ES2338654T3 - Amplificacion de acidos nucleicos mediante emulsion de perlas. - Google Patents

Amplificacion de acidos nucleicos mediante emulsion de perlas. Download PDF

Info

Publication number
ES2338654T3
ES2338654T3 ES04706051T ES04706051T ES2338654T3 ES 2338654 T3 ES2338654 T3 ES 2338654T3 ES 04706051 T ES04706051 T ES 04706051T ES 04706051 T ES04706051 T ES 04706051T ES 2338654 T3 ES2338654 T3 ES 2338654T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
amplification
primer
pearl
pearls
beads
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES04706051T
Other languages
English (en)
Other versions
ES2338654T5 (es
Inventor
Jan Berka
Yi-Ju Chen
John H. Leamon
Steven Lefkowitz
Kenton Lohman
Vinod Makhijani
Gary J. Sarkis
Jonathan Rothberg
Michael Weiner
Maithreyan Srinivasan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
454 Life Science Corp
Original Assignee
454 Life Science Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=32854649&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2338654(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 454 Life Science Corp filed Critical 454 Life Science Corp
Publication of ES2338654T3 publication Critical patent/ES2338654T3/es
Application granted granted Critical
Publication of ES2338654T5 publication Critical patent/ES2338654T5/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502707—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the manufacture of the container or its components
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1075—Isolating an individual clone by screening libraries by coupling phenotype to genotype, not provided for in other groups of this subclass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6867—Replicase-based amplification, e.g. using Q-beta replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/251—Colorimeters; Construction thereof
    • G01N21/253—Colorimeters; Construction thereof for batch operation, i.e. multisample apparatus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
    • G01R33/00—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables
    • G01R33/12—Measuring magnetic properties of articles or specimens of solids or fluids
    • G01R33/1269—Measuring magnetic properties of articles or specimens of solids or fluids of molecules labeled with magnetic beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0636—Integrated biosensor, microarrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0819—Microarrays; Biochips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0877—Flow chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N2021/6484—Optical fibres
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Photoreceptors In Electrophotography (AREA)
  • Colloid Chemistry (AREA)

Abstract

Método para la amplificación de uno o más ácidos nucleicos sobre una perla, que comprende las etapas siguientes: (a) formar una emulsión de agua en aceite para crear una pluralidad de microrreactores acuosos, en la que por lo menos uno de los microrreactores comprende un ácido nucleico molde monocatenario, una única perla con una primera población que comprende una pluralidad de moléculas de una primera especie de cebador dispuesta sobre la misma, y una solución de reacción de amplificación que comprende una segunda población que comprende una pluralidad de moléculas de la primera especie de cebador, una pluralidad de moléculas de una segunda especie de cebador, y reactivos necesarios para llevar a cabo la amplificación de ácidos nucleicos, en donde la primera especie de cebador es capaz de unirse al ácido nucleico molde monocatenario, la segunda especie de cebador es capaz de unirse a una cadena complementaria del ácido nucleico molde monocatenario, y la concentración de la segunda especie de cebador es mayor que la de la segunda población de la primera especie de cebador en la solución de reacción de amplifica- ción, (b) amplificar asimétricamente el molde de ácido nucleico monocatenario y la cadena complementaria a la cadena molde en la solución de reacción de amplificación, para formar una población de copias amplificadas del ácido nucleico molde monocatenario, y (c) unir una pluralidad de las copias amplificadas asimétricamente de ácido nucleico molde monocatenario a la primera población de la primera especie de cebador sobre la perla en el microrreactor, en el que una cadena complementaria unida a perla se extiende a partir de la primera especie de cebador.

