに変換し、これをルシフェラーゼなどの酵素
の存在下でルシフェリンに作用させ、得られる燐光を検
出することで相補鎖合成をモニターし、DNA配列情報を
得るＤＮＡ塩基配列決定方法において、４種のdNTPを、
反応液と接し得るそれぞれ異なる毛細管あるいは細溝を
通して加圧により反応部に供給する事を特徴とする上記
方法。
【００１４】（２） 各dNTP溜に順次圧力を加えること
により、各dNTPを予め定められた順序で反応部に供給す
ることを特徴とする上記（１）に記載の方法。 （３） 鋳型DNAの相補鎖を合成する際にできるピロリ
ン酸をATPに変換し、これをルシフェラーゼなどの酵素
の存在下でルシフェリンに作用させ、得られる燐光を検
出することで相補鎖合成をモニターし、DNA配列情報を
得るシステムにおいて、４種のdNTPを、反応部と接し得
るそれぞれ異なる毛細管あるいは細溝を通して加圧ある
いは送液システムにより反応部に供給する手段を有する
ことを特徴とするシステム。
により、各dNTPを予め定められた順序で反応部に供給す
ることを特徴とする上記（１）に記載の方法。 （３） 鋳型DNAの相補鎖を合成する際にできるピロリ
ン酸をATPに変換し、これをルシフェラーゼなどの酵素
の存在下でルシフェリンに作用させ、得られる燐光を検
出することで相補鎖合成をモニターし、DNA配列情報を
得るシステムにおいて、４種のdNTPを、反応部と接し得
るそれぞれ異なる毛細管あるいは細溝を通して加圧ある
いは送液システムにより反応部に供給する手段を有する
ことを特徴とするシステム。
【００１５】（４） 反応部と、dNTPを供給する毛細管
あるいは細溝が１つのモジュールに組み込まれ、一体と
なっていることを特徴とする、上記（３）に記載のシス
テム。 （５） dNTPを供給する毛細管あるいは細溝を反応部の
上部から反応液中に導入することができる構成であるこ
とを特徴とする、上記（３）に記載のシステム。 （６） 断続的に繰り返して行う反応部へのdNTP供給の
制御を、各dNTP溜への加圧の制御、あるいは加圧に加え
てdNTP溜と反応部の間にかけられる電界の制御により行
うことを特徴とする（３）から（５）のいずれかに記載
のシステム。
あるいは細溝が１つのモジュールに組み込まれ、一体と
なっていることを特徴とする、上記（３）に記載のシス
テム。 （５） dNTPを供給する毛細管あるいは細溝を反応部の
上部から反応液中に導入することができる構成であるこ
とを特徴とする、上記（３）に記載のシステム。 （６） 断続的に繰り返して行う反応部へのdNTP供給の
制御を、各dNTP溜への加圧の制御、あるいは加圧に加え
てdNTP溜と反応部の間にかけられる電界の制御により行
うことを特徴とする（３）から（５）のいずれかに記載
のシステム。
【００１６】（７） 少なくとも１つ以上の反応部と、
４種のdNTPに対応して少なくとも４系統の試薬導入用毛
細管を具備しており、反応部入り口の毛細管あるいは細
溝の内径が0.2mm以下であるか、および／または断面積
が0.04mm2以下であることを特徴とする、上記（３）か
ら（６）のいずれかに記載のシステムに用いる反応モジ
ュール。
４種のdNTPに対応して少なくとも４系統の試薬導入用毛
細管を具備しており、反応部入り口の毛細管あるいは細
溝の内径が0.2mm以下であるか、および／または断面積
が0.04mm2以下であることを特徴とする、上記（３）か
ら（６）のいずれかに記載のシステムに用いる反応モジ
ュール。
【００１７】（８） 少なくとも１つ以上の反応部と、
４種のdNTPに対応して少なくとも４系統の試薬導入用毛
細管を具備しており、反応部入り口の毛細管あるいは細
溝の内径が0.1mm以下であるか、および／または断面積
が0.01mm2以下であることを特徴とする、上記（３）か
ら（６）のいずれかに記載のシステムに用いる反応モジ
ュール。 （９） dNTPを含む反応試薬を、反応部下部から毛細管
あるいは細溝を通して試薬溜から反応部へ導入すること
が可能な構造であることを特徴とする上記（７）または
（８）に記載の反応モジュール。
４種のdNTPに対応して少なくとも４系統の試薬導入用毛
細管を具備しており、反応部入り口の毛細管あるいは細
溝の内径が0.1mm以下であるか、および／または断面積
が0.01mm2以下であることを特徴とする、上記（３）か
ら（６）のいずれかに記載のシステムに用いる反応モジ
ュール。 （９） dNTPを含む反応試薬を、反応部下部から毛細管
あるいは細溝を通して試薬溜から反応部へ導入すること
が可能な構造であることを特徴とする上記（７）または
（８）に記載の反応モジュール。
【００１８】（１０） dNTPを含む反応試薬供給ユニッ
トと反応部ユニットが分離可能であり、反応部の上部に
取り付けられた反応試薬供給ユニットから各反応試薬が
交互に繰り返して各反応液中に毛細管あるいは細溝を通
してそれぞれ供給されることを特徴とする上記（７）ま
たは（８）に記載の反応モジュール。
トと反応部ユニットが分離可能であり、反応部の上部に
取り付けられた反応試薬供給ユニットから各反応試薬が
交互に繰り返して各反応液中に毛細管あるいは細溝を通
してそれぞれ供給されることを特徴とする上記（７）ま
たは（８）に記載の反応モジュール。
【００１９】（１１） 鋳型DNAの相補鎖を合成する際
にできるピロリン酸をATPに変換し、これをルシフェラ
ーゼなどの酵素の存在下でルシフェリンに作用させ、得
られる燐光を検出することで相補鎖合成をモニターし、
DNA配列情報を得るDNA配列決定方法において、相補鎖合
成の開始地点を規定するプライマーを固体表面上に固定
し、それにハイブリダイズしたDNAの相補鎖を合成する
際にでるピロリン酸をATPに変換してルシフェリン、ル
シフェラーゼなどと反応せしめ、得られる燐光を検出す
ることでDNA塩基配列をモニターすることを特徴とす
る、上記方法。
にできるピロリン酸をATPに変換し、これをルシフェラ
ーゼなどの酵素の存在下でルシフェリンに作用させ、得
られる燐光を検出することで相補鎖合成をモニターし、
DNA配列情報を得るDNA配列決定方法において、相補鎖合
成の開始地点を規定するプライマーを固体表面上に固定
し、それにハイブリダイズしたDNAの相補鎖を合成する
際にでるピロリン酸をATPに変換してルシフェリン、ル
シフェラーゼなどと反応せしめ、得られる燐光を検出す
ることでDNA塩基配列をモニターすることを特徴とす
る、上記方法。
【００２０】（１２） ターゲットDNAにハイブリダイ
ズする複数種のプライマーをそれぞれ異なる固体表面あ
るいは固体表面の区画された異なるセルに固定し、ター
ゲットDNAをハイブリダイズさせた後、所定の反応をdNT
Pを用いて行い、それぞれの異なるプライマーに起因す
る相補鎖合成反応の結果放出される燐光を識別してモニ
ターすることを特徴とする上記（１１）記載の方法。
ズする複数種のプライマーをそれぞれ異なる固体表面あ
るいは固体表面の区画された異なるセルに固定し、ター
ゲットDNAをハイブリダイズさせた後、所定の反応をdNT
Pを用いて行い、それぞれの異なるプライマーに起因す
る相補鎖合成反応の結果放出される燐光を識別してモニ
ターすることを特徴とする上記（１１）記載の方法。
【００２１】（１３） プライマーを、プライマーの種
類ごとに空間的に分離されたビーズの表面上にそれぞれ
固定することを特徴とする上記（１１）記載の方法。 （１４） プライマーを表面上に固定した固体が、プラ
イマーの種類ごとに空間的に分離されたセル内に保持さ
れていることを特徴とする、上記（１１）記載の方法。 （１５） 上記（１１）〜（１４）のいずれかに記載の
方法に使用するシステム。
類ごとに空間的に分離されたビーズの表面上にそれぞれ
固定することを特徴とする上記（１１）記載の方法。 （１４） プライマーを表面上に固定した固体が、プラ
イマーの種類ごとに空間的に分離されたセル内に保持さ
れていることを特徴とする、上記（１１）記載の方法。 （１５） 上記（１１）〜（１４）のいずれかに記載の
方法に使用するシステム。
【００２２】（１６） 燐光の発光位置が識別可能な検
出システムであることを特徴とする上記（１５）記載の
DNA解析システム。 （１７） 燐光検出を冷却CCDなどのエリアセンサーに
よって行うことを特徴とする上記（１５）記載のDNA解
析システム。 （１８） 燐光検出手段を、光電子増倍管あるいはアバ
ランシエフォトダイオードなどの光検出デバイスと、反
応部の位置を検出器に対して相対的に移動可能なシステ
ムで構成したことを特徴とする上記（１５）記載のDNA
解析システム。
出システムであることを特徴とする上記（１５）記載の
DNA解析システム。 （１７） 燐光検出を冷却CCDなどのエリアセンサーに
よって行うことを特徴とする上記（１５）記載のDNA解
析システム。 （１８） 燐光検出手段を、光電子増倍管あるいはアバ
ランシエフォトダイオードなどの光検出デバイスと、反
