ES2307832T3

ES2307832T3 - Clasificacion de anticuerpos basada en las caracteristicas de union.

Info

Publication number: ES2307832T3
Application number: ES02804495T
Authority: ES
Inventors: Xiao-Chi Jia; Michael Gallo; Jaspal Singh Kang; Wynn L. Walker; Keith Joho
Original assignee: Amgen Fremont Inc
Current assignee: Amgen Fremont Inc
Priority date: 2001-12-03
Filing date: 2002-12-02
Publication date: 2008-12-01
Anticipated expiration: 2022-12-02
Also published as: US20110021373A1; US7771951B2; CA2467633A1; WO2003048731A3; EP1461423B1; DE60226641D1; WO2003048731A2; US8206936B2; US20130085074A1; ATE395413T1; EP1461423A2; US20030157730A1; EP1461423A4; AU2002357060A1; JP2005512044A; CA2467633C; US8568992B2; US20140178905A1

Abstract

Método de ensayo de competición de anticuerpos para determinar anticuerpos que se unen a un epítopo sobre un antígeno, que comprende: proporcionar un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno; marcar cada anticuerpo de dicho conjunto para formar un conjunto de anticuerpos de referencia marcados de modo que cada anticuerpo de referencia marcado puede distinguirse de todos los demás anticuerpos de referencia marcados en dicho conjunto de anticuerpos de referencia marcados; proporcionar un anticuerpo sonda que se une a dicho antígeno; poner en contacto dicho anticuerpo sonda con dicho conjunto de anticuerpos de referencia marcados en presencia de dicho antígeno; detectar el anticuerpo sonda unido en un complejo que comprende dicho antígeno, un anticuerpo de referencia marcado unido a dicho antígeno y dicho anticuerpo sonda unido a dicho antígeno; identificar cada dicho anticuerpo de referencia marcado unido a dicho antígeno en cada dicho complejo; determinar si dicho anticuerpo sonda compite con cualquier anticuerpo de referencia en dicho conjunto de anticuerpos de referencia marcados, en el que la competición indica que dicho anticuerpo sonda se une al mismo epítopo que otro anticuerpo en dicho conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno.

Description

Clasificación de anticuerpos basada en las características de unión.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a agrupar anticuerpos basándose en los epítopos que reconocen y a identificar anticuerpos que tienen distintas características de unión. En particular, la presente invención se refiere a métodos de ensayo de competición de anticuerpos para determinar anticuerpos que se unen a un epítopo, y a procedimientos de análisis de datos para dividir anticuerpos específicos de antígeno en agrupaciones o "combinaciones" que representan distintas especificidades de unión. Específicamente, la invención se refiere al ensayo de competición de anticuerpos de alto rendimiento, combinación de anticuerpos competitiva múltiple ("Multiplex Competitive Antibody Binning") (MCAB) y al procedimiento de análisis de datos de reconocimiento del patrón competitivo (Competitive Pattern Recognition (CPR)) para analizar los datos generados por los ensayos de alto rendimiento.

Antecedentes de la invención

Los anticuerpos monoclonales (AcM) muestran una importante utilidad terapéutica en el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades tales como enfermedades infecciosas, enfermedad cardiovascular, inflamación y cáncer. (Storch (1998) Pediatrics 102:648-651; Coller et al. (1995) Thromb, Haemostasis 74:302-308; Present et al. (1999) New Eng. J. Med. 6:1398-1405; Goldenberg (1999) Clin. Ther. 21:309-318). Las células producen anticuerpos en respuesta a la infección o inmunización con un antígeno o una sustancia extraña. La utilidad terapéutica potencial de los anticuerpos monoclonales se debe en parte a su unión específica y de alta afinidad a una diana. Los anticuerpos se unen específicamente a un antígeno diana reconociendo un sitio particular, o epítopo, sobre el antígeno. Con el uso de la tecnología XenoMouse^{TM} desarrollada recientemente (Abgenix, Inc., Fremont, CA) junto con procedimientos establecidos para células B o células de hibridoma (Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497) y aislar linfocitos (Babcook et al. (1996) Proc. Natl. Acad Sci. 93:7843-7848), es posible generar grandes números de anticuerpos monoclonales humanos específicos de antígeno frente a casi cualquier antígeno humano. (Green (1999) Jnl. Immunol. Methods 231:11-23, Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:2551-2555, Mendez et al. (1997) Nat. Genet. 15:146-156; Green y Jakobivits, J. Exp. Med. (1998), 188:483-495).

Se han desarrollado métodos para localizar sitios antigénicos para anticuerpos monoclonales mediante unión competitiva de anticuerpos monoclonales. Perton et al. (1996) Jnl. Immunol. Methods 190(1):1 117-125. Se han usado ensayos de competición e inhibición mutua en fase sólida usando antígeno biotinilado para determinar las especificidades de epítopo de los anticuerpos monoclonales. Kuroki et al. (1992) Immunological. Investigations 21(6):523-5381; Kuroki (1996) Methods in Molecular Biology 66:47-53.

Los grandes números de anticuerpos generados frente a un antígeno diana particular pueden variar sustancialmente en cuanto a cómo de fuerte es su unión al antígeno así como el epítopo particular al que se unen sobre el antígeno diana. Diferentes anticuerpos generados frente a un antígeno reconocen diferentes epítopos y tienen afinidades de unión variables para cada epítopo. Con el fin de identificar anticuerpos terapéuticamente útiles del gran número de anticuerpos candidatos generados, es necesario examinar grandes números de anticuerpos para determinar sus afinidades de unión y propiedades de reconocimiento de epítopo. Por esta razón, sería ventajoso tener un método de examen rápido de anticuerpos generados frente a un antígeno diana particular para identificar aquellos anticuerpos que es más probable que tengan un efecto terapéutico. Además, sería ventajoso proporcionar un mecanismo para clasificar los anticuerpos generados según sus sitios de unión al epítopo diana.