Description

Amplificación de ácidos nucleicos mediante emulsión de perlas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para amplificar ácidos nucleicos de molde a partir de un número de copia reducido hasta cantidades que permitan la secuenciación en un soporte sólido, tal como en una perla. Asimismo, la presente invención se refiere a la eliminación de perlas vacías, un método de enriquecimiento de soporte sólidos que contienen ácidos nucleicos amplificados.
Antecedentes
La capacidad de amplificar una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos, tal como una biblioteca genómica o una biblioteca de ADNc, resulta crítica dada la ineficiencia de los métodos actuales de secuenciación. Las tecnologías de secuenciación actuales requieren millones de copias de ácido nucleico por cada reacción de secuenciación. Además, la secuenciación de un genoma humano requeriría aproximadamente diez millones de reacciones de secuenciación diferentes. En el caso de que el material de partida fuese limitado, resultaría necesaria la amplificación del ADN inicial antes de la secuenciación genómica. El material de partida puede ser limitado, por ejemplo si el genoma que debe secuenciarse procede de una cantidad traza de patógeno o de un paciente prenatal. Las técnicas actuales para la amplificación genómica in vitro implican protocolos laboriosos de clonación y cultivo que han limitado la utilidad de la secuenciación genómica. Otras técnicas, tales como la PCR, aunque rápidas y fiables, no son capaces de amplificar un genoma de una manera representativa.
Aunque la PCR con cebadores aleatorios puede manipularse fácilmente para amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos en una reacción, este método no resulta preferente debido a que la biblioteca amplificada no es representativa de la biblioteca de partida. Es decir, en el contexto de una PCR aleatoria algunas secuencias de ADN se amplifican preferentemente a expensas de otras secuencias, de manera que el producto amplificado no representa el material de partida. Este problema de la PCR puede superarse si cada miembro individual de una biblioteca se amplifica en una reacción separada. Sin embargo, este enfoque puede no resultar práctico en el caso de que se requieran muchos miles de tubos de reacción para el procedimiento de amplificación, ya que una biblioteca genómica o una biblioteca de ADNc puede incluir más de 100.000 fragmentos. La amplificación individual de cada fragmento de estas bibliotecas en una reacción separada no resulta práctica.
El documento WO 00/40712 da a conocer un método de separación óptica utilizado para aislar uno o más elementos genéticos codificantes de un producto génico que presente una actividad deseada.
Descripción resumida de la invención
La presente invención proporciona un método para amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos (por ejemplo cada secuencia de una biblioteca de ADN, transcriptoma o genoma) de una manera rápida y económico en un único tubo de reacción. Un uso del método de la invención es llevar a cabo la amplificación clonal simultánea (por ejemplo mediante PCR) de una pluralidad de muestras (hasta varios cientos de miles) en un recipiente de reacción. La presente invención proporciona además un medio para encapsular una pluralidad de muestras de ADN individualmente en una microcápsula de una emulsión (es decir, un microrreactor), llevando a cabo la amplificación de la pluralidad de muestras encapsuladas de ácidos nucleicos simultáneamente, y liberando dicha pluralidad amplificada de ADN de las microcápsulas para reacciones posteriores.
En una realización, se hibridan copias individuales de la especie de ácido nucleico molde a perlas de captura que comprenden, por ejemplo, oligonucleótidos de captura o grupos químicos que se unen al molde de ácidos nucleicos. Las perlas se suspenden en solución de amplificación completa (ver el Ejemplo 2 para un ejemplo de una solución de amplificación) y se emulsionan para producir microrreactores (típicamente de 100 a 200 micrómetros de diámetro). A continuación, se utiliza la amplificación asimétrica (por ejemplo la PCR) para incrementar clonalmente el número de copia de la especie molde inicial en los microrreactores, y estas copias se unen a las perlas de captura en los microrreactores.
En una realización alternativa, se añaden perlas de captura a una mezcla de reacción de amplificación (por ejemplo una solución de amplificación del Ejemplo 2) que comprende ácido nucleico molde y esta mezcla se emulsiona para producir microrreactores. Se utiliza la amplificación asimétrica (por ejemplo una PCR) para incrementar clonalmente el número de copia de la especie molde inicial en los microrreactores, y estas copias se unen a las perlas de captura en los microrreactores.
Una ventaja de la presente invención es que los microrreactores permiten la amplificación clonal y discreta simultánea de muchos moldes diferentes sin contaminación cruzada de los productos amplificados o reactivos, o el dominio de un molde particular o conjunto de moldes (por ejemplo el sesgo de PCR). La reacción de amplificación, por ejemplo, puede llevarse a cabo simultáneamente con por lo menos 3.000 microrreactores por microlitro de mezcla de reacción. Preferentemente, cada microrreactor comprende una o unas pocas especies de molde amplificado.
En diversas realizaciones de la invención, los microrreactores presentan un tamaño medio de entre aproximadamente 10 \mum y aproximadamente 250 \mum. En una realización preferente, los microrreactores presentan un diámetro medio de entre aproximadamente 60 y aproximadamente 200 \mum. En una realización más preferente, los microrreactores presentan un diámetro medio de aproximadamente 60 \mum, tal como una media de entre 40 \mum y 80 \mum de diámetro. En una realización, los microrreactores presentan un diámetro medio de aproximadamente 60 \mum. En otra realización preferente, los microrreactores presentan un volumen medio de aproximadamente 113 pl. En una realización todavía más preferente, aproximadamente 3.000 microrreactores se encuentran contenidos en un microlitro de una emulsión 1:2 de agua en aceite.
La presente invención proporciona además un método para producir una pluralidad de perlas portadoras de ácidos nucleicos molde, en la que cada perla comprende hasta 1.000.000 copias o más de una única secuencia de ácidos nucleicos. En una realización preferente, cada perla puede comprender más de 20 millones de copias de un único ácido nucleico.
La presente invención proporciona además un método para enriquecer aquellas perlas que contengan el producto de la amplificación exitosa de ADN (es decir, mediante la eliminación de perlas que no presentan ADN unido a las mismas).
\vskip1.000000\baselineskip
Breve descripción de los dibujos
Figura 1 Esquema de la estructura de una perla de captura de ADN.
Figuras 2A-2B Esquema de una realización de un procedimiento de amplificación en emulsión de perlas.
Figura 3 Esquema de un procedimiento de enriquecimiento para eliminar perlas que no presentan ningún ADN unido a las mismas.
Figura 4 Ilustración de dispositivo utilizado para sostener tubos en la placa de agitación situada bajo una bomba vertical de jeringa. El dispositivo se modificó para sostener tres conjuntos de mezclas de reacción de amplificación en emulsión de perlas. La jeringa se cargó con la mezcla de reacción de PCR y perlas.
Figura 5 Ilustración de la organización óptima de jeringas en una bomba vertical de jeringa y orientación de los tubos de emulsión bajo las salidas de las jeringas.
Figura 6 Ilustración de la organización óptima del bloque impulsor de la bomba de jeringas contra los émbolos de las jeringas, y orientación óptima del dispositivo sobre la placa de agitación. Mediante la utilización de dicha disposición, se expulsa el contenido de la jeringa en el aceite en emulsión bajo agitación.
Figura 7 Ilustración de perlas (ver las flechas) suspendidas en microrreactores individuales según los métodos de la invención.
Figura 8A-8C Esquema que muestra las etapas iniciales de amplificación en emulsión de perlas utilizada conjuntamente con la secuenciación desde dos extremos. La perla activada por NHS (figura 8A) se une a los cebadores de captura (figura 8B) y se encapsula en un microrreactor que comprende la perla de captura de ADN y molde (figura 8C).
Figura 9 Esquema que muestra las etapas de amplificación y de captura de la amplificación en emulsión de perlas utilizada conjuntamente con la secuenciación desde dos extremos. El molde se amplifica mediante PCR en fase solución y los productos de amplificación se unen a la perla de captura de ADN.
Figura 10 Esquema que muestra las últimas etapas de amplificación en emulsión de perlas utilizada conjuntamente con la secuenciación desde dos extremos. La emulsión se rompe (figuras 10A-10B), se elimina la segunda cadena del producto de amplificación y se utiliza el enriquecimiento para maximizar el número de perlas unidas a producto de amplificación (figura 10C), se hibridan los cebadores de secuenciación (figura 10D) y se secuencia la primera cadena (figura 10E), seguido de la segunda cadena.
\vskip1.000000\baselineskip
Descripción detallada de la invención Breve vista general de la amplificación en emulsión de perlas
Se comenta posteriormente una breve vista general de una realización de la invención. A continuación, se proporciona una descripción más detallada de cada etapa individual de la presente realización. En la presente realización, la PCR es la técnica de amplificación seleccionada.
En un aspecto de la invención, se lleva a cabo la amplificación en emulsión de perlas mediante la unión de un molde (por ejemplo un molde de ADN) que debe amplificarse a un soporte sólido, preferentemente en la forma de un perla generalmente esférica. La perla se una a un gran número de una única especie de cebador (es decir, el cebador B en la figura 2) que es complementario a una región del molde de ADN y la amplificación copia a partir de este molde. Alternativamente, la perla se une a grupos químicos (por ejemplo biotina) que pueden unirse a grupos químicos (por ejemplo estreptavidina) incluidos en el ADN molde y la amplificación copia a partir de este molde. Las perlas se suspenden en una mezcla de reacción acuosa y después se encapsulan en una emulsión de agua en aceite. En diferentes aspectos de la invención, el ADN molde se une a la perla previamente a la emulsificación, o el ADN molde se incluye en una solución en la mezcla de reacción de amplificación. En una realización preferente, se lleva a cabo una etapa de amplificación previamente a la distribución de los moldes de ácidos nucleicos en una placa multipocillo (por ejemplo PicoTiter).
En determinadas realizaciones, la emulsión está compuesta de microgotas discretas en fase acuosa, por ejemplo de diámetro medio comprendido entre aproximadamente 60 y 200 \mum, incluidas en una fase aceite termoestable. Cada microgota contiene, preferentemente, solución de reacción de amplificación (es decir, los reactivos necesarios para la amplificación de los ácidos nucleicos). Un ejemplo de una solución de reacción de amplificación sería una mezcla de reacción de PCR (polimerasa, sales, dNTPs; ver el Ejemplo 2 para un ejemplo de una realización) y una pareja de cebadores de PCR (cebador A y cebador B) (ver la figura 2A). En algunos casos, el ADN molde se incluye en la mezcla de reacción. Un subconjunto de la población de microgotas incluye la perla de ADN y el molde. Este subconjunto de microgotas es la base para la amplificación. Las microcápsulas restantes no contienen ADN molde y no participarán en la amplificación. En una realización, la técnica de amplificación es la PCR y los cebadores de PCR se encuentran presentes en una proporción de 8:1 o de 16:1 (es decir, 8 ó 16 de un cebador a 1 del segundo cebador) para llevar a cabo una PCR asimétrica. En otra realización, la proporción de cebadores de PCR puede ser sustancialmente igual, para una PCR normal.
La reacción de amplificación asimétrica, tal como la PCR, puede llevarse a cabo utilizando cualquier método adecuado. En la vista general siguiente, se comenta a título ilustrativo un mecanismo de PCR. En el ejemplo, se hibrida una región de la molécula de ADN (región B') a un oligonucleótido inmovilizado en una perla (cebador B). Durante el termociclado (figura 2B), el enlace entre el molde monocatenario y el cebador B inmovilizado en la perla se rompe, liberando el molde a la solución microencapsulada circundante. La solución de amplificación, en este caso la solución de PCR, contiene además cebador A y cebador B en fase solución (por ejemplo en una proporción de 8:1 o de 16:1). Los cebadores B en fase solución se unen fácilmente a la región B' complementaria del molde debido a que la cinética de unión es más rápida para los cebadores en fase solución que para los cebadores inmovili-
zados.
En la PCR en etapa temprana, tanto la cadena A como la B se amplifican igualmente bien (figura 2C). Al alcanzar la etapa intermedia de la PCR (es decir, entre los ciclos 10 y 30), se han agotado los cebadores B, deteniendo la amplificación exponencial. A continuación, la reacción entra en amplificación asimétrica y la población de amplicones resulta dominada por las cadenas A (figura 2D). En la PCR en etapa tardía (figura 2E), tras 30 a 40 ciclos, la amplificación asimétrica incrementa la concentración de cadenas A en solución. El exceso de cadenas A inicia su hibridación a los cebadores B inmovilizados en perlas. Seguidamente las polimerasas termoestables utilizan la cadena A como molde para sintetizar una cadena B inmovilizada del amplicón unida a perla.
En la PCR en la etapa final (figura 2F), el ciclado térmico continuo fuerza la hibridación adicional a cebadores unidos a perlas. La amplificación en fase solución puede ser mínima en esta etapa, aunque la concentración de cadenas B inmovilizadas se incrementa. A continuación, se rompe la emulsión y el producto inmovilizado se convierte en monocatenario mediante desnaturalización (por calor, pH, etc.), que elimina la cadena A complementaria. Los cebadores A se hibridan a la región A' de la cadena inmovilizada, y la cadena inmovilizada se carga con enzimas de secuenciación, y cualquier proteína accesoria necesaria. A continuación, las perlas se secuencian utilizando técnicas de pirofosfato conocidas (descritas, por ejemplo, en las patentes US Nos. 6.274.320, 6.258.568 y 6.210.891).
\vskip1.000000\baselineskip
Diseño del molde
En una realización preferente, el molde de ácidos nucleicos que debe amplificarse mediante amplificación en emulsión de perlas es una población de ADN, tal como, por ejemplo, una biblioteca de ADN genómico o una biblioteca de ADNc. Resulta preferente que cada miembro de la población de ADN presente una secuencia común de ácidos nucleicos en el primer extremo y una secuencia común de ácidos nucleicos en un segundo extremo. Esto puede conseguirse, por ejemplo, ligando una primera secuencia adaptadora de ADN a un extremo y una segunda secuencia adaptadora de ADN a un segundo extremo de cada miembro de la población de ADN. Muchas bibliotecas de ADN y de ADNc, en virtud de la naturaleza del vector de clonación (por ejemplo Bluescript, Stratagene, La Jolla, CA) encajan en la descripción de que presentan una secuencia común en un primer extremo y una segunda secuencia común en un segundo extremo de cada ADN miembro. El molde de ácidos nucleicos puede presentar cualquier tamaño que permite la amplificación in vitro (incluyendo las técnicas de amplificación preferentes de la PCR y la PCR asimétrica). En una realización preferente, el molde presenta un tamaño de entre aproximadamente 150 y 750 pb, tal como, por ejemplo aproximadamente 250 pb.
\vskip1.000000\baselineskip
Unión de molde de ácidos nucleicos a perlas de captura
En un aspecto de la invención, se une un molde de ácidos nucleicos monocatenarios que debe amplificarse a una perla de captura. El molde puede capturarse en una perla previamente a la emulsificación o después de formarse la emulsión. En un aspecto preferente, las copias de amplificación del molde de ácidos nucleicos se unen a una perla de captura. A título de ejemplos no limitantes, estas uniones pueden encontrarse mediadas por grupos químicos u oligonucleótidos que se encuentran unidos a la superficie de la perla. El ácido nucleico (por ejemplo el molde de ácidos nucleicos, las copias de amplificación o los oligonucleótidos) puede unirse al soporte sólido (por ejemplo una perla de captura) de cualquier manera conocida de la técnica.
Según la presente invención, la unión química covalente de un ácido nucleico a una perla puede conseguirse mediante la utilización de agentes acoplantes estándares. Por ejemplo, puede utilizarse carbodiimida soluble en agua para unir el fosfato 5' de una secuencia de ADN a perlas de captura recubiertas con amina mediante un enlace fosfoamidato. Alternativamente, pueden acoplarse oligonucleótidos específicos a la perla utilizando reacciones similares, y después puede utilizarse ADN ligasa para ligar el molde de ADN al oligonucleótido en la perla. Entre otras químicas de enlace para unir el oligonucleótido a las perlas se incluyen la utilización de N-hidroxisuccinamida (NHS) y derivados de la misma.
En un método ejemplar, un extremo de una molécula conectora puede contener un grupo reactivo (tal como un grupo amida) que forma un enlace covalente con el soporte sólido, mientras que el otro extremo de la molécula conectora contiene un segundo grupo reactivo que puede unirse con el oligonucleótido que debe inmovilizarse. En una realización preferente, el oligonucleótido se une a la perla de captura de ADN mediante enlace covalente. Sin embargo, también pueden utilizarse enlaces no covalentes, tales como la quelación o los complejos de antígeno-anticuerpo, para unir el oligonucleótido a la perla.
A título de ejemplos no limitativos, pueden utilizarse oligonucleótidos que se hibriden específicamente a secuencias únicas en el extremo del fragmento de ADN, tal como el extremo solapante de un sitio de enzima de restricción o los "extremos cohesivos" de vectores de clonación, aunque también pueden utilizarse moléculas conectoras de extremos romos. Estos métodos se describen en detalle en la patente US No. 5.674.743. Resulta preferente que las perlas continúen ligando los oligonucleótidos inmovilizados durante las etapas de los métodos de la invención.
En una realización de la invención, cada perla de captura se diseña para que presente una pluralidad de oligonucleótidos que reconocen (es decir, que sean complementarios a) una parte del molde de ácidos nucleicos, y las copias de amplificación de dicho molde. En los métodos descritos en la presente memoria, se desea la amplificación clonal de la especie molde, de manera que resulta preferente que únicamente una única especie de ácidos nucleicos se una a una perla de captura cualquiera.
Las perlas utilizadas en la presente memoria puede presentar cualquier tamaño conveniente y fabricarse a partir de uno o más materiales conocidos cualesquiera. Entre los ejemplos de dichos materiales se incluyen: compuestos inorgánicos, polímeros naturales y polímeros sintéticos. Entre los ejemplos específicos de dichos materiales se incluyen: celulosa, derivados de celulosa, resinas acrílicas, vidrio, geles de sílice, poliestireno, gelatina, polivinilpirrolidona, copolímeros de vinilo y acrilamida, poliestireno entrecruzado con divinilbenceno o similar (tal como se describe, por ejemplo en Merrifield, Biochemistry, 3:1385-1390, 1964), poliacrilamidas, geles de látex, poliestireno, dextrano, caucho, silicio, plásticos, nitrocelulosa, esponjas naturales, geles de sílice, vidrio de poro controlado, metales, dextranos entrecruzados (por ejemplo Sephadex^{TM}), gel de agarosa (Sepharose^{TM}) y otros soportes de fase sólida conocidos por el experto en la materia. En realizaciones preferentes, las perlas de captura son perlas de diámetro aproximado entre 2 y 100 \mum o de entre 10 y 80 \mum de diámetro, más preferentemente de entre 20 y 40 \mum de diámetro. En una realización preferente, las perlas de captura son perlas de sefarosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Emulsificación
Para la utilización con la presente invención, se suspenden perlas de captura con o sin ácidos nucleicos de molde en una emulsión de agua en aceite estable frente al calor. Se contempla que una pluralidad de los microrreactores incluya únicamente un molde y una perla. Pueden existir muchas gotas que no contengan un molde o que no contengan una perla. De manera similar, pueden existir gotas que contengan más de una copia de un molde. La emulsión puede formarse según cualquier método conocido de la técnica. Un método para crear una emulsión se describe posteriormente, aunque puede utilizarse cualquier método para preparar una emulsión. Estos métodos son conocidos de la técnica e incluyen métodos adyuvantes, métodos de contraflujo, métodos de contracorriente, métodos de tambor giratorio y métodos de membrana. Además, el tamaño de las microcápsulas puede ajustarse modificando el caudal y la velocidad de los componentes. Por ejemplo, en la adición gota a gota, puede modificarse el tamaño de las gotas y el tiempo total de adición. Preferentemente, la emulsión contiene una densidad de aproximadamente 3.000 perlas encapsuladas por microlitro.
Se hace referencia a diversas emulsiones que resultan adecuadas para reacciones biológicas en Griffiths y Tawfik, EMBO, 22:24-35, (2003); Ghadessy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:4552-4557, (2001); patentes US No. 6.489.103 y WO 02/22869.
Se indica que Griffiths et al. (patentes US No. 6.489.103 y WO 99/02671) se refiere a un método para la separación in vitro de uno o más elementos genéticos codificantes de un producto génico que presenta una actividad deseada. Este método implica compartimentalizar un gen, expresar el gen y separar el gen compartimentalizado basándose en el producto expresado. En contraste con la presente invención, el método de separación por microencapsulado no resulta adecuado para el análisis paralelo de múltiples microcápsulas debido a que su producto ácido nucleico no se encuentra anclado y no puede anclarse. Debido a que los ácidos nucleicos de Griffiths no se encuentran anclados, se mezclarían durante la demulsificación.
La emulsión preferentemente se genera mediante la adición de perlas a una solución de amplificación. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "solución de amplificación" se refiere a una mezcla suficiente de reactivos necesaria para llevar a cabo la amplificación del ADN molde. Un ejemplo de una solución de amplificación, una solución de amplificación por PCR, se proporciona en los Ejemplos, posteriormente. Se apreciará que pueden realizarse diversas modificaciones de la solución de amplificación basándose en el tipo de amplificación que se lleva a cabo y en que el ADN molde se encuentre unido a perlas o en solución. En una realización, la mezcla de perlas y solución de amplificación se añade gota a gota a una mezcla de aceite biocompatible (por ejemplo aceite mineral ligero, Sigma) bajo centrifugación y se deja que se emulsione. En otra realización, las perlas y la solución de amplificación se añaden gota a gota en un flujo cruzado de aceite biocompatible. El aceite utilizado puede suplementarse con uno o más estabilizantes de emulsión biocompatibles. Entre estos estabilizantes de emulsión se incluyen Atlox 4912, Span 80, y otros estabilizantes adecuados comercialmente disponibles. En aspectos preferentes, la emulsión es estable al calor para permitir el ciclado térmico, por ejemplo a por lo menos 94ºC, a por lo menos 95ºC, o a por lo menos 96ºC. Preferentemente, las gotas formadas presentan un tamaño comprendido entre aproximadamente 5 micrómetros y aproximadamente 500 micrómetros, más preferentemente entre aproximadamente 10 micrómetros y aproximadamente 350 micrómetros, todavía más preferentemente entre aproximadamente 50 y 250 micrómetros, y todavía más preferentemente entre aproximadamente 100 micrómetros y aproximadamente 200 micrómetros. Ventajosamente, la mezcla de fluido en flujo cruzado permite el control de la formación de las gotas y la uniformidad del tamaño de gota. Los presentes inventores señalan que pueden encontrarse presentes en la emulsión gotas de agua de menor tamaño que no contienen perlas.
Los microrreactores deben presentar un tamaño suficientemente grande para poder incluir suficientes reactivos de amplificación para el grado de amplificación requerido. Sin embargo, los microrreactores deben ser suficientemente pequeños para que una población de microrreactores, conteniendo cada uno un miembro de una biblioteca de ADN, pueda amplificarse utilizando equipos de laboratorio convencionales, por ejemplo un equipo de termociclado de PCR, probetas, incubadores y similares. Notablemente, la utilización de microrreactores permite la amplificación de mezclas complejas de moldes (por ejemplo muestras de ADN genómico o ARN de células completas) sin mezclar entre sí las secuencias o sin que domine uno o más moldes (por ejemplo sesgo de selección de la PCR; ver Wagner et al., 1994; Suzuki y Giovannoni, 1996; Chandler et al., 1997; Polz y Cavanaugh, 1998).
Dentro de las limitaciones indicadas anteriormente, el tamaño óptimo de un microrreactor puede ser de entre 100 y 200 micrómetros de diámetro. Los microrreactores de este tamaño permitirían la amplificación de una biblioteca de ADN que comprende aproximadamente 600.000 miembros en una suspensión de microrreactores de menos de 10 ml de volumen. Por ejemplo, en el caso de que la PCR sea el método de amplificación seleccionado, podrían incluirse 10 ml de microrreactores en 96 tubos de un termociclador convencional con capacidad para 96 tubos. En una realización preferente, la suspensión de 600.000 microrreactores presentaría un volumen inferior a 1 ml. Una suspensión de menos de 1 ml puede amplificarse en aproximadamente 10 tubos de un termociclador de PCR convencional. En una realización todavía más preferente, la suspensión de 600.000 microrreactores presentaría un volumen inferior a 0,5 ml.
Otra realización de la invención se refiere a un método para llevar a cabo la amplificación de ácidos nucleicos con un molde y una perla, aunque sin unir el molde a la perla. En un aspecto, la perla puede comprender una molécula conectora que puede unirse al ácido nucleico amplificado tras la amplificación. Por ejemplo, el conector puede ser un conector activable. Este tipo de conectores son bien conocidos e incluyen parejas de unión sensibles a la temperatura o a las condiciones salinas, tales como estreptavidina/biotina y anticuerpos/antígeno. El ácido nucleico molde puede encapsularse con una perla y amplificarse. Tras la amplificación, el ácido nucleico amplificado puede unirse a las perlas, por ejemplo mediante ajustes de temperatura o de la concentración salina.
Amplificación asimétrica
Tras el encapsulado, el ácido nucleico molde puede amplificarse, unido o no unido a las perlas, mediante cualquier método adecuado de amplificación, incluyendo los sistemas de amplificación basados en la transcripción (Kwoh D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:1173, (1989); Gingeras, T.R. et al., patente WO 88/10315; Davey C et al., publicación EP No. 329.822; Miller H.I. et al., patente WO 89/06700), "RACE" (Frohman M.A., en: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, NY, 1990) y PCR unilateral (Ohara O. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:5673-5677, 1989). Pueden utilizarse todavía otros métodos según la presente invención, tales como la amplificación con dioligonucleótidos, la amplificación isotérmica (Walker G.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:392-396, 1992), la amplificación basada en una secuencia de ácidos nucleicos (NASBA; ver, por ejemplo, Deiman B. et al., Mol. Biotechnol. 20(2):163-79, 2002), la amplificación de genoma completo (ver, por ejemplo, Hawkins T.L. et al., Curr. Opin. Biotechnol. 13(1):65-7, 2002), la amplificación por desplazamiento de cadena (ver, por ejemplo, Andras S.C., Mol. Biotechnol. 19(1):29-44, 2001), la amplificación de círculo rodante (revisada en la patente US No. 5.714.320) y otras técnicas bien conocidas.
En una realización preferente, la amplificación del ADN se lleva a cabo mediante PCR. La PCR según la presente invención puede llevarse a cabo mediante encapsulado del ácido nucleico diana con una solución de PCR que comprenda todos los reactivos necesarios para la PCR. A continuación, la PCR puede llevarse a cabo mediante exposición de la emulsión a cualquier régimen adecuado de termociclado conocido de la técnica. En una realización preferente, se llevan a cabo 30 a 50 ciclos, preferentemente aproximadamente 40 ciclos de amplificación. Resulta deseable, aunque no necesario, que tras el procedimiento de amplificación se realice uno o más ciclos de hibridación y extensión tras los ciclos de amplificación. En una realización preferente, se llevan a cabo 10 a 30 ciclos, preferentemente aproximadamente 25 ciclos de hibridación y extensión (por ejemplo tal como se describe en los ejemplos). Rutinariamente, el ADN molde se amplifica hasta inmovilizar en cada perla típicamente por lo menos 10.000 a 50.000.000 copias. Se reconoce que, para las aplicaciones de detección de ácidos nucleicos, resultan necesarias menos copias de molde. Para las aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos los presentes inventores prefieren que se inmovilicen en cada perla por lo menos dos millones a cincuenta millones de copias, preferentemente entre aproximadamente diez millones y treinta millones de copias del ADN molde. El experto en la materia reconocerá que el tamaño de la perla (y del sitio de captura en la misma) determina el número de cebadores capturados que pueden unirse (y, de esta manera, el número de moldes amplificados que puede capturarse en cada perla).
\vskip1.000000\baselineskip
Diseño del cebador de PCR
La selección de ácidos nucleicos cebadores para la amplificación, tal como la amplificación por PCR, se encuentra perfectamente dentro de las capacidades del experto en la materia. Pueden encontrarse estrategias para el diseño de cebadores en la literatura científica, por ejemplo en Rubin E. y A.A. Levy, Nucleic Acids Res. 24(18):3538-45, 1996; y Bucks G.A. et al., Biotechniques 27(3):528-36, 1999. En una realización preferente, los cebadores pueden limitarse a una longitud de 20 bases (5 tetrámeros) para la síntesis eficiente de cebadores bipartitos de PCR/secuenciación. Cada cebador puede incluir una abrazadera GC de dos bases en el extremo 5', una única abrazadera GC en el extremo 3', y todos los cebadores pueden compartir una Tm similar (+/-2ºC). En una realización preferente, las estructuras de horquilla dentro de los cebadores (\DeltaG de tallos de horquillas internas > -1,9 kcal/moles) resultan fuertemente desfavorecidas en cualquiera de los cebadores diseñados. En otra realización preferente, la dimerización de los cebadores también se encuentra controlada, de manera que se acepta como máximo un dímero de 3 bases. Sin embargo, se permite que esto ocurra únicamente en las últimas seis bases 3' y la \DeltaG máxima permisible para un dímero 3' es de -2,0 kcal/mol. Preferentemente, se aplica una penalización a los cebadores en los que los extremos 3' son excesivamente similares a otros en el grupo. Esto impide la hibridación cruzada entre un cebador y el complemento inverso del otro cebador.
En el caso de que los cebadores se diseñen según los criterios indicados anteriormente, la posibilidad de que existan regiones complementarias dentro del genoma de interés no constituye un gran problema, a pesar de la tolerancia informada de la PCR a apareamientos incorrectos en poblaciones de muestra complejas (Rubin E y A.A. Levy, Nucleic Acids Res. 24(18):3538-45, 1996). Aunque la probabilidad de encontrar un apareamiento perfecto con un cebador de 20 bases es extremadamente baja (4^{20}) (ver la Tabla 1), la probabilidad de encontrar apareamientos no consecutivos más cortos se incrementa significativamente con el tamaño del genoma de interés. Como consecuencia, la probabilidad de encontrar una correspondencia perfecta para una secuencia de por lo menos 10 ó 20 bases es 99,35% para un genoma de adenovirus. La probabilidad de encontrar una correspondencia perfecta para una secuencia de 16 bases es de 97% para las secuencias en la base de datos de NCBI (aproximadamente 100 veces más información de secuencia que el genoma de adenovirus). La probabilidad de encontrar una correspondencia perfecta para una secuencia de 17 a 20 bases es de 99% para el genoma humano (aproximadamente 3.000 millones de bases).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
1 
\vskip1.000000\baselineskip
Sin embargo, la hibridación cruzada de un cebador a diversas regiones del genoma resulta menos problemática de lo esperado a partir de la digestión aleatoria de ADN utilizada para formar los ácidos nucleicos molde. Las regiones de hibridación cruzada (CHRs) son bastante benignas. En primer lugar, es improbable que una CHR pueda competir con éxito con el apareamiento perfecto entre los cebadores de PCR en solución y el molde. Además, cualquier cebador que incluya apareamientos incorrectos en el extremo 3' presentará una desventaja competitiva significativa. Incluso en el caso de que una CHR ganase en competición al cebador de PCR deseado, produciría un producto de PCR truncado, sin sitio cadena abajo para el cebador de secuenciación. En el caso de que el producto truncado pudiese transportarse hasta la perla de captura e inmovilizarse, podrían resultar dos situaciones. En el caso de que la CHR ganase en competencia al cebador en fase solución, el producto inmovilizado no presentaría un sitio de unión de cebador de secuenciación y resultaría en un pocillo vacío en la placa PicoTiter (PTP). En el caso de que la CHR ganase en competencia con el cebador unido a perla, el cebador de secuenciación todavía se encontraría presente y el único efecto sería una inserción más corta. Ninguno de estos resultados comprometería indebidamente la calidad de la secuenciación. Dada la gran cantidad de material genómico utilizado en el procedimiento de preparación de muestras (en la actualidad 25 \mug, que contiene 5,29x10^{16} copias del genoma adenovírico de 35 Kb), puede utilizarse el sobremuestreo para proporcionar fragmentos que no presentan la CHR completa, permitiendo la amplificación por PCR estándar de la región en cuestión.
\vskip1.000000\baselineskip
Rotura de la emulsión y recuperación de perlas
Tras la amplificación del ácido nucleico molde y la unión de copias de amplificación a la perla, se "rompió" la emulsión (también denominada "demulsificación" en la técnica). Existen muchos métodos para romper una emulsión (ver, por ejemplo, la patente US No. 5.989.892 y referencias citadas en la misma) y un experto en la materia sería capaz de seleccionar un método apropiado. En la presente invención, un método preferente para romper la emulsión utiliza aceite adicional para provocar que la emulsión se separe en dos fases. A continuación, se elimina la fase aceite y se añade un solvente orgánico adecuado (por ejemplo hexanos). Tras la mezcla, se elimina la fase de aceite/solvente orgánico. Esta etapa puede repetirse varias veces. Finalmente, se eliminan las capas acuosas en la parte superior de las perlas. Seguidamente las perlas se lavan con una mezcla de un solvente orgánico y tampón de hibridación (por ejemplo, se describe en los ejemplos un tampón de hibridación adecuado) y después se lavan nuevamente en tampón de hibridación. Entre los solventes orgánicos adecuados se incluyen alcoholes tales como metanol, etanol y similares.
Las perlas unidas a productos de amplificación seguidamente pueden resuspenderse en solución acuosa para la utilización, por ejemplo, en una reacción de secuenciación según tecnologías conocidas (ver Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:5463-5467, (1977); Maxam A.M. y Gilbert W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560-564, (1977); Ronaghi M. et al., Science 281:363-365, (1998); Lysov I. et al., Dok. Akad. Nauk. SSSR 303:1508-1511, (1988); Bains W. y Smith G.C., J. Theor. Biol. 135:303-307, (1988); Drnanac R. et al., Genomics 4:114-128, (1989); Khrapko K.R. et al., FEBS Lett. 256:118-122, (1989); Pevzner P.A., J. Biomol. Struct. Dyn. 7:63-73, (1989); Southern E.M. et al., Genomics 13:1008-1017, (1992)).
En el caso de que las perlas deban utilizarse en una reacción de secuenciación (descrita, por ejemplo, en las patentes US Nos. 6.274.30, 6.258.568 y 6.210.891, e incorporadas in toto en la presente memoria como referencia), resulta necesario eliminar la segunda cadena del producto de PCR e hibridar un cebador de secuenciación al molde monocatenario que se encuentra unido a la perla. La segunda cadena puede disociarse utilizando cualquiera de entre varios métodos comúnmente conocidos, tales como la adición de NaOH, la aplicación de una fuerza iónica reducida (por ejemplo sal), la degradación enzimática o el desplazamiento de la segunda cadena, o el procesamiento térmico. Tras esta etapa de eliminación de la cadena, las perlas se peletizan y se descarta el sobrenadante. Las perlas se resuspenden en un tampón de hibridación y se añade un cebador de secuenciación u otro cebador no de amplificación. El cebador se hibrida al producto de amplificación monocatenario. Esto puede llevarse a cabo mediante la utilización de un tampón de hibridación y condiciones de temperatura apropiados, por ejemplo según procedimientos estándares de la técnica.
Purificación de las perlas
En este punto, el ácido nucleico amplificado en la perla puede secuenciarse directamente en la perla o en un recipiente de reacción diferente. En una realización de la presente invención, el ácido nucleico se secuencia directamente en la perla mediante la transferencia de la perla a un recipiente de reacción y sometiendo el ácido nucleico a una reacción de secuenciación (por ejemplo la secuenciación de pirofosfato o la secuenciación de Sanger). Alternativamente, las perlas pueden aislarse y el ácido nucleico puede separarse de cada perla y secuenciarse. En cualquiera de los dos casos, las etapas de secuenciación pueden llevarse a cabo en cada perla individual. Sin embargo, este método, aunque comercialmente viable y técnicamente factible, podría no ser el más efectivo debido a que muchas de las perlas serán perlas "negativas" (es decir, perlas sin ácido nucleico amplificado ligado a las mismas). En estos casos, pueden utilizarse el procedimiento opcional indicado de manera general posteriormente, con el fin de eliminar las perlas negativas antes de la distribución en las placas multipocillo (por ejemplo en placas PicoTiter).
Un porcentaje elevado de las perlas puede ser negativo en el caso de que el objeto sea minimizar el número de perlas que se asocian a dos o más especies diferentes de ácidos nucleicos de molde. Para una secuenciación de pirofosfato óptima, cada perla debería contener múltiples copias de una única especie de ácido nucleico. Esto puede llevarse a cabo mediante la maximización del número total de perlas en combinación con un único fragmento de ácido nucleico antes de la amplificación. Por ejemplo, puede utilizarse el modelo matemático siguiente.
Para el caso general de un número N de ADNs distribuido aleatoriamente con M número de perlas, la población relativa de perlas asociada a cualquier número de ADNs depende de la proporción N/M. La fracción de perlas asociada a N ADNs, R(N), puede calcularse utilizando la distribución de Poisson:
R(N) = exp-(N/M) x (N/M)^{N}/N!
en la que x es el símbolo de multiplicación.
La Tabla 2, a continuación, muestra algunos valores calculados para diversos N/M (la proporción media de fragmento de ADN a perla) y N (el número de fragmentos asociados a una perla).
TABLA 2
2
En la Tabla 2, la fila superior muestra las diversas proporciones de N/M. R(0) indica la fracción de perlas sin ADN, R (1) indica la fracción de perlas con un ADN (antes de la amplificación) y R(N>1) indica la fracción de ADN con más de un ADN (antes de la amplificación).
La Tabla 2 indica que la fracción máxima de perlas asociada a un único fragmento de ADN es 0,37 (37%) y esto ocurre a una proporción de fragmento a perla de uno a uno. En esta mezcla, aproximadamente 63% de las perlas no puede utilizarse para la secuenciación debido a que no se encuentran asociadas a ADN o se encuentran asociadas a más de una especie de ADN. Sin embargo, el control de la proporción de fragmento a perla requiere cálculos complejos, y la variabilidad produce lotes de perlas con una fracción significativamente menor de perlas utilizables.
Esta ineficiencia puede mejorarse significativamente separando las perlas que contienen amplicón (originado de la asociación con por lo menos un fragmento) de aquéllas sin amplicón (originadas de perlas sin fragmentos asociados). Se define "amplicón" como cualquier molécula de ácidos nucleicos producida mediante una técnica in vitro de amplificación de ácidos nucleicos. Para incrementar la eficiencia, puede llevarse a cabo la unión utilizando proporciones bajas de fragmento a perla (N/M < 1). Esto minimiza el número de perlas asociado a más de un ADN. Puede utilizarse una etapa de separación para eliminar la mayor parte o la totalidad de las perlas sin ADN, dejando una población enriquecida de perlas con una o más especies de ADN amplificado. Esta población enriquecida puede analizarse mediante cualquier método de secuenciación, tal como, por ejemplo, la secuenciación de pirofosfato. Debido a que la fracción de perlas con un amplicón (N = 1) se encuentra enriquecida, puede aplicarse cualquier método de secuenciación más eficientemente.
A título de ejemplo, con una proporción media de fragmento a perla de 0,1, el 90% de las perlas no portará amplicón, el 9% de las perlas portará un amplicón y el 0,5% de las perlas portará más de un amplicón. El enriquecimiento descrito posteriormente en la presente memoria eliminará el 90% de las perlas sin amplicón, dejando una población de perlas en la que la fracción disponible para la secuenciación (N = 1) es igual a:
1 - (0,005/0,09) = 94%
La dilución de la mezcla de fragmento a perla, conjuntamente con la separación de las perlas que contienen amplicón puede proporcionar un enriquecimiento de 2,5 veces sobre el método no enriquecido óptimo. Por ejemplo, 94%/37% (ver la Tabla 2, anteriormente, N/M = 1) = 2,5. Un beneficio adicional del procedimiento de enriquecimiento descrito posteriormente en la presente memoria es que la fracción última de perlas útil para la secuenciación es relativamente insensible a la variabilidad de N/M. De esta manera, los complejos cálculos para derivar la proporción N/M óptima resultan innecesarios o pueden llevarse a cabo con niveles más bajos de precisión. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, los métodos de la invención pueden adaptarse fácilmente para la utilización por personal menos formado o para la automatización. Un beneficio adicional de estos métodos es que las perlas sin amplicón pueden reciclarse y reutilizarse. Aunque el reciclado no resulta necesario, puede reducir el coste o el volumen total de reactivos, de manera que el método de la invención resulte más adecuado para algunos fines tales como, por ejemplo, el muestreo portátil, el muestreo robótico a distancia y similar. Además, los beneficios colectivos de los métodos dados a conocer (por ejemplo la adaptación para personal menos formado, la automatización y el reciclado de reactivos) reducirán el coste de los métodos. El procedimiento de enriquecimiento se describe en más detalle posteriormente.
El procedimiento de enriquecimiento puede utilizarse para tratar perlas que han sido amplificadas en el método de emulsión de perlas descrito anteriormente. La amplificación se diseña de manera que cada molécula de ácidos nucleicos amplificada contenga la misma secuencia en su extremo 3'. La secuencia de nucleótidos puede ser un 20-mero, aunque puede ser cualquier secuencia de 15 bases o más, tal como 25 bases, 30 bases, 35 bases, 40 bases o más larga. Aunque los extremos de oligonucleótidos más largos son funcionales, no resultan necesarios. Un experto en la materia será capaz de introducir dicha secuencia 3' en el extremo de un ácido nucleico amplificado. Por ejemplo, en el caso de que se utilice PCR para la amplificación de un ADN molde, la secuencia puede incluirse como parte de un miembro de la pareja de cebadores de PCR.
En la figura 3 se ilustra un esquema del procedimiento de enriquecimiento. En este procedimiento, se mezcló la perla ligada a amplicón con cuatro perlas vacías para crear una mezcla de perlas de amplificación diluida en fragmentos. En la etapa 1, se hibridó con el amplicón un cebador biotinilado complementario al extremo 3' del amplicón. En la etapa 2, se añadió ADN polimerasa y los cuatro desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) naturales a la mezcla de perlas y se extendió el cebador biotinilado. Esta extensión sirve para fortalecer la unión entre el cebador biotinilado y el ADN unido a perla. Esta etapa puede omitirse en el caso de que el enlace cebador biotinilado-ADN sea fuerte (por ejemplo en un ambiente altamente iónico). En la etapa 3, se introducen perlas recubiertas de estreptavidina susceptibles de atracción por un campo magnético (denominadas en la presente memoria "perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina") en las mezclas de perlas. Las perlas magnéticas se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo de Dynal (M290). Los grupos de captura de estreptavidina se unen a grupos biotina hibridados a los amplicones, uniendo de esta manera las perlas unidas a amplicón a las perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina.
En la etapa 5, se aplicó un campo magnético (representado por un imán) en un área próxima a la mezcla de reacción, provocando que los complejos de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina/perlas unidas a amplicón se posicionasen a lo largo de la pared del tubo más próxima al campo magnético. Las perlas magnéticas sin unión de perlas con amplicón también se esperaba que se posicionasen a lo largo del mismo lado. Las perlas sin amplicones permanecen en solución. Se lavó la mezcla de perlas y las perlas no unidas al imán (es decir, las perlas vacías) se separaron y se descartaron. En la etapa 6, la cadena extendida por el cebador biotinilado se separó de la cadena de amplicón mediante "disociación". Esta etapa puede llevarse a cabo, por ejemplo con calor o mediante una modificación del pH. El calor puede ser 60ºC bajo condiciones de baja salinidad (por ejemplo en un ambiente poco iónico, tal como 0,1xSSC). La modificación del pH puede llevarse a cabo mediante la adición de NaOH. A continuación, la mezcla se lava y el sobrenadante que contiene las perlas unidas a amplicón se recupera, mientras que las perlas magnéticas resultan retenidas por un campo magnético. Las perlas enriquecidas resultantes pueden utilizarse para la secuenciación del ADN. Se indica que el cebador en la perla de captura de ADN puede ser el mismo que el cebador de la etapa 2, anteriormente. En este caso, la hibridación de las cadenas complementarias de amplicón-cebador (con o sin extensión) es el origen de la afinidad de captura de la diana.
La pareja de biotina-estreptavidina podría sustituirse por una diversidad de parejas de capturadiana. Por ejemplo, las parejas de captura-diana pueden utilizar enlaces reversibles (por ejemplo cortables) o irreversibles. Entre los ejemplos no limitantes de enlaces reversibles se incluyen tiol-tiol, digoxigenina/anti-digoxigenina y enlaces utilizando VECTREX® avidina DLA (Vector Laboratories, Burlingame, CA), CaptAvidin^{TM}, NeutrAvidin^{TM} y D-destiobiotina (Molecular Probes Inc., Eugene, OR).
Tal como se ha descrito anteriormente, la etapa 2 del procedimiento de enriquecimiento es opcional. En el caso de que se omita la etapa 2, podría no resultar necesario separar las perlas magnéticas de las perlas con amplicón ligado. Las perlas con amplicón ligado, con las perlas magnéticas unidas, pueden utilizarse directamente para la secuenciación. Por ejemplo, la separación puede no resultar necesaria en el caso de que la secuenciación se lleve a cabo en una placa de microtitulación o en una placa PicoTiter y el complejo de perla con amplicón ligado-perla magnética quepa en el interior del pocillo de la placa.
Aunque la utilización de perlas de captura magnéticas resulta conveniente, los grupos de captura pueden comprender otras superficies ligantes. Pro ejemplo, puede unirse químicamente estreptavidina a una superficie, tal como la superficie interior de un tubo. En este caso, la mezcla de perlas amplificadas puede hacerse fluir a través del tubo. Las perlas con amplicón ligado tenderán a resultar retenidas hasta la "disociación" mientras que las perlas vacías fluirán a través del tubo. Esta disposición puede resultar particularmente ventajosa para la automatización del procedimiento de preparación de perlas.
Aunque las realizaciones descritas anteriormente resultan particularmente útiles, pueden contemplarse otros métodos para separar perlas. Por ejemplo, las perlas de captura pueden marcarse con un grupo fluorescente que provocaría que el complejo de perla de captura de diana fuese fluorescente. El complejo de perla de captura de diana puede separarse mediante citometría de flujo o con un separador celular de fluorescencia. La utilización de perlas de captura de gran tamaño permitiría la separación mediante filtración u otras técnicas de separación basadas en el tamaño de partícula. Debido a que las perlas tanto de captura como con diana son capaces de formar complejos con varias perlas, resulta posible aglutinar una masa de perlas de captura de diana entrecruzadas. El gran tamaño de la masa aglutinada permitiría la separación mediante el simple lavado de las perlas vacías no aglutinadas. Los métodos descritos se describen en mayor detalle en, por ejemplo, Bauer J., J. Chromatography B, 722:55-69, (1999), y en Brody et al., Applied Physics Lett. 74:144-146, (1999).
En una realización, la invención comprende un método para amplificar uno o más ácidos nucleicos, que comprende las etapas siguientes: a) formar una emulsión de agua en aceite para crear una pluralidad de microrreactores acuosos, en la que por lo menos uno de los microrreactores comprende un único ácido nucleico molde, una única perla capaz de unirse al ácido nucleico, y solución de reacción de amplificación que contiene los reactivos necesarios para llevar a cabo la amplificación de ácidos nucleicos, b) amplificar los ácidos nucleicos en los microrreactores para formar copias amplificadas de los ácidos nucleicos, y c) unir las copias amplificadas a las perlas en los microrreactores, y tal como se define adicionalmente en la reivindicación 1.
La solución de reacción de amplificación utilizada con este método puede ser una solución de reacción en cadena de polimerasa que comprende nucleótidos trifosfato, una polimerasa termoestable, y ácidos nucleicos cebadores suspendidos en un tampón compatible con condiciones de reacción en cadena de polimerasa. La reacción en cadena de polimerasa puede ser una reacción en cadena de polimerasa asimétrica o una reacción en cadena de polimerasa simétrica. A título de ejemplo, la amplificación puede llevarse a cabo mediante amplificación basada en la transcripción, la amplificación rápida de extremos de ADNc, la amplificación en flujo continuo o la amplificación de círculo
rodante.
Para la utilización con este método, una mayoría de los microrreactores puede incluir un único ácido nucleico. El método puede ponerse en práctica con por lo menos 10.000 ácidos nucleicos, o con por lo menos 50.000 ácidos nucleicos. Cada perla utilizada con el método puede utilizarse para capturar más de 10.000 copias de amplificación de un ácido nucleico molde. En diversas realizaciones, la emulsión contiene además estabilizantes de emulsión. Los estabilizantes de emulsión pueden ser Atlox 4912, Span 80 o combinaciones o mezclas de los mismos. La emulsión puede ser estable frente al calor, por ejemplo a 95ºC, y puede formarse mediante la adición gota a gota a un aceite de los ácidos nucleicos molde, perlas y la solución de reacción de amplificación. Los microrreactores pueden presentar un tamaño medio de entre 50 y 250 \mum de diámetro.
La invención también comprende un método para amplificar un ácido nucleico, que comprende las etapas siguientes: a) proporcionar un ácido nucleico molde que debe amplificarse, b) proporcionar un material de soporte sólido que comprende una perla generalmente esférica que presenta un diámetro de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 80 \mum, en donde la perla es capaz de unirse al ácido nucleico molde, c) mezclar el ácido nucleico molde y la perla en una solución de reacción de amplificación que contiene los reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos en una emulsión de agua en aceite, d) amplificar el ácido nucleico molde para formar copias amplificadas del ácido nucleico molde, y e) unir las copias amplificadas a la perla, y tal como se define adicionalmente en la reivindicación 14.
