ES2294231T3 - Metodo mejorado para tratamiento por bisulfito. - Google Patents
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Abstract
Método para la conversión de una base citosina de un ácido nucleico en una base uracilo mediante el tratamiento con bisulfito caracterizado porque el ácido nucleico está unido a una fase sólida durante las etapas de desaminación y/o desulfonación, caracterizado porque la fase sólida es seleccionada de vidrio o sílice, un material conteniendo vidrio o sílice, un intercambiador de iones o hidroxiapatita.
Description
Método mejorado para tratamiento por
bisulfito.
La presente solicitud está dirigida a un método
para llevar a cabo una reacción de bisulfito con el fin de
determinar las posiciones de metilación en un ácido nucleico, esto
es las citosinas metiladas y no metiladas, mediante el cual el
ácido nucleico es unido a una fase sólida durante la etapa de
desaminación y/o desulfonación de la reacción de bisulfito. La fase
sólida es preferiblemente un material que comprende vidrio o sílice,
más preferiblemente lana de vidrio, una membrana de vidrio o una
partícula magnética de vidrio. Además, se describe la utilización
de una fase sólida para unir un ácido nucleico durante la etapa de
desaminación y/o desulfonación de la reacción de bisulfito y un kit
que contiene un reactivo bisulfito y una fase sólida.
Los genes constituyen únicamente una pequeña
proporción del genoma total de los mamíferos, y el control preciso
de su expresión en presencia de un impresionante fondo de ácido
desoxirribonucleico (ADN) no codificador presenta un problema
sustancial para su regulación. El ADN no codificador que contiene
intrones, elementos repetitivos y elementos que pueden ser
transpuestos potencialmente activos, requiere mecanismos eficaces
para su silenciación a largo plazo. Los mamíferos parecen haber
aprovechado las posibilidades permitidas por la metilación de las
citosinas para proporcionar un mecanismo heredable para alterar las
interacciones ADN-proteína con el fin de favorecer
tal silenciación. La metilación del ADN es esencial para el
desarrollo de los mamíferos y desempeña una función potencial
durante el envejecimiento y el cáncer. La implicación de la
metilación en la regulación de la expresión génica y como
modificación epigenética que marca los genes sellados está bien
establecida. En los mamíferos, la metilación tiene lugar únicamente
en los residuos de citosina y más específicamente sólo en los
residuos de citosina adyacentes a un residuo de guanosina, esto es
en la secuencia CG. La detección y la generación de mapas de los
sitios de metilación del ADN son etapas esenciales para comprender
las señales moleculares que indican si una secuencia dada está
metilada.
Esto se lleva a cabo actualmente mediante el
método llamado del bisulfito descrito por Frommer, M. y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 1827-31, para la
detección 5-metil-citosinas. El
método del bisulfito para el mapeo de
5-metil-citosina utiliza el efecto
de que el hidrógeno sulfito de sodio reacciona con citosina pero no
reacciona o reacciona sólo débilmente con
5-metil-citosina. La citosina
reacciona con el bisulfito para formar un producto intermedio de la
reacción que es citosina sulfonada, la cual es susceptible a
experimentar una desaminación que tiene como resultado un uracilo
sulfonado que puede ser desulfonado a uracilo bajo condiciones
alcalinas. Es de conocimiento público el que el uracilo tiene el
comportamiento de apareamiento de bases de la timina diferente al
de la citosina de partida, mientras que la
5-metil-citosina tiene el
comportamiento de apareamiento de bases de la citosina. Esto hace
posible discriminar entre citosinas metiladas o no metiladas
mediante, por ejemplo, secuenciación genómica con bisulfito (Grigg,
G. y Clark, S., Bioessays 16 (1994) 431-6; Grigg,
G.W., DNA Seq. 6 (1996) 189-98) o PCR específica de
metilación (MSP) descrita en US 5.786.146.
Existen varios documentos dirigidos a aspectos
específicos de la reacción de bisulfito. Benyajati, C. y col.,
Nucleic Acids Res. 8 (1980) 5649-67, realizan
investigaciones generales acerca de la modificación con bisulfito
de la 5-metil-desoxicitosina y de la
desoxicitosina. Olek, A. y col., Nucleic Acids Res. 24 (1996)
5064-6, describen un método para la secuenciación
de bases con bisulfito en el cual el tratamiento con bisulfito y
las etapas posteriores de PCR se llevan a cabo sobre un material
incluido en esferas de agarosa. En el método del bisulfito descrito
por Clark, S.J. y col., Nucleic Acids Res. 22 (1994)
2990-7, la muestra es desalada después de la
desaminación.
Raizis, A.M. y col., Anal. Biochem. 226 (1995)
161-6, describen un método con bisulfito para el
mapeo de 5-metil-citosina que
minimiza la degradación del molde. Investigan la influencia del pH,
de la temperatura y del tiempo de reacción. Investigaciones
similares han sido realizadas por Grunau, C. y col., Nucleic Acids
Res. 29 (2001) E65-5 o por Warnecke, P.M. y col.,
Methods 27 (2002) 101-7. Componentes adicionales
diferentes en la mezcla de bisulfito están descritos por WO
01/98528 o por Paulin, R. y col, Nucleic Acids Res. 26 (1998)
5009-10. En WO 02/31186 se describe una etapa de
bisulfito adicional después del tratamiento con bisulfito y PCR.
Komiyama, M. y Oshima, S., Tetrahedron Letters 35 (1994)
8185-8188 investigaron la catalisis de la
desaminación de citosina inducida por bisulfito en
oligodesoxirribonucleótidos.
Existen kits para llevar a cabo tratamientos con
bisulfito que están disponibles comercialmente en Intergen,
distribuidos por Serologicals Corporation, Norcross, GA, EE.UU., por
ejemplo el kit de modificación de ADN
CpGenome^{TM}.
CpGenome^{TM}.
Hayatsu y col., Chem. Pharm. Bull. 45(8)
pp. 1363-1368, 1997, describen un método para
convertir una base citosina de un ADN en un base uracilo mediante
tratamiento con bisulfito. El ADN está unido a quitosano.
Una variación del método de secuenciación
genómica con bisulfito está descrita por Feil, R. y col., Nucleic
Acids Res. 22 (1994) 695-6, mediante el cual el ADN
genómico es unido a esferas de vidrio después de la desaminación y
lavado. Después de la elución el ácido nucleico es desulfonado. Es
sabido que los ácidos nucleicos pueden ser aislados mediante la
utilización de su comportamiento de unión a superficies de vidrio,
por ejemplo la adsorción a gel de sílice o a tierra de diatomeas,
la adsorción a partículas magnéticas de vidrio (MGPs) o a
partículas de órganosilanos bajo condiciones caotrópicas. La
extracción utilizando fases sólidas contiene normalmente las etapas
de adición de la solución con los ácidos nucleicos a la fase sólida
bajo condiciones que permitan la unión de la sustancia de interés a
la fase sólida, la eliminación del resto de la solución de los
ácidos nucleicos unidos a la fase sólida y la liberación posterior
de los ácidos nucleicos de la fase sólida a un eluato líquido
(algunas veces denominada elución). El resultado de tal proceso es
normalmente una solución que contiene la sustancia de interés en
estado disuelto.
Todos los métodos de la técnica anterior para el
tratamiento con bisulfito tienen desventajas. Por tanto, el
problema que tenía que ser resuelto por la presente invención era
proporcionar un método que superara las desventajas de los métodos
de la técnica anterior.
El problema anteriormente discutido es
solucionado proporcionando un método para la conversión de una base
citosina, preferiblemente de bases citosina, de un ácido nucleico en
una base uracilo mediante tratamiento con bisulfito,
preferiblemente en bases uracilo, mediante el cual preferiblemente
las bases 5-metil-citosina no son
convertidas significativamente ("reacción de bisulfito" o
"tratamiento con bisulfito"), en el que el ácido nucleico está
unido a una base sólida durante las etapas de desaminación y/o de
desulfonación de la reacción de bisulfito, en el que la fase sólida
es seleccionada de vidrio o sílice, un material que contenga vidrio
o sílice, un intercambiador iónico o hidroxiapatita; prefiriéndose
lana de vidrio, una membrana de vidrio o una partícula magnética de
vidrio. Además, la presente invención describe utilizaciones de una
fase sólida en la etapa de desaminación y/o desulfonación de la
reacción de bisulfito y kits que contienen una fase sólida y
reactivos para llevar a cabo una reacción de bisulfito.
La utilización de una fase sólida durante la
etapa de desaminación y/o desulfonación de la reacción de bisulfito,
preferiblemente en la etapa de desulfonación, tiene la ventaja de
que el manejo es más sencillo y/o fácilmente susceptible de
automatización. Por ejemplo, cuando se utilizan lanas de vidrio para
las etapas de desaminación y/o desulfonación, no son necesarias las
tediosas reacciones de precipitación de ADN; la separación del ADN
unido-libre puede ser realizada fácilmente por
centrifugación, el volumen muerto de la lana de vidrio es
despreciable y por tanto las etapas de lavado son muy eficaces.
Esto es una ventaja cuando el tratamiento con bisulfito del ADN es
utilizado para PCR, donde los inhibidores potenciales pueden reducir
significativamente la sensibilidad. El método de acuerdo con la
invención puede ser realizado fácilmente de forma manual y es por
tanto muy adecuado para laboratorios más pequeños en los que no hay
disponibles analizadores de rutina. Para laboratorios mayores con
una mayor cantidad de muestras, la utilización de una fase sólida
que pueda ser manejada por los analizadores de rutina, en
particular partículas de vidrio magnéticas, es ventajoso. En una
reacción de bisulfito rutinaria, se eligen condiciones de
desnaturalización ya que el bisulfito puede reaccionar únicamente
con pirimidinas que no estén implicadas en el apareamiento de
bases. Por tanto, es sorprendente el que la reacción de bisulfito
pueda ser llevada a cabo con éxito de manera satisfactoria mediante
el método de acuerdo con la invención, ya que el ácido nucleico
está unido a la superficie de la fase sólida por varias
interacciones que afectan posiblemente al éxito de la reacción de
bisulfito.
