ES2332123T3

ES2332123T3 - Sistema para analisis simplificado de acidos nucleicos.

Info

Publication number: ES2332123T3
Application number: ES01103113T
Authority: ES
Inventors: Michael Fritz; Herbert Dr. Harttig; Joachim Dr. Steinbiss; Volker Gerstle; Jurgen Schwab; Andreas Dr. Rauscher
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2000-02-11
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2010-01-27
Anticipated expiration: 2021-02-09
Also published as: US20020018998A1; EP1123980B1; EP1123980A2; JP3541181B2; US7449326B2; DE10006214A1; DE50115166D1; EP1123980A3; ATE445712T1; JP2001245684A

Abstract

Procedimiento para la detección de ácidos nucleicos en una muestra que comprende las etapas: (a) Purificar los ácidos nucleicos en un recinto de unión, de manera que los ácidos nucleicos son inmovilizados y se separan las impurezas, (b) Eluir los ácidos nucleicos inmovilizados, (c) Amplificar los ácidos nucleicos purificados en un recinto de amplificación, de manera que el recinto de amplificación comprende, como mínimo, una parte del recinto de unión, (d) Detección de los productos de amplificación en un recinto de detección, caracterizado porque el recinto de detección comprende, como mínimo, una parte del recinto de amplificación y/o, como mínimo, una parte del recinto de unión.

Description

Sistema para análisis simplificado de ácidos nucleicos.

La presente invención se refiere a un sistema para el análisis simplificado de ácidos nucleicos.

En sistemas conocidos de análisis de ácidos nucleicos se lleva a cabo, en primer lugar, una unión de ácidos nucleicos para la purificación o aislamiento de los analitos buscados. La unión tiene lugar habitualmente en recipientes con volúmenes relativamente grandes, de algunos centímetros cúbicos, para poder recibir las cantidades necesarias para una detección sensible de la muestra, tampón de unión, etc. Puesto que en el área de diagnóstico se deben alcanzar límites de detección de 1 a 10 analitos por ml de muestra, para procedimientos diagnósticos sensibles son necesarias cantidades correspondientemente grandes de muestra y, por lo tanto, grandes volúmenes de reacción. Los volúmenes de muestra más pequeños conducen a procedimientos menos sensibles y al peligro de que en la parte escogida en la muestra realmente positiva, el analito buscado no se encuentre allí, lo que podría conducir a un resultado de diagnóstico llamado falso negativo.

Por otra parte, la amplificación del ácido nucleico necesaria para la detección de los analitos de ADN aislados debe ser realizada, no obstante, en recipientes lo más reducidos posible para conseguir una velocidad de amplificación suficientemente elevada. Este contraste, tiene como consecuencia que los ácidos nucleicos, inmovilizados para la depuración, se eluyen habitualmente hacia fuera del recinto de unión y deben ser transferidos a un recinto de amplificación que es distinto al recinto de unión. Se dan a conocer dispositivos para análisis de ácidos nucleicos con sistemas de recintos múltiples, por ejemplo, en los documentos EP 0 754 725; WO 95/11454; US 5,645,801; WO 97/02357; US 5,714,380; EP 0 733 714; EP 0 674 009; US 5,725,831; US 5,639,428; WO 97/10056; WO 94/05414; WO 96/41864; US 5,589,136; WO 97/00726; EP 0 838 025; WO 97/03348; EP 0 594 260; EP 0 594 259; US 5,288,463; US 5,422,271; US 5,593,838; WO 93/22053; WO 93/22054; WO 93/22055; WO 93/22058 y WO 96/15269. La fase de transferencia necesaria para estos dispositivos de los ácidos nucleicos aislados de un recipiente a otro está relacionada, no obstante, con medidas adicionales y con el peligro de que en la transferencia una parte, o la totalidad, del analito buscado se pierda o que contamine la muestra.

El documento US 5,955,351 da a conocer un dispositivo cerrado, de recintos múltiples, para el análisis de ácido nucleico, en el que tiene lugar una extracción de ácido nucleico, amplificación y detección, en varios recintos de reacción móviles entre sí. La preparación y la detección de los ácidos nucleicos a investigar tienen lugar dentro de recintos separados entre sí del dispositivo. El volumen de muestra a analizar está, por lo tanto, limitado al volumen del recinto de unión.

Existe, por lo tanto, la necesidad de un procedimiento de análisis de ácidos nucleicos mediante el cual se pueden superar los inconvenientes del procedimiento conocido y que presente especialmente una elevada sensibilidad y con el cual se pueden reducir la complicación técnica y necesidad de tiempo para un análisis.

Este objetivo se consigue mediante un procedimiento para la detección de ácidos nucleicos en una muestra que comprende las siguientes fases:

(a) purificación de los ácidos nucleicos en un recinto de unión, de manera que los ácidos nucleicos son inmovilizados y las impurezas son eliminadas,

(b) elución de los ácidos nucleicos inmovilizados,

(c) amplificación de los ácidos nucleicos purificados en un recinto de amplificación, de manera que el recinto de amplificación comprende, como mínimo, una parte del recinto de purificación, y

(d) detección de los productos de amplificación en un recinto de detección;

que se caracteriza porque el recinto de detección comprende, como mínimo, una parte del recinto de amplificación o/y una parte del recinto de unión.

A causa de la realización de la amplificación, como mínimo, en una parte del recinto de unión, se puede conseguir una sustancial mejora con respecto a la complicación técnica y necesidad de tiempo en los análisis de ácidos nucleicos. De acuerdo con la invención, el mismo recinto, o una parte de éste, puede ser utilizado tanto para la inmovilización como también para la amplificación, de manera que la muestra, en el caso en que se desee mezclada con otros reactivos, es guiada a efectos de inmovilización, como mínimo, una vez, y preferentemente varias, a través del recinto de unión.

Básicamente, los sistemas para el análisis de ácidos nucleicos comprenden una o varias de las siguientes fases: preparación de la muestra, amplificación, detección y evaluación.