Opcionalmente, el método puede incluir una etapa de enriquecimiento para aislar perlas que se unan a copias amplificadas del ácido nucleico separándolas de perlas a las que no se ha unido ácido nucleico. Esta etapa de enriquecimiento puede llevarse a cabo mediante electroforesis, separación celular o purificación de afinidad (por ejemplo con perlas magnéticas que se ligan ácido nucleico). Preferentemente, por lo menos 100.000 copias de cada molécula de ácido nucleico diana se unen a cada perla, por lo menos 1.000.000 copias de cada molécula de ácido nucleico diana se unen a cada perla, o por lo menos 1 a 20.000.000 copias de cada molécula de ácido nucleico diana se unen a cada perla. En diversos aspectos, las perlas son perlas de sefarosa y las copias amplificadas se unen a las perlas mediante una pareja de unión, tal como antígeno/anticuerpo, ligando/receptor, polihistidina/níquel o avidina/biotina. El método también puede incluir las etapas siguientes: f) separar las perlas que portan molde y perla magnética, y g) eliminar las perlas magnéticas utilizando un campo magnético. Esta separación puede conseguirse mediante incubación a una temperatura superior a 45ºC o mediante incubación de las perlas portadoras de molde y las perlas magnéticas en una solución con un pH básico.
La invención comprende además un kit para llevar a cabo la amplificación de ácidos nucleicos de un ácido nucleico molde que comprende: a) una perla de captura de ácidos nucleicos, b) un aceite de emulsión, c) uno o más estabilizantes de emulsión, y d) instrucciones para utilizar el kit según los métodos proporcionados en las reivindicaciones 1 a 14 adjuntas.
Además, la invención comprende un método para producir una población clonal de ácidos nucleicos, que comprende: a) proporcionar una pluralidad de ácidos nucleicos molde de longitud comprendida entre 50 y 800 pb y perlas capaces de unirse a los ácidos nucleicos molde, b) mezclar los ácidos nucleicos molde y las perlas en una solución de reacción biológica que contiene reactivos necesarios para amplificar los ácidos nucleicos molde, y c) formar una emulsión para crear una pluralidad de microrreactores que comprenden los ácidos nucleicos molde, perlas y solución de reacción biológica, en donde por lo menos uno de los microrreactores comprende un único ácido nucleico molde y una única perla encapsulada en la solución de reacción biológica, en donde los microrreactores se encuentran contenidos en el mismo recipiente, y tal como se define adicionalmente en la reivindicación 24.
Según este método, los ácidos nucleicos pueden transcribirse y traducirse para generar por lo menos 10.000 copias de un producto de expresión. El producto de expresión puede unirse a las perlas mediante una pareja de unión seleccionada de entre el grupo que consiste de parejas de unión antígeno/anticuerpo, ligando/receptor, 6Xhis/níquel-ácido nitrilotriacético y etiqueta FLAG/anticuerpo FLAG. En determinados aspectos, el método produce una población clonal de proteínas, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y anticuerpos manipulados. La emulsión puede comprender una pluralidad de microrreactores termoestables, en la que los microrreactores presentan un diámetro de entre 50 y 200 \mum y comprende una solución de reacción biológica. La solución de reacción biológica puede comprende reactivos para llevar a cabo reacciones de amplificación mediante reacción en cadena de polimerasa o reacciones acopladas de transcripción y traducción. Preferentemente, una pluralidad de microrreactores comprende un ácido nucleico molde, por ejemplo uno o menos ácidos nucleicos molde, y uno o menos perlas que se unen a los ácidos nucleicos molde.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos PCR en emulsión de perlas
Los procedimientos siguientes, incluyendo la captura del ADN molde, la amplificación del ADN, y la recuperación de las perlas unidas al molde amplificado, pueden llevarse a cabo en un único tubo. El formato de emulsión garantiza la separación física de las perlas en "microrreactores" de entre 100 y 200 \mum dentro de este único tubo, permitiendo de esta manera la amplificación clonal de los diversos moldes. La inmovilización del producto de amplificación se lleva a cabo mediante la extensión del molde a lo largo de los oligonucleótidos unidos a las perlas de captura de ADN. Típicamente, el numero de copia del molde inmovilizado se encuentra comprendido entre 10 y 30 millones de copias por perla. Las perlas de captura de ADN con fijación de múltiples copias de una única especie de ácido nucleico molde se encuentran listas para la distribución en PTPs.
Los 300.000 pocillos de 75 picolitros grabados en la superficie de la PTP proporcionan una matriz única para la secuenciación de ADNs molde cortos de una manera masivamente paralela, eficiente y económica. Sin embargo, ello requiere cantidades bastante grandes (millones de copias) de moldes clonales en cada pocillo de reacción. Los métodos de la invención permiten al usuario amplificar clonalmente especies de molde genómico monocatenarias mediante reacciones de PCR llevadas a cabo en tubos estándares o en placas de microtitulación. Pueden mezclar copias únicas de las especies de molde con perlas de captura, resuspenderse en solución de amplificación por PCR completa y emulsionarse en microrreactores (de entre 100 y 200 \mum de diámetro), después de lo cual la amplificación por PCR genera una amplificación de 10^{7} veces de la especie de molde inicial. Este procedimiento resulto mucho más simple y más económico que los métodos anteriores.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1
Unión de ácido nucleico molde a perlas de captura
El presente ejemplo describe la preparación de una población de perlas que preferentemente presenta únicamente un ácido nucleico molde unido a las mismas. La amplificación clonal con éxito depende de la administración de un número controlado de especies molde (0,5 a 1) en cada perla. La administración de un exceso de especies puede resultar en la amplificación por PCR de una población mixta de moldes, evitando la generación de datos de secuencia con sentido, mientras que una deficiencia de especies resultará en que menos pocillos contendrán molde para la secuenciación. Esto puede reducir el grado de cobertura del genoma proporcionado por la etapa de secuenciación. En consecuencia, resulta preferente que se determine con exactitud la concentración de molde mediante cuantificación replicada y que se siga el protocolo de unión tal como se describe de manera general posteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Control de calidad de los moldes
El éxito de la reacción de PCR en emulsión se relaciona con la calidad de las especies de molde. Con independencia del cuidado y atención prestados a la etapa de amplificación, los moldes de mala calidad impedirán la amplificación exitosa y la generación de datos de secuencia con sentido. Para evitar la pérdida innecesaria de tiempo y dinero, resulta importante comprobar la calidad del material de molde antes de iniciar la tapa de PCR en emulsión del procedimiento. Preferentemente, la biblioteca debe pasar dos etapas de control de calidad antes de que se utilice en la PCR en emulsión. Debería determinarse su concentración y la distribución de los productos que contiene. Idealmente, la biblioteca debería ser una población heterogénea de fragmentos con pocos o ningún dímero (por ejemplo \sim90 bases) adaptador visible. Además, la amplificación con cebadores de PCR debería resultar en una extensión del producto comprendida entre, por ejemplo, 300 y 500 pb. La ausencia de producto de amplificación podría reflejar la incapacidad de ligar correctamente los adaptadores al molde, mientras que la presencia de una única banda de cualquier tamaño podría reflejar la contaminación del molde.
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación de la solución de PCR
La consideración principal en esta etapa es evitar la contaminación de la mezcla de reacción de PCR con amplicones dispersos. La contaminación de las reacciones de PCR con un amplicón residual es una de las cuestiones críticas que pueden provocar el fracaso de una secuenciación. Para reducir la posibilidad de contaminación, deberían seguirse prácticas adecuadas en el laboratorio y la preparación de la mezcla de reacción debería llevarse a cabo en una sala limpia en una campana de flujo laminar tratada por UV.
\vskip1.000000\baselineskip
Mezcla de reacción de PCR
Para 200 \mul de mezcla de reacción de PCR (suficiente para amplificar 600.000 perlas), se combinaron los reactivos siguientes en un tubo de PCR de 0,2 ml:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3
3
El tubo se agitó con vórtex intensamente y se almacenó en hielo hasta la hibridación de las perlas con molde.
Perlas de captura de ADN
1.
Se transfirieron 600.000 perlas de captura de ADN desde el tubo de solución madre hasta un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml. La cantidad exacta utilizada dependía de la concentración en perlas de reactivo formalizado.
2.
Las perlas se peletizaron en una minicentrífuga de laboratorio y se separó el sobrenadante.
3.
Se llevaron a cabo las etapas 4 a 11 en una sala limpia de PCR.
4.
Las perlas se lavaron con 1 ml de tampón de hibridación 1X.
5.
Las perlas de captura se peletizaron en la microcentrífuga. El tubo se giró 180º y se centrifugó nuevamente.
6.
La totalidad excepto 10 \mul del sobrenadante se extrajeron del tubo que contenía las perlas. Las perlas no resultaron perturbadas.
7.
Se añadió 1 ml de tampón de hibridación 1X y esta mezcla se incubó durante 1 minuto. A continuación, las perlas se peletizaron tal como en la etapa 5.
8.
Se extrajo del tubo la totalidad del material excepto aproximadamente 100 \mul.
9.
Las perlas restantes y la solución se transfirieron a un tubo de PCR.
10.
El tubo de 1,5 ml se lavó con 150 \mul de tampón de hibridación 1X mediante pipeteado varias veces. Se añadió lo anterior al tubo de PCR que contenía las perlas.
11.
Las perlas se peletizaron tal como en la etapa 5 y se extrajo la totalidad excepto 10 \mul de sobrenadante, procurando no perturbar el pellet de perlas.
12.
Se extrajo una alícuota de ADN molde monocatenario cuantificado (ADNsst). La concentración final era de 200.000 moléculas de ADNsst/\mul.
13.
Se añadieron 3 \mul del ADNsst diluido al tubo de PCR que contenía las perlas. Esto era equivalente a 600.000 copias de ADNsst.
14.
El tubo se agitó con vórtex suavemente para mezclar el contenido.
15.
El ADNsst se hibridó a las perlas de captura en un termociclador de PCR con el programa 80Anneal almacenado en la carpeta EPCR del termociclador MJ, utilizando el protocolo siguiente:
\bullet
\vtcortauna 5 minutos a 65ºC,
\bullet
\vtcortauna reducción de 0,1ºC/s hasta 60ºC,
\bullet
\vtcortauna mantenimiento a 60ºC durante 1 minuto,
\bullet
\vtcortauna reducción de 0,1ºC/s hasta 50ºC,
\bullet
\vtcortauna mantenimiento a 50ºC durante 1 minuto,
\bullet
\vtcortauna reducción de 0,1ºC/s hasta 40ºC,
\bullet
\vtcortauna mantenimiento a 40ºC durante 1 minuto,
\bullet
\vtcortauna reducción de 0,1ºC/s hasta 20ºC, y
\bullet
\vtcortauna mantenimiento a 10ºC hasta la etapa siguiente.
En la mayoría de casos, las perlas se utilizaron para la amplificación inmediatamente después de la unión de molde. En el caso de que las perlas no se utilizaran inmediatamente, deberían almacenarse en la solución de molde a 4ºC hasta necesitarlas. Tras el almacenamiento, las perlas se trataron de la manera siguiente.
16.
Tal como en la etapa 6, las perlas se extrajeron del termociclador, se centrifugaron y se extrajo el tampón de hibridación sin perturbar las perlas.
17.
Las perlas se almacenaron en un cubo de hielo hasta la emulsificación (Ejemplo 2).
18.
Las perlas de captura incluían, de media, 0,5 a 1 copias de ADNsst unido a cada perla, y se encontraban listas para la emulsificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2
Emulsificación
El presente ejemplo describe cómo crear una emulsión de agua en aceite termoestable que contiene aproximadamente 3.000 microrreactores de PCR por microlitro. A continuación se describe de manera general un protocolo para la preparación de la emulsión.
1.
Se añadieron 200 \mul de solución de PCR a las 600.000 perlas (ambos componentes del Ejemplo 1).
2.
La solución se pipeteó varias veces para resuspender las perlas.
3.
Se dejó incubar la mezcla de perlas para PCR a temperatura ambiente durante 2 minutos para equilibrar las perlas con la solución de PCR.
4.
Se añadieron 400 \mul de aceite de emulsión a un tubo de microcentrífuga de 2 ml irradiado con UV.
5.
Se añadió una barra de agitación magnética de 1/4'' "libre de amplicones" al tubo de aceite de emulsión.
Se preparó una barra de agitación libre de amplicones de la manera siguiente. Se utilizó una barra de agitación grande para sostener una barra de agitación de 1/4''. A continuación, la barra de agitación se:
\bullet
\vtcortauna lavó con DNA-Off (por goteo o por pulverización),
\bullet
\vtcortauna se enjuagó con agua picopura,
\bullet
\vtcortauna se secó con el borde de una toalla de papel Kimwipe, y
\bullet
\vtcortauna se irradió con UV durante 5 minutos.
6.
Se extrajo la inserción magnética de un soporte de tubos Dynal MPC-S. El tubo de aceite de emulsión se acopló al soporte para tubos. El tubo se fijó en el centro de una placa de agitación con el dial a 600 rpm.
7.
El tubo se agitó con vórtex intensamente para resuspender las perlas. Esto garantizó que se producía una agregación mínima de las perlas.
8.
Utilizando una pipeta P-200, se añadió gota a gota la mezcla de perlas para PCR al aceite bajo agitación a una tasa de aproximadamente una gota cada 2 segundos, permitiendo que cada gota bajase hasta el nivel de la barra de agitación magnética y se emulsificase antes de añadir la gota siguiente. La solución se convirtió en un líquido blanco lechoso homogéneo con una viscosidad similar a la mayonesa.
9.
Tras la adición de la mezcla de perlas para PCR entera, se dieron unos cuantos golpecitos al tubo de microcentrífuga para mezclar cualquier aceite en la superficie de la emulsión lechosa.
10.
Se continuó con la agitación durante 5 minutos más.
11.
Se repitieron las etapas 9 y 10.
12.
Se extrajo la barra de agitación del material emulsificado extrayéndolo del tubo con una barra de agitación más grande.
13.
Se extrajeron 10 \mul de la emulsión y se situaron sobre un portaobjetos de microscopía. Se cubrió la emulsión con un cubreobjetos y se inspeccionó la emulsión a una magnificación de 50X (ocular de 10X y lente objetivo de 5X). Se esperaba que una "buena" emulsión incluyese principalmente perlas individuales en gotas aisladas (microrreactores) de solución de PCR en aceite.
14.
Se preparó una mezcla de aceite en emulsión adecuada con estabilizantes de emulsión, de la manera siguiente. Los componentes de la mezcla en emulsión se muestran en la Tabla 4.
TABLA 4
4 
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla de aceite en emulsión se preparó mediante precalentamiento de Atlox 4912 a 60ºC en un baño de agua. A continuación, se añadieron 4,5 gramos de Span 80 a 94,5 gramos de aceite mineral para formar una mezcla. A continuación, se añadió a la mezcla un gramo del Atlox 4912 precalentado. Las soluciones se introdujeron en un recipiente cerrado y se mezclaron mediante agitación e inversión. Cualquier indicio de que Atlox sedimentaba o solidificaba se remedió mediante calentamiento de la mezcla a 60ºC, seguido de agitación adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
Amplificación
El presente ejemplo describe la amplificación del ADN molde en la mezcla en emulsión de perlas. Según el presente protocolo de la invención, la duración de la etapa de amplificación del ADN del procedimiento es de entre 3 y 4 horas. Tras completar la amplificación, la emulsión puede dejarse en el termociclador durante 12 horas como máximo antes de iniciar el procedimiento de aislamiento de las perlas. Se llevó a cabo el termociclado de PCR introduciendo 50 a 100 \mul de la mezcla de reacción emulsificada en cámaras de reacción PCR individuales (es decir, tubos para PCR). Se llevó a cabo la PCR de la manera siguiente:
1.
Se transfirió la emulsión en cantidades de entre 50 y 100 \mul a aproximadamente 10 tubos para PCR individuales o a una placa de 96 pocillos utilizando una única punta de pipeta. Para esta etapa, la emulsión de agua en aceite era altamente viscosa.
2.
Se selló la placa, o se cerraron los tubos para PCR con los tapones, y los recipientes se introdujeron en un termociclador MJ con o sin adaptador de placa de 96 pocillos.
3.
El termociclador de PCR se programó para que ejecutase el programa siguiente:
\bullet
\vtcortauna 1 ciclo (4 minutos a 94ºC) - inicio en caliente,
\bullet
\vtcortauna 40 ciclos (30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 58ºC, 90 segundos a 68ºC),
\bullet
\vtcortauna 25 ciclos (30 segundos a 94ºC, 6 minutos a 58ºC), y
\bullet
\vtcortauna almacenamiento a 14ºC.
4.
Tras completar la reacción de PCR, el material amplificado se extrajo con el fin de llevar a cabo la rotura de la emulsión y la recuperación de las perlas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
Rotura de la emulsión y recuperación de las perlas
El presente ejemplo describe cómo romper la emulsión y recuperar las perlas con molde amplificado sobre las mismas. Preferentemente, la emulsión posterior a la PCR debe seguir intacta. La fase inferior de la emulsión debería, según la inspección visual, seguir siendo una suspensión blanca lechosa. En el caso de que la solución se transparente, la emulsión podría haberse resuelto parcialmente en sus fase acuosas y aceitosa, y probablemente muchas de las perlas presentarán una mezcla de moldes. En el caso de que la emulsión se haya roto en uno o dos de los tubos, estas muestras no deberían agruparse con las demás. En el caso de que la emulsión se haya roto en todos los tubos, no debería continuarse el procedimiento.
1.
Todas las reacciones de PCR a partir de la muestra original de 600 \mul se agruparon en un único tubo de microcentrifugación de 1,5 ml utilizando una única punta de pipeta. Tal como se ha indicado anteriormente, la emulsión era bastante viscosa. En algunos casos, se repitió el pipeteado varias veces para cada tubo. Se transfirió la máxima cantidad posible de material al tubo de 1,5 ml.
\newpage
2.
El material emulsificado restante se recuperó de cada tubo para PCR mediante la adición de 50 \mul de aceite mineral Sigma en cada muestra. Utilizando una única punta de pipeta, se mezcló cada tubo mediante pipeteado varias veces para resuspender el material restante.
3.
Este material se añadió al tubo de 1,5 ml que contenía la mayor parte del material emulsificado.
4.
La muestra se agitó con vórtex durante 30 segundos.
5.
La muestra se agitó durante 20 minutos en el tubo de microcentrífuga de laboratorio a 13,2 Krpm en la microcentrífuga Eppendorf.
6.
La emulsión se separó en dos fases con una gran interfase blanca. Se extrajo la máxima cantidad posible de la fase superior de aceite transparente. El material turbio se dejó en el tubo. Con frecuencia, una capa blanca separaba las capas aceitosa y acuosa. Con frecuencia se observaron perlas peletizadas en el fondo del tubo.
7.
Se eliminó la capa acuosa en la parte superior de las perlas y se guardó para su análisis (análisis en gel, Agilent 2100, y Taqman). En el caso de que persistiese una interfase de material blanco en la parte superior de la capa acuosa, se extraían 20 microlitros de la capa acuosa subyacente. Esto se llevó a cabo atravesando el material de la interfase con una punta de pipeta y succionando la solución de la parte inferior.
8.
En la campana de humos de la sala de fabricación de PTP y de química superficial, se añadió 1 ml de hexanos al resto de la emulsión.
9.
La muestra se agitó con vórtex durante 1 minuto y se centrifugó a velocidad máxima durante 1 minuto.
10.
En la campana de humos de la sala de fabricación de PTP y química superficial, se extrajo la fase superior de aceite/hexano y se introdujo en el recipiente para residuos orgánicos.
11.
Se añadió 1 ml de tampón de hibridación 1X en etanol al 80% a la fase acuosa restante, interfase y perlas.
12.
La muestra se agitó con vórtex durante 1 minuto o hasta la disolución de la sustancia blanca.
13.
La muestra se centrifugó durante 1 minuto a alta velocidad. El tubo se hizo girar 180 grados y se centrifugó nuevamente durante 1 minuto. Se extrajo el sobrenadante sin perturbar el pellet de perlas.
14.
Las perlas se lavaron con 1 ml de tampón de hibridación 1X que contenía Tween-20 al 0,1% y se repitió esta etapa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5
Extracción de cadenas únicas e hibridación de cebadores
En el caso de que las perlas deban utilizarse en una reacción de secuenciación basada en pirofosfato, resulta necesario eliminar la segunda cadena del producto de PCR e hibridar un cebador de secuenciación al molde de una sola cadena que se encuentra unido a la perla. El presente ejemplo describe un protocolo para llevar a cabo lo anterior.
1.
Las perlas se lavaron con 1 ml de agua y se centrifugaron dos veces durante 1 minuto. El tubo se hizo girar 180º entre centrifugaciones. Tras la centrifugación, se eliminó la fase acuosa.
2.
Las perlas se lavaron con 1 ml de EDTA 1 mM. El tubo se centrifugó tal como en la etapa 1 y se eliminó la fase acuosa.
3.
Se añadió 1 ml de NaOH 0,125 M y se incubó la muestra durante 8 minutos.
4.
La muestra se agitó con vórtex brevemente y se introdujo en una microcentrífuga.
5.
Tras 6 minutos, las perlas se peletizaron tal como en la etapa 1 y se eliminó la máxima cantidad posible de solución.
6.
Al completarse la incubación de 8 minutos con NaOH, se añadió 1 ml de tampón de hibridación 1X.
7.
La muestra se agitó con vórtex brevemente, y las perlas se peletizaron tal como en la etapa 1. Se eliminó la máxima cantidad posible de sobrenadante y se añadió 1 ml adicional de tampón de hibridación 1X.
8.
La muestra se agitó con vórtex brevemente, las perlas se peletizaron tal como en la etapa 1, y se extrajeron 800 \mul de tampón de hibridación 1X.
9.
Las perlas se transfirieron a un tubo para PCR de 0,2 ml.
10.
Las perlas se transfirieron y se eliminó la máxima cantidad posible de tampón de hibridación, sin perturbar las perlas.
11.
Se añadieron 100 \mul de tampón de hibridación 1X.
12.
Se añadieron 4 \mul de cebador de secuenciación 100 \muM. La muestra se agitó con vórtex inmediatamente antes de la hibridación.
13.
La hibridación se llevó a cabo en un termociclador MH utilizando el programa "80Anneal".
14.
Las perlas se lavaron tres veces con 200 \mul de tampón de hibridación 1X y se resuspendieron con 100 \mul de tampón de hibridación 1X.
15.
Las perlas se contaron en un hemocitómetro Hausser. Típicamente se recuperaron entre 300.000 y 500.000 perlas (3.000 a 5.000 perlas/\mul).
16.
Las perlas se almacenaron a 4ºC y podrían utilizarse para la secuenciación durante 1 semana.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6
Etapa opcional de enriquecimiento
Las perlas se enriquecieron para perlas que contienen amplicón utilizando el procedimiento siguiente. El enriquecimiento no resulta necesario, pero podría utilizarse para hacer más eficientes técnicas posteriores de biología molecular, tales como la secuenciación de ADN.
Se añadieron cincuenta microlitros de cebador de secuenciación-biotina 10 \muM (total: 500 pmoles) a las perlas de sefarosa que contenía amplicones del Ejemplo 5. Las perlas se introdujeron en un termociclador. El cebador fue hibridado con el ADN en la perla por el programa de hibridación del termociclador del Ejemplo 2.
Tras la hibridación, las perlas de sefarosa se lavaron tres veces con tampón de hibridación que contenía Tween-20 al 0,1%. Las perlas, que ahora contienen fragmentos de ADNss hibridados con cebadores de secuenciación-biotina, se concentraron mediante centrifugación y se resuspendieron en 200 \mul de tampón de unión BST. Se añadieron 10 microlitros de 50.000 unidades/ml de polimerasa Bst a las perlas resuspendidas y se introdujo el recipiente que contenía las perlas en un agitador durante cinco minutos. Se añadieron dos microlitros de mezcla de dNTP 10 mM (es decir, 2,5 \mul de cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP 10 mM) y la mezcla se incubó durante 10 minutos adicionales a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron tres veces con tampón de hibridación que contenía Tween-20 al 0,1% y se resuspendieron en el volumen original de tampón de hibridación.
Cincuenta microlitros de perlas Dynal recubiertas de estreptavidina (Dynal Biotech INc., Lake Success, NY; perlas M270 o MyOne^{TM} a una concentración de 10 mg/ml) se lavaron tres veces con tampón de hibridación que contenía Tween-20 al 0,1% y se resuspendieron en el volumen original de tampón de hibridación que contenía Tween-20 al 0,1%. A continuación, se añadió la mezcla de perlas Dynal a las perlas de sefarosa resuspendidas. La mezcla se agitó con vórtex y se introdujo en un agitador durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Las perlas se recogieron en el fondo del tubo de ensayo mediante centrifugación a 2.300 g (500 rpm para la centrífuga Eppendorf 5415D). Las perlas se resuspendieron en el volumen original de tampón de hibridación que contenía Tween-20 al 0,1%. La mezcla, en un tubo de ensayo, se introdujo en un separador magnético (Dynal). Las perlas se lavaron tres veces con tampón de hibridación que contenía Tween-20 al 0,1% y se resuspendieron en el volumen original en el mismo tampón. Las perlas sin amplicones se eliminaron mediante etapas de lavado, tal como se ha indicado anteriormente. Únicamente se retuvieron las perlas de sefarosa que contenían los fragmentos de ADN apropiados.
Las perlas magnéticas se separaron de las perlas de sefarosa mediante la adición de 500 \mul de NaOH 0,125 M. La mezcla se agitó con vórtex y se separaron las perlas magnéticas mediante separación magnética. Las perlas de sefarosa que quedaban en solución se transfirieron a otro tubo y se lavaron con 400 \mul de Tris-acetato 50 mM hasta estabilizar el pH a 7,6.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7
Secuenciación de ácidos nucleicos mediante PCR en emulsión de perlas
Se llevó a cabo el experimento siguiente para someter a ensayo la eficacia de la PCR en emulsión de perlas. Para el presente protocolo, se unieron covalentemente 600.000 perlas de sefarosa, con un diámetro medio de entre 25 y 35 \mum (tal como son suministradas por el fabricante) a cebadores de captura a una proporción de 30 a 50 millones de copias por perla. Las perlas con cebadores de captura covalentemente unidos se mezclaron con 1,2 millones de copias de ADN monocatenario de una biblioteca de adenovirus. Los constructos de biblioteca incluían una secuencia que era complementaria al cebador de captura en las perlas.
La biblioteca de adenovirus se hibridó a las perlas utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. A continuación, las perlas se resuspendieron en solución de PCR completa. La solución de PCR y las perlas se emulsionaron en 2 volúmenes de aceite de emulsificación bajo centrifugación utilizando el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 2. Las perlas emulsificadas (encapsuladas) se sometieron a amplificación mediante PCR tal como se indica de manera general en el Ejemplo 3. La emulsión se rompió tal como se indica de manera general en el Ejemplo 4. El ADN en las perlas se separó en cadenas individuales, y se hibridó cebador de secuenciación utilizando el procedimiento del Ejemplo 5.
A continuación, se secuenciaron 70.000 perlas simultáneamente mediante secuenciación basada en pirofosfato utilizando un secuenciador pirofosfato de 454 Life Sciences (New Haven, CT) (ver solicitud copendiente de Lohman et al., presentada simultáneamente con la presente, titulada "Methods of Amplifying and Sequencing Nucleic Acids", USSN 60/476, presentada el 6 de junio de 2003). Se secuenciaron múltiples lotes de 70.000 perlas y los datos se proporcionan en la Tabla 5, a continuación.
TABLA 5
5
La Tabla 5 muestra los resultados obtenidos del análisis BLAST de comparación de las secuencias obtenidas del secuenciador pirofosfato con la secuencia de adenovirus. La primera columna muestra la tolerancia de error utilizada en el programa BLAST. La última columna muestra el error real determinado mediante comparación directa con la secuencia conocida.
\vskip1.000000\baselineskip
PCR en emulsión de perlas para la secuenciación desde dos extremos
Ejemplo 8
Control de calidad de moldes
Tal como se ha indicado anteriormente, se ha encontrado que el éxito de la reacción de PCR en emulsión se relaciona con la calidad de la especie molde monocatenaria. Por consiguiente, la calidad del material de molde se evaluó mediante dos controles de calidad independientes antes de iniciar el protocolo de PCR en emulsión. En primer lugar, se corrió una alícuota del molde monocatenario en el 2100 BioAnalyzer (Agilient). Se utilizó un PicoChip de ARN para verificar que la muestra incluía una población heterogénea de fragmentos, de tamaño comprendido entre aproximadamente 200 y 500 bases. En segundo lugar, se cuantificó la biblioteca utilizando el ensayo de fluorescencia RiboGreen en un fluorímetro de placas Bio-Tek FL600. Las muestras que se determinó que presentaban concentraciones de ADN inferiores a 5 ng/\mul se consideraron excesivamente diluidas para ser utilizadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 9
Síntesis de perlas de captura de ADN
Se extrajeron de la columna perlas empaquetadas de una columna de afinidad HP de sefarosa activada con 1 ml de N-hidroxisuccinimida (NHS) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Las perlas de tamaño comprendido entre 30 y 25 \mum se seleccionaron mediante pase seriado a través de secciones de filtro de malla de 30 y 25 \mum de poro (Sefar America, Depew, NY, USA). Las perlas que pasaron a través del primer filtro, pero que resultaron retenidas por el segundo se recogieron y se activaron tal como se describe en la literatura del producto (Amersham Pharmacia nº de protocolo 71700600AP). Se obtuvieron dos cebadores de captura largos diferentes marcados con amina HEG (hexaetilenglicol), correspondientes al extremo 5' de las cadenas sentido y antisentido del molde que debía amplificarse (espaciadores 5'-amina-3-HEG gcttacctgaccgacctctgcctatcccctgttgcgtgtc-3'; SEC ID nº 1, y espaciadores 5'-amina-3-HEG ccattccccagctcgtcttgccatctgttccctccctgtc-3'; SEC ID nº 2) (IDT Technologies, Coralville, IA, USA). Se diseñaron los cebadores para capturar ambas cadenas de los productos de amplificación. Los cebadores de captura se disolvieron en tampón fosfato 20 mM, pH 8,0, para obtener una concentración final de 1 mM. Se unieron tres microlitros de cada cebador a las perlas tamizadas de entre 30 y 25 \mum. A continuación, las perlas se almacenaron en un tampón de almacenamiento de perlas (Tris 50 mM, Tween al 0,02% y azida sódica al 0,02%, pH 8). Las perlas se cuantificaron con un hemocitómetro (Hausser Scientific, Horsham, PA, USA) y se almacenaron a 4ºC hasta su utilización.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 10
Preparación y formulación de mezcla de reacción PCR
Al igual que con cualquier técnica de amplificación de moléculas individuales, la contaminación de las reacciones con amplicones foráneos o residuales procedentes de otros experimentos podría interferir con una secuenciación. Para reducir la probabilidad de contaminación, se preparó la mezcla de reacción de PCR en una campana de flujo laminar tratada con UV situada en una sala limpia para PCR. Por cada reacción de PCR en una emulsión de 600.000 perlas se mezclaron en un tubo de 1,5 ml los reactivos siguientes: 225 \mul de mezcla de reacción (tampón HiFi Platinum 1X (Invitrogen), dNTPs 1 mM, MgSO_{4} 2,5 mM (Invitrogen), BSA al 0,1%, Tween al 0,01%, 0,003 U/\mul de PPi-asa termoestable (NEB), 0,125 \muM de cebador directo (5'-gcttacctgaccgacctctg-3'; SEC ID nº 3) y 0,125 \muM de cebador inverso (5'-ccattccccagctcgtcttg-3'; SEC ID nº 4) (IDT Technologies, Coralville, IA, USA) y 0,2 U/\mul de polimerasa Taq Hi-Fi Platinum 0,2 U/\mul (Invitrogen). Se extrajeron veinticinco microlitros de la mezcla de reacción y se almacenaron en un tubo individual para PCR de 200 \mul para la utilización como control negativo. Se almacenaron en hielo tanto la mezcla de reacción como los controles negativos hasta la utilización.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 11
Unión de especies de molde a perlas de captura de ADN
La amplificación clonal con éxito del ADN para la secuenciación se refiere al transporte de un número controlado de especies de molde hasta cada perla. Para los experimentos descritos posteriormente en la presente memoria, se determinó que la concentración de molde diana típica era de 0,5 copias de molde por perla de captura. A esta concentración, la distribución de Poisson dicta que 61% de las perlas no presentan molde asociado, que 30% presentan una especie de molde y 9% presenta dos o más especies de molde. El transporte de un exceso de especies puede resultar en la unión y posterior amplificación de una población mixta (2 ó más especies) en una perla individual, evitando la generación de datos de secuencia con sentido. Sin embargo, el transporte de un número excesivamente bajo de especies resultará en menos pocillos que contengan molde (una especie por perla), reduciendo el grado de cobertura de la secuenciación. En consecuencia, se consideró que era importante la concentración de molde de la biblioteca monocatenaria.
Se hibridaron moléculas de ácidos nucleicos de molde a cebadores complementarios en las perlas de captura de ADN mediante el método siguiente, puesto en práctica en una campana de flujo laminar tratada con UV. Se transfirieron a un tubo para PCR de 200 \mul seis cientas mil perlas de captura de ADN suspendidas en tampón de almacenamiento de perlas (ver el Ejemplo 9, anteriormente). El tubo se centrifugó en una minicentrífuga de laboratorio durante 10 segundos, se hicieron girar 180º y se centrifugaron durante 10 segundos adicionales para garantizar una formación uniforme del pellet. Se extrajo el sobrenadante y las perlas se lavaron con 200 \mul de tampón de hibridación (Tris 20 mM, pH 7,5 y acetato de magnesio 5 mM). El tubo se agitó con vórtex durante 5 segundos para resuspender las perlas, y las perlas se peletizaron tal como se ha indicado anteriormente. Se extrajo la totalidad menos 10 \mul del sobrenadante en la parte superior de las perlas, y se añadieron 200 \mul adicionales de tampón de hibridación. Las perlas se agitaron con vórtex nuevamente durante 5 segundos, se dejaron reposar durante 1 minuto y después se peletizaron tal como se ha indicado anteriormente. Se descartó la totalidad menos 10 \mul del sobrenadante.
A continuación, se añadieron a las perlas 1,5 \mul de 300.000 moléculas/\mul de biblioteca de moldes. El tubo se agitó con vórtex durante 5 segundos para mezclar el contenido y los moldes se hibridaron a las perlas en un programa de desnaturalización/hibridación controlada en un termociclador MJ. El programa permitió la incubación durante 5 minutos a 80ºC, seguido de una reducción de 0,1ºC/s hasta 70ºC, la incubación durante 1 minuto a 70ºC, la reducción de 0,1ºC/s hasta 60ºC, el mantenimiento a 60ºC durante 1 minuto, la reducción de 0,1ºC/s hasta 50ºC, el mantenimiento a 50ºC durante 1 minuto, la reducción de 0,1ºC/s hasta 20ºC y el mantenimiento a 20ºC. Tras completar el procedimiento de hibridación, se extrajeron las perlas del termociclador, se centrifugaron tal como se ha indicado anteriormente y se decantó cuidadosamente el tampón de hibridación. Las perlas de captura incluían, de media, 0,5 copias de ADN molde monocatenario unido a cada perla, y se almacenaron en hielo hasta que fueron utilizadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 12
Emulsificación
El procedimiento de emulsificación crea una emulsión termoestable de agua en aceite que contiene 10.000 microrreactores de PCR discretos por microlitro. Ésta sirve como matriz para la amplificación clonal de las moléculas individuales de la biblioteca de dianas. La mezcla de reacción y las perlas de captura de ADN para una única reacción se emulsificaron de la manera siguiente. En una campana de flujo lamina tratada con UV, se añadieron 200 \mul de solución para PCR (del Ejemplo 10) al tubo que contenía 600.000 perlas de captura de ADN (del Ejemplo 11). Las perlas se resuspendieron mediante pipeteado repetido. A continuación, se incubó la mezcla de perlas para PCR a temperatura ambiente durante por lo menos 2 minutos, permitiendo que las perlas se equilibrase con la solución de PCR. Simultáneamente, 450 \mul de aceite de emulsión (Span 80 al 4,5% (p/p), Atlox 4912 al 1% (p/p) (Uniqema, Delaware) en aceite mineral ligero (Sigma)) se dividió en alícuotas en un tubo de centrífuga de 2 ml de tapón plano (Dot Scientific) que contenía una barra de agitación magnética de &#188; pulgada estéril (Fischer). Este tubo seguidamente se introdujo en un dispositivo de soporte de tubos de plásticos diseñado al efecto, que después se centró en una placa caliente de agitación digital Fisher Isotemp (Fisher Scientific) con el dial fijo en 450 rpm.
La solución de perlas para PCR se agitó con vórtex durante 15 segundos para resuspender las perlas. A continuación, la solución se aspiró en un jeringa plástica desechable de 1 ml (Benton, Dickinson) acoplada a una aguja de jeringa de seguridad de plástico (Henry Schein). La jeringa se introdujo en una bomba de jeringa (Cole-Parmer) modificada con una unidad de base de aluminio que orientaba la bomba verticalmente y no horizontalmente (por ejemplo figuras 4 a 6). El tubo con el aceite en emulsión se alineó con la placa de agitación de manera que se encontrase centrado bajo la aguja de la jeringa de plástico y la barra de agitación magnética girase correctamente. Se fijó la bomba de jeringa para que dispensase 0,6 ml a una tasa de 5,5 ml/hora. Se añadió la solución de perlas para PCR al aceite en emulsión gota a gota. Se procuró garantizar que las gotas no entrasen en contacto con las paredes del tubo a medida que caían en el aceite en rotación.
Tras la formación de la emulsión, se procuró minimizar la agitación de la emulsión tanto durante el procedimiento de emulsificación como durante las etapas de división en alícuotas posteriores a la emulsificación. Se encontró que la agitación con vórtex, el pipeteado rápido o la mezcla excesiva podían provocar la rotura de la emulsión, destruyendo los microrreactores discretos. Durante la formación de la emulsión, las dos soluciones se convirtieron en mezclas blancas lechosas homogéneas con la viscosidad de la mayonesa. Se vació el contenido de la jeringa en el aceite en rotación. A continuación, se retiró el tubo de emulsión del dispositivo de soporte y se golpeó suavemente con los dedos hasta desaparecer cualquier capa de aceite residual en la parte superior de la emulsión. Se colocó nuevamente el tubo en el dispositivo de soporte y se agitó utilizando la barra de agitación magnética durante un minuto adicional. Se sacó la barra de agitación de la emulsión pasando una herramienta de extracción magnética por el exterior del tubo, y se descartó.
Se extrajeron veinte microlitros de la emulsión procedentes de la parte intermedia del tubo mediante la utilización de un pipeteador P100 y se pusieron sobre un portaobjetos de microscopía. Se utilizaron las puntas de pipeta más grandes para minimizar las fuerzas de cizalla. Se inspeccionó la emulsión a una magnificación de 50X para comprobar que comprendía predominantemente perlas individuales en microrreactores de solución para PCR en aceite de 30 a 150 micrómetros de diámetro (figura 7). Tras el examen visual, se amplificaron inmediatamente las emulsiones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 13
Amplificación
La emulsión se dividió en alícuotas en 7 a 8 tubos para PCR separados. Cada tubo incluía aproximadamente 75 \mul de la emulsión. Se sellaron los tubos y se introdujeron en un termociclador MJ conjuntamente con los 25 \mul de control negativo indicados anteriormente. Se utilizaron los tiempos de ciclado siguientes: 1 ciclo de incubación durante 4 minutos a 94ºC (inicio en caliente), 30 ciclos de incubación durante 30 segundos a 94ºC y 150 segundos a 68ºC (amplificación), y 40 ciclos de incubación durante 30 segundos a 94ºC, y 360 segundos a 68ºC (hibridación y extensión). Tras completar el programa de PCR, se extrajeron los tubos y se rompieron inmediatamente las emulsiones o se almacenaron las reacciones a 10ºC durante como máximo 16 horas antes de iniciar el procedimiento de rotura.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 14
Rotura de la emulsión y recuperación de las perlas
Tras la amplificación, se examinaron las emulsiones para rotura (separación de las fases de aceite y de agua). Las emulsiones no rotas se agruparon en un único tubo de microcentrifugación de 1,5 ml, mientras que las emulsiones rotas, encontradas ocasionalmente, se descartaron. Debido a que las muestras de emulsión eran bastante viscosas, quedaron cantidades significativas en cada tubo para PCR. La emulsión que quedaba en los tubos se recuperó mediante la adición de 75 \mul de aceite mineral en cada tubo para PCR y el pipeteado de esta mezcla. La mezcla se añadió al tubo de 1,5 ml que contenía la mayor parte del material emulsificado. A continuación, se agitó con vórtex el tubo de 1,5 ml durante 30 segundos. Seguidamente, el tubo se centrifugó durante 20 minutos en la microcentrífuga de laboratorio a 13,2 Krpm (velocidad máxima).
Tras la centrifugación, la emulsión se separó en dos fases con una gran interfase blanca. La fase aceitosa transparente en la parte superior se descartó, mientras que el material turbio de interfase se dejó en el tubo. En una campana de humos química, se añadió 1 ml de hexanos a la fase inferior y a la capa de interfase. La mezcla se agitó con vórtex durante 1 minuto y se centrifugó a velocidad máxima durante 1 minuto en una microcentrífuga de laboratorio. La fase superior de aceite/hexano se extrajo y se descartó. A continuación, se añadió 1 ml de etanol al 80%/tampón de hibridación 1X a la fase acuosa, interfase y perlas restantes. Esta mezcla se agitó con vórtex durante 1 minuto o hasta que el material blanco de la interfase se hubiese disuelto. Seguidamente la muestra se centrifugó en una microcentrífuga de laboratorio durante 1 minuto a velocidad máxima. Se giró el tubo 180 grados y se centrifugó nuevamente durante un minuto adicional. A continuación, se extrajo cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el pellet de perlas.
El pellet blanco de perlas se lavó dos veces con 1 ml de tampón de hibridación que contenía Tween-20 al 0,1%. Se descartó la solución de lavado y las perlas se peletizaron después de cada lavado tal como se ha indicado anteriormente. El pellet se lavó con 1 ml de agua picopura. Las perlas se peletizaron mediante el método de centrifugación-giro-centrifugación utilizado anteriormente. Se extrajo cuidadosamente la fase acuosa. Seguidamente se lavaron las perlas con 1 ml de EDTA 1 mM tal como se ha indicado anteriormente, excepto que las perlas se agitaron con vórtex brevemente a una velocidad intermedia durante 2 segundos antes de peletizar y retirar el sobrenadante.
El ADN amplificado, inmovilizado sobre las perlas de captura, se sometió a tratamiento para obtener ADN monocatenario. Se extrajo la segunda cadena mediante incubación en una solución de disociación básica. Posteriormente se añadió a las perlas un ml de solución de disociación (NaOH 0,125 M, NaCl 0,2 M). El pellet se resuspendió mediante agitación con vórtex a velocidad intermedia durante 2 segundos y el tubo se introdujo en un agitador orbital para tubos Thermolyne LabQuake durante 3 minutos. A continuación, las perlas se peletizaron tal se ha indicado como anteriormente, y se extrajo cuidadosamente el sobrenadante y se descartó. La solución residual de disociación se neutralizó mediante la adición de 1 ml de tampón de hibridación. Seguidamente, las perlas se agitaron con vórtex a velocidad intermedia durante 2 segundos. Las perlas se peletizaron y el sobrenadante se extrajo tal como se ha indicado anteriormente. Se repitió el lavado con tampón de hibridación, excepto en que únicamente se extrajeron 800 \mul del tampón de hibridación tras la centrifugación. Las perlas y el tampón de hibridación remanente se transfirieron a un tubo para PCR de 0,2 ml. Las perlas se utilizaron inmediatamente o se almacenaron a 4ºC durante, como máximo, 48 horas antes de continuar con el procedimiento de enriquecimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 15
Enriquecimiento en perlas
La masa de perlas incluía perlas sin cadenas de ADN inmovilizadas amplificadas, y perlas vacías o nulas. Tal como se ha indicado anteriormente, se calculó que 61% de las perlas no presentaba ADN molde durante el procedimiento de amplificación. Se realizó un enriquecimiento para aislar selectivamente las perlas que presentaban ADN molde, maximizando de esta manera la eficiencia de la secuenciación. A continuación, se describe el procedimiento de enriquecimiento en detalle.
Las perlas con ADN monocatenario del Ejemplo 14 se peletizaron mediante el método de centrifugación-giro-centrifugación y se extrajo la máxima cantidad posible de sobrenadante sin perturbar las perlas. Se añadieron quince microlitros de tampón de hibridación a las perlas, seguido de 2 \mul de cebador de enriquecimiento de 40 bases biotinilado 100 \muM (espaciadores 5'-biotina-tetraetilenglicol ccattccccagctcgtcttgccatctgttccctccctgtctcag-3'; SEC ID nº 5). El cebador era complementario a la combinación de sitios de amplificación y secuenciación (cada uno de 20 bases de longitud) en el extremo 3' del molde inmovilizado en una perla. La solución se mezcló con vórtex a velocidad intermedia durante 2 segundos, y los cebadores de enriquecimiento se hibridaron a las cadenas de ADN inmovilizadas utilizando un programa de desnaturalización/hibridación controladas en un termociclador MJ. El programa consistía de los tiempos de ciclado y temperaturas siguientes: incubación durante 30 segundos a 65ºC, reducción de 0,1ºC/s hasta 58ºC, incubación durante 90 segundos a 58ºC, y mantenimiento a 10ºC.
Aunque los cebadores se hibridaban, se resuspendieron las perlas recubiertas de estreptavidina Dynal MyOne^{TM} haciendo girar suavemente los tubos. A continuación, se añadieron 20 \mul de las perlas MyOne^{TM} a un tubo de mcirocentrífuga de 1,5 ml que contenía 1 ml de líquido potenciador (NaCl 2 M, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5). La mezcla de perlas MyOne se agitó con vórtex durante 5 segundos y el tubo se introdujo en un imán MPC-S de Dynal. Las perlas paramagnéticas se peletizaron contra las paredes del tubo de microcentrífuga. Se extrajo cuidadosamente el sobrenadante y se descartó sin perturbar las perlas MyOne^{TM}. Se retiró el tubo del imán y se añadieron 100 \mul de líquido potenciador. El tubo se agitó con vórtex durante 3 segundos para resuspender las perlas y se almacenó en hielo hasta su utilización.
Tras completar el programa de hibridación, se añadieron 100 \mul de tampón de hibridación al tubo para PCR que contenía las perlas de captura de ADN y el cebador de enriquecimiento. El tubo se agitó con vórtex durante 5 segundos y el contenido se transfirió a un tubo fresco de microcentrífuga de 1,5 ml. El tubo para PCR en el que se hibridaba el cebador de enriquecimiento con las perlas de captura se lavó una vez con 200 \mul de tampón de hibridación, y se añadió la solución de lavado al tubo de 1,5 ml. Las perlas se lavaron tres veces con 1 ml de tampón de hibridación, se agitaron con vórtex durante 2 segundos y se peletizaron tal como se ha indicado anteriormente. Se extrajo cuidadosamente el sobrenadante. Tras el tercer lavado, las perlas se lavaron dos veces con 1 ml de líquido potenciador helado. Las perlas se agitaron con vórtex, se peletizaron y se extrajo el sobrenadante tal como se ha indicado anteriormente. Las perlas se resuspendieron en 150 \mul de liquido potenciador helado. El líquido potenciador y la solución de perlas se añadieron a las perlas MyOne^{TM} lavadas.
La mezcla de perlas se agitó con vórtex durante 3 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 3 minutos en un agitador orbital para tubos LabQuake. Las perlas MyOne^{TM} recubiertas de estreptavidina se unieron a los cebadores de enriquecimiento biotinilados que se encontraban hibridados a moldes inmovilizados en las perlas de captura de ADN. A continuación, las perlas se centrifugaron a 2.000 rpm durante 3 minutos, después de lo cual se agitaron con vórtex aplicando pulsos de 2 segundos hasta la resuspensión. Las perlas resuspendidas se dejaron sobre hielo durante 5 minutos. Seguidamente, se añadieron 500 \mul de líquido potenciador frío a las perlas y el tubo se insertó en un imán MPC-S de Dynal. Las perlas se dejaron en reposo durante 60 segundos, para permitir que se produjese la peletización contra el imán. A continuación, se retiró cuidadosamente el sobrenadante con exceso de MyOne^{TM} y perlas de captura de ADN nulas y se descartó.
El tubo se sacó del imán MPC-S y se añadió 1 ml de líquido potenciador frío a las perlas. Las perlas se resuspendieron con golpecitos suaves de los dedos. Resultaba importante no someter a agitación con vórtex a las perlas en este punto, debido a que la mezcla vigorosa podría romper el enlace entre las perlas MyOne^{TM} y las perlas de captura de ADN. Se devolvieron las perlas al imán y se eliminó el sobrenadante. Este lavado se repitió tres veces más para garantizar la eliminación de todas las perlas de captura nulas. Para extraer los cebadores de enriquecimiento hibridados y las perlas MyOne^{TM}, las perlas de captura de ADN se resuspendieron en 400 \mul de solución de disociación, se agitaron con vórtex durante 5 segundos y se peletizaron con el imán. El sobrenadante con las perlas enriquecidas se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml separado. Para la máxima recuperación de perlas enriquecidas, se añadió al tubo que contenía las perlas MyOneTM una segunda alícuota de 400 \mul de solución de disociación. Las perlas se agitaron con vórtex y se peletizaron tal como se ha indicado anteriormente. Se extrajo el sobrenadante del segundo lavado y se agrupó con el primer bolo de perlas enriquecidas. El tubo de perlas MyOne^{TM} ya utilizadas se descartó.
El tubo de microcentrífuga de perlas de captura de ADN enriquecidas se introdujo en el imán MPC-S de Dynal para peletizar cualquier perla MyOne^{TM} residual. Las perlas enriquecidas en el sobrenadante se transfirieron a un segundo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se centrifugaron. Se retiró el sobrenadante y las perlas se lavaron 3 veces con 1 ml de tampón de hibridación para neutralizar la solución residual de disociación. Tras el tercer lavado, se extrajeron 800 \mul del sobrenadante, y las perlas y solución remanentes se transfirieron a un tubo para PCR de 0,2 ml. Las perlas enriquecidas se centrifugaron a 2.000 rpm durante 3 minutos y se decantó el sobrenadante. A continuación, se añadieron 20 \mul de tampón de hibridación y 3 \mul de dos cebadores de secuenciación 100 \muM diferentes (5'-ccatctgttccctccctgtc-3'; SEC ID nº 6, y 5'-cctatccctgttgcgtgtc-3' fosfato; SEC ID nº 7). El tubo se agitó con vórtex durante 5 segundos y se introdujo en un termociclador MJ para someterlo al programa de hibridación en 4 etapas siguiente: incubación durante 5 minutos a 65ºC, reducción de 0,1ºC/s hasta 50ºC, incubación durante 1 minuto a 50ºC, reducción de 0,1ºC/s hasta 40ºC, mantenimiento a 40ºC durante 1 minuto, reducción de 0,1ºC/s hasta 15ºC y mantenimiento a 15ºC.
Tras completar el programa de hibridación, se extrajeron las perlas del termociclador y se peletizaron mediante centrifugación durante 10 segundos. Se hizo girar el tubo 180º y se centrifugó durante 10 segundos adicionales. Se decantó el sobrenadante y se descartó, y se añadieron 200 \mul de tampón de hibridación al tubo. Las perlas se resuspendieron con una segunda agitación con vórtex de 5 segundos y se peletizaron tal como se ha indicado anteriormente. Se extrajo el sobrenadante y las perlas se resuspendieron en 100 \mul de tampón de hibridación. En este punto se cuantificaron las perlas utilizando un contador Coulter Multisizer 3 (Beckman Coulter). Las perlas se almacenaron a 4ºC y fueron estables durante por lo menos 1 semana.
<110> Berka, Jan
\hskip1cm
Chen, Yi-Ju 
\hskip1cm
Leamon, John H. 
\hskip1cm
Lefkowitz, Steve 
\hskip1cm
Lohman, Kenton 
\hskip1cm
Makhijani, Vinod 
\hskip1cm
Sarkis, Gary J. 
\hskip1cm
Rothberg, Jonathan 
\hskip1cm
Weiner, Michael 
\hskip1cm
Srinivasan, Maithreyan 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Amplificación de ácidos nucleicos en emulsión de perlas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 21465-508 UTIL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> documento US nº 60/443.471
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2003-01-29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> documento US nº 60/465.071
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2003-04-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> documento US nº 60/476.592
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2003-06-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> documento US nº 60/476.504
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2003-06-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> documento US nº 60/476.592
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2003-06-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> documento US nº 60/476.602
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2003-06-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> documento US nº 60/497.985
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2003-08-25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcttacctga ccgacctctg cctatcccct gttgcgtgtc 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccattcccca gctcgtcttg ccatctgttc cctccctgtc 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcttacctga ccgacctctg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccattcccca gctcgtcttg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccattcccca gctcgtcttg ccatctgttc cctccctgtc tcag 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccatctgttc cctccctgtc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctatcccct gttgcgtgtc 
\hfill
20

