JP4930872B2

JP4930872B2 - 核酸検出システム及び核酸検出方法

Info

Publication number: JP4930872B2
Application number: JP2006072205A
Authority: JP
Inventors: 陽一赤上; 圭二片野; 博吉田; 慎真田; 国夫小松
Original assignee: Nipro Corp; Akita Prefecture
Current assignee: Nipro Corp; Akita Prefecture
Priority date: 2006-03-16
Filing date: 2006-03-16
Publication date: 2012-05-16
Anticipated expiration: 2026-03-16
Also published as: JP2007244286A

Description

本発明は、核酸検出システム及び核酸検出方法に関する。

近年、ゲノムシークエンシングの進展により各生物のゲノムの全塩基配列が明らかにされつつある中、この結果を有効に利用する技術が望まれている。核酸マイクロアレイは複数の遺伝子を同時に解析できる技術であり、塩基配列決定法のみではなく、遺伝子の発現量や多型などを効率よく調べる方法として開発され、テーラーメイド医療、菌類などの生物学的分類の特定及び疾病の診断などへの技術開発が展開されている。

一般に、テーラーメイド医療、ならびに生物学的分類又は変異体の同定に用いられうる核酸マイクロアレイは、特定の塩基配列を定性的に検出する程度で十分であり、試験紙のような安価な使い捨て用のものが求められている。

さらに、例えばポリメラーゼチェーンリアクション（以下、「ＰＣＲ」という。）法などの手法を用いて容易に核酸を増幅及び検出するために、当該使い捨て用のデバイスには、核酸を増幅するための機構と検出するための機構を同時に備えたものが近年開発されている。例えば、同一基板上に設けた増幅部位と核酸検出部位の付近に緩衝液保持部、試薬保持部、検体保持部等を設け、或いは緩衝液、試薬、反応液等の流通を可能とする液流路を同一基板上に設けることを特徴とするものが開示されている（特許文献１〜３）。このような反応基盤には液流路が設けられているものの、当該液流路を反応液が流れるのに多大な時間を要するという問題がある。また、場合によっては当該液流路を反応液が流れないということもある。

一方、液流路を設けないデバイスでは、ＰＣＲ反応を行う系が閉鎖系とならないため、特に９５℃付近で行われる熱変性工程時に水溶液系の反応液が蒸散してしまい、デバイスをセットするための機器が汚染されてしまうという問題がある。

係る課題は、ＰＣＲ反応中は反応液層を密閉するような蓋をすることにより解決可能のように思われるが、蓋を着脱する際の蒸散を防止することは困難である。ＰＣＲ溶液は非常に少量であるためにこのような蓋の着脱時における蒸散であっても機器への汚染の問題は深刻である。

特開２００３−３２５１９９号公報特開２００３−１７７１１４号公報特開２００３−３２５１９９号公報

したがって、核酸を検出する機器への核酸の汚染を防止するためのシステムを提供することを課題とする。言い換えれば、高温で反応する系での反応液の蒸散を防止する機構を備えたシステムを提供することを課題とする。