Sumario de la invención

La presente descripción proporciona métodos para clasificar anticuerpos basándose en sus características de unión a epítopo. Un aspecto proporciona métodos y sistemas para determinar las propiedades de reconocimiento de epítopo de diferentes anticuerpos. Otro aspecto proporciona procedimientos de análisis de datos para agrupar anticuerpos basándose en sus propiedades de reconocimiento de epítopo y para identificar anticuerpos que tienen características de unión a epítopo distintas. La clasificación o "combinación" de anticuerpos tal como se da a conocer y se reivindica en el presente documento abarca métodos de ensayo y procedimientos de análisis de datos para determinar las características de unión a epítopo de una combinación de anticuerpos específicos de antígeno, agrupar anticuerpos en "combinaciones" que representan características de unión a epítopo distintas e identificar anticuerpos que tienen características de unión deseadas.

Una realización de la presente invención proporciona un método de ensayo de competición de anticuerpos para determinar anticuerpos que se unen a un epítopo o un antígeno, que comprende:

\quad: proporcionar un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno;

\quad: marcar cada anticuerpo de dicho conjunto para formar un conjunto de anticuerpos de referencia marcados de modo que cada anticuerpo de referencia marcado puede distinguirse de todos los demás anticuerpos de referencia marcados en dicho conjunto de anticuerpos de referencia marcados;

\quad: proporcionar un anticuerpo sonda que se une a dicho antígeno;

\quad: poner en contacto dicho anticuerpo sonda con dicho conjunto de anticuerpos de referencia marcados en presencia de dicho antígeno;

\quad: detectar el anticuerpo sonda unido en un complejo que comprende dicho antígeno, un anticuerpo de referencia marcado unido a dicho antígeno y dicho anticuerpo sonda unido a dicho antígeno;

\quad: identificar cada dicho anticuerpo de referencia marcado unido a dicho antígeno en cada dicho complejo;

\quad: determinar si dicho anticuerpo sonda compite con cualquier anticuerpo de referencia en dicho conjunto de anticuerpos de referencia marcados, en el que la competición indica que dicho anticuerpo sonda se une al mismo epítopo que otro anticuerpo en dicho conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno.

El método para clasificar anticuerpos basándose en las características de unión incluye

a): proporcionar un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno, marcar cada anticuerpos en el conjunto para formar un conjunto de anticuerpos de referencia marcados de modo que cada anticuerpo de referencia marcado puede distinguirse de todos los todos anticuerpos de referencia marcados en el conjunto de anticuerpos de referencia marcados, seleccionar un anticuerpo sonda del conjunto de anticuerpos que se unen al antígeno, poner en contacto el anticuerpo sonda con el conjunto de anticuerpos de referencia marcados en presencia del antígeno, detectar el anticuerpo sonda en un complejo que incluye un anticuerpo de referencia marcado unido al antígeno, el antígeno y el anticuerpo sonda unido al antígeno; y

b): proporcionar datos de entrada que representan los resultados de al menos un ensayo de competición de anticuerpos usando un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno como en la etapa a), normalizar los datos de entrada para generar una matriz de intensidad normalizada, calcular al menos una matriz de disimilitud que comprende generar una matriz umbral a partir de la matriz de intensidad normalizada y calcular una matriz de disimilitud a partir de la matriz umbral, y agrupar anticuerpos basándose en los valores de disimilitud en celdas de la matriz de disimilitud, para determinar los patrones de unión a epítopo del conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno. Los datos de entrada pueden generarse mediante un ensayo de alto rendimiento, preferiblemente mediante el ensayo combinación de anticuerpos competitiva multiplexada (MCAB). Preferiblemente, se usa el procedimiento de reconocimiento del patrón competitivo para el análisis de datos.

Para el método de ensayo de competición de anticuerpos, el anticuerpo sonda puede marcarse y detectarse en un complejo que incluye un anticuerpo de referencia marcado unido al antígeno, el antígeno y el anticuerpo sonda marcado unido al antígeno, que permite la determinación de si el anticuerpo sonda marcado compite con cualquier anticuerpo de referencia en el conjunto de anticuerpos de referencia marcados, porque la competición indica que el anticuerpo sonda se une al mismo epítopo que otro anticuerpo en el conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno. El anticuerpo sonda puede marcarse, por ejemplo, con un marcador enzimático, o un marcador colorimétrico, o un marcador fluorescente o un marcador radiactivo.

En una realización preferida del método de ensayo de competición de anticuerpos, se usa un anticuerpo de detección para detectar el anticuerpo sonda unido, en el que el anticuerpo de detección se une sólo al anticuerpo sonda y no al anticuerpo de referencia. El anticuerpo de detección detecta el anticuerpo sonda unido en el complejo que incluye un anticuerpo de referencia marcado unido al antígeno, el antígeno y el anticuerpo sonda marcado unido al antígeno. Se usa un anticuerpo de detección marcado para detectar el anticuerpo sonda unido, en el que puede marcarse el anticuerpo de detección, por ejemplo, con un marcador enzimático, o un marcador colorimétrico, o un marcador fluorescente o un marcador radiactivo. Alternativamente, el anticuerpo de detección se detecta usando un medio de detección tal como una proteína de unión a anticuerpo.