De acuerdo con la invención, el término
"reacción de bisulfito", "tratamiento con bisulfito" o
"método del bisulfito" indica una reacción para la conversión
de una base citosina, en partícular de bases citosina, de una ácido
nucleico en una base o bases uracilo, preferiblemente en presencia
de iones bisulfito, mediante la cual preferiblemente las bases
5-metil-citosina no son convertidas
significativamente. Esta reacción para la detección de citosinas
metiladas está descrita con detalle por Frommer y col., supra
y Grigg y Clark, supra. La reacción de bisulfito contiene
una etapa de desaminación y una etapa de desulfonación que pueden
ser llevadas a cabo separadamente o simultáneamente (ver la Figura
1: Grigg y Clark, supra). La afirmación de que las bases
5-metil-citosina no son convertidas
significativamente, tendrá en cuenta únicamente el hecho de que no
puede excluirse que un pequeño porcentaje de bases
5-metil-citosina sea convertido a
uracilo aunque se desee convertir únicamente y exclusivamente las
bases citosina (no metiladas) (Frommer y col., supra).
El método de la invención puede ser realizado en
varias disposiciones de las etapas de reacción con bisulfito e
inmovilización. En una primera realización, la etapa de desaminación
y desulfonación se realiza mientras que el ácido nucleico está
unido a la fase sólida. Por tanto, en una realización preferida de
la invención, se describe un método para la conversión de una base
citosina, preferiblemente de bases citosina, de un ácido nucleico
en una base uracilo, preferiblemente en bases uracilo ("reacción
de bisulfito"), mediante el cual preferiblemente las bases
5-metil-citosina no son convertidas
significativamente, que comprende las etapas de
- a)
- unión del ácido nucleico a una fase sólida,
- b)
- incubación del ácido nucleico unido a la fase sólida en presencia de iones sulfito, mediante lo cual el ácido nucleico es desaminado,
- c)
- lavado opcional del ácido nucleico desaminado unido a la fase sólida,
- d)
- incubación del ácido nucleico desaminado unido a la fase sólida bajo condiciones alcalinas, mediante lo cual el ácido nucleico desaminado es desulfonado,
- e)
- lavado opcional del ácido nucleico desaminado y desulfonado unido a la fase sólida y
- f)
- elución opcional del ácido nucleico desaminado y desulfonado de la fase sólida.
En una segunda realización de la invención, la
etapa de desulfonación se realiza mientras el ácido nucleico está
unido a la fase sólida. Por tanto, en otra realización preferida de
la invención, se describe un método para la conversión de una base
citosina, preferiblemente de bases citosina, de un ácido nucleico en
una base uracilo, preferiblemente en bases de uracilo, mediante el
cual las bases 5-metil-citosina no
son convertidas significativamente ("reacción de bisulfito"),
que comprende las etapas de
- a)
- incubación del ácido nucleico en presencia de iones sulfito, mediante lo cual el ácido nucleico es desaminado,
- b)
- unión del ácido nucleico desaminado a una fase sólida,
- c)
- lavado opcional del ácido nucleico desaminado unido a la fase sólida,
- d)
- incubación del ácido nucleico desaminado unido a la fase sólida bajo condiciones alcalinas, mediante lo cual el ácido nucleico desaminado es desulfonado,
- e)
- lavado opcional del ácido nucleico desaminado y desulfonado unido a la fase sólida y
- f)
- elución opcional del ácido nucleico desaminado y desulfonado de la fase sólida.
En una tercera realización, la etapa de
desaminación se lleva a cabo mientras el ácido nucleico está unido
a la fase sólida. Por tanto, en otra realización preferida de la
invención, se describe un método para la conversión de una base
citosina, preferiblemente de bases citosina, de un ácido nucleico en
una base uracilo, preferiblemente en bases uracilo, mediante el
cual preferiblemente las bases
5-metil-citosina no son convertidas
significativamente ("reacción de bisulfito"), que comprende las
etapas de
- a)
- unión del ácido nucleico a una fase sólida,
- b)
- incubación del ácido nucleico unido a la fase sólida en presencia de iones sulfito, mediante lo cual el ácido nucleico es desaminado,
- c)
- lavado opcional del ácido nucleico unido a la fase sólida,
- d)
- elución del ácido nucleico desaminado a partir de la fase sólida y
- e)
- incubación del ácido nucleico desaminado bajo condiciones alcalinas, mediante lo cual el ácido nucleico desaminado es desulfonado.
El experto con experiencia en la técnica sabe
cómo realizar la reacción del bisulfito, por ejemplo mediante
referencia a Frommer y col., supra o Grigg y Clark,
supra, que describen los principales parámetros de la
reacción del bisulfito. De Grunau y col., supra, el experto
en la materia sabe qué variaciones son posibles en el método del
bisulfito. Se describe la influencia del tiempo y la temperatura de
incubación sobre la eficacia de desaminación y parámetros que
influyen sobre la degradación del ADN. En resumen, en la etapa de
desaminación se emplea un tampón que contiene iones bisulfito,
opcionalmente agentes caotrópicos y opcionalmente también reactivos
adicionales tales como un alcohol o estabilizantes tales como
hidroquinona, y el pH está en el rango ácido. La concentración de
bisulfito está entre 0,1 y 6 M de bisulfito, preferiblemente de 1 M
a 5,5 M; la concentración del agente caotrópico está entre 1 y 8 M,
por lo que se emplean preferiblemente sales de guanidinio; el pH
está en el rango ácido, preferiblemente entre 4,5 y 6,5; la
temperatura está entre 0ºC y 90ºC, preferiblemente entre
temperatura ambiente (25ºC) y 90ºC, y el tiempo de reacción está
entre 30 minutos y 24 horas o 48 horas, o incluso mayor, pero
preferiblemente entre 1 hora y 24 horas. La etapa de desulfonación
se realiza añadiendo una solución o tampón alcalinos tal como por
ejemplo una solución que contenga únicamente un hidróxido, por
ejemplo hidróxido de sodio, o una solución que contenga etanol,
cloruro de sodio e hidróxido de sodio (por ejemplo, EtOH 38%, NaCl
100 mM, NaOH 200 mM) e incubando a temperatura ambiente o a
temperaturas elevadas durante varios minutos, preferiblemente de 5
minutos a 60 minutos.
En una realización de la invención, el ácido
nucleico es ácido desoxirribonucleico (ADN), en particular ADN
genómico, o un ácido nucleico, esto es el ADN o el ácido nucleico
que se encuentra en el genoma del organismo y que es transmitido a
la descendencia como información necesaria para la supervivencia. La
frase es utilizada para distinguir entre otros tipos de ADN, tales
como los encontrados en plásmidos. El origen del ácido nucleico
puede eucariótico o procariótico, preferiblemente de vertebrados,
particularmente de mamíferos, muy preferiblemente de animales o
humanos.
En una realización de la invención, el ácido
nucleico está unido a la fase sólida, que está sin modificar, esto
es el ácido nucleico está unido directamente sin ningún compuesto
que medie la unión a la fase sólida. El ácido nucleico se une a la
superficie sin modificar de la fase sólida, por lo que la unión a la
superficie tendrá también en cuenta que la fase sólida puede
contener poros y que el ácido nucleico puede unirse a la superficie
de los poros de la fase sólida. En la invención, la fase sólida es
un intercambiador iónico (disponible comercialmente en, por
ejemplo, Amersham Biosciences Europe, Freiburg, Alemania), capaz de
unirse a un ácido nucleico bajo condiciones específicas,
hidroxiapatita (disponible comercialmente en Sigma, Taufkirchen,
Alemania), vidrio o sílice o materiales que contengan vidrio o
sílice, preferiblemente con una superficie no modificada. En otra
realización, la fase sólida puede estar modificada, esto es la fase
sólida se une indirectamente al ácido nucleico con un compuesto que
medie la unión a la fase sólida, por ejemplo mediante la unión
específica de secuencias del ácido nucleico a oligonucleótidos
fijados a la superficie, o mediante la unión de estreptavidina
(fijada a la superficie de la fase sólida) a ADN marcado con
biotina. Partículas adecuadas están por tanto disponibles
comercialmente en DYNAL, Oslo, Noruega y descritas en, por ejemplo,
WO 90/06045.
El término "no modificada" significa que no
existe ninguna modificación química adicional, esto es ningún otro
grupo químico está unido covalentemente o no covalentemente. El
término "superficie no modificada", "superficie de sílice no
modificada" o "superficie de vidrio no modificada",
significa que no hay otros grupos químicos unidos covalentemente o
no covalentemente que sirvan como sustancia intermedia para la unión
del ácido nucleico, y en la que los ácidos nucleicos se unan a la
sustancia intermedia y no a la propia superficie de sílice. Por
tanto, los ácidos nucleicos se unen preferiblemente a la
"superficie no modificada" directamente mediante enlaces de
hidrógeno y otras fuerzas atómicas. Ejemplos de superficies
modificadas son superficies de sílice a las cuales se fijan
oligonucleótidos que se unen de manera específica de la secuencia a
moléculas de ácido nucleico. Otro ejemplo de superficies de sílice
modificadas son superficies de sílice revestidas con estreptavidina
a las cuales se unen moléculas de ADN biotiniladas.
En una realización particularmente preferida de
acuerdo con la invención, la fase sólida es un material que
contiene vidrio o sílice, preferiblemente con una superficie (vidrio
o sílice) no modificada, por ejemplo fibras de vidrio, tierra de
diatomeas, esferas o partículas de vidrio, membranas de vidrio o
partículas magnéticas de vidrio u otras sustancias cubiertas con
una superficie de vidrio no modificada. Son particularmente
preferidas las lanas de vidrio o las membranas de vidrio o las
partículas magnéticas de vidrio. Tales fases sólidas están
descritas en, por ejemplo, EP 0 389 063 o US 5.234.809.
Las condiciones para la unión de ADN o de ácidos
nucleicos a superficies de vidrio o sílice son básicamente
conocidas por los expertos en este campo. Estos procesos están
descritos con detalle por varios documentos. En Vogelstein, B. y
Gillespie, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979)
615-9, por ejemplo, se propone un procedimiento
para unir ácidos nucleicos procedentes de geles de agarosa en
presencia de yoduro de sodio a vidrio incoloro esmerilado. La
purificación de ADN plasmídico de bacterias sobre polvo de vidrio en
presencia de perclorato de sodio está descrita en Marko, M.A. y
col., Anal. Biochem. 121 (1982) 382-7. En
DE-A 37 34 442, se describe el aislamiento de ADN
monocatenario del fago M13 sobre filtros de fibra de vidrio mediante
precipitación de las partículas del fago utilizando ácido acético y
lisis de las partículas del fago con perclorato. Los ácidos
nucleicos unidos a los filtros de fibra de vidrio son lavados y
eluidos posteriormente con tampón Tris/EDTA conteniendo metanol. Un
procedimiento similar para purificar ADN de fagos lambda está
descrito en Jakobi, R. y col., Anal. Biochem. 175 (1988)
196-201. El procedimiento supone la unión selectiva
de ácidos nucleicos a superficies de vidrio en soluciones de sales
caotrópicas y la separación de los ácidos nucleicos de los
contaminantes tales como agarosa, proteínas o residuos celulares.