La preparación de la muestra puede tener lugar, en caso deseado, antes de la purificación del ácido nucleico en la etapa (a) una lisis de muestras que contienen ácidos nucleicos. Esta lisis será llevada a cabo, preferentemente, cuando las muestras a investigar contienen células y/o restos de células. La lisis de células puede tener lugar, por ejemplo, mediante añadidura de reactivos de litio, en especial reactivos caotrópicos o encimas líticas. En una forma de realización especialmente preferente se colocará en una jeringa de doble émbolo un reactivo caotrópico. La muestra será aspirada hacia dentro de la jeringa y, finalmente, la abertura de inyección será cerrada, por ejemplo, mediante una válvula o un grifo. Mediante movimiento de avance y retroceso del segundo émbolo de la jeringa de doble émbolo, se conseguirá una mezcla intensa de la muestra que contiene ácido nucleico y el reactivo caotrópico. En caso deseado, la lisis puede tener lugar mediante calentamiento de la mezcla a una temperatura más elevada, preferentemente de 30ºC a 70ºC. La lisis se efectuará preferentemente por la acción de fuerzas de cizalladura sobre la muestra que contiene el ácido nucleico.

Además, la preparación de la muestra comprende una etapa de purificación a efectos de separar, en la mayor medida posible, los componentes que perturban la detección posterior. La purificación de los ácidos nucleicos será llevada a cabo, de acuerdo con la presente invención, en un recinto de unión, de manera que los ácidos nucleicos serán inmovilizados y las impurezas serán separadas. Los ácidos nucleicos pueden ser inmovilizados, por ejemplo, mediante unión covalente o de absorción en el recinto de unión. Además, también es posible la unión de los ácidos nucleicos mediante una interacción de alta afinidad, por ejemplo, una unión específica de secuencia mediante sondas de hibridación o un asociado de unión de pares de unión de alta afinidad, tales como adivina/biotina, o mediante anticuerpos específicos.
De manera preferente, la inmovilización de los ácidos nucleicos tiene lugar mediante unión de adsorción, por ejemplo, sobre la superficie de un vidrio. La unión de los ácidos nucleicos a la superficie puede ser reforzada mediante la añadidura de los reactivos de unión adecuados, tales como, por ejemplo, isopropanol, sales caotrópicas, etc.

La unión tiene lugar, de manera preferente, en una superficie interna del recinto de unión, pero también es posible efectuar la unión de los ácidos nucleicos sobre dispositivos introducidos en el recinto de unión, tales como recubrimientos o rellenos.

En caso de que se deba analizar una muestra que contiene células, por ejemplo, microorganismos, puede ser ventajoso unir, en primer lugar, las células, por ejemplo, microorganismos infecciosos, con intermedio de anticuerpos específicos de antígenos superficiales o unión por absorción no específica a la superficie del recinto de unión. Así, por ejemplo, para una unión específica de microorganismos, tal como, por ejemplo, organismos infecciosos, se pueden inmovilizar correspondientes anticuerpos en el recinto de unión. Se ha podido demostrar que las células, tales como, por ejemplo, clamidias, se unen de forma absorbente sobre superficies, preferentemente superficies de poliestireno y, de esta manera, pueden ser separados en la purificación. Los ácidos nucleicos en sí mismos pueden ser detectados, entonces, después una lisis de las células, que puede tener lugar, por ejemplo, mediante la acción térmica durante la reacción de amplificación.

Es especialmente preferente como recinto de unión un recinto que, como mínimo, es parcialmente capilar. En una forma de realización preferente tiene lugar la inmovilización de los ácidos nucleicos o células sobre la superficie interna de un material capilar que está realizado mediante vidrio, especialmente borosilicato o poliestireno. El recinto capilar puede estar también constituido como intersticio, por ejemplo, entre dos placas de recubrimiento. La abertura, o bien el diámetro, del recinto capilar tiene un valor preferentemente \geq0,05 mm, de modo preferente \geq0,5 mm y con mayor preferencia \geq0,9 mm, siendo preferente \leq5 mm, especialmente preferente \leq2 mm y lo más preferente \leq1,1 mm. Mientras que una parte del recinto de unión, especialmente \geq10%, preferentemente \geq20% del volumen de unión total puede estar constituido como recinto capilar, es preferible que prácticamente la totalidad del recinto de unión, preferentemente \geq80% y en especial \geq90% con respecto a la totalidad del volumen de unión esté constituido en forma de recinto capilar.

Para la inmovilización se colocará un material capilar, por ejemplo, en una jeringa de doble émbolo, del tipo que se ha descrito, y se hará pasar a través del capilar la muestra que contiene ácidos nucleicos o bien la mezcla conseguida después de una lisis que se hará pasar, como mínimo, una vez, preferentemente un mínimo de 5 veces, más preferentemente un mínimo de 10 veces y con la máxima preferencia un mínimo de 20 veces. Mediante la conducción repetida de la muestra o bien de la mezcla de lisis a través del recinto de unión, se puede conseguir de manera ventajosa un aumento del rendimiento en ácidos nucleicos inmovilizados y, por lo tanto, un aumento de la sensibilidad del conjunto del procedimiento.

La relación de volumen del recinto de unión, con respecto a la muestra que contiene ácido nucleico, asciende de modo preferente como mínimo a 10:1, de manera especialmente preferente 20:1.

Una proporción grande del recinto de unión, con respecto a la muestra, es ventajosa, puesto que posibilita un elevado volumen de muestra, tal como es necesario para una elevada sensibilidad de la unión y, simultáneamente, posibilita la realización del procedimiento en un recinto reducido, especialmente en un recinto capilar, tal como se requerirá para la posterior amplificación de los ácidos nucleicos. Una elevada proporción del volumen de muestra, con respecto al volumen del recinto de unión, se puede conseguir cuando la muestra no es llevada al recinto de unión, tal como es habitual en la técnica conocida, sino, por el contrario, es obligada a pasar, como mínimo, una vez, preferentemente varias veces, a través del recinto de unión.

En otra forma de realización preferente, la unión de los ácidos nucleicos tiene lugar en la superficie de lana de vidrio en un recubrimiento, por ejemplo, en un cartucho que se ha colocado en el capilar antes descrito. También para esta forma de realización, la muestra o bien la mezcla de lisis que contiene los ácidos nucleicos será guiada, como mínimo, una vez a través del recubrimiento, de manera que los ácidos nucleicos, al atravesar, se unen a la superficie de la lana de vidrio.