応部の位置を検出器に対して相対的に移動可能なシステ
ムで構成したことを特徴とする上記（１５）記載のDNA
解析システム。
【００２３】（１９） 試薬の供給を反応部と非接触の
方法で行うことができることを特徴とする上記（１５）
記載のシステム。 （２０） 複数の反応部の各反応部への試薬の供給を同
時にインクジェット方式で行うことを特徴とする上記
（１５）記載のシステム。 （２１） 試薬の供給を反応部に通じる管径が0.2mm以
下の毛細管を通して行うことを特徴とする上記（１５）
記載のシステム。
方法で行うことができることを特徴とする上記（１５）
記載のシステム。 （２０） 複数の反応部の各反応部への試薬の供給を同
時にインクジェット方式で行うことを特徴とする上記
（１５）記載のシステム。 （２１） 試薬の供給を反応部に通じる管径が0.2mm以
下の毛細管を通して行うことを特徴とする上記（１５）
記載のシステム。
【００２４】（２２） 相補鎖合成の鋳型となるDNAを
固体表面上に固定し、それにハイブリダイズする相補鎖
を合成する際にでるピロリン酸をATPに変換してルシフ
ェリン、ルシフェラーゼなどと反応せしめ、得られる燐
光を検出することでDNA塩基配列をモニターすることを
特徴とするシステムにおいて、第一回目のプライマーを
用いた配列決定操作後にプライマー及び相補鎖合成産物
を除去し、新たにプライマー、酵素類を注入し、第二回
目のDNA配列解析を引き続き行う事のできる機能を有
し、必要に応じてこのプロセスを繰り返し行う事のでき
る機能を具備する事を特徴とするシステム。
固体表面上に固定し、それにハイブリダイズする相補鎖
を合成する際にでるピロリン酸をATPに変換してルシフ
ェリン、ルシフェラーゼなどと反応せしめ、得られる燐
光を検出することでDNA塩基配列をモニターすることを
特徴とするシステムにおいて、第一回目のプライマーを
用いた配列決定操作後にプライマー及び相補鎖合成産物
を除去し、新たにプライマー、酵素類を注入し、第二回
目のDNA配列解析を引き続き行う事のできる機能を有
し、必要に応じてこのプロセスを繰り返し行う事のでき
る機能を具備する事を特徴とするシステム。
【００２５】（２３） 種々異なるターゲットDNA（DNA
サンプル）をそれぞれ異なる固体表面上あるいは区画さ
れた異なるセルに固定し、プライマーをハイブリダイズ
させた後、所定の反応を酵素とdNTPを用いて行い、それ
ぞれの異なる相補鎖合成反応の結果生成する燐光を識別
してモニターする手段を具備することを特徴とする上記
（２２）に記載のシステム。 （２４） 反応部と、４種のdNTPをそれぞれ保持する試
薬溜と、該試薬溜から該反応部にdNTPを供給するため
の、少なくとも一部が毛細管または細溝からなる供給手
段と、試薬の供給を制御する加圧手段と、反応部からの
燐光を検出する検出手段と、検出されたデータを処理し
てDNA配列情報を得るデータ解析手段とを含むことを特
徴とする、DNA塩基配列決定装置。
サンプル）をそれぞれ異なる固体表面上あるいは区画さ
れた異なるセルに固定し、プライマーをハイブリダイズ
させた後、所定の反応を酵素とdNTPを用いて行い、それ
ぞれの異なる相補鎖合成反応の結果生成する燐光を識別
してモニターする手段を具備することを特徴とする上記
（２２）に記載のシステム。 （２４） 反応部と、４種のdNTPをそれぞれ保持する試
薬溜と、該試薬溜から該反応部にdNTPを供給するため
の、少なくとも一部が毛細管または細溝からなる供給手
段と、試薬の供給を制御する加圧手段と、反応部からの
燐光を検出する検出手段と、検出されたデータを処理し
てDNA配列情報を得るデータ解析手段とを含むことを特
徴とする、DNA塩基配列決定装置。
【００２６】（２５）上記（１）、（２）及び（１２）
のいずれかに記載の方法において、ｄＮＴＰを加える際
に、同じ種類を二度ずつ加えて、反応が十分進行したこ
とを確認しながら配列決定する方法。 （２６）上記（３）〜（６）及び（２３）のいずれかに
記載のシステムにおいて、ｄＮＴＰを加える際に、同じ
種類を二度ずつ加えて、反応が十分進行したことを確認
しながら配列決定するシステム。
のいずれかに記載の方法において、ｄＮＴＰを加える際
に、同じ種類を二度ずつ加えて、反応が十分進行したこ
とを確認しながら配列決定する方法。 （２６）上記（３）〜（６）及び（２３）のいずれかに
記載のシステムにおいて、ｄＮＴＰを加える際に、同じ
種類を二度ずつ加えて、反応が十分進行したことを確認
しながら配列決定するシステム。
【００２７】
【発明の実施の形態】以下、本発明の詳細を実施例に従
い、図を用いて説明する。 （実施例１）図１は、本発明の実施例１の構成例を示す
図であり、１つの反応部とｄＮＴＰ試薬溜を持つパイロ
シーケンシングデバイス（ＤＮＡ塩基配列決定装置）の
構成例を示す図である。反応モジュールは、デバイス基
板５に形成された反応槽（反応部）１０と４種のｄＮＴ
Ｐをそれぞれ保持する試薬溜１、２、３、４とからなっ
ている。反応槽１０と各溜は試料導入用キャピラリー
（毛細管）１２で結ばれており、各試薬溜から反応に用
いるｄＮＴＰが反応部に供給される。ｄＮＴＰの運搬は
試薬溜の液面を加圧して反応槽１０に流入させるが、反
応液の逆流等を押さえたり、液面の少しの差で試薬が他
方に流れることを防止する必要がある。そこで各キャピ
ラリーの内径は０．１ｍｍ以下、あるいは断面積を０．
０１ｍｍ2以下とした。この例では反応槽１０と試薬溜
１〜４をガラス製のキャピラリー１２でつないだが、微
細加工を用いた細溝を試薬導入管として用いてもよい。
い、図を用いて説明する。 （実施例１）図１は、本発明の実施例１の構成例を示す
図であり、１つの反応部とｄＮＴＰ試薬溜を持つパイロ
シーケンシングデバイス（ＤＮＡ塩基配列決定装置）の
構成例を示す図である。反応モジュールは、デバイス基
板５に形成された反応槽（反応部）１０と４種のｄＮＴ
Ｐをそれぞれ保持する試薬溜１、２、３、４とからなっ
ている。反応槽１０と各溜は試料導入用キャピラリー
（毛細管）１２で結ばれており、各試薬溜から反応に用
いるｄＮＴＰが反応部に供給される。ｄＮＴＰの運搬は
試薬溜の液面を加圧して反応槽１０に流入させるが、反
応液の逆流等を押さえたり、液面の少しの差で試薬が他
方に流れることを防止する必要がある。そこで各キャピ
ラリーの内径は０．１ｍｍ以下、あるいは断面積を０．
０１ｍｍ2以下とした。この例では反応槽１０と試薬溜
１〜４をガラス製のキャピラリー１２でつないだが、微
細加工を用いた細溝を試薬導入管として用いてもよい。
【００２８】図２は、本発明の実施例１の他の構成例を
示す図であり、複数の反応部を持ち、外部に設けられた
試薬溜と複数の反応部を配管で結合したパイロシーケン
シングデバイス（ＤＮＡ塩基配列決定装置）の反応モジ
ュールの構成例を示す図である。図２は、複数の反応部
（反応槽）１０と試薬導入用細管６が一体にデバイス基
板５に形成された反応モジュールの例を示す。試薬はこ
の反応モジュールと分離された試薬溜１、２、３、４に
保持され、試薬導入用細管６を通して各反応槽１０に導
入される。試薬導入用細管６の各反応槽１０に接する各
２ｃｍの領域が約０．１ｍｍ内径の細い毛細管（キャピ
ラリー）で構成されており、ここを通過する液体抵抗が
注入スピードを決める。
示す図であり、複数の反応部を持ち、外部に設けられた
試薬溜と複数の反応部を配管で結合したパイロシーケン
シングデバイス（ＤＮＡ塩基配列決定装置）の反応モジ
ュールの構成例を示す図である。図２は、複数の反応部
（反応槽）１０と試薬導入用細管６が一体にデバイス基
板５に形成された反応モジュールの例を示す。試薬はこ
の反応モジュールと分離された試薬溜１、２、３、４に
保持され、試薬導入用細管６を通して各反応槽１０に導
入される。試薬導入用細管６の各反応槽１０に接する各
２ｃｍの領域が約０．１ｍｍ内径の細い毛細管（キャピ
ラリー）で構成されており、ここを通過する液体抵抗が
注入スピードを決める。
【００２９】図１、図２に示す反応モジュールは、図５
〜図１０に示す反応モジュールと同様に、暗箱等の内部
にセットされ、外部の光から遮光されている。図１、図
２に示す反応モジュールの反応部の上部あるいは下部は
透明部材で構成されており、発光はこの窓を通して検出
器７に導かれる。窓に接して、もしくはレンズで集光
し、または光ファイバー等でガイドして光電子増倍管で
検出したり、冷却ＣＣＤ等のエリアセンサーで検出す
る。検出可能な光の量を多くするために、受光する側と
反対側に平面あるいは凹面の反射鏡を設置するのも有効
である。
〜図１０に示す反応モジュールと同様に、暗箱等の内部
にセットされ、外部の光から遮光されている。図１、図
２に示す反応モジュールの反応部の上部あるいは下部は
透明部材で構成されており、発光はこの窓を通して検出
器７に導かれる。窓に接して、もしくはレンズで集光
し、または光ファイバー等でガイドして光電子増倍管で
