JP2007074914A - 核酸抽出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】
固体状の生物試料を対象とする核酸抽出方法は、生物試料の破砕、及び核酸抽出を目的とする2種類以上の器具を用いる為、操作が複雑化し、操作労力の増大,操作時間の延長、さらに操作時間の延長に伴う核酸の性状劣化を引き起こす。また、生物試料の破砕操作において破砕器具に付着してしまった試料は、次工程の核酸抽出操作へと持ち込まれず、核酸抽出効率を低下させるという課題を持っている。
【解決手段】
本発明は、生物試料を破砕する工程と、破砕した試料から遊離状態となった核酸を抽出する核酸抽出工程で構成される核酸抽出方法において、2つの工程を単一の器具により実施することに関する。
本発明により、試料破砕器具に付着した試料を損失することなく核酸抽出効率を向上させ、操作を簡便化して操作性を向上できる。
【選択図】図1
固体状の生物試料を対象とする核酸抽出方法は、生物試料の破砕、及び核酸抽出を目的とする2種類以上の器具を用いる為、操作が複雑化し、操作労力の増大,操作時間の延長、さらに操作時間の延長に伴う核酸の性状劣化を引き起こす。また、生物試料の破砕操作において破砕器具に付着してしまった試料は、次工程の核酸抽出操作へと持ち込まれず、核酸抽出効率を低下させるという課題を持っている。
【解決手段】
本発明は、生物試料を破砕する工程と、破砕した試料から遊離状態となった核酸を抽出する核酸抽出工程で構成される核酸抽出方法において、2つの工程を単一の器具により実施することに関する。
本発明により、試料破砕器具に付着した試料を損失することなく核酸抽出効率を向上させ、操作を簡便化して操作性を向上できる。
【選択図】図1
Description
本発明は、核酸を含む生物試料からの核酸抽出技術に関する。例えば、核酸を含む固体状の生物試料から、生物試料の破砕操作と破砕した生物試料から遊離した核酸の抽出操作を単一の器具を用いて一貫して行う方法に関する。
核酸の分析により得られる遺伝子情報は、医療,臨床検査,医薬品産業,食品産業等の様々な分野で活用されている。この核酸分析には、様々な生物試料からの核酸抽出が必須の前処理となっている。
近年の核酸抽出方法としては、有害な有機溶媒であるフェノールやクロロホルム等を使用する方法ではなく、〔B. Vogelstein and D. Gillespie, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 76(2), 615-619(1979)〕に報告されるカオトロピック剤の存在下で核酸がシリカに結合する性質に基づいた方法、あるいは、〔特開2001−95572号公報〕,〔特開2002−360245号公報〕に報告される有機溶媒の存在下で核酸がシリカに結合する性質に基づいた方法が一般的である。
尚、動植物組織,培養細胞等の固体状の生物試料からの核酸抽出方法としては、生物試料に対して、カオトロピック剤,タンパク質変性剤,界面活性剤等による化学的溶解処理、及び、機械的ホモジナイザー,ビーズミル,ペッスル,注射針を備えたシリンジ,試験管ミキサー等による物理的破砕処理を行い、生物試料に含まれる核酸を遊離状態とした後に、シリカと核酸の結合特性を利用した方法により核酸を抽出する方法が一般的である。
上述の固体状の生物試料を対象とする核酸抽出方法は、生物試料の破砕、及び核酸抽出を目的とする2種類以上の器具を用いる為、操作が複雑化し、操作労力の増大,操作時間の延長、さらに操作時間の延長に伴う核酸の性状劣化を引き起こす。また、生物試料の破砕操作において破砕器具に付着してしまった試料は、次工程の核酸抽出操作へと持ち込まれず、核酸抽出効率を低下させるという課題を持っている。
本発明は、生物試料を破砕する工程と、破砕した試料から遊離状態となった核酸を抽出する核酸抽出工程で構成される核酸抽出方法において、2つの工程を単一の器具により実施することに関する。
本発明により、試料破砕器具に付着した試料を損失することなく核酸抽出効率を向上させ、操作を簡便化して操作性を向上できる。
器具としては、生物試料を効率的に破砕することができる先端構造や細管構造を備えたチップの内部に核酸を結合する為の固相担体を固定したものであり、チップに接続した加減圧機器により、溶液をチップ内部、及び固相担体内部を通過させることができるものである。或いは、生物試料を効率的に破砕することができる先端構造や細管構造を備えたチップを接続したシリンジの内部に核酸を結合する為の固相担体を固定したものでも良い。