En particular, el método de ensayo de competición de anticuerpos para determinar anticuerpos que se unen a un epítopo sobre un antígeno incluye proporcionar un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno, marcar cada anticuerpo en el conjunto con una perla coloreada de manera única para formar un conjunto de anticuerpos de referencia marcados de modo que cada anticuerpo de referencia marcado puede distinguirse de todos los demás anticuerpos de referencia marcados en el conjunto de anticuerpos de referencia marcados, seleccionar un anticuerpo sonda del conjunto de anticuerpos que se unen al antígeno, poner en contacto el anticuerpo sonda con el conjunto de anticuerpos de referencia marcados en presencia del antígeno, detectar el anticuerpo sonda unido en un complejo que incluye un anticuerpo de referencia marcado unido al antígeno, el antígeno y el anticuerpo sonda unido al antígeno, y determinar si el anticuerpo sonda compite con cualquier anticuerpo de referencia en el conjunto de anticuerpos de referencia marcados, en el que la competición indica que el anticuerpo sonda se une al mismo epítopo que otro anticuerpo en el conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno. Cada perla coloreada de manera única puede tener un espectro de emisión distinto. El anticuerpo sonda puede marcarse, por ejemplo, con un marcador enzimático, o un marcador colorimétrico, o un marcador fluorescente, o un marcador radiactivo. Alternativamente, se usa un anticuerpo de detección para detectar el anticuerpo sonda unido, en el que el anticuerpo de detección puede estar marcado. El anticuerpo de detección marcado puede marcarse, por ejemplo, con un marcador enzimático, o un marcador colorimétrico, o un marcador fluorescente, o un marcador radiactivo.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para clasificar anticuerpos basándose en las características de unión proporcionando datos de entrada a partir de un ensayo de competición tal como se describió anteriormente, representando dichos datos de entrada los resultados de al menos un ensayo de competición de anticuerpos usando un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno, normalizando los datos de entrada para generar una matriz de intensidad normalizada, calculando al menos una matriz de disimilitud que comprende generar una matriz umbral a partir de la matriz de intensidad normalizada y calcular una matriz de disimilitud a partir de la matriz umbral y agrupar anticuerpos basándose en los valores de disimilitud en celdas de la matriz de disimilitud, para determinar los patrones de unión a epítopo del conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno.

Los datos de entrada pueden ser valores de intensidad de señal que representan los resultados de un ensayo de competición de anticuerpos usando un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno. Los datos de entrada que representan los resultados de un ensayo de competición de anticuerpos pueden almacenarse en forma de matriz. Los datos de entrada almacenados en forma de matriz pueden estar en una matriz bidimensional o una matriz multidimensional, y pueden almacenarse en una pluralidad de matrices. Los datos de entrada almacenados en forma de matriz pueden ser valores de intensidad de señal que representan los resultados de un ensayo de competición de anticuerpos. El ensayo de competición de anticuerpos puede ser el ensayo de combinación de anticuerpos competitiva múltiple (MCAB). Los datos de entrada almacenados en forma de matriz puede ser al menos una matriz en la que cada celda de la matriz comprende el valor de intensidad de señal de un ensayo de competición de anticuerpos individual.

La normalización de los datos de entrada para generar una matriz de intensidad normalizada puede incluir generar una matriz de intensidad normalizada para el fondo restando una primera matriz con valores de intensidad de señal a partir de un primer ensayo de competición de anticuerpos en el que no se añadió antígeno (control negativo) de una segunda matriz con valores de intensidad de señal a partir de un segundo ensayo de competición de anticuerpos en el que se añadió antígeno. Se fija un valor umbral mínimo para los valores de tampón de bloqueo, y cualquier valor de tampón de bloqueo por debajo del valor umbral se ajusta hasta el valor umbral antes de dicha generación de la matriz de intensidad normalizada.

Si se desea, la etapa de normalización incluye generar una matriz normalizada para la intensidad dividiendo cada valor en una columna de la matriz de intensidad normalizada para el fondo entre el valor de intensidad del tampón de bloqueo para la columna. La etapa de normalización puede incluir además la normalización con respecto a la señal de nivel inicial para anticuerpos sonda dividiendo cada columna de la matriz normalizada para la intensidad entre su valor diagonal correspondiente para generar una matriz final normalizada para la intensidad. Antes de dividir cada columna entre su valor diagonal correspondiente, se compara cada valor diagonal con un valor umbral definido por el usuario y cualquier dicho valor diagonal por debajo del valor umbral definido por el usuario se ajusta hasta el valor umbral.

Si se desea, la etapa de normalización incluye la generación de una matriz normalizada para la intensidad dividiendo cada valor en una fila de la matriz de intensidad normalizada para el fondo entre el valor de intensidad del tampón de bloqueo para la fila. La etapa de normalización puede incluir además la normalización con respecto a la señal de nivel inicial para anticuerpos sonda dividiendo cada fila de la matriz normalizada para la intensidad entre su correspondiente valor diagonal para generar una matriz final normalizada para la intensidad. Antes de dividir cada fila entre su correspondiente valor diagonal, se compara cada valor diagonal con un valor umbral definido por el usuario y cualquier dicho valor diagonal por debajo del valor umbral definido por el usuario se ajusta hasta el valor umbral.

La generación de la matriz umbral implica fijar el valor normalizado en cada celda de la matriz de intensidad normalizada a un valor de uno (1) o cero (0), en la que los valores normalizados inferiores o iguales a un valor umbral se fijan a un valor de cero (0) y los valores normalizados superiores a un valor umbral se fijan a un valor de uno
(1).

Se calcula al menos una matriz de disimilitud a partir de la matriz umbral de unos y ceros determinando el número de posiciones en las que difiere cada par de filas. Puede calcularse una pluralidad de matrices de disimilitud usando una pluralidad de valores umbral. El promedio de una pluralidad de matrices de disimilitud puede calcularse y usarse como entrada para la etapa de agrupación.

La agrupación de anticuerpos basándose en dichos valores de disimilitud en celdas de dicha matriz de disimilitud puede incluir una agrupación jerárquica. La agrupación jerárquica incluye generar una jerarquía de subconjuntos anidados de anticuerpos dentro de un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno determinando el par de anticuerpos en el conjunto que tiene el valor de disimilitud más bajo, determinando luego el par de anticuerpos que tiene el siguiente nivel de disimilitud más bajo y repitiendo de manera interactiva esta determinación de cada par de anticuerpos que tiene el siguiente valor de disimilitud más bajo hasta que queda un par de anticuerpos, de modo que se genera una jerarquía de subconjuntos anidados que indica la similitud de los patrones de competición dentro del conjunto de anticuerpos. Se determinan las agrupaciones basándose en los patrones de competición.