Después de la inmovilización de los ácidos nucleicos o simultáneamente con la misma se efectuará la separación de impurezas contenidas en la muestra, de manera que se conseguirá una detección selectiva y sensible de ácidos nucleicos. La separación de impurezas puede tener lugar, por ejemplo, de manera que el recinto de unión, en el que están inmovilizados los ácidos nucleicos, será tratado o enjuagado con un tampón de lavado. El tampón de lavado se hará pasar preferentemente de forma lenta, como mínimo, una vez por el recinto de unión, y contendrá preferentemente del 70 al 80% de etanol.

Una purificación adicional puede tener lugar de forma que para la eliminación del tampón de lavado se efectúa el secado del recinto de unión, de manera que se calienta aproximadamente, por ejemplo, a 80ºC, y simultáneamente es atravesado por aire o un "intergas". La eliminación de restos del lavado con tampón, en especial restos de alcohol, es ventajosa puesto que los restos de alcohol pueden inhibir o alterar la sucesiva operación de amplificación.

Al final de la etapa (a), los ácidos nucleicos se encuentran preferentemente inmovilizados en el recinto de unión de forma seca, unidos preferentemente de forma adsorbente en una superficie de vidrio.

Para la preparación de la amplificación, se eluyen los ácidos nucleicos inmovilizados en la etapa (b). La elución puede tener lugar con soluciones de elución apropiadas conocidas por los técnicos en la materia. Los ácidos nucleicos pueden ser disueltos, por ejemplo, mediante una mezcla de reactivos con pequeño contenido de sales desde la superficie de un vidrio. Es especialmente ventajoso para la elución utilizar una solución que ya contiene todos los reactivos necesarios para la amplificación. En una forma de realización preferente se efectuará, mediante aspiración de un "mastermix" en el recinto de unión, la separación de los ácidos nucleicos de la superficie, especialmente de un cuerpo capilar, en especial una superficie de vidrio o de poliestireno. Con el término elución se comprenderá, en esta descripción, en especial, la separación de los ácidos nucleicos inmovilizados de la superficie, de manera que los ácidos nucleicos eluidos no serán eliminados del recinto de unión. En caso de que en la etapa de preparación de la muestra los gérmenes infecciosos no sean purificados, por ejemplo, por unión por adsorción sobre poliestireno, estos serán sometidos preferentemente a lisado solo al inicio de la etapa de amplificación, por lo tanto, en la etapa de preparación de la muestra, no se utilizarán tampones de lisado.

Finalmente, en la etapa (c) se llevará a cabo la amplificación de los ácidos nucleicos depurados en un recinto de amplificación. Puesto que el recinto de amplificación comprende, como mínimo, una parte del recinto de unión, no es necesaria la transferencia o trasporte de los ácidos nucleicos eluidos, de manera que se pueden evitar las pérdidas de rendimiento asociadas a ello. La amplificación será llevada a cabo preferentemente mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR). Este método de amplificación tiene la ventaja de que es utilizable de manera universal y que presenta una elevada especificidad y sensibilidad. No obstante, y de modo evidente, se pueden utilizar también otros métodos de amplificación conocidos por los técnicos en la materia, tales como, por ejemplo, IsoCR-, LCR-, Champ-, SDA, Q\beta-Replicasa-, NASBA3SR-, CPT-, TMA-, rRNA-hibridación, o bien métodos bDNA. El método de amplificación utilizado de manera más ventajosa puede ser determinado dependiendo del analito y de otras condiciones de entorno sin dificultades por el técnico en la materia.

Preferentemente se utilizará un recinto de amplificación termostatizado. Se ha mostrado como especialmente ventajoso el rodear el recinto de amplificación con un faldón metálico que se pueda calentar, puesto que, de esta manera, es posible un calentamiento rápido y, por lo tanto, se pueden conseguir ciclos de calentamiento cortos.

En una forma de realización preferente con utilización de la reacción en cadena de polimerasa, será cerrado, en primer lugar, el recinto de unión, especialmente un recinto capilar, por su extremo inferior con un primer tapón. A continuación se pueden retirar los capilares de la jeringa de doble émbolo antes descrita y se puede cerrar con un segundo tapón. El recinto de unión sirve, entonces, simultáneamente, como recinto de amplificación.

En caso de que se utilice un cuerpo capilar con una capa metálica calentable como recinto de amplificación en el paso de corriente eléctrica por los capilares, o bien por el recubrimiento externo, eléctricamente conductor, se calentaran los capilares. La temperatura deseada puede ser deducida con facilidad en base a los coeficientes de temperatura y resistencia eléctrica, pudiendo ser regulada. La refrigeración del recinto de amplificación puede tener lugar por soplado mediante aire ambiente, lo que provocará su aceleración, de manera que la utilización de un capilar, como recinto de amplificación, será sometida a una elevada velocidad de refrigeración como consecuencia de las reducidas masas después de la terminación de la corriente de calentamiento. En la utilización preferente, según la invención, de un capilar envuelto en una capa metálica calentable se puede llevar a cabo a causa de las elevadas velocidades de calentamiento y refrigeración, un ciclo térmico, de 92ºC, 55ºC, 72ºC en menos de 25 segundos.

Los productos constituidos en la amplificación serán detectados de acuerdo con la invención para determinar los ácidos nucleicos contenidos en la muestra. La detección puede tener lugar según procedimientos conocidos. Dicha detección tiene lugar preferentemente en línea "online" mediante fluorescencia.

Se consiguen especiales ventajas con respecto a la simplicidad del procedimiento cuando todas las etapas del procedimiento de detección, es decir, la purificación de los ácidos nucleicos, la amplificación de los ácidos nucleicos depurados y la detección de los productos de amplificación son llevadas a cabo en el mismo recinto de reacción, en especial, en un capilar.

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Así, por ejemplo, para la forma de realización preferente que se ha descrito de un capilar, que se puede cerrar mediante tapones como recinto de unión y recinto de amplificación, se puede hacer pasar la luz de excitación a través de una ventana óptica en los tapones y medir la luz que sale a través de una ventana en los mismos tapones o en oposición a los mismos para llevar a cabo una detección de fluorescencia. De igual manera, se puede aplicar para la detección la variación de una adsorción.

Para la evaluación se pueden compensar las intensidades de la luz de excitación y de la luz fluorescente entre sí, de forma que se obtiene una señal. Mediante aplicación de la intensidad de señal, con respecto al número de ciclos de amplificación pasantes, se puede decidir aparte de la evaluación equitativa también cuantitativamente sobre la concentración de un analito. Esto posibilita una decisión diagnóstica previa, por ejemplo, por la comparación de un número de ciclos, en la que se inicia una sustancial subida de la señal con un valor límite previamente definido.

Una mejora adicional de la prueba se puede conseguir por añadidura de una cantidad definida de una norma interna, así como las correspondientes sondas y marcadores, de manera que se puede llevar a cabo el control de la amplificación sobre una posible inhibición mediante reactivos de prueba y/o en las impurezas existentes en la muestra. En este caso, es ventajoso detectar los controles internos y los analitos sobre dos longitudes de onda distintas, lo que posibilita la realización simultánea de análisis y control.

Se consigue un control adicional del procedimiento mediante la comparación de la cinética de la temperatura en el calentamiento del recinto de amplificación con valores previstos predeterminados, de lo que se puede deducir el grado de llenado del recinto de amplificación, en especial un capilar. Si el recinto de amplificación pierde líquido durante la amplificación, ello conduce a la variación de la cinética de calentamiento y, si se sobrepasa un límite de tolerancia definido con anterioridad, da indicaciones falsas.

Para una simplificación adicional del procedimiento, de manera preferente, todas las fases se llevan a cabo en un dispositivo cerrado, es decir, en un dispositivo cerrado que contiene todos los recintos de reacción y reactivos necesarios.

El procedimiento de la invención es especialmente adecuado para detecciones "Point of Care" (PoC), ya que además de una capacidad funcional comparable con métodos estándar de laboratorio, posibilita una manipulación simple sin grandes complicaciones de aparatos, con reducidos costes de producción y una reducida complicación analítica. Mediante la integración de la preparación de muestras, con la siguiente etapa de amplificación, se pueden evitar etapas de pipeteado y, por lo tanto, los problemas de contaminación relacionados con ellas.

El procedimiento objeto de la presente invención es adecuado en especial para la detección de patógenos en muestras biológicas. Posibilita una detección sencilla y rápida de microorganismos, por ejemplo, clamidias u otros.

La invención comprende, además, un dispositivo para la detección de ácidos nucleicos en una muestra, en especial, mediante un procedimiento, tal como se ha descrito anteriormente, que comprende:

(a) un recinto de unión para la purificación de ácidos nucleicos, en la que los ácidos nucleicos son inmovilizados y las impurezas son separadas,

(b) un recinto de amplificación para la amplificación de ácidos nucleicos, en la que el recinto de amplificación comprende, como mínimo, una parte del recinto de unión,

(c) un recinto de detección para la detección de ácidos nucleicos, y opcionalmente

(d) recipientes y/o conducciones de alimentación para la muestra y/o para los reactivos, caracterizado porque el recinto de detección comprende, como mínimo, una parte del recinto de amplificación y/o del recinto de unión. El recinto de unión y/o de amplificación puede estar constituido, como mínimo parcialmente, en forma de recinto capilar, de manera que se pueden conseguir las ventajas que se han indicado anteriormente.

Una condición previa para la detección de ácidos nucleicos en una muestra consiste en liberar, en primer lugar, los ácidos nucleicos comprendidos en aquella o unidos a un complejo, a efectos de hacerlos accesibles para un análisis. Para ello se utilizan, por ejemplo, células con enzimas líticas para producir la rotura de la pared celular y liberar los ácidos nucleicos contenidos en las células. Este tipo de lisis requiere, no obstante, un importante periodo de tiempo.

El documento WO 95/18851 describe un procedimiento para la disgregación de estructuras de alto peso molecular, de manera que la muestra es conducida a través de capas porosas para favorecer la disgregación por cizalladura. En este caso, no obstante, se presenta también el problema de que también el analito deseado quedará retenido, por lo menos parcialmente, en los poros y, por lo tanto, se influirá en la sensibilidad del conjunto de procedimiento de detección.

Con objetivos ilustrativos, se describirá un procedimiento para la disgregación de complejos que contienen ácidos nucleicos, que posibilitan la liberación de ácidos nucleicos en un tiempo más reducido y sin pérdidas de rendimiento.

En dicho procedimiento se disgrega una matriz que contiene ácidos nucleicos o se disgregan complejos que contienen ácidos nucleicos, de manera que se hacen circular una mezcla de disgregación que comprende la matriz dotada de ácidos nucleicos y un reactivo de disgregación a través de un recinto capilar, de forma que la matriz es fracturada y los ácidos nucleicos contenidos en la misma son liberados.

Para la disgregación de matrices que contienen ácidos nucleicos se requieren elevados esfuerzos de cizalladura para conseguir la disgregación de la muestra en un tiempo reducido. En el procedimiento de la invención, se consiguen elevados esfuerzos de cizalladura por la utilización de un recinto capilar y el desplazamiento de la muestra, por ejemplo, haciendo pasar o alimentando la muestra a través del recinto capilar, de manera que se favorece la disgregación de la matriz que contiene los ácidos nucleicos.

Mediante el término disgregación se debe comprender cualquier rotura o disgregación de una matriz que contiene ácidos nucleicos, en la que los ácidos nucleicos encerrados dentro de la matriz o unidos a la matriz son liberados. Por ejemplo, se trata de la disgregación para una lisis. En una matriz que contiene ácidos nucleicos se trata, por ejemplo, de células y fracciones de células. Se pueden disgregar también otras estructuras que contienen, retenidos o unidos, ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, micelas u otros.

El reactivo de disgregación hace la función de favorecer la liberación de los ácidos nucleicos. De manera preferente se utiliza un reactivo de disgregación que contiene una enzima lítica y/o una sustancia caotrópica. Básicamente, el reactivo de disgregación debe estar en condiciones de atacar o disolver los complejos que contienen los ácidos nucleicos.

Como recinto capilar, se utiliza, por ejemplo, un capilar de vidrio y/o un capilar de poliestireno, en especial un capilar recubierto de borosilicato. Esto tiene la ventaja de que además de conseguir elevados esfuerzos de cizalladura, lo cual favorece la disgregación, el mismo recinto que se ha descrito se utilizará también para la inmovilización y manipulación posterior o elaboración de los ácidos nucleicos liberados. En cuanto al recinto capilar, se puede tratar también de un molde con orificios capilares o bien un intersticio entre la pared de un recipiente y un molde. Por ejemplo, la muestra será obligada a circular varias veces, en especial más de cinco veces o más de diez veces a través del recinto capilar para conseguir una disgregación rápida. La relación de volumen de la mezcla de disgregación, con respecto al recinto capilar, puede ser en este caso superior a 10:1 o superior a 20:1. Cuando la muestra es obligada a pasar por el recinto capilar, es posible utilizar un gran volumen de muestra, de lo que resulta una elevada sensibilidad y el mantenimiento del recinto capilar con dimensiones reducidas, lo cual aporta ventajas con respecto a la disposición general y en particular con respecto a una amplificación a realizar más adelante.

A efectos ilustrativos se describirá adicionalmente un procedimiento para conseguir ácidos nucleicos de microorganismos que se caracteriza porque se lleva a establecer contacto una muestra que contiene microorganismos con una superficie de poliestireno bajo condiciones tales en las que los microorganismos se unen a las superficies de poliestireno y otros componentes de la muestra se separan y se consiguen los ácidos nucleicos de los microorganismos. Las superficies de poliestireno son extraordinariamente apropiadas para la preparación de la muestra para el análisis de ácidos nucleicos. Los recipientes que presentan una superficie de poliestireno pueden ser utilizados para la preparación de la muestra en el análisis de ácidos nucleicos, de manera que se puede preparar una disposición altamente integrada. El poliestireno presenta, con respecto a las superficies de vidrio utilizadas hasta el momento para la inmovilización, múltiples ventajas, tales como una fácil procesabilidad, reducido peso y estabilidad mecánica incluso para grosores de pared reducidos.

Como superficie de poliestireno es apropiada, por ejemplo, la pared interna de un recinto de unión realizado en poliestireno o recubierto de poliestireno, pero también la utilización de bolitas de poliestireno o perlas de poliestireno entre otros. Por ejemplo, se puede utilizar un capilar de poliestireno. Para el aumento del rendimiento, y para mantener el recinto de unión lo más reducido posible, la muestra puede ser guiada varias veces sobre la superficie de poli-
estireno.

Tal como se ha explicado en lo anterior, es un objetivo sustancial del desarrollo de procedimientos para la determinación de ácidos nucleicos, la disminución de los aparatos necesarios y/o el tiempo necesario. Los ciclos de calentamiento y de refrigeración para la realización de una amplificación requieren una utilización sensible de tiempo, por lo que sería ventajoso dar a conocer un procedimiento en el que se pudiera reducir esta necesidad de tiempo.

A efectos ilustrativos se describirá, por lo tanto, un procedimiento para la amplificación de ácidos nucleicos que comprende fases a diferentes temperaturas que se caracteriza porque la amplificación es llevada a cabo en un recinto que está rodeado mediante una capa metálica calentable. La utilización de una capa metálica que se puede calentar, que rodea el recinto de amplificación, preferentemente de forma completa, permite conseguir periodos de calentamiento cortos. La refrigeración puede ser acelerada con respecto a los procedimientos conocidos, por ejemplo, por la proyección de aire o por la utilización de otras técnicas de refrigeración. La amplificación puede ser realizada, no obstante, de manera ventajosa en un recinto capilar. Dada la reducida masa de dicho recinto capilar, la velocidad de calentamiento y de refrigeración puede ser aumentada adicionalmente. Por ejemplo, se puede utilizar un capilar de vidrio y/o poliestireno que está rodeado por un elemento calentable, preferentemente por una capa metálica calentable que se extiende a toda su superficie.

Además, se tomará en consideración un recipiente de reacción capilar para llevar a cabo la amplificación de ácido nucleicos, el cual estará rodeado de una capa metálica calentable.

Los aspectos antes indicados de la invención pueden ser utilizados solos, o bien en la combinación deseada, para conseguir la mejora de análisis de ácidos nucleicos. Las mejoras indicadas son también ventajosas, en especial en un procedimiento automatizable. Se puede utilizar un análisis de ácidos nucleicos fácil y rápido, en especial para análisis de control, que deben posibilitar la determinación de si está indicada la realización de procedimientos de prueba engorrosos y costosos. Los procedimientos son apropiados asimismo para la investigación simultánea de varias muestras.

La invención será explicada adicionalmente mediante las figuras y ejemplos adjuntos, correspondiendo las figuras 1 a 7 a una realización preferente del procedimiento de la invención.

La figura 1 muestra una disposición de jeringa para la extracción de una muestra que contiene células, de manera que en la jeringa de la izquierda está dispuesto un producto caotrópico, y en la derecha de la jeringa de doble recinto con émbolo de aguja se ha dispuesto proteinasa K seca. De un recipiente de almacenamiento se aspira la muestra mediante el accionamiento del émbolo de la jeringa de la derecha.

La figura 2 indica la mezcla de la muestra con los reactivos previamente dispuestos, así como la disgregación de complejos que contienen ácidos nucleicos. Para ello, los émbolos de la jeringa son accionados de manera alternativa y se favorece la disgregación por el desplazamiento de la mezcla a través de un recinto capilar entre las jeringas.

La figura 3 muestra la unión de los ácidos nucleicos liberados sobre una pared capilar interna. Para ello, la muestra es impulsada, como mínimo, una vez, preferentemente varias, a través de un capilar pasando nuevamente al recipiente de la muestra, y es aspirada nuevamente en sentido contrario.

La figura 4 muestra el lavado de los ácidos nucleicos inmovilizados en la cara interna del capilar mediante una aspiración de un tampón de lavado.

La figura 5 muestra el secado de los ácidos nucleicos inmovilizados y lavados mediante la aspiración lenta de aire.

La figura 6 muestra la entrada de mastermix en los capilares, de manera que el mastermix eluye los ácidos nucleicos inmovilizados, y simultáneamente contiene todos los reactivos necesarios para la amplificación siguiente.

La figura 7 muestra la amplificación y detección de los productos de amplificación. Para ello, los capilares son cerrados mediante un tapón de cierre que contiene una ventana. Después de la realización de amplificación tiene lugar la detección mediante la emisión de luz sobre el dispositivo óptico mostrado (por ejemplo, mediante detección fluorescente).

Ejemplos 1. Jeringa de doble émbolo para la realización del procedimiento de la invención

La jeringa de doble émbolo utilizada corresponde principalmente a una jeringa de un cuerpo de tipo conocido realizada en polipropileno. Presenta entre los cuerpos de la jeringa y la salida una válvula o un grifo que se puede cerrar. El doble émbolo está realizado de manera tal que, en el interior del émbolo principal, discurre la varilla de empuje para el émbolo de mezcla.