Para separar las partículas de vidrio de los contaminantes, las
partículas pueden ser centrifugadas o bien los fluidos son pasados a
través de filtros de fibra de vidrio. Ésta es, sin embargo, una
etapa limitante que impide que el procedimiento sea utilizado para
procesar grandes cantidades de muestra. En una realización preferida
de la invención, se utilizan partículas de vidrio magnéticas para
unir los ácidos nucleicos después de precipitación por la adición de
sal y etanol, según está descrito en, por ejemplo, Alderton, R.P. y
col., Anal. Biochem. 201 (1992) 166-9 y en WO
91/12079 (PCT GB 91/00212).
En una realización muy preferida de la
invención, la fase sólida es una partícula magnética de vidrio,
preferiblemente con una superficie de vidrio no modificada. Las
partículas magnéticas de vidrio son una dispersión sólida de
pequeños núcleos magnéticos en vidrio, esto es, son gotitas de
vidrio en las cuales están dispersos objetos magnéticos muy
pequeños. Esos objetos que son referidos como magnéticos son
atraídos por un imán, esto es, por ejemplo, por materiales ferri o
ferromagnéticos o superparamagnéticos. Las sustancias paramagnéticas
no son útiles ya que solamente son atraídas por los imanes muy
débilmente, lo cual no es suficiente para un método de acuerdo con
esta invención. Se prefieren los materiales ferri o ferromagnéticos,
en particular si no han sido todavía premagnetizados. La
premagnetización en este contexto significa la puesta en contacto
con un imán, que incrementa la remanencia magnética. Los materiales
magnéticos preferidos son hierro u óxido de hierro tal como por
ejemplo magnetita (Fe_{3}O_{4}) o Fe_{2}O_{3},
preferiblemente \gamma-Fe_{2}O_{3}. En
principio, podría utilizarse ferrita de bario, níquel, cobalto,
aleaciones de
Al-Ni-Fe-Co o
cualquier otro material ferri o ferromagnético. Son particularmente
preferidas de acuerdo con la presente invención las partículas de
vidrio magnéticas descritas en WO 96/41811, WO 00/32762 y WO
01/37291.
En una realización muy preferida de la
invención, las partículas de vidrio magnéticas tienen un lixiviador
de hierro inferior, ya que el hierro es un inhibidor de la reacción
de amplificación posterior, esto es el hierro es un inhibidor
enzimático. Ésta es, por tanto, una característica importante de las
partículas de vidrio magnéticas. Preferiblemente, el lixiviador de
hierro en agua o HCl 1 M (durante 20 minutos) está por debajo de 40
ppm, más preferiblemente por debajo de 20 ppm, muy preferiblemente
por debajo de 10 ppm. En la realización más preferida de la
invención, las partículas de vidrio magnéticas son las descritas en
la solicitud internacional WO 01/37291, que están también
disponibles públicamente en el kit de aislamiento de ADN MagNA Pure
LC DNA Isolation Kit I (Roche, Mannheim, Alemania). Estas partículas
sedimentan lentamente y pueden ser por tanto utilizadas de forma
ventajosa en un método automatizado de acuerdo con la invención. La
producción de las mismas se resumen a continuación.
Las partículas de vidrio magnéticas son
sustancialmente esféricas, tienen un pequeño diámetro y contienen
al menos un objeto magnético con un diámetro entre 5 y 500 nm. Esto
tiene consecuencias sorprendentes sobre la cinética de
sedimentación, cuantificada por los valores del tiempo medio
t_{^{1}/_{2}}, que es el tiempo transcurrido hasta que el 50% de
las partículas han sedimentado a partir de un elemento de volumen
específico. El periodo de semivida para la sedimentación de una
suspensión de 3 mg/ml, peso por volumen, de las MGPs con una
superficie de vidrio no modificada de acuerdo con la invención en
isopropanol es más de 3 minutos, preferiblemente 4 minutos, más
preferiblemente 6 minutos. Sin embargo, los valores más preferidos
para el periodo de semivida son de más de 10 minutos o incluso de
más de 20 minutos. Los objetos magnéticos de las MGPs más preferidas
pueden ser, por ejemplo, pigmentos magnéticos. El tamaño de los
objetos magnéticos está en el rango de nanoescala, esto es entre 5
y 500 nm, preferiblemente entre 10 y 200 nm, muy preferiblemente
entre 15 y 50 nm. Los pigmentos magnéticos adecuados están
producidos por la compañía CERAC, tienen un diámetro medio de 23 nm
y constan de \gamma-Fe_{2}O_{3} (superficie
BET 50 m^{2}/g, CERAC: P.O. Box 1178, Milwaukee, Wisconsin
53201-1178, EE.UU.; Nº de Artículo
1-2012). Las partículas de vidrio magnéticas más
preferidas de acuerdo con la presente invención se caracterizan
además por el hecho de que las MGPs tienen un diámetro de partícula
entre 0,5 \mum y 5 \mum, preferiblemente entre 1 \mum y 2
\mum, determinado mediante microscopía electrónica de barrido de
alta resolución, mientras que los objetos magnéticos tienen un
diámetro entre 5 y 500 nm, preferiblemente entre 10 y 200 nm, muy
preferiblemente en el rango de 15 a 50 nm, según se describió
anteriormente. Por tanto, las MGPs se caracterizan adicionalmente
por una relación de diámetros entre el núcleo de pigmento magnético
y la partícula de vidrio magnética menor de 1 a 10, determinada
mediante microscopía electrónica de barrido de alta resolución. Las
MGPs más preferidas son microporosas pero tienen una superficie muy
estructurada y por tanto relativamente grande, con más de 6
m^{2}/g. Preferiblemente, las partículas de vidrio magnéticas
tienen un área de superficie en el rango de 5 a 100 m^{2}/g,
preferiblemente de 5 a 90 m^{2}/g, más preferiblemente en el
rango de 10 a 50 m^{2}/g, muy preferiblemente en el rango de 15 a
30 m^{2}/g. Ésta puede ser determinada mediante el método de
Braunauer-Emett-Teller utilizando un
aparato comercial automático. Para una discusión de este método,
denominado familiarmente el método BET, ver Braunauer, en "The
Adsorption of Gases and Vapors" (1943), Princeton University
Press.
Las partículas de vidrio magnéticas utilizadas
en la presente invención pueden ser proporcionadas en diferentes
formulaciones, esencialmente según está descrito en WO 01/37291. Es
posible proporcionarlas en forma de tableta, como un polvo o,
preferiblemente, como una suspensión. En una realización preferida
de la invención estas suspensiones contienen entre 5 y 60 mg/ml de
partículas de vidrio magnéticas (MGPs). En otra realización de la
invención, el material que contiene sílice es suspendido en
soluciones tamponadas acuosas que pueden contener opcionalmente un
agente caotrópico en una concentración de entre 2 y 8 moles/l, y
preferiblemente entre 4 y 6 moles/l. Las sales caotrópicas son
yoduro de sodio, perclorato de sodio, tiocianato de guanidinio,
isotiocianato de guanidinio o clorhidrato de guanidinio. Un agente
caotrópico de acuerdo con la presente invención es cualquier
sustancia química que altere la estructura ordenada del agua líquida
y tendrá como efecto el que el ADN o el ARN se una a las MGPs de
acuerdo con la presente invención si este agente está presente en la
solución que contiene el ADN o el ARN. Son también posibles otros
compuestos conocidos por los expertos en este campo.
En una realización preferida de la invención,
las partículas de vidrio magnéticas son producidas mediante el
método de sol-gel descrito en WO 01/37291, WO
00/37291 y WO 96/41811, en particular cuando el método de
sol-gel comprende las etapas de:
- -
- suspensión de los objetos magnéticos en un sol
- -
- hidrólisis del sol con el fin de cubrir los objetos magnéticos con un gel
- -
- deshidratación por aspersión de los objetos magnéticos cubiertos con un gel en un deshidratador por aspersión de dos boquillas y
- -
- sinterización del polvo deshidratado por aspersión con el fin de formar un vidrio a partir del gel que cubre los objetos magnéticos.
Las MGPs preferidas de acuerdo con la invención
son partículas de vidrio magnéticas producidas de acuerdo con el
Ejemplo 8 de WO 00/32762 que contienen como pigmento magnético negro
mate micronizado. Las MGPs más preferidas de acuerdo con la
invención son producidas según la solicitud internacional WO
01/37291, las cuales se proporcionan también en el kit de
aislamiento de ADN MagNa Pure LC DNA Isolation Kit I (Roche,
Mannheim, Alemania). Son también producidas mediante el método de
sol-gel según está descrito en la solicitud
internacional WO 01/37291 utilizando objetos o pigmentos magnéticos
con un diámetro de 23 nm aproximadamente (fabricados por CERAC,
consistentes en \gamma-Fe_{2}O_{3}; CERAC:
P.O. Box 1178, Milwaukee, Wisconsin 53201-1178,
EE.UU.; Nº de Artículo 1-2012). Una vez que los
objetos magnéticos son cubiertos con el gel, se crea un polvo
mediante pulverización de la suspensión a través de una boquilla de
dos fluidos. Sistemas de deshidratación por aspersión adecuados son
producidos por Nubilosa Molekularzerstäubung, Ladisch GmbH & Co.
KG, Konstanz, Alemania, por ejemplo el
"Labor-Zerstäubungstrockner (Typ LTK)" o por
Büchi AG, Uster, Suiza, por ejemplo el Mini Spray Dryer (Tipo
B-191). Como las relaciones de los diámetros entre
los núcleos magnéticos y la cubierta de vidrio son menores de 1 a
10, preferiblemente entre 1:10 y 1:1000, la geometría y el número de
núcleos magnéticos incorporados o de sus vehículos inertes no
determina la forma y el tamaño de las partículas sino las
condiciones de fabricación, en particular las condiciones durante la
deshidratación por aspersión. En otras palabras, la elección de la
presión, la temperatura de entrada, la temperatura de salida y la
velocidad de flujo durante el procedimiento de deshidratación por
aspersión representa los grados de libertad que determinan la
distribución de tamaños, la forma de las gotas de vidrio y por ello
modificará las MGPs. Por tanto, las boquillas del sistema de
deshidratación por aspersión son calentadas. La temperatura de
entrada está entre 120ºC y 500ºC, preferiblemente entre 170ºC y
230ºC o entre 150ºC y 230ºC, muy preferiblemente entre 150ºC y
200ºC o entre 190ºC y 210ºC, o a 200ºC o ligeramente inferior. La
temperatura de salida depende del punto de ebullición del sol y por
ello del solvente y puede estar por encima de, ser igual a, o estar
ligeramente por debajo de, esto es menos de 10ºC, el punto de
ebullición del solvente. Cuando se utiliza etanol como solvente,
está entre 50ºC y 300ºC, preferiblemente entre 70ºC y 150ºC, muy
preferiblemente entre 80ºC y 110ºC. La temperatura óptima está
entre 90ºC y 100ºC. La presión de la boquilla es más de 3 bares,
preferiblemente está regulada entre 4 y 6 bares. El técnico
apreciará el hecho de que los parámetros exactos dependerán del
sistema de deshidratación por aspersión utilizado. Sin embargo, él
puede transferir las descripciones de la presente invención a
cualquier otro sistema de deshidratación por aspersión y encontrar
los parámetros considerando las descripciones de esta invención.
Fórmulas como las descritas en Masters: "Spray Drying Handbook"
(1991), John Wiley & Sons, New York, pueden conducirle al
camino para encontrar los parámetros que tienen que ser elegidos
para otras preparaciones. Preferiblemente, buscará en los manuales
de su sistema de deshidratación por aspersión o contactará con el
servicio técnico del fabricante del sistema de deshidratación por
aspersión. Para optimizar el rendimiento, la temperatura de
densificación o sinterización debe ser tan elevada como sea posible,
esto es ligeramente por debajo del rango de fusión. La temperatura
exacta depende de la composición del vidrio pero puede estar entre
400ºC y 1200ºC. En el caso de la composición de vidrio EJ descrita
en WO 01/37291, la temperatura de sinterización está entre 720ºC y
770ºC, preferiblemente alrededor de 750ºC. Está dentro de la
experiencia del técnico el encontrar las temperaturas para cada
composición de vidrio cuando se tienen en cuenta las descripciones
de la presente invención. Posteriormente, el polvo es calentado
durante 1 hora a 200ºC, enfriado opcionalmente hasta temperatura
ambiente y calentado a 750ºC (temperatura de densificación o
sinterización) en una atmósfera de nitrógeno con una velocidad de
calentamiento de 1 K/minuto y es mantenido a esa temperatura durante
1 hora. Posteriormente el horno es enfriado a 150ºC y calentado de
nuevo a 200ºC durante una hora en aire. Después de enfriar hasta
temperatura ambiente, el polvo es transferido a un tamiz (50 \mum)
y tamizado durante 30 minutos. La muestra tamizada es embotellada y
esterizada a 200ºC durante 4 horas y posteriormente enfriada a
80ºC. Posteriormente los vasos de vidrio son retirados del horno,
cubiertos con papel de aluminio estéril y cerrados.
El procedimiento experimental para unir el ácido
nucleico a superficies de vidrio o de sílice no modificadas (o
preferiblemente a las partículas magnéticas de vidrio) puede ser
descrito con detalle según sigue. Es realizado preferiblemente en
presencia de sales caotrópicas con una concentración de entre 1 y 8
moles/l, y preferiblemente entre 2 y 6 moles/l. Las sales
caotrópicas pueden ser yoduro de sodio, perclorato de sodio,
tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio o clorhidrato
de guanidinio. Un agente caotrópico de acuerdo con la presente
invención es cualquier sustancia química que altere la estructura
ordenada del agua líquida y tenga como efecto el que el ADN (o ARN)
se una a las partículas magnéticas de vidrio si este agente está
presente en la solución que contiene el ADN (o el ARN). Pueden
estar presentes también otras sustancias biológicas conocidas por
los expertos en este campo. Otras sustancias más son también
posibles. Para unir la mezcla de ácidos nucleicos y opcionalmente
otros compuestos biológicos, las esferas de vidrio con una
superficie de vidrio no modificada son añadidas a la mezcla e
incubadas durante un tiempo suficiente para que tenga lugar la
unión. Los expertos están normalmente familiarizados con la duración
de la etapa de incubación. Esta etapa puede ser optimizada
determinando la cantidad de ácidos nucleicos inmovilizados sobre la
superficie a diferentes puntos de tiempo. Tiempos de incubación de
entre 10 segundos y 30 minutos pueden ser apropiados para los ácidos
nucleicos. Posteriormente se añaden los reactivos para llevar a
cabo las diferentes etapas de la reacción del bisulfito (o incluso
pueden haber estado presentes antes). Después de la incubación o del
lavado, los ácidos nucleicos pueden separarse del líquido. Esto
puede ser conseguido en general por gravedad o, en el caso práctico
de ácidos nucleicos unidos a partículas magnéticas de vidrio,
mediante separación del ácido nucleico unido a las partículas
magnéticas de vidrio por la aplicación de un campo magnético. Por
ejemplo, las partículas magnéticas pueden ser arrastradas hacia la
pared del vaso en el que se realizó la incubación. El líquido que
contiene los componentes biológicos o los componentes de la reacción
que no se unieron a las partículas magnéticas puede ser
posteriormente eliminado. El procedimiento de eliminación utilizado
depende del tipo de vaso en el que se realice la incubación. Las
etapas adecuadas incluyen la eliminación del líquido mediante
pipeteo o aspiración. El material con el ácido nucleico unido puede
ser entonces lavado al menos una vez, preferiblemente con una
mezcla de 70 partes en volumen de etanol con 30 partes en volumen de
agua ("etanol al 70%") o en una solución de lavado ácida según
está descrito en WO 99/40098. Se utiliza una solución de lavado que
no haga que los ácidos nucleicos y el ácido nucleico diana sean
liberados de la superficie del material, sino que elimine los
contaminantes no deseados tan a fondo como sea posible. Esta etapa
de lavado tiene lugar preferiblemente mediante incubación del
vidrio o de la sílice con el ácido nucleico unido. El material es
preferiblemente resuspendido durante esta etapa. La solución de
lavado contaminada es eliminada preferiblemente igual que en la
etapa de unión anteriormente descrita. Después de la última etapa de
lavado, el material puede ser secado brevemente en vacío, o bien
puede dejarse evaporar el fluido. Puede realizarse también una
etapa de pretratamiento utilizando acetona.
En una realización de la invención, el ácido
nucleico es obtenido de una muestra biológica utilizando las fases
sólidas de acuerdo con la invención y métodos conocidos por los
expertos en este campo. La muestra biológica comprende células de
organismos multicelulares como por ejemplo células humanas y de
animales tales como leucocitos, y compuestos químicos de alto y
bajo peso molecular inmunológicamente activos tales como haptenos,
antígenos, anticuerpos y ácidos nucleicos, plasma sanguíneo, fluido
cerebral, esputos, heces, especímenes de biopsia, médula ósea,
enjuagues orales, suero sanguíneo, tejidos, orina o mezclas de los
mismos. En una realización preferida de la invención la muestra
biológica es un fluido del cuerpo humano o animal. Preferiblemente,
la muestra biológica es sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo u
orina. El plasma sanguíneo es preferiblemente plasma de sangre
tratada con EDTA, heparina o citrato. La muestra biológica que
contiene los ácidos nucleicos es lisada para crear una mezcla de
compuestos biológicos conteniendo ácidos nucleicos y otros
componentes. Los procedimientos para lisar muestras biológicas son
conocidos por los expertos y pueden ser de naturaleza química,
enzimática o física. Es también aplicable una combinación de estos
procedimientos. Por ejemplo, la lisis puede ser realizada
utilizando ultrasonidos, presión elevada, fuerzas de cizallamiento,
álcalis, detergentes o soluciones salinas caotrópicas, o proteasas
o lipasas. Para el procedimiento de lisis con el fin de obtener
ácidos nucleicos se hace referencia especial a Sambrook y col.:
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring
Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY y Ausubel y col.:
Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NY.
Posteriormente los ácidos nucleicos son aislados de la mezcla de
lisis utilizando los métodos y las fases sólidas de acuerdo con la
invención y pueden ser posteriormente sometidos a los métodos de
acuerdo con la invención, esto es al tratamiento con bisulfito de
acuerdo con la invención. Se utilizan también agentes caotrópicos
con el fin de lisar las células para preparar una mezcla entre
ácidos nucleicos y otras sustancias biológicas (ver por ejemplo
Sambrook y col. (1989) o EP 0 389 063). Posteriormente, se añade el
material que contiene vidrio o sílice y un efecto de purificación es
el resultado del comportamiento del ADN o del ARN para unirse al
material con una superficie de vidrio bajo estas condiciones, esto
es en presencia de ciertas concentraciones de un agente caotrópico,
mayores concentraciones de solventes orgánicos o bajo condiciones
ácidas. Por tanto, la presente invención considera también la
combinación de las etapas de lisis y la reacción del bisulfito,
esto es el ácido nucleico aislado de la mezcla entre ácidos
nucleicos y otras sustancias biológicas es sometido directamente al
tratamiento con bisulfito, por lo que el ácido nucleico está unido
a una fase sólida durante la etapa de desaminación y/o
desulfonación. Con más detalle, se proporciona un método para la
conversión de una base citosina, preferiblemente de bases citosina,
de un ácido nucleico en una base uracilo, preferiblemente en bases
uracilo, mediante el cual preferiblemente las bases
5-metil-citosina no son convertidas
significativamente ("reacción del bisulfito" o "tratamiento
con bisulfito"), por lo que el ácido nucleico es aislado de una
mezcla que contiene un ácido nucleico y otros compuestos biológicos
mediante la unión del mismo a una fase sólida, preferiblemente a un
material que contiene vidrio o sílice, y permanece unido a la fase
sólida durante la etapa de desaminación y/o desulfonación de la
reacción del bisulfito. Incluso con más detalle, se proporciona un
método en el que el ácido nucleico es aislado de una mezcla de un
ácido nucleico y otros compuestos biológicos y unido a una fase
sólida durante la etapa de desaminación y desulfonación de la
reacción del bisulfito, esto es se proporciona un método para la
conversión de una base citosina, preferiblemente de bases citosinas,
de un ácido nucleico en una base uracilo, preferiblemente en bases
uracilo, mediante el cual preferiblemente las bases
5-metil-citosina no son convertidas
significativamente ("reacción del bisulfito" o "tratamiento
con bisulfito"), que comprende las etapas de
- a)
- la provisión de una mezcla de un ácido nucleico y otros compuestos biológicos,
- b)
- la unión del ácido nucleico a una fase sólida, eliminando opcionalmente los demás compuestos biológicos y lavando opcionalmente el ácido nucleico unido a la fase sólida,
- c)
- la incubación del ácido nucleico unido a la fase sólida en presencia de iones sulfito, mediante lo cual el ácido nucleico es desaminado,
- d)
- el lavado opcional del ácido nucleico desaminado unido a la fase sólida,
- e)
- la incubación del ácido nucleico desaminado unido a la fase sólida bajo condiciones alcalinas, mediante lo cual el ácido nucleico es desulfonado,
- f)
- el lavado opcional del ácido nucleico desaminado y desulfonado unido a la fase sólida, y
- g)
- la elución opcional del ácido nucleico desaminado y desulfonado de la fase sólida.