Claims (29)

1. Método para la amplificación de uno o más ácidos nucleicos sobre una perla, que comprende las etapas siguientes:
(a)
formar una emulsión de agua en aceite para crear una pluralidad de microrreactores acuosos, en la que por lo menos uno de los microrreactores comprende un ácido nucleico molde monocatenario, una única perla con una primera población que comprende una pluralidad de moléculas de una primera especie de cebador dispuesta sobre la misma, y una solución de reacción de amplificación que comprende una segunda población que comprende una pluralidad de moléculas de la primera especie de cebador, una pluralidad de moléculas de una segunda especie de cebador, y reactivos necesarios para llevar a cabo la amplificación de ácidos nucleicos, en donde la primera especie de cebador es capaz de unirse al ácido nucleico molde monocatenario, la segunda especie de cebador es capaz de unirse a una cadena complementaria del ácido nucleico molde monocatenario, y la concentración de la segunda especie de cebador es mayor que la de la segunda población de la primera especie de cebador en la solución de reacción de amplifica- ción,
(b)
amplificar asimétricamente el molde de ácido nucleico monocatenario y la cadena complementaria a la cadena molde en la solución de reacción de amplificación, para formar una población de copias amplificadas del ácido nucleico molde monocatenario, y
(c)
unir una pluralidad de las copias amplificadas asimétricamente de ácido nucleico molde monocatenario a la primera población de la primera especie de cebador sobre la perla en el microrreactor, en el que una cadena complementaria unida a perla se extiende a partir de la primera especie de cebador.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, en el que una mayoría de los microrreactores incluye un único ácido nucleico.
3. Método según la reivindicación 1, en el que dicha solución de reacción de amplificación es una solución de reacción en cadena de polimerasa que comprende además nucleótidos trifosfato, una polimerasa termoestable, y tampón compatible con las condiciones de reacción en cadena de polimerasa.
4. Método según la reivindicación 1, en el que dicha emulsión contiene además estabilizantes de emulsión.
5. Método según la reivindicación 4, en el que dichos estabilizantes de emulsión se seleccionan de entre el grupo que consiste de Atlox 4912, Span 80 y combinaciones y mezclas de los mismos.
6. Método según la reivindicación 1, en el que dicha emulsión es termoestable.
7. Método según la reivindicación 6, en el que dicha emulsión es termoestable hasta 95ºC.
8. Método según la reivindicación 1, en el que la amplificación se lleva a cabo mediante un método seleccionado de entre el grupo que consiste de amplificación basada en la transcripción, amplificación rápida de extremos del ADNc, amplificación en flujo continuo y amplificación de círculo rodante.
9. Método según la reivindicación 1, en el que la emulsión se forma mediante la adición gota a gota de los ácidos nucleicos molde, perlas y solución de reacción de amplificación en un aceite.
10. Método según la reivindicación 1, puesto en práctica con por lo menos 10.000 ácidos nucleicos.
11. Método según la reivindicación 1, puesto en práctica con por lo menos 50.000 ácidos nucleicos.
12. Método según la reivindicación 1, en el que los microrreactores presentan un tamaño medio comprendido entre 50 y 250 \mum de diámetro.
13. Método según la reivindicación 1, en el que cada perla se una a más de 10.000 copias amplificadas asimétricamente del ácido nucleico molde monocatenario.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Método para la amplificación de un ácido nucleico, que comprende las etapas siguientes:
(a)
proporcionar un ácido nucleico molde monocatenario que debe amplificarse.
(b)
proporcionar un material de soporte sólido que comprende una perla generalmente esférica que presenta un diámetro de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 80 \mum, en el que la perla comprende una pluralidad de moléculas de una primera población de una primera especie de cebador dispuesta sobre las mismas y que es capaz de unirse al ácido nucleico molde,
(c)
mezclar los ácidos nucleicos de molde y las perlas en una solución de reacción de amplificación que comprende una pluralidad de moléculas de una segunda población de la primera especie de cebador, una segunda especie de cebador y reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos en una emulsión de agua en aceite, en donde la primera especie de cebador es capaz de unirse al ácido nucleico molde monocatenario, la segunda especie de cebador es capaz de unirse a una cadena complementaria del ácido nucleico molde monocatenario, y la concentración de la segunda especie de cebador es mayor que la de la segunda población de la primera especie de cebador en la solución de reacción de amplificación,
(d)
amplificar asimétricamente el ácido nucleico molde monocatenario y la cadena complementaria del ácido nucleico molde monocatenario en la solución de reacción de amplificación presente en la fase acuosa de la emulsión de agua en aceite utilizando la segunda población de la primera especie de cebador y la segunda especie de cebador para formar una población de copias amplificadas del ácido nucleico molde monocatenario, y
(e)
unir una pluralidad de las copias asimétricamente amplificadas del ácido nucleico molde monocatenario a la primera población de la primera especie de cebador sobre la perla, en donde una cadena complementaria unida a una perla se extiende a partir de la primera especie de cebador.
15. Método según la reivindicación 1 ó 14, que comprende además la etapa de enriquecer en perlas que se unen a copias amplificadas del ácido nucleico respecto a perlas a las que no se une ningún ácido nucleico, seleccionando la etapa de enriquecimiento de entre el grupo que consiste de purificación por afinidad, electroforesis y separación celular.
16. Método según la reivindicación 15, en el que la etapa de enriquecimiento se lleva a cabo mediante purificación por afinidad con perlas magnéticas que se unen a ácidos nucleicos.
17. Método según la reivindicación 1 ó 14, en el que se unen a cada perla por lo menos 100.000 copias de cada molécula de ácido nucleico diana.
18. Método según la reivindicación 1 ó 14, en el que se unen a cada perla por lo menos 1.000.000 copias de cada molécula de ácido nucleico diana.
19. Método según la reivindicación 1 ó 14, en el que se unen a cada perla por lo menos 1 a 20.000.000 copias de cada molécula de ácido nucleico diana.
20. Método según la reivindicación 1 ó 14, en el que las perlas son perlas de sefarosa.
21. Método según la reivindicación 16, que comprende además las etapas siguientes:
separar las perlas portadoras de molde y las perlas magnéticas, y
extraer las perlas magnéticas con un campo magnético.
22. Método según la reivindicación 21, en el que la separación se lleva a cabo mediante incubación a una temperatura superior a 45ºC o mediante la incubación de las perlas portadoras de molde y las perlas magnéticas en una solución con un pH básico.
23. Método para la producción de una población clonal de ácidos nucleicos, que comprende:
(a)
proporcionar una pluralidad de ácidos nucleicos molde monocatenarios de longitud comprendida entre 50 y 800 pb, y perlas, comprendiendo, cada una, una primera población de una pluralidad de moléculas de una primera especie de cebador dispuesta sobre las mismas,
(b)
mezclar los ácidos nucleicos molde monocatenarios y las perlas en una solución de reacción de amplificación que comprende una segunda población de una pluralidad de moléculas de la primera especie de cebador, una pluralidad de moléculas de una segunda especie de cebador y reactivos necesarios para amplificar los ácidos nucleicos de molde, y una concentración de la segunda especie de cebador superior a la de la segunda población de la primera especie de cebador en la solución de reacción de amplificación, en donde la primera especie de cebador es capaz de unirse al ácido nucleico molde monocatenario y la segunda especie de cebador es capaz de unirse a una cadena complementaria del ácido nucleico molde monocatenario,
(c)
formar una emulsión para crear una pluralidad de microrreactores que comprende ácidos nucleicos molde, perlas y solución de reacción de amplificación, en donde por lo menos uno de los microrreactores comprende un ácido nucleico molde y una única perla encapsulada en la solución de reacción de amplificación, en donde los microrreactores se encuentran contenidos en el mismo recipiente,
(d)
amplificar asimétricamente el ácido nucleico molde monocatenario y la cadena complementaria del ácido nucleico molde monocatenario en la solución de reacción de amplificación utilizando la segunda población de la primera especie de cebador y la segunda especie de cebador para formar una población de copias amplificadas del ácido nucleico molde monocatenario, y
(e)
unir una pluralidad de las copias amplificadas asimétricamente del ácido nucleico molde monocatenario a la primera población de la primera especie de cebador sobre la perla, en donde se extiende una cadena complementaria unida a perla a partir de la primera especie de cebador.
24. Método según la reivindicación 23, que comprende además transcribir y traducir los ácidos nucleicos para generar por lo menos 10.000 copias de un producto de expresión.
25. Método según la reivindicación 24, en el que dicho producto de expresión se encuentra unido a dichas perlas mediante una pareja de unión seleccionada de entre el grupo que consiste de las parejas de unión antígeno/anticuerpo, ligando/receptor, 6Xhis/níquel-ácido nitriloacético y etiqueta FLAG/anticuerpo de FLAG.
26. Método según la reivindicación 24, en el que el método produce una población clonal de proteínas.
27. Método según la reivindicación 26, en el que las proteínas se seleccionan de entre el grupo que consiste de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y anticuerpos manipulados.
28. Método según la reivindicación 1 ó 14, en el que el método comprende además las etapas siguientes:
\bullet
romper los microrreactores acuosos para liberar por lo menos una de las perlas unidas a ácido nucleico, comprendiendo la solución de reacción de amplificación productos de amplificación no unidos, y
\bullet
recuperar las perlas unidas a ácido nucleico.
29. Método según la reivindicación 1 ó 14, en el que, en la etapa (b) o (d), respectivamente, la solución de reacción se encuentra empobrecida en moléculas de la segunda población de la primera especie de cebador.
ES04706051.2T 2003-01-29 2004-01-28 Amplificación de ácidos nucleicos en emulsión de perlas Expired - Lifetime ES2338654T5 (es)

Applications Claiming Priority (15)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US44347103P 2003-01-29 2003-01-29
US443471P 2003-01-29
US46507103P 2003-04-23 2003-04-23
US465071P 2003-04-23
US47660203P 2003-06-06 2003-06-06
US47631303P 2003-06-06 2003-06-06
US47650403P 2003-06-06 2003-06-06
US47659203P 2003-06-06 2003-06-06
US476313P 2003-06-06
US476602P 2003-06-06
US476592P 2003-06-06
US476504P 2003-06-06
US49798503P 2003-08-25 2003-08-25
US497985P 2003-08-25
PCT/US2004/002484 WO2004069849A2 (en) 2003-01-29 2004-01-28 Bead emulsion nucleic acid amplification

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2338654T3 true ES2338654T3 (es) 2010-05-11
ES2338654T5 ES2338654T5 (es) 2017-12-11

Family

ID=32854649

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09166658T Expired - Lifetime ES2396245T3 (es) 2003-01-29 2004-01-28 Método de amplificación y secuenciamiento de ácidos nucleicos
ES04706051.2T Expired - Lifetime ES2338654T5 (es) 2003-01-29 2004-01-28 Amplificación de ácidos nucleicos en emulsión de perlas
ES09175588T Expired - Lifetime ES2380893T3 (es) 2003-01-29 2004-01-28 Amplificación de ácidos nucleicos en emulsión en perlas
ES04706053T Expired - Lifetime ES2342665T3 (es) 2003-01-29 2004-01-28 Secuenciacion desde dos extremos.
ES04785758T Expired - Lifetime ES2330339T3 (es) 2003-01-29 2004-01-28 Procedimientos para amplificar y secuenciar acidos nucleicos.

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09166658T Expired - Lifetime ES2396245T3 (es) 2003-01-29 2004-01-28 Método de amplificación y secuenciamiento de ácidos nucleicos

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09175588T Expired - Lifetime ES2380893T3 (es) 2003-01-29 2004-01-28 Amplificación de ácidos nucleicos en emulsión en perlas
ES04706053T Expired - Lifetime ES2342665T3 (es) 2003-01-29 2004-01-28 Secuenciacion desde dos extremos.
ES04785758T Expired - Lifetime ES2330339T3 (es) 2003-01-29 2004-01-28 Procedimientos para amplificar y secuenciar acidos nucleicos.

Country Status (10)

Country Link
US (15) US7323305B2 (es)
EP (8) EP2145955B1 (es)
JP (9) JP4768598B2 (es)
CN (2) CN102212614B (es)
AT (4) ATE461291T1 (es)
AU (4) AU2004209001B2 (es)
CA (6) CA2513899C (es)
DE (4) DE602004036672C5 (es)
ES (5) ES2396245T3 (es)
WO (4) WO2004069849A2 (es)

Families Citing this family (1143)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7622294B2 (en) 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US20030027126A1 (en) 1997-03-14 2003-02-06 Walt David R. Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
DE69826697T2 (de) 1997-07-07 2006-02-16 Medical Research Council In vitro selektionsmethode
GB9900298D0 (en) * 1999-01-07 1999-02-24 Medical Res Council Optical sorting method
CA2290731A1 (en) * 1999-11-26 2001-05-26 D. Jed Harrison Apparatus and method for trapping bead based reagents within microfluidic analysis system
US6432290B1 (en) 1999-11-26 2002-08-13 The Governors Of The University Of Alberta Apparatus and method for trapping bead based reagents within microfluidic analysis systems
ATE455186T1 (de) * 2000-06-26 2010-01-15 Nugen Technologies Inc Methoden und zusammensetzungen zur auf transkription basierenden vervielfältigung von nukleinsäuren
US7846733B2 (en) 2000-06-26 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
DE60142709D1 (de) 2000-12-13 2010-09-09 Nugen Technologies Inc Methoden und zusammensetzungen zur generierung einer vielzahl von kopien von nukleinsäuresequenzen und methoden zur detektion derselben
WO2002072772A2 (en) 2001-03-09 2002-09-19 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for amplification of rna sequences
WO2002102820A1 (en) 2001-06-20 2002-12-27 Nuevolution A/S Nucleoside derivatives for library preparation
WO2003004690A2 (en) * 2001-07-06 2003-01-16 454$m(3) CORPORATION Method for isolation of independent, parallel chemical micro-reactions using a porous filter
DE10147074A1 (de) * 2001-09-25 2003-05-08 Beru Ag Verfahren zum Betreiben einer aus mehreren Heizelementen bestehenden mehrstufigen elektrischen Heizung
US20030108664A1 (en) * 2001-10-05 2003-06-12 Kodas Toivo T. Methods and compositions for the formation of recessed electrical features on a substrate
WO2003035824A1 (en) * 2001-10-25 2003-05-01 Bar-Ilan University Interactive transparent individual cells biochip processor
GB0127564D0 (en) * 2001-11-16 2002-01-09 Medical Res Council Emulsion compositions
ATE414769T1 (de) 2002-03-15 2008-12-15 Nuevolution As Eine verbesserte methode zur synthese von matritzenabhängigen molekülen
US20030217923A1 (en) * 2002-05-24 2003-11-27 Harrison D. Jed Apparatus and method for trapping bead based reagents within microfluidic analysis systems
WO2004013070A2 (en) * 2002-08-01 2004-02-12 Nuevolution A/S Multi-step synthesis of templated molecules
US7595883B1 (en) 2002-09-16 2009-09-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biological analysis arrangement and approach therefor
US8791053B2 (en) * 2002-09-27 2014-07-29 Mpm-Holding Aps Spatially encoded polymer matrix
LT2348125T (lt) 2002-10-30 2017-09-11 Nuevolution A/S Bifunkcinio komplekso sintezės būdas
ATE450609T1 (de) 2002-12-19 2009-12-15 Nuevolution As Durch quasizufallsstrukturen und funktionen geführte synthesemethode
KR101216828B1 (ko) * 2002-12-30 2013-01-04 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 병원균 검출과 분석을 위한 방법과 기구
US7575865B2 (en) * 2003-01-29 2009-08-18 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
WO2004069849A2 (en) 2003-01-29 2004-08-19 454 Corporation Bead emulsion nucleic acid amplification
WO2004074429A2 (en) 2003-02-21 2004-09-02 Nuevolution A/S Method for producing second-generation library
CA2555962C (en) 2003-02-26 2015-10-06 Callida Genomics, Inc. Random array dna analysis by hybridization
IL154677A0 (en) * 2003-02-27 2003-09-17 Univ Bar Ilan A method and apparatus for manipulating an individual cell
US7041481B2 (en) * 2003-03-14 2006-05-09 The Regents Of The University Of California Chemical amplification based on fluid partitioning
GB0307403D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Selection by compartmentalised screening
GB0307428D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Compartmentalised combinatorial chemistry
US20060078893A1 (en) * 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
JP2006523465A (ja) 2003-04-14 2006-10-19 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド ランダムにプライミングされる複合プライマーを用いる大規模増幅
FR2856498B1 (fr) * 2003-06-19 2005-09-30 Goulven Jean Alain Vernois Distribution sous atmosphere controlee
US8597597B2 (en) * 2003-06-26 2013-12-03 Seng Enterprises Ltd. Picoliter well holding device and method of making the same
US9200245B2 (en) 2003-06-26 2015-12-01 Seng Enterprises Ltd. Multiwell plate
US7888110B2 (en) * 2003-06-26 2011-02-15 Seng Enterprises Ltd. Pico liter well holding device and method of making the same
JP5183063B2 (ja) 2003-07-05 2013-04-17 ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティ 遺伝的変異の検出および列挙のための方法ならびに組成物
US11118215B2 (en) * 2003-09-18 2021-09-14 Nuevolution A/S Method for obtaining structural information concerning an encoded molecule and method for selecting compounds
WO2005028110A2 (en) * 2003-09-19 2005-03-31 Applera Corporation Microplates useful for conducting thermocycled nucleotide amplification
WO2005054431A2 (en) * 2003-12-01 2005-06-16 454 Corporation Method for isolation of independent, parallel chemical micro-reactions using a porous filter
US7972994B2 (en) 2003-12-17 2011-07-05 Glaxosmithkline Llc Methods for synthesis of encoded libraries
JP2007525571A (ja) * 2004-01-07 2007-09-06 ソレクサ リミテッド 修飾分子アレイ
CA2553833C (en) * 2004-01-28 2012-10-02 454 Corporation Nucleic acid amplification with continuous flow emulsion
EP1723255B1 (en) * 2004-02-17 2010-12-29 Nuevolution A/S Method for enrichment involving elimination by mismatch hybridisation
US8440404B2 (en) * 2004-03-08 2013-05-14 Rubicon Genomics Methods and compositions for generating and amplifying DNA libraries for sensitive detection and analysis of DNA methylation
US20050221339A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
US7622281B2 (en) 2004-05-20 2009-11-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for clonal amplification of nucleic acid
WO2005118773A2 (en) 2004-05-28 2005-12-15 Wafergen, Inc. Apparatus and methods for multiplex analyses
US7799553B2 (en) 2004-06-01 2010-09-21 The Regents Of The University Of California Microfabricated integrated DNA analysis system
US7264934B2 (en) * 2004-06-10 2007-09-04 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Rapid parallel nucleic acid analysis
US8536661B1 (en) 2004-06-25 2013-09-17 University Of Hawaii Biosensor chip sensor protection methods
WO2006003664A1 (en) * 2004-07-07 2006-01-12 Seng Enterprises Ltd. Method and device for identifying an image of a well in an image of a well-bearing component
EP1781404A2 (en) * 2004-08-25 2007-05-09 Seng Enterprises Limited Method and device for isolating cells
CN101073002B (zh) 2004-09-15 2012-08-08 英特基因有限公司 微流体装置
US7968287B2 (en) * 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
US20060110764A1 (en) * 2004-10-25 2006-05-25 Tom Tang Large-scale parallelized DNA sequencing
US7785785B2 (en) 2004-11-12 2010-08-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Charge perturbation detection system for DNA and other molecules
US7485451B2 (en) * 2004-11-18 2009-02-03 Regents Of The University Of California Storage stable compositions of biological materials
BRPI0515777A (pt) * 2004-12-11 2008-08-05 Cytogenix Inc biossìntese isenta de células de ácido nucléico de alta qualidade e usos dos mesmos
US8038964B2 (en) * 2005-01-25 2011-10-18 Seng Enterprises Ltd. Device for studying individual cells
EP2272983A1 (en) * 2005-02-01 2011-01-12 AB Advanced Genetic Analysis Corporation Reagents, methods and libraries for bead-based sequencing
JP2006211984A (ja) * 2005-02-04 2006-08-17 Univ Nagoya エマルジョンを利用した核酸増幅方法、及び核酸増幅反応用キット
US8374887B1 (en) 2005-02-11 2013-02-12 Emily H. Alexander System and method for remotely supervising and verifying pharmacy functions
JP2008529538A (ja) * 2005-02-16 2008-08-07 ジェネティック テクノロジーズ リミテッド 相補性デュプリコンの増幅を含む遺伝子分析方法
EP1861721B1 (en) * 2005-03-10 2017-05-03 Gen-Probe Incorporated Systems and methods to perform assays for detecting or quantifying analytes within samples
WO2006099579A2 (en) * 2005-03-16 2006-09-21 Applera Corporation Compositions and methods for clonal amplification and analysis of polynucleotides
US7604940B1 (en) 2005-03-16 2009-10-20 Applied Biosystems, Llc Compositions and methods for analyzing isolated polynucleotides
EP1877576B1 (en) * 2005-04-12 2013-01-23 454 Life Sciences Corporation Methods for determining sequence variants using ultra-deep sequencing
US20060228721A1 (en) 2005-04-12 2006-10-12 Leamon John H Methods for determining sequence variants using ultra-deep sequencing
CA2607532C (en) * 2005-04-29 2013-03-12 The J. Craig Venter Institute Amplification and cloning of single dna molecules using rolling circle amplification
NZ564095A (en) * 2005-05-10 2009-06-26 Oregon State Methods of mapping polymorphisms and polymorphism microarrays
US20090233291A1 (en) * 2005-06-06 2009-09-17 454 Life Sciences Corporation Paired end sequencing
WO2007145612A1 (en) 2005-06-06 2007-12-21 454 Life Sciences Corporation Paired end sequencing
DK1910538T3 (da) 2005-06-09 2011-08-08 Praecis Pharm Inc Fremgangsmåder til syntese af kodede biblioteker
WO2006138284A2 (en) 2005-06-15 2006-12-28 Callida Genomics, Inc. Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments
CN101641449B (zh) 2005-06-23 2014-01-29 科因股份有限公司 用于多态性的高通量鉴定和检测的策略
ES2344802T3 (es) * 2005-06-23 2010-09-07 Keygene N.V. Estrategias mejoradas para la secuenciacion de genomas complejos utilizando tecnologias de secuenciacion de alto rendimiento.
US20070031865A1 (en) * 2005-07-07 2007-02-08 David Willoughby Novel Process for Construction of a DNA Library
GB0514935D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Methods for sequencing a polynucleotide template
GB0514910D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Method for sequencing a polynucleotide template
US10083273B2 (en) * 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US11111543B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US11111544B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US10081839B2 (en) * 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
JP2009505642A (ja) * 2005-08-19 2009-02-12 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション アラクノカンパのルシフェラーゼ
WO2007024778A2 (en) * 2005-08-22 2007-03-01 Applera Corporation Device, system and method for depositing processed immiscible-fluid-discrete-volumes
CA2621267A1 (en) * 2005-09-07 2007-03-15 Nugen Technologies, Inc. Improved nucleic acid amplification procedure
JP2009508495A (ja) * 2005-09-16 2009-03-05 ４５４ ライフ サイエンシーズ コーポレイション ｃＤＮＡライブラリー調製
US10316364B2 (en) 2005-09-29 2019-06-11 Keygene N.V. Method for identifying the source of an amplicon
JP5237099B2 (ja) 2005-09-29 2013-07-17 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 変異させた集団のハイスループットスクリーニング
WO2007133831A2 (en) 2006-02-24 2007-11-22 Callida Genomics, Inc. High throughput genome sequencing on dna arrays
EP2546360A1 (en) 2005-10-07 2013-01-16 Callida Genomics, Inc. Self-assembled single molecule arrays and uses thereof
US20070141555A1 (en) * 2005-10-11 2007-06-21 Mordechai Deutsch Current damper for the study of cells
PT1948816E (pt) * 2005-10-24 2012-03-19 Univ Johns Hopkins Processos melhorados de focalização
KR100828714B1 (ko) 2005-10-25 2008-05-09 주식회사 엘지화학 리보핵산을 이용한 멀티플렉스 증폭방법
JP2009513135A (ja) * 2005-10-28 2009-04-02 プリーシス・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド エンコードされたライブラリーを用いて興味のある化合物を同定する方法
GB0522310D0 (en) 2005-11-01 2005-12-07 Solexa Ltd Methods of preparing libraries of template polynucleotides
US8288120B2 (en) * 2005-11-03 2012-10-16 Seng Enterprises Ltd. Method for studying floating, living cells
WO2007056490A2 (en) * 2005-11-08 2007-05-18 Incom, Inc. Fiber optic interrogated microslide, microslide kits and uses thereof
WO2007055568A1 (en) * 2005-11-14 2007-05-18 Keygene N.V. Method for high throughput screening of transposon tagging populations and massive parallel sequence identification of insertion sites
GB0524069D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Solexa Ltd Preparation of templates for solid phase amplification
DK2341140T3 (da) 2005-12-01 2017-11-06 Nuevolution As Fremgangsmåde til enzymatisk kodning ved effektiv syntese af store biblioteker
US20070128610A1 (en) * 2005-12-02 2007-06-07 Buzby Philip R Sample preparation method and apparatus for nucleic acid sequencing
EP3404114B1 (en) 2005-12-22 2021-05-05 Keygene N.V. Method for high-throughput aflp-based polymorphism detection
DK1966394T3 (da) * 2005-12-22 2012-10-29 Keygene Nv Forbedrede strategier til transkriptprofilering under anvendelse af high throughput-sekventeringsteknologier
WO2007081387A1 (en) * 2006-01-11 2007-07-19 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices, methods of use, and kits for performing diagnostics
CA2637974A1 (en) * 2006-01-19 2007-07-26 The Research Foundation Of State University Of New York Methods and devices for detection and identification of encoded beads and biological molecules
WO2007083388A1 (ja) * 2006-01-20 2007-07-26 Toppan Printing Co., Ltd. 反応容器及びｄｎａの増幅反応方法
US20070172839A1 (en) * 2006-01-24 2007-07-26 Smith Douglas R Asymmetrical adapters and methods of use thereof
US7749365B2 (en) 2006-02-01 2010-07-06 IntegenX, Inc. Optimized sample injection structures in microfluidic separations
WO2008030631A2 (en) 2006-02-03 2008-03-13 Microchip Biotechnologies, Inc. Microfluidic devices
DE102006005287B4 (de) * 2006-02-06 2012-12-27 Siemens Ag Verfahren zum Nachweis von Zielnukleinsäuren
CA2641851A1 (en) 2006-02-08 2007-08-16 Eric Hans Vermaas Method for sequencing a polynucleotide template
US9012184B2 (en) * 2006-02-08 2015-04-21 Illumina Cambridge Limited End modification to prevent over-representation of fragments
US8301394B2 (en) 2006-02-16 2012-10-30 454 Life Sciences Corporation System and method for correcting primer extension errors in nucleic acid sequence data
US8364417B2 (en) * 2007-02-15 2013-01-29 454 Life Sciences Corporation System and method to correct out of phase errors in DNA sequencing data by use of a recursive algorithm
US11237171B2 (en) 2006-02-21 2022-02-01 Trustees Of Tufts College Methods and arrays for target analyte detection and determination of target analyte concentration in solution
US8492098B2 (en) * 2006-02-21 2013-07-23 The Trustees Of Tufts College Methods and arrays for target analyte detection and determination of reaction components that affect a reaction
SG10201405158QA (en) * 2006-02-24 2014-10-30 Callida Genomics Inc High throughput genome sequencing on dna arrays
US7766033B2 (en) * 2006-03-22 2010-08-03 The Regents Of The University Of California Multiplexed latching valves for microfluidic devices and processors
US20070231823A1 (en) * 2006-03-23 2007-10-04 Mckernan Kevin J Directed enrichment of genomic DNA for high-throughput sequencing
SG170802A1 (en) 2006-03-31 2011-05-30 Solexa Inc Systems and devices for sequence by synthesis analysis
EP3239304B1 (en) * 2006-04-04 2020-08-19 Keygene N.V. High throughput detection of molecular markers based on aflp and high troughput sequencing
US8809068B2 (en) 2006-04-18 2014-08-19 Advanced Liquid Logic, Inc. Manipulation of beads in droplets and methods for manipulating droplets
US7439014B2 (en) 2006-04-18 2008-10-21 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based surface modification and washing
CN101495654A (zh) * 2006-04-19 2009-07-29 阿普里拉股份有限公司 无凝胶珠基测序的试剂、方法和文库
US10522240B2 (en) 2006-05-03 2019-12-31 Population Bio, Inc. Evaluating genetic disorders
US7702468B2 (en) * 2006-05-03 2010-04-20 Population Diagnostics, Inc. Evaluating genetic disorders
EP2047910B1 (en) 2006-05-11 2012-01-11 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic device and method
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
WO2007136736A2 (en) * 2006-05-19 2007-11-29 Codon Devices, Inc. Methods for nucleic acid sorting and synthesis
CA2653321A1 (en) * 2006-05-26 2007-12-06 Althea Technologies, Inc. Biochemical analysis of partitioned cells
US11001881B2 (en) 2006-08-24 2021-05-11 California Institute Of Technology Methods for detecting analytes
US8614278B2 (en) 2006-06-06 2013-12-24 Dow Corning Corporation Silicone acrylate hybrid composition and method of making same
US8569416B2 (en) 2006-06-06 2013-10-29 Dow Corning Corporation Single phase silicone acrylate formulation
JP2009540052A (ja) * 2006-06-06 2009-11-19 ダウ・コーニング・コーポレイション シリコーンアクリレートハイブリッド組成物およびその製造方法
US20080124707A1 (en) * 2006-06-09 2008-05-29 Agency For Science, Technology And Research Nucleic acid concatenation
EP2548972A1 (en) 2006-06-14 2013-01-23 Verinata Health, Inc Methods for the diagnosis of fetal abnormalities
US20080009007A1 (en) * 2006-06-16 2008-01-10 Pacific Biosciences Of California, Inc. Controlled initiation of primer extension
EP2038425B1 (en) 2006-07-12 2010-09-15 Keygene N.V. High throughput physical mapping using aflp
WO2008014485A2 (en) 2006-07-28 2008-01-31 California Institute Of Technology Multiplex q-pcr arrays
US11525156B2 (en) 2006-07-28 2022-12-13 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
WO2008015396A2 (en) 2006-07-31 2008-02-07 Solexa Limited Method of library preparation avoiding the formation of adaptor dimers
EP3536396B1 (en) 2006-08-07 2022-03-30 The President and Fellows of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
US11560588B2 (en) 2006-08-24 2023-01-24 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
WO2008027558A2 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Codon Devices, Inc. Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits
WO2008042067A2 (en) 2006-09-28 2008-04-10 Illumina, Inc. Compositions and methods for nucleotide sequencing
WO2008039998A2 (en) * 2006-09-28 2008-04-03 President And Fellows Of Harvard College Methods for sequencing dna
US7754429B2 (en) 2006-10-06 2010-07-13 Illumina Cambridge Limited Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides
WO2008045575A2 (en) * 2006-10-13 2008-04-17 J. Craig Venter Institute, Inc. Sequencing method
US8841116B2 (en) * 2006-10-25 2014-09-23 The Regents Of The University Of California Inline-injection microdevice and microfabricated integrated DNA analysis system using same
US7910354B2 (en) * 2006-10-27 2011-03-22 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
US8338109B2 (en) 2006-11-02 2012-12-25 Mayo Foundation For Medical Education And Research Predicting cancer outcome
WO2008055915A2 (en) * 2006-11-06 2008-05-15 Clondiag Gmbh Device and process for assays using binding members
US20090111705A1 (en) 2006-11-09 2009-04-30 Complete Genomics, Inc. Selection of dna adaptor orientation by hybrid capture
DK2518162T3 (en) * 2006-11-15 2018-06-18 Biospherex Llc Multi-tag sequencing and ecogenomic analysis
US20080242560A1 (en) * 2006-11-21 2008-10-02 Gunderson Kevin L Methods for generating amplified nucleic acid arrays
US7902345B2 (en) 2006-12-05 2011-03-08 Sequenom, Inc. Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
WO2008076842A2 (en) * 2006-12-14 2008-06-26 Applied Biosystems Inc. Sequencing methods
ES2923759T3 (es) 2006-12-14 2022-09-30 Life Technologies Corp Aparato para medir analitos utilizando matrices de FET
US11339430B2 (en) 2007-07-10 2022-05-24 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
US7932034B2 (en) * 2006-12-20 2011-04-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Heat and pH measurement for sequencing of DNA
WO2008093098A2 (en) 2007-02-02 2008-08-07 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
EP2109666A4 (en) * 2007-02-05 2011-09-14 Integenx Inc MICROFLUIDIC AND NANOFLUIDIC DEVICES, SYSTEMS, AND APPLICATIONS
WO2008097559A2 (en) 2007-02-06 2008-08-14 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
US9152150B1 (en) 2007-02-22 2015-10-06 Applied Biosystems, Llc Compositions, systems, and methods for immiscible fluid discrete volume manipulation
US9029085B2 (en) 2007-03-07 2015-05-12 President And Fellows Of Harvard College Assays and other reactions involving droplets
JP2010521156A (ja) 2007-03-16 2010-06-24 ４５４ ライフ サイエンシーズ コーポレイション Ｈｉｖ薬物耐性バリアントの検出のためのシステムおよび方法
US20100151465A1 (en) 2008-03-27 2010-06-17 Jingyue Ju Selective Capture and Release of Analytes
US20080243865A1 (en) * 2007-03-28 2008-10-02 Oracle International Corporation Maintaining global state of distributed transaction managed by an external transaction manager for clustered database systems
US20080239867A1 (en) * 2007-03-28 2008-10-02 Gilbert Donna J Adjustable stir
JP2008245612A (ja) * 2007-03-30 2008-10-16 Hitachi Ltd 試料調製法および装置
US8592221B2 (en) 2007-04-19 2013-11-26 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
US7883265B2 (en) * 2007-06-01 2011-02-08 Applied Biosystems, Llc Devices, systems, and methods for preparing emulsions
EP2164985A4 (en) * 2007-06-01 2014-05-14 454 Life Sciences Corp SYSTEM AND METHOD FOR IDENTIFYING INDIVIDUAL SAMPLES FROM A MULTIPLEX MIXTURE
EP2173898A2 (en) * 2007-06-28 2010-04-14 454 Life Sciences Corporation System and method for adaptive reagent control in nucleic acid sequencing
US7635566B2 (en) * 2007-06-29 2009-12-22 Population Genetics Technologies Ltd. Methods and compositions for isolating nucleic acid sequence variants
WO2009015296A1 (en) * 2007-07-24 2009-01-29 The Regents Of The University Of California Microfabricated dropley generator
WO2009012984A1 (en) 2007-07-26 2009-01-29 Roche Diagnostics Gmbh Target preparation for parallel sequencing of complex genomes
JP5020734B2 (ja) * 2007-07-31 2012-09-05 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸解析方法及び装置
US9404150B2 (en) 2007-08-29 2016-08-02 Sequenom, Inc. Methods and compositions for universal size-specific PCR
EP2201021A4 (en) 2007-08-29 2012-01-25 Applied Biosystems Llc METHOD OF ALTERNATING NUCLEIC ACID SEQUENCING
EP2191011B1 (en) * 2007-08-29 2017-03-29 Illumina Cambridge Limited Method for sequencing a polynucleotide template
CA2734029C (en) 2007-08-30 2016-03-29 The Trustees Of Tufts College Methods for determining the concentration of an analyte in solution
EP2188027A4 (en) * 2007-09-11 2011-06-08 Arryx Inc LINK METHOD AND APPARATUS FOR SORTING OBJECTS
JP2010538644A (ja) * 2007-09-13 2010-12-16 アリックス インク 法医学的ｄｎａ分析および医学的診断において対象物を選別するための方法および装置
EP2188660B1 (en) * 2007-09-13 2018-11-14 GE Healthcare Bio-Sciences Corp. Method of dispersing immersion liquid on a specimen substrate for high resolution imaging and lithography
US8716190B2 (en) 2007-09-14 2014-05-06 Affymetrix, Inc. Amplification and analysis of selected targets on solid supports
US9388457B2 (en) 2007-09-14 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Locus specific amplification using array probes
US20100304378A1 (en) * 2007-09-17 2010-12-02 Universite De Strasbourg Method for Detecting or Quantifying a Truncating Mutation
US20090118129A1 (en) * 2007-09-28 2009-05-07 Pacific Biosciences Of California, Inc. Virtual reads for readlength enhancement
JP2010539982A (ja) * 2007-10-01 2010-12-24 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー チェイスライゲーション配列決定法
US20100086914A1 (en) * 2008-10-03 2010-04-08 Roche Molecular Systems, Inc. High resolution, high throughput hla genotyping by clonal sequencing
EP2053132A1 (en) 2007-10-23 2009-04-29 Roche Diagnostics GmbH Enrichment and sequence analysis of geomic regions
WO2009055597A2 (en) * 2007-10-25 2009-04-30 Monsanto Technology Llc Methods for identifying genetic linkage
US9145540B1 (en) 2007-11-15 2015-09-29 Seng Enterprises Ltd. Device for the study of living cells
US8592150B2 (en) 2007-12-05 2013-11-26 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for long fragment read sequencing
US9797010B2 (en) 2007-12-21 2017-10-24 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for nucleic acid sequencing
EP2237887A2 (en) * 2007-12-26 2010-10-13 Seng Enterprises Ltd. Device for the study of living cells
US8189186B2 (en) * 2007-12-27 2012-05-29 Lawrence Livermore National Security, Llc. Signal enhancement using a switchable magnetic trap
US20090181390A1 (en) * 2008-01-11 2009-07-16 Signosis, Inc. A California Corporation High throughput detection of micrornas and use for disease diagnosis
WO2009091934A1 (en) * 2008-01-17 2009-07-23 Sequenom, Inc. Single molecule nucleic acid sequence analysis processes and compositions
KR20110030415A (ko) 2008-01-22 2011-03-23 인터젠엑스 인크. 만능 샘플 제조 시스템 및 집적 분석 시스템에서의 용도
US7767400B2 (en) * 2008-02-03 2010-08-03 Helicos Biosciences Corporation Paired-end reads in sequencing by synthesis
US20090203086A1 (en) * 2008-02-06 2009-08-13 454 Life Sciences Corporation System and method for improved signal detection in nucleic acid sequencing
EP2250283A2 (en) * 2008-02-12 2010-11-17 Nugen Technologies, Inc. Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions
US20090203531A1 (en) * 2008-02-12 2009-08-13 Nurith Kurn Method for Archiving and Clonal Expansion
CA2717320A1 (en) * 2008-03-11 2009-09-17 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
AU2009226248B8 (en) 2008-03-17 2014-10-02 Stichting Genetwister Ip Expression-linked gene discovery
US10745740B2 (en) 2008-03-19 2020-08-18 Qiagen Sciences, Llc Sample preparation
GB2470672B (en) * 2008-03-21 2012-09-12 Nugen Technologies Inc Methods of RNA amplification in the presence of DNA
EP3170904B1 (en) * 2008-03-28 2017-08-16 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for nucleic acid sequencing
BRPI0911326B1 (pt) * 2008-04-04 2019-11-26 Allopartis Biotechnologies Inc método de seleção para atividade enzimática melhorada em um substrato insolúvel
JP5227062B2 (ja) 2008-04-08 2013-07-03 株式会社日立製作所 Ｄｎａ分析装置
TWI460602B (zh) * 2008-05-16 2014-11-11 Counsyl Inc 廣用的懷孕前篩檢裝置
AU2009253675A1 (en) 2008-05-28 2009-12-03 Genomedx Biosciences, Inc. Systems and methods for expression-based discrimination of distinct clinical disease states in prostate cancer
US10407731B2 (en) 2008-05-30 2019-09-10 Mayo Foundation For Medical Education And Research Biomarker panels for predicting prostate cancer outcomes
US8470164B2 (en) 2008-06-25 2013-06-25 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US7888034B2 (en) 2008-07-01 2011-02-15 454 Life Sciences Corporation System and method for detection of HIV tropism variants
WO2010003132A1 (en) 2008-07-02 2010-01-07 Illumina Cambridge Ltd. Using populations of beads for the fabrication of arrays on surfaces
WO2010009426A2 (en) * 2008-07-17 2010-01-21 Life Technologies Corporation Devices and methods for reagent delivery
ES2532153T3 (es) 2008-07-18 2015-03-24 Trovagene, Inc. Métodos para la detección de secuencias de ácidos nucleicos "ultracortos" basados en PCR
EP2315629B1 (en) 2008-07-18 2021-12-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet libraries
US20100035252A1 (en) * 2008-08-08 2010-02-11 Ion Torrent Systems Incorporated Methods for sequencing individual nucleic acids under tension
WO2010025310A2 (en) 2008-08-27 2010-03-04 Westend Asset Clearinghouse Company, Llc Methods and devices for high fidelity polynucleotide synthesis
EP3216874A1 (en) 2008-09-05 2017-09-13 TOMA Biosciences, Inc. Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options
US8795961B2 (en) 2008-09-05 2014-08-05 Pacific Biosciences Of California, Inc. Preparations, compositions, and methods for nucleic acid sequencing
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US8962247B2 (en) 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
US20110218123A1 (en) 2008-09-19 2011-09-08 President And Fellows Of Harvard College Creation of libraries of droplets and related species
WO2010039189A2 (en) * 2008-09-23 2010-04-08 Helicos Biosciences Corporation Methods for sequencing degraded or modified nucleic acids
US20100075862A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Quanterix Corporation High sensitivity determination of the concentration of analyte molecules or particles in a fluid sample
US8663920B2 (en) 2011-07-29 2014-03-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Library characterization by digital assay
US9417190B2 (en) 2008-09-23 2016-08-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Calibrations and controls for droplet-based assays
US9132394B2 (en) 2008-09-23 2015-09-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for detection of spaced droplets
US20100075439A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules by capture-and-release using reducing agents followed by quantification
US8951939B2 (en) 2011-07-12 2015-02-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital assays with multiplexed detection of two or more targets in the same optical channel
US9492797B2 (en) 2008-09-23 2016-11-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for detection of spaced droplets
US9598725B2 (en) 2010-03-02 2017-03-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Emulsion chemistry for encapsulated droplets
US9156010B2 (en) 2008-09-23 2015-10-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based assay system
US11130128B2 (en) 2008-09-23 2021-09-28 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection method for a target nucleic acid
US8222047B2 (en) * 2008-09-23 2012-07-17 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules on single molecule arrays
US9764322B2 (en) 2008-09-23 2017-09-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for generating droplets with pressure monitoring
US8633015B2 (en) 2008-09-23 2014-01-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Flow-based thermocycling system with thermoelectric cooler
US9399215B2 (en) 2012-04-13 2016-07-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Sample holder with a well having a wicking promoter
WO2011120020A1 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Quantalife, Inc. Droplet transport system for detection
US8709762B2 (en) 2010-03-02 2014-04-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for hot-start amplification via a multiple emulsion
US10512910B2 (en) 2008-09-23 2019-12-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based analysis method
US20100261189A1 (en) 2008-10-03 2010-10-14 Roche Molecular Systems, Inc. System and method for detection of HLA Variants
US20100087325A1 (en) * 2008-10-07 2010-04-08 Illumina, Inc. Biological sample temperature control system and method
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US20100301398A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US8541207B2 (en) 2008-10-22 2013-09-24 Illumina, Inc. Preservation of information related to genomic DNA methylation
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
ES2515065T3 (es) 2008-10-24 2014-10-29 Epicentre Technologies Corporation Composiciones de extremo del transposón y métodos para modificar ácidos nucleicos
US8877436B2 (en) * 2008-10-27 2014-11-04 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay on an automated platform
US8486865B2 (en) 2008-11-03 2013-07-16 The Regents Of The University Of California Methods for detecting modification resistant nucleic acids
JP2010110262A (ja) * 2008-11-06 2010-05-20 Hitachi Maxell Ltd ウェルプレートを用いた核酸増幅法
US9506119B2 (en) 2008-11-07 2016-11-29 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of sequence determination using sequence tags
US9394567B2 (en) 2008-11-07 2016-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Detection and quantification of sample contamination in immune repertoire analysis
US8748103B2 (en) 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US8628927B2 (en) 2008-11-07 2014-01-14 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US9528160B2 (en) 2008-11-07 2016-12-27 Adaptive Biotechnolgies Corp. Rare clonotypes and uses thereof
US9365901B2 (en) 2008-11-07 2016-06-14 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia
SG195652A1 (en) 2008-11-07 2013-12-30 Sequenta Inc Methods of monitoring conditions by sequence analysis
US10236078B2 (en) 2008-11-17 2019-03-19 Veracyte, Inc. Methods for processing or analyzing a sample of thyroid tissue
US9495515B1 (en) 2009-12-09 2016-11-15 Veracyte, Inc. Algorithms for disease diagnostics
GB2512153B (en) 2008-11-17 2014-11-12 Veracyte Inc Methods and compositions of molecular profiling for disease diagnostics
US8674175B2 (en) 2008-12-05 2014-03-18 Keygene N.V. Farnesene synthase
EP3150724A1 (en) 2008-12-19 2017-04-05 President and Fellows of Harvard College Particle-assisted nucleic acid sequencing
WO2010075188A2 (en) 2008-12-23 2010-07-01 Illumina Inc. Multibase delivery for long reads in sequencing by synthesis protocols
CN102341691A (zh) 2008-12-31 2012-02-01 尹特根埃克斯有限公司 具有微流体芯片的仪器
ES2403312T3 (es) 2009-01-13 2013-05-17 Keygene N.V. Nuevas estrategias para la secuenciación del genoma
US20100179074A1 (en) * 2009-01-15 2010-07-15 Honeywell International Inc. Methods and apparatus for fluid delivery and removal of micron scale structures
HUE029424T2 (en) 2009-01-15 2017-02-28 Adaptive Biotechnologies Corp Adaptive immunity profiling and a method for producing monoclonal antibodies
CN102333891A (zh) * 2009-01-20 2012-01-25 利兰·斯坦福青年大学托管委员会 用于药靶诊断、预后和鉴别的单细胞基因表达
US20100331204A1 (en) 2009-02-13 2010-12-30 Jeff Jeddeloh Methods and systems for enrichment of target genomic sequences
JP5457222B2 (ja) 2009-02-25 2014-04-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 小型化ハイスループット核酸分析
US9347092B2 (en) 2009-02-25 2016-05-24 Roche Molecular System, Inc. Solid support for high-throughput nucleic acid analysis
US9074258B2 (en) 2009-03-04 2015-07-07 Genomedx Biosciences Inc. Compositions and methods for classifying thyroid nodule disease
EP2406003A2 (en) 2009-03-13 2012-01-18 President and Fellows of Harvard College Scale-up of flow-focusing microfluidic devices
WO2010107946A2 (en) * 2009-03-18 2010-09-23 Sequenom, Inc. Use of thermostable endonucleases for generating reporter molecules
EP2411148B1 (en) 2009-03-23 2018-02-21 Raindance Technologies, Inc. Manipulation of microfluidic droplets
GB0904957D0 (en) 2009-03-23 2009-05-06 Univ Erasmus Medical Ct Tumour gene profile
GB0904934D0 (en) 2009-03-23 2009-05-06 Geneseqe As Method and apparatus for detecting molecules
WO2010115100A1 (en) 2009-04-03 2010-10-07 L&C Diagment, Inc. Multiplex nucleic acid detection methods and systems
WO2010117456A2 (en) * 2009-04-08 2010-10-14 Applied Biosystems, Llc Column enrichment of pcr beads comprising tethered amplicons
JP2012529918A (ja) 2009-04-19 2012-11-29 セルマティックス， インコーポレイテッド 不妊症および／または卵の質を評価するための方法および装置
US9090663B2 (en) * 2009-04-21 2015-07-28 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Systems and methods for the capture and separation of microparticles
AU2010242073C1 (en) 2009-04-30 2015-12-24 Good Start Genetics, Inc. Methods and compositions for evaluating genetic markers
EP2248914A1 (en) 2009-05-05 2010-11-10 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. The use of class IIB restriction endonucleases in 2nd generation sequencing applications
EP3360978A3 (en) 2009-05-07 2018-09-26 Veracyte, Inc. Methods for diagnosis of thyroid conditions
US8003329B2 (en) * 2009-05-12 2011-08-23 Becton Dickinson & Company Molecular counting by color-coded micelles
US8776573B2 (en) 2009-05-29 2014-07-15 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes
US8673627B2 (en) 2009-05-29 2014-03-18 Life Technologies Corporation Apparatus and methods for performing electrochemical reactions
US20120261274A1 (en) 2009-05-29 2012-10-18 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes
US8574835B2 (en) 2009-05-29 2013-11-05 Life Technologies Corporation Scaffolded nucleic acid polymer particles and methods of making and using
EP3663750B1 (en) 2009-05-29 2021-11-03 Life Technologies Corporation Scaffolded nucleic acid polymer particles and methods of making and using
EP2438154A1 (en) 2009-06-02 2012-04-11 Integenx Inc. Fluidic devices with diaphragm valves
CN102803147B (zh) 2009-06-05 2015-11-25 尹特根埃克斯有限公司 通用样品准备***以及在一体化分析***中的用途
US9524369B2 (en) 2009-06-15 2016-12-20 Complete Genomics, Inc. Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data
JP2012531202A (ja) 2009-06-25 2012-12-10 フレッド ハチンソン キャンサー リサーチ センター 適応免疫を測定する方法
WO2011002319A2 (en) * 2009-07-02 2011-01-06 Zygem Corporation Limited Combined nucleic acid blocking, extraction, and detection in a single reaction vessel
JP5099455B2 (ja) * 2009-07-16 2012-12-19 独立行政法人科学技術振興機構 エマルジョンを用いたｒｎａの選択的増幅法
US8825412B2 (en) 2010-05-18 2014-09-02 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
EP2456892B1 (en) * 2009-07-24 2014-10-01 Illumina, Inc. Method for sequencing a polynucleotide template
JP5795313B2 (ja) * 2009-07-29 2015-10-14 パイロベット ピーティーイー エルティーディーＰｙｒｏｂｅｔｔ Ｐｔｅ Ｌｔｄ アッセイを行うための方法及び装置
WO2011014811A1 (en) * 2009-07-31 2011-02-03 Ibis Biosciences, Inc. Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests
EP2470669B1 (en) 2009-08-25 2014-06-18 Illumina, Inc. Methods for selecting and amplifying polynucleotides
JP5869482B2 (ja) 2009-09-02 2016-02-24 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ジェッティングおよび他の技術を使用して生成された多重エマルジョン
EP2473618B1 (en) 2009-09-02 2015-03-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for mixing fluids by coalescence of multiple emulsions
US10072287B2 (en) 2009-09-10 2018-09-11 Centrillion Technology Holdings Corporation Methods of targeted sequencing
US10174368B2 (en) 2009-09-10 2019-01-08 Centrillion Technology Holdings Corporation Methods and systems for sequencing long nucleic acids
WO2011041485A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Gene Security Network, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US8609339B2 (en) * 2009-10-09 2013-12-17 454 Life Sciences Corporation System and method for emulsion breaking and recovery of biological elements
US10520500B2 (en) 2009-10-09 2019-12-31 Abdeslam El Harrak Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof
AU2010315580B2 (en) 2009-10-27 2014-11-06 President And Fellows Of Harvard College Droplet creation techniques
EP2494353B1 (en) 2009-10-30 2017-09-27 Illumina Inc. An apparatus comprising a plurality of encoded microvessels and a plurality of compartments and a method of reading a plurality of encoded micro vessels
EP2494069B1 (en) 2009-10-30 2013-10-02 Roche Diagniostics GmbH Method for detecting balanced chromosomal aberrations in a genome
WO2011056872A2 (en) * 2009-11-03 2011-05-12 Gen9, Inc. Methods and microfluidic devices for the manipulation of droplets in high fidelity polynucleotide assembly
CN102712954A (zh) 2009-11-06 2012-10-03 小利兰·斯坦福大学托管委员会 器官移植患者移植排斥的非侵入性诊断
ES2542426T3 (es) * 2009-11-16 2015-08-05 Genomictree, Inc. Método de genotipado
EP3085791A1 (en) 2009-11-25 2016-10-26 Gen9, Inc. Methods and apparatuses for chip-based dna error reduction
EP2504448B1 (en) * 2009-11-25 2016-10-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for detecting genetic material
WO2011066185A1 (en) 2009-11-25 2011-06-03 Gen9, Inc. Microfluidic devices and methods for gene synthesis
US8584703B2 (en) 2009-12-01 2013-11-19 Integenx Inc. Device with diaphragm valve
US10446272B2 (en) 2009-12-09 2019-10-15 Veracyte, Inc. Methods and compositions for classification of samples
WO2011071382A1 (en) 2009-12-10 2011-06-16 Keygene N.V. Polymorfphic whole genome profiling
CN102656279A (zh) 2009-12-17 2012-09-05 凯津公司 基于全基因组测序的限制性酶
CN102791880A (zh) 2009-12-18 2012-11-21 凯津公司 改进的大突变分析
US9926593B2 (en) 2009-12-22 2018-03-27 Sequenom, Inc. Processes and kits for identifying aneuploidy
EP2517025B1 (en) 2009-12-23 2019-11-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods for reducing the exchange of molecules between droplets
US9217144B2 (en) 2010-01-07 2015-12-22 Gen9, Inc. Assembly of high fidelity polynucleotides
ES2704701T3 (es) 2010-01-19 2019-03-19 Verinata Health Inc Nuevo protocolo de preparación de bibliotecas de secuenciación
US20120100548A1 (en) 2010-10-26 2012-04-26 Verinata Health, Inc. Method for determining copy number variations
PL2531880T3 (pl) 2010-02-01 2017-09-29 Illumina Inc. Sposoby ogniskowania oraz układy optyczne i zespoły optyczne realizujące te sposoby
US20110195457A1 (en) * 2010-02-09 2011-08-11 General Electric Company Isothermal amplification of nucleic acid using primers comprising a randomized sequence and specific primers and uses thereof
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
WO2011100604A2 (en) 2010-02-12 2011-08-18 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
WO2011103421A1 (en) 2010-02-18 2011-08-25 Shuber Anthony P Compositions and methods for treating cancer
EP2539450B1 (en) * 2010-02-25 2016-02-17 Advanced Liquid Logic, Inc. Method of making nucleic acid libraries
US20110262903A1 (en) 2010-02-26 2011-10-27 Life Technologies Corporation Modified Proteins and Methods of Making and Using Same
US8415171B2 (en) * 2010-03-01 2013-04-09 Quanterix Corporation Methods and systems for extending dynamic range in assays for the detection of molecules or particles
US8236574B2 (en) 2010-03-01 2012-08-07 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules or particles using beads or other capture objects
WO2011109379A1 (en) 2010-03-01 2011-09-09 Quanterix Corporation Methods and systems for extending dynamic range in assays for the detection of molecules or particles
US9678068B2 (en) * 2010-03-01 2017-06-13 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules using dual detection methods
US8716467B2 (en) * 2010-03-03 2014-05-06 Gen9, Inc. Methods and devices for nucleic acid synthesis
CN202281746U (zh) 2010-03-06 2012-06-20 伊鲁米那股份有限公司 检测来自样品光信号的测定设备及其光学组件和光学***
US20110311963A1 (en) * 2010-03-16 2011-12-22 Life Technologies Corporation Method and Apparatus for Addressable Flow Cells in Single Molecule Sequencing
EP2550351A4 (en) 2010-03-25 2014-07-09 Quantalife Inc DETECTION SYSTEM FOR DROPLET-BASED ANALYZES
EP2550528B1 (en) 2010-03-25 2019-09-11 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet generation for droplet-based assays
US8951940B2 (en) 2010-04-01 2015-02-10 Illumina, Inc. Solid-phase clonal amplification and related methods
PT2556171E (pt) 2010-04-05 2015-12-21 Prognosys Biosciences Inc Ensaios biológicos codificados espacialmente
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
SI2558577T1 (sl) 2010-04-16 2019-05-31 Nuevolution A/S Bifunkcionalni kompleksi in metode za pripravo in uporabo takšnih kompleksov
US20110269194A1 (en) * 2010-04-20 2011-11-03 Swift Biosciences, Inc. Materials and methods for nucleic acid fractionation by solid phase entrapment and enzyme-mediated detachment
WO2011135041A1 (en) 2010-04-30 2011-11-03 Roche Diagnostics Gmbh System and method for purification and use of inorganic pyrophosphatase from aquifex aeolicus
US9930297B2 (en) * 2010-04-30 2018-03-27 Becton, Dickinson And Company System and method for acquiring images of medication preparations
EP2388337B1 (en) 2010-04-30 2014-07-02 Nxp B.V. Sensing device and manufacturing method thereof
EP2566985A4 (en) * 2010-05-06 2014-08-06 Ibis Biosciences Inc INTEGRATED SAMPLE PREPARATION SYSTEMS AND MIXTURES OF STABILIZED ENZYMES
DK2567226T3 (en) 2010-05-06 2016-10-10 Adaptive Biotechnologies Corp Monitoring the health and disease status using klonotypeprofiler
WO2011140433A2 (en) 2010-05-07 2011-11-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Measurement and comparison of immune diversity by high-throughput sequencing
WO2011143194A2 (en) 2010-05-10 2011-11-17 Life Technologies Corporation System and method for processing a biological sample
WO2011143361A2 (en) 2010-05-11 2011-11-17 Veracyte, Inc. Methods and compositions for diagnosing conditions
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US20110287432A1 (en) 2010-05-21 2011-11-24 454 Life Science Corporation System and method for tailoring nucleotide concentration to enzymatic efficiencies in dna sequencing technologies
US8512538B2 (en) 2010-05-28 2013-08-20 Integenx Inc. Capillary electrophoresis device
US20120035062A1 (en) 2010-06-11 2012-02-09 Life Technologies Corporation Alternative nucleotide flows in sequencing-by-synthesis methods
US9353412B2 (en) 2010-06-18 2016-05-31 Illumina, Inc. Conformational probes and methods for sequencing nucleic acids
AU2011226767B1 (en) 2010-06-30 2011-11-10 Life Technologies Corporation Ion-sensing charge-accumulation circuits and methods
AU2011274090B2 (en) 2010-06-30 2015-04-09 Bgi Genomics Co., Ltd New PCR sequencing method and use thereof in HLA genotyping
US20120001646A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for testing isfet arrays
US8455927B2 (en) 2010-06-30 2013-06-04 Life Technologies Corporation One-transistor pixel array with cascoded column circuit
US11307166B2 (en) 2010-07-01 2022-04-19 Life Technologies Corporation Column ADC
US8653567B2 (en) 2010-07-03 2014-02-18 Life Technologies Corporation Chemically sensitive sensor with lightly doped drains
US9650629B2 (en) * 2010-07-07 2017-05-16 Roche Molecular Systems, Inc. Clonal pre-amplification in emulsion
WO2012008831A1 (en) 2010-07-13 2012-01-19 Keygene N.V. Simplified de novo physical map generation from clone libraries
CN105964312A (zh) 2010-07-22 2016-09-28 基因细胞生物***有限公司 复合液体池
CN103392182B (zh) 2010-08-02 2017-07-04 众有生物有限公司 用于发现遗传疾病中致病突变的***和方法
US20120034603A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Tandem Diagnostics, Inc. Ligation-based detection of genetic variants
US10533223B2 (en) 2010-08-06 2020-01-14 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
US11203786B2 (en) 2010-08-06 2021-12-21 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
US20130040375A1 (en) 2011-08-08 2013-02-14 Tandem Diagnotics, Inc. Assay systems for genetic analysis
US11031095B2 (en) 2010-08-06 2021-06-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Assay systems for determination of fetal copy number variation
US8700338B2 (en) 2011-01-25 2014-04-15 Ariosa Diagnosis, Inc. Risk calculation for evaluation of fetal aneuploidy
US20130261003A1 (en) 2010-08-06 2013-10-03 Ariosa Diagnostics, In. Ligation-based detection of genetic variants
US10167508B2 (en) 2010-08-06 2019-01-01 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
US20140342940A1 (en) 2011-01-25 2014-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of Target Nucleic Acids using Hybridization
US9121058B2 (en) 2010-08-20 2015-09-01 Integenx Inc. Linear valve arrays
WO2012024657A1 (en) 2010-08-20 2012-02-23 IntegenX, Inc. Microfluidic devices with mechanically-sealed diaphragm valves
JP5917519B2 (ja) 2010-09-10 2016-05-18 バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド クロマチン分析のためのｄｎａのサイズ選択
EP2617061B1 (en) 2010-09-15 2021-06-30 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes
EP3572528A1 (en) 2010-09-24 2019-11-27 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers
US8685324B2 (en) 2010-09-24 2014-04-01 Life Technologies Corporation Matched pair transistor circuits
US20120077716A1 (en) 2010-09-29 2012-03-29 454 Life Sciences Corporation System and method for producing functionally distinct nucleic acid library ends through use of deoxyinosine
US8759038B2 (en) 2010-09-29 2014-06-24 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for sequencing nucleic acids
US9562897B2 (en) 2010-09-30 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
GB201016484D0 (en) 2010-09-30 2010-11-17 Geneseque As Method
US9399217B2 (en) 2010-10-04 2016-07-26 Genapsys, Inc. Chamber free nanoreactor system
US9187783B2 (en) 2010-10-04 2015-11-17 Genapsys, Inc. Systems and methods for automated reusable parallel biological reactions
US9184099B2 (en) 2010-10-04 2015-11-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biosensor devices, systems and methods therefor
US20120322665A1 (en) 2010-10-08 2012-12-20 454 Life Sciences Corporation System and method for detection of hiv-1 clades and recombinants of the reverse transcriptase and protease regions
GB2512213B (en) 2010-10-08 2015-02-11 Harvard College High-throughput single cell barcoding
US9689012B2 (en) 2010-10-12 2017-06-27 Cornell University Method of dual-adapter recombination for efficient concatenation of multiple DNA fragments in shuffled or specified arrangements
US20150225792A1 (en) 2014-01-17 2015-08-13 Northwestern University Compositions and methods for identifying depressive disorders
US10233501B2 (en) 2010-10-19 2019-03-19 Northwestern University Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment
US10093981B2 (en) 2010-10-19 2018-10-09 Northwestern University Compositions and methods for identifying depressive disorders
US20150218639A1 (en) 2014-01-17 2015-08-06 Northwestern University Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment
EP2633069B1 (en) 2010-10-26 2015-07-01 Illumina, Inc. Sequencing methods
EP3141614B1 (en) 2010-10-27 2018-11-28 Life Technologies Corporation Predictive model for use in sequencing-by-synthesis
US9387476B2 (en) 2010-10-27 2016-07-12 Illumina, Inc. Flow cells for biological or chemical analysis
US10273540B2 (en) 2010-10-27 2019-04-30 Life Technologies Corporation Methods and apparatuses for estimating parameters in a predictive model for use in sequencing-by-synthesis
WO2012058096A1 (en) * 2010-10-27 2012-05-03 Illumina, Inc. Microdevices and biosensor cartridges for biological or chemical analysis and systems and methods for the same
EP4016086A1 (en) 2010-11-01 2022-06-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for forming emulsions
JP6118725B2 (ja) 2010-11-12 2017-04-19 ジェン９・インコーポレイテッドＧｅｎ９，ＩＮＣ． 核酸合成のための方法およびデバイス
WO2012064975A1 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Gen9, Inc. Protein arrays and methods of using and making the same
WO2012074855A2 (en) 2010-11-22 2012-06-07 The Regents Of The University Of California Methods of identifying a cellular nascent rna transcript
EP2646573A1 (en) 2010-12-01 2013-10-09 MorphoSys AG Simultaneous detection of biomolecules in single cells
EP3709303A1 (en) 2010-12-14 2020-09-16 Life Technologies Corporation Systems and methods for run-time sequencing run quality monitoring
ES2770342T3 (es) 2010-12-22 2020-07-01 Natera Inc Procedimientos para pruebas prenatales no invasivas de paternidad
US9163281B2 (en) 2010-12-23 2015-10-20 Good Start Genetics, Inc. Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction
US9594870B2 (en) 2010-12-29 2017-03-14 Life Technologies Corporation Time-warped background signal for sequencing-by-synthesis operations
US20130060482A1 (en) 2010-12-30 2013-03-07 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer readable media for making base calls in nucleic acid sequencing
US10241075B2 (en) 2010-12-30 2019-03-26 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer readable media for nucleic acid sequencing
KR20210131432A (ko) 2010-12-30 2021-11-02 파운데이션 메디신 인코포레이티드 종양 샘플의 다유전자 분석의 최적화
WO2012092455A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Life Technologies Corporation Models for analyzing data from sequencing-by-synthesis operations
US8951781B2 (en) 2011-01-10 2015-02-10 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis
US20130005591A1 (en) * 2011-01-13 2013-01-03 Halgen Corporation Method for parallel amplification of nucleic acids
CA2823815A1 (en) 2011-01-14 2012-07-19 Keygene N.V. Paired end random sequence based genotyping
WO2012100194A1 (en) 2011-01-20 2012-07-26 Ibis Biosciences, Inc. Microfluidic transducer
US10131947B2 (en) 2011-01-25 2018-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Noninvasive detection of fetal aneuploidy in egg donor pregnancies
US8756020B2 (en) 2011-01-25 2014-06-17 Ariosa Diagnostics, Inc. Enhanced risk probabilities using biomolecule estimations
US11270781B2 (en) 2011-01-25 2022-03-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Statistical analysis for non-invasive sex chromosome aneuploidy determination
US9994897B2 (en) 2013-03-08 2018-06-12 Ariosa Diagnostics, Inc. Non-invasive fetal sex determination
US9952237B2 (en) 2011-01-28 2018-04-24 Quanterix Corporation Systems, devices, and methods for ultra-sensitive detection of molecules or particles
US10144950B2 (en) 2011-01-31 2018-12-04 Roche Sequencing Solutions, Inc. Methods of identifying multiple epitopes in cells
US20130316358A1 (en) 2011-01-31 2013-11-28 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of diagnosing disease using overlap extension pcr
WO2012108920A1 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Natera, Inc Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US9364803B2 (en) 2011-02-11 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Methods for forming mixed droplets
WO2012112804A1 (en) 2011-02-18 2012-08-23 Raindance Technoligies, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
WO2012129187A1 (en) 2011-03-18 2012-09-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiplexed digital assays with combinatorial use of signals
US20120244523A1 (en) 2011-03-25 2012-09-27 454 Life Sciences Corporation System and Method for Detection of HIV Integrase Variants
US20120252682A1 (en) 2011-04-01 2012-10-04 Maples Corporate Services Limited Methods and systems for sequencing nucleic acids
WO2012139125A2 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Life Technologies Corporation System and methods for making and processing emulsions
US9121047B2 (en) 2011-04-07 2015-09-01 Life Technologies Corporation System and methods for making and processing emulsions
EP3878975A1 (en) 2011-04-08 2021-09-15 Life Technologies Corporation Phase-protecting reagent flow orderings for use in sequencing-by-synthesis
WO2012142301A2 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Quanterix Corporation Methods of determining a treatment protocol for and/or a prognosis of a patients recovery from a brain injury
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
ES2625288T3 (es) 2011-04-15 2017-07-19 The Johns Hopkins University Sistema de secuenciación segura
AU2012249759A1 (en) 2011-04-25 2013-11-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for nucleic acid analysis
CA2834218C (en) 2011-04-29 2021-02-16 Sequenom, Inc. Quantification of a minority nucleic acid species using inhibitory oligonucleotides
US9487825B2 (en) 2011-05-13 2016-11-08 Mount Sinai School Of Medicine Pooled adapter strategy for reducing bias in small RNA characterization
SG10201605049QA (en) * 2011-05-20 2016-07-28 Fluidigm Corp Nucleic acid encoding reactions
EP2714254B1 (en) 2011-05-23 2017-09-06 President and Fellows of Harvard College Control of emulsions, including multiple emulsions
US9926596B2 (en) 2011-05-27 2018-03-27 Genapsys, Inc. Systems and methods for genetic and biological analysis
US8585973B2 (en) 2011-05-27 2013-11-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nano-sensor array
EP2714928B1 (en) * 2011-05-27 2017-08-02 Life Technologies Corporation Methods for manipulating biomolecules
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
DE202012013668U1 (de) 2011-06-02 2019-04-18 Raindance Technologies, Inc. Enzymquantifizierung
US9598473B2 (en) 2011-06-10 2017-03-21 Keygene N.V. Trichome-specific transcription factor modulating terpene biosynthesis
CN103732744A (zh) 2011-06-15 2014-04-16 Gen9股份有限公司 制备性体外克隆的方法
US9752176B2 (en) 2011-06-15 2017-09-05 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods for preparative in vitro cloning
DK2729580T3 (en) 2011-07-08 2015-12-14 Keygene Nv SEQUENCE BASED genotyping BASED ON OLIGONUKLEOTIDLIGERINGSASSAYS
US8920751B2 (en) 2011-07-08 2014-12-30 Life Technologies Corporation Automated enrichment for nucleic acid sequencing
WO2013009927A2 (en) 2011-07-11 2013-01-17 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuators and techniques for droplet-based assays
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
WO2013019714A1 (en) 2011-07-29 2013-02-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mems affinity sensor for continuous monitoring of analytes
WO2013022778A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid sequencing by electrochemical detection
EP4324935A3 (en) 2011-08-18 2024-05-08 Life Technologies Corporation Methods, systems and computer readable media for making base calls in nucleic acid sequencing
EP3564261A1 (en) 2011-08-23 2019-11-06 Foundation Medicine, Inc. Kif5b-ret fusion molecules and uses thereof
LT3594340T (lt) 2011-08-26 2021-10-25 Gen9, Inc. Kompozicijos ir būdai, skirti nukleorūgščių didelio tikslumo sąrankai
US10704164B2 (en) 2011-08-31 2020-07-07 Life Technologies Corporation Methods, systems, computer readable media, and kits for sample identification
US8712697B2 (en) 2011-09-07 2014-04-29 Ariosa Diagnostics, Inc. Determination of copy number variations using binomial probability calculations
GB2496016B (en) 2011-09-09 2016-03-16 Univ Leland Stanford Junior Methods for obtaining a sequence
US10385475B2 (en) 2011-09-12 2019-08-20 Adaptive Biotechnologies Corp. Random array sequencing of low-complexity libraries
EP2758552A4 (en) * 2011-09-23 2015-09-09 Univ Columbia ISOLATION AND ENRICHMENT OF NUCLEIC ACIDS ON A MICROCHIP
DK3623481T3 (da) 2011-09-23 2021-11-15 Illumina Inc Sammensætninger til nukleinsyresekventering
US10152569B2 (en) 2011-09-26 2018-12-11 Gen-Probe Incorporated Algorithms for sequence determinations
US10378051B2 (en) 2011-09-29 2019-08-13 Illumina Cambridge Limited Continuous extension and deblocking in reactions for nucleic acids synthesis and sequencing
DE102011054101A1 (de) 2011-09-30 2013-04-04 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Verfahren zur räumlichen Anordnung von Probenfragmenten zur Amplifikation und Immobilisierung für weitere Derivatisierungen
US11008611B2 (en) 2011-09-30 2021-05-18 Unm Rainforest Innovations Double gate ion sensitive field effect transistor
US10221454B2 (en) 2011-10-10 2019-03-05 The Hospital For Sick Children Methods and compositions for screening and treating developmental disorders
CN102329876B (zh) * 2011-10-14 2014-04-02 深圳华大基因科技有限公司 一种测定待检测样本中疾病相关核酸分子的核苷酸序列的方法
WO2013055995A2 (en) 2011-10-14 2013-04-18 President And Fellows Of Harvard College Sequencing by structure assembly
CA2852665A1 (en) 2011-10-17 2013-04-25 Good Start Genetics, Inc. Analysis methods
US9206418B2 (en) 2011-10-19 2015-12-08 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing
US20150136604A1 (en) 2011-10-21 2015-05-21 Integenx Inc. Sample preparation, processing and analysis systems
EP2768982A4 (en) 2011-10-21 2015-06-03 Adaptive Biotechnologies Corp QUANTIFICATION OF ADAPTIVE IMMUNOCELL GENOMES IN A COMPLEX MIX OF CELLS
US10865440B2 (en) 2011-10-21 2020-12-15 IntegenX, Inc. Sample preparation, processing and analysis systems
DE102011085473A1 (de) 2011-10-28 2013-05-02 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Verfahren zur Identifikation von Aptameren
US11180807B2 (en) 2011-11-04 2021-11-23 Population Bio, Inc. Methods for detecting a genetic variation in attractin-like 1 (ATRNL1) gene in subject with Parkinson's disease
EP2776962A4 (en) 2011-11-07 2015-12-02 Ingenuity Systems Inc METHODS AND SYSTEMS FOR IDENTIFICATION OF CAUSAL GENOMIC VARIANTS
AU2012336040B2 (en) 2011-11-07 2015-12-10 Illumina, Inc. Integrated sequencing apparatuses and methods of use
GB201120711D0 (en) 2011-12-01 2012-01-11 Univ Erasmus Medical Ct Method for classifying tumour cells
US9970984B2 (en) 2011-12-01 2018-05-15 Life Technologies Corporation Method and apparatus for identifying defects in a chemical sensor array
JP6193252B2 (ja) 2011-12-01 2017-09-06 ジナプシス インコーポレイテッド 高効率電子配列決定及び検出のためのシステム並びに方法
WO2013085918A1 (en) * 2011-12-05 2013-06-13 The Regents Of The University Of California Methods and compostions for generating polynucleic acid fragments
EP2788509B1 (en) 2011-12-09 2018-07-11 Adaptive Biotechnologies Corporation Diagnosis of lymphoid malignancies and minimal residual disease detection
KR101830778B1 (ko) 2011-12-09 2018-02-22 삼성전자주식회사 발열 입자를 포함하는 오일 층을 이용하는 핵산 증폭 장치 및 방법
EP2788499B1 (en) 2011-12-09 2016-01-13 Illumina, Inc. Expanded radix for polymeric tags
US9499865B2 (en) 2011-12-13 2016-11-22 Adaptive Biotechnologies Corp. Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes
US10513737B2 (en) 2011-12-13 2019-12-24 Decipher Biosciences, Inc. Cancer diagnostics using non-coding transcripts
US20130189679A1 (en) 2011-12-20 2013-07-25 The Regents Of The University Of Michigan Pseudogenes and uses thereof
WO2013096838A2 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Ibis Biosciences, Inc. Systems and methods for isolating nucleic acids
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
US10150993B2 (en) 2011-12-22 2018-12-11 Ibis Biosciences, Inc. Macromolecule positioning by electrical potential
ES2953308T3 (es) 2011-12-22 2023-11-10 Harvard College Composiciones y métodos para la detección de analitos
WO2013096799A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Ibis Biosciences, Inc. Systems and methods for isolating nucleic acids from cellular samples
US9823246B2 (en) 2011-12-28 2017-11-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescence enhancing plasmonic nanoscopic gold films and assays based thereon
US9506113B2 (en) 2011-12-28 2016-11-29 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid ligation systems and methods
WO2013102081A2 (en) 2011-12-29 2013-07-04 Ibis Biosciences, Inc. Macromolecule delivery to nanowells
US9222115B2 (en) 2011-12-30 2015-12-29 Abbott Molecular, Inc. Channels with cross-sectional thermal gradients
WO2013104990A1 (en) 2012-01-09 2013-07-18 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer
WO2013106737A1 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Data2Bio Genotyping by next-generation sequencing
US8821798B2 (en) 2012-01-19 2014-09-02 Life Technologies Corporation Titanium nitride as sensing layer for microwell structure
US8747748B2 (en) 2012-01-19 2014-06-10 Life Technologies Corporation Chemical sensor with conductive cup-shaped sensor surface
US9777269B2 (en) 2012-01-25 2017-10-03 Gencell Biosystems Ltd. Biomolecule isolation
CA2862552A1 (en) 2012-01-26 2013-08-01 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation
US9701959B2 (en) 2012-02-02 2017-07-11 Invenra Inc. High throughput screen for biologically active polypeptides
US8597882B2 (en) 2012-02-03 2013-12-03 Pyrobett Pte. Ltd. Method and apparatus for conducting an assay
WO2013117595A2 (en) * 2012-02-07 2013-08-15 Illumina Cambridge Limited Targeted enrichment and amplification of nucleic acids on a support
CA2863887C (en) 2012-02-09 2023-01-03 Population Diagnostics, Inc. Methods of screening low frequency gdna variation biomarkers for pervasive developmental disorder (pdd) or pervasive developmental disorder - not otherwise specified (pdd_nos)
CN104220876A (zh) 2012-02-21 2014-12-17 奥斯陆大学医院 用于***的检测和预后的方法和生物标志物
US20130217023A1 (en) 2012-02-22 2013-08-22 454 Life Sciences Corporation System And Method For Generation And Use Of Compact Clonally Amplified Products
ES2930180T3 (es) 2012-03-02 2022-12-07 Sequenom Inc Métodos para enriquecer ácido nucleico canceroso a partir de una muestra biológica
EP2823060B1 (en) 2012-03-05 2018-02-14 Adaptive Biotechnologies Corporation Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits
IN2014DN08312A (es) 2012-03-06 2015-05-15 Univ Oslo Hf
NO2694769T3 (es) 2012-03-06 2018-03-03
US9150853B2 (en) 2012-03-21 2015-10-06 Gen9, Inc. Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis
US20130261984A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Illumina, Inc. Methods and systems for determining fetal chromosomal abnormalities
US9193996B2 (en) 2012-04-03 2015-11-24 Illumina, Inc. Integrated optoelectronic read head and fluidic cartridge useful for nucleic acid sequencing
US9732387B2 (en) 2012-04-03 2017-08-15 The Regents Of The University Of Michigan Biomarker associated with irritable bowel syndrome and Crohn's disease
US8209130B1 (en) 2012-04-04 2012-06-26 Good Start Genetics, Inc. Sequence assembly
US8812422B2 (en) 2012-04-09 2014-08-19 Good Start Genetics, Inc. Variant database
US20130274148A1 (en) 2012-04-11 2013-10-17 Illumina, Inc. Portable genetic detection and analysis system and method
CN107435070A (zh) * 2012-04-12 2017-12-05 维里纳塔健康公司 拷贝数变异的检测和分类
US10227635B2 (en) 2012-04-16 2019-03-12 Molecular Loop Biosolutions, Llc Capture reactions
CN104471075B (zh) 2012-04-19 2018-06-22 生命技术公司 核酸扩增
EP3095879B1 (en) 2012-04-19 2018-09-19 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
WO2013163210A1 (en) * 2012-04-23 2013-10-31 Philip Alexander Rolfe Method and system for detection of an organism
CA2871505C (en) 2012-04-24 2021-10-12 Gen9, Inc. Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning
WO2013165594A1 (en) * 2012-04-30 2013-11-07 Life Technologies Corporation Modules and calibration method for a robotic polynucleotide sample preparation system
US20150133310A1 (en) 2012-05-02 2015-05-14 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid sequencing systems and methods