検出したり、冷却ＣＣＤ等のエリアセンサーで検出す
る。検出可能な光の量を多くするために、受光する側と
反対側に平面あるいは凹面の反射鏡を設置するのも有効
である。
【００３０】反応モジュールの反応槽１０内に鋳型ＤＮ
Ａ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼ、アピ
ラーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ等の試薬を注入
する。一方、４つの反応試薬溜１、２、３、４にはバフ
ァー液とそれぞれｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およ
びｄＴＴＰを注入する。反応部１０と各試薬溜１〜４を
結ぶ毛細管には反応液が満たされるが、動作上支障はな
い。また、この毛細管を疎水性のもので構成し、最初は
液が毛細管内に入らないようにしてもよい。この場合、
毛細管には空気が入っており、液体の流動は反応操作を
開始するまではない。いずれの場合も、反応に際しては
ｄＮＴＰを反応部に加圧注入するので実用上問題はな
い。試薬を所定の反応槽に注入して４種の試薬溜を順次
加圧し、４種のｄＮＴＰを一定の順序で反応槽に導入し
て相補鎖合成を行う。相補鎖に取り込まれるべき塩基が
Ａの場合にｄＡＴＰを加えると相補鎖が１つ伸張し、反
応産物としてピロリン酸が放出される。これはＡＴＰス
ルフリラーゼによりＡＴＰに変換され、ルシフェラーゼ
の働きでルシフェリンと作用し光を発する。
Ａ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼ、アピ
ラーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ等の試薬を注入
する。一方、４つの反応試薬溜１、２、３、４にはバフ
ァー液とそれぞれｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およ
びｄＴＴＰを注入する。反応部１０と各試薬溜１〜４を
結ぶ毛細管には反応液が満たされるが、動作上支障はな
い。また、この毛細管を疎水性のもので構成し、最初は
液が毛細管内に入らないようにしてもよい。この場合、
毛細管には空気が入っており、液体の流動は反応操作を
開始するまではない。いずれの場合も、反応に際しては
ｄＮＴＰを反応部に加圧注入するので実用上問題はな
い。試薬を所定の反応槽に注入して４種の試薬溜を順次
加圧し、４種のｄＮＴＰを一定の順序で反応槽に導入し
て相補鎖合成を行う。相補鎖に取り込まれるべき塩基が
Ａの場合にｄＡＴＰを加えると相補鎖が１つ伸張し、反
応産物としてピロリン酸が放出される。これはＡＴＰス
ルフリラーゼによりＡＴＰに変換され、ルシフェラーゼ
の働きでルシフェリンと作用し光を発する。
【００３１】図３は、本発明の実施例１のパイロシーケ
ンシングで行われる一連の反応を示す図である。過剰の
ｄＡＴＰはアピラーゼにより分解されるので、試薬注入
直後に光り、信号が増大し直ちに減衰する。すなわち、
時間変化をみているとピーク状の光信号が得られる。一
方、相補鎖に取り込まれるべき塩基種と異なるｄＮＴＰ
が注入された場合には反応は起こらないので光はでな
い。このようにｄＮＴＰの種類を変化させながら相補鎖
合成を一歩一歩行っていく過程で発光が見られるか否か
でＤＮＡ塩基配列を決定する。反応が不十分な場合に
は、それぞれのＤＮＡ鎖で反応の進行が不揃いとなり、
塩基配列決定に支障を来す。
ンシングで行われる一連の反応を示す図である。過剰の
ｄＡＴＰはアピラーゼにより分解されるので、試薬注入
直後に光り、信号が増大し直ちに減衰する。すなわち、
時間変化をみているとピーク状の光信号が得られる。一
方、相補鎖に取り込まれるべき塩基種と異なるｄＮＴＰ
が注入された場合には反応は起こらないので光はでな
い。このようにｄＮＴＰの種類を変化させながら相補鎖
合成を一歩一歩行っていく過程で発光が見られるか否か
でＤＮＡ塩基配列を決定する。反応が不十分な場合に
は、それぞれのＤＮＡ鎖で反応の進行が不揃いとなり、
塩基配列決定に支障を来す。
【００３２】そこで反応を均一にするために反応モジュ
ールを振動させるデバイスが取り付けられている。例え
ば、図７に示すように、周波数２０ｋＨｚの振動子３２
が使用できるが、特に限定されるものではなく、また反
応液を撹拌できればデバイスを振動させないものでもよ
い。また、同じｄＮＴＰを２回ずつ加えて反応の進行が
十分であることを確認しながら行っても良い。
ールを振動させるデバイスが取り付けられている。例え
ば、図７に示すように、周波数２０ｋＨｚの振動子３２
が使用できるが、特に限定されるものではなく、また反
応液を撹拌できればデバイスを振動させないものでもよ
い。また、同じｄＮＴＰを２回ずつ加えて反応の進行が
十分であることを確認しながら行っても良い。
【００３３】図１、図２に示す反応モジュールの反応部
で発生した発光は光電子増倍管７等で受光された後、電
流・電圧増幅器８、ＡＤ変換器等を経て計算機（データ
処理器）９に導入されデータ処理され、塩基配列決定結
果が出力される。図４は、本発明の実施例１の構成によ
り実験で得られる発光信号の一例を示し、縦軸は発光強
度、横軸は時間を示す図である。
で発生した発光は光電子増倍管７等で受光された後、電
流・電圧増幅器８、ＡＤ変換器等を経て計算機（データ
処理器）９に導入されデータ処理され、塩基配列決定結
果が出力される。図４は、本発明の実施例１の構成によ
り実験で得られる発光信号の一例を示し、縦軸は発光強
度、横軸は時間を示す図である。
【００３４】dNTP試薬はdATP、 dCTP、 dTTP、 dGTPの
順序で繰り返し反応部に注入される。それに応じて光が
でるが、相補鎖合成がおこったときには強い光が出る。
相補鎖合成が起こらないと本来Ppiができず光はでない
が、試薬中に含まれる不純物などのためにわずかに光が
出る。大きな光信号を発する場合に注入されたdNTPの種
類を記録していくことで配列決定ができる。同じ塩基種
がつながっており、続けて同じ塩基が取り込まれるとき
には生成するPpiの量が増加する。２個とりこまれると
きには約二倍の、３個取り込まれるときには約３倍の強
度の光が出る。このような相補鎖合成反応は１００％行
われるわけではなく、反応が進むと未反応のDNA鎖も増
えてきて本来光が出ないdNTP添加のときでも光が観測さ
れるようになる。これによって配列決定できるDNAの長
さ限界がほぼ決まる。図では５０塩基以上の配列決定が
可能な例を示している。
順序で繰り返し反応部に注入される。それに応じて光が
でるが、相補鎖合成がおこったときには強い光が出る。
相補鎖合成が起こらないと本来Ppiができず光はでない
が、試薬中に含まれる不純物などのためにわずかに光が
出る。大きな光信号を発する場合に注入されたdNTPの種
類を記録していくことで配列決定ができる。同じ塩基種
がつながっており、続けて同じ塩基が取り込まれるとき
には生成するPpiの量が増加する。２個とりこまれると
きには約二倍の、３個取り込まれるときには約３倍の強
度の光が出る。このような相補鎖合成反応は１００％行
われるわけではなく、反応が進むと未反応のDNA鎖も増
えてきて本来光が出ないdNTP添加のときでも光が観測さ
れるようになる。これによって配列決定できるDNAの長
さ限界がほぼ決まる。図では５０塩基以上の配列決定が
可能な例を示している。
【００３５】（実施例２）図５は、本発明の実施例２の
構成例を示す図であり、反応部に上部からキャピラリー
でｄＮＴＰを注入するタイプのパイロシーケンシングデ
バイス（ＤＮＡ塩基配列決定装置）の構成例を示す図で
ある。実施例２では試薬注入を反応槽１０の上部から行
う。実施例２の反応モジュールは、デバイス基板５に形
成された反応部（反応槽）１０と、デバイス基板５と分
離可能なふた（試薬供給ユニット）１１から構成され
る。反応槽１０の上部から試薬導入用細管６と試薬導入
用毛細管（キャピラリー）１２を具備したふた１１が覆
い被さる。反応槽１０に接するキャピラリー１２の部分
は実施例１よりも長くなるので、キャピラリーの内径を
０．２ｍｍとした。内径０．２ｍｍのキャピラリーを通
過する液体抵抗が注入スピードを決める。反応槽１０と
ふた１１は密閉構造とすることができ、実施例１と同様
にして加圧により試薬を試薬溜１、２、３、４から反応
槽１０に供給する。加圧はポンプを用いたが、別の方法
として各試薬溜１〜４と反応槽１０との落差を用いても
よい。落差を用いる場合には、４種の試料溜１〜４の高
さを交互に変化させる必要がある。また、落差を一定に
保ち電解によるオスミックフローを活用して、電界で試
料の注入をコントロールしてもよい。また、マイクロシ
ステムで用いられる送液ポンプを活用しても良い。反応
槽１０と各試料溜１〜４の間に１ｋＶ〜２ｋＶの電圧を
かけ、反応槽１０から試料溜１〜４にオスミックフロー
を生成する。このオスミックフローは落差による液流と
逆方向でありほぼバランスする。電界の向きを逆転さ
せ、落差とオスミックフローの流れを一致させると試料
が反応槽へ供給される。このようなサンプル供給を反応
部の上部のふた部分に設けられた毛細管を通して行う方
式は、配列決定しようとするＤＮＡ試料の種類が多い場
合に有効である。
構成例を示す図であり、反応部に上部からキャピラリー
でｄＮＴＰを注入するタイプのパイロシーケンシングデ
バイス（ＤＮＡ塩基配列決定装置）の構成例を示す図で
ある。実施例２では試薬注入を反応槽１０の上部から行
う。実施例２の反応モジュールは、デバイス基板５に形
成された反応部（反応槽）１０と、デバイス基板５と分
離可能なふた（試薬供給ユニット）１１から構成され
る。反応槽１０の上部から試薬導入用細管６と試薬導入
用毛細管（キャピラリー）１２を具備したふた１１が覆
い被さる。反応槽１０に接するキャピラリー１２の部分
は実施例１よりも長くなるので、キャピラリーの内径を
０．２ｍｍとした。内径０．２ｍｍのキャピラリーを通
過する液体抵抗が注入スピードを決める。反応槽１０と
ふた１１は密閉構造とすることができ、実施例１と同様
にして加圧により試薬を試薬溜１、２、３、４から反応
槽１０に供給する。加圧はポンプを用いたが、別の方法
として各試薬溜１〜４と反応槽１０との落差を用いても
よい。落差を用いる場合には、４種の試料溜１〜４の高
さを交互に変化させる必要がある。また、落差を一定に
保ち電解によるオスミックフローを活用して、電界で試
料の注入をコントロールしてもよい。また、マイクロシ
ステムで用いられる送液ポンプを活用しても良い。反応
槽１０と各試料溜１〜４の間に１ｋＶ〜２ｋＶの電圧を
かけ、反応槽１０から試料溜１〜４にオスミックフロー
を生成する。このオスミックフローは落差による液流と
逆方向でありほぼバランスする。電界の向きを逆転さ
せ、落差とオスミックフローの流れを一致させると試料
が反応槽へ供給される。このようなサンプル供給を反応
部の上部のふた部分に設けられた毛細管を通して行う方
式は、配列決定しようとするＤＮＡ試料の種類が多い場
合に有効である。
【００３６】図６は、本発明の実施例２の他の構成例を
示す図であり、複数の反応部をもち、外部に配置された
試薬溜のｄＮＴＰを配管を通して上部からキャピラリー
により順番に注入するタイプのデバイス（反応モジュー
ル）の構成例を示す図である。図６に示す構成例は、多
数の反応容器（反応セル）を持ったマイクロタイタープ
レート５の反応セルを反応槽１０として用いた例であ
る。上部のふた１１はマイクロタイタープレートの上面
に密着され、反応部（反応槽、反応セル）１０を密封す
る事ができる。ふた１１には試料導入用キャピラリー１
２が各反応セル１０について４本設けられており、各反
応セルに各ｄＮＴＰを供給する。試料導入用キャピラリ
ー１２はそれぞれ太い試料導入用細管６を介して試料溜
１、２、３、４につながっている。試料溜に圧力を加え
ると各キャピラリー１２から反応槽１０に試薬が供給さ
れる。以下の反応は前述した通りである。
示す図であり、複数の反応部をもち、外部に配置された
試薬溜のｄＮＴＰを配管を通して上部からキャピラリー
により順番に注入するタイプのデバイス（反応モジュー
ル）の構成例を示す図である。図６に示す構成例は、多
数の反応容器（反応セル）を持ったマイクロタイタープ
レート５の反応セルを反応槽１０として用いた例であ
る。上部のふた１１はマイクロタイタープレートの上面
に密着され、反応部（反応槽、反応セル）１０を密封す
る事ができる。ふた１１には試料導入用キャピラリー１
２が各反応セル１０について４本設けられており、各反
応セルに各ｄＮＴＰを供給する。試料導入用キャピラリ
ー１２はそれぞれ太い試料導入用細管６を介して試料溜
１、２、３、４につながっている。試料溜に圧力を加え
ると各キャピラリー１２から反応槽１０に試薬が供給さ
れる。以下の反応は前述した通りである。
【００３７】（実施例３）図７は、本発明の実施例３の
構成例を示す図であり、複数の反応部と複数の試薬溜を
持ち、マイクロ加工等により作製した細管を用いて試薬
を反応部に供給する構造としたＤＮＡ配列決定装置の接
合型反応モジュールの構成例を示す図である。
構成例を示す図であり、複数の反応部と複数の試薬溜を
持ち、マイクロ加工等により作製した細管を用いて試薬
を反応部に供給する構造としたＤＮＡ配列決定装置の接
合型反応モジュールの構成例を示す図である。
【００３８】図７に示す接合型反応モジュールの例で
は、反応試薬を反応槽１０の下部から供給する。接合型
反応モジュールは、反応槽１０を構成する複数の穴が形
成された接合型反応モジュールの上部板１４と、複数の
試薬溜１、２、３、４、１’、２’、３’、４’および
試薬導入用キャピラリー（細溝）１３が形成された接合
型反応モジュールの下部板１５とが接合されて形成さ
れ、上部板１４と下部板１５の接合により複数の反応槽
１０が形成される。試薬溜１と試薬溜１’、試薬溜２と
試薬溜２’、試薬溜３と試薬溜３’、試薬溜４と試薬溜
４’は、それぞれ試薬導入用細管６により結ばれてお
り、試薬導入用細管６と各反応槽１０とが細溝１３によ
り結ばれる。反応槽１０の下部に形成される細溝１３か
らｄＮＴＰが供給される。
は、反応試薬を反応槽１０の下部から供給する。接合型
反応モジュールは、反応槽１０を構成する複数の穴が形
成された接合型反応モジュールの上部板１４と、複数の
試薬溜１、２、３、４、１’、２’、３’、４’および
試薬導入用キャピラリー（細溝）１３が形成された接合
型反応モジュールの下部板１５とが接合されて形成さ
れ、上部板１４と下部板１５の接合により複数の反応槽
１０が形成される。試薬溜１と試薬溜１’、試薬溜２と
試薬溜２’、試薬溜３と試薬溜３’、試薬溜４と試薬溜
４’は、それぞれ試薬導入用細管６により結ばれてお
り、試薬導入用細管６と各反応槽１０とが細溝１３によ
り結ばれる。反応槽１０の下部に形成される細溝１３か
らｄＮＴＰが供給される。
【００３９】実施例３の反応モジュールの構成では、洗
浄も容易であり繰り返し使用もできる。４種のｄＮＴＰ
はそれぞれ独立の試薬溜１、２、３、４に保持され、加
圧により反応部１０へ順番に供給される。図７に示す構
成では、試薬溜を１つのｄＮＴＰあたり２個設けたが、
これは反応液を送る試薬導入用細管６中に気泡等が入っ
た場合に、試薬溜を片方から加圧して気泡を反対側へ押
し流すためである。この試薬導入用細管６と反応部１０
はキャピラリー１３で結ばれているがキャピラリーの内
径は試料導入用細管６より細く、試薬溜の加圧時の圧力
損失はほぼキャピラリー１３の部分でおこる。ＤＮＡ相
補鎖合成反応が行われた時には、前述の反応により発光
し、実施例１、２と同様にして光検出器により検出され
る。なお、上部板１４には、加圧を行うために各試薬溜
に通じる穴が形成されている。また、反応を均一にする
ために反応モジュールを振動させる振動子３２を取り付
けている。
浄も容易であり繰り返し使用もできる。４種のｄＮＴＰ
はそれぞれ独立の試薬溜１、２、３、４に保持され、加
圧により反応部１０へ順番に供給される。図７に示す構
成では、試薬溜を１つのｄＮＴＰあたり２個設けたが、
これは反応液を送る試薬導入用細管６中に気泡等が入っ
た場合に、試薬溜を片方から加圧して気泡を反対側へ押
し流すためである。この試薬導入用細管６と反応部１０
はキャピラリー１３で結ばれているがキャピラリーの内
径は試料導入用細管６より細く、試薬溜の加圧時の圧力
損失はほぼキャピラリー１３の部分でおこる。ＤＮＡ相
補鎖合成反応が行われた時には、前述の反応により発光
し、実施例１、２と同様にして光検出器により検出され
る。なお、上部板１４には、加圧を行うために各試薬溜
に通じる穴が形成されている。また、反応を均一にする
ために反応モジュールを振動させる振動子３２を取り付
けている。
【００４０】キャピラリーは細溝１３として構成した
が、反応槽の底面に垂直方向に毛細管を設けてここから
試薬を供給してもよい。この実施例は多数の反応槽をも
うけたモジュールに有効である。
が、反応槽の底面に垂直方向に毛細管を設けてここから
試薬を供給してもよい。この実施例は多数の反応槽をも
うけたモジュールに有効である。
【００４１】図８は、本発明の実施例３の他の構成例を
示す図であり、外部に試薬溜を持ち、複数の反応部にマ
イクロ加工等により作製した溝を用いて試薬を供給する
構造としＤＮＡ配列決定装置の接合型反応モジュールの
構成例を示す図である。図８に示す接合型反応モジュー
ルの例では、図７に示す接合型反応モジュールの例と同
様に、反応試薬を反応槽１０の下部から供給する。接合
型反応モジュールは、反応槽１０を構成する複数の穴が
形成された接合型反応モジュールの上部板１４と、各反
応槽１０に対応してｄＮＴＰを供給する４本の試薬導入
用キャピラリー１３が埋め込まれた接合型反応モジュー
ルの中板１６と、４本の試薬導入用キャピラリー１３に
対応して４本の試薬導入用の溝６’が形成された接合型
反応モジュールの下部板１７とが接合されて形成され、
上部板１４と中板１６の接合により多数の相互に分離さ
れた反応槽１０が形成される。各反応槽に対応する４本
の試薬導入用の溝６’と試薬溜１、２、３、４とは試薬
導入用細管６により結ばれており、各反応槽に試薬がキ
ャピラリー１３から供給される。図８に示す反応モジュ
ールの構成では、洗浄も容易であり繰り返し使用でき
る。４種のｄＮＴＰはそれぞれ独立の試薬溜１、２、
３、４に保持され、加圧により細管６、溝６’、キャピ
ラリー１３を経由して各反応槽１０へ順番に供給され
る。溝６’と反応部１０はキャピラリー１３で結ばれて
いるがキャピラリー１３の内径は細管６より細く、加圧
時の圧力損失はほぼキャピラリー１３の部分でおこる。
ＤＮＡ相補鎖合成反応が行われた時には、前述の反応に
より発光し、実施例１、２と同様にして光検出器により
検出される。図８に示す反応モジュールの例では、反応
部を６個示したが９６穴のタイタープレートの穴のピッ
チと同じピッチで反応部を作製した反応モジュール等も
可能である。
示す図であり、外部に試薬溜を持ち、複数の反応部にマ
イクロ加工等により作製した溝を用いて試薬を供給する
構造としＤＮＡ配列決定装置の接合型反応モジュールの
構成例を示す図である。図８に示す接合型反応モジュー
ルの例では、図７に示す接合型反応モジュールの例と同
様に、反応試薬を反応槽１０の下部から供給する。接合
型反応モジュールは、反応槽１０を構成する複数の穴が
形成された接合型反応モジュールの上部板１４と、各反
応槽１０に対応してｄＮＴＰを供給する４本の試薬導入
用キャピラリー１３が埋め込まれた接合型反応モジュー
ルの中板１６と、４本の試薬導入用キャピラリー１３に
対応して４本の試薬導入用の溝６’が形成された接合型
反応モジュールの下部板１７とが接合されて形成され、
上部板１４と中板１６の接合により多数の相互に分離さ
れた反応槽１０が形成される。各反応槽に対応する４本
の試薬導入用の溝６’と試薬溜１、２、３、４とは試薬
導入用細管６により結ばれており、各反応槽に試薬がキ
ャピラリー１３から供給される。図８に示す反応モジュ
ールの構成では、洗浄も容易であり繰り返し使用でき
る。４種のｄＮＴＰはそれぞれ独立の試薬溜１、２、
３、４に保持され、加圧により細管６、溝６’、キャピ
ラリー１３を経由して各反応槽１０へ順番に供給され
る。溝６’と反応部１０はキャピラリー１３で結ばれて
いるがキャピラリー１３の内径は細管６より細く、加圧
時の圧力損失はほぼキャピラリー１３の部分でおこる。
ＤＮＡ相補鎖合成反応が行われた時には、前述の反応に
より発光し、実施例１、２と同様にして光検出器により
検出される。図８に示す反応モジュールの例では、反応
部を６個示したが９６穴のタイタープレートの穴のピッ
チと同じピッチで反応部を作製した反応モジュール等も
可能である。
【００４２】以上説明した実施例１〜実施例３では、試
料は予め１本鎖状態に調製されたＤＮＡをプライマー、
ポリメラーゼ及び他の試薬とともに試料毎ごとに異なる
反応セル（反応槽）に入れ、パイロシーケンシングの所
定の反応を行い配列を決定した。
料は予め１本鎖状態に調製されたＤＮＡをプライマー、
ポリメラーゼ及び他の試薬とともに試料毎ごとに異なる
反応セル（反応槽）に入れ、パイロシーケンシングの所
定の反応を行い配列を決定した。
【００４３】（実施例４）配列決定すべき試料として
は、複数種のＤＮＡ試料を含む場合、１つのＤＮＡに複
数の配列解析すべき場所がある場合、および配列解析を
段階的に繰り返して行う場合等が含まれる。実施例４
は、配列決定部位が複数ある場合の効率のよいＤＮＡ試
料供給に関する（図６〜図１０参照）。ここでは多数サ
ンプルを効率よく配列決定する例を示す。配列決定する
ターゲット毎に異なるプライマーを用いる。各プライマ
ーをペレット、ビーズ等の固体表面に固定し、区分けさ
れた固体表面上あるいはそれぞれ異なるビーズ表面に固
定し、空間的に識別できる配置で反応セル（反応部、反
応槽）内に保持する。次いでＤＮＡサンプルを反応部に
入れて固定されたプライマーとハイブリダイゼーション
させ、所定の配列を持つＤＮＡを捕獲する。残りのＤＮ
Ａを含む溶液を排出除去した後、反応液を注入してパイ
ロシーケンシングを先に説明した手順に従って行う。発
光は位置検出可能なＣＣＤアレーセンサーあるいは検出
位置をずらすことのできる共焦点顕微鏡技術を応用した
検出器等で発光位置を識別し、どのＤＮＡからの相補鎖
合成産物が光っているか識別できる構成とする。
は、複数種のＤＮＡ試料を含む場合、１つのＤＮＡに複
数の配列解析すべき場所がある場合、および配列解析を
段階的に繰り返して行う場合等が含まれる。実施例４
は、配列決定部位が複数ある場合の効率のよいＤＮＡ試
料供給に関する（図６〜図１０参照）。ここでは多数サ
ンプルを効率よく配列決定する例を示す。配列決定する
ターゲット毎に異なるプライマーを用いる。各プライマ
ーをペレット、ビーズ等の固体表面に固定し、区分けさ
れた固体表面上あるいはそれぞれ異なるビーズ表面に固
定し、空間的に識別できる配置で反応セル（反応部、反
応槽）内に保持する。次いでＤＮＡサンプルを反応部に
入れて固定されたプライマーとハイブリダイゼーション
させ、所定の配列を持つＤＮＡを捕獲する。残りのＤＮ
Ａを含む溶液を排出除去した後、反応液を注入してパイ
ロシーケンシングを先に説明した手順に従って行う。発
光は位置検出可能なＣＣＤアレーセンサーあるいは検出
位置をずらすことのできる共焦点顕微鏡技術を応用した
検出器等で発光位置を識別し、どのＤＮＡからの相補鎖
合成産物が光っているか識別できる構成とする。
【００４４】（実施例５）実施例５は、反応にアピラー
ゼ等のｄＮＴＰ分解酵素を用いない方式を実現した例で
ある。ＤＮＡをビーズに固定し、キャピラリー等からな
る反応セルに入れる。反応セルは分光セルのような角型
のものでもよい。複数のＤＮＡ配列を同時に配列決定す
るときには配列決定しようとするＤＮＡが区別できるよ
うに、ＤＮＡを固定したビーズを区分けして保持した
り、異なるセルに保持したりする。
ゼ等のｄＮＴＰ分解酵素を用いない方式を実現した例で
ある。ＤＮＡをビーズに固定し、キャピラリー等からな
る反応セルに入れる。反応セルは分光セルのような角型
のものでもよい。複数のＤＮＡ配列を同時に配列決定す
るときには配列決定しようとするＤＮＡが区別できるよ
うに、ＤＮＡを固定したビーズを区分けして保持した
り、異なるセルに保持したりする。
【００４５】図９は、本発明の実施例５の構成例を示す
図であり、ＤＮＡおよびプライマーをキャピラリー中に
あるビーズ上に保持し、キャピラリー内に試薬を流すこ
とにより相補鎖合成を段階的に行うＤＮＡ配列決定装置
の構成例を示す図である。キャピラリー型の反応部２０
の内部に、プローブおよびＤＮＡを保持したビーズ２３
を並べるが、種類の異なるＤＮＡを保持したビーズ２３
の間に分離用ビーズ２２がおかれており、反応生成物が
混合しないように工夫されている。分離用ビーズ２２の
直径はキャピラリー型反応部２０の内径よりやや小さ
く、ビーズ２３の直径は分離用ビーズ２２の直径よりも
小さく、キャピラリー２０の内部に反応液や洗浄液が流
入しても、分離用ビーズ２２の間からビーズ２３が抜け
出すことはない。なお、キャピラリー型反応部２０内の
試薬および洗浄液流入口２６および溶液出口２７の側に
はそれぞれ、分離用ビーズ２２の移動を妨げるストッパ
ーが形成されている。このような配置に分離用ビーズ２
２、プローブおよびＤＮＡを保持したビーズ２３を並べ
た後、反応試薬を含む溶液を試薬溜１、２、３、４の何
れかから、試薬および洗浄液流入口２６から反応部２０
に注入する。４種のｄＮＴＰを繰り返し順番に注入する
が、１つのｄＮＴＰの注入と反応の終了後には、導入管
接合部１９を切り替えて洗浄液溜１８から洗浄液を試薬
および洗浄液流入口２６から反応部２０に流して反応液
を溶液出口２７から廃液入れ２１に除去し、次のｄＮＴ
Ｐを入れる。キャピラリー型反応部２０としては内径
０．１ｍｍ〜０．３ｍｍ程度のものが用いられるが、反
応に要する液量は高々数マイクロリッターであり、１０
０回繰り返し反応しても消耗する試薬量は従来の方法に
比べると非常に少なく、ほとんど無視し得る量である。
図であり、ＤＮＡおよびプライマーをキャピラリー中に
あるビーズ上に保持し、キャピラリー内に試薬を流すこ
とにより相補鎖合成を段階的に行うＤＮＡ配列決定装置
の構成例を示す図である。キャピラリー型の反応部２０
の内部に、プローブおよびＤＮＡを保持したビーズ２３
を並べるが、種類の異なるＤＮＡを保持したビーズ２３
の間に分離用ビーズ２２がおかれており、反応生成物が
混合しないように工夫されている。分離用ビーズ２２の
直径はキャピラリー型反応部２０の内径よりやや小さ
く、ビーズ２３の直径は分離用ビーズ２２の直径よりも
小さく、キャピラリー２０の内部に反応液や洗浄液が流
入しても、分離用ビーズ２２の間からビーズ２３が抜け
出すことはない。なお、キャピラリー型反応部２０内の
試薬および洗浄液流入口２６および溶液出口２７の側に
はそれぞれ、分離用ビーズ２２の移動を妨げるストッパ
ーが形成されている。このような配置に分離用ビーズ２
２、プローブおよびＤＮＡを保持したビーズ２３を並べ
た後、反応試薬を含む溶液を試薬溜１、２、３、４の何
れかから、試薬および洗浄液流入口２６から反応部２０
に注入する。４種のｄＮＴＰを繰り返し順番に注入する
が、１つのｄＮＴＰの注入と反応の終了後には、導入管
接合部１９を切り替えて洗浄液溜１８から洗浄液を試薬
および洗浄液流入口２６から反応部２０に流して反応液
を溶液出口２７から廃液入れ２１に除去し、次のｄＮＴ
Ｐを入れる。キャピラリー型反応部２０としては内径
０．１ｍｍ〜０．３ｍｍ程度のものが用いられるが、反
応に要する液量は高々数マイクロリッターであり、１０
０回繰り返し反応しても消耗する試薬量は従来の方法に
比べると非常に少なく、ほとんど無視し得る量である。
【００４６】１つのｄＮＴＰの注入によりＤＮＡ相補鎖
合成反応が行われた時には、前述の反応により、ＤＮＡ
相補鎖合成反応が生成したビーズ２３の近傍で発光し、
図９に示す例では、発光は冷却ＣＣＤカメラ２４により
検出され、実施例１、２と同様にして、検出された発光
信号はデータ処理器２５で処理され塩基配列が決定され
ていく。
合成反応が行われた時には、前述の反応により、ＤＮＡ
相補鎖合成反応が生成したビーズ２３の近傍で発光し、
図９に示す例では、発光は冷却ＣＣＤカメラ２４により
検出され、実施例１、２と同様にして、検出された発光
信号はデータ処理器２５で処理され塩基配列が決定され
ていく。
【００４７】以上の説明では、キャピラリー型反応部２
０を用いて複数のＤＮＡ配列を同時に配列決定する構成
例について説明したが、複数の分画（セル）が形成され
た基板型の反応部を使用して、プローブおよびＤＮＡを
保持したビーズ２３を各分画（セル）に保持して複数の
ＤＮＡ配列を同時に配列決定することもできる。基板型
の反応部の複数の分画（セル）に、４種のｄＮＴＰを繰
り返し順番に注入し、１つのｄＮＴＰの注入と反応の終
了後に、各分画（セル）に洗浄液を流して反応液を除去
し、次のｄＮＴＰを入れる。１つのｄＮＴＰの注入によ
りＤＮＡ相補鎖合成反応が行われた時には、前述の反応
により、ＤＮＡ相補鎖合成反応が生成した分画（セル）
で発光が生じるので、発光を検出する。
０を用いて複数のＤＮＡ配列を同時に配列決定する構成
例について説明したが、複数の分画（セル）が形成され
た基板型の反応部を使用して、プローブおよびＤＮＡを
保持したビーズ２３を各分画（セル）に保持して複数の
ＤＮＡ配列を同時に配列決定することもできる。基板型
の反応部の複数の分画（セル）に、４種のｄＮＴＰを繰
り返し順番に注入し、１つのｄＮＴＰの注入と反応の終
了後に、各分画（セル）に洗浄液を流して反応液を除去
し、次のｄＮＴＰを入れる。１つのｄＮＴＰの注入によ
りＤＮＡ相補鎖合成反応が行われた時には、前述の反応
により、ＤＮＡ相補鎖合成反応が生成した分画（セル）
で発光が生じるので、発光を検出する。
【００４８】図１０は、本発明の実施例５の他の構成例
を示す図であり、基板に設けた穴にビーズを保持し、ビ
ーズに捕獲されたＤＮＡおよびプライマーを用いて相補
鎖合成し、ルシフェラーゼ等を使用して発光を検出する
ＤＮＡ配列決定装置に使用する接合型反応モジュールの
構成例を示す図である。図１０に示す接合型反応モジュ
ールは、反応槽（セル）２８を構成する複数の穴、試薬
および洗浄液流入口２６、溶液出口２７が形成された接
合型反応モジュールの上部基板３１と、反応液流路
（溝）２９が形成された接合型反応モジュールの下部基
板３０とを接合して形成される。上部基板３１と下部基
板３０とを接合したとき、反応液流路２９は全ての反応
槽（セル）２８に連接する。図１０に示したように全て
の反応槽（セル）２８に共通した反応液流路２９を作る
ことが簡便な反応デバイスのキーポイントである。図１
０に示す構成では、異なるＤＮＡ配列決定をセル毎に行
うが反応液の供給と排出は同時に一緒に行える様に下部
基板に反応液流路２９が設けてある。反応液流路２９の
深さはビーズ２３の直径の値より小さくする。ＤＮＡお
よびプライマーを保持したビーズ２３は反応槽２８から
出ることができないが、反応液は反応液流路２９を通し
て注入・排出が簡単にできる。ビーズに固定されたＤＮ
Ａはここでは配列解析しようとするＤＮＡを固定した
が、ルシフェラーゼ等の酵素も併せてビーズに固定した
り、異なるビーズあるいは反応セル壁面に固定してもよ
い。図１０に図示しないが、図９の構成と同様に、溶液
出口２７は廃液入れ２１につながり、試薬および洗浄液
流入口２６は導入管接合部１９を介して、反応試薬を含
む溶液を試薬溜１、２、３、４、洗浄液溜１８につなが
っている。試薬溜からの試薬の流入後、フローを止めて
相補鎖合成反応を行う。フロー中に起こる相補鎖合成反
応を抑えるために、フロー中は反応部を２０°Ｃに冷却
し、反応時に適温となるように温度コントロールする事
も配列決定ミスを防ぐのに有効である。キャピラリー型
の反応部の場合と同様に、ｄＮＴＰおよび種々反応試薬
の混ざった反応液を順次注入し相補鎖合成し、反応産物
として放出されるピロリン酸をＡＴＰに変換しルシフェ
リンを光らせてこの発光を光検出器で検出する。下部基
板３０を透明な材質で構成する場合には、下部基板３０
の底面側から発光を検出する。また、セル２８の開口部
側から発光を検出してもよい。この検出の後に反応液の
排出と新たなｄＮＴＰの注入という動作を繰り返してＤ
ＮＡ塩基配列を決定する。図１０に示す構成では液体の
流れ方向を接合型反応モジュールの下部基板３０の底面
に平行な方向としたが、底面側あるいは上面側から反応
液を出し入れしてもよい。この場合、底面は穴付きの部
材で構成し、ビーズは通らないが液体は通過する構成と
する。
を示す図であり、基板に設けた穴にビーズを保持し、ビ
ーズに捕獲されたＤＮＡおよびプライマーを用いて相補
鎖合成し、ルシフェラーゼ等を使用して発光を検出する
ＤＮＡ配列決定装置に使用する接合型反応モジュールの
構成例を示す図である。図１０に示す接合型反応モジュ
ールは、反応槽（セル）２８を構成する複数の穴、試薬
および洗浄液流入口２６、溶液出口２７が形成された接
合型反応モジュールの上部基板３１と、反応液流路
（溝）２９が形成された接合型反応モジュールの下部基
板３０とを接合して形成される。上部基板３１と下部基
板３０とを接合したとき、反応液流路２９は全ての反応
槽（セル）２８に連接する。図１０に示したように全て
の反応槽（セル）２８に共通した反応液流路２９を作る
ことが簡便な反応デバイスのキーポイントである。図１
０に示す構成では、異なるＤＮＡ配列決定をセル毎に行
うが反応液の供給と排出は同時に一緒に行える様に下部
基板に反応液流路２９が設けてある。反応液流路２９の
深さはビーズ２３の直径の値より小さくする。ＤＮＡお
よびプライマーを保持したビーズ２３は反応槽２８から
出ることができないが、反応液は反応液流路２９を通し
て注入・排出が簡単にできる。ビーズに固定されたＤＮ
Ａはここでは配列解析しようとするＤＮＡを固定した
が、ルシフェラーゼ等の酵素も併せてビーズに固定した
り、異なるビーズあるいは反応セル壁面に固定してもよ
い。図１０に図示しないが、図９の構成と同様に、溶液
出口２７は廃液入れ２１につながり、試薬および洗浄液
流入口２６は導入管接合部１９を介して、反応試薬を含
む溶液を試薬溜１、２、３、４、洗浄液溜１８につなが
っている。試薬溜からの試薬の流入後、フローを止めて
相補鎖合成反応を行う。フロー中に起こる相補鎖合成反
応を抑えるために、フロー中は反応部を２０°Ｃに冷却
し、反応時に適温となるように温度コントロールする事
も配列決定ミスを防ぐのに有効である。キャピラリー型
の反応部の場合と同様に、ｄＮＴＰおよび種々反応試薬
の混ざった反応液を順次注入し相補鎖合成し、反応産物
として放出されるピロリン酸をＡＴＰに変換しルシフェ
リンを光らせてこの発光を光検出器で検出する。下部基
板３０を透明な材質で構成する場合には、下部基板３０
の底面側から発光を検出する。また、セル２８の開口部
側から発光を検出してもよい。この検出の後に反応液の
排出と新たなｄＮＴＰの注入という動作を繰り返してＤ
ＮＡ塩基配列を決定する。図１０に示す構成では液体の
流れ方向を接合型反応モジュールの下部基板３０の底面
に平行な方向としたが、底面側あるいは上面側から反応
液を出し入れしてもよい。この場合、底面は穴付きの部
材で構成し、ビーズは通らないが液体は通過する構成と
する。
【００４９】
【発明の効果】以上述べたように本発明によれば、毛細
管あるいは細溝を用いることにより、コンパクトで安価
なＤＮＡ配列決定装置を作成する事ができる。また、Ｄ
ＮＡあるいはプライマーをビーズ等の固体表面に固定し
て相補鎖合成を行い、生成物のピロリン酸をＡＴＰに変
え、ルシフェリンを光らす様にしてその発光位置をモニ
ターすることで非常に多くのＤＮＡサンプルを同時に簡
単に配列決定する事ができる。一方、反応槽をキャピラ
リーあるいは分光セルの様なもので構成し、反応液を注
入あるいは排出しうる構造とすることでｄＮＴＰを分解
する酵素を使用せずに反応を行なうことができる。この
場合、相補鎖合成反応は十分に行えるので反応が十分に
行われないことによる配列決定のミスを低減することが
できる。
管あるいは細溝を用いることにより、コンパクトで安価
なＤＮＡ配列決定装置を作成する事ができる。また、Ｄ
ＮＡあるいはプライマーをビーズ等の固体表面に固定し
て相補鎖合成を行い、生成物のピロリン酸をＡＴＰに変
え、ルシフェリンを光らす様にしてその発光位置をモニ
ターすることで非常に多くのＤＮＡサンプルを同時に簡
単に配列決定する事ができる。一方、反応槽をキャピラ
リーあるいは分光セルの様なもので構成し、反応液を注
入あるいは排出しうる構造とすることでｄＮＴＰを分解
する酵素を使用せずに反応を行なうことができる。この
場合、相補鎖合成反応は十分に行えるので反応が十分に
行われないことによる配列決定のミスを低減することが
できる。
【図１】本発明の実施例１の構成例を示す図であり、１
つの反応部とｄＮＴＰ試薬溜を持つＤＮＡ塩基配列決定
装置の構成例を示す模式図。
つの反応部とｄＮＴＰ試薬溜を持つＤＮＡ塩基配列決定
装置の構成例を示す模式図。
【図２】本発明の実施例１の他の構成例を示す図であ
り、複数の反応部を持ち、外部に設けられた試薬溜と複
数の反応部を配管で結合した反応モジュールの構成例を
示す模式図。
り、複数の反応部を持ち、外部に設けられた試薬溜と複
数の反応部を配管で結合した反応モジュールの構成例を
示す模式図。
【図３】本発明の実施例１のパイロシーケンシングで行
われる一連の反応を示す図。
われる一連の反応を示す図。
【図４】本発明の実施例１の構成により実験で得られる
発光信号の例を示し、縦軸は発光強度、横軸は時間を示
す図。
発光信号の例を示し、縦軸は発光強度、横軸は時間を示
す図。
【図５】本発明の実施例２の構成例を示す図であり、反
応部に上部からキャピラリーでｄＮＴＰを注入するタイ
プのパイロシーケンシングデバイス（ＤＮＡ塩基配列決
定装置）の構成例を示す図。
応部に上部からキャピラリーでｄＮＴＰを注入するタイ
プのパイロシーケンシングデバイス（ＤＮＡ塩基配列決
定装置）の構成例を示す図。
【図６】本発明の実施例２の他の構成例を示す図であ
り、複数の反応部をもち、外部に配置された試薬溜のｄ
ＮＴＰを配管を通して上部からキャピラリーにより順番
に４種のｄＮＴＰを注入する反応モジュールの構成例を
示す図。
り、複数の反応部をもち、外部に配置された試薬溜のｄ
ＮＴＰを配管を通して上部からキャピラリーにより順番
に４種のｄＮＴＰを注入する反応モジュールの構成例を
示す図。
【図７】本発明の実施例３の構成例を示す図であり、複
数の反応部と試薬溜を持ち、細管を用いて試薬を反応部
に供給する構造の反応モジュールの構成例を示す図。
数の反応部と試薬溜を持ち、細管を用いて試薬を反応部
に供給する構造の反応モジュールの構成例を示す図。
【図８】本発明の実施例３の他の構成例を示す図であ
り、外部に試薬溜を持ち、複数の反応部に溝を用いて試
薬を供給する構造の反応モジュールの構成例を示す図。
り、外部に試薬溜を持ち、複数の反応部に溝を用いて試
薬を供給する構造の反応モジュールの構成例を示す図。
【図９】本発明の実施例５の構成例を示す図であり、Ｄ
ＮＡおよびプライマーをキャピラリー内のビーズに保持
し、キャピラリー内に試薬を流すことにより相補鎖合成
を段階的に行うＤＮＡ配列決定装置の構成例を示す図。
ＮＡおよびプライマーをキャピラリー内のビーズに保持
し、キャピラリー内に試薬を流すことにより相補鎖合成
を段階的に行うＤＮＡ配列決定装置の構成例を示す図。
【図１０】本発明の実施例５の他の構成例を示す図であ
り、ＤＮＡおよびプライマーを保持したビーズを基板に
設けた穴に保持し、相補鎖合成を行う接合型反応モジュ
ールの構成例を示す図。
り、ＤＮＡおよびプライマーを保持したビーズを基板に
設けた穴に保持し、相補鎖合成を行う接合型反応モジュ
ールの構成例を示す図。
１、２、３、４…ｄＮＴＰ等の試薬溜、５…デバイス基
板、５’…マイクロタイタープレート、６…試薬導入用
細管、６’…試薬導入用の溝、７…２次電子増倍管、８
…増幅器、９…データ処理器、１０…反応槽、１１…試
薬導入用細管とキャピラリーを具備したふた、１２…試
薬導入用キャピラリー、１３…試薬導入用キャピラリ
ー、１４…接合型反応モジュールの上部板、１５…接合
型反応モジュールの下部板、１６…接合型反応モジュー
ルの中板、１７…接合型反応モジュールの下部板、１
８：洗浄液溜、１９…導入管接合部、２０…キャピラリ
ー型の反応モジュール、２１…廃液入れ、２２…分離用
ビーズ、２３…プローブおよびＤＮＡを保持したビー
ズ、２４…冷却ＣＣＤカメラ、２５…データ処理器、２
６…試薬および洗浄液流入口、２７…溶液出口、２８…
反応槽、２９…反応液流路、３０…接合型反応モジュー
ルの下部基板、３１…接合型反応モジュールの上部基
板、３２…振動子
板、５’…マイクロタイタープレート、６…試薬導入用
細管、６’…試薬導入用の溝、７…２次電子増倍管、８
…増幅器、９…データ処理器、１０…反応槽、１１…試
薬導入用細管とキャピラリーを具備したふた、１２…試
薬導入用キャピラリー、１３…試薬導入用キャピラリ
ー、１４…接合型反応モジュールの上部板、１５…接合
型反応モジュールの下部板、１６…接合型反応モジュー
ルの中板、１７…接合型反応モジュールの下部板、１
８：洗浄液溜、１９…導入管接合部、２０…キャピラリ
ー型の反応モジュール、２１…廃液入れ、２２…分離用
ビーズ、２３…プローブおよびＤＮＡを保持したビー
ズ、２４…冷却ＣＣＤカメラ、２５…データ処理器、２
６…試薬および洗浄液流入口、２７…溶液出口、２８…
反応槽、２９…反応液流路、３０…接合型反応モジュー
ルの下部基板、３１…接合型反応モジュールの上部基
板、３２…振動子
─────────────────────────────────────────────────────
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(56)参考文献 特開 平７−203998（ＪＰ，Ａ)
特表 平８−500724（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12M 1/00
C12M 1/34
C12N 15/00
C12Q 1/68
Claims (26)
- 【請求項１】 鋳型DNAの相補鎖を合成する工程と、 前記合成する工程で生じるピロリン酸をATPに変換し、
前記ATPと酵素により発光を生じさせ、前記発光を検出
する工程と、 前記検出から相補鎖合成の有無を検出することにより、
DNA塩基配列情報を得る工程とを有し、 前記合成する工程では、４種のdNTPを、前記４種のdNTP
を各々収める複数のdNTP溜から、前記４種のdNTPごとに
それぞれ異なる毛細管あるいは細溝を介して、前記合成
を行う場である反応部に加圧により供給することを特徴
とするＤＮＡ塩基配列決定方法。 - 【請求項２】 前記供給では、前記dNTP溜各々に順次圧
力を加えることにより、前記dNTPの各々を予め定められ
た順序で前記反応部に供給することを特徴とする請求項
１に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。 - 【請求項３】 鋳型DNAの相補鎖を合成する工程と、 前記合成する工程で生じるピロリン酸をATPに変換し、
前記ATPと酵素により発光を生じさせ、前記発光を検出
する工程と、 前記検出から相補鎖合成の有無を検出することにより、
DNA塩基配列情報を得る工程とを有し、 前記合成する工程では、４種のdNTPを、前記４種のdNTP
ごとにそれぞれ異なる、毛細管あるいは細溝を介して、
前記４種のdNTPを各々収めるdNTP溜と前記合成を行う場
である反応部との落差により前記反応部に供給すること
を特徴とするＤＮＡ塩基配列決定方法。 - 【請求項４】 前記反応部への前記dNTPの供給を、前記
加圧に加えて、前記dNTP溜と前記反応部との間に電界を
印加することにより行うことを特徴とする請求項１又は
請求項３に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。 - 【請求項５】 前記合成する工程では、同じ種類の前記
ｄＮＴＰを二度ずつ供給することを特徴とする請求項１
又は請求項３に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。 - 【請求項６】 鋳型DNAの相補鎖を合成する工程と、 前記合成する工程で生じるピロリン酸をATPに変換し、
前記ATPと酵素により発光を生じさせ、前記発光を検出
する工程と、 前記検出から相補鎖合成の有無を検出することにより、
DNA塩基配列情報を得る工程とを有し、 前記合成する工程では、固体に固定されかつ前記相補鎖
を合成の開始点を規定するプライマーに、ハイブリダイ
ズした前記鋳型DNAの前記相補鎖を合成し、 前記合成する工程では、４種のdNTPを、前記４種のdNTP
ごとにそれぞれ異なる、毛細管あるいは細溝を通して加
圧により前記合成を行う場である反応部に供給すること
を特徴とするＤＮＡ塩基配列決定方法。 - 【請求項７】 前記合成する工程では、前記プライマー
として複数種の前記プライマーを用い、前記複数種のプ
ライマーは、各々異なる固体表面あるいは固体表面の区
画された異なるセルに固定されるのものであり、 前記検出する工程では、複数種の前記プライマー各々に
起因する前記相補鎖の合成の結果として生じる各々の前
記発光を識別して検出することを特徴とする請求項６に
記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。 - 【請求項８】 前記合成する工程では、前記プライマー
として複数種の前記プライマーを用い、前記複数種のプ
ライマーは、各々異なるビーズの表面に固定されるもの
であり、 前記検出する工程では、複数種の前記プライマー各々に
起因する前記相補鎖の合成の結果として生じる各々の前
記発光を識別して検出することを特徴とする請求項６に
記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。 - 【請求項９】 前記プライマーを表面に固定された前記
ビーズが、前記プライマーの種類ごとに、分離して保持
されていることを特徴とする請求項８に記載のＤＮＡ塩
基配列決定方法。 - 【請求項１０】 固体表面上に固定された鋳型DNAの相
補鎖を合成する工程と、 前記合成する工程で生じるピロリン酸をATPに変換し、
前記ATPと酵素により発光を生じさせ、前記発光を検出
する工程と、 前記検出から相補鎖合成の有無を検出することにより、
DNA塩基配列情報を得る工程とを有し、 前記合成する工程では、プライマーを用いて前記相補鎖
を合成し、前記検出する工程と前記DNA塩基配列を得る
工程とを経た後に、前記プライマーを除去し、引き続き
注入された新規プライマーを用いて、前記合成する工程
と前記検出する工程と前記DNA塩基配列を得る工程とを
繰り返し行うことを特徴とするＤＮＡ塩基配列決定方
法。 - 【請求項１１】 前記合成する工程では、各々ごとに異
なる固体表面に固定された複数の異なる前記鋳型DNAを
前記プライマーもしくは前記新規プライマーにハイブリ
ダイズさせ、 前記検出する工程では、前記複数の異なる鋳型DNA各々
に起因する前記相補鎖の前記合成の結果として生じる前
記発光を識別して検出することを特徴とする請求項１０
に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。 - 【請求項１２】 前記検出する工程では、ルシフェリン
と前記酵素としてルシフェラーゼを用い、前記ATPと前
記ルシフェラーゼと前記ルシフェリンとを反応させるこ
とにより、前記発光を生じさせることを特徴とする請求
項１、請求項３、請求項６、請求項１０のいずれかに記
載のＤＮＡ塩基配列決定方法。 - 【請求項１３】 鋳型DNAと、前記鋳型DNAの相補鎖合成
反応のための試薬と、化学発光のための試薬とを収める
ための１つ以上の反応部と、 ４種のdNTP各々を収めるための、前記４種のdNTP各々に
対応して設けられた４つ以上のdNTP溜と、 ４種のdNTP各々に対応して設けられ、前記dNTP溜と前記
反応部とを連結する４つ以上の導入管とを有し、 前記dNTPは前記反応部へ加圧により供給されるものであ
り、 前記反応部は、前記dNTPと前記鋳型DNAの相補鎖合成反
応のための試薬とを用いた前記相補鎖合成反応で生じる
ピロリン酸と、前記化学発光のための試薬との発光反応
を検出するようにされているものであることを特徴とす
る反応モジュール。 - 【請求項１４】 前記導入管は、内径が0.３mm以下であ
ることを特徴とする請求項１３に記載の反応モジュー
ル。 - 【請求項１５】 前記反応部内の反応液を攪拌する手段
をさらに有することを特徴とする請求項１３に記載の反
応モジュール。 - 【請求項１６】 前記dNTP溜は前記dNTPの種類ごとに複
数設けられるものであり、前記dNTPの種類ごとに複数設
けられた前記dNTP溜は、前記導入管を介して連結され、
前記導入管に入った気泡を一方の前記dNTP溜内で加圧す
ることにより他方の前記dNTP溜に押し流すためのもので
あることを特徴とする請求項１３に記載の反応モジュー
ル。 - 【請求項１７】 複数の前記反応部が形成された上部基
板と、 前記上部基板の下部に設けられ、複数の前記反応部各々
に対応した前記導入管が形成された中部基板と、 前記中部基板の下部に設けられ、複数の前記反応部各々
に対応した前記導入管各々に対応した管または溝が形成
された下部基板とを有し、 前記導入管は、前記管または溝よりも細いことを特徴と
する請求項１３に記載の反応モジュール。 - 【請求項１８】 前記反応部は、反応セルであって、 前記反応セルは、前記鋳型DNA及び前記鋳型DNAにハイブ
リダイズするプライマーを保持したビーズを収めるもの
であり、 前記ビーズは、直径が前記反応セルの内径よりも小さい
ものであることを特徴とする請求項１３に記載の反応モ
ジュール。 - 【請求項１９】 前記反応セルは、分離用ビーズをさら
に収めるものであり、 前記分離用ビーズは、複数の前記ビーズの間に置かれ、
かつ直径が前記反応セルの内径より小さくかつ前記ビー
ズの直径よりも大きいことを特徴とする請求項１８に記
載の反応モジュール。 - 【請求項２０】 前記反応セルは、溶液流入口と溶液出
口とに、前記ビーズの移動を妨げるためのストッパーが
形成されているものであることを特徴とする請求項１８
に記載の反応モジュール。 - 【請求項２１】 第１の基板と前記第１の基板の下部に
接合された第２の基板とを有し、 第１の基板には、複数の前記反応部が複数の穴として形
成されており、 複数の前記反応部は、複数の前記鋳型DNAおよび複数の
前記鋳型DNAに各々ハイブリダイズする複数のプライマ
ーを保持したビーズを収められるものであり、 前記第２の基板には、複数の前記反応部に連接する反応
液流路が形成されており、前記反応液流路の深さは前記
ビーズの直径よりも小さいことを特徴とする請求項１３
に記載の反応モジュール。 - 【請求項２２】 鋳型DNAと、前記鋳型DNAの相補鎖合成
反応のための試薬と、化学発光のための試薬とを収める
１つ以上の反応部と、 ４種のdNTPを各々ごとに保持する１つ以上の試薬溜と、 前記試薬溜から前記４種のdNTPを各々ごとに前記反応部
に供給するための、毛細管または細溝を具備する供給手
段と、 前記４種のdNTPのいずれかを含む溶液の供給を制御する
加圧手段と、 前記鋳型DNAの相補鎖合成反応のための試薬と前記４種
のdNTPとを用いた前記鋳型DNAの相補鎖合成反応で生じ
るピロリン酸と、前記化学発光のための試薬との反応に
より、前記反応部で生じる発光を検出する検出手段とを
有することを特徴とするDNA分析装置。 - 【請求項２３】 前記毛細管は疎水性を有するものであ
ることを特徴とする請求項２２に記載のDNA分析装置。 - 【請求項２４】 前記検出手段は、前記発光の位置を識
別するものであることを特徴とする請求項２２に記載の
DNA分析装置。 - 【請求項２５】 前記検出手段は、エリアセンサー又は
光電子増倍管又は光検出デバイスであることを特徴とす
る請求項２２に記載のDNA分析装置。 - 【請求項２６】 鋳型DNAと、前記鋳型DNAの相補鎖合成
反応のための試薬と、化学発光のための試薬とを収める
１つ以上の反応部と、 ４種のdNTPを各々ごとに保持する１つ以上の試薬溜と、 前記試薬溜から前記４種のdNTPを各々ごとに前記反応部
に供給するための、毛細管または細溝を具備する供給手
段と、 前記４種のdNTPのいずれかを含む溶液の供給を制御する
加圧手段と、 前記鋳型DNAの相補鎖合成反応のための試薬と前記４種
のdNTPとを用いた前記鋳型DNAの相補鎖合成反応で生じ
るピロリン酸と、前記化学発光のための試薬との反応に
より、前記反応部で生じる発光を検出する検出手段と、 前記検出手段で得たデータを処理してDNA塩基配列情報
を得るデータ解析手段とを有することを特徴とするDNA
塩基配列決定装置。
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