生物試料を効率的に破砕することができるチップ先端構造とは、例えば、チップ先端部が試料を添加する容器の最底面と接面可能な形状であり、チップ先端部を容器内の生物試料に押し付けた状態で回転運動,円運動、或いは上下運動等をさせることで試料を破砕することができる形状である。但し、上述方法により生物試料を破砕する際に、チップ先端の通液孔に生物試料を詰らせない為、通液孔を開閉可能な機構として、通液孔を閉孔した状態で破砕工程を行う必要がある。
チップ先端部を回転運動,円運動、或いは上下運動させる方法としては、手動、或いは、モーター駆動させる方法がある。
チップ先端の通液孔を開閉とする機構としては、チップ先端部に通液孔開閉板を1枚以上付加し、チップ先端を容器底面に押し付けると、開閉板が弾性変形により、通液孔方向に折れ曲がり、通液孔を覆って閉孔状態となり、一方、チップ先端部を容器底面から離すと開閉板が通液孔から離れて開孔状態と戻るような機構が好ましい。このような開閉機構においては、試料を破砕する際に、閉孔状態の通液孔と開閉板の微細な隙間に破砕した試料が詰まった場合でも、チップ先端を容器底面から離して開孔状態とすることで、詰まった試料を取り除くことができる。
また、生物試料を効率的に破砕することができる細管構造とは、チップ内部に設けられた細管状の通液路であり、チップに接続した加減圧機器により、試料を複数回、吸引・排出し、細管に試料を通過させることで、試料を破砕することができる形状であり、細管の内径は0.5〜1.5mm程度が好ましい。
チップ内部、或いはシリンジ内部に固定する固相担体としては、ガラス繊維濾紙,ガラス粒子,シリカ粒子,シリカウール、あるいは、それら破砕物,ケイソウ土など、酸化ケイ素を含有する物質で構成される多孔性固相であり、最大孔径は2〜20μmが好ましい。
固体状の生物試料としては、動物組織,植物組織,細菌,細胞、等である。
生物試料を破砕する工程は、生物試料の溶解を化学的、或いは生化学的に促進させる為の溶解剤を添加した試料に対して、器具のチップ先端部分を押し付けた状態で、回転運動,円運動、或いは上下運動させることで試料を破砕する工程、及び、加減圧機器を用いて、溶解剤を添加した試料を、器具のチップ内部の細管通液路を通過させることで試料を破砕する工程、の両方、或いは、一方で構成される。
溶解剤としては、ヨウ化ナトリウム,ヨウ化カリウム,チオシアン酸ナトリウム,チオシアン酸グアニジン,塩酸グアニジン等のカオトロピック剤を含むものであり、これに、界面活性剤やタンパク質分解酵素を添加しても良い。カオトロピック剤は、タンパク質変性作用により生物試料を溶解し、且つ、生物試料に由来する核酸分解酵素を不活性化し、さらに、後工程の核酸抽出工程においてシリカと核酸の結合を促進する。
破砕された生物試料から核酸を抽出する核酸抽出工程は、生物試料から遊離状態となった核酸を固相担体に結合させる工程,固相担体に結合した核酸を洗浄する工程,固相担体に結合した核酸を溶離する工程、で構成される。
核酸を固相担体に結合させる工程は、加減圧機器を用いて、生物試料から遊離状態となった核酸を含む溶解液に結合剤を添加した溶液を、チップ内部、或いはシリンジ内部に固定した固相担体を隔てる一方の空間から他方の空間へと固相担体内部を通過させて、核酸を固相担体に結合させる。
結合剤とは、有機溶媒を含む水溶液である。
有機溶媒としては、脂肪族アルコール,脂肪族エーテル,脂肪族エステル,脂肪族ケトンの中から選ばれた2から10個の炭素数を有する化合物の1種または2種以上の組み合わせが使用可能である。
脂肪族アルコールとして、好ましくは、エタノール,イソプロパノール,プロパノール,ブタノールを用いる。
脂肪族エーテルとして、好ましくは、エチレングリコールジメチルエーテル,エチレングリコールジエチルエーテル,プロピレングリコールジメチルエーテル,プロピレングリコールジエチルエーテル,ジエチレングリコールジメチルエーテル,ジエチレングリコールジエチルエーテルを用いる。
脂肪族エステルとして、好ましくは、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート,乳酸エチルを用いる。
脂肪族ケトンとして、好ましくは、アセトン,ヒドロキシアセトン,メチルケトンを用いる。
固相担体に結合した核酸を洗浄する工程は、加減圧機器を用いて、洗浄溶液を、チップ内部、或いはシリンジ内部に固定した固相担体を隔てる一方の空間から他方の空間へと、固相担体内部を通過させて、固相担体に吸着した不純物を除去する。洗浄溶液としては、固相担体に結合した核酸を溶離せず、かつ、非特異的に吸着した不純物の除去を効率的に行うために、エタノール等の有機溶媒を含む低塩濃度緩衝液などを用いる。また、エタノール等の有機溶媒を含む低塩濃度緩衝液にカオトロピック剤や界面活性剤を加えても良い。
固相担体に結合した核酸を溶離する工程は、加減圧機器を用いて、溶離溶液を、チップ内部、或いはシリンジ内部に固定した固相担体を隔てる一方の空間から他方の空間へと、固相担体内部を通過させて、固相担体に結合した核酸を溶離し、精製核酸溶液として回収する。溶離液としては、固相担体に結合した核酸を効率的に溶離し、かつ、核酸の性状を劣化させない為に核酸分解酵素除去、あるいは核酸分解酵素失活化処理を行った純水や低塩濃度緩衝液、等を用いる。
生物試料の破砕操作と生物試料から遊離状態となった核酸の抽出操作を一貫して行うことができる核酸抽出器具を用いて、生物試料からRNA抽出を行った。抽出RNAは、分光光度計により濃度定量と純度算出を行った。以下に本実施例に用いた核酸抽出器具,試薬,容器,生物試料,プロトコルを説明する。尚、本実施例に対する比較対照1として、一般的な試料破砕器具を用いて破砕工程を行った後に、上記器具を用いて核酸抽出工程のみを実施し、RNA抽出を行った。以下に本比較方法において用いた試料破砕器具とプロトコルについても説明する。
<核酸抽出器具>
核酸抽出器具は、チップ内部に固相担体を固定し、ピペットチップ先端部に通液孔開閉板を備えたものを用いる。以下に核酸抽出器具の詳細を説明する。
<核酸抽出器具>
核酸抽出器具は、チップ内部に固相担体を固定し、ピペットチップ先端部に通液孔開閉板を備えたものを用いる。以下に核酸抽出器具の詳細を説明する。
核酸抽出器具は、図1に示すように、加減圧機器との接続部1を有するチップ本体2の先端内部に核酸結合性の固相担体3と固相担体保持部材4,5が固定化され、また、先端部に通液孔6と通液孔開閉板7を備える。
チップ本体は、ポリプロピレン製のピペットチップを加工し、加減圧機器との接続部はピペッター、或いはシリンジとの接続を可能にする。固相担体は、ガラス繊維ろ紙
(Whatman社製 GMF150)をポンチ状のカッターによってチップ内径と同径の円形状に切り抜いたものである。固相担体保持部材は、ポリプロプレン製粒子を焼結して、チップ内径と同径の円形状に成形した、多孔性を有するものである。本部材は、固相担体を固定,保持すると同時に、固相担体への通液におけるプレフィルターとしての効果も併せ持つ。試料破砕用の通液孔開閉板は、通液孔の円周部分に付加した楕円形状の板である。通液孔開閉板は先端部を容器底面に押し付けると、弾性変形により開閉板が通液孔方向に折れ曲がり、通液孔を覆って閉孔状態となり、開閉板は容器底面に密着し、先端部を容器底面から離すと、開閉板が通液孔から離れて開孔状態に戻る。
(Whatman社製 GMF150)をポンチ状のカッターによってチップ内径と同径の円形状に切り抜いたものである。固相担体保持部材は、ポリプロプレン製粒子を焼結して、チップ内径と同径の円形状に成形した、多孔性を有するものである。本部材は、固相担体を固定,保持すると同時に、固相担体への通液におけるプレフィルターとしての効果も併せ持つ。試料破砕用の通液孔開閉板は、通液孔の円周部分に付加した楕円形状の板である。通液孔開閉板は先端部を容器底面に押し付けると、弾性変形により開閉板が通液孔方向に折れ曲がり、通液孔を覆って閉孔状態となり、開閉板は容器底面に密着し、先端部を容器底面から離すと、開閉板が通液孔から離れて開孔状態に戻る。
<試薬>
カオトロピック溶液:4M チオシアン酸グアニジン,8mM MES-KOH(pH5.5)
有機溶媒:50% ジエチレングリコールジメチルエーテル水溶液
洗浄液:80% EtOH水溶液
溶離液:RNase Free 滅菌純水
カオトロピック溶液:4M チオシアン酸グアニジン,8mM MES-KOH(pH5.5)
有機溶媒:50% ジエチレングリコールジメチルエーテル水溶液
洗浄液:80% EtOH水溶液
溶離液:RNase Free 滅菌純水
<容器>
抽出用容器:2.0mlマイクロチューブ(ポリプロピレン製)
精製品用容器:1.5mlマイクロチューブ(ポリプロピレン製)
抽出用容器:2.0mlマイクロチューブ(ポリプロピレン製)
精製品用容器:1.5mlマイクロチューブ(ポリプロピレン製)
<生物試料>
マウス肝臓
マウス肝臓
<プロトコル>
1.抽出用容器にマウス肝臓組織5mgを秤量する。
2.抽出用容器にカオトロピック溶解液0.5mlを添加する。
3.核酸抽出器具の先端部を容器底面に接した状態で円運動させ、途中で先端部を容器底 面から離し、溶液を固相担体に達しないように吸引・排出する。
4.抽出用容器に有機溶媒0.5mlを添加し、混合する
5.核酸抽出器具により混合液が固相担体を通液するように5回、吸引・排出し、溶液を 廃棄する。
6.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
7.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
8.洗浄液10mlを抽出用シリンジ1で3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
9.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
10.核酸抽出器具により溶離液0.1mlを10回、吸引・排出し、溶液を精製品用容器 へ排出する。
1.抽出用容器にマウス肝臓組織5mgを秤量する。
2.抽出用容器にカオトロピック溶解液0.5mlを添加する。
3.核酸抽出器具の先端部を容器底面に接した状態で円運動させ、途中で先端部を容器底 面から離し、溶液を固相担体に達しないように吸引・排出する。
4.抽出用容器に有機溶媒0.5mlを添加し、混合する
5.核酸抽出器具により混合液が固相担体を通液するように5回、吸引・排出し、溶液を 廃棄する。
6.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
7.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
8.洗浄液10mlを抽出用シリンジ1で3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
9.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
10.核酸抽出器具により溶離液0.1mlを10回、吸引・排出し、溶液を精製品用容器 へ排出する。
<比較対照1の試料破砕器具>
ペッスル
<比較対照1のプロトコル>
1.抽出用容器にマウス肝臓組織5mgを秤量する。
2.抽出用容器にカオトロピック溶解液0.5mlを添加する。
3.ペッスルを準備する。
4.ペッスルを容器内に挿入し、ペッスル先端部を容器底面に接した状態で円運動させる。
5.ペッスルに付着した試料と溶液を可能な限り容器内に戻して、ペッスルを廃棄する。
6.抽出用容器に有機溶媒0.5mlを添加し、混合する。
7.核酸抽出器具により混合液が固相担体を通液するように5回、吸引・排出し、溶液を 廃棄する。
8.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
9.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
10.洗浄液10mlを抽出用シリンジ1で3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
11.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
12.核酸抽出器具により溶離液0.1mlを10回、吸引・排出し、溶液を精製品用容器 へ排出する。
1.抽出用容器にマウス肝臓組織5mgを秤量する。
2.抽出用容器にカオトロピック溶解液0.5mlを添加する。
3.ペッスルを準備する。
4.ペッスルを容器内に挿入し、ペッスル先端部を容器底面に接した状態で円運動させる。
5.ペッスルに付着した試料と溶液を可能な限り容器内に戻して、ペッスルを廃棄する。
6.抽出用容器に有機溶媒0.5mlを添加し、混合する。
7.核酸抽出器具により混合液が固相担体を通液するように5回、吸引・排出し、溶液を 廃棄する。
8.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
9.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
10.洗浄液10mlを抽出用シリンジ1で3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
11.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
12.核酸抽出器具により溶離液0.1mlを10回、吸引・排出し、溶液を精製品用容器 へ排出する。
<抽出結果>
以下に、実施例1、及び比較対照1におけるRNA抽出の結果を示す。実施例1のRNA抽出量は、比較対照よりも高い値を示した。これは、比較対照の方法が、試料破砕工程後のペッスルに付着した試料を損失してしまうのに対して、実施例1の方法は、試料破砕工程後の試料を損失しないためである。尚、RNA純度は比較対照1と同等の値を示した。また、実施例1の操作は、比較対照の操作よりも簡便であり、操作性に優れるものであった。
以下に、実施例1、及び比較対照1におけるRNA抽出の結果を示す。実施例1のRNA抽出量は、比較対照よりも高い値を示した。これは、比較対照の方法が、試料破砕工程後のペッスルに付着した試料を損失してしまうのに対して、実施例1の方法は、試料破砕工程後の試料を損失しないためである。尚、RNA純度は比較対照1と同等の値を示した。また、実施例1の操作は、比較対照の操作よりも簡便であり、操作性に優れるものであった。
生物試料の破砕操作と生物試料から遊離状態となった核酸の抽出操作を一貫して行うことができる核酸抽出器具を用いて、生物試料からRNA抽出を行った。抽出RNAは、分光光度計により濃度定量と純度算出を行った。本実施例に用いた核酸抽出器具,試薬,容器,生物試料,プロトコルを説明する。尚、本実施例に対する比較対照1として、実施例1の比較対照と同様に、実施例2で用いる器具を用いて核酸抽出工程のみを実施し、RNA抽出を行った。
<核酸抽出器具>
核酸抽出器具は、実施例1に用いた器具において、通液孔開閉板の形状が異なるものである。
核酸抽出器具は、実施例1に用いた器具において、通液孔開閉板の形状が異なるものである。
核酸抽出器具は、図2に示すように、加減圧機器との接続部1を有するチップ本体2の先端内部に核酸結合性の固相担体3と固相担体保持部材4,5が固定化され、また、先端部に通液孔6と通液孔開閉板7を備える。接続部,チップ本体,固相担体,固相担体保持部材,通液孔は実施例1と同様である。
通液孔開閉板7は、図3に示すように、通液孔の円周部分に付加した4枚の三角形状の板であり、図4に示すように、通液孔開閉板はチップ先端部を容器底面に押し付けると、弾性変形により開閉板が通液孔の中心方向に折れ曲り、各々の側辺と密接して、通液孔を覆って閉孔状態となり、開閉板が容器底面と密着し、チップ先端部を容器底面から離すと、開閉板が通液孔から離れて、開孔状態に戻る。
<生物試料>
実施例1と同じ
実施例1と同じ
<試薬>
実施例1と同じ
実施例1と同じ
<容器>
実施例1と同じ
実施例1と同じ
<プロトコル>
以下に示す工程の操作方法以外は、実施例1と同じ
3.核酸抽出器具の先端部を容器底面に接した状態で上下運動、及び円運動させ、途中で先端部を容器底面から離し、溶液を固相担体に達しないように吸引・排出する。
以下に示す工程の操作方法以外は、実施例1と同じ
3.核酸抽出器具の先端部を容器底面に接した状態で上下運動、及び円運動させ、途中で先端部を容器底面から離し、溶液を固相担体に達しないように吸引・排出する。
<抽出結果>
以下に、実施例2、及び比較対照におけるRNA抽出の結果を示す。実施例2のRNA抽出量は、比較対照、及び実施例1よりも高い値を示した。これは、実施例2の方法が、試料破砕工程後の試料を損失しないことに加えて、通液孔開閉板の開閉機構の特性により、組織破砕の効率が向上した為と考えられる。本方法の核酸抽出器具は、上下運動させて通液孔開閉板を容器底面に押し付ける際に、試料を効率的に容器底面にかき集めて押し潰し、さらに、開閉板の各々の側辺が密接する際に、試料を挟み込んで潰し、試料を効率的に破砕する。尚、RNA純度は比較対照と同等の値を示し、実施例2の操作は実施例1と同様に比較対照の操作よりも簡便であり、操作性に優れるものであった。
以下に、実施例2、及び比較対照におけるRNA抽出の結果を示す。実施例2のRNA抽出量は、比較対照、及び実施例1よりも高い値を示した。これは、実施例2の方法が、試料破砕工程後の試料を損失しないことに加えて、通液孔開閉板の開閉機構の特性により、組織破砕の効率が向上した為と考えられる。本方法の核酸抽出器具は、上下運動させて通液孔開閉板を容器底面に押し付ける際に、試料を効率的に容器底面にかき集めて押し潰し、さらに、開閉板の各々の側辺が密接する際に、試料を挟み込んで潰し、試料を効率的に破砕する。尚、RNA純度は比較対照と同等の値を示し、実施例2の操作は実施例1と同様に比較対照の操作よりも簡便であり、操作性に優れるものであった。
生物試料の破砕操作と生物試料から遊離状態となった核酸の抽出操作を一貫して行うことができる核酸抽出器具を用いて、試料からRNA抽出を行った。抽出RNAは、分光光度計により濃度定量と純度算出を行った。本実施例に用いた核酸抽出器具,試薬,容器,生物試料,プロトコルを説明する。尚、本実施例に対する比較対照2として、一般的な試料器具を用いて破砕操作を行った後に、上記器具を用いて核酸抽出工程のみを実施し、
RNA抽出を行った。以下に本比較方法において用いた試料器具とプロトコルについても説明する。
RNA抽出を行った。以下に本比較方法において用いた試料器具とプロトコルについても説明する。
<核酸抽出器具>
核酸抽出器具は、シリンジ内部に固相担体を固定し、通液孔開閉板と細管通液路を備えたチップを接続したものを用いる。以下に器具の詳細を説明する。
核酸抽出器具は、シリンジ内部に固相担体を固定し、通液孔開閉板と細管通液路を備えたチップを接続したものを用いる。以下に器具の詳細を説明する。
核酸抽出器具は、図5、及び図6に示すように、シリンジ本体10,プランジャ20,チップ本体30及び固相担体ユニット40から構成される。
シリンジ本体10は、円筒状の円筒部101と、上端の開口部102と、下端の底部
103と、開口部102の周囲に設けられた鍔形の保持部104と、底部103に設けられたチップ本体を接続するための接続部105とを有する。
103と、開口部102の周囲に設けられた鍔形の保持部104と、底部103に設けられたチップ本体を接続するための接続部105とを有する。
プランジャ20は、プランジャ本体201とシールピース203とを有する。シールピース203は、プランジャ本体201とは別個の部材として形成され、プランジャ本体
201の下端の取り付け部202に取り付けられる。シールピース203は、下端に円錐状の突起204を有する。
201の下端の取り付け部202に取り付けられる。シールピース203は、下端に円錐状の突起204を有する。
チップ本体30は、上端の接続部301,通液孔302,通液孔開閉板303,細管通液路304を有する。通液孔開閉板による開閉機構は、実施例1に用いる器具と同様である。尚、ノズルの接続部301とシリンジ本体の接続部105は、ねじによって接続される。
固相担体ユニット40は、図6に示すように、円板状の固相担体41、固相担体41の上側及び下側に配置された2つの円板状の固相担体保持部材42,43及び円筒状のホルダ44から構成される。固相担体は、ガラス繊維ろ紙(Whatman社製 GMF150)をポンチ状のカッターによって切り抜いたものである。また、固相担体保持部材は、プリプロピレン粒子を焼結して成形された多孔性を有するものであり、固相担体を保持すると同時に、固相担体への通液におけるプレフィルターとしての効果を持つ。
<生物試料>
マウス腎臓
マウス腎臓
<試薬>
カオトロピック溶液:RLTバッファー(QIAGEN社製)
有機溶媒:70% エタノール水溶液
洗浄液:80% EtOH水溶液
溶離液:RNase Free 滅菌純水
カオトロピック溶液:RLTバッファー(QIAGEN社製)
有機溶媒:70% エタノール水溶液
洗浄液:80% EtOH水溶液
溶離液:RNase Free 滅菌純水
<容器>
実施例1と同じ
実施例1と同じ
<プロトコル>
1.抽出用容器にマウス腎臓組織5mgを秤量する。
2.抽出用容器にカオトロピック溶解液0.5mlを添加する。
3.核酸抽出器具の先端部を容器底面に接した状態で円運動させ、途中で先端部を容器底 面から離し、溶液が細管通液路に達しないように吸引・排出する。
4.核酸抽出器具の先端部を容器底面から離し、溶液が固相担体に達しないように、細管 通液路を通液させて、吸引・排出する。
5.抽出用容器に有機溶媒0.5mlを添加し、混合する。
6.核酸抽出器具により混合液が固相担体を通液するように5回、吸引・排出し、溶液を 廃棄する。
7.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
8.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
9.洗浄液10mlを抽出用シリンジ1で3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
10.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
11.核酸抽出器具により溶離液0.1mlを10回、吸引・排出し、溶液を精製品用容器
へ排出する。
1.抽出用容器にマウス腎臓組織5mgを秤量する。
2.抽出用容器にカオトロピック溶解液0.5mlを添加する。
3.核酸抽出器具の先端部を容器底面に接した状態で円運動させ、途中で先端部を容器底 面から離し、溶液が細管通液路に達しないように吸引・排出する。
4.核酸抽出器具の先端部を容器底面から離し、溶液が固相担体に達しないように、細管 通液路を通液させて、吸引・排出する。
5.抽出用容器に有機溶媒0.5mlを添加し、混合する。
6.核酸抽出器具により混合液が固相担体を通液するように5回、吸引・排出し、溶液を 廃棄する。
7.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
8.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
9.洗浄液10mlを抽出用シリンジ1で3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
10.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
11.核酸抽出器具により溶離液0.1mlを10回、吸引・排出し、溶液を精製品用容器
へ排出する。
<比較対照2の組織破砕器具>
ペッスル
注射針(20G)を備えたシリンジ
ペッスル
注射針(20G)を備えたシリンジ
<比較対照2のプロトコル>
1.抽出用容器にマウス肝臓組織5mgを秤量する。
2.抽出用容器にカオトロピック溶解液0.5mlを添加する。
3.ペッスルを準備する。
4.ペッスルを容器内に挿入し、ペッスル先端部を容器底面に接した状態で円運動させる 。
5.ペッスルに付着した試料と溶液を可能な限り容器内に戻して、ペッスルを廃棄する。
6.注射針を備えたシリンジを準備する。
7.注射針を備えたシリンジにより溶液を5回、吸引・排出する。
8.注射針とシリンジに残存した試料を可能な限り容器内に戻して、注射針とシリンジを 廃棄する。
9.抽出用容器に有機溶媒0.5mlを添加し、混合する。
10.核酸抽出器具により混合液が固相担体を通液するように5回、吸引・排出し、溶液を 廃棄する。
11.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
12.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
13.洗浄液10mlを抽出用シリンジ1で3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
14.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
15.核酸抽出器具により溶離液0.1mlを10回、吸引・排出し、溶液を精製品用容器 へ排出する。
1.抽出用容器にマウス肝臓組織5mgを秤量する。
2.抽出用容器にカオトロピック溶解液0.5mlを添加する。
3.ペッスルを準備する。
4.ペッスルを容器内に挿入し、ペッスル先端部を容器底面に接した状態で円運動させる 。
5.ペッスルに付着した試料と溶液を可能な限り容器内に戻して、ペッスルを廃棄する。
6.注射針を備えたシリンジを準備する。
7.注射針を備えたシリンジにより溶液を5回、吸引・排出する。
8.注射針とシリンジに残存した試料を可能な限り容器内に戻して、注射針とシリンジを 廃棄する。
9.抽出用容器に有機溶媒0.5mlを添加し、混合する。
10.核酸抽出器具により混合液が固相担体を通液するように5回、吸引・排出し、溶液を 廃棄する。
11.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
12.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
13.洗浄液10mlを抽出用シリンジ1で3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
14.核酸抽出器具により洗浄液1.5mlを3回、吸引・排出し、溶液を廃棄する。
15.核酸抽出器具により溶離液0.1mlを10回、吸引・排出し、溶液を精製品用容器 へ排出する。
<抽出結果>
以下に、実施例3、及び比較対照2におけるRNA抽出の結果を示す。実施例3のRNA抽出量は、比較対照よりも高い値を示した。これは、比較対照の方法が、試料破砕工程後のペッスル、及び、注射針を備えたシリンジに付着した試料を損失してしまうのに対して、実施例3の方法は、試料破砕工程後の試料を損失しないためであると考えられる。尚、RNA純度は比較対照1と同等の値を示した。また、実施例3の操作は、試料破砕工程に異なる2種類の器具を用いる比較対照の操作よりも、簡便で操作性に優れるものであり、所要操作時間も短縮された。
以下に、実施例3、及び比較対照2におけるRNA抽出の結果を示す。実施例3のRNA抽出量は、比較対照よりも高い値を示した。これは、比較対照の方法が、試料破砕工程後のペッスル、及び、注射針を備えたシリンジに付着した試料を損失してしまうのに対して、実施例3の方法は、試料破砕工程後の試料を損失しないためであると考えられる。尚、RNA純度は比較対照1と同等の値を示した。また、実施例3の操作は、試料破砕工程に異なる2種類の器具を用いる比較対照の操作よりも、簡便で操作性に優れるものであり、所要操作時間も短縮された。
1,105,301…接続部、2,30…チップ本体、3,41…固相担体、4,5,42,43…固相担体保持部材、6,302…通液孔、7,303…通液孔開閉板、10…シリンジ本体、20…プランジャ、40…固相担体ユニット、44…ホルダ、101…円筒部、102…開口部、103…底部、104…保持部、201…プランジャ本体、
202…取り付け部、203…シールピース、204…円錐状の突起、304…細管通液路。
202…取り付け部、203…シールピース、204…円錐状の突起、304…細管通液路。
Claims (6)
- 核酸を含有する生物試料から核酸を抽出する核酸抽出方法であって、
核酸抽出器具に備えられた試料破砕機構により生物試料を破砕し、破砕された試料から遊離した核酸を、前述核酸抽出器具に備えられた核酸結合性の固相へ吸着させて、核酸を抽出する核酸抽出方法。 - 請求項1記載の核酸抽出方法であって、
核酸抽出器具が、加減圧機器と接続可能な配管の内部に、核酸結合性の固相を固定している核酸抽出方法。 - 請求項1記載の核酸抽出方法であって、
核酸抽出器具が、加減圧機器の内部に、核酸結合性の固相を固定している核酸抽出方法。 - 請求項1記載の核酸抽出方法であって、
核酸抽出器具に備えられた試料破砕機構が、加減圧機器との接続が可能な中空状の細管状の配管であり、配管に接続した加減圧機器による加減圧により、配管に生物試料を通過させることで、生物試料を破砕する核酸抽出方法。 - 請求項1記載の核酸抽出方法であって、
核酸抽出器具に備えられた試料破砕機構が、加減圧機器との接続が可能な中空状の配管の先端部に設けられた部材であり、配管先端を容器内の生物試料に押し付けると、配管通液孔を覆い、容器底面と接面し、生物試料を押しつぶし、破砕する核酸抽出方法。 - 請求項1記載の核酸抽出方法であって、
核酸抽出器具に備えられた試料破砕機構が、加減圧機器との接続が可能な中空状の配管の先端部に設けられた通液孔開閉板である方法。
Priority Applications (2)
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---|---|---|---|---|
JP2008298615A (ja) * | 2007-05-31 | 2008-12-11 | Canon Inc | 細胞構成成分取出し機能付血液採取用の容器及び核酸検出方法 |
JP2017528147A (ja) * | 2014-09-17 | 2017-09-28 | ホロジック, インコーポレイテッドHologic, Inc. | 部分的溶解およびアッセイの方法 |
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JP4090443B2 (ja) * | 2004-02-24 | 2008-05-28 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸回収器具、その部品、及び核酸回収器具の生産方法 |
-
2005
- 2005-09-12 JP JP2005263168A patent/JP2007074914A/ja not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-09-11 US US11/518,175 patent/US20070059751A1/en not_active Abandoned
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JP4522434B2 (ja) * | 2007-05-31 | 2010-08-11 | キヤノン株式会社 | 血液採取用容器 |
JP2017528147A (ja) * | 2014-09-17 | 2017-09-28 | ホロジック, インコーポレイテッドHologic, Inc. | 部分的溶解およびアッセイの方法 |
US10859475B2 (en) | 2014-09-17 | 2020-12-08 | Hologic, Inc. | Method of partial lysis and assay |
US11719607B2 (en) | 2014-09-17 | 2023-08-08 | Hologic, Inc. | Method of partial lysis and assay |
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