En otra realización, se proporciona un método en
el que el ácido nucleico es aislado de una mezcla de un ácido
nucleico y otros compuestos biológicos y está unido a una fase
sólida durante la etapa de desulfonación de la reacción del
bisulfito, esto es, se proporciona un método para la conversión de
una base citosina, preferiblemente de bases citosina, de un ácido
nucleico en una base uracilo, preferiblemente en bases uracilo,
mediante el cual preferiblemente las bases
5-metil-citosina no son convertidas
significativamente ("reacción del bisulfito" o "tratamiento
con bisulfito"), que comprende las etapas de
- a)
- la provisión de una mezcla de un ácido nucleico y otros compuestos biológicos,
- b)
- la unión del ácido nucleico a una fase sólida, eliminando opcionalmente los demás compuestos biológicos, lavando opcionalmente el ácido nucleico unido a la fase sólida y eluyendo el ácido nucleico de la fase sólida,
- c)
- la incubación del ácido nucleico eluido en presencia de iones sulfito, mediante lo cual el ácido nucleico es desaminado,
- d)
- la unión del ácido nucleico desaminado a una fase sólida,
- e)
- el lavado opcional del ácido nucleico desaminado unido a la fase sólida,
- f)
- la incubación del ácido nucleico desaminado unido a la fase sólida bajo condiciones alcalinas, mediante lo cual el ácido nucleico es desulfonado,
- g)
- el lavado opcional del ácido nucleico desaminado y desulfonado unido a la fase sólida, y
- h)
- la elución opcional del ácido nucleico desaminado y desulfonado de la fase sólida.
En otra realización de la invención, se
proporciona un método en el cual el ácido nucleico es aislado de una
mezcla de un ácido nucleico y otros compuestos biológicos y unido a
una fase sólida durante la etapa de desaminación de la reacción del
bisulfito, esto es, se proporciona un método para la conversión de
una base citosina, preferiblemente de bases citosina, de un ácido
nucleico en una base uracilo, preferiblemente en bases uracilo,
mediante el cual preferiblemente las bases
5-metil-citosina no son convertidas
significativamente, que comprende las etapas de
- a)
- la provisión de una mezcla de un ácido nucleico y otros compuestos biológicos,
- b)
- la unión del ácido nucleico a una fase sólida, eliminando opcionalmente los demás compuestos biológicos y lavando opcionalmente el ácido nucleico unido a la fase sólida,
- c)
- la incubación del ácido nucleico unido a la fase sólida en presencia de iones sulfito, mediante lo cual el ácido nucleico es desaminado,
- d)
- el lavado opcional del ácido nucleico unido a la fase sólida,
- e)
- la elución del ácido nucleico desaminado de la fase sólida, y
- f)
- la incubación del ácido nucleico desaminado bajo condiciones alcalinas, mediante lo cual el ácido nucleico desaminado es desulfonado.
El método preferido de acuerdo con la invención
comprende además la etapa de elución a partir de dicha fase sólida
del ácido nucleico unido. Posteriormente dicho ácido nucleico puede
ser, por ejemplo, amplificado. Para que tenga lugar la elución, el
material conteniendo vidrio o sílice (con la superficie de sílice no
modificada) es resuspendido en una solución con ninguna o con una
pequeña cantidad de un agente caotrópico y/o un solvente orgánico.
Alternativamente, la suspensión puede ser diluida con una solución
con ninguna o con una pequeña cantidad de un agente caotrópico y/o
un solvente orgánico. Tampones de esta naturaleza son conocidos a
partir de DE 3724442 y Jakobi y col., supra. Los tampones de
elución con un bajo contenido en sales son en particular tampones
con un contenido menor de 0,2 moles/l. En una realización
especialmente preferida, el tampón de elución contiene la sustancia
Tris para la amortiguación, en particular una solución tamponada con
Tris con un pH alrededor de 7 o por encima de 7. En otra
realización especial, el tampón de elución es agua desmineralizada.
La solución que contiene el ácido nucleico está ahora lista para ser
utilizada en la reacción de amplificación una vez que ha sido
eliminada la fase sólida. Por tanto, el ácido nucleico es
transferido a un nuevo tubo de reacción que contiene todos los
reactivos necesarios para la amplificación. Opcionalmente, una
solución conteniendo todos los reactivos necesarios para la
amplificación es añadida a la suspensión de la fase sólida y los
ácidos nucleicos liberados. En otra realización, una solución
conteniendo todos los reactivos necesarios para la amplificación es
añadida a la suspensión de la fase sólida y el ácido nucleico unido
sin etapa de elución, por lo que se realiza la amplificación del
ácido nucleico en la fase sólida.
De acuerdo con la presente invención, para las
etapas de lavado y de unión, se utilizan preferiblemente líquidos
que sean adecuados para procesos de biología molecular, en
particular para procesos de purificación de ácido
desoxirribonucleico (ADN) o de ácido ribonucleico (ARN) que utilizan
la unión de estas sustancias a una fase sólida, en particular a
superficies de sílice o de vidrio, más particularmente a partículas
magnéticas de vidrio, bajo ciertas condiciones. Los líquidos
preferidos comprenden alcoholes y/o cetonas o cualquier mezcla de
los mismos con agua. Los alcoholes incluirán, de acuerdo con la
invención, preferiblemente alcoholes primarios, secundarios o
terciarios de fórmula general R-OH, en la que R
representa la fórmula general
-(CH_{2})_{n}-CH_{3} con n >= 0.
Sin embargo, otros alcoholes pueden ser también utilizados sin son
adecuados para biología molecular tales como, por ejemplo,
glicerol. Son particularmente adecuados los alcoholes isopropanol,
etanol o mezclas de los mismos con agua, preferiblemente una mezcla
de 80 partes en volumen de isopropanol con 20 partes en volumen de
agua. En otra realización de la invención, el líquido contiene
cetonas tales como por ejemplo acetona. Además, se utilizan
soluciones acuosas tamponadas adecuadas. Sistemas de tampones que
son adecuados para biología molecular pueden encontrarse en, por
ejemplo, Sambrook, J. y col., en "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual" (1989), Eds. J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis,
Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY.
Sustancias tampón preferidas son
Tris-hidroximetilamina (TRIS), fosfato,
N-(2-hidroxi-etil)piperazina-N'-(2-ácido
etanosulfónico) (HEPES), sales de las mismas u otras sustancias
adecuadas. Adicionalmente, pueden estar presentes sustancias que
modifiquen la fuerza iónica de la solución tales como, por ejemplo,
NaCl, KCl o CaCl_{2}, o que sean agentes acomplejantes de
cationes metálicos tales como, por ejemplo, ácido
etilén-diamino-tetraacético (EDTA)
o las sales del mismo.
En una realización preferida de la invención, el
ácido nucleico es amplificación con la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR; EP 0 201 184,
EP-A-0 200 362, US 4.683.202). El
método de amplificación puede ser también la reacción en cadena de
la ligasa (LCR; Wu, D.Y. y Wallace, R.B., Genomics 4 (1989)
560-9 y Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88
(1991) 189-93); la Reacción en Cadena de Polimerasa
Ligasa (Barany, F., PCR Methods Appl. 1 (1991)
5-16); Gap-LCR (Publicación de
Patente PCT Nº WO 90/01069); la Reacción de Reparación de la Cadena
(Publicación de Patente Europea Nº EP 439.182 A2); 3SR (Kwoh, D.Y. y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173-7;
Guatelli, J.C. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990)
1874-8; Publicación de Patente PCT Nº WO 92/0880A),
y NASBA (Patente de EE.UU. Nº US 5.130.238). Además, están la
amplificación por desplazamiento de la cadena (SDA), la
amplificación mediada por transcripción (TMA) y la amplificación
Q\beta (para una revisión ver por ejemplo Whelen, A.C. y Persing,
D.H., Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349-73;
Abramson, R.D. y Myers, T.W., Curr. Opin. Biotechnol. 4 (1993)
41-7). Métodos de amplificación particularmente
preferidos de acuerdo con la invención son el método de PCR
específica de metilación (MSP) descrito en US 5.786.146 que combina
el tratamiento con bisulfito y una PCR específica de un alelo (ver
por ejemplo US 5.137.806, US 5.595.890, US 5.639.611).
En una realización preferida, el método puede
comprender además la etapa de detección del ácido nucleico
amplificado. El ácido nucleico amplificado puede ser determinado o
detectado mediante métodos analíticos estándar conocidos por las
personas expertas en la técnica y descritos en, por ejemplo,
Sambrook, y col., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor University
Press (1989), Lottspeich y Zorbas, en "Bioanalytik" (1998),
Eds. L.A. Zorbas, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin,
Alemania o en Ausubel, F. y col., en "Current protocols in
molecular biology" (1994), Eds. F. Ausubel, R. Brent y K.R.E,
Wiley & Sons, Verlag, New York. Puede haber también etapas de
purificación adicionales antes de que el ácido nucleico diana sea
detectado, por ejemplo una etapa de precipitación. Los métodos de
detección pueden incluir, pero no se limitan a, la unión o el
intercalado de colorantes específicos tales como el bromuro de
etidio que se intercala en el ADN bicatenario y después de lo cual
cambia su fluorescencia. Los ácidos nucleicos purificados pueden ser
también separados por métodos electroforéticos opcionalmente
después de una digestión de restricción y visualizados
posteriormente. Existen también ensayos basados en sondas que
aprovechan la hibridación de oligonucleótidos a secuencias
específicas y la detección posterior del híbrido. Es posible
también secuenciar el ácido nucleico diana después de etapas
adicionales conocidas por los expertos en este campo. Otros métodos
aplican una diversidad de secuencias de ácido nucleico a un chip de
silicio al cual se unen sondas específicas y producen una señal
cuando se unen secuencias complementarias.