すなわち本発明は、以下からなる。
１．核酸を増幅・検出するためのシステムであって、
前記システムは、使い捨て用の核酸検出デバイス、並びに、核酸検出装置を含み、
前記核酸検出デバイスは、
デバイス本体と、
前記デバイス本体にスライド手段を嵌挿するためのスライド孔と、
前記デバイス本体の下部に設け、スライド孔に対して開口した液体貯留部と、
前記デバイス本体において液体貯留部の前記スライド孔を介して対向する上部に設け、デバイス本体の上面とスライド孔を連通する開口部と、
前記液体貯留部を密閉する蓋部材と、
前記デバイス本体のスライド孔に嵌挿したスライド手段と、
前記スライド手段に設け、前記液体貯留部と開口部とを連通する複数の空孔と、
及び、前記蓋部材の下面に設けた核酸マイクロアレイを備えている
核酸を増幅・検出するためのシステム。
２．核酸検出装置は、
前記核酸検出デバイスを保持するためのデバイスセット機構と、
前記デバイス本体の液体貯留部の下部に配置可能なヒーターと、
少なくとも前記蓋部材を着脱自在に保持し、上下に可動する保持手段と、
前記保持手段に設けたカウンターヒーターと、
液体を液体貯留部に注入する液体注入手段を備える
ことを特徴とする前項１の核酸を増幅・検出するためのシステム。
３．デバイス本体が、
前記液体貯留部を密閉する第１の蓋部材と、
前記デバイス本体のスライド孔に嵌挿したスライド手段と、
前記スライド手段に設け、前記液体貯留部と開口部とを連通する第１の空孔と、
前記スライド手段に設け、前記液体貯留部と開口部とを連通する第２の空孔と、
前記第２の空孔に具備し、前記液体貯留部を密閉する第２の蓋部材と、
及び、前記第２の蓋部材の下面に設けた核酸マイクロアレイを備え、
前記核酸検出装置が、
前記核酸検出デバイスを保持するためのデバイスセット機構と、
前記デバイス本体の液体貯留部の下部に配置可能なヒーターと、
少なくとも前記第１の蓋部材を着脱自在に保持し、上下に可動する第１の保持手段と、
前記第１の保持手段に設けたカウンターヒーターと、
液体を液体貯留部に注入する液体注入手段を備える
ことを特徴とする前項１又は２に記載の核酸を増幅・検出するためのシステム。
４．第１の蓋部材の下面に、第２の蓋部材を保持する蓋保持構造を具備する前項３に記載の核酸検出システム。
５．さらに、核酸検出装置には第２蓋部材を保持する第２の保持手段を備えた前項３又は４に記載の核酸検出システム。

本発明の核酸を増幅・検出するためのシステムにより、ＰＣＲ反応における高温での反応系での反応液の蒸散を防止し、核酸を検出する機器への核酸の汚染を防止することができ、効果的にＰＣＲ反応を行うことができる。さらに、高温での反応後に温度を冷却する時間を省略することができ、より迅速な核酸の検出を可能とする。

以下は本発明の核酸検出システムを図面を用いながら説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

本発明の核酸検出システムは、核酸検出デバイスＡ（単にデバイスＡともいう）、並びに、核酸検出装置Ｂ（単に装置Ｂともいう）を含む。本発明における核酸検出デバイスＡは、使い捨て用のものであり、後述する核酸検出装置Ｂにセットすることにより全自動で核酸を検出するためのデバイスをいう。また、核酸を増幅するための機構と、核酸を検出するための機構を共に備えたものをいう。

図１は、本発明の核酸検出デバイスＡを示す図である。デバイスＡは、デバイス本体１と、前記デバイス本体１にスライド手段３を嵌挿するためのスライド孔１１と、前記デバイス本体１の下部に設け、スライド孔１１に対して開口した液体貯留部１２と、前記デバイス本体１において液体貯留部１２の前記スライド孔を介して対向した上部に設け、デバイス本体１の上面とスライド孔１１を連通する開口部１３と、前記液体貯留部１２を密閉する第１の蓋部材２１と、前記デバイス本体１のスライド孔１１に嵌挿したスライド手段３と、前記スライド手段３に設け、前記液体貯留部１２と開口部１３とを連通する第１の空孔３１と、前記スライド手段３に設け、前記液体貯留部１２と開口部１３とを連通する第２の空孔３２と、前記第２の空孔３２に具備し、前記液体貯留部１２を密閉する第２の蓋部材２２、及び、前記第２の蓋部材２２の下面に設けたＤＮＡアレイ４を備える。

デバイスＡを構成する素材は、高分子材料、無機材料、及び、金属材料のいずれも選択することができるが、作業者が怪我をすることなく安全に取り扱うことができる観点から、高分子材料が好ましい。高分子材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリルアミド、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリテトラフロオロエチレン、ポリアミド及びエポキシ樹脂などの汎用の高分子材料が適宜使用できるため、特に限定されるものではないが、製造が容易であり、安価であり、変形しにくい適当な硬度を有する観点から、ポリカーボネート及びポリプロピレンが好ましい。

上記の高分子材料の成形は、当業者が適宜設定しうる製法により行うことができる。例えば、押出成形、射出成形、圧縮成型及び真空形成などが挙げられる。これらの製法の中でも製造が容易であり、製造コストが安価である観点から、押出成形及び射出成形が好ましいが、本発明はこれらの製法に限定されるものではない。

