JP5198284B2 - 高処理量配列決定技術を使用する転写産物の特徴づけのための改良された戦略 - Google Patents
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Description
本発明者らは、異なる戦略を使用して、この問題を解決できること、及び転写産物の特徴づけにおいて、高処理量配列決定技術を効率的に使用できることをここに発見した。
以下の記載及び例において、多くの用語が使用される。このような用語に付与されるべき範囲を含め、明細書及び特許請求の範囲を明確且つ一貫して理解するために、以下の定義が提供される。本明細書に別段の定義がなければ、使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。全ての公報、特許出願、特許及び他の参考文献の開示は、参照により、その全ての内容が全体として本明細書に組み込まれる。
本発明は、
(a)cDNAを準備する段階;
(b)前記cDNAの少なくとも1つに対して複雑性の低下を実施してcDNA断片を含むcDNAの第一のライブラリを得る段階;
(c)高処理量配列決定によって、第一のライブラリの前記cDNA断片のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定する段階;
(d)段階d)の第一のライブラリの前記cDNA断片の前記ヌクレオチド配列を整列させて第一のライブラリの連結断片を生成する段階;及び
(e)前記cDNAの前記ヌクレオチド配列を決定する段階
を含む、cDNAのヌクレオチド配列を決定するための方法を提供する。
(c1)配列決定アダプターを断片に連結する段階;
(c2)、各々、単一の断片と徐冷するビーズに、配列決定アダプター連結断片を徐冷する段階;
(c3)各々、単一ビーズを含む油中水微小反応器中でビーズを乳化する段階;
(c4)ビーズの表面上で配列決定アダプター連結断片を増幅するために、乳濁液PCRを実施する段階;
(c5)増幅された配列決定アダプター連結断片を含有するビーズを選択/濃縮する段階;
(c6)各々、単一ビーズを含むウェル中にビーズを負荷する段階;及び
(c7)ピロリン酸塩シグナルを発生させる段階
を含む。
i).少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼでcDNAを消化して制限断片へと断片化する段階;
ii).制限断片の一方又は両方の末端と適合性のある1つの末端を有する少なくとも1つの二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターと前記制限断片を連結してアダプターが連結された制限断片を生成する段階;
iii).前記アダプターが連結された制限断片を、1つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーと、ハイブリッド形成条件下で接触させる段階(前記1つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも1つのアダプターの一部と、及び制限エンドヌクレアーゼの認識配列の残りの部分の一部とに相補的なヌクレオチド配列部分を含むプライマー配列を有する。);並びに
iv).ハイブリッド形成された1つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長によって、前記アダプターが連結された制限断片を増幅する段階
を含む方法によって実施される。
(a)cDNAを準備する段階;
(b)前記cDNAの少なくとも部分について複雑性の低下を実施してcDNA断片を含む前記cDNAの第一のライブラリを得る段階;
(c)配列決定によって、第一のライブラリの前記cDNA断片のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定する段階;及び
(d)ヌクレオチド配列の頻度を決定する段階
を含む、ヌクレオチド配列の頻度を決定するための方法にも関する。
(a)第一のcDNA試料に対して請求項2に記載の方法を実施することによって、前記第一のcDNA試料中のヌクレオチド配列の頻度を決定する段階;
(b)第二の及び/又はさらなるcDNA試料に対して請求項2に記載の方法を実施することによって、第二の及び/又はさらなるcDNA試料中の同一のヌクレオチド配列の頻度を決定する段階;及び
(c)第一のcDNA試料中のヌクレオチド配列の頻度を、第二の及び/又はさらなるcDNA試料中の同一のヌクレオチド配列の頻度と比較して前記ヌクレオチド配列の相対的な転写レベルを得る段階
を含む、cDNA試料中のヌクレオチド配列の相対的な転写レベルを決定するための方法にも関する。
a)第一のcDNA試料を準備する段階;
b)第一のcDNA試料に対して複雑性の低下を実施して第一のライブラリを得る段階;
c)第一のライブラリにタグ付けして第一のタグ付きライブラリを得る段階;
d)好ましくは各cDNA試料に対して異なるタグを使用して、第二の及び/又はさらなるcDNA試料を用いて連続して又は同時に段階(a)及び(b)を実施して第二の及び/又はさらなるタグ付きライブラリを得る段階;
e)前記第一のタグ付きライブラリ並びに第二の及び/又はさらなるタグ付きライブラリを組み合わせて組み合わされたライブラリを得る段階;
f)前記組み合わされたライブラリのヌクレオチド配列の少なくとも一部を配列決定によって決定する段階;
g)第一のcDNA試料並びに第二の及び/又はさらなるDNA試料中のヌクレオチド配列の頻度を決定する段階;並びに
h)第一のcDNA試料中のヌクレオチド配列の頻度を、第二の及び/又はさらなるcDNA試料中のヌクレオチド配列の頻度と比較して前記cDNA試料中のヌクレオチド配列の相対的な転写レベルを得る段階
を含む、前記cDNA試料中のヌクレオチド配列の相対的な転写レベルを決定するための方法にも関する。
ノザンハイブリッド形成又はDNAマイクロアレイ発現適用等のアプローチを使用して、高等植物中での遺伝子発現の時間的及び空間的制御の多数の例が蓄積されている。後者の技術は、遺伝子千個の発現を同時にモニターすることを可能とする。これらの分析方法とは異なり、遺伝子発現の特徴づけのデジタル分析は、高処理量配列技術を直接使用して、タグ付き転写産物を配列決定することによって実現され得る。試料中の特異的転写産物から得られた配列数は、この特定の配列の転写レベルを反映する。配列決定の深度を考慮しながら、複数の試料間でこれらの数を比較することによって、これらの試料間で転写レベルを正確に測定することが可能である。前記技術は、ある種の発現特性と関連した新たな未知の性質マーカーを発見するための強力なツールと思われる。
全RNA/ポリ(A)+RNA単離
コショウ系PSP11及びPI201234から、RNeasyミニキット(カタログ番号74104)を使用するQIAGEN製RNeasy Plant Mini Protocolを使用して、葉の材料から全RNAを単離した。入力として、試料あたり100mgの葉の材料を使用した。
以下のプロトコールに従って、cDNAを作製した。
以下を共に添加する。
10μLポリ(A)+RNA(50から100ng)
5μLオリゴ−dT25(70ng/μL)
その後、以下を添加する。
5μLの5×第一の鎖の緩衝液(Superscript II RTとともに供給)
2.5μLの0.1M DTT
1μLの10mM dNTP
0.5μLのSuperscript II(200U/μL)
1μLのMQ水で25μLの最終容積にする。
42℃で2時間定温放置する。
以下のものを、一緒に添加する。
25μLの第一の鎖の反応混合物
8μLの10×第二の鎖の緩衝液
1.5μLの10mM dNTP
7.5単位のイー・コリ(E.coli)DNAリガーゼ
25単位のイー・コリポリメラーゼ
0.8単位のRNase−H(1U/μL)
MQ水を添加して、80μLの最終容積にする。
12℃で1時間定温放置する。
22℃で1時間定温放置する。
Zabeau & Vos,1993:Selective restriction fragment amplification;a general method for DNA fingerprinting.欧州特許出願公開(A1)第0534858号;米国特許第6045994号及びVosら(Vos,P.,Hogers,R.,Bleeker,M.,Reijans,M.,van de Lee,T.,Hornes,M.,Frijters,A.,Pot,J.,Peleman,J.,Kuiper,M.et al.(1995)AFLP:a new technique for DNA fingerprinting.Nucl.Acids Res.,21,4407−4414)によって記載されているとおり、制限エンドヌクレアーゼの組み合わせTaqI/MseIを使用して、コショウ親系PSP11及びPI−201234の作製されたcDNAのAFLPテンプレートを調製した。
2つの段階、すなわち、TaqIによる第一段階(最高定温放置温度)、MseIによるその後の段階(最低定温放置温度)において消化を実施した。
以下のものを、一緒に添加する。
250ng cDNA
10単位のTaqI
8μLの5×RL緩衝液 5×RL緩衝液は、50mMトリス−HAc、50mM MgAc、250mM KAc、25mM DTT、250ng/BSAμL;pH7.5である。
MQ水を添加して、40μLの最終容積にする。
65℃で2時間定温放置する。
以下を添加する。
10単位のMseI
2μLの5×RL緩衝液
MQ水を添加して、50μLの最終容積にする。
37℃で2時間定温放置する。
消化混合物に以下の成分を添加した。
1μLの10mM ATP
1μLのT4 DNAリガーゼ
1μLのTaqIアダプター(50pmol/μL)
制限−連結の後、非選択的増幅段階において、この制限/連結反応性生物をテンプレートとして使用した。選択的増幅(+1/+1)のために、これらの非選択的AFLP生成物をその後テンプレートとして使用した。+2/+3の選択的増幅を実施することによって、前記+1/+1生成物に関して性質チェックを実施した。後者の増幅の生成物を4.5%配列ゲルでチェックした。
5μLの希釈されていない制限−連結混合物
1.5μLのTaqI−プライマー(50ng/μL)
1単位のTaq.ポリメラーゼ
5μLの10×PCR緩衝液
MQ水を添加して、50μLの最終容積にする。
コショウ系PSP11に由来する非選択的cDNA−AFLP生成物用
5μLの600×希釈した非選択的生成物
1.5μLのTr01ACACプライマー(+A)*(50ng/μg)
5μLの600×希釈した非選択的生成物
1.5μLのTr01AGCTプライマー(+A)*(50ng/μg)
Marguliesら(Margulies et al.,Nature 437,pp.376−380及びオンライン補遺)によって記載されている454 Life Sciences/Roche GS20配列決定技術を使用する高処理量配列決定に、両コショウ系由来のタグ付きcDNA AFLP生成物を供した。
タグ付きcDNA−AFLP PCR生成物をまず生成し、修飾されたアダプター(
バイオインフォマティクスパイプライン(Keygene N.V.)を使用して、GS20配列実行の半分(すなわち、GS20PicoTiterPlate上で利用可能な2チャネルのうちの1チャネル)から得られる配列データを処理した。具体的には、塩基が呼び出された(basecalled)生配列の読み取りをFASTAフォーマット中で変換し、BLASTアルゴリズムを使用して、タグ付きAFLPアダプター配列の存在に関して検査した。既知のタグ付きAFLPプライマー配列に対して信頼度の高い合致が得られたら、配列を整え、制限エンドヌクレアーゼ部位を復元し、適切なタグを割り当てた。その後、全体的な配列相同性に基づいたメガBLAST手法を使用して、33塩基よりも大きな整えられた配列を全てクラスター化した。次に、CAP3多重整列化アルゴリズムを使用して、クラスターあたり1つ又はそれ以上の連結断片中にクラスターを構築した。
クラスター387
試料2のIDタグ(AGTC)を太字で示している。試料1のIDタグ(ACAC)を下線で示している。図4を参照されたい。
段階1)「試料配列決定深度標準化因子」は、2.45であり、試料2から得られた読み取り全体を試料1に由来する読み取り総数で除したものとして定義される(123822/50599=2.45)。連結断片あたりの試料2に由来する読み取り数を2.45で除して、転写レベルを試料1の転写レベルと比較した。
参考文献:Altschul,Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and David J.Lipman(1997),“Gapped BLAST and PSI−BLAST:a new generation of protein database search programs”,Nucleic Acids Res.25:3389−3402。
データベース:taggedReads.fna
174,421配列;15,408,192全文字。結果を図5に示す。
Claims (6)
- (a)第一のcDNA試料を準備する段階;
(b)第一のcDNA試料に対して複雑性の低下を実施して第一のライブラリを得る段階であって、当該段階が、
・cDNAを、少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼで消化して制限断片へと断片化する段階;
・前記制限断片を、制限断片の一方又は両方の末端と適合性のある1つの末端を有する少なくとも1つの二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターと連結してアダプターが連結された制限断片を生成する段階;
・前記アダプターが連結された制限断片を、少なくとも1つのアダプターの一部と、及び制限エンドヌクレアーゼの認識配列の残りの部分の一部と相補的なヌクレオチド配列部分を含むプライマー配列を有する1つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーと、ハイブリッド形成条件下で接触させる段階;及び
・前記アダプターが連結された制限断片を、ハイブリッド形成された1つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長によって増幅する段階を含み;
(c)段階(b)において、少なくとも1つのタグ付きアダプターを使用することによって第一のライブラリにタグ付けして第一のタグ付きライブラリを得る段階;
(d)各cDNA試料に対して異なるタグを使用して、第二の及び/又はさらなるcDNA試料を用いて、連続して又は同時に段階(a)から(c)を実施して第二の及び/又はさらなるタグ付きライブラリを得る段階;
(e)第一のタグ付きライブラリ並びに第二の及び/又はさらなるタグ付きライブラリを組み合わせたライブラリを得る段階;
(f)前記組み合わせたライブラリのヌクレオチド配列の少なくとも一部を高処理量配列決定によって決定する段階;
(g)第一のcDNA試料並びに第二の及び/又はさらなるDNA試料中のヌクレオチド配列の頻度を決定する段階;並びに
(h)第一のcDNA試料中のヌクレオチド配列の頻度を、第二の及び/又はさらなるcDNA試料中のヌクレオチド配列の頻度と比較して前記cDNA試料中のヌクレオチド配列の相対的な転写レベルを得る段階
を含む、cDNA試料中のヌクレオチド配列の相対的な転写レベルを決定するための方法。 - 高処理量配列決定が、固体支持体上で実施される、請求項1に記載の方法。
- 高処理量配列決定が、合成による配列決定に基づいている、請求項1又は2の何れか一項に記載の方法。
- 高処理量配列決定が、
(f1)配列決定アダプターを断片に連結する段階;
(f2)各々、単一の断片とアニーリングするビーズに、配列決定アダプター連結断片をアニーリングする段階;
(f3)各々、単一ビーズを含む油中水微小反応器中で前記ビーズを乳化する段階;
(f4)乳濁液PCRを実施してビーズの表面上で配列決定アダプター連結断片を増幅する段階;
(f5)増幅された配列決定アダプター連結断片を含有するビーズを選択し/濃縮する段階;
(f6)各々単一ビーズを含むウェル中に前記ビーズを負荷する段階;及び
(f7)ピロリン酸塩シグナルを発生させる段階
を含む、請求項1から3の何れか一項に記載の方法。 - プライマーが、プライマー配列の3’末端に、選択された配列をさらに含み、1から10個の選択的ヌクレオチドを含む前記選択された配列が、制限エンドヌクレアーゼの認識配列の残りの部分に直接隣接して配置される部分と相補的である、請求項1に記載の方法。
- プライマー配列の3’末端の選択された配列が、1から8個の選択的ヌクレオチドを含む、請求項5に記載の方法。
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