El émbolo principal presenta en su extremo inferior dos zonas estancas. Por una parte, una junta para la pared de la jeringa y por otra una junta para la varilla de empuje del émbolo de mezcla. El émbolo principal será accionado mediante el cilindro de empuje que se desplaza en el cuerpo de la jeringa y que está realizado en sistema superior de forma tal que puede ser cogido y desplazado de manera segura con la mano o alternativamente con un elemento instrumental.

El émbolo de mezcla constituye en su extremo inferior con la pared de la jeringa un pequeño intersticio. La varilla de empuje del émbolo de mezcla discurre a través del piso o base del émbolo principal y sale para cada posición del émbolo principal hacia fuera del cilindro de empuje del émbolo principal. El extremo superior está realizado de forma tal que se puede coger y desplazar de manera segura con la mano o alternativamente con un elemento instrumental.

El grifo de cierre puede ser accionado, alternativamente, de forma manual o automática, de manera que puede adoptar de forma duradera ambas posiciones (abierto/cerrado).

La apertura de la jeringa para líquidos adopta forma de un cono habitual. De manera ventajosa, el cono es adecuado para la recepción de puntos de etiqueta de una sola utilización y de los capilares de amplificación.

2. Realización de un procedimiento según la invención, con dos jeringas separadas

En lugar de la jeringa de doble émbolo que se ha descrito anteriormente, se pueden acoplar también jeringas separadas, por ejemplo, dos jeringas individuales de polipropileno por medio de una válvula de tres vías de plástico. Para la captación de reactivos o bien de la muestra, se colocará una punta de pipeta de un solo uso mediante un cono en la válvula de tres vías. Entonces, el líquido será recogido por aspiración del émbolo de una de las jeringas. También se puede aspirar líquido adicional en la misma jeringa. Para la mezcla, la válvula de tres vías se dispone de forma tal que ambas jeringas quedan conectadas y se impide la salida de la muestra recogida o bien de los reactivos. Mediante accionamiento alternativo de ambos émbolos de la jeringa, el líquido será presionado a través del orificio del cuerpo de la válvula desde una jeringa a la otra y de esta manera será mezclado bajo una elevada fuerza de cizalladura.

3. Control de volumen de la mezcla de amplificación

Para aspirar el volumen de amplificación exacto en el capilar de amplificación, uno de los émbolos de la jeringa será realizado en forma de émbolo doble de forma tal que centralmente recibe un émbolo muy estrecho, por ejemplo, un émbolo a base de una varilla de metal o de material plástico, que presenta un diámetro que corresponde al diámetro interno del capilar de amplificación. De esta manera, es posible una admisión precisa de líquido en el capilar de amplificación y se evitará la aspiración imprevista de mastermix y eluido en el recipiente de desperdicios.

4. Capilar de amplificación

El capilar de amplificación utilizado tiene de manera preferente un diámetro interno aproximado de 1 mm y presenta en la superficie interna una superficie de vidrio. La superficie de vidrio puede ser lisa o rugosa o estructura para aumentar la superficie efectiva. El capilar por su parte puede estar realizado a base de metal, vidrio o material plástico, de manera que las paredes son realizadas lo más delgadas posibles. La superficie externa está realizada en un material buen conductor eléctrico, preferentemente, de un metal. El material buen conductor eléctrico tiene una resistencia eléctrica con un coeficiente de temperatura positivo o negativo. En ambos extremos de los capilares se encuentra un recubrimiento con conducción eléctrica elevada y pequeña resistencia de contacto para constituir un contacto eléctrico entre el capilar y el instrumento. Por la aplicación de una tensión eléctrica circula corriente eléctrica que calienta la capa conductora y, por lo tanto, el capilar. La corriente depende de la temperatura y por esta dependencia puede ser utilizada para la medición de la temperatura.

El capilar de amplificación estará dotado preferentemente de materiales de cierre, los cuales estarán constituidos a base de material plástico, en especial un material ópticamente transparente. Son especialmente preferentes el policarbonato y el polipropileno. De manera favorable, los tapones de cierre están realizados de forma tal que un tapón sobresale en el recinto interno del capilar y el exterior será rodeado por una capa o envolvente. A través del lado alejado del capilar, se puede emitir o introducir luz. Para ello, se puede integrar en el tapón de cierre un elemento óptico, por ejemplo, una ventana o una lente. En la pared de la capa del tapón puede estar integrado adicionalmente un elemento eléctricamente conductor, por ejemplo, un cable que al ser presionado el tapón establece sobre el capilar un contacto eléctrico.

5. Jeringa con lana de vidrio como fase de unión (filtro supletorio de la jeringa)

Para la unión de ácidos nucleicos según lisis caotrópica, sobre una superficie de una lana de vidrio, se integró lana de vidrio en un filtro supletorio de jeringa. La utilización directa de la lana de vidrio en el recinto de amplificación no es ventajosa a causa de la posible inhibición del material de lana de vidrio durante la reacción de amplificación, por ejemplo, una reacción PCR. Un residuo de 250 \mul de cultivo celular conteniendo clamidias (1%) fue sometido a lisado mediante lisis caotrópica. El lisado fue facilitado mediante una jeringa individual a lana de vidrio para conseguir la unión de los ácidos nucleicos. Como tampón de lisis, lavado y elución, se utilizaron las respectivas soluciones de los High Pure Plasmid Isolation Kits (Boehringer Mannheim Kat. No. 1754777) (Equipos de aislamiento de plásmidos de alta pureza). La lana de vidrio utilizada en la investigación era idéntica en su composición a la lana de vidrio de los tubos de filtro de los High Pure Plasmid Isolation Kits. A continuación, se lavó con tampón de lavado y se secó con aire. Se debe tener en cuenta en este caso que los restos de alcohol deben ser eliminados de la manera más completa posible del tampón de lavado. A continuación, los ácidos nucleicos fueron eluidos y se llevó a cabo una amplificación PCR y una detección por gel. De modo preferente, se lleva a cabo la elución de unos ácidos nucleicos con la solución principal que contiene ya todos los reactivos necesarios para la amplificación. Se determinó que el paso por la lana de vidrio conducía a una pérdida por amplificación en la reacción de PCR (10^{5}-CT-Plásmido); esto quedó compensado, de todas maneras, por la elevada capacidad de unión y elevada velocidad de unión del material de lana de vidrio.

Protocolo PCR

Se utilizaron como cebador para la amplificación los oligonucleótidos CP24 5'-GGGATTCCTGTAACAACAAGT
CAGG-3' (Posición 195-219 de pCTT1) y CP27: 5'-CCTCTTCCCCAGAACAATAAGAACAC-3' (Posición 401-376 y pCTT1) utilizados eventualmente en forma 5'-biotinilada o 5'-digoxigenilada.

El volumen de reacción era de 100 \mul (4 mM MgCl2, de modo correspondiente 0,1 mM dNTP, de modo correspondiente 300 nM cebador CP24 y CP27, 2,5 U Taq-polimerasa, 2 U UNG (Uracil-DNA-Glicosilasa) y matriz en tampón PCR (Roche Diagnostics No. de catálogo 1600753).

La conducción de la reacción fue la siguiente:

- 10 minutos a 37ºC, 5 minutos a 95ºC, 1 minuto a 60ºC

- 34 ciclos, cada uno de ellos de 30 segundos a 95ºC y 60 segundos a 60ºC

- 10 minutos a 72ºC

- Mantener a 50ºC

6. Jeringa con capilar de vidrio como base de unión

Una ventaja esencial en la preparación de la muestra en un capilar de vidrio, por ejemplo, en combinación con una jeringa, consiste en la simple capacidad de servicio manual, así como la simple integración con la amplificación siguiente. El capilar utilizado en la preparación de la muestra puede ser utilizado de manera directa con los ácidos nucleicos unidos después de llenado con mastermix para la amplificación. El recinto de preparación de la muestra es, por lo tanto, simultáneamente el recinto de amplificación. La utilización de un capilar de vidrio posibilita tanto una amplificación rápida como también una detección en línea y constituye, por lo tanto, una solución global altamente integrada para la detección de los ácidos nucleicos.

El material de la muestra se conducirá preferentemente varias veces a través del capilar de vidrio, por ejemplo, con una bomba elástica con tiempos de incubación de unos 20 minutos. No obstante, es también posible hacer pasar por el capilar la solución que contiene la muestra mediante una jeringa manual con un tiempo de incubación exclusivamente de 1 minuto, con lo que también se obtiene una sensibilidad suficiente de la prueba. Es especialmente ventajoso también en este caso, para la elución de los ácidos nucleicos inmovilizados, utilizar directamente una solución de mastermix, de manera que se pueda llevar a cabo la etapa de amplificación, por ejemplo, PCR, con eliminación de la etapa separada de elución.

7. Jeringa con capilares de poliestireno como fase de unión

Se determinó que se pueden ligar microorganismos en un medio acuoso en superficies de poliestireno. Así, por ejemplo, se unen las clamidias a un inyectable de poliestireno de una dosis en una etapa de incubación de 20 minutos y pueden ser transferidas directamente a un equipo de reacción PCR. Se utilizaron, por lo tanto, capilares de poliestireno conjuntamente con una jeringa individual para constituir un dispositivo altamente integrado para la determinación de ácido nucleico de clamidias. Para un tiempo de incubación de 1 minuto de una muestra que contenía clamidias se pudo conseguir, según el medio de dilución (H_{2}O, PBS u orina), una sensibilidad de entre 0,1 y 0,01% del residuo de cultivo celular.

Para la preparación de capilares de poliestireno se sometieron a estirado recipientes de reacción estándar de poliestireno (Sarstedt) después de calentamiento hasta estado capilar y se utilizaron en combinación con una jeringa individual. Se demostró que los capilares de poliestireno son extraordinariamente apropiados para la preparación de muestras de ácidos nucleicos. En una preparación de muestra de este tipo, 300 \mul de un resto de cultivo celular 0,01% se demostró en una siguiente reacción PCR y detección todavía sustancialmente como positivo. Se llegó, por lo tanto, mediante la utilización de un capilar de poliestireno a conseguir una sensibilidad comparable con los métodos de laboratorio conocidos hasta el momento.

8. Preparación de muestras con capilares de vidrio

Como capilar de vidrio se utilizó un capilar 5 \mul Modulohm (vidrio de borosilicato) con 3 cm de longitud. 250 \mul de muestra + 50 \mul de proteinasa K (20 mg/ml) y 250 \mul de agente de lisis (5,4 M GuSCN, 20% Triton X-100, 1% DTT, 10 mM Tris HCl, pH 6) se incubaron después de un corto período de 10 minutos en torbellino a 70ºC y finalmente se dejó enfriar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se conectó una jeringa (10 ml, Becton Dickinson) con intermedio de un corto tubo de plástico con el capilar de vidrio. El lisado fue aspirado y expulsado durante 2 minutos con un movimiento regular en la jeringa. Durante este tiempo tuvo lugar la unión de los ácidos nucleicos al capilar. A continuación, se hicieron pasar 800 \mul de tampón de lavado (20 mM NaCl, 10 mM Tris HCl pH 7,5, 70 Vol-% Etanol) con la jeringa a lo largo de unos 20 minutos a través del capilar y finalmente el capilar fue secado por aspiración de aire durante 1 minuto. A continuación, se hicieron pasar 100 \mul de tampón de elución (10 mM Tris HCl pH 8,5) con la segunda jeringa (1 ml; Fa. Becton Dickinson) en el capilar. La reacción PCR tuvo lugar en las condiciones indicadas en 5. Se detectó mediante una sonda de detección (5'-GTCTCTCATCGAGACAAAGTG-3' del plásmido Chlamydiatrachomatis pCTT [C. thrachomatis Basen 1-7496] correspondiente a la posición 354-374 de pCTT1 (Sriprakash y Macavoy, Plásmido 18 (1987), 205-214) después de un proceso estándar.

9. Preparación de la muestra con un capilar de poliestireno

Se calentaron recipientes de poliestireno (Sarstedt) con una lámpara de calentamiento y se pasaron a capilares con un diámetro comprendido entre 1 y 2 mm. Después del enfriamiento se cortaron piezas tubulares de 3 cm. Se conectó una jeringa (10 ml, Bectonc Dickinson) con intermedio de un corto tubo de plástico con el capilar de poliestireno. A continuación, se hizo pasar la muestra durante un minuto mediante la jeringa por los capilares. Finalmente, se hicieron pasar 800 \mul de tampón de lavado mediante la jeringa por el capilar y este fue secado por el paso de aire durante 1 minuto. La amplificación mediante una reacción PCR y detección mediante hibridación con una sonda de detección, tal como se ha descrito en 8 puede ser llevado a cabo finalmente, de manera directa, con utilización del capilar de poliestireno o por seccionamiento del capilar y transferencia a un recipiente de reacción PCR.

<110> Roche Diagnostics GmbH (Mannheim)

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<120> Sistema para el análisis simplificado de ácidos nucleicos

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<130> 20913PEP_DR

\vskip0.400000\baselineskip

<140> 01103113.5

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2001-02-09

\vskip0.400000\baselineskip

<150> DE 100 06 214.8

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-02-11

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 3

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<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial:

\hskip1cm

Oligonucleotido CP24 (Posición 195-219 de pCTT1)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

gggattcctg taacaacaag tcagg

\hfill

25

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial:

\hskip1cm

Oligonucleotido CP24 (Posición 401-376 de pCTT1)

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

cctcttcccc agaacaataa gaacac

\hfill

26

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial:

\hskip1cm

Sonda de detección de Chlamydia trachomatis

\hskip1cm

Plásmido (Posición 354-374)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtctctcatc gagacaaagt g

\hfill

21

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Claims

1. Procedimiento para la detección de ácidos nucleicos en una muestra que comprende las etapas:

(a) Purificar los ácidos nucleicos en un recinto de unión, de manera que los ácidos nucleicos son inmovilizados y se separan las impurezas,

(b) Eluir los ácidos nucleicos inmovilizados,

(c) Amplificar los ácidos nucleicos purificados en un recinto de amplificación, de manera que el recinto de amplificación comprende, como mínimo, una parte del recinto de unión,

(d) Detección de los productos de amplificación en un recinto de detección,

caracterizado porque el recinto de detección comprende, como mínimo, una parte del recinto de amplificación y/o, como mínimo, una parte del recinto de unión.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque, como mínimo, una parte de un recinto capilar es utilizada como recinto de unión y/o amplificación.

3. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la etapa (a) se lleva a cabo una absorción de ácidos nucleicos sobre una superficie de vidrio.

4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque para la elución en la etapa (b) se utiliza una solución que contiene todos los reactivos necesarios para la amplificación.

5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el recinto de amplificación puede estar termostáticamente controlado.

6. Procedimiento, según la reivindicación 5, caracterizado porque el recinto de amplificación está rodeado por una capa metálica calentable.

7. Procedimiento, según la reivindicación 6, caracterizado porque el recinto de amplificación está rodeado por una capa de metal completa.

8. Procedimiento, según la reivindicación 6 o 7, caracterizado porque se utiliza como recinto de amplificación un capilar de vidrio y/o poliestireno, que está rodeado por una capa metálica calentable.

9. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se lleva a cabo, antes de la etapa de purificación de ácidos nucleicos en la etapa (a), una degradación o lisis de las muestras que contienen los ácidos nucleicos.

10. Procedimiento, según la reivindicación 9, caracterizado porque para la degradación de una matriz que contiene ácido nucleico se hace pasar una mezcla de degradación que comprende la matriz que contiene el ácido nucleico y un agente de degradación a través de un recinto capilar, de manera que la matriz es rota y los ácidos nucleicos contenidos en la misma son liberados.

11. Procedimiento, según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado por la utilización de un reactivo de degradación que contiene una encima lítica y/o una sustancia caotrópica.

12. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque el recinto capilar es un capilar de vidrio y/o un capilar de poliestireno.

13. Procedimiento, según la reivindicación 12, caracterizado porque el recinto capilar es un capilar recubierto con borosilicato.

14. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizado porque la muestra se hace pasar varias veces a través del recinto capilar.

15. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, caracterizado porque la proporción de volumen de la mezcla de degradación al recinto capilar es superior a 10:1.

16. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la muestra comprende células y/o fracciones de células.

17. Procedimiento, según la reivindicación 16, caracterizado porque las células están unidas a una superficie de poliestireno.

18. Procedimiento, según la reivindicación 17, caracterizado porque para obtener ácidos nucleicos a partir de microorganismos se establece contacto de una muestra que contiene microorganismos con una superficie de poliestireno en condiciones en las que los microorganismos se unen a la superficie de poliestireno y otros componentes de la muestra son separados y los ácidos nucleicos son obtenidos a partir de los microorganismos.

19. Procedimiento, según la reivindicación 18, caracterizado porque se añade además una sal para facilitar la unión de los microorganismos a la superficie de poliestireno.

20. Procedimiento, según la reivindicación 18 ó 19, caracterizado por la utilización de un capilar de poliestireno.

21. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, caracterizado porque la muestra es obligada a pasar varias veces sobre la superficie de poliestireno.

22. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, caracterizado porque los microorganismos son clamidias.

23. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, caracterizado porque se utiliza orina como muestra.

24. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la purificación del ácido nucleico, la amplificación de los ácidos nucleicos purificados y la detección de los productos de amplificación se llevan a cabo en el mismo recinto de reacción.

25. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque todas las etapas son llevadas a cabo en un aparato cerrado.

26. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, para detectar patógenos en muestras biológicas.

27. Aparato para la detección de ácidos nucleicos en una muestra, particularmente, por un método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, que comprende:

(a) un recinto de unión para purificar ácidos nucleicos en el que los ácidos nucleicos son inmovilizados y las impurezas son separadas,

(b) un recinto de amplificación para amplificar ácidos nucleicos en el que el recinto de amplificación comprende, como mínimo, una parte del recinto de unión,

(c) un recinto de detección para detectar ácidos nucleicos y opcionalmente,

(d) recipientes y/o conducciones de alimentación para la muestra y/o para los reactivos, caracterizado porque el recinto de detección comprende, como mínimo, una parte del recinto de amplificación y/o del recinto de unión.

28. Aparato según la reivindicación 26 o 27, caracterizado porque el recinto de unión y/o el recinto de amplificación son, por lo menos parcialmente, un recinto capilar.

29. Aparato, según la reivindicación 28, caracterizado porque el recinto de amplificación está rodeado por una capa metálica calentable.