DK2831276T3 (da) 2012-05-08 2016-08-01 Adaptive Biotechnologies Corp Sammensætninger og fremgangsmåde til at måle og kalibrere amplifikations-bias i multipleks-PCR-reaktioner
US9646132B2 (en) 2012-05-11 2017-05-09 Life Technologies Corporation Models for analyzing data from sequencing-by-synthesis operations
US10192024B2 (en) 2012-05-18 2019-01-29 454 Life Sciences Corporation System and method for generation and use of optimal nucleotide flow orders
US10289800B2 (en) 2012-05-21 2019-05-14 Ariosa Diagnostics, Inc. Processes for calculating phased fetal genomic sequences
WO2013177220A1 (en) * 2012-05-21 2013-11-28 The Scripps Research Institute Methods of sample preparation
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
CN102766574B (zh) * 2012-05-24 2013-12-25 中国科学院北京基因组研究所 用于dna测序仪的反应仓
EP2856177B1 (en) * 2012-05-25 2020-11-18 The University of North Carolina At Chapel Hill Microfluidic devices, solid supports for reagents and related methods
US8786331B2 (en) 2012-05-29 2014-07-22 Life Technologies Corporation System for reducing noise in a chemical sensor array
WO2013184754A2 (en) 2012-06-05 2013-12-12 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequencing of nucleic acids using dna origami probes
US9012022B2 (en) 2012-06-08 2015-04-21 Illumina, Inc. Polymer coatings
US8895249B2 (en) 2012-06-15 2014-11-25 Illumina, Inc. Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
CN104619894B (zh) 2012-06-18 2017-06-06 纽亘技术公司 用于非期望核酸序列的阴性选择的组合物和方法
AU2013280661A1 (en) 2012-06-25 2015-01-22 Gen9, Inc. Methods for nucleic acid assembly and high throughput sequencing
WO2014005076A2 (en) 2012-06-29 2014-01-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods and biomarkers for detection of kidney disorders
WO2014008448A1 (en) 2012-07-03 2014-01-09 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Quantitative assessment of human t-cell repertoire recovery after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation
US20150011396A1 (en) 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
EP2872648B1 (en) 2012-07-13 2019-09-04 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US9092401B2 (en) 2012-10-31 2015-07-28 Counsyl, Inc. System and methods for detecting genetic variation
GB201212775D0 (en) 2012-07-18 2012-08-29 Dna Electronics Ltd Sensing apparatus and method
US9977861B2 (en) 2012-07-18 2018-05-22 Illumina Cambridge Limited Methods and systems for determining haplotypes and phasing of haplotypes
CA2878280A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 Ariosa Diagnostics, Inc. Multiplexed sequential ligation-based detection of genetic variants
CA2877493C (en) * 2012-07-24 2020-08-25 Natera, Inc. Highly multiplex pcr methods and compositions
US8673972B2 (en) 2012-08-03 2014-03-18 Foundation Medicine, Inc. Human papilloma virus as predictor of cancer prognosis
JP6525872B2 (ja) 2012-08-08 2019-06-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 細胞中の複数のエピトープを同定するためのダイナミックレンジを高めること
AU2013302867A1 (en) 2012-08-13 2015-02-26 The Regents Of The University Of California Methods and systems for detecting biological components
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20140378345A1 (en) * 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
CA2881685C (en) * 2012-08-14 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Microcapsule compositions and methods
US20140378322A1 (en) * 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10584381B2 (en) 2012-08-14 2020-03-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20150005199A1 (en) * 2012-08-14 2015-01-01 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9567631B2 (en) 2012-12-14 2017-02-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20150005200A1 (en) * 2012-08-14 2015-01-01 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
DK3435084T3 (da) 2012-08-16 2023-05-30 Mayo Found Medical Education & Res Prostatakræftprognose under anvendelse af biomarkører
NL2017959B1 (en) 2016-12-08 2018-06-19 Illumina Inc Cartridge assembly
US10876152B2 (en) 2012-09-04 2020-12-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11913065B2 (en) 2012-09-04 2024-02-27 Guardent Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
EP2895620B1 (en) 2012-09-11 2017-08-02 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
WO2014043143A1 (en) 2012-09-11 2014-03-20 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
US10752945B2 (en) 2012-09-12 2020-08-25 The Regents Of The University Of California Accurate genome sequencing of single cells by single-stranded amplification and sequencing
DK2895621T3 (da) 2012-09-14 2020-11-30 Population Bio Inc Fremgangsmåder og sammensætning til diagnosticering, prognose og behandling af neurologiske tilstande
US10233495B2 (en) 2012-09-27 2019-03-19 The Hospital For Sick Children Methods and compositions for screening and treating developmental disorders
ES2749118T3 (es) 2012-10-01 2020-03-19 Adaptive Biotechnologies Corp Evaluación de la inmunocompetencia por la diversidad de los receptores de inmunidad adaptativa y caracterización de la clonalidad
US10329608B2 (en) 2012-10-10 2019-06-25 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer readable media for repeat sequencing
US9177098B2 (en) 2012-10-17 2015-11-03 Celmatix Inc. Systems and methods for determining the probability of a pregnancy at a selected point in time
US10162800B2 (en) 2012-10-17 2018-12-25 Celmatix Inc. Systems and methods for determining the probability of a pregnancy at a selected point in time
WO2015160439A2 (en) 2014-04-17 2015-10-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
JP6200511B2 (ja) 2012-10-26 2017-09-20 シスメックス株式会社 エマルジョン系及びエマルジョンベースの核酸増幅
US9651539B2 (en) 2012-10-28 2017-05-16 Quantapore, Inc. Reducing background fluorescence in MEMS materials by low energy ion beam treatment
AU2013338393B2 (en) 2012-10-29 2017-05-11 The Johns Hopkins University Papanicolaou test for ovarian and endometrial cancers
EP2914621B1 (en) 2012-11-05 2023-06-07 Foundation Medicine, Inc. Novel ntrk1 fusion molecules and uses thereof
US9776182B2 (en) 2012-11-27 2017-10-03 Gencell Biosystems Ltd. Handling liquid samples
CN105189780A (zh) * 2012-12-03 2015-12-23 以琳生物药物有限公司 核酸制备和分析的组合物和方法
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9836577B2 (en) 2012-12-14 2017-12-05 Celmatix, Inc. Methods and devices for assessing risk of female infertility
EP2746405B1 (en) 2012-12-23 2015-11-04 HS Diagnomics GmbH Methods and primer sets for high throughput PCR sequencing
US9080968B2 (en) 2013-01-04 2015-07-14 Life Technologies Corporation Methods and systems for point of use removal of sacrificial material
US9841398B2 (en) 2013-01-08 2017-12-12 Life Technologies Corporation Methods for manufacturing well structures for low-noise chemical sensors
WO2014113502A1 (en) 2013-01-15 2014-07-24 Quanterix Corporation Detection of dna or rna using single molecule arrays and other techniques
US9128861B2 (en) 2013-01-17 2015-09-08 Personalis, Inc. Methods and systems for genetic analysis
WO2014113729A2 (en) 2013-01-18 2014-07-24 Foundation Mecicine, Inc. Methods of treating cholangiocarcinoma
WO2014116729A2 (en) 2013-01-22 2014-07-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Haplotying of hla loci with ultra-deep shotgun sequencing
US8962366B2 (en) 2013-01-28 2015-02-24 Life Technologies Corporation Self-aligned well structures for low-noise chemical sensors
CA3209385A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 The Regents Of The University Of California Methods for genome assembly and haplotype phasing
US9411930B2 (en) 2013-02-01 2016-08-09 The Regents Of The University Of California Methods for genome assembly and haplotype phasing
CA2900543C (en) 2013-02-08 2023-01-31 10X Genomics, Inc. Partitioning and processing of analytes and other species
US9512422B2 (en) 2013-02-26 2016-12-06 Illumina, Inc. Gel patterned surfaces
ES2662598T3 (es) 2013-03-08 2018-04-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Análisis de sangre para la detección de mutaciones de EGFR
EP3578666A1 (en) * 2013-03-12 2019-12-11 President and Fellows of Harvard College Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
EP2971169A4 (en) 2013-03-13 2016-10-26 Abbott Molecular Inc SYSTEMS AND METHODS FOR ISOLATING NUCLEIC ACIDS
US8841217B1 (en) 2013-03-13 2014-09-23 Life Technologies Corporation Chemical sensor with protruded sensor surface
US8963216B2 (en) 2013-03-13 2015-02-24 Life Technologies Corporation Chemical sensor with sidewall spacer sensor surface
WO2014164716A1 (en) * 2013-03-13 2014-10-09 President And Fellows Of Harvard College Methods of elongating dna
US11060145B2 (en) 2013-03-13 2021-07-13 Sequenom, Inc. Methods and compositions for identifying presence or absence of hypermethylation or hypomethylation locus
US8778609B1 (en) 2013-03-14 2014-07-15 Good Start Genetics, Inc. Methods for analyzing nucleic acids
US20140287946A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid control panels
JP2016512437A (ja) 2013-03-14 2016-04-28 アボツト・モレキユラー・インコーポレイテツド 多重メチル化特異的増幅システムおよび方法
US9146248B2 (en) 2013-03-14 2015-09-29 Intelligent Bio-Systems, Inc. Apparatus and methods for purging flow cells in nucleic acid sequencing instruments
US20140296080A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Life Technologies Corporation Methods, Systems, and Computer Readable Media for Evaluating Variant Likelihood
GB2584364A (en) 2013-03-15 2020-12-02 Abvitro Llc Single cell bar-coding for antibody discovery
WO2014151764A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Veracyte, Inc. Methods and compositions for classification of samples
US9591268B2 (en) 2013-03-15 2017-03-07 Qiagen Waltham, Inc. Flow cell alignment methods and systems
WO2014149779A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Life Technologies Corporation Chemical device with thin conductive element
CN105358709B (zh) 2013-03-15 2018-12-07 雅培分子公司 用于检测基因组拷贝数变化的***和方法
US9835585B2 (en) 2013-03-15 2017-12-05 Life Technologies Corporation Chemical sensor with protruded sensor surface
GB2528205B (en) 2013-03-15 2020-06-03 Guardant Health Inc Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
JP6581074B2 (ja) 2013-03-15 2019-09-25 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 一貫性のあるセンサ表面積を有する化学センサ
US9822408B2 (en) * 2013-03-15 2017-11-21 Nugen Technologies, Inc. Sequential sequencing
US10767221B2 (en) 2013-03-15 2020-09-08 Illumina, Inc. Enzyme-linked nucleotides
US9809852B2 (en) 2013-03-15 2017-11-07 Genapsys, Inc. Systems and methods for biological analysis
WO2014144822A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Immumetrix, Inc. Methods and compositions for tagging and analyzing samples
EP2971152B1 (en) 2013-03-15 2018-08-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Identification and use of circulating nucleic acid tumor markers
EP2972280B1 (en) 2013-03-15 2021-09-29 Life Technologies Corporation Chemical sensor with consistent sensor surface areas
US9116117B2 (en) 2013-03-15 2015-08-25 Life Technologies Corporation Chemical sensor with sidewall sensor surface
ES2716094T3 (es) 2013-03-15 2019-06-10 Ibis Biosciences Inc Métodos para analizar la contaminación en la secuenciación del ADN
US11976329B2 (en) 2013-03-15 2024-05-07 Veracyte, Inc. Methods and systems for detecting usual interstitial pneumonia
US9708658B2 (en) * 2013-03-19 2017-07-18 New England Biolabs, Inc. Enrichment of target sequences
US11859171B2 (en) 2013-04-17 2024-01-02 Agency For Science, Technology And Research Method for generating extended sequence reads
JP6433982B2 (ja) * 2013-04-19 2018-12-05 シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッドＳｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ． 無接触微小滴ディスペンサおよび方法
RU2578009C2 (ru) * 2013-05-08 2016-03-20 Закрытое акционерное общество "ЕВРОГЕН" Способ идентификации нативных пар фрагментов днк или рнк, присутствующих в одних и тех же живых клетках
US20140336063A1 (en) 2013-05-09 2014-11-13 Life Technologies Corporation Windowed Sequencing
US10160995B2 (en) * 2013-05-13 2018-12-25 Qiagen Waltham, Inc. Analyte enrichment methods and compositions
EP3004385B1 (en) 2013-05-24 2018-11-28 Quantapore Inc. Nanopore-based nucleic acid analysis with mixed fret detection
WO2014197377A2 (en) 2013-06-03 2014-12-11 Good Start Genetics, Inc. Methods and systems for storing sequence read data
EP3603679B1 (en) 2013-06-04 2022-08-10 President and Fellows of Harvard College Rna-guided transcriptional regulation
US10458942B2 (en) 2013-06-10 2019-10-29 Life Technologies Corporation Chemical sensor array having multiple sensors per well
US10526640B2 (en) 2013-06-19 2020-01-07 Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University Methods for retrieving sequence-verified nucleic acid fragments and apparatuses for amplifying sequence verified nucleic acid fragments
KR101648252B1 (ko) * 2014-01-28 2016-08-16 연세대학교 산학협력단 염기서열 확인 과정에서 분리된 핵산 단편들을 회수하는 방법
CN105849275B (zh) 2013-06-25 2020-03-17 普罗格诺西斯生物科学公司 检测样品中生物靶标的空间分布的方法和***
US9708657B2 (en) * 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
EP3919624A3 (en) 2013-07-01 2021-12-29 Illumina, Inc. Catalyst-free surface functionalization and polymer grafting
ES2719579T3 (es) 2013-07-03 2019-07-11 Illumina Inc Sistema para secuenciación por síntesis ortogonal
US9926597B2 (en) 2013-07-26 2018-03-27 Life Technologies Corporation Control nucleic acid sequences for use in sequencing-by-synthesis and methods for designing the same
JP6656733B2 (ja) 2013-08-05 2020-03-04 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション 新規合成した遺伝子ライブラリ
FI3030645T3 (fi) 2013-08-08 2023-02-10 Fluidijärjestelmä reagenssien toimittamiseen virtauskennoon
US20150051117A1 (en) * 2013-08-16 2015-02-19 President And Fellows Of Harvard College Assembly of Nucleic Acid Sequences in Emulsions
EP2840148B1 (en) 2013-08-23 2019-04-03 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for nucleic acid amplification
EP2848698A1 (en) 2013-08-26 2015-03-18 F. Hoffmann-La Roche AG System and method for automated nucleic acid amplification
US20160199832A1 (en) 2013-08-30 2016-07-14 Advanced Liquid Logic France Sas Manipulation of droplets on hydrophilic or variegated-hydrophilic surfaces
WO2015031689A1 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Personalis, Inc. Methods and systems for genomic analysis
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
CA2959978A1 (en) * 2013-09-24 2015-04-02 The Regents Of The University Of California Encapsulated sensors and sensing systems for bioassays and diagnostics and methods for making and using them
US10577655B2 (en) 2013-09-27 2020-03-03 Natera, Inc. Cell free DNA diagnostic testing standards
US10262755B2 (en) 2014-04-21 2019-04-16 Natera, Inc. Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments
WO2015051275A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Personalis, Inc. Methods for analyzing genotypes
JP6532456B2 (ja) 2013-10-04 2019-06-19 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 終止化学を用いる配列決定における整相効果（ｐｈａｓｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ）をモデル化するための方法及びシステム
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
EP3572527B1 (en) 2013-10-17 2021-05-26 Illumina, Inc. Methods and compositions for preparing nucleic acid libraries
US10851414B2 (en) 2013-10-18 2020-12-01 Good Start Genetics, Inc. Methods for determining carrier status
US11041203B2 (en) 2013-10-18 2021-06-22 Molecular Loop Biosolutions, Inc. Methods for assessing a genomic region of a subject
US9897986B2 (en) 2013-10-29 2018-02-20 Regal Beloit America, Inc. System and method for enabling a motor controller to communicate using multiple different communication protocols
CN103540672B (zh) * 2013-10-29 2015-04-08 中国科学技术大学 一种亲和核酸分子的快速鉴定和分离方法
WO2015069798A1 (en) * 2013-11-05 2015-05-14 The Regents Of The University Of California Single-cell forensic short tandem repeat typing within microfluidic droplets
CN105829589B (zh) 2013-11-07 2021-02-02 小利兰·斯坦福大学理事会 用于分析人体微生物组及其组分的无细胞核酸
WO2015069634A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 President And Fellows Of Harvard College Microparticles, methods for their preparation and use
WO2015073332A1 (en) 2013-11-12 2015-05-21 Life Technologies Corporation System and method for emulsion breaking
EP3511422B1 (en) 2013-11-12 2022-12-28 Population Bio, Inc. Methods and compositions for diagnosing, prognosing, and treating endometriosis
CN104630202A (zh) * 2013-11-13 2015-05-20 北京大学 一种能够减小微量核酸物质整体扩增时产生偏倚的扩增方法
WO2015073711A1 (en) 2013-11-13 2015-05-21 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read
CN114471756B (zh) 2013-11-18 2024-04-16 尹特根埃克斯有限公司 用于样本分析的卡盒和仪器
EP3077543B1 (en) 2013-12-05 2019-09-25 Centrillion Technology Holdings Corporation Fabrication of patterned arrays
EP3077545B1 (en) 2013-12-05 2020-09-16 Centrillion Technology Holdings Corporation Methods for sequencing nucleic acids
US10385335B2 (en) 2013-12-05 2019-08-20 Centrillion Technology Holdings Corporation Modified surfaces
AU2014364180B2 (en) 2013-12-09 2021-03-04 Illumina, Inc. Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing
US11091758B2 (en) 2013-12-11 2021-08-17 The Regents Of The University Of California Methods for labeling DNAa fragments to reconstruct physical linkage and phase
EP3080300B1 (en) 2013-12-11 2020-09-02 Genapsys Inc. Systems and methods for biological analysis and computation
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
WO2015089438A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Northwestern University Biomarkers for post-traumatic stress states
US9824068B2 (en) 2013-12-16 2017-11-21 10X Genomics, Inc. Methods and apparatus for sorting data
US10768181B2 (en) 2013-12-17 2020-09-08 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Detection of an antibody against a pathogen
EP3524694B1 (en) 2013-12-28 2020-07-15 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
US11193176B2 (en) 2013-12-31 2021-12-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detecting and quantifying latent retroviral RNA species
WO2015103225A1 (en) 2013-12-31 2015-07-09 Illumina, Inc. Addressable flow cell using patterned electrodes
WO2015107430A2 (en) 2014-01-16 2015-07-23 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer
US9587268B2 (en) 2014-01-29 2017-03-07 Agilent Technologies Inc. Fast hybridization for next generation sequencing target enrichment
US9387451B2 (en) 2014-02-03 2016-07-12 International Business Machines Corporation Flow cell array and uses thereof
EP3105326A4 (en) 2014-02-10 2018-01-10 Gencell Biosystems Limited Composite liquid cell (clc) mediated nucleic acid library preparation device, and methods for using the same
US9745614B2 (en) 2014-02-28 2017-08-29 Nugen Technologies, Inc. Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors
WO2015134787A2 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods using randomer-containing synthetic molecules
EP3736344A1 (en) 2014-03-13 2020-11-11 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2015141649A1 (ja) * 2014-03-20 2015-09-24 ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社 核酸増幅自動化装置、及び核酸増幅分析自動化装置
US11060139B2 (en) 2014-03-28 2021-07-13 Centrillion Technology Holdings Corporation Methods for sequencing nucleic acids
US10066265B2 (en) 2014-04-01 2018-09-04 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining antigen-specific t-cells
US11390921B2 (en) 2014-04-01 2022-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Determining WT-1 specific T cells and WT-1 specific T cell receptors (TCRs)
US20150284715A1 (en) * 2014-04-07 2015-10-08 Qiagen Gmbh Enrichment Methods
CN106413896B (zh) 2014-04-10 2019-07-05 10X基因组学有限公司 用于封装和分割试剂的流体装置、***和方法及其应用
WO2015161054A2 (en) 2014-04-18 2015-10-22 Genapsys, Inc. Methods and systems for nucleic acid amplification
EP3957749A1 (en) 2014-04-21 2022-02-23 Natera, Inc. Detecting tumour specific mutations in biopsies with whole exome sequencing and in cell-free samples
US11053548B2 (en) 2014-05-12 2021-07-06 Good Start Genetics, Inc. Methods for detecting aneuploidy
WO2015179098A1 (en) 2014-05-21 2015-11-26 Integenx Inc. Fluidic cartridge with valve mechanism
US10760109B2 (en) 2014-06-06 2020-09-01 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for characterizing and diagnosing periodontal disease
WO2015191877A1 (en) * 2014-06-11 2015-12-17 Life Technologies Corporation Systems and methods for substrate enrichment
EP3155127B1 (en) * 2014-06-13 2020-07-22 Life Technologies Corporation Multiplex nucleic acid amplification
CN105392902B (zh) 2014-06-24 2021-10-29 生物辐射实验室股份有限公司 数字式pcr条码化
JP6838969B2 (ja) 2014-06-26 2021-03-03 １０エックス ジェノミクス， インコーポレイテッド 個々の細胞または細胞集団由来の核酸の分析方法
CN110211637B (zh) 2014-06-26 2023-10-27 10X基因组学有限公司 核酸序列装配的方法和***
EP3160654A4 (en) 2014-06-27 2017-11-15 The Regents of The University of California Pcr-activated sorting (pas)
MX2016017136A (es) 2014-06-27 2017-05-10 Abbott Lab Composiciones y metodos para detectar pegivirus 2 de humano (hpgv-2).
WO2016007839A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 President And Fellows Of Harvard College Methods for high-throughput labelling and detection of biological features in situ using microscopy
CA2954895A1 (en) 2014-07-17 2016-01-21 Celmatix Inc. Methods and systems for assessing infertility and related pathologies
EP3578668B1 (en) 2014-07-24 2020-12-30 Abbott Molecular Inc. Methods for the detection and analysis of mycobacterium tuberculosis
US10526641B2 (en) 2014-08-01 2020-01-07 Dovetail Genomics, Llc Tagging nucleic acids for sequence assembly
WO2016022696A1 (en) 2014-08-05 2016-02-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method of isolating aptamers for minimal residual disease detection
US10102337B2 (en) 2014-08-06 2018-10-16 Nugen Technologies, Inc. Digital measurements from targeted sequencing
GB201413929D0 (en) 2014-08-06 2014-09-17 Geneseque As Method
CA2956812C (en) 2014-08-11 2023-04-11 Luminex Corporation Probes for improved melt discrimination and multiplexing in nucleic acid assays
GB2543728B (en) 2014-08-12 2019-04-17 Nextgen Jane Inc Medical kit and method for processing a biological sample
US10435685B2 (en) * 2014-08-19 2019-10-08 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for enrichment of nucleic acids
EP3183577B1 (en) 2014-08-21 2020-08-19 Illumina Cambridge Limited Reversible surface functionalization
WO2016036403A1 (en) 2014-09-05 2016-03-10 Population Diagnostics Inc. Methods and compositions for inhibiting and treating neurological conditions
CA3180239A1 (en) 2014-09-08 2016-03-17 Becton, Dickinson And Company Enhanced platen for pharmaceutical compounding
US11408024B2 (en) 2014-09-10 2022-08-09 Molecular Loop Biosciences, Inc. Methods for selectively suppressing non-target sequences
CN105400864B (zh) * 2014-09-12 2020-04-14 深圳华大基因股份有限公司 用于基于血液样品构建测序文库的方法及其在确定胎儿遗传异常中的用途
CN106715713B (zh) * 2014-09-12 2020-11-03 深圳华大智造科技有限公司 试剂盒及其在核酸测序中的用途
EP3192869B1 (en) * 2014-09-12 2019-03-27 MGI Tech Co., Ltd. Isolated oligonucleotide and use thereof in nucleic acid sequencing
US10590483B2 (en) 2014-09-15 2020-03-17 Abvitro Llc High-throughput nucleotide library sequencing
US10550428B2 (en) 2014-09-17 2020-02-04 Ibis Biosciences, Inc. Sequencing by synthesis using pulse read optics
CN107002121B (zh) 2014-09-18 2020-11-13 亿明达股份有限公司 用于分析核酸测序数据的方法和***
JP2017536087A (ja) 2014-09-24 2017-12-07 グッド スタート ジェネティクス， インコーポレイテッド 遺伝子アッセイのロバストネスを増大させるためのプロセス制御
CA2963604C (en) 2014-10-10 2023-02-14 Quantapore, Inc. Nanopore-based polymer analysis with mutually-quenching fluorescent labels
WO2016060974A1 (en) 2014-10-13 2016-04-21 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer-readable media for accelerated base calling
US10344317B2 (en) 2014-10-13 2019-07-09 Mgi Tech Co., Ltd Method and a sequence combination for producing nucleic acid fragments
EP3209419A4 (en) 2014-10-22 2018-10-03 The Regents of The University of California High definition microdroplet printer
EP3209410A4 (en) 2014-10-22 2018-05-02 IntegenX Inc. Systems and methods for sample preparation, processing and analysis
CN107002126B (zh) * 2014-10-24 2021-05-25 昆塔波尔公司 使用纳米结构阵列的聚合物的高效光学分析
US20160122817A1 (en) 2014-10-29 2016-05-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing
CA2966201A1 (en) 2014-10-29 2016-05-06 Adaptive Biotechnologies Corp. Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from many samples
EP4026913A1 (en) 2014-10-30 2022-07-13 Personalis, Inc. Methods for using mosaicism in nucleic acids sampled distal to their origin
CN114805710B (zh) 2014-10-31 2023-11-17 伊鲁米纳剑桥有限公司 聚合物以及dna共聚物涂层
JP6812797B2 (ja) * 2014-11-04 2021-01-13 凸版印刷株式会社 核酸導入方法、核酸検出方法、生体成分解析方法、生体成分定量用アレイデバイス、及び生体成分解析キット
EP3770274A1 (en) 2014-11-05 2021-01-27 Veracyte, Inc. Systems and methods of diagnosing idiopathic pulmonary fibrosis on transbronchial biopsies using machine learning and high dimensional transcriptional data
CN111024936A (zh) 2014-11-05 2020-04-17 纳迈达斯生物科技中心 用于增强成像的金属复合物
CN107250358B (zh) 2014-11-05 2021-03-30 伊卢米纳剑桥有限公司 在样品制备和测序期间使用铁载体螯合剂减少dna损伤
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
US10246701B2 (en) 2014-11-14 2019-04-02 Adaptive Biotechnologies Corp. Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture
US11789906B2 (en) 2014-11-19 2023-10-17 Arc Bio, Llc Systems and methods for genomic manipulations and analysis
WO2016081549A1 (en) 2014-11-20 2016-05-26 Ampliwise Inc. Compositions, methods, systems and kits for nucleic acid amplification and analysis
US10233490B2 (en) 2014-11-21 2019-03-19 Metabiotech Corporation Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations
US11066705B2 (en) 2014-11-25 2021-07-20 Adaptive Biotechnologies Corporation Characterization of adaptive immune response to vaccination or infection using immune repertoire sequencing
EP3227464B1 (en) 2014-12-05 2022-04-20 Foundation Medicine, Inc. Multigene analysis of tumor samples
US20160177386A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 Life Technologies Corporation Calibration panels and methods for designing the same
EP3234576B1 (en) 2014-12-18 2023-11-22 Life Technologies Corporation High data rate integrated circuit with transmitter configuration
US10077472B2 (en) 2014-12-18 2018-09-18 Life Technologies Corporation High data rate integrated circuit with power management
WO2016100521A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays
US20180016631A1 (en) 2014-12-24 2018-01-18 Keygene N.V. Backbone mediated mate pair sequencing
US10066259B2 (en) 2015-01-06 2018-09-04 Good Start Genetics, Inc. Screening for structural variants
CN112126675B (zh) 2015-01-12 2022-09-09 10X基因组学有限公司 用于制备核酸测序文库的方法和***以及用其制备的文库
SG11201705425SA (en) 2015-01-13 2017-08-30 10X Genomics Inc Systems and methods for visualizing structural variation and phasing information
GB201501012D0 (en) * 2015-01-21 2015-03-04 Base4 Innovation Ltd Improved droplet sequencing apparatus and method
WO2016122582A1 (en) * 2015-01-30 2016-08-04 Hewlett Packard Enterprise Development Lp Relationship preserving projection of digital objects
WO2016125236A1 (ja) 2015-02-02 2016-08-11 株式会社日立ハイテクノロジーズ 多色蛍光分析装置
US10646869B2 (en) * 2015-02-03 2020-05-12 Hitachi, Ltd. Flow cell device for single cell analysis, and single cell analysis device
US10669304B2 (en) 2015-02-04 2020-06-02 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
WO2016126987A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Compositions and methods for synthetic gene assembly
EP3253479B1 (en) 2015-02-04 2022-09-21 The Regents of The University of California Sequencing of nucleic acids via barcoding in discrete entities
CA2975529A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 10X Genomics, Inc. Systems and methods for determining structural variation and phasing using variant call data
CN107532166A (zh) * 2015-02-11 2018-01-02 佰隆基因公司 用于减少非特异性扩增产物的方法和组合物
US10421993B2 (en) 2015-02-11 2019-09-24 Paragon Genomics, Inc. Methods and compositions for reducing non-specific amplification products
CA2976786A1 (en) * 2015-02-17 2016-08-25 Complete Genomics, Inc. Dna sequencing using controlled strand displacement
WO2016134034A1 (en) 2015-02-17 2016-08-25 Dovetail Genomics Llc Nucleic acid sequence assembly
CN107407685B (zh) 2015-02-20 2021-08-03 宝生物工程（美国)有限公司 快速精确分配、可视化和分析单个细胞的方法
KR20170119710A (ko) 2015-02-24 2017-10-27 10엑스 제노믹스, 인크. 표적화된 핵산 서열 커버리지 방법
EP4286516A3 (en) 2015-02-24 2024-03-06 10X Genomics, Inc. Partition processing methods and systems
AU2016222788B2 (en) 2015-02-24 2022-03-31 Adaptive Biotechnologies Corp. Methods for diagnosing infectious disease and determining HLA status using immune repertoire sequencing
CN107614096A (zh) 2015-03-13 2018-01-19 哈佛学院院长及董事 使用扩增测定细胞
CA2979850C (en) 2015-03-24 2020-07-21 Illumina, Inc. Methods, carrier assemblies, and systems for imaging samples for biological or chemical analysis
US11807896B2 (en) 2015-03-26 2023-11-07 Dovetail Genomics, Llc Physical linkage preservation in DNA storage
US10301660B2 (en) 2015-03-30 2019-05-28 Takara Bio Usa, Inc. Methods and compositions for repair of DNA ends by multiple enzymatic activities
US20160287152A1 (en) * 2015-03-30 2016-10-06 Verily Life Sciences Llc Functionalized Nanoparticles, Methods and In Vivo Diagnostic System
AU2016242967B2 (en) 2015-04-01 2021-07-01 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of identifying human compatible T cell receptors specific for an antigenic target
CA2980769A1 (en) 2015-04-02 2016-10-06 The Jackson Laboratory Method for detecting genomic variations using circularised mate-pair library and shotgun sequencing
EP3530752B1 (en) 2015-04-10 2021-03-24 Spatial Transcriptomics AB Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
WO2016172377A1 (en) 2015-04-21 2016-10-27 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
EP3091026B1 (en) 2015-05-08 2019-02-20 Centrillion Technology Holdings Corporation Disulfide-linked reversible terminators
WO2016183106A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
DK3294911T3 (da) 2015-05-11 2020-11-16 Illumina Inc Platform til opdagelse og analyse af terapeutiske midler
CN107969138B (zh) 2015-05-14 2022-04-12 生命科技公司 条形码序列和有关***与方法
WO2016196358A1 (en) * 2015-05-29 2016-12-08 Epicentre Technologies Corporation Methods of analyzing nucleic acids
EP3307908B1 (en) 2015-06-09 2019-09-11 Life Technologies Corporation Methods for molecular tagging
EP3527672B1 (en) 2015-06-09 2022-10-05 Centrillion Technology Holdings Corporation Oligonucleotide arrays for sequencing nucleic acids
WO2017007753A1 (en) 2015-07-07 2017-01-12 Illumina, Inc. Selective surface patterning via nanoimrinting
CN108350452B (zh) 2015-07-14 2022-07-19 雅培分子公司 使用铜-钛氧化物纯化核酸
WO2017011565A1 (en) 2015-07-14 2017-01-19 Abbott Molecular Inc. Compositions and methods for identifying drug resistant tuberculosis
ES2945607T3 (es) 2015-07-17 2023-07-04 Illumina Inc Láminas de polímero para aplicaciones de secuenciación
US10150994B2 (en) 2015-07-22 2018-12-11 Qiagen Waltham, Inc. Modular flow cells and methods of sequencing
BR112017023418A2 (pt) 2015-07-30 2018-07-24 Illumina, Inc. desbloqueio ortogonal de nucleotídeos
EP3332034A4 (en) 2015-08-06 2019-01-02 Arc Bio, LLC Systems and methods for genomic analysis
WO2017027653A1 (en) 2015-08-11 2017-02-16 The Johns Hopkins University Assaying ovarian cyst fluid
US10976334B2 (en) 2015-08-24 2021-04-13 Illumina, Inc. In-line pressure accumulator and flow-control system for biological or chemical assays
CN107921432A (zh) 2015-09-02 2018-04-17 伊卢米纳剑桥有限公司 改善流控***中的液滴操作的***和方法
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
US9938572B1 (en) 2015-09-08 2018-04-10 Raindance Technologies, Inc. System and method for forming an emulsion
JP6982362B2 (ja) 2015-09-18 2021-12-17 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション オリゴ核酸変異体ライブラリーとその合成
CN108698012A (zh) 2015-09-22 2018-10-23 特韦斯特生物科学公司 用于核酸合成的柔性基底
US10465232B1 (en) 2015-10-08 2019-11-05 Trace Genomics, Inc. Methods for quantifying efficiency of nucleic acid extraction and detection
CN108289797B (zh) 2015-10-13 2022-01-28 哈佛学院院长及董事 用于制备和使用凝胶微球的***和方法
SG11201803289VA (en) 2015-10-19 2018-05-30 Dovetail Genomics Llc Methods for genome assembly, haplotype phasing, and target independent nucleic acid detection
WO2017079406A1 (en) 2015-11-03 2017-05-11 President And Fellows Of Harvard College Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
US9895673B2 (en) 2015-12-01 2018-02-20 Twist Bioscience Corporation Functionalized surfaces and preparation thereof
WO2017096110A1 (en) * 2015-12-04 2017-06-08 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Method and device for optimizing the process of identification of pathogens
SG11201804086VA (en) 2015-12-04 2018-06-28 10X Genomics Inc Methods and compositions for nucleic acid analysis
US10730030B2 (en) 2016-01-08 2020-08-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiple beads per droplet resolution
AU2017207259B2 (en) 2016-01-11 2019-06-27 Illumina Singapore Pte Ltd Detection apparatus having a microfluorometer, a fluidic system, and a flow cell latch clamp module
CN108495938B (zh) * 2016-01-12 2023-07-14 生物辐射实验室股份有限公司 利用相位移区块合成条码化序列及其用途
WO2017123758A1 (en) 2016-01-12 2017-07-20 Seqwell, Inc. Compositions and methods for sequencing nucleic acids
KR102641264B1 (ko) 2016-01-22 2024-02-26 퍼듀 리서치 파운데이션 하전된 질량 표지 시스템
JP6685138B2 (ja) 2016-01-27 2020-04-22 シスメックス株式会社 核酸増幅の精度管理方法、精度管理用試薬およびその試薬キット
EP3848457A1 (en) 2016-02-08 2021-07-14 Rgene, Inc. Multiple ligase compositions, systems, and methods
JP6735348B2 (ja) 2016-02-11 2020-08-05 １０エックス ジェノミクス， インコーポレイテッド 全ゲノム配列データのデノボアセンブリのためのシステム、方法及び媒体
JP2017143783A (ja) * 2016-02-17 2017-08-24 国立大学法人 筑波大学 並列反応用懸濁液、並列反応方法、スクリーニング方法および検査方法
KR20180116377A (ko) 2016-02-23 2018-10-24 더브테일 제노믹스 엘엘씨 게놈 어셈블리를 위한 페이징된 판독 세트의 생성 및 반수체형 페이징
WO2017155858A1 (en) 2016-03-07 2017-09-14 Insilixa, Inc. Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension
US20190062827A1 (en) 2016-03-14 2019-02-28 RGENE, Inc. HYPER-THERMOSTABLE LYSINE-MUTANT ssDNA/RNA LIGASES
CA3016077A1 (en) 2016-03-22 2017-09-28 Counsyl, Inc. Combinatorial dna screening
EP4198146A3 (en) 2016-03-25 2023-08-23 Karius, Inc. Methods using synthetic nucleic acid spike-ins
CN108463287B (zh) 2016-03-28 2021-01-15 亿明达股份有限公司 多平面微阵列
WO2017180909A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Nextgen Jane, Inc. Sample collection and preservation devices, systems and methods
US11355328B2 (en) 2016-04-13 2022-06-07 Purdue Research Foundation Systems and methods for isolating a target ion in an ion trap using a dual frequency waveform
ITUA20162640A1 (it) * 2016-04-15 2017-10-15 Menarini Silicon Biosystems Spa Metodo e kit per la generazione di librerie di dna per sequenziamento massivo parallelo
CA3210120C (en) 2016-04-25 2024-04-09 President And Fellows Of Harvard College Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection
CN105821482B (zh) * 2016-04-29 2018-04-10 李星军 一种生化微反应体系、高通量测序的建库仪及应用
US10077459B2 (en) 2016-05-04 2018-09-18 General Electric Company Cell-free protein expression using rolling circle amplification product
US10619205B2 (en) 2016-05-06 2020-04-14 Life Technologies Corporation Combinatorial barcode sequences, and related systems and methods
EP3455356B1 (en) 2016-05-13 2021-08-04 Dovetail Genomics LLC Recovering long-range linkage information from preserved samples
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
US10900076B2 (en) 2016-05-18 2021-01-26 Illumina, Inc. Self assembled patterning using patterned hydrophobic surfaces
US11299783B2 (en) 2016-05-27 2022-04-12 Personalis, Inc. Methods and systems for genetic analysis
EP3469078B1 (en) 2016-06-10 2024-03-27 Life Technologies Corporation Methods and compositions for nucleic acid amplification
EP3469097B1 (en) * 2016-06-14 2020-02-19 Base4 Innovation Limited Method for the separation of a modified polynucleotide
WO2018013509A1 (en) 2016-07-11 2018-01-18 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Compositions and methods for diagnosing and treating arrhythmias
WO2018017884A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Genapsys, Inc. Systems and methods for nucleic acid sequencing
JP7075394B2 (ja) 2016-07-21 2022-05-25 タカラ バイオ ユーエスエー， インコーポレイテッド マルチウェルデバイスを用いたマルチｚ撮像及び分注
WO2018031691A1 (en) 2016-08-10 2018-02-15 The Regents Of The University Of California Combined multiple-displacement amplification and pcr in an emulsion microdroplet
EP3500082A1 (en) 2016-08-22 2019-06-26 Biolumic Limited System, device and methods of seed treatment
GB2568444A (en) 2016-08-22 2019-05-15 Twist Bioscience Corp De novo synthesized nucleic acid libraries
WO2018039490A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 Genomedx Biosciences, Inc. Use of genomic signatures to predict responsiveness of patients with prostate cancer to post-operative radiation therapy
EP3507364A4 (en) 2016-08-31 2020-05-20 President and Fellows of Harvard College METHODS OF GENERATING NUCLEIC ACID SEQUENCE LIBRARIES FOR IN SITU FLUORESCENT SEQUENCING DETECTION
WO2018045186A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 President And Fellows Of Harvard College Methods of combining the detection of biomolecules into a single assay using fluorescent in situ sequencing
WO2018039969A1 (en) * 2016-08-31 2018-03-08 President And Fellows Of Harvard College Methods of whole genome digital amplification
WO2018045162A1 (en) 2016-09-01 2018-03-08 Biogen Ma Inc. Biomarkers predictive of primary progressive multiple sclerosis and uses thereof
WO2018049260A1 (en) * 2016-09-09 2018-03-15 Tl Biolabs Corp . Reusable microarray compositions and methods
US10428325B1 (en) 2016-09-21 2019-10-01 Adaptive Biotechnologies Corporation Identification of antigen-specific B cell receptors
KR102217487B1 (ko) 2016-09-21 2021-02-23 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 기반 데이터 저장
WO2018064226A1 (en) 2016-09-27 2018-04-05 uBiome, Inc. Method and system for crispr-based library preparation and sequencing
WO2018064116A1 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Illumina, Inc. Methods and systems for data compression
US11485996B2 (en) 2016-10-04 2022-11-01 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
US10190155B2 (en) 2016-10-14 2019-01-29 Nugen Technologies, Inc. Molecular tag attachment and transfer
IL290157B2 (en) 2016-10-14 2023-09-01 Illumina Inc cartridge kit
US11725232B2 (en) 2016-10-31 2023-08-15 The Hong Kong University Of Science And Technology Compositions, methods and kits for detection of genetic variants for alzheimer's disease
US10255990B2 (en) 2016-11-11 2019-04-09 uBiome, Inc. Method and system for fragment assembly and sequence identification
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
CN110366613A (zh) 2016-12-16 2019-10-22 特韦斯特生物科学公司 免疫突触的变体文库及其合成
WO2018118971A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet tagging contiguity preserved tagmented dna
JP6847499B2 (ja) * 2016-12-20 2021-03-24 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 環状コンセンサスシークエンシングのための一本鎖環状ｄｎａライブラリー
CA3047328A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 The Regents Of The University Of California Single cell genomic sequencing using hydrogel based droplets
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP3564387A4 (en) 2016-12-27 2020-10-07 EGI Tech (Shen Zhen) Co., Limited SINGLE FLUORESCENT DYE BASED SEQUENCING METHOD
KR102349259B1 (ko) * 2017-01-04 2022-01-07 엠쥐아이 테크 컴퍼니 엘티디. 친화성 시약을 이용한 핵산 시퀀싱
GB201704754D0 (en) 2017-01-05 2017-05-10 Illumina Inc Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
WO2018132459A1 (en) 2017-01-10 2018-07-19 Paragon Genomics, Inc. Methods and compositions for reducing redundant molecular barcodes created in primer extension reactions
EP3571322B9 (en) 2017-01-20 2023-10-04 VERACYTE SD, Inc. Molecular subtyping, prognosis, and treatment of bladder cancer
WO2018140966A1 (en) 2017-01-30 2018-08-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
GB201701688D0 (en) 2017-02-01 2017-03-15 Illumia Inc System and method with fiducials in non-recliner layouts
GB201701689D0 (en) 2017-02-01 2017-03-15 Illumia Inc System and method with fiducials of non-closed shapes
GB201701686D0 (en) 2017-02-01 2017-03-15 Illunina Inc System & method with fiducials having offset layouts
US10240205B2 (en) 2017-02-03 2019-03-26 Population Bio, Inc. Methods for assessing risk of developing a viral disease using a genetic test
US10995333B2 (en) 2017-02-06 2021-05-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation
EP3585889A1 (en) 2017-02-21 2020-01-01 Natera, Inc. Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids
CA3054303A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
EP4218738A1 (en) 2017-02-24 2023-08-02 The Regents of The University of California Particle-drop structures and methods for making and using the same
GB201703049D0 (en) * 2017-02-24 2017-04-12 Univ I Tromsø - Norges Arktiske Univ Single-strand binding protein
JP6931540B2 (ja) 2017-02-27 2021-09-08 シスメックス株式会社 検体処理チップを用いた送液方法、検体処理チップの送液装置
CA3055925A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Decipher Biosciences, Inc. Subtyping prostate cancer to predict response to hormone therapy
WO2018170169A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Twist Bioscience Corporation Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
WO2018175399A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Universal hairpin primers
US10737267B2 (en) 2017-04-04 2020-08-11 Omniome, Inc. Fluidic apparatus and methods useful for chemical and biological reactions
WO2018186930A1 (en) * 2017-04-06 2018-10-11 MyOmicsDx, Inc Method and kit for constructing nucleic acid library
EP3610034B1 (en) 2017-04-12 2022-06-08 Karius, Inc. Sample preparation methods, systems and compositions
US11185568B2 (en) 2017-04-14 2021-11-30 President And Fellows Of Harvard College Methods for generation of cell-derived microfilament network
US20210371918A1 (en) 2017-04-18 2021-12-02 Dovetail Genomics, Llc Nucleic acid characteristics as guides for sequence assembly
US10161003B2 (en) 2017-04-25 2018-12-25 Omniome, Inc. Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency
JP2018183097A (ja) * 2017-04-26 2018-11-22 株式会社エンプラス 細胞由来の解析用液滴の単離方法、および細胞の解析方法
CA3062716A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Decipher Biosciences, Inc. Genetic signatures to predict prostate cancer metastasis and identify tumor agressiveness
CN106957842B (zh) * 2017-05-15 2020-05-22 青岛安德贝生命科技有限公司 Bac克隆dna的提取方法
WO2018213774A1 (en) 2017-05-19 2018-11-22 10X Genomics, Inc. Systems and methods for analyzing datasets
US10844372B2 (en) 2017-05-26 2020-11-24 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
EP4230746A3 (en) 2017-05-26 2023-11-01 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
US20200362397A1 (en) * 2017-05-31 2020-11-19 Centrillion Technology Holdings Corporation Oligonucleotide probe array with electronic detection system
CN110997711A (zh) 2017-06-08 2020-04-10 布里格姆妇女医院 用于鉴定表位的方法和组合物
CA3066744A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
WO2018231864A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
US11001885B2 (en) * 2017-06-13 2021-05-11 Personal Genomics Taiwan, Inc. Apparatus for single molecular sequencing and method of sequencing nucleic acid molecules
US11186862B2 (en) 2017-06-20 2021-11-30 Bio-Rad Laboratories, Inc. MDA using bead oligonucleotide
CA3068273A1 (en) 2017-06-21 2018-12-27 Bluedot Llc Systems and methods for identification of nucleic acids in a sample
US11217329B1 (en) 2017-06-23 2022-01-04 Veracyte, Inc. Methods and systems for determining biological sample integrity
WO2019018404A1 (en) * 2017-07-17 2019-01-24 SeqOnce Biosciences, Inc. FAST BANK CONSTRUCTION FOR HIGH FLOW SEQUENCING
SG11202000964UA (en) 2017-08-15 2020-02-27 Omniome Inc Scanning apparatus and methods useful for detection of chemical and biological analytes
WO2019038594A2 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Biolumic Limited TRANSGENIC PLANTS WITH HIGH GROWTH AND HIGH RUSTICITY
EP3673064A4 (en) 2017-08-24 2021-05-26 Takara Bio USA, Inc. METHOD OF PRODUCING NUCLEIC ACIDS USING STIMULUS MODIFIED OLIGONUCLEOTIDES
SG11202002194UA (en) 2017-09-11 2020-04-29 Twist Bioscience Corp Gpcr binding proteins and synthesis thereof
JP2020536051A (ja) 2017-09-20 2020-12-10 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 腫瘍が高いパッセンジャー遺伝子変異量を担持する患者の免疫療法剤
SG11202002516WA (en) 2017-09-21 2020-04-29 Genapsys Inc Systems and methods for nucleic acid sequencing
WO2019060716A1 (en) 2017-09-25 2019-03-28 Freenome Holdings, Inc. SAMPLE EXTRACTION METHODS AND SYSTEMS
CN111372574A (zh) * 2017-09-29 2020-07-03 加利福尼亚大学董事会 单分散乳液的制备方法
US10837047B2 (en) 2017-10-04 2020-11-17 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
CN111787930A (zh) 2017-10-06 2020-10-16 芝加哥大学 针对癌症特异性抗原对t淋巴细胞的筛选
US10501739B2 (en) 2017-10-18 2019-12-10 Mission Bio, Inc. Method, systems and apparatus for single cell analysis
WO2019079593A1 (en) 2017-10-19 2019-04-25 Omniome, Inc. BACKGROUND NOISE REDUCTION AND STABILIZATION OF SIMULTANEOUS COMPLEXES IN LINKED ASSAY WORKFLOWS
WO2019079769A1 (en) 2017-10-20 2019-04-25 Twist Bioscience Corporation HEATED NANOWELLS FOR THE SYNTHESIS OF POLYNUCLEOTIDES
US11099202B2 (en) 2017-10-20 2021-08-24 Tecan Genomics, Inc. Reagent delivery system
WO2019084043A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID PREPARATION AND CHROMATIN ANALYSIS
CN111479631B (zh) 2017-10-27 2022-02-22 10X基因组学有限公司 用于样品制备和分析的方法和***
CN111295443B (zh) 2017-11-02 2024-04-16 生物辐射实验室股份有限公司 基于转座酶的基因组分析
SG11201913654QA (en) 2017-11-15 2020-01-30 10X Genomics Inc Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
WO2019103967A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating cancer
JP2021503969A (ja) 2017-11-29 2021-02-15 エックスゲノムズ コーポレーション 出現（ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ）による核酸のシーケンシング
US11254980B1 (en) 2017-11-29 2022-02-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements
US11427867B2 (en) 2017-11-29 2022-08-30 Xgenomes Corp. Sequencing by emergence
WO2019108851A1 (en) 2017-11-30 2019-06-06 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation and analysis
JP2021509024A (ja) 2018-01-02 2021-03-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 多数の液滴の捕捉
US10936953B2 (en) 2018-01-04 2021-03-02 Twist Bioscience Corporation DNA-based digital information storage with sidewall electrodes
US20190237163A1 (en) 2018-01-12 2019-08-01 Life Technologies Corporation Methods for flow space quality score prediction by neural networks
EP4324962A3 (en) 2018-01-31 2024-05-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for deconvoluting partition barcodes
US20200370096A1 (en) 2018-01-31 2020-11-26 Dovetail Genomics, Llc Sample prep for dna linkage recovery
EP3752832A1 (en) 2018-02-12 2020-12-23 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
CN110184325A (zh) * 2018-02-22 2019-08-30 张家港万众一芯生物科技有限公司 基于微孔阵列芯片的单分子文库pcr扩增的基因测序方法
US11639928B2 (en) 2018-02-22 2023-05-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations
CN112368397A (zh) * 2018-03-13 2021-02-12 萨摩尔股份有限公司 用于单分子测序的方法
WO2019195346A1 (en) 2018-04-02 2019-10-10 Progenity, Inc. Methods, systems, and compositions for counting nucleic acid molecules
CN112262218A (zh) 2018-04-06 2021-01-22 10X基因组学有限公司 用于单细胞处理中的质量控制的***和方法
EP3553182A1 (en) 2018-04-11 2019-10-16 Université de Bourgogne Detection method of somatic genetic anomalies, combination of capture probes and kit of detection
CA3097583A1 (en) 2018-04-19 2019-10-24 Omniome, Inc. Improving accuracy of base calls in nucleic acid sequencing methods
CA3098296A1 (en) 2018-04-26 2019-10-31 Omniome, Inc. Methods and compositions for stabilizing nucleic acid-nucleotide-polymerase complexes
US20210239700A1 (en) 2018-05-04 2021-08-05 Abbott Laboratories Hbv diagnostic, prognostic, and therapeutic methods and products
CN108588200A (zh) * 2018-05-06 2018-09-28 湖南大地同年生物科技有限公司 一种R-Loop高通量测序文库构建方法
WO2019222706A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Twist Bioscience Corporation Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization
EP3802874A1 (en) 2018-05-31 2021-04-14 Omniome, Inc. Increased signal to noise in nucleic acid sequencing
US11814750B2 (en) 2018-05-31 2023-11-14 Personalis, Inc. Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples
US10801064B2 (en) 2018-05-31 2020-10-13 Personalis, Inc. Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples
US11180794B2 (en) 2018-05-31 2021-11-23 Omniome, Inc. Methods and compositions for capping nucleic acids
US11932899B2 (en) 2018-06-07 2024-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules
US11703427B2 (en) 2018-06-25 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for cell and bead processing
US11525159B2 (en) 2018-07-03 2022-12-13 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
AU2019312152A1 (en) 2018-07-24 2021-02-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Serial formation of ternary complex species
US20200032335A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
EP3836967A4 (en) 2018-07-30 2022-06-15 ReadCoor, LLC METHODS AND SYSTEMS FOR SAMPLE PROCESSING OR ANALYSIS
HRP20221504T1 (hr) 2018-08-08 2023-03-31 Pml Screening, Llc Postupci procjene rizika od razvoja progresivne multifokalne leukoencefalopatije uzrokovane john cunningham virusom pomoću genetskog testiranja
WO2020041293A1 (en) 2018-08-20 2020-02-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleotide sequence generation by barcode bead-colocalization in partitions
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
US20220048940A1 (en) 2018-09-28 2022-02-17 Centrillion Technology Holdings Corporation Disulfide-linked reversible terminators
AU2019364418A1 (en) 2018-10-25 2021-04-22 Illumina, Inc. Methods and compositions for identifying ligands on arrays using indexes and barcodes
WO2020101795A1 (en) 2018-11-15 2020-05-22 Omniome, Inc. Electronic detection of nucleic acid structure
EP3887545A4 (en) * 2018-11-29 2022-08-24 XGenomes Corp. COALESCENCE SEQUENCING
GB2585608B (en) 2018-12-04 2021-11-03 Omniome Inc Mixed-phase fluids for nucleic acid sequencing and other analytical assays
CA3121805A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 Octant, Inc. Systems for protein-protein interaction screening
US11459607B1 (en) 2018-12-10 2022-10-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes
WO2020120442A2 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Dna Script Direct oligonucleotide synthesis on cells and biomolecules
SG11202012558VA (en) 2018-12-19 2021-01-28 Illumina Inc Methods for improving polynucleotide cluster clonality priority
US11041199B2 (en) 2018-12-20 2021-06-22 Omniome, Inc. Temperature control for analysis of nucleic acids and other analytes
US11358137B2 (en) 2018-12-26 2022-06-14 Industrial Technology Research Institute Tubular structure for producing droplets and method for producing droplets
CN109738469A (zh) * 2018-12-29 2019-05-10 赛纳生物科技(北京)有限公司 一种fop表面微坑镀膜的致密性检测方法
US20220081714A1 (en) 2019-01-04 2022-03-17 Northwestern University Storing temporal data into dna
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11845983B1 (en) 2019-01-09 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for multiplexing of droplet based assays
EP3908678A1 (en) 2019-01-10 2021-11-17 Iovance Biotherapeutics, Inc. System and methods for monitoring adoptive cell therapy clonality and persistence
MX2021009482A (es) * 2019-02-11 2021-11-12 Ultima Genomics Inc Metodos para el analisis de acidos nucleicos.
US11467153B2 (en) 2019-02-12 2022-10-11 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
US11851683B1 (en) 2019-02-12 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for selective analysis of cellular samples
SG11202108788TA (en) 2019-02-12 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods for processing nucleic acid molecules
EP3924513B1 (en) 2019-02-14 2023-04-12 Pacific Biosciences of California, Inc. Mitigating adverse impacts of detection systems on nucleic acids and other biological analytes
CN113613787B (zh) 2019-02-20 2023-06-13 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 用于检测化学和生物分析物的扫描装置和方法
US11655499B1 (en) 2019-02-25 2023-05-23 10X Genomics, Inc. Detection of sequence elements in nucleic acid molecules
SG11202109322TA (en) 2019-02-26 2021-09-29 Twist Bioscience Corp Variant nucleic acid libraries for glp1 receptor
JP2022522668A (ja) 2019-02-26 2022-04-20 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション 抗体を最適化するための変異体核酸ライブラリ
WO2020185791A1 (en) 2019-03-11 2020-09-17 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing optically tagged beads
EP3937780A4 (en) 2019-03-14 2022-12-07 InSilixa, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR TIMED FLUORESCENCE-BASED DETECTION
NL2023316B1 (en) 2019-03-21 2020-09-28 Illumina Inc Artificial intelligence-based sequencing
WO2020191387A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based base calling
NL2023312B1 (en) 2019-03-21 2020-09-28 Illumina Inc Artificial intelligence-based base calling
NL2023311B9 (en) 2019-03-21 2021-03-12 Illumina Inc Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata
US11210554B2 (en) 2019-03-21 2021-12-28 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata
NL2023310B1 (en) 2019-03-21 2020-09-28 Illumina Inc Training data generation for artificial intelligence-based sequencing
NL2023314B1 (en) 2019-03-21 2020-09-28 Illumina Inc Artificial intelligence-based quality scoring
WO2020206170A1 (en) 2019-04-02 2020-10-08 Progenity, Inc. Methods, systems, and compositions for counting nucleic acid molecules
US11989216B2 (en) 2019-04-09 2024-05-21 University Of Washington Systems and methods for providing similarity-based retrieval of information stored in DNA
CN109853047A (zh) * 2019-04-10 2019-06-07 翌圣生物科技（上海）有限公司 一种基因组dna测序文库快速构建方法及配套试剂盒
MX2021003760A (es) 2019-04-29 2021-09-21 Illumina Inc Identificacion y analisis de muestras microbianas por incubacion rapida y enriquecimiento de acido nucleico.
WO2020227382A1 (en) * 2019-05-08 2020-11-12 Qiagen Sciences, Llc Sequential sequencing methods and compositions
US11593649B2 (en) 2019-05-16 2023-02-28 Illumina, Inc. Base calling using convolutions
AU2020280104A1 (en) 2019-05-22 2022-01-20 Mission Bio, Inc. Method and apparatus for simultaneous targeted sequencing of DNA, RNA and protein
AU2020283935A1 (en) 2019-05-28 2021-12-23 Octant, Inc. Transcriptional relay system
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
WO2020252186A1 (en) 2019-06-11 2020-12-17 Omniome, Inc. Calibrated focus sensing
AU2020298294A1 (en) 2019-06-21 2022-02-17 Twist Bioscience Corporation Barcode-based nucleic acid sequence assembly
WO2021003255A1 (en) 2019-07-01 2021-01-07 Mission Bio Method and apparatus to normalize quantitative readouts in single-cell experiments
WO2021011803A1 (en) 2019-07-16 2021-01-21 Omniome, Inc. Synthetic nucleic acids having non-natural structures
US10656368B1 (en) 2019-07-24 2020-05-19 Omniome, Inc. Method and system for biological imaging using a wide field objective lens
CN110499361B (zh) * 2019-07-31 2022-11-25 齐鲁工业大学 一种末端碱基流式荧光测序微球的制备方法及应用
US20230178182A1 (en) 2019-08-19 2023-06-08 Green Cross Genome Corporation Method for detecting chromosomal abnormality by using information about distance between nucleic acid fragments
TW202124406A (zh) 2019-09-10 2021-07-01 美商歐姆尼歐美公司 核苷酸之可逆修飾
BR112021026562A2 (pt) 2019-09-20 2022-11-29 Illumina Inc Métodos e composições para identificar ligantes em arranjos com o uso de índices e códigos de barras
CN114829626A (zh) 2019-10-10 2022-07-29 1859公司 用于微流体筛选的方法和***
CN114599795A (zh) * 2019-10-18 2022-06-07 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 用于对核酸加帽的方法和组合物
CN114556480A (zh) 2019-11-07 2022-05-27 欧森纳治疗股份有限公司 肿瘤微环境的分类
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
EP4025711A2 (en) 2019-11-08 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
CN110951852B (zh) * 2019-11-25 2022-11-25 齐鲁工业大学 单碱基连续延伸流式靶向测序法
US20230028790A1 (en) 2019-11-29 2023-01-26 GC Genome Corporation Artificial intelligence-based chromosomal abnormality detection method
SG11202106899SA (en) 2019-12-23 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
JP2023511279A (ja) 2020-01-13 2023-03-17 フルーエント バイオサイエンシーズ インコーポレイテッド 単一細胞シーケンシング
US11827936B2 (en) 2020-01-13 2023-11-28 Fluent Biosciences Inc. Methods and systems for single cell gene profiling
CA3167729A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Fluent Biosciences Inc. Emulsion based drug screening
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
WO2021152586A1 (en) 2020-01-30 2021-08-05 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of analyzing microbiome, immunoglobulin profile and physiological state
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
WO2021158511A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 Omniome, Inc. Flow cells and methods for their manufacture and use
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
WO2021163637A1 (en) 2020-02-13 2021-08-19 Zymergen Inc. Metagenomic library and natural product discovery platform
US20210265018A1 (en) 2020-02-20 2021-08-26 Illumina, Inc. Knowledge Distillation and Gradient Pruning-Based Compression of Artificial Intelligence-Based Base Caller
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
EP4121016A1 (en) 2020-03-16 2023-01-25 Fluent Biosciences Inc. Multi-omic analysis in monodisperse droplets
CN111455469B (zh) * 2020-04-07 2023-08-18 深圳易倍科华生物科技有限公司 一种单链快速建库方法及建库仪器
WO2021214766A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of diagnosing viral infections and vaccines thereto
EP4242325A3 (en) 2020-04-22 2023-10-04 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
US20230183798A1 (en) 2020-05-05 2023-06-15 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for modifying polymerase-nucleic acid complexes
US11188778B1 (en) 2020-05-05 2021-11-30 Illumina, Inc. Equalization-based image processing and spatial crosstalk attenuator
US20230203592A1 (en) 2020-05-05 2023-06-29 Akershus Universitetssykehus Hf Compositions and methods for characterizing bowel cancer
US11851700B1 (en) 2020-05-13 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules
US10941453B1 (en) 2020-05-20 2021-03-09 Paragon Genomics, Inc. High throughput detection of pathogen RNA in clinical specimens
EP4153775A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
EP4153776A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
IL298097A (en) 2020-05-27 2023-01-01 Genetic Tech Limited Methods for assessing the risk of the development of an acute reaction to infection with the corona virus
EP4025692A2 (en) 2020-06-02 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
CN116249785A (zh) 2020-06-02 2023-06-09 10X基因组学有限公司 用于抗原-受体的空间转录组学
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
EP4165207A1 (en) 2020-06-10 2023-04-19 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
AU2021294334A1 (en) 2020-06-25 2023-02-02 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of DNA methylation
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
EP4179113A1 (en) 2020-07-08 2023-05-17 F. Hoffmann-La Roche AG Targeted depletion of non-target library molecules using poison primers during target capture of next-generation sequencing libraries
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
CA3200519A1 (en) * 2020-11-03 2022-05-12 Fluent Biosciences Inc. Methods and systems for detecting pathogenic microbes in a patient
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
KR20220074088A (ko) 2020-11-27 2022-06-03 주식회사 지씨지놈 인공지능 기반 암 진단 및 암 종 예측방법
AU2021409136A1 (en) 2020-12-21 2023-06-29 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
CN116997411A (zh) 2021-01-13 2023-11-03 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 使用胶体组装的表面结构化
WO2022174054A1 (en) 2021-02-13 2022-08-18 The General Hospital Corporation Methods and compositions for in situ macromolecule detection and uses thereof
AU2022227563A1 (en) 2021-02-23 2023-08-24 10X Genomics, Inc. Probe-based analysis of nucleic acids and proteins
WO2022198068A1 (en) 2021-03-18 2022-09-22 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
EP4314327A1 (en) 2021-03-22 2024-02-07 Illumina Cambridge Limited Methods for improving nucleic acid cluster clonality
WO2022208171A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 UCL Business Ltd. Methods for analyte detection
US20220336052A1 (en) * 2021-04-19 2022-10-20 University Of Utah Research Foundation Systems and methods for facilitating rapid genome sequence analysis
KR20220160806A (ko) 2021-05-28 2022-12-06 주식회사 지씨지놈 세포유리 핵산단편 말단 서열 모티프 빈도 및 크기를 이용한 암 진단 및 암 종 예측방법
WO2022265994A1 (en) 2021-06-15 2022-12-22 Illumina, Inc. Hydrogel-free surface functionalization for sequencing
US11236388B1 (en) 2021-06-17 2022-02-01 Element Biosciences, Inc. Compositions and methods for pairwise sequencing
US11859241B2 (en) 2021-06-17 2024-01-02 Element Biosciences, Inc. Compositions and methods for pairwise sequencing
CN113174388B (zh) * 2021-06-28 2021-09-10 中国农业大学 一种功能核酸纳米杆与功能核酸纳米花的制备及形貌转换方法
US11455487B1 (en) 2021-10-26 2022-09-27 Illumina Software, Inc. Intensity extraction and crosstalk attenuation using interpolation and adaptation for base calling
KR20240031968A (ko) 2021-07-19 2024-03-08 일루미나, 인코포레이티드 염기 호출에 대한 보간 및 적응을 갖는 강도 추출
GB202110479D0 (en) 2021-07-21 2021-09-01 Dnae Diagnostics Ltd Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides
GB202110485D0 (en) 2021-07-21 2021-09-01 Dnae Diagnostics Ltd Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides
WO2023002203A1 (en) 2021-07-21 2023-01-26 Dnae Diagnostics Limited Method and system comprising a cartridge for sequencing target polynucleotides
US20230116852A1 (en) 2021-07-23 2023-04-13 Illumina, Inc. Methods for preparing substrate surface for dna sequencing
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
WO2023049215A1 (en) 2021-09-22 2023-03-30 Illumina, Inc. Compressed state-based base calling
CA3234961A1 (en) 2021-10-20 2023-04-27 Illumina, Inc. Methods for capturing library dna for sequencing
WO2023081300A2 (en) * 2021-11-03 2023-05-11 Abbott Laboratories Systems and methods for sample analysis
US20230348957A1 (en) 2021-12-07 2023-11-02 Luminex Corporation Methods and compositions for nucleic acid analysis
WO2023114190A1 (en) * 2021-12-13 2023-06-22 Cz Biohub Sf, Inc. Single-cell epigenomic profiling using fluidics and hydrogels
US20230215515A1 (en) 2021-12-23 2023-07-06 Illumina Software, Inc. Facilitating secure execution of external workflows for genomic sequencing diagnostics
WO2023122363A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Illumina Software, Inc. Dynamic graphical status summaries for nucelotide sequencing
WO2023129764A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Illumina Software, Inc. Automatically switching variant analysis model versions for genomic analysis applications
WO2023135485A1 (en) 2022-01-13 2023-07-20 Oslo Universitetssykehus Hf Prostate cancer markers and uses thereof
WO2023141154A1 (en) 2022-01-20 2023-07-27 Illumina Cambridge Limited Methods of detecting methylcytosine and hydroxymethylcytosine by sequencing
WO2023152568A2 (en) 2022-02-10 2023-08-17 Oslo Universitetssykehus Hf Compositions and methods for characterizing lung cancer
AU2023234670A1 (en) * 2022-03-15 2024-01-18 Illumina, Inc. Concurrent sequencing of forward and reverse complement strands on separate polynucleotides for methylation detection
WO2023183937A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Illumina, Inc. Sequence-to-sequence base calling
CN114592023B (zh) * 2022-03-31 2023-03-24 杭州优玛达生物科技有限公司 一种细胞裂解自组装多肽复合物、自组装方法、自组装多肽制剂及应用
EP4253550A1 (en) 2022-04-01 2023-10-04 GenCC GmbH 6 Co. KG Method for the manufacture of a viral system, a vector system or any transport system for cancer-specific crispr complexes
US11680293B1 (en) 2022-04-21 2023-06-20 Paragon Genomics, Inc. Methods and compositions for amplifying DNA and generating DNA sequencing results from target-enriched DNA molecules
US20230392201A1 (en) 2022-06-06 2023-12-07 Element Biosciences, Inc. Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations
WO2023239917A1 (en) 2022-06-09 2023-12-14 Illumina, Inc. Dependence of base calling on flow cell tilt
WO2024050450A1 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Gigamune, Inc. Engineered enveloped vectors and methods of use thereof
US20240133892A1 (en) 2022-09-27 2024-04-25 Nautilus Subsidiary, Inc. Polypeptide capture, in situ fragmentation and identification

Family Cites Families (235)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4175054A (en) 1976-11-11 1979-11-20 Petrolite Corporation Use of hydrocarbon polymers in demulsification
US5821058A (en) * 1984-01-16 1998-10-13 California Institute Of Technology Automated DNA sequencing technique
US5171534A (en) * 1984-01-16 1992-12-15 California Institute Of Technology Automated DNA sequencing technique
US4965188A (en) * 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4801529A (en) 1985-06-18 1989-01-31 Brandeis University Methods for isolating mutant microoganisms using microcapsules coated with indicator material
US4863849A (en) 1985-07-18 1989-09-05 New York Medical College Automatable process for sequencing nucleotide
US4811218A (en) * 1986-06-02 1989-03-07 Applied Biosystems, Inc. Real time scanning electrophoresis apparatus for DNA sequencing
US5252494A (en) * 1986-06-25 1993-10-12 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensors, apparatus, and detection methods using controlled release polymers and reagent formulations held within a polymeric reaction matrix
US5143853A (en) * 1986-06-25 1992-09-01 Trustees Of Tufts College Absorbance modulated fluorescence detection methods and sensors
US5254477A (en) * 1986-06-25 1993-10-19 Trustees Of Tufts College Flourescence intramolecular energy transfer conjugate compositions and detection methods
US4822746A (en) * 1986-06-25 1989-04-18 Trustees Of Tufts College Radiative and non-radiative energy transfer and absorbance modulated fluorescence detection methods and sensors
US4994372A (en) * 1987-01-14 1991-02-19 President And Fellows Of Harvard College DNA sequencing
US5525464A (en) * 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
IL86724A (en) 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
JP2846018B2 (ja) 1988-01-21 1999-01-13 ジェネンテク，インコーポレイテッド 核酸配列の増幅および検出
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
GB8810400D0 (en) 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
SE8801070D0 (sv) 1988-03-23 1988-03-23 Pharmacia Ab Method for immobilizing a dna sequence on a solid support
US4971903A (en) * 1988-03-25 1990-11-20 Edward Hyman Pyrophosphate-based method and apparatus for sequencing nucleic acids
JPH03503845A (ja) 1988-04-22 1991-08-29 マサチユセツツ・インスチチユート・オブ・テクノロジー 微小滴を形成しそして使用する方法
US5225332A (en) 1988-04-22 1993-07-06 Massachusetts Institute Of Technology Process for manipulation of non-aqueous surrounded microdroplets
US6054270A (en) * 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
US5700637A (en) * 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
GB8822228D0 (en) * 1988-09-21 1988-10-26 Southern E M Support-bound oligonucleotides
US5512439A (en) * 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US4938876A (en) 1989-03-02 1990-07-03 Ohsol Ernest O Method for separating oil and water emulsions
US5629158A (en) * 1989-03-22 1997-05-13 Cemu Bitecknik Ab Solid phase diagnosis of medical conditions
EP0392546A3 (en) 1989-04-14 1991-09-11 Ro Institut Za Molekularnu Genetiku I Geneticko Inzenjerstvo Process for determination of a complete or a partial contents of very short sequences in the samples of nucleic acids connected to the discrete particles of microscopic size by hybridization with oligonucleotide probes
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5871928A (en) * 1989-06-07 1999-02-16 Fodor; Stephen P. A. Methods for nucleic acid analysis
US5744101A (en) * 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5302509A (en) * 1989-08-14 1994-04-12 Beckman Instruments, Inc. Method for sequencing polynucleotides
US5545522A (en) * 1989-09-22 1996-08-13 Van Gelder; Russell N. Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex
KR0185192B1 (ko) 1989-10-05 1999-04-01 제임스 더블유. 데이비 신규의 유전자 및 폴리펩티드의 무세포 합성 및 분리
WO1991012342A1 (en) * 1990-02-16 1991-08-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Improvements in the specificity and convenience of the polymerase chain reaction
CA2036946C (en) * 1990-04-06 2001-10-16 Kenneth V. Deugau Indexing linkers
JPH04223A (ja) * 1990-04-16 1992-01-06 Toshiba Corp 無線電話装置、その充電方法および無線電話充電システム
DK0552290T3 (da) * 1990-10-11 2000-05-29 Advanced Res & Tech Inst Fremgangsmåde og apparat til fragmentering af biologiske materialer
US5506100A (en) * 1990-10-11 1996-04-09 Indiana University Foundation Process and apparatus for fragmenting biomaterials
US5244636A (en) * 1991-01-25 1993-09-14 Trustees Of Tufts College Imaging fiber optic array sensors, apparatus, and methods for concurrently detecting multiple analytes of interest in a fluid sample
US5320814A (en) * 1991-01-25 1994-06-14 Trustees Of Tufts College Fiber optic array sensors, apparatus, and methods for concurrently visualizing and chemically detecting multiple analytes of interest in a fluid sample
US5250264A (en) * 1991-01-25 1993-10-05 Trustees Of Tufts College Method of making imaging fiber optic sensors to concurrently detect multiple analytes of interest in a fluid sample
US5114984A (en) * 1991-04-26 1992-05-19 Olin Corporation Process for producing an antimicrobially effective polyurethane
WO1993003151A1 (en) † 1991-08-10 1993-02-18 Medical Research Council Treatment of cell populations
US5474796A (en) 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
WO1993005183A1 (en) * 1991-09-09 1993-03-18 Baylor College Of Medicine Method and device for rapid dna or rna sequencing determination by a base addition sequencing scheme
WO1993006239A1 (en) * 1991-09-24 1993-04-01 Keygene N.V. Selective restriction fragment amplification: a general method for dna fingerprinting
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
EP0916396B1 (en) * 1991-11-22 2005-04-13 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) Combinatorial strategies for polymer synthesis
US5445971A (en) * 1992-03-20 1995-08-29 Abbott Laboratories Magnetically assisted binding assays using magnetically labeled binding members
GB9208733D0 (en) 1992-04-22 1992-06-10 Medical Res Council Dna sequencing method
GB9210176D0 (en) * 1992-05-12 1992-06-24 Cemu Bioteknik Ab Chemical method
DE4223169C1 (de) 1992-07-10 1993-11-25 Ferring Arzneimittel Gmbh Verfahren zur Mikroverkapselung wasserlöslicher Wirkstoffe
GB9214873D0 (en) * 1992-07-13 1992-08-26 Medical Res Council Process for categorising nucleotide sequence populations
US6114114A (en) * 1992-07-17 2000-09-05 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Comparative gene transcript analysis
RU2048522C1 (ru) 1992-10-14 1995-11-20 Институт белка РАН Способ размножения нуклеиновых кислот, способ их экспрессии и среда для их осуществления
US5436143A (en) * 1992-12-23 1995-07-25 Hyman; Edward D. Method for enzymatic synthesis of oligonucleotides
IL104384A (en) 1993-01-13 1996-11-14 Yeda Res & Dev Method for screening catalytic non-enzyme polypeptides and proteins
US5298741A (en) * 1993-01-13 1994-03-29 Trustees Of Tufts College Thin film fiber optic sensor array and apparatus for concurrent viewing and chemical sensing of a sample
CA2155186A1 (en) 1993-02-01 1994-08-18 Kevin M. Ulmer Methods and apparatus for dna sequencing
US5436149A (en) 1993-02-19 1995-07-25 Barnes; Wayne M. Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension
US5714320A (en) 1993-04-15 1998-02-03 University Of Rochester Rolling circle synthesis of oligonucleotides and amplification of select randomized circular oligonucleotides
AU6707194A (en) 1993-04-19 1994-11-08 Medisorb Technologies International L.P. Encapsulation of nucleic acids with conjugates that facilitate and target cellular uptake and gene expression
AU6815894A (en) 1993-04-19 1994-11-08 Stuart A. Kauffman Random chemistry for the generation of new compounds
GB9315847D0 (en) * 1993-07-30 1993-09-15 Isis Innovation Tag reagent and assay method
US5482845A (en) * 1993-09-24 1996-01-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for construction of normalized cDNA libraries
ATE424927T1 (de) * 1993-10-28 2009-03-15 Houston Advanced Res Ct Mikrofabriziertes poröses durchflussgerät zur diskreten bestimmung von bindungsreaktionen
US5429807A (en) * 1993-10-28 1995-07-04 Beckman Instruments, Inc. Method and apparatus for creating biopolymer arrays on a solid support surface
AU8124694A (en) 1993-10-29 1995-05-22 Affymax Technologies N.V. In vitro peptide and antibody display libraries
GB9401833D0 (en) * 1994-02-01 1994-03-30 Isis Innovation Method for discovering ligands
US5928905A (en) * 1995-04-18 1999-07-27 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5834252A (en) * 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
AU710504B2 (en) 1994-03-15 1999-09-23 Brown University Research Foundation Polymeric gene delivery system
WO1995025538A1 (en) * 1994-03-18 1995-09-28 The General Hospital Corporation Cleaved amplified rflp detection methods
JP2556293B2 (ja) * 1994-06-09 1996-11-20 日本電気株式会社 Ｍｏｓ ｏｔａ
US5512490A (en) * 1994-08-11 1996-04-30 Trustees Of Tufts College Optical sensor, optical sensing apparatus, and methods for detecting an analyte of interest using spectral recognition patterns
US5604097A (en) * 1994-10-13 1997-02-18 Spectragen, Inc. Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
US6013445A (en) * 1996-06-06 2000-01-11 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
US5695934A (en) * 1994-10-13 1997-12-09 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides
US5795716A (en) * 1994-10-21 1998-08-18 Chee; Mark S. Computer-aided visualization and analysis system for sequence evaluation
FR2726286B1 (fr) 1994-10-28 1997-01-17 Genset Sa Procede d'amplification d'acides nucleiques en phase solide et trousse de reactifs utile pour la mise en oeuvre de ce procede
US5919673A (en) * 1995-03-22 1999-07-06 The Scripps Research Institute One-pot enzymatic sulfation process using 3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate and recycled phosphorylated adenosine intermediates
EP0735144B1 (en) * 1995-03-28 2002-06-05 Japan Science and Technology Corporation Method for molecular indexing of genes using restriction enzymes
GB9507238D0 (en) * 1995-04-07 1995-05-31 Isis Innovation Detecting dna sequence variations
US5750341A (en) * 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
KR19990008000A (ko) 1995-04-24 1999-01-25 로버트 에스. 화이트 헤드 새로운 대사 경로를 만들고 이를 스크리닝하는 방법
US5648245A (en) * 1995-05-09 1997-07-15 Carnegie Institution Of Washington Method for constructing an oligonucleotide concatamer library by rolling circle replication
DE19518505A1 (de) * 1995-05-19 1996-11-21 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur Genexpressionsanalyse
US5690894A (en) * 1995-05-23 1997-11-25 The Regents Of The University Of California High density array fabrication and readout method for a fiber optic biosensor
US5910408A (en) 1995-06-07 1999-06-08 The General Hospital Corporation Catalytic DNA having ligase activity
US5814444A (en) * 1995-06-07 1998-09-29 University Of Washington Methods for making and using single-chromosome amplfication libraries
US5989892A (en) 1995-06-14 1999-11-23 Tonen Corporation Microorganisms, demulsifiers and processes for breaking an emulsion
US5728529A (en) * 1995-06-23 1998-03-17 Baylor College Of Medicine Alternative dye-labeled ribonucleotides, deoxyribonucleotides, and dideoxyribonucleotides for automated DNA analysis
US6200737B1 (en) * 1995-08-24 2001-03-13 Trustees Of Tufts College Photodeposition method for fabricating a three-dimensional, patterned polymer microstructure
US5843655A (en) * 1995-09-18 1998-12-01 Affymetrix, Inc. Methods for testing oligonucleotide arrays
US5871697A (en) * 1995-10-24 1999-02-16 Curagen Corporation Method and apparatus for identifying, classifying, or quantifying DNA sequences in a sample without sequencing
DE19646372C1 (de) 1995-11-11 1997-06-19 Evotec Biosystems Gmbh Genotyp und Phänotyp koppelnde Verbindung
US5780231A (en) * 1995-11-17 1998-07-14 Lynx Therapeutics, Inc. DNA extension and analysis with rolling primers
US5962228A (en) * 1995-11-17 1999-10-05 Lynx Therapeutics, Inc. DNA extension and analysis with rolling primers
DK0862656T3 (da) 1995-11-21 2001-04-09 Univ Yale Unimolekylær segmentamplifikation og -detektering
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US5633972A (en) * 1995-11-29 1997-05-27 Trustees Of Tufts College Superresolution imaging fiber for subwavelength light energy generation and near-field optical microscopy
US5814524A (en) * 1995-12-14 1998-09-29 Trustees Of Tufts College Optical sensor apparatus for far-field viewing and making optical analytical measurements at remote locations
US5851772A (en) * 1996-01-29 1998-12-22 University Of Chicago Microchip method for the enrichment of specific DNA sequences
WO1997029211A1 (en) * 1996-02-09 1997-08-14 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services RESTRICTION DISPLAY (RD-PCR) OF DIFFERENTIALLY EXPRESSED mRNAs
AU2069597A (en) * 1996-03-04 1997-09-22 Genetrace Systems, Inc. Methods of screening nucleic acids using mass spectrometry
GB9608540D0 (en) * 1996-04-25 1996-07-03 Medical Res Council Isolation of enzymes
US5770637A (en) * 1996-05-01 1998-06-23 Johnson & Johnson Vision Products, Inc. Anti-bacterial, UV absorbable, tinted, metal-chelating polymers
US6022688A (en) * 1996-05-13 2000-02-08 Sequenom, Inc. Method for dissociating biotin complexes
US5846727A (en) * 1996-06-06 1998-12-08 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural & Mechanical College Microsystem for rapid DNA sequencing
CZ397998A3 (cs) * 1996-06-06 1999-07-14 Lynx Therapeutics, Inc. Způsob sekvenční analýzy ligací kódovaného adaptoru
US6083693A (en) 1996-06-14 2000-07-04 Curagen Corporation Identification and comparison of protein-protein interactions that occur in populations
US5916524A (en) 1997-07-23 1999-06-29 Bio-Dot, Inc. Dispensing apparatus having improved dynamic range
US5846721A (en) * 1996-09-19 1998-12-08 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Efficient and simpler method to construct normalized cDNA libraries with improved representations of full-length cDNAs
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
WO1998013502A2 (en) 1996-09-27 1998-04-02 Icos Corporation Method to identify compounds for disrupting protein/protein interactions
US6124092A (en) 1996-10-04 2000-09-26 The Perkin-Elmer Corporation Multiplex polynucleotide capture methods and compositions
US5900481A (en) * 1996-11-06 1999-05-04 Sequenom, Inc. Bead linkers for immobilizing nucleic acids to solid supports
US6133436A (en) * 1996-11-06 2000-10-17 Sequenom, Inc. Beads bound to a solid support and to nucleic acids
US6887665B2 (en) * 1996-11-14 2005-05-03 Affymetrix, Inc. Methods of array synthesis
DE19648372A1 (de) 1996-11-22 1998-05-28 Serck Como Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Eindampfen von Abwässern
US6395524B2 (en) 1996-11-27 2002-05-28 University Of Washington Thermostable polymerases having altered fidelity and method of identifying and using same
US6310354B1 (en) 1996-12-03 2001-10-30 Erkki Soini Method and a device for monitoring nucleic acid amplification reactions
US6060245A (en) * 1996-12-13 2000-05-09 Stratagene Methods and adaptors for generating specific nucleic acid populations
US20020172965A1 (en) * 1996-12-13 2002-11-21 Arcaris, Inc. Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom
GB9626815D0 (en) 1996-12-23 1997-02-12 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
EP1712623B1 (en) 1997-01-21 2011-10-19 The General Hospital Corporation Selection of proteins using RNA-protein fusions
US6136543A (en) * 1997-01-31 2000-10-24 Hitachi, Ltd. Method for determining nucleic acids base sequence and apparatus therefor
CA2196496A1 (en) 1997-01-31 1998-07-31 Stephen William Watson Michnick Protein fragment complementation assay for the detection of protein-protein interactions
ATE273381T1 (de) * 1997-02-12 2004-08-15 Eugene Y Chan Verfahren zur analyse von polymeren
GB9703369D0 (en) 1997-02-18 1997-04-09 Lindqvist Bjorn H Process
US5994068A (en) * 1997-03-11 1999-11-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Nucleic acid indexing
US6023540A (en) * 1997-03-14 2000-02-08 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensor with encoded microspheres
AU6571598A (en) 1997-03-18 1998-10-12 Chromaxome Corporation Methods for screening compounds using encapsulated cells
US5891477A (en) 1997-03-28 1999-04-06 Biohybrid Technologies, Inc. Non-steroidal anti-inflammatory agents inhibition of fibrotic response to an implanted device
AU6846698A (en) * 1997-04-01 1998-10-22 Glaxo Group Limited Method of nucleic acid amplification
ATE269908T1 (de) 1997-04-01 2004-07-15 Manteia S A Methode zur sequenzierung von nukleinsäuren
US6143496A (en) 1997-04-17 2000-11-07 Cytonix Corporation Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly
US6406845B1 (en) 1997-05-05 2002-06-18 Trustees Of Tuft College Fiber optic biosensor for selectively detecting oligonucleotide species in a mixed fluid sample
EP1138764A3 (en) * 1997-05-13 2001-10-24 Azign Bioscience A/S Two-step reverse transcription
DE69826697T2 (de) 1997-07-07 2006-02-16 Medical Research Council In vitro selektionsmethode
JP3610231B2 (ja) * 1997-08-01 2005-01-12 キヤノン株式会社 反応場アレー、反応場アレーの製造方法、反応場アレーを用いた反応方法及び反応場アレーを用いた試料溶液中の物質の定量方法
EP0895083B1 (en) 1997-08-01 2009-09-23 Canon Kabushiki Kaisha Reaction site array, preparation of it, reaction process using it and quantitative determination method of substance in sample solution using it
US5961228A (en) * 1997-08-22 1999-10-05 Paxar Corporation Modular printer
US20010006630A1 (en) * 1997-09-02 2001-07-05 Oron Yacoby-Zeevi Introducing a biological material into a patient
US6087099A (en) * 1997-09-08 2000-07-11 Myriad Genetics, Inc. Method for sequencing both strands of a double stranded DNA in a single sequencing reaction
US6475722B1 (en) 1997-12-03 2002-11-05 Curagen Corporation Surface treatments for DNA processing devices
NL1007781C2 (nl) 1997-12-12 1999-06-15 Packard Instr Bv Microtiterplaat.
DE69822206T2 (de) 1997-12-19 2005-02-17 Affymetrix, Inc., Santa Clara Erkenntnisse der genomforschung für die suche nach neuartigen wirkstoffen
ATE506449T1 (de) 1997-12-22 2011-05-15 Hitachi Chemical Co Ltd Direkte rt-pcr auf oligonukleotid-immobilisierten pcr-mikroplatten
KR100280219B1 (ko) * 1998-02-26 2001-04-02 이수빈 삼핵산 반복 서열을 이용한 신경정신 질환의 진단 방법 및 진단 시약
US5882874A (en) * 1998-02-27 1999-03-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Reciprocal subtraction differential display
US6210910B1 (en) * 1998-03-02 2001-04-03 Trustees Of Tufts College Optical fiber biosensor array comprising cell populations confined to microcavities
US6378527B1 (en) 1998-04-08 2002-04-30 Chondros, Inc. Cell-culture and polymer constructs
WO1999055886A1 (en) * 1998-04-24 1999-11-04 Genova Pharmaceuticals Corporation Function-based gene discovery
JP2981547B1 (ja) 1998-07-02 1999-11-22 農林水産省食品総合研究所長 クロスフロー型マイクロチャネル装置及び同装置を用いたエマルションの生成または分離方法
WO2000004139A1 (en) 1998-07-17 2000-01-27 Mirus Corporation Micellar systems
US6210896B1 (en) * 1998-08-13 2001-04-03 Us Genomics Molecular motors
US6263286B1 (en) * 1998-08-13 2001-07-17 U.S. Genomics, Inc. Methods of analyzing polymers using a spatial network of fluorophores and fluorescence resonance energy transfer
GB9820185D0 (en) 1998-09-15 1998-11-11 Dynal As Method
US6287825B1 (en) * 1998-09-18 2001-09-11 Molecular Staging Inc. Methods for reducing the complexity of DNA sequences
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
US6203989B1 (en) * 1998-09-30 2001-03-20 Affymetrix, Inc. Methods and compositions for amplifying detectable signals in specific binding assays
AU2595300A (en) * 1998-12-31 2000-07-31 City Of Hope Method for detecting mutations in nucleic acids
GB9900298D0 (en) * 1999-01-07 1999-02-24 Medical Res Council Optical sorting method
US20020150909A1 (en) 1999-02-09 2002-10-17 Stuelpnagel John R. Automated information processing in randomly ordered arrays
EP1157131A2 (en) * 1999-02-22 2001-11-28 Lynx Therapeutics, Inc. Polymorphic dna fragments and uses thereof
US6255476B1 (en) * 1999-02-22 2001-07-03 Pe Corporation (Ny) Methods and compositions for synthesis of labelled oligonucleotides and analogs on solid-supports
US6225061B1 (en) * 1999-03-10 2001-05-01 Sequenom, Inc. Systems and methods for performing reactions in an unsealed environment
DK1159453T3 (da) * 1999-03-10 2008-10-06 Asm Scient Inc Fremgangsmåde til direkte nukleinsyresekventering
US7371851B1 (en) * 1999-03-18 2008-05-13 Complete Genomics As Methods of cloning and producing fragment chains with readable information content
US6506594B1 (en) 1999-03-19 2003-01-14 Cornell Res Foundation Inc Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
GB9907812D0 (en) 1999-04-06 1999-06-02 Medical Biosystems Ltd Sequencing
US6284465B1 (en) * 1999-04-15 2001-09-04 Agilent Technologies, Inc. Apparatus, systems and method for locating nucleic acids bound to surfaces
ATE413467T1 (de) 1999-04-20 2008-11-15 Illumina Inc Detektion von nukleinsäurereaktionen auf kügelchen-arrays
US20030108867A1 (en) * 1999-04-20 2003-06-12 Chee Mark S Nucleic acid sequencing using microsphere arrays
US6355431B1 (en) * 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
US6221653B1 (en) * 1999-04-27 2001-04-24 Agilent Technologies, Inc. Method of performing array-based hybridization assays using thermal inkjet deposition of sample fluids
CA2374390A1 (en) 1999-05-20 2000-12-14 Illumina, Inc. Combinatorial decoding of random nucleic acid arrays
US20020051971A1 (en) * 1999-05-21 2002-05-02 John R. Stuelpnagel Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
US6300070B1 (en) * 1999-06-04 2001-10-09 Mosaic Technologies, Inc. Solid phase methods for amplifying multiple nucleic acids
US6340589B1 (en) 1999-07-23 2002-01-22 Mj Research, Inc. Thin-well microplate and methods of making same
GB9921155D0 (en) 1999-09-08 1999-11-10 Medical Res Council Selection system
US7211390B2 (en) 1999-09-16 2007-05-01 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US6274320B1 (en) 1999-09-16 2001-08-14 Curagen Corporation Method of sequencing a nucleic acid
WO2001046471A1 (en) 1999-12-21 2001-06-28 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Expression of proteins from amplified, immobilized nucleic acids
AU2282801A (en) * 1999-12-29 2001-07-09 Mergen Ltd. Methods for amplifying and detecting multiple polynucleotides on a solid phase support
JP2003535576A (ja) 2000-01-20 2003-12-02 ロゼッタ・インファーマティクス・インコーポレーテッド 薬物標的を同定するためのバーコード化された合成的致死スクリーニング
ATE360095T1 (de) 2000-02-07 2007-05-15 Illumina Inc Nukleinsäure nachweisverfahren mit universellem priming
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US6714874B1 (en) 2000-03-15 2004-03-30 Applera Corporation Method and system for the assembly of a whole genome using a shot-gun data set
JP3442338B2 (ja) * 2000-03-17 2003-09-02 株式会社日立製作所 Ｄｎａ分析装置、ｄｎａ塩基配列決定装置、ｄｎａ塩基配列決定方法、および反応モジュール
CN1189159C (zh) 2000-05-05 2005-02-16 欧莱雅 含水溶性美容活性组分水性核的微胶囊及含其的组合物
US6475736B1 (en) * 2000-05-23 2002-11-05 Variagenics, Inc. Methods for genetic analysis of DNA using biased amplification of polymorphic sites
US6808874B2 (en) 2000-06-13 2004-10-26 Cyclacel Ltd. Methods of monitoring enzyme activity
CA2419058A1 (en) 2000-08-09 2002-02-14 Illumina, Inc. Automated information processing in randomly ordered arrays
GB0021977D0 (en) 2000-09-07 2000-10-25 Pyrosequencing Ab Method of sequencing DNA
GB0022069D0 (en) 2000-09-08 2000-10-25 Pyrosequencing Ab Method
GB0022458D0 (en) 2000-09-13 2000-11-01 Medical Res Council Directed evolution method
WO2002027029A2 (en) * 2000-09-27 2002-04-04 Lynx Therapeutics, Inc. Method for determining relative abundance of nucleic acid sequences
US6632610B2 (en) 2000-10-12 2003-10-14 Gensat S.A. Methods of identification and isolation of polynucleotides containing nucleic acid differences
US20020172980A1 (en) * 2000-11-27 2002-11-21 Phan Brigitte Chau Methods for decreasing non-specific binding of beads in dual bead assays including related optical biodiscs and disc drive systems
JP2002257070A (ja) 2001-02-28 2002-09-11 Toyota Industries Corp 真空ポンプにおける軸封構造
US6936264B2 (en) 2001-03-05 2005-08-30 The Procter & Gamble Company Delivery of reactive agents via multiple emulsions for use in shelf stable products
US6996287B1 (en) 2001-04-20 2006-02-07 Adobe Systems, Inc. Method and apparatus for texture cloning
GB0114856D0 (en) 2001-06-18 2001-08-08 Medical Res Council Selection by avidity capture
GB0114854D0 (en) * 2001-06-18 2001-08-08 Medical Res Council Selective gene amplification
WO2003004690A2 (en) * 2001-07-06 2003-01-16 454$m(3) CORPORATION Method for isolation of independent, parallel chemical micro-reactions using a porous filter
US20030064400A1 (en) 2001-08-24 2003-04-03 Li-Cor, Inc. Microfluidics system for single molecule DNA sequencing
US6956114B2 (en) 2001-10-30 2005-10-18 '454 Corporation Sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase
US6902921B2 (en) 2001-10-30 2005-06-07 454 Corporation Sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase
GB0127564D0 (en) 2001-11-16 2002-01-09 Medical Res Council Emulsion compositions
US20030165935A1 (en) 2001-11-21 2003-09-04 Vann Charles S. Digital assay
US7198897B2 (en) * 2001-12-19 2007-04-03 Brandeis University Late-PCR
EP1495137B1 (en) * 2002-04-04 2005-09-14 Biotage AB Primer extension based method employing nucleotides labelled via cleavable linkers
AU2003302770B2 (en) 2002-12-20 2007-07-12 Caliper Life Sciences, Inc. Single molecule amplification and detection of DNA
EP1583831A2 (en) * 2003-01-15 2005-10-12 Wyeth Novel high throughput method of generating and purifying labeled crna targets for gene expression analysis
US7575865B2 (en) 2003-01-29 2009-08-18 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
WO2004069849A2 (en) 2003-01-29 2004-08-19 454 Corporation Bead emulsion nucleic acid amplification
US8150627B2 (en) 2003-05-15 2012-04-03 Illumina, Inc. Methods and compositions for diagnosing lung cancer with specific DNA methylation patterns
JP5183063B2 (ja) * 2003-07-05 2013-04-17 ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティ 遺伝的変異の検出および列挙のための方法ならびに組成物
CA2553833C (en) 2004-01-28 2012-10-02 454 Corporation Nucleic acid amplification with continuous flow emulsion
US7682816B2 (en) 2005-04-07 2010-03-23 454 Life Sciences Corporation Thin film coated microwell arrays and methods of using same
US7785862B2 (en) 2005-04-07 2010-08-31 454 Life Sciences Corporation Thin film coated microwell arrays
WO2007145612A1 (en) 2005-06-06 2007-12-21 454 Life Sciences Corporation Paired end sequencing
US8301394B2 (en) 2006-02-16 2012-10-30 454 Life Sciences Corporation System and method for correcting primer extension errors in nucleic acid sequence data
US8364417B2 (en) 2007-02-15 2013-01-29 454 Life Sciences Corporation System and method to correct out of phase errors in DNA sequencing data by use of a recursive algorithm
EP2038427A4 (en) 2006-06-19 2010-07-07 Univ Johns Hopkins SINGLE MOLECULE PCR ON MICROPARTICLES IN WATER-IN-OIL EMULSIONS
US7585865B2 (en) 2006-07-21 2009-09-08 The Penn State Research Foundation Protein kinase C zeta inhibition to treat vascular permeability
JP2010521156A (ja) 2007-03-16 2010-06-24 ４５４ ライフ サイエンシーズ コーポレイション Ｈｉｖ薬物耐性バリアントの検出のためのシステムおよび方法
EP3404009B1 (en) 2017-05-16 2019-12-25 Arkema France Method for manufacturing 1,4-bis(4-phenoxybenzoyl)benzene in supersaturation conditions