En una realización particularmente preferida de
la invención, el ácido nucleico es detectado midiendo la intensidad
de la luz de fluorescencia durante la amplificación. Este método
supone la monitorización de la fluorescencia en tiempo real. Un
método particularmente preferido que aprovecha la amplificación y la
detección simultáneas midiendo la intensidad de la luz fluorescente
es el método TaqMan® descrito en WO 92/02638 y en las patentes de
EE.UU. correspondientes US 5.210.015, US 5.804.375, US 5.487.972.
Este método aprovecha la actividad exonucleasa de una polimerasa
para generar una señal. Con más detalle, el ácido nucleico es
detectado por un proceso que comprende la puesta en contacto de la
muestra con un oligonucleótido que contiene una secuencia
complementaria a una región del ácido nucleico diana y un
oligonucleótido marcado que contiene una secuencia complementaria a
una segunda región de la misma hebra del ácido nucleico diana, pero
no incluye la secuencia de ácido nucleico definida por el primer
oligonucleótido, para crear una mezcla de dúplices durante las
condiciones de hibridación, donde los dúplices contienen el ácido
nucleico diana hibridado al primer oligonucleótido y al
oligonucleótido marcado, de tal manera que el extremo 3' del primer
oligonucleótido es adyacente al extremo 5' del oligonucleótido
marcado. Posteriormente esta mezcla es tratada con una polimerasa de
ácido nucleico dependiente del molde que posee actividad nucleasa
de 5' a 3' bajo condiciones suficientes para permitir que la
actividad nucleasa de 5' a 3' de la polimerasa corte el
oligonucleótido hibridado marcado y libere fragmentos marcados. La
señal generada por la hidrólisis del oligonucleótido marcado es
detectada y/o medida. La tecnología TaqMan® elimina la necesidad de
que se forme un complejo de reacción unido a una fase sólida y se
convierta en detectable. En términos más generales, la reacción de
amplificación y/o detección del método de acuerdo con la invención
es un ensayo en fase de solución homogénea. Métodos adicionales
preferidos son los formatos utilizados en el instrumento
LightCycler® (ver por ejemplo US 6.174.670). Es particularmente
preferida la utilización de un tratamiento con bisulfito, la
amplificación con o sin cebadores específicos de metilación en
presencia de una
sonda específica de metilación y la detección de fluorescencia en tiempo real, según está descrito en US 6.331.393.
sonda específica de metilación y la detección de fluorescencia en tiempo real, según está descrito en US 6.331.393.
En una realización preferida de la presente
invención, el método es automatizado, esto es el método lleva a
cabo un proceso susceptible de ser automatizado como el descrito,
por ejemplo, en WO 99/16781. Un proceso susceptible de ser
automatizado significa que las etapas del proceso son adecuadas para
ser llevadas a cabo con un aparato o una máquina capaz de funcionar
con poco o ningún control o influencia externos por un ser humano.
Un método automatizado significa que las etapas del método
susceptible de ser automatizado son llevadas a cabo con un aparato
o una máquina capaz de funcionar con poco o ningún control o
influencia externos por un ser humano. Únicamente las etapas de
preparación del método pueden tener que ser realizadas manualmente,
por ejemplo los recipientes de almacenamiento tienen que ser
llenados y colocados en su lugar, la elección de las muestras tiene
que ser realizada por un ser humano y las etapas posteriores
conocidas por los expertos en este campo, por ejemplo el manejo del
ordenador de control. El aparato o la máquina pueden, por ejemplo,
añadir líquidos automáticamente, mezclar las muestras o llevar a
cabo las etapas de incubación a temperaturas específicas.
Típicamente, tal máquina o aparato es un robot controlado por un
ordenador que realiza un programa en el cual las etapas y los
comandos individuales están especificados. En una realización
preferida de la invención, el método está en un formato de alto
rendimiento, esto es los métodos automatizados se llevan a cabo en
un formato de alto rendimiento, lo cual significa que los métodos y
la máquina o el aparato utilizados están optimizados para un número
elevado de muestras en un tiempo corto.
Preferiblemente, el método de acuerdo con la
invención es utilizado en diagnóstico, para análisis de diagnóstico
o para bioanalítica, o bien para someter a selección tejidos o
fluidos del cuerpo humano o incluso del cuerpo de animales por la
presencia de cierto patrón de metilación. Además, el método de
acuerdo con la invención es utilizado para incrementar la
velocidad, la precisión o la sensibilidad de la detección de lugares
de metilación en ácidos nucleicos.
\global\parskip0.900000\baselineskip
En una realización preferida, la presente
invención está dirigida a la utilización de una fase sólida en la
etapa de desaminación y/o desulfonación de una reacción en la que
una base citosina, preferiblemente bases citosina, de un ácido
nucleico es convertida en una base uracilo, preferiblemente en bases
uracilo, en presencia de iones bisulfito, por la que
preferiblemente las bases
5-metil-citosina no son convertidas
significativamente ("reacción de bisulfito"). En una
realización preferida, la presente invención está dirigida a la
utilización de una fase sólida en la etapa de desaminación y/o
desulfonación de una reacción en la que una base citosina,
preferiblemente bases citosina, de un ácido nucleico es convertida
en una base uracilo, preferiblemente en bases uracilo, en presencia
de iones bisulfito, por la que preferiblemente las bases
5-metil-citosina no son convertidas
significativamente. Más particularmente, esto significa que la fase
sólida es utilizada para unir el ácido nucleico durante la etapa de
desaminación y/o desulfonación de la reacción del bisulfito, esto
es, el ácido nucleico está unido a la fase sólida durante la etapa
de desaminación y/o desulfonación de la reacción del bisulfito.
Preferiblemente, la fase sólida es un material que comprende sílice
o vidrio. Más preferiblemente, la fase sólida es lana de vidrio o
una membrana de vidrio. En la realización más preferida, la fase
sólida es una partícula magnética de vidrio.
En otra realización preferida, la presente
invención está dirigida a un kit para llevar a cabo una reacción de
bisulfito, que comprende una solución conteniendo iones bisulfito y
una fase sólida. En una realización preferida, la fase sólida es un
material conteniendo sílice o vidrio. En una realización más
preferida, la fase sólida es lana de vidrio o una membrana de
vidrio. En la realización más preferida, la fase sólida es una
partícula magnética de vidrio. En otra realización de la invención,
se proporciona un kit de partes que comprende un recipiente de
almacenamiento conteniendo las partículas magnéticas de vidrio o una
suspensión de las mismas de acuerdo con la presente invención.
Tales kits conocidos en la técnica contienen además material de
plástico que puede ser utilizado durante el procedimiento del
bisulfito tal como, por ejemplo, placas de microvaloración en el
formato de 96 ó 384 pocillos o tubos de reacción fabricados por, por
ejemplo, Eppendorf, Hamburg, Alemania. El kit puede contener además
una solución de lavado que sea adecuada para la etapa de lavado de
la fase sólida, en particular de la lana o la membrana de vidrio o
de las partículas magnéticas de vidrio. A menudo la solución de
lavado es proporcionada como una solución madre que tiene que ser
diluida antes de su utilización. El kit puede contener además un
eluyente, esto es una solución o un tampón (por ejemplo TE, Tris 10
mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) o agua pura para eluir el ADN o el ARN unido
a la fase sólida. Además, pueden estar presentes reactivos
adicionales que contengan tampones adecuados para ser utilizados en
la presente invención. Preferiblemente, el kit de acuerdo con la
invención es utilizado para una reacción en la que una base
citosina, preferiblemente bases citosina, de un ácido nucleico es
convertida en una base uracilo, preferiblemente en bases uracilo,
en presencia de iones bisulfito, mediante la cual preferiblemente
las bases 5-metil-citosina no son
convertidas significativamente.
1. Ejemplo
1
El hecho de que la reacción de bisulfito haya
funcionado y convertido las citosinas no metiladas en uracilo,
puede ser demostrado por una reacción en cadena de la polimerasa en
la cual se utilizan cebadores que son específicos para una región
de la secuencia del ácido nucleico en la que citosinas no metiladas
han sido convertidas en uracilos, esto es la base adenina del
cebador está opuesta al uracilo que es el producto de la reacción
del bisulfito a partir de las citosinas no metiladas. En el caso de
una conversión incompleta, el cebador no podría hibridarse con esta
región ya que habría citosinas que no se aparearían con las bases
adenina del cebador. Esto tendría el efecto de no se obtendría
ningún producto de la PCR.
Un método mejorado para realizar reacciones en
cadena de la polimerasa rápidas está descrito en, por ejemplo, US
6.174.670 y es utilizado en el instrumento LightCycler® (Roche,
Mannheim, Alemania). En este método, dos sondas marcadas pueden
aproximarse estrechamente de manera dependiente del amplificado, de
tal manera que las dos marcas puedan llevar a cabo una
transferencia de energía de fluorescencia (FRET). La cantidad de
amplificado se correlaciona por ello con la intensidad de la luz
emitida de una cierta longitud de onda. Este método de PCR
específica puede ser utilizado por tanto para analizar si se ha
obtenido una conversión completa de las citosinas no metiladas,
analizando por ejemplo la región promotora del gen de la
glutation-S-transferasa \pi (ver
por ejemplo la SEC ID Nº: 1 para la secuencia de longitud completa
de este gen y del promotor, US 5.552.277, código de acceso del
Genbank M24485 y Morrow y col. (1989) Gene 75, 3-11)
utilizando sondas y cebadores adecuados. Sin embargo, los expertos
en la técnica saben que pueden utilizarse también otros métodos para
esta evaluación. Las medidas de la fluorescencia son normalizadas
dividiendo por la medida de la fluorescencia inicial, esto es por
la fluorescencia de fondo, obtenida durante un ciclo temprano de la
reacción mientras las medidas de la fluorescencia entre los ciclos
parecen ser relativamente constantes. El número de ciclos elegido
para la medida de la fluorescencia inicial es el mismo para todas
las reacciones comparadas, de tal manera que todas las medidas
representan incrementos relativos al mismo ciclo de reacción. En los
ciclos tempranos de una amplificación por la reacción en cadena de
la polimerasa, el número de moléculas diana puede ser descrito por
la ecuación geométrica N_{i} = N_{0} x (1 + E)^{i},
donde N_{0} = número de moléculas diana al inicio de la reacción,
N_{i} = número de moléculas diana al finalizar el ciclo iº, E =
eficacia de la amplificación (0 =< E =< 1). Durante esta fase
de crecimiento geométrico de la amplificación, el número de ciclos
requeridos para alcanzar un valor umbral particular (valor de
C_{T} o punto de cruce) es inversamente proporcional al logaritmo
de (1 + E). Por tanto, el valor de C_{T} representa una medida de
la eficacia de la reacción que permite comparaciones entre
reacciones. Una disminución del valor de C_{T}, que significa que
la reacción alcanzó el valor umbral en menos ciclos, indica un
incremento de la eficacia de la reacción. Como el incremento del
producto de la amplificación es monitorizado midiendo el incremento
de la fluorescencia de la reacción, se define C_{T} en la
presente como el número de ciclos de amplificación llevados a cabo
hasta que la fluorescencia exceda un nivel de fluorescencia
arbitrario (AFL). El AFL fue elegido próximo al nivel de
fluorescencia basal, pero por encima del rango de las fluctuaciones
aleatorias de la fluorescencia medida, de tal manera que la
cinética de la reacción fue medida durante la fase de crecimiento
geométrico de la amplificación. La acumulación del producto
amplificado en los ciclos más tardíos inhibe la reacción y da lugar
finalmente a una meseta de la reacción. Se eligió un AFL de 1,5
para todas las reacciones. Como una amplificación por PCR consta de
ciclos discretos y las medidas de la fluorescencia se llevan a cabo
una vez por ciclo, la fluorescencia medida aumenta típicamente
desde por debajo del AFL hasta por encima del AFL en un único ciclo.