本発明のデバイスＡは、主に４つの構成を備えるものである。つまり、デバイス本体１と、当該デバイス本体に嵌挿し、摺動可能なスライド手段３と、第１の蓋部材２１、並びに、ＤＮＡアレイ４を含む第２の蓋部材２２である。

デバイス本体１には、スライド手段３を嵌挿するためのスライド孔１１と、液体を貯留するための液体貯留部１２、及び、前記デバイス本体１において液体貯留部１２の前記スライド孔１１を介して対向する上部に設け、デバイス本体の上面とスライド孔１１を連通する開口部１３が具備される。

スライド孔１１は、後述するスライド手段３を嵌挿・摺動可能な構造であれば特に限定されるものではないが、スライド孔１１とスライド手段３との間には隙間が少なくなるように設計される。

液体貯留部１２は、主にＰＣＲ反応を行うための液層である。その容積は、ＰＣＲ反応が可能であれば特に限定されるものではないが、約０．０１〜１．０ｍｌ、好ましくは約０．０２〜０．１ｍｌである。また、液体貯留部１２の開口の面積は、ＰＣＲ反応液の蒸散を防止する観点から、なるべく小さい方が好ましく、約０．１〜３００ｍｍ^２、好ましくは約１〜２０ｍｍ^２である。

また、開口部１３は、前記デバイス本体１において液体貯留部１２の前記スライド孔１１を介して対向する上部に設ける。開口部１３は、デバイス本体の上面とスライド孔１１を連通する。これは、後述するスライド手段３がスライド孔１１に嵌挿されることにより、スライド手段３に具備する第１の空孔３１及び第２の空孔３２が、液体貯留部１２及び開口部１３と一体となり、１つの空間を形成させるためである。詳しくは、図１及び図２を参照すればよい。開口部１３の内径は、ＰＣＲ液の蒸散を防止する上で重要な要素となる。つまり、少なくとも最上部の内径は、後述する第１の蓋部材２１の外径以下に設計される。

スライド手段３は、デバイス本体１におけるスライド孔１１に嵌挿・摺動することができる。スライド手段３は、第１の空孔３１と第２の空孔３２を備える。核酸を検出する前の初期の状態では、図１及び図２に示すように、第１の空孔３１が、液体貯留部１２及び開口部１３と一体となり、１つの空間を形成する。この事により、後述する核酸検出装置Ｂの第１の保持手段７１が、当該空間内を上下自在に可動することができる。第１の空孔及び第２の空孔の内径は、後述する第１の蓋部材２１及び第２の蓋部材２２の外径よりも若干大きめに設計すればよく、特に限定されるものではないが、後述する第１の蓋部材２１及び第２の蓋部材２２の外径よりも約０．０５〜２０ｍｍ、好ましくは約１〜５ｍｍだけ大きいことが好ましい。

第１の蓋部材２１及び第２の蓋部材２２は、前記液体貯留部１２を密封するための部材をいう。蓋部材２１、２２の構造は、液体貯留部１２を密封することができれば特に限定されるものではないが、その外径は少なくとも液体貯留部の開口よりも大である必要がある。具体的には、約０．０５〜２０ｍｍ、好ましくは約１〜５ｍｍである。

また、第２の蓋部材２２の下面には、核酸マイクロアレイ４を設ける。核酸マイクロアレイとは、検出対象の核酸、又は、検出対象の核酸とハイブリダイズしうる一本鎖の核酸を基材上に固定化したものをいい、一般的にはＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイと称するものをいう。上記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＰＮＡが挙げられるが、使用頻度の観点からＤＮＡが多く使用される。

基材に固定されうる核酸は、検体核酸であっても、核酸プローブであってもよいが、予め工業的に製造できる観点から核酸プローブであることが好ましい。検体核酸とは、検出の対象となる核酸を、核酸プローブとは、当該検体核酸とハイブリダイズしうる核酸をいう。核酸プローブの製造は、特に限定されるものではなく、例えば、合成されたＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）又はｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡであってもよい。オリゴヌクレオチドの合成は、市販の核酸の自動合成機などで合成することができる。