Also Published As

Publication number Publication date
CA2513899C (en) 2013-03-26
EP2261372B1 (en) 2012-08-22
EP1997889A2 (en) 2008-12-03
EP2159285B1 (en) 2012-09-26
ES2342665T3 (es) 2010-07-12
CA2513899A1 (en) 2005-01-13
US8790876B2 (en) 2014-07-29
EP1594980B2 (en) 2017-08-16
US10240192B2 (en) 2019-03-26
JP4480715B2 (ja) 2010-06-16
AU2004254552A1 (en) 2005-01-13
EP2159285A2 (en) 2010-03-03
EP1594950A2 (en) 2005-11-16
JP2007525151A (ja) 2007-09-06
US20120238475A1 (en) 2012-09-20
EP2145955A2 (en) 2010-01-20
EP2261372A3 (en) 2011-04-06
CA2727850C (en) 2013-04-30
US7323305B2 (en) 2008-01-29
EP1594981B1 (en) 2010-03-17
US8012690B2 (en) 2011-09-06
CA2728746A1 (en) 2005-01-13
EP2145955B1 (en) 2012-02-22
ATE461291T1 (de) 2010-04-15
JP2013066475A (ja) 2013-04-18
EP1590477B1 (en) 2009-07-29
WO2005003375A3 (en) 2007-08-23
JP2012231799A (ja) 2012-11-29
ATE448302T1 (de) 2009-11-15
WO2004070005A2 (en) 2004-08-19
EP1997889A3 (en) 2009-09-23
AU2004209001A1 (en) 2004-08-19
AU2004254552B2 (en) 2008-04-24
US20160298175A1 (en) 2016-10-13
US20050130173A1 (en) 2005-06-16
WO2004069849A2 (en) 2004-08-19
ES2380893T3 (es) 2012-05-21
EP1594981A4 (en) 2008-03-05
WO2004070007A3 (en) 2005-12-22
CN101128601B (zh) 2011-06-08
EP1594950A4 (en) 2007-07-25
US20130078638A1 (en) 2013-03-28
CA2513535A1 (en) 2004-08-19
CA2727850A1 (en) 2005-01-13
AU2004209416A1 (en) 2004-08-19
EP1590477A4 (en) 2008-04-09
EP2261372A2 (en) 2010-12-15
JP2006515522A (ja) 2006-06-01
DE602004036672C5 (de) 2012-11-29
US20190203263A1 (en) 2019-07-04
US8765380B2 (en) 2014-07-01
JP2007523627A (ja) 2007-08-23
EP2145955A3 (en) 2011-03-30
JP5495399B2 (ja) 2014-05-21
US20110201526A1 (en) 2011-08-18
CN102212614A (zh) 2011-10-12
US7842457B2 (en) 2010-11-30
JP4473878B2 (ja) 2010-06-02
JP2010178744A (ja) 2010-08-19
US20040185484A1 (en) 2004-09-23
EP1590477A2 (en) 2005-11-02
WO2004069849A3 (en) 2005-03-24
JP4768598B2 (ja) 2011-09-07
US20150099672A1 (en) 2015-04-09
ATE437945T1 (de) 2009-08-15
AU2004209416B2 (en) 2007-08-02
ATE546525T1 (de) 2012-03-15
ES2330339T3 (es) 2009-12-09
US8748102B2 (en) 2014-06-10
CA2728746C (en) 2018-01-16
ES2338654T5 (es) 2017-12-11
WO2004069849A8 (en) 2007-04-19
ES2396245T3 (es) 2013-02-20
DE602004024034D1 (de) 2009-12-24
AU2004209001B2 (en) 2007-10-11
US20090011959A1 (en) 2009-01-08
EP2159285A3 (en) 2011-06-29
WO2004070005B1 (en) 2005-01-20
WO2004070007A2 (en) 2004-08-19
US20090048124A1 (en) 2009-02-19
JP5726155B2 (ja) 2015-05-27
US20060134633A1 (en) 2006-06-22
US20110009275A1 (en) 2011-01-13
AU2004209426A1 (en) 2004-08-19
US20050079510A1 (en) 2005-04-14
EP1594981A2 (en) 2005-11-16
US10982274B2 (en) 2021-04-20
CA2513541A1 (en) 2004-08-19
EP1594980A2 (en) 2005-11-16
WO2005003375A2 (en) 2005-01-13
US20140162885A1 (en) 2014-06-12
US8158359B2 (en) 2012-04-17
CA2513889A1 (en) 2004-08-19
EP1594980B1 (en) 2009-11-11
EP1594980A4 (en) 2007-05-02
AU2004209426B2 (en) 2008-04-17
US7244567B2 (en) 2007-07-17
DE602004022253D1 (de) 2009-09-10
JP2010142233A (ja) 2010-07-01
US20080132693A1 (en) 2008-06-05
CN102212614B (zh) 2013-12-25
DE602004026033D1 (de) 2010-04-29
CA2513535C (en) 2012-06-12
CN101128601A (zh) 2008-02-20
WO2004070005A3 (en) 2004-11-11
JP5258822B2 (ja) 2013-08-07
JP2013090635A (ja) 2013-05-16
JP2007535892A (ja) 2007-12-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2338654T3 (es) Amplificacion de acidos nucleicos mediante emulsion de perlas.
ES2206485T3 (es) Aislamiento del acido nucleico.
US20130109576A1 (en) Methods for detecting mutations
EP2644699A1 (en) Amplified nucleic acid detection method and detection device
ES2743453T3 (es) Métodos de enriquecimiento de analito
CN105772122A (zh) 用于在管内操作对象成分的器件和方法
ES2355899T3 (es) Procedimientos, kits y dispositivos de tratamiento de ácidos nucleicos.
WO2010054000A1 (en) Methods, flow cells and systems for single cell analysis
ES2291199T3 (es) Medio cubierto por fta para uso como herramienta de diagnostico molecular.
AU2008200151B2 (en) Bead Emulsion Nucleic Acid Amplification
CA2773059C (en) Bead emulsion nucleic acid amplification