Con el fin de mejorar la precisión de las medidas, se calculó un
número "exacto" de ciclos para alcanzar el umbral de
AFL,
referido en la presente como valor de C_{T} o punto de cruce, interpolando las medidas de la fluorescencia entre ciclos.
referido en la presente como valor de C_{T} o punto de cruce, interpolando las medidas de la fluorescencia entre ciclos.
El experimento siguiente demuestra que la PCR
descrita en el instrumento LightCycler® puede ser utilizada como
herramienta de evaluación del ADN tratado con bisulfito. Muestra que
la combinación cebador/sonda diseñada da resultados positivos
únicamente con ADN después del tratamiento con bisulfito. El ADN
tratado con bisulfito (en este caso el ADN fue tratado con
bisulfito de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 2) y el
ADN no tratado fueron amplificados en paralelo utilizando las
mismas concentraciones de molde (20 ng y 1 ng por PCR).
Sonda de hibridación "LC FastStart DNA Master
Hybridation Probe" 1x, MgCl_{2} 2 mM, cebador directo 0,5
\muM, cebador inverso 0,5 \muM, sonda donante 250 nM, sonda
aceptora 250 nM, molde 10 \mul, volumen total de la PCR 20
\mul.
Desnaturalización 10 minutos/95ºC
- 55 ciclos
- 95ºC/10 segundos
- \quad
- 65ºC/10 segundos - adquisición de la señal
- \quad
- 72ºC/10 segundos - Incremento gradual de la temperatura 20ºC/segundo
El resultado muestra puntos de cruce únicamente
para el ADN tratado con bisulfito. Por tanto, esta PCR es adecuada
para evaluar los métodos del bisulfito. Para los expertos en la
técnica está claro que podría utilizarse cualquier PCR como
herramienta de evaluación si se garantiza que la combinación
cebador/sonda no reacciona con el ADN antes del tratamiento con
bisulfito.
\global\parskip1.000000\baselineskip
2. Ejemplo
2
Cien microlitros de la dilución del ADN metilado
(Intergen, distribuido por Serologicals Corporation, Norcross, GA,
EE.UU.; Cat S7821) (30 ng y 6 ng/ensayo añadidos a 1000 ng de hADN
de fondo, catálogo de Roche 1691112; 10 replicados por
concentración), y 12 \mul de NaOH 2 M son mezclados e incubados
durante 15 minutos a 37ºC.
Se mezclan 112 \mul del ADN desnaturalizado
con 200 \mul de reactivo bisulfito (bisulfito de sodio 2,5 M,
hidroquinona 125 mM, pH 5,0) y se incuban durante 16 horas a
50ºC.
Se mezclan 312 \mul del ADN desaminado con 600
\mul de tampón de unión (kit de aislamiento de ADN "MagNAPure
DNA Isolation Kit I", Roche, Nº de Catálogo 3 003 990) y 75
\mul de una solución de partículas magnéticas de vidrio
(MagNAPure DNA Isolation Kit I) y se incuban durante 15 minutos a
temperatura ambiente con mezclado continuo. Posteriormente, las
partículas magnéticas de vidrio son lavadas tres veces con 1 ml de
etanol al 70%. La separación del ADN unido y el libre se realiza
con un separador magnético (Catálogo de Roche 1641794).
Posteriormente, tiene lugar la desulfonación por la adición de 250
\mul de EtOH al 90%/NaOH 20 mM al ADN unido a las MGPs; la mezcla
es incubada durante 10 minutos a temperatura ambiente con mezclado.
Posteriormente las MGPs son lavadas dos veces con etanol al 90%.
Para eliminar los restos de etanol las MGPs fueron calentadas
durante 15 minutos/60ºC en un termomezclador con la tapa abierta.
Posteriormente el ADN es eluido con 50 \mul de Tris 10 mM/EDTA
0,1 mM pH 7,5 (15 minutos/60ºC). Se utilizan 10 \mul del ADN
eluido para el análisis mediante PCR posterior.
Se trataron 30 ng y 6 ng de ADN metilado
(Intergen, distribuido por Serologicals Corporation, Norcross, GA,
EE.UU.; Cat S7821) (10 replicados por concentración) de acuerdo con
el método descrito en el prospecto del paquete del kit de Intergen
"CpGenome DNA Modification Kit" (Intergen, distribuido por
Serologicals Corporation, Norcross, GA, EE.UU.; Cat S7820). Se
utilizan 10 \mul del ADN eluido para el análisis mediante PCR
posterior.
Sonda de hibridación "LightCycler® FastStart
DNA Master Hybridation Probe" 1x (Roche 2239272), MgCl_{2} 2
mM, cebador directo 0,5 \muM, cebador inverso 0,5 \muM, sonda
donante 250 nM, sonda aceptora 250 nM, molde 10 \mul, volumen
total de la PCR 20 \mul.
Desnaturalización 10 minutos/95ºC
- 55 ciclos
- 95ºC/10 segundos
- \quad
- 65ºC/10 segundos - adquisición de la señal
- \quad
- 72ºC/10 segundos - Incremento gradual de la temperatura 20ºC/segundo
Las muestras procedentes del tratamiento con
bisulfito de MGP y del tratamiento con bisulfito de Intergen fueron
procesadas en paralelo en el mismo proceso en el instrumento
LightCycler®.
Los valores de C_{T} o puntos de cruce
calculados durante la PCR en tiempo real son casi idénticos para
los dos métodos del bisulfito utilizados, esto es, el funcionamiento
de los métodos es el mismo.
3. Ejemplo
3
Se mezclan y se incuban durante 10 minutos a
37ºC 20 \mul de la dilución de ADN metilado (Intergen, distribuido
por Serologicals Corporation, Norcross, GA, EE.UU.; Cat S7821) (50
ng/ensayo), 4 \mul de una solución de Poli(dA)
(concentración 250 ng/\mul) y 2,6 \mul de NaOH 2 M.
Se mezclan 26 \mul del ADN desnaturalizado con
220 \mul de reactivo de bisulfito (bisulfito de sodio 2,5 M,
hidroquinona 125 mM, pH 5,0) y se incuban durante 4 horas a
50ºC.
Se mezclan 250 \mul del ADN desaminado con 600
\mul de tampón de unión (kit de aislamiento de ADN "MagNAPure
DNA Isolation Kit I", Roche, Mannheim, Alemania) y 75 \mul de
la solución de partículas magnéticas de vidrio (kit de aislamiento
de ADN "MagNAPure DNA Isolation Kit I", Roche, Mannheim,
Alemania) y se incuban durante 15 minutos/temperatura ambiente con
mezclado continuo. Posteriormente, las partículas magnéticas de
vidrio son lavadas tres veces con 1 ml de Etanol al 70%.
Posteriormente, tiene lugar la desulfonación por la adición al ADN
unido a las MGPs de 250 \mul de EtOH 90%/NaOH 20 mM; la mezcla es
incubada durante 10 minutos a temperatura ambiente con mezclado.
Posteriormente, las MGPs son lavadas dos veces con etanol al 90% y
eluidas con 50 \mul de Tris 10 mM/EDTA 0,1 mM pH 7,5 (7 minutos,
180ºC).
Sonda de hibridación "LightCycler® FastStart
DNA Master Hybridation Probe" 1x, MgCl_{2} 2 mM, cebador
directo 0,5 \muM, cebador inverso 0,5 \muM, sonda donante 250
nM, sonda aceptora 250 nM, molde 5 \mul, volumen total de la PCR
20 \mul.
Desnaturalización 10 minutos/95ºC
- 55 ciclos
- 95ºC/10 segundos
- \quad
- 65ºC/10 segundos - adquisición de la señal
- \quad
- 72ºC/10 segundos - Incremento gradual de la temperatura 20ºC/segundo
Los resultados muestran los puntos de cruce para
concentración utilizada. Esto indica que el tratamiento con
bisulfito automatizado tuvo éxito.
\global\parskip0.900000\baselineskip
4. Ejemplo
4
Se mezclan 100 \mul de la dilución de ADN
metilado (Intergen, distribuido por Serologicals Corporation,
Norcross, GA, EE.UU.; Cat S7821) (30 ng y 6 ng/ensayo, 10 replicados
por concentración) con 12 \mul de NaOH 2 M y se incuban durante
15 minutos a 37ºC.
Se incuban 112 \mul del ADN desnaturalizado
con 200 \mul de reactivo de bisulfito (bisulfito de sodio 2,5 M,
hidroquinona 125 mM, pH 5,0) durante 16 horas/50ºC con mezclado
continuo.
- \bullet
- Se mezclan 312 \mul de ADN desaminado con 200 \mul del tampón de unión del kit y 100 \mul de isopropanol, y se pipetea todo ello sobre la columna que contiene la lana de vidrio. La columna es posteriormente centrifugada en una centrífuga de sobremesa Eppendorf (1 minuto/8000 rpm).
- \bullet
- Posteriormente, las columnas son lavadas tres veces cada una con 500 \mul de etanol al 80% (centrifugación 10 segundos/12000 rpm).
- \bullet
- Para la desulfonación, se añaden a las columnas \mul del reactivo (etanol 38%/NaCl 100 mM/NaOH 200 mM). Después de una incubación de 5 minutos/temperatura ambiente, se centrifuga 1 minuto/800 rpm.
- \bullet
- Posteriormente, las columnas son lavadas dos veces cada una con 500 \mul de etanol 80% (centrifugación 10 segundos/12000 rpm).
- \bullet
- Finalmente, el ADN unido es eluido por la adición de 50 \mul de tampón de elución (Tris 10 mM/EDTA 0,1 mM, pH 7,5) precalentado (70ºC) y centrifugación durante 1 minuto/800 rpm.
Sonda de hibridación "LightCycler® FastStart
DNA Master Hybridation Probe" 1x (Roche 2239272), MgCl_{2} 2
mM, cebador directo 0,5 \muM, cebador inverso 0,5 \muM, sonda
donante 250 nM, sonda aceptora 250 nM, molde 10 \mul, volumen
total de la PCR 20 \mul.
Desnaturalización 10 minutos/95ºC
- 55 ciclos
- 95ºC/10 segundos
- \quad
- 65ºC/10 segundos - adquisición de la señal
- \quad
- 72ºC/10 segundos - Incremento gradual de la temperatura 20ºC/segundo
El resultado muestra los puntos de cruce para
cada concentración utilizada. Esto indica que el tratamiento con
bisulfito utilizando lana de vidrio tuvo éxito.
\global\parskip1.000000\baselineskip
5. Ejemplo
5
Se mezclan 100 \mul de ADN (conteniendo una
mezcla de 1 \mug de hADN (Roche) y 100 ng de ADN metilado
(Intergen, distribuido por Serologicals Corporation, Norcross, GA,
EE.UU.; Cat S7821) con 200 \mul de tampón de unión ("High Pure
PCR Template Preparation Kit", Catálogo de Roche 1796828) y 100
\mul de isopropanol. La mezcla es pipeteada sobre la columna del
kit. La columna es posteriormente centrifugada en una centrífuga de
sobremesa Eppendorf (1 minuto/8000 rpm). La lana de vidrio es lavada
dos veces con el tampón de lavado del kit (500 \mul por etapa de
lavado).
La desnaturalización tiene lugar mediante el
pipeteo de 200 \mul de EtOH 38%/NaOH 100 mM/NaCl 200 mM sobre la
lana de vidrio y la incubación de ambos durante 10 minutos a
temperatura ambiente.
Posteriormente, la lana de vidrio es lavada una
vez con 500 \mul del tampón de lavado del kit.
Se pipetean 200 \mul de solución de
desaminación (urea 6,25 M/bisulfito de sodio 2 M/pH 5,0) sobre la
lana de vidrio que tiene el ADN seguido por incubación a 50ºC
durante 16 horas en un baño de agua.
Posteriormente, se retira el reactivo de
desaminación y se lava la lana de vidrio dos veces con 500 \mul
cada vez del tampón de lavado del kit.
Para la desulfonación, se añaden a las columnas
250 \mul de reactivo (etanol 90%/NaOH 20 mM). Después de una
incubación de 15 minutos/temperatura ambiente las columnas son
centrifugadas 1 minuto/8000 rpm. Posteriormente, las columnas son
lavadas dos veces con 500 \mul cada vez de etanol al 80%
(centrifugación 10 segundos/12000 rpm).
Finalmente, el ADN unido es eluido por la
adición de 50 \mul de tampón de elución (Tris 10 mM/EDTA 0,1 mM,
pH 7,5) precalentado (70ºC) y centrifugación durante 1 minuto/8000
rpm.
Sonda de hibridación "LightCycler® FastStart
DNA Master Hybridation Probe" 1x (Roche 2239272), MgCl_{2} 2
mM, cebador directo 0,5 \muM, cebador inverso 0,5 \muM, sonda
donante 250 nM, sonda aceptora 250 nM, molde 10 \mul, volumen
total de la PCR 20 \mul.
Desnaturalización 10 minutos/95ºC
- 55 ciclos
- 95ºC/10 segundos
- \quad
- 65ºC/10 segundos - adquisición de la señal
- \quad
- 72ºC/10 segundos - Incremento gradual de la temperatura 20ºC/segundo
En cada reacción se detectó una curva de
crecimiento y se calculó el punto de cruce. Este resultado muestra
que la desaminación y la desulfonación sobre la fase sólida de lana
de vidrio son factibles.
\vskip1.000000\baselineskip
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29-08-2002
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<150> 02028114.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
18-12-2002
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Versión 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4261
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> señal varia
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1156)..(1162)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> motivo regulador de la
transcripción; supuesto
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> señal de GC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1169)..(1174)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> señal de GC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1179)..(1184)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> señal de TATA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1199)..(1198)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1225)..(1254)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> señal de poliA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4041)..(4046)
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<300>
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<308> Genbank: M24485
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<309>
04-03-2000
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<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<303> Gen
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<304> 75
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<305> 1
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<306> 3-11
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<307> 1989
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<308> Morrow y col.
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<300>
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<310> US 5.552.277
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<311>
19-07-1994
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<312>
03-09-1996
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<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Roche Diagnostics GmbH F.
Hoffmann-La Roche AG
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<120> Método mejorado para el tratamiento
con bisulfito
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<130> 21371
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<140>
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<141>
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<150> 02019097.1
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<151>
29-08-2002
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<151>
18-12-2002
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<160> 1
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<170> PatentIn Versión 2.1
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<210> 1
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<211> 4261
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> señal varia
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<222> (1156)..(1162)
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<223> motivo regulador de la
transcripción; supuesto
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<221> señal de GC
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<222> (1169)..(1174)
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03-09-1996
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<400> 1
Claims (18)
1. Método para la conversión de una base
citosina de un ácido nucleico en una base uracilo mediante el
tratamiento con bisulfito caracterizado porque el ácido
nucleico está unido a una fase sólida durante las etapas de
desaminación y/o desulfonación,
caracterizado porque la fase sólida es
seleccionada de vidrio o sílice, un material conteniendo vidrio o
sílice, un intercambiador de iones o hidroxiapatita.
2. Método para la conversión de la base citosina
de un ácido nucleico en una base uracilo de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende las etapas de
- a)
- unión del ácido nucleico a una fase sólida,
- b)
- incubación del ácido nucleico unido a la fase sólida en presencia de iones sulfito, mediante lo cual el ácido nucleico es desaminado,
- c)
- lavado opcional del ácido nucleico desaminado unido a la fase sólida,
- d)
- incubación del ácido nucleico desaminado unido a la fase sólida bajo condiciones alcalinas, mediante lo cual el ácido nucleico desaminado es desulfonado,
- e)
- lavado opcional del ácido nucleico desaminado y desulfonado unido a la fase sólida y
- f)
- elución opcional del ácido nucleico desaminado y desulfonado de la fase sólida.
3. Método para la conversión de una base
citosina de un ácido nucleico en una base uracilo de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende las etapas de
- a)
- incubación del ácido nucleico en presencia de iones sulfito, mediante lo cual el ácido nucleico es desaminado,
- b)
- unión del ácido nucleico desaminado a una fase sólida,
- c)
- lavado opcional del ácido nucleico desaminado unido a la fase sólida,
- d)
- incubación del ácido nucleico desaminado unido a la fase sólida bajo condiciones alcalinas, mediante lo cual el ácido nucleico desaminado es desulfonado,
- e)
- lavado opcional del ácido nucleico desaminado y desulfonado unido a la fase sólida y
- f)
- elución opcional del ácido nucleico desaminado y desulfonado a partir de la fase sólida.
4. Método para la conversión de una base
citosina de un ácido nucleico en una base uracilo de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende las etapas de
- a)
- unión del ácido nucleico a una fase sólida,
- b)
- incubación del ácido nucleico unido a la fase sólida en presencia de iones sulfito, mediante lo cual el ácido nucleico es desaminado,
- c)
- lavado opcional del ácido nucleico unido a la fase sólida,
- d)
- elución del ácido nucleico desaminado a partir de la fase sólida y
- e)
- incubación del ácido nucleico desaminado bajo condiciones alcalinas, mediante lo cual el ácido nucleico desaminado es desulfonado.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque la fase sólida es lana de vidrio o una
membrana de vidrio.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque la fase sólida es una partícula
magnética de vidrio.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6,
caracterizado porque la partícula magnética de vidrio tiene
un diámetro medio entre 0,5 \mum y 5 \mum.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 6
ó 7, caracterizado porque la partícula magnética de vidrio
contiene un objeto magnético con un diámetro entre 5 y 500 nm.
9. El método de la reivindicación 8,
caracterizado porque la partícula magnética de vidrio
contiene un objeto magnético con un diámetro medio de 23 nm.
10. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 9, caracterizado porque la partícula
magnética de vidrio es producida mediante el método
sol-gel.
11. El método de la reivindicación 10, donde
dicho método sol-gel comprende las etapas de
- a)
- suspensión de los objetos magnéticos en un sol,
- b)
- hidrólisis del sol para cubrir los objetos magnéticos con un gel,
- c)
- deshidratación por aspersión de los objetos magnéticos cubiertos con un gel en un deshidratador por aspersión de dos boquillas y
- d)
- sinterización del polvo deshidratado por aspersión para formar un vidrio a partir del gel que cubre los objetos magnéticos.
12. Utilización de una fase sólida en la etapa
de desaminación y/o desulfonación de una reacción en la que una
base citosina de un ácido nucleico es convertida en una base uracilo
en presencia de iones bisulfito, en la que la fase sólida es
seleccionada de vidrio o sílice, un material conteniendo vidrio o
sílice, un intercambiador de iones o hidroxiapatita.
13. Utilización de acuerdo con la reivindicación
12, en la que la fase sólida es lana de vidrio o una membrana de
vidrio.
14. Utilización de acuerdo con la reivindicación
12, en la que la fase sólida es una partícula magnética de
vidrio.
15. Un kit para la realización de un método de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que contiene
una solución que comprende iones bisulfito y una fase sólida, en la
que la fase sólida es seleccionada de vidrio o sílice, un material
conteniendo vidrio o sílice, un intercambiador de iones o
hidroxiapatita.
16. El kit de acuerdo con la reivindicación 15,
en el que la fase sólida es lana de vidrio o una membrana de
vidrio.
17. El kit de acuerdo con la reivindicación 15 ó
16, en el que la fase sólida es una partícula magnética de
vidrio.
18. Utilización del kit de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 para una reacción en la
cual una base citosina de un ácido nucleico es convertida en una
base uracilo en presencia de iones bisulfito.
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