さらに、上記核酸プローブの塩基配列は、検体核酸とハイブリダイズすることが可能な範囲内であれば、前記特定の塩基配列の完全相補的な塩基配列から塩基の挿入、変異及び欠失された塩基配列であってもよい。しかしながら、例えば、一塩基レベルの変異を検出することを目的とした場合、反応精度の観点から、完全相補的な塩基配列であることが好ましい。

また、上記核酸プローブの塩基数は、検出する特定の塩基配列の種類によって異なるため、特に限定されるものではない。例えば、生物から抽出されたゲノムＤＮＡの１塩基レベルの変異を検出する場合は、検出する時の温度にもよるが、検出精度の観点から約１０〜３０塩基、好ましくは約１２〜２６塩基である。

また、核酸マイクロアレイに使用される基材としては、上記核酸を固定しうる材料であればよく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート及びニトロセルロースなどの有機材料、ガラス及びシリカなどの無機材料、並びに、金、銀及び胴などの金属材料などが挙げられる。これらの中でも成形加工性が容易である点から、有機材料が好ましく、さらに好ましくは、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル及びポリアミドであるが、これに限定されるものではない。

さらに、基材として有機材料を選択する場合、発色による検出が明確に判断することができる観点から、白色を呈した材料が好ましいが、本発明はこれに限定されるものではない。

基材の形状としては、長方形状のフィルム及び基板が好ましい。また、基材の大きさについては、検出を容易にする観点から、検出する面はある程度の面積が必要である。例えば、基材が長方形状のフィルム及び基板である場合、上表面の面積は、取り扱いが容易である観点から、約４０〜１０００ｍｍ^２、好ましくは約６０〜３００ｍｍ^２である。

基材は、当業者により状況に応じて製造することができ、当業者が適宜設定できるものであるため特に限定されるものではない。例えば、押出成形、射出成形、溶融成形及び圧縮成形などが挙げられる。特に製造コスト及び容易性の観点から、押出成形が好ましい。

上記検体核酸又は核酸プローブは、物理的又は化学的処理により基材上に固定化される。

物理的な処理による固定化としては、検体核酸又は核酸プローブの溶液を基材にスポッティングする方法であれば特に限定されるものではない。このようなスポッティングの方法としては、ディスペンサなどを用いた押出し法及びインクジェット法などが挙げられる。製造コストの観点からは押出し法が、固定化の精度の観点からはインクジェット法が好ましく、特に限定されるものではない。

また、このような物理的な処理により固定化する場合は、上記核酸プローブに無関係な塩基配列を付加すれば、ＵＶ照射により基材に固定化率が向上して好ましい。前記核酸プローブに無関係な塩基配列とは、ポリアデニン、ポリシトシン、ポリチミン及びポリグアニンなどが挙げられるが、固定化率が最も高い観点からポリチミンが好ましい。

また、核酸プローブは親水性高分子であるため、基材に何らかの処理を行ってもよい。例えば：
(A) ポリリジンなどのポリカチオン性の高分子を基材表面に被覆する方法；
(B) 基材がガラスなどの無機材料である場合、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤などで処理する方法；
(C) 基材が金などの金属材料である場合は、２−アミノエタンチオールなどのアミノ基を有するチオールもしくはジスルフィド化合物などで担体表面を処理する方法；
などが挙げられる。

一方で、共有結合による化学に固定化する方法としては、核酸プローブの末端に基材と共有結合形成可能な官能基を修飾する方法、もしくは、核酸プローブの末端及び基材にそれぞれ共有結合可能な官能基を修飾する方法などが挙げられる。例えば：
(a) 基材が、ガラス及びシリコンなどの無機材料の場合、核酸検出用プローブの末端にトリメトキシシラン、トリエトキシシランなどのシランカップリング反応が可能な官能基を修飾し、シランカップリング反応により固定化する方法；
(b) 基材が、ガラス、シリコンなどの無機材料の場合、上記無機材料基材上に、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤で処理することにより、基材の表面をシランケップリング結合によりアミノ化する。一方で、核酸プローブの末端にカルボン酸を修飾する。そして、基材のアミノ基と核酸プローブのカルボン酸のアミノカップリング反応によりアミド結合を形成させて固定化する方法；
などが挙げられる。

また、基材が金、銀などの金属材料の場合であっても、当業者であれば、前記シランカップリング結合を、金属−チオール又は金属−ジスルフィド結合に置きかえることによって固定化することは容易に想到しうる。

以上の固定化方法の中でも核酸の固定化に関しては、製造が容易である観点から、上記核酸プローブの末端にポリチミンを付加し、ＵＶ照射により固定化する方法が好ましい。

また、基材にプラズマ処理などの表面処理を施すことにより核酸の固定化量はさらに増加する。プラズマ処理とは、不活性ガス雰囲気下で放電する事により、前記不活性ガスの電離作用によって生じるプラズマを基材表面に照射し、当該表面をエッチング、濡れ性の向上及び官能基の導入などを効果を付与する処理をいう。放電としては、コロナ放電（高圧低温プラズマ）、アーク放電（高圧高温プラズマ）及びグロー放電（低圧低温プラズマ）などが挙げられる。これらの中でも表面処理の反応性がよい観点から、コロナ放電が好ましいが、本発明はこれらに限定されるものではない。

前記プラズマ処理における不活性ガスとしては、窒素ガス、アルゴンガス、酸素ガス、ヘリウムガス、ネオンガス及びキセノンガスなどが挙げられる。プラズマ処理後の核酸の固定量が最も高くなる観点から、窒素ガス又は酸素又はアルゴンガスが好ましい。特に、窒素ガスは、リン酸骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡを基材に固定する場合、基材表面にアミン及び／又はアミノ基を発生させ、当該表面の濡れ性の向上及び表面のイオンチャージによって、より強固に核酸を固定することができて，また酸素の場合は表面を容易に削りとることができるため，微小な突起部が形成される．これにより電荷が集中し，そこへＤＮＡが滴下されると固定が容易に可能となり好ましい。

以上に説明した核酸マイクロアレイ４を含む第２の蓋部材２２は、スライド手段３における第２の空孔３２に具備される。スライド手段３を摺動し、第２の空孔３２が液体貯留部１２と開口部１３と一体となり空間を形成した場合、第２の空孔３２に具備していた第２の蓋部材は液体貯留部１２の蓋として機能する。この際、第１の蓋部材２１は、後述する核酸検出装置Ｂに備えた第１の保持手段７１により保持され、デバイス本体１の開口部１３の位置に配置される。つまり、第１の蓋部材２１は開口部１３に配置することで空間を密封するため、スライド手段３がスライドしている間であっても、液体貯留部１２に存在する液体が蒸散することがない。そして今度は、スライドされてきた第２の蓋部材２２が、液体貯留部１２の蓋となるのである。

一方、本発明の核酸検出装置Ｂ（外面図は図示せず）は、前記核酸検出デバイスＡをセットする機構を備え、使用者の施設に導入・管理されうるものをいう。具体的には、前記核酸検出デバイスＡを保持するためのデバイスセット機構５と、デバイス本体１の液体貯留部１２の下部に配置可能なヒーター６１と、少なくとも前記第１の蓋部材２１を着脱自在に保持し、上下に可動する第１の保持手段７１と、前記第１の保持手段７１に設けたカウンターヒーター６２と、液体を液体貯留部に注入する液体注入手段８を備える。

デバイスセット機構５（図示せず）は、上記デバイスＡを装置Ｂに固定しうるものであれば特に限定されるものではないが、デバイスＡにおける液体貯留部１２の開口が上を向くように配置されることは自明である。デバイスＡの装置Ｂへの固定は、螺合、係合、挟持及び嵌合などの種々の機構で達成される。

ヒーター６１は、デバイスＡの液体貯留部１２中の液体の温度を制御するためのものであり、デバイスセット機構５にて固定されたデバイスＡの液体貯留部１２の下に配置される。ヒーター６１は、後述するカウンターヒーター６２とセットで温度調節の効果を奏する。本発明の液体貯留部１２では主にＰＣＲ反応を行うため、ヒーター６１及びカウンターヒーター６２は、変性工程の約９２〜９５℃、迅速冷却工程の約２〜２０℃、アニール工程の約５０〜６５℃、伸長工程の約７０〜７５℃の３種類の温度を付与することが可能とする。もちろん、設定温度は当業者が他の核酸増幅反応などに応じて適宜選択できるものであるから、上述したＰＣＲ反応に用いる温度条件のみに限定されるものではない。

装置Ｂには、デバイスＡの第１の蓋部材２１を制御するための第１の保持手段７１を備える。第１の保持手段７１は第１の蓋部材２１を、螺合、係合、挟持及び嵌合などの機構により保持し、核酸検出デバイスＡの液体貯留部１２の蓋をする。第１の保持手段７１は上下に可動することができ、液体貯留部１２にてＰＣＲ反応などを行っている時は、第１の蓋部材２１を下に押しつけることにより、より強固に液体貯留部１２内の系を密閉することができる。さらに、第１の保持手段７１は、第１の蓋部材２１を開口部１３に移動させることにより、上述した空間で密閉させることができる。

また、第１の保持手段７１にはヒーター６１に対応するカウンターヒーター６２を具備する。これにより、第１の蓋部材２１で液体貯留部１２を密閉した状態で液体貯留部１２内の系の温度を制御することができる。

液体注入手段８は、液体貯留部１２に検体、ＰＣＲ反応液、ハイブリダイズ液及び／又は反応検出液を注入するものであれば特に限定されるものではない。例えば、チューブ及びノズルなどを用いることができる。

ＰＣＲ反応液、ハイブリダイズ液及び／又は反応検出液等の試薬は、遮光されたフィルムで密封保持され、装置に搭載される。各処理工程で装置に備え付けのカッターによって開封され、注入手段を通じてデバイスに供給される。

以下に本発明の核酸検出システムにおける核酸の検出方法について図面を用いて説明するが、本発明これらに限定されるものではない。

まず、検体核酸を調製する。検体核酸は、測定の目的に応じて動物の生体試料からゲノムＤＮＡを抽出する。生体試料とは、血液、唾液又は毛髪などが挙げられ、好ましくは、血球細胞、表皮細胞及び粘膜細胞などの各種ヒト細胞である。生体試料からＤＮＡを抽出する方法は、公知の方法で行うことができ、例えば、フェノール抽出法、グアニジンチオシナネート抽出法及びバナジルリボヌクレオシド複合抽出法などが挙げられる。

次に、核酸検出デバイスＡを核酸検出装置Ｂにセットする。核酸検出デバイスＡは、核酸検出装置Ｂに備えたデバイスセット機構５により固定される。また、第１の空孔３１は、液体貯留１２及び開口部１３と一体となり空間を形成した状態である。そして、検体及びＰＣＲ反応液を液体貯留部１２に導入した後、第１の保持手段７１で保持した第１の蓋部材２１にて液体貯留部１２を密閉する（図１）。

次に密閉された液体貯留部１２内にてＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ法は、例えば、（I）二本鎖ゲノムＤＮＡを約９２〜９５℃、約０．１秒〜１分間の反応条件で熱処理することにより一本鎖にする変性工程、（II）前記一本鎖ＤＮＡのそれぞれに約５０〜６５℃を約０．１秒〜１分間の反応条件で、少なくとも２種類の増幅プライマーを結合させることによりＰＣＲの反応開始点となる二本鎖部分を作製するアニール工程、並びに、（III）約７０〜７５℃を約０．１秒〜５分間の反応条件でＤＮＡポリメラーゼを用いて反応させる鎖伸張工程の（I）〜（III）の工程を、１〜４０回繰り返すことで核酸を増幅することができる。温度は、核酸検出装置Ｂに備えたヒーター６１及びカウンターヒーター６２により制御される。また、ＰＣＲ反応における液量は、液体貯留部１２の大きさに一存するため特に限定されるものではないが、例えば約１０〜１，０００μｌ、好ましくは２０〜１００μｌである。

ここで、上記ＰＣＲ法に用いられるプライマー対は、上記抽出されたゲノムＤＮＡとハイブリダイズすることができ、上記特定の塩基配列を含む核酸を増幅しうる塩基配列を有し、その重合度は約１５〜４０塩基程度のものであればよい。前記プライマーは、上記核酸プローブと同様自動合成機などで合成することができる。

また、標的核酸の増幅の際に、核酸の検出を容易ならしめるために、標識することが好ましい。標識方法としてはＲＩ法と非ＲＩ法とがあるが、取り扱いの容易さから非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ法としては蛍光標識法、酵素標識法等があげられる。蛍光標識としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができ、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅ^(TM)シリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ_２ −アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、並びに、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）などがあげられる。酵素標識としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。

ＰＣＲ反応後、第１の保持手段７１及び第１の蓋部材２１は上方に移動する。これにより、第１の空孔３１、液体貯留１２及び開口部１３で一体となった空間は、第１の蓋部材２１により密閉される（図２）。

次にスライド手段３は、第２の空孔３２が第１の空孔３１の位置に配置するように摺動する。これにより第２の空孔３２、液体貯留１２及び開口部１３が一体となった空間を形成する。この際、第２の空孔３２に具備されていた第２の蓋部材３２が液体貯留部１２の蓋となり密閉される（図３）。これらの機構により、液体貯留部１２中のＰＣＲ反応液の温度が常温になるまで待つことなく次のハイブリダイズ反応を開始することができ、核酸の検出の時間短縮を可能とする。また、核酸検出装置ＢにＰＣＲ反応液が蒸散することがないので、装置Ｂが汚染されることがない。また、この際にアルカリ溶液を添加、又は、ヒートショックにより増幅した核酸を変性・一本鎖にしてもよいし、非対称ＰＣＲ反応を行うことにより特異的に一本鎖の核酸のみを増幅してもよい。

第２の蓋部材２２の制御は、装置Ｂに具備される第２の蓋部材２２を保持する第２の保持手段７２にて行う（図４）。また、第２の蓋部材２２の制御の他の実施例として、第１の保持手段７１で保持した第１の蓋部材２１を第２の蓋部材２２に接続することにより、第１の保持手段７１を以て制御してもよい。この際、第１の蓋部材２１の下面には第２の蓋部材２２を接続する機構を備えることにより、第１の蓋部材２１と第２の蓋部材２２とを接続する。

ハイブリダイズ液は、予めヒーターで約４０〜５０度に暖められている。第２の蓋手段２２がＰＣＲ貯留部１２を密閉した状態で、液体注入手段８を通じて注入される（図５）。その後、第２の蓋部材２２を開封することにより、ＰＣＲ貯留部１２に存在する増幅した検体核酸と、ハイブリダイズ液が混合される。つまり、第２の蓋部材２２の下面に配置する核酸マイクロアレイ４が、ハイブリダイズ反応液に浸漬する。この際、第２の保持手段７２を上下に稼働させることにより攪拌すると反応がより迅速に進行して好ましい（図６）。

ＰＣＲ反応液に対するハイブリダイズ液の容量は、ＰＣＲ反応液がハイブリダイズ反応を阻害しない程度であればよく、例えば、ＰＣＲ反応液の容量を１００％とした場合、約100〜1,000,000％、好ましくは約1,000〜100,000％である。つまり、ＰＣＲ反応液をハイブリダイズ反応液により希釈することになる。この際、液体貯留部１２、開口部１３及び第２の空孔３２が一体となり形成される空間が一つの反応液槽となるため、ハイブリダイズ液を過剰に注入することにより、液体貯留部１２から溢れ出ても問題ない。

ハイブリダイズ反応の温度条件は、基材に固定化されたＤＮＡプローブの熱変性温度による。例えば、前記ＤＮＡプローブの熱変性温度が、約５５．０〜７５．０℃程度である場合は、約６１．５〜６２．５℃が一般的である。また、この際未反応の検体核酸及び／又は核酸プローブは洗浄工程により除去することが好ましい。

検出方法は、標識に応じて適宜設定することができる。例えば、ＲＩ標識の場合は、オートラジオグラフィーにより検出することができる。蛍光標識の場合は、それぞれの蛍光標識に適した励起波長の光を照射し、その蛍光強度を測定することにより、検出することができる。酵素標識の場合、各酵素の基質を添加して測定することができる。アルカリホスファターゼを用いた場合、例えば、基質としてｐ−ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸ｐ−トルイジン塩（ＢＣＩＰ）を添加し、その発色の程度を目視又は、ＣＣＤカメラやデンシトメーター等により測定することができる。

アルカリホスファターゼ標識と基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰとの組み合わせによる検出方法では、測定結果が目視観察できることから、臨床診断に好適に用いられうる。

なお、本発明において解析は、各データを画像処理したデジタル画像によって、処理アウトプットすることによっても好適に達成できる。

本発明の核酸検出システムは、核酸検出デバイスＡ、並びに、核酸検出装置Ｂを含む。核酸検出デバイスＡには高温で反応を行う系での反応液の蒸散を防止する機構を備え、核酸検出装置Ｂにより当該デバイスＡを制御する。このことにより、核酸を検出する機器への核酸の汚染を防止するためのシステムを提供することができる。特にＰＣＲ反応などの高温での反応後に温度を冷却する時間を省略し、より迅速な核酸の検出を可能とする。

核酸検出デバイスＡにおいて、液体貯留部１２を密閉した状態を示す図である。核酸検出デバイスＡにおいて、第１の保持手段７１及び第１の蓋部材２１を上方に移動させることで、第１の空孔３１、液体貯留１２及び開口部１３で一体となった空間が、第１の蓋部材２１により密閉された状態を示す図である。核酸検出デバイスＡにおいて、スライド手段３を、第２の空孔３２が第１の空孔３１の位置に配置するように摺動させ、第２の空孔３２、液体貯留１２及び開口部１３が一体となった空間を形成し、第２の空孔３２に具備されていた第２の蓋部材２２が液体貯留部１２の蓋となり密閉される状態を示す図である。核酸検出デバイスＡにおいて、第２の空孔３２において、液体貯留部１２を密閉させ、ＰＣＲ反応を行う状態を示す図である。第２の蓋部材２２の制御は、装置Ｂに具備される第２の保持手段７２によって行われる。核酸検出デバイスＡにおいて、第２の蓋手段２２によって液体貯留部１２を密閉した状態で、液体注入手段を通じてハイブリダイズ液が注入される状態を示す図である。核酸検出デバイスＡにおいて、第２の保持手段７２を上下に稼働することにより攪拌する状態を示す図である。

符号の説明

１デバイス本体
１１スライド孔
１２液体貯留部
１３開口部
２１第１の蓋部材
２２第２の蓋部材
３スライド手段
３１第１の空孔
３２第２の空孔
４核酸マイクロアレイ
５デバイスセット機構
６１ヒーター
６２カウンターヒーター
７１第１の保持手段
７２第２の保持手段
８注入手段

Claims

核酸を増幅・検出するためのシステムであって、
前記システムは、使い捨て用の核酸検出デバイス、並びに、核酸検出装置を含み、
前記核酸検出デバイスは、
デバイス本体と、
前記デバイス本体にスライド手段を嵌挿するためのスライド孔と、
前記デバイス本体の下部に設け、スライド孔に対して開口した液体貯留部と、
前記デバイス本体において液体貯留部の前記スライド孔を介して対向する上部に設け、デバイス本体の上面とスライド孔を連通する開口部と、
前記液体貯留部を密閉する第１の蓋部材と、
前記デバイス本体のスライド孔に嵌挿したスライド手段と、
前記スライド手段に設け、前記液体貯留部と開口部とを連通する第１の空孔と、
前記スライド手段に設け、前記液体貯留部と開口部とを連通する第２の空孔と、
前記第２の空孔に具備し、前記液体貯留部を密閉する第２の蓋部材と、
及び、前記第２の蓋部材の下面に設けた核酸マイクロアレイを備えている
核酸を増幅・検出するためのシステム。
核酸検出装置は、
前記核酸検出デバイスを保持するためのデバイスセット機構と、
前記デバイス本体の液体貯留部の下部に配置可能なヒーターと、
少なくとも前記蓋部材を着脱自在に保持し、上下に可動する保持手段と、
前記保持手段に設けたカウンターヒーターと、
液体を液体貯留部に注入する液体注入手段を備える
ことを特徴とする請求項１の核酸を増幅・検出するためのシステム。
前記第１の蓋部材が、当該部材の下面に第２の蓋部材を接続する機構を具備してなる請求項２に記載の核酸検出システム。