JP7057348B2 - 蛍光in situ配列決定を用いた単一アッセイに生体分子の検出を組み合わせる方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年8月31日に出願された米国仮特許出願第62/381,997号の利益を主張し、この出願はその全体が参照により本明細書に援用される。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所(National Institutes of Health)により授与された助成金番号P50HG005550及びRM1 HG008525及びアメリカ国立科学財団(National Science Foundation)により授与された助成金番号DGE1144152の下での政府の支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
本明細書で言及された全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、又は特許出願が具体的かつ個別に参照により援用されることが示されるのと同程度に参照により本明細書に援用される。
本開示は、目的の生体分子が三次元マトリックス内に固定されるように試料を処理することに関するシステム及び方法、を提供する。本明細書で使用される三次元マトリックスは、ヒドロゲル又はゲルを指し得る。三次元マトリックスは、電磁気刺激、電気化学的刺激、又は熱刺激などの様々な刺激を使用して重合及び/又は膨張させることができる。いくつかの実施形態において、三次元マトリックスは、電磁気刺激、電気化学的刺激、又は熱刺激などの外部刺激によって拡大又は縮小/収縮することができる。いくつかの例において、三次元マトリックスを重合し、続いて目的の生体分子を検出するために標識を含むプローブをマトリックスに流し込んでもよい。試料は、単一アッセイでin situで異なるクラスの生体分子を検出するために使用及び/又は再使用することができる。いくつかの例において、試料(同一試料)は、異なる種類又はクラスの生体分子の検出のために複数回処理又はアッセイされてもよい。本開示のシステム及び方法の利点の1つは、例えば、異なる生体分子検出のために単一の試料を使用することである。いくつかの実施形態において、試料は、ハイドロゲルがその場で形成され得るように試薬(例えば、ハイドロゲル形成モノマー)によって処理される。いくつかの実施形態において、目的の生体分子は、核酸、タンパク質、及び/又は小分子であり得る。様々な場合において、目的の生体分子は、付着部分を介してハイドロゲルに連結している。様々な実施形態において、ハイドロゲルを調製するための試薬が提供される。様々な実施形態において、目的の異なる生体分子をハイドロゲルに結合する方法が提供される。いくつかの例において、容器は、本明細書に記載のシステムの一部として提供され得る。容器は、生体試料、生体分子、膨潤剤、付着部分、試薬などを収容するように構成された任意の容器であり得る。場合によっては、容器は刺激の供給源から刺激を受け取るように構成され得る。
蛍光in situ配列決定(FISSSEQ)は、マトリックス内でin situで三次元的に配置された標的を検出又は配列決定する方法を指すことができ、ここで検出シグナルは蛍光シグナルである。FISSEQによって採用され得る配列決定方法は、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、又はハイブリダイゼーションによる配列決定であり得る。FISSEQで検出又は配列決定された標的は、目的の生体分子又は目的の生体分子に結合したプローブであり得る。
次世代配列決定技術は、DNA配列の空間的構成に関する情報を必要としない場合があるので、例えば個別化医療のために、そして系統発生を推論することなどの他のゲノム配列決定用途のために、生物間の多様な変異源を再配列決定するために使用できる。しかしながら、ゲノムFISSEQを使用して、生体試料内の非常に貴重な多数の情報を取得することができる。
抗体又は他のマーカーは、OligoPaint、OligoFISSEQと併用したDNAコンジュゲート抗体の使用、環状化法による捕捉、又は直接的in situゲノム配列決定などによるゲノム検出と並行したエピジェネティック(後成的)な修飾に適用できる。抗体が利用可能であり、遺伝子制御、転写、複製、及び/又はDNA損傷及び修復において顕著な役割を果たす因子には、Oct4、Sox2、及びNanogなどの多能性の確立に関与する要因と同様に、コヒーシン、コンデンシン、RNAPII、CTCF、ヒストン変異体(例えば、H2A.Z、H2A.X、H3K4me3、H3K27ac、H3K27me3、H3K9me2/3)、PRC1、PRC2、SIN3、NuRDの成分、及びco-RESTクロマチン複合体などの包括的に作用する因子が含まれる。ゲノムFISSEQは相同染色体の視覚的識別を可能にするので、我々はX不活性化、インプリンティング、及び単一対立遺伝子発現を検討できる。重要なことに、他の相同体感受性法はゲノム又はRNA分子の反復部分に限定され、したがって単一コピー又は発現抑制領域には不適切であるが、本明細書に提供される方法は一塩基多型(SNP)を標的とし、ゲノム全体の発見を可能にする。
従来のタンパク質検出アッセイの限界
核酸標的のように、タンパク質はin situで検出され得る。タンパク質を標的とするために様々な方法を使用することができる。例えば、in situタンパク質検出は、免疫タンパク質及びアプタマーの親和性結合特性を利用し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、FISSEQに使用される親和性バインダーのライブラリー・オン・ライブラリー選択を使用する方法である。いくつかの実施形態において、ライブラリー・オン・ライブラリー選択戦略は、単一分子相互作用配列決定(SMI-seq)を使用することであり得る。この戦略は、同じ緩衝液条件で機能し得る複数のタンパク質標的に対して複数のバインダーを選択するのに有用であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法において選択されるバインダーは、同じ条件で作用し得、そして他のものと相互作用しない。いくつかの実施形態において、バインダーは互いに反応性が低下している可能性がある。本明細書に提供される方法は、選択されたバインダーを使用し、FISSEQを使用して三次元的に固定した試料中のタンパク質を検出する。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、タンパク質配列を同定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、エドマン分解によって同定され得る。
本開示は、蛍光部分に結合した複数種の準安定自己組織化DNAヘアピン、例えばハイブリダイゼーション連鎖反応モノマーを含むタンパク質FISSEQライブラリーの蛍光in situ配列決定のためのキット又はシステムを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、親和性バインダーバーコード配列に相補的な配列を含む複数種のDNAオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、キットは、イメージング用緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、キットは、ハイブリダイゼーション用緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、キットは、HCR増幅用緩衝液を含む。
真のパンオミクスin situ分子検出技術を創出するために、核酸及びタンパク質に加えて他のクラスの生体分子を本明細書に提供される方法において標的とすることができる。いくつかの従来の小分子検出方法は、本明細書に提供されているFISSEQと組み合わせることができる。代謝産物は、本質的には細胞生化学過程と相互作用するあらゆる小分子であり、ビタミン、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸、アルコール及びポリオール、脂質並びに脂肪酸などが含まれる(Wishart, David S., et al. “HMDB: the human metabolome database.” Nucleic acids research 35.suppl 1 (2007): D521-D526)。代謝における中間体、生成物、及び補因子としてのそれらの役割を超えて、代謝産物及び他の小分子は、エネルギー源、シグナル伝達分子、浸透圧調節剤、及び酵素阻害剤又は活性化剤として生物系において役割を果たすことができる。代謝産物はまた、毒素、顔料、臭気物質、フェロモンなどとして、組織、生物全体、個体群、及び生態学の規模で重要な機能を果たす(Vining, Leo C. “Functions of secondary metabolites.” Annual Reviews in Microbiology 44.1 (1990): 395-427)。特に重要なクラスの代謝産物の一つは脂質である。脂質種の数はタンパク質種の数とほぼ同じで、脂質は構造分子及びシグナル分子として様々な役割を果たす(Muro, Eleonora, G. Ekin Atilla-Gokcumen, and Ulrike S. Eggert. “Lipids in cell biology: how can we understand them better?. “Molecular biology of the cell 25.12 (2014): 1819-1823)。これら全ての小分子は、細胞内で複雑な空間パターンの構成を有し得る。
いくつかの場合において、生体分子間の相互作用を検出することができる。分子相互作用の強度を検出及び測定するためのいくつかの戦略があり、一般的に4つのテーマに分類することができる:アレイ化検体への結合の定量、架橋精製、相補性アッセイ、及び単一分子イメージング。
染色は、典型的には試料のいくつかの成分の異なる結合によって、生体試料の特徴間のコントラストを増強するための重要な技術であり得る。合成アニリン染料の発見以来、科学者達は化学反応と化学成分及び組織成分間の親和性を利用して、組織構造及び化学的及び分子的組成の視覚的又は顕微鏡的分析のために組織の光学的性質を高めた。最もよく知られている染色の1つは、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)の組み合わせであり得、それぞれ核酸及び細胞質/細胞外組織成分を染色する。その他の染色の例としては、トルイジンブルー、マッソン(Masson)のトリクローム染色、マロリー(Mallory)のトリクローム染色、ワイゲルト(Weigert)の弾性染色、ハイデンハイン(Heidenhain)のアザントリクローム染色、シルバー(Silver)染色、ライト(Wright)染色、オルセイン(Orcein)染色、及び過ヨウ素酸シッフ(periodic-acid Schiff:PAS)染色が挙げられる。DAPI及び他の挿入染料もまた、核酸及び核を標識するために使用してもよい。
いくつかの場合において、より高い解像度のイメージングが必要とされている。生体システム内では、ほとんどの物質はナノメートルオーダーの大きさである。例えば、DNAらせんの「B」型は、10塩基対当たり23.7オングストローム幅及び34オングストローム長である。例えば、Watson, James D., and Francis HC Crick. “Molecular structure of nucleic acids.“ Nature 171.4356 (1953): 737-738を参照。最小のポリペプチドも数ナノメートルのオーダーの長さである。したがって、生物学における「完全な分解能」は数ナノメートルのオーダーになる。蛍光イメージングのために、任意の数の戦略を使用してこの解像度を達成することが可能である。
分子及びプローブ捕捉
FISSEQハイドロゲルを形成するためには、特定の性質が望まれ得る。例えば、酵素との相溶性、急速拡散、熱的、物理的、光及び化学的安定性、光学的透明度、核酸との共有結合を確立するための入手容易な化学、固体支持基板への付着方法、生体直交性、及び均一なナノスケールネットワークアーキテクチャである。
配列決定は、実質的に無制限の固有のアイデンティティを持つ豊富なデジタルラベルとして機能する一連の順序付けられたシグナルを取得するプロセスである。核酸分子内の塩基の配列を決定するための、又は核酸を使用して蛍光シグナルの順序付けられたセットを生成するための化学として、ハイブリダイゼーションによる配列決定(SBH)、ライゲーションによる配列決定(SBL)、及び合成による配列決定(SBS)が挙げられるが、これらに限定されない。
パンオミクスFISSEQは、試料内の同一の物理的空間に対応し、試料を構成する一連の画像を特徴とする一種のデータを生成することができる。
本明細書で使用される核酸化学、生化学、遺伝学、及び分子生物学の用語及び記号は、当技術分野の、例えば以下の標準的な論文及び教科書に従う:Komberg and Baker, DNA Replication, Second Edition (W.H. Freeman, New York, 1992); Lehninger, Biochemistry, Second Edition (Worth Publishers, New York, 1975); Strachan and Read, Human Molecular Genetics, Second Edition (Wiley-Liss, New York, 1999); Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogs: A Practical Approach (Oxford University Press, New York, 1991); Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984)など。
本開示は、本開示の方法を実施するようにプログラムされているコンピューター制御システムを提供する。図3は、実質的に全体を通して説明されているように、生体分子の検出又は識別を補助するようにプログラムされているかそうでなければ構成されているコンピューターシステム301を示す。コンピューターシステム301は、例えば、光源、検出器(例えば、光検出器)、薬剤を放出するために利用される装置又は構成要素、反応条件(例えば、ハイブリダイゼーション、配列決定、酵素反応)を提供するのに利用される装置又は構成要素などの、生体分子の検出に利用される本開示の構成要素及び/又は装置の様々な態様を調整できる。コンピューターシステム301は、ユーザーの電子装置又は電子装置に対して遠隔に配置されたコンピューターシステムとすることができる。電子機器は携帯電子機器であり得る。
Claims (21)
- (a)および(b)を含む、生体試料中の生体分子のin situ検出又は同定に使用するための方法:
(a)(i)相対的な三次元(3D)空間関係を有する生体分子を含む、第1の体積の生体試料と、(ii)活性化剤と、(iii)付着部分とを用意すること;
(b)前記生体試料内に三次元マトリックスを形成すること、ここで、前記三次元マトリックスは、前記三次元マトリックスに前記付着部分を介して結合した前記生体分子を含み、前記三次元マトリックスは、前記生体試料中の前記生体分子の相対的な三次元空間的関係を保存し、前記三次元マトリックスを形成する間に、電磁気刺激、電気化学的刺激、又は熱刺激を含む刺激の印加により前記活性化剤が活性化され、前記第1の体積とは異なる第2の体積を有する前記生体試料又はその派生物を提供する。 - 前記(a)が前記活性化剤とは別個の1又は複数のポリマー前駆体を供給することをさらに含み、(b)において、前記三次元マトリックスは、前記1又は複数のポリマー前駆体を用いて形成される、請求項1に記載の方法。
- 前記生体試料が、細胞又はその派生物である、請求項1に記載の方法。
- 前記生体分子が、核酸分子、タンパク質分子又は小分子である、請求項1に記載の方法。
- 前記三次元マトリックスが、前記活性化剤の活性化により1.1~10倍に膨潤する、請求項1に記載の方法。
- 前記三次元マトリックスが、前記活性化剤の活性化により収縮する、請求項1に記載の方法。
- 前記刺激が電磁気刺激である、請求項1に記載の方法。
- 前記活性化剤がキレート官能性を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記活性化剤がエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記生体分子の相対的な三次元空間的関係が、前記三次元マトリックスの膨潤又は収縮により保存される、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の体積が、前記第1の体積より大きい、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の体積が、前記第1の体積より小さい、請求項1に記載の方法。
- 前記付着部分が、反応性基を含むか、又は反応性基に作動可能に結合されている、請求項1に記載の方法。
- 前記付着部分が、アミン、チオール、アジド、アルキン、又はクリック反応性基を含む、請求項1に記載の方法。
- (b)に続いて、1又は複数の試薬を用いて前記生体分子中のある生体分子を検出又は同定することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記生体分子が、前記三次元マトリックス内で検出又は同定される、請求項15に記載の方法。
- 前記1又は複数の試薬がプローブを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記プローブが核酸配列を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記プローブの核酸配列を検出することを更に含むことによって、前記生体分子を検出又は同定する、請求項18に記載の方法。
- (i)~(iii)を含む、請求項1に記載の方法:
(i)刺激を印加することにより、前記活性化剤を活性化し、前記活性化剤の活性化により前記三次元マトリックスが、前記第2の体積が前記第1の体積より大きくなるように膨潤する、(ii)前記三次元マトリックスが膨潤した後、前記生体分子中のある生体分子を同定すること、及び(iii)前記三次元マトリックスが、第2の体積より小さい第3の体積に収縮するように追加の刺激を印加すること。 - 前記刺激が液体ではない、請求項1に記載の方法。
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