Alternativamente, el procedimiento de análisis de datos implica restar la matriz de datos para el experimento llevado a cabo con antígeno de la matriz de datos para el experimento sin antígeno. Entonces se usa el valor de cada celda diagonal como valor de fondo para determinar la afinidad de unión del anticuerpo en la columna correspondiente. Las celdas en la matriz restada que tienen valores significativamente superiores al valor diagonal correspondiente se destacan o se indican de otra manera.

Pueden capturarse datos de la etapa de agrupación, incluyendo mediante medios automatizados. En particular, pueden capturarse datos de la etapa de agrupación en un formato compatible con un ordenador o dispositivo de entrada de datos. La etapa de agrupación puede generar una presentación visual, que puede estar en un formato compatible con un ordenador o dispositivo de entrada de datos. La presentación visual generada por la etapa de agrupación puede ser una matriz de disimilitud. Pueden determinarse agrupaciones mediante inspección visual del valor de disimilitud en cada celda de la matriz de disimilitud. La matriz de disimilitud puede incluir celdas que tienen un indicador visual de la agrupación a la que pertenece el par de anticuerpos representado por dicha celda, en la que el indicador visual puede ser un color, o un sombreado, o un dibujo. Alternativamente, la presentación visual puede ser un dendrograma definido mediante valores de disimilitud calculados para un conjunto de anticuerpos. Un dendrograma de este tipo tiene ramas que representan anticuerpos en el conjunto de anticuerpos, en el que la disposición de las ramas representa relaciones entre anticuerpos dentro del conjunto de anticuerpos, y la disposición representa adicionalmente agrupaciones de anticuerpos dentro del conjunto de anticuerpos. En un dendrograma de este tipo, la longitud de cualquier rama representa el grado de similitud entre el patrón de unión de los anticuerpos o agrupación de anticuerpos representados por dicha rama.

Pueden analizarse datos de entrada que representan los resultados de una pluralidad de ensayos de competición de anticuerpos, en los que cada ensayo representa un experimento individual usando un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno, en el que además cada experimento incluye al menos un anticuerpo que también se somete a prueba en al menos otro experimento. Cuando se analiza una pluralidad de experimentos, puede generarse una matriz de intensidad normalizada individual para cada experimento individual y puede generarse una única matriz de intensidad normalizada calculando el valor de intensidad promedio de cada par de anticuerpos representado en cada matriz de intensidad normalizada individual. Puede generarse una única matriz de disimilitud que representa cada par de anticuerpos sometidos a prueba en la pluralidad de ensayos de competición de anticuerpos a partir de la única matriz de intensidad normalizada.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Ilustración esquemática de una realización de un ensayo de combinación por epítopos usando tecnología de perlas marcadas en un único pocillo de una placa de microtitulación. Cada anticuerpo de referencia se acopla a una perla con un espectro de emisión distinto, formando un anticuerpo de referencia marcado de manera única. Se coloca el conjunto completo de anticuerpos de referencia marcados de manera única en el pocillo de una placa de microtitulación de múltiples pocillos y se incuba con antígeno. Se añade un anticuerpo sonda y se determina la interacción del anticuerpo sonda con cada anticuerpo de referencia marcado de manera única.

Figura 2. Correlación entre los valores de intensidad del tampón de bloqueo y la intensidad promedio. Figura 2A. Correlación entre la intensidad del tampón de bloqueo y la intensidad promedio dentro de las filas. Valor de intensidad del tampón de bloqueo para cada fila (eje y) representado frente al valor de intensidad promedio de la fila omitiéndose el valor del tampón del bloqueo (eje x). El ajuste de una línea a los datos muestra una fuerte correlación lineal entre los valores del tampón de bloqueo y los valores de intensidad promedio del resto de la fila. Figura 2B. Correlación entre la intensidad del tampón de bloqueo y la intensidad promedio dentro de las columna. Valor de intensidad del tampón de bloqueo para cada columna (eje y) representado frente al valor de intensidad promedio de la columna omitiéndose el valor del tampón de bloqueo (eje-x). El ajuste de una línea a los datos muestra una correlación lineal relativamente débil entre los valores del tampón de bloqueo y los valores de intensidad promedio del resto de la columna. Figura 2C. Gráfico de dispersión de los valores de intensidad para la matriz con antígeno y la matriz normalizada para el fondo. Este gráfico muestra una fuerte correlación lineal (pendiente de aproximadamente 1,0) para valores de señal restados altos, indicando que la señal de fondo es mínima en relación con la señal en presencia de antígeno. Los puntos se sombrean según el valor de la fracción, calculado como la señal restada dividida por la señal para el experimento con antígeno presente. Los valores de fracción más pequeños (más cercanos a cero) corresponden a una contribución del fondo alta y tienen un sombreado claro. Los valores de fracción más grandes (más cercanos a 1) corresponden a una contribución del fondo inferior y tienen un sombreado más oscuro.

Figura 3. Comparación de los resultados de la combinación por epítopos con los resultados de FACS. Se muestran los resultados de los experimentos con anticuerpos usando el anticuerpo frente al ANTIGEN39, que comparan resultados usando el método de combinación por epítopos descrito en el presente documento con resultados usando citometría de flujo (citometría de flujo activada por fluorescencia, FACS). Se asignan anticuerpos a las combinaciones 1-15, tal como se indica mediante las filas 1-15 en la columna izquierda lejana usando el ensayo de combinación por epítopos. El sombreado de las celdas indica anticuerpos que son positivos por FACS para células que expresan el ANTIGEN39 (línea celular 786-0), y cuando no hay sombreado indica anticuerpos que son negativos para células que no expresan el ANTÍGENO29 (línea celular M14).

Figura 4. Disimilitud frente al valor de fondo: efecto de la elección del valor de límite del umbral. La figura muestra la cantidad de disimilitud entre los anticuerpos 2.1 y 2.25 calculada a diversos valores umbral. La cantidad de disimilitud representa el valor para la matriz de disimilitud para la entrada correspondiente a los dos anticuerpos, Ac 2.1 y Ac 2.25 para una serie de matrices de disimilitud calculadas usando diferentes valores umbral. En este caso, el eje x es el valor umbral y el eje y es el valor de disimilitud calculado usando ese valor de límite umbral.

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Figura 5. Dendrograma para anticuerpos frente al ANTÍGENO14. La longitud de las ramas que conectan dos anticuerpos es proporcional al grado de similitud entre los dos anticuerpos. Esta figura muestra que hay dos epítopos muy distintos reconocidos por estos anticuerpos. Un epítopo es reconocido por los anticuerpos 2.73, 2.4, 2.16, 2.15, 2.69, 2.19, 2.45, 2.1 y 2.25. Se reconoce un epítopo diferente por los anticuerpos 2.13, 2.78, 2.24, 2.7, 2.76, 2.61, 2.12, 2.55, 2.31, 2.56 y 2.39. El anticuerpo 2.42 no tiene un patrón que sea muy similar a cualquier otro anticuerpo, pero tiene alguna similitud perceptible con la segunda agrupación, aunque puede reconocer aún un tercer epítopo que se solapa parcialmente con el segundo epítopo.

Figura 6. Dendrogramas para anticuerpos frente al ANTIGEN39. Figura 6A. Dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para cinco conjuntos de datos experimentales de entrada. El número o agrupaciones únicas de anticuerpos sugieren que son varios epítopos diferentes, algunos de los cuales pueden solaparse. Por ejemplo, la agrupación que contiene los anticuerpos 1.17, 1.55, 1.16, 1.11 y 1.12 y la agrupación que contiene 1.21, 2.12, 2.38, 2.35 y 2.1 parecen estar bastante estrechamente relacionadas, siendo cada par de anticuerpos con la excepción de 2.35 y 1.11 diferentes en no más del 25%. Este alto grado de similitud a través de las dos agrupaciones sugiere que los dos epítopos diferentes tienen por sí mismos un alto grado de similitud. Figura 6B. Dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 1. Los anticuerpos 1.12, 1.63, 1.17, 1.55 y 2.12 se agrupan entre sí de manera coherente en este experimento así como en otros experimentos, al igual que los anticuerpos 1.46, 1.31, 2.17 y 1.29. Figura 6C. Dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 2. Los anticuerpos 1.57 y 1.61 se agrupan entre sí de manera coherente en este experimento así como en otros experimentos. Figura 6D. Dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 3. Los anticuerpos 1.55, 1.12, 1.17, 2.12, 1.11 y 1.21 se agrupan entre sí de manera coherente en este experimento así como en otros experimentos. Figura 6E. Dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 4. Los anticuerpos 1.17, 1.16, 1.55, 1.11 y 1.12 se agrupan entre sí de manera coherente en este experimento así como en otros experimentos, a igual que los anticuerpos 1.31, 1.46, 1.65, y 1.29, así como los anticuerpos 1.57 y 1.61. Figura 6F. Dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 5. Los anticuerpos 1.21, 1.12, 2.12, 2.38, 2.35 y 2.1 se agrupan entre sí de manera coherente en este experimento así como en otros experimentos.

Figura 7. Dendrogramas para agrupación de anticuerpos monoclonales frente a IL-8. Figura 7A. Dendrogramas para una agrupación de siete anticuerpos monoclonales frente a IL-8. El dendrograma de la izquierda se genera mediante la agrupación de columnas, y el dendrograma de la derecha mediante la agrupación de filas de una matriz de intensidad de señal normalizada para el fondo. Ambos dendrogramas indican que hay dos epítopos, usando un límite de disimilitud de 0,25: un epítopo es reconocido por los anticuerpos monoclonales HR26, a215, a203, a393 y a452; un segundo epítopo es reconocido por los anticuerpos monoclonales K221 y a33. Figura 7B. Dendrogramas para anticuerpos monoclonales frente a IL-8 a partir de un análisis de agrupación combinada que confluye con cinco conjuntos de datos experimentales diferentes. Se generó el dendrograma de la izquierda mediante la agrupación de columnas, mientras que se generó el dendrograma de la derecha mediante la agrupación de filas de la matriz de intensidad de señal normalizada para el fondo. Ambos dendrogramas indican que hay dos epítopos, usando un límite de disimilitud de 0,25: un epítopo es reconocido por los anticuerpos monoclonales a809, a928, HR26, a215 y D111; un segundo epítopo es reconocido por los anticuerpos monoclonales a837, K221, a33, a142, a358, y a203, a393 y a452. Figura 7C. Dendrogramas para una agrupación de nueve anticuerpos monoclonales frente a IL-8. Se generó el dendrograma de la derecha mediante la agrupación de columnas y el dendrograma de la izquierda mediante la agrupación de filas de la matriz de intensidad de señal normalizada para el fondo. Ambos dendrogramas indican que hay dos epítopo, usando un límite de disimilitud de 0,25: un epítopo es reconocido por los anticuerpos monoclonales HR26 y a215; un segundo epítopo es reconocido por los anticuerpos monoclonales K221, a33, a142, a203, a358, a393, y a452.

Figura 8. Matrices de intensidad generadas en la realización dada a conocer en el ejemplo 2 usando un conjunto de anticuerpos frente al ANTÍGENO 14. La figura 8A es una tabla que muestra la matriz de intensidad para el experimento realizado con antígeno. La figura 8B es una tabla que muestra la matriz de intensidad para el mismo experimento realizado sin antígeno (control). Estas matrices se usan en matrices de datos de entrada para etapas posteriores en el análisis de datos.

Figura 9. Matriz de diferencias para anticuerpos frente a la diana ANTÍGENO14. Se genera la matriz de diferencias restando la matriz correspondiente a valores obtenidos a partir del experimento sin antígeno (véase la figura 8B) de la matriz correspondiente a valores obtenidos a partir del experimento con antígeno (véase la figura 8A) dada a conocer en el ejemplo 2.

Figura 10. Matriz de diferencias ajustada con el valor umbral mínimo. Para los valores de intensidad del ejemplo 2, se fija la intensidad de señal fiable mínima a 200 unidades de intensidad y se fijan los valores por debajo del umbral mínimo al umbral de 200.

Figura 11. Matriz normalizada para las filas. Se ajusta cada fila en la matriz de diferencias ajustada de la figura 10 dividiéndola entre el último valor de intensidad de la fila, que corresponde al valor de intensidad para perlas a las que se añade tampón de bloqueo en lugar de anticuerpo primario. Esto ajusta para la intensidad entre pocillos.

Figura 12. Matriz normalizada diagonal. Todas las columnas excepto la correspondiente al anticuerpo 2.42 estaban normalizadas para las columnas. Se lleva a cabo la división de cada columna entre su diagonal correspondiente para medir cada intensidad en relación con una intensidad que se sabe que refleja la competición, es decir, la competición frente a sí misma.

Figura 13. Matriz de reconocimiento del patrón de anticuerpos. Para los datos a partir de la realización dada a conocer en el ejemplo 2, se fijaron hasta cero los valores de intensidad por debajo del umbral definido por el usuario. Se fijó el umbral definido por el usuario hasta dos (2) veces los valores de intensidad diagonales. Se fijaron los valores restantes a uno.

Figura 14. Matriz de disimilitud. Para los datos a partir de la realización dada A conocer en el ejemplo 2, se genera una matriz de disimilitud a partir de la matriz de ceros y unos mostrada en la figura 13, fijando la entrada en la fila i y la columna j con respecto a la fracción de las posiciones en las que difieren las dos filas, i y j. La figura 14 muestra el número de posiciones, de un total de 22, en las que se diferencian los patrones para dos anticuerpos cualesquiera para el conjunto de anticuerpos generados frente a la diana ANTÍGENO14.

Figura 15. Matriz de disimilitud promedio. Después de que se generaran matrices de disimilitud separadas a partir de cada uno de varios valores umbral que oscilaban desde 1,5 hasta 2,5 veces los valores de las diagonales, se calculó el promedio de estas matrices de disimilitud (figura 15) y se usó como entrada para el procedimiento de agrupación.

Figura 16. Matriz de disimilitud promedio permutada. Para los datos a partir de la realización dada a conocer en el ejemplo 2, pueden visualizarse agrupaciones en las matrices. En la figura 16, se dispusieron las filas y columnas de la matriz de disimilitud según el orden de las "hojas" o clados en el dendrograma mostrado en la figura 5, y se visualizaron las celdas individuales codificadas según el grado de disimilitud.

Figura 17. Matriz de intensidad normalizada permutada. Para los datos a partir de la realización dada a conocer en el ejemplo 2, se dispusieron las filas y las columnas de la matriz de intensidad normalizada según el orden de las hojas en el dendrograma mostrado en la figura 5, y se codificaron las celdas visualmente según sus valores de intensidad normalizados.

Figura 18. Matriz de disimilitud promedio permutada para cinco conjuntos de dados de entrada para el ANTIGEN39. Los datos a partir de cinco experimentos que se realizaron usando anticuerpos frente a la diana ANTIGEN39 (véase el ejemplo 3) produjeron cinco conjuntos de datos de entrada. Se generaron matrices de disimilitud para cada conjunto de datos de entrada y se generó una matriz de disimilitud promedio, y se dispusieron (permutaron) las filas y columnas según la disposición del/de los correspondiente(s) dendrograma(s) mostrado(s) en la figura 6.

Figura 19. Matriz de intensidad normalizada permutada para cinco conjuntos de datos de entrada para el ANTIGEN39. Los datos a partir de cinco experimentos que se realizaron usando anticuerpos frente a la diana ANTIGEN39 (véase el ejemplo 3) produjeron cinco conjuntos de datos de entrada. Se generó una matriz de intensidad normalizada para los cinco conjuntos de datos de entrada y se dispusieron (permutaron) las filas y columnas según la disposición del/de los correspondiente(s) dendrograma(s) mostrado(s) en la figura 6.

Figura 20. Matriz de disimilitud promedio permutada para el experimento 1 usando un conjunto de anticuerpos frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del conjunto de anticuerpos analizados en el experimento 1 (ejemplo 3). Véase el dendrograma mostrado en la figura 6B.

Figura 21. Matriz de intensidad normalizada permutada para el experimento 1 usando un conjunto de anticuerpos frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del conjunto de anticuerpos analizado en el experimento 1 (ejemplo 3). Véase el dendrograma mostrado en la figura 6B.

Figura 22. Matriz de disimilitud promedio permutada para el experimento 2 usando un conjunto de anticuerpos frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del conjunto de anticuerpos analizado en el experimento 2 (ejemplo 3). Véase el dendrograma mostrado en la figura 6C.

Figura 23. Matriz de intensidad normalizada permutada para el experimento 2 usando un conjunto de anticuerpos frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del conjunto de anticuerpos analizado en el experimento 2 (ejemplo 3). Véase el dendrograma mostrado en la figura 6C.

Figura 24. Matriz de disimilitud promedio permutada para el experimento 3 usando un conjunto de anticuerpos frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del conjunto de anticuerpos analizado en el experimento 3 (ejemplo 3). Véase el dendrograma mostrado en la figura 6D.

Figura 25. Matriz de intensidad normalizada permutada para el experimento 3 usando un conjunto de anticuerpos frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del conjunto de anticuerpos analizado en el experimento 3 (ejemplo 3). Véase el dendrograma mostrado en la figura 6D.

Figura 26. Matriz de disimilitud promedio permutada para el experimento 4 usando un conjunto de anticuerpos frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del conjunto de anticuerpos analizado en el experimento 4 (ejemplo 3). Véase el dendrograma mostrado en la figura 6E.

Figura 27. Matriz de intensidad normalizada permutada para el experimento 4 usando un conjunto de anticuerpos frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del conjunto de anticuerpos analizado en el experimento 4 (ejemplo 3). Véase el dendrograma mostrado en la figura 6E.

Figura 28. Matriz de disimilitud promedio permutada para el experimento 5 usando un conjunto de anticuerpos frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del conjunto de anticuerpos analizado en el experimento 5 (ejemplo 3). Véase el dendrograma mostrado en la figura 6F.

Figura 29. Matriz de intensidad normalizada permutada para el experimento 5 usando un conjunto de anticuerpos frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del conjunto de anticuerpos analizado en el experimento 5 (Ejemplo 3). Véase el dendrograma mostrado en la figura 6F.

Figura 30. Agrupaciones identificadas en los experimentos 1-5 usando conjuntos de anticuerpos frente a la diana ANTIGEN39. La figura 30 resume las agrupaciones identificadas para cada uno de los cinco conjuntos de datos individuales y para el conjunto de datos combinados para todos los anticuerpos generados en los cinco experimentos dados a conocer en el ejemplo 3.

Descripción detallada de la realización preferida

Con el aumento de la eficacia de fusión produciendo grandes números de anticuerpos específicos de antígeno a partir de cada experimento de fusión hibridoma-célula, un método de selección de manejo y priorización de grandes números de anticuerpos se hace cada vez más importante. Cuando se ha generado un conjunto de anticuerpos monoclonales frente a un antígeno diana, diferentes anticuerpos del conjunto reconocerán diferentes epítopos, y también tendrán afinidades de unión variables. Por tanto, para seleccionar eficazmente grandes números de anticuerpos, es importante determinar qué anticuerpo se une a cada epítopo, y determinar la afinidad de unión para cada anticuerpo.

La combinación por epítopos, tal como se describe en el presente documento, es el proceso de agrupar anticuerpos basándose en los epítopos que reconocen. Más particularmente, la combinación por epítopos comprende métodos y sistemas para discriminar las propiedades de reconocimiento de epítopo de diferentes anticuerpos, combinado con procedimientos informáticos para agrupar anticuerpos basándose en sus propiedades de reconocimiento de epítopo e identificando anticuerpos que tienen especificidades de unión distintas. En consecuencia, las realizaciones incluyen ensayos para determinar las propiedades de unión a epítopo de los anticuerpos, y procedimientos para analizar datos generados a partir de tales ensayos.

La invención es un método basado en competición de clasificación de un conjunto de anticuerpos que se han generado frente a un antígeno. Este método depende de la realización de una serie de ensayos en los que cada anticuerpo a partir del conjunto se somete a prueba para determinar la unión competitiva frente a todos los demás anticuerpos del conjunto. Por tanto, se usará cada anticuerpo en dos modos diferentes: en al menos un ensayo, se usará cada anticuerpo en el modo de "detección" como el "anticuerpo sonda" que se somete a prueba frente a todos los demás anticuerpos en el conjunto; en otros ensayos, se usará el anticuerpo en el modo de "captura" como un "anticuerpo de referencia" dentro del conjunto de anticuerpos de referencia que está sometiéndose a ensayo. Dentro del conjunto de anticuerpos de referencia, cada anticuerpo de referencia estará marcado de manera única de una forma que permita la detección e identificación de cada anticuerpo de referencia dentro de una mezcla de anticuerpos de referencia. El método depende de la formación de "sándwiches" o complejos que implican anticuerpos de referencia, antígeno y anticuerpo sonda, y la detección de la formación o falta de formación de estos complejos. Debido a que cada anticuerpo de referencia en el conjunto está marcado de manera única, es posible determinar de manera accesible si se ha formado un complejo para cada anticuerpo de referencia presente en el conjunto de anticuerpos de referencia que está sometiéndose a ensayo.

Visión general del ensayo de anticuerpos

El método comienza seleccionando un anticuerpo a partir del conjunto de anticuerpos frente a un antígeno, en el que el anticuerpo seleccionado servirá como "anticuerpo sonda" que va a someterse a prueba para determinar la unión competitiva frente a todos los demás anticuerpos del conjunto. Una mezcla que contiene todos los anticuerpos servirá como conjunto de "anticuerpos de referencia" para el ensayo, en el que cada anticuerpo de referencia en la mezcla está marcado de manera única. En un ensayo, se pone en contacto el anticuerpo sonda con el conjunto de anticuerpos de referencia en presencia del antígeno diana. En consecuencia, se formará un complejo entre el anticuerpo sonda y cualquier otro anticuerpo en el conjunto que no compite por el mismo epítopo en el antígeno diana. No se formará un complejo entre el anticuerpo sonda y cualquier otro anticuerpo en el conjunto que compite por el mismo epítopo en el antígeno diana. Se detecta la formación de complejos usando un anticuerpo de detección marcado que se une al anticuerpo sonda. Debido a que cada anticuerpo de referencia en la mezcla está marcado de manera única, es posible determinar para cada anticuerpo de referencia si ese anticuerpo de referencia forma o no forma un complejo con el anticuerpo sonda. Por tanto, puede determinarse qué anticuerpos en la mezcla compiten con el anticuerpo sonda y se unen al mismo epítopo que el anticuerpo sonda.

Se usa cada anticuerpo como anticuerpo sonda en al menos un ensayo. Repitiendo esta método de someter a prueba cada anticuerpo individual del conjunto frente al conjunto completo de anticuerpos, pueden generarse las afinidades de unión competitiva para el conjunto completo de anticuerpos frente a un antígeno. A partir de tales mediciones de afinidad, puede determinarse qué anticuerpos del conjunto tienen características de unión similares a otros anticuerpos del conjunto, permitiendo de ese modo el agrupamiento o "combinación" de cada anticuerpo basándose en su perfil de unión a epítopo. Una tabla de las mediciones de la afinidad de unión competitiva es un método adecuado para representar visualmente los resultados del ensayo. Una realización preferida de este método es el ensayo de combinación de anticuerpos competitiva multiplexada (MCAB) para la selección de anticuerpos de alto rendimiento.

Debido a que esta realización depende de someter a prueba la competición de anticuerpos, en la que se somete a prueba un único anticuerpo frente al conjunto completo de anticuerpos generados frente a un antígeno, un desafío para implementar este método se refiere al mecanismo usado para identificar de manera única y medir cuantitativamente complejos formados entre el único anticuerpo y uno cualquiera de los otros anticuerpos en el conjunto. Es esta medición cuantitativa la que proporciona una estimación de si dos anticuerpos están compitiendo por el mismo epítopo sobre el antígeno.

Tal como se describe a continuación, las realizaciones de la invención se refieren al marcaje de manera única de cada anticuerpo de referencia en el conjunto antes de crear una mezcla de todos los anticuerpos. Este marcador único, tal como se discute a continuación, no se limita a ningún mecanismo particular. En su lugar, se contempla que sería adecuado cualquier método que proporcione una forma de identificar cada anticuerpo de referencia dentro de la mezcla, permitiendo distinguir cada anticuerpo de referencia en el conjunto de todos los demás anticuerpos de referencia en el conjunto. Por ejemplo, cada anticuerpo de referencia puede marcarse colorimétricamente de modo que puede determinarse el color particular de cada anticuerpo en el conjunto. Alternativamente, cada anticuerpo de referencia en el conjunto podría marcarse radiactivamente usando diferentes isótopos radiactivos. El anticuerpo de referencia puede marcarse acoplando, uniendo o enlazando el anticuerpo a un objeto marcado tal como una perla u otra superficie.

Una vez que cada anticuerpo de referencia en el conjunto se ha marcado de manera única, se forma una mezcla que contiene todos los anticuerpos de referencia. Se añade el antígeno a la mezcla y se añade el anticuerpo sonda a la mezcla. Es necesario un marcador de detección con el fin de detectar complejos que contienen anticuerpo sonda unido. Un anticuerpo de detección puede ser un anticuerpo de detección marcado o puede ser otro marcador que se une al anticuerpo sonda. Por ejemplo, cuando está sometiéndose a prueba un conjunto de anticuerpos monoclonales humanos, un anticuerpo monoclonal de ratón anti-ser humano es adecuado para su uso como anticuerpo de detección. El marcador de detección se elige para que sea distinto de todos los demás marcadores en la mezcla que se usan para marcar anticuerpos de referencia. Por ejemplo, un anticuerpo de detección marcado podría marcarse con un único color, o marcarse radiactivamente o marcarse mediante un marcador fluorescente particular tal como ficoeritrina (PE).

El diseño de un experimento debe incluir seleccionar condiciones tales que el anticuerpo de detección se una sólo al anticuerpo sonda, y no se una a los anticuerpos de referencia. En realizaciones en las que los anticuerpos de referencia se acoplan a perlas u otros materiales a través de anticuerpos, el anticuerpo que acopla el anticuerpo de referencia a la perla (el "anticuerpo de captura") será el mismo anticuerpo que el anticuerpo de detección. Según esta realización de la invención, el anticuerpo de detección se elige o modifica específicamente de modo que el anticuerpo de detección se une sólo al anticuerpo sonda y no se une al anticuerpo de referencia. Usando el mismo anticuerpo tanto para la detección como para la captura, cada uno bloqueará la unión del otro a sus dianas respectivas. En consecuencia, cuando el anticuerpo de captura se une al anticuerpo de referencia, bloqueará la unión del anticuerpo de detección al mismo epítopo en el anticuerpo de referencia y producirá un resultado de falso positivo. Los anticuerpos adecuados para su uso como anticuerpos de detección incluyen anticuerpos anti-IgG2, IgG3 e IgG4 humanas de ratón disponibles de Calbiochem, (número de catálogo 411427, Ig kappa de ratón anti-ser humano disponible de Southern Biotechnology Associates, Inc. (números de catálogo 9220-01 y 9220-08, y anticuerpo anti-hIgG de ratón de PharMingen (números de catálogo 555784 y 555785).

Una vez que el anticuerpo de detección se ha añadido a la mezcla, entonces puede analizarse la mezcla completa para detectar complejos entre el anticuerpo de detección marcado, el anticuerpo sonda unido, el antígeno y el anticuerpo de referencia marcado de manera única. El método de detección debe permitir la detección de complejos (o falta de los mismos) para cada anticuerpo de referencia marcado de manera única en la mezcla.

La detección de un complejo formado entre un anticuerpo sonda y cada anticuerpo de referencia en el conjunto indica, para cada anticuerpo de referencia, si ese anticuerpo de referencia compite con el anticuerpo sonda por la unión al mismo (o casi) epítopo. Debido a que la mezcla de anticuerpos de referencia incluirá el anticuerpo que está usándose como anticuerpo de referencia, se espera que éste proporcione un control negativo. La detección de la formación de complejo permite la medición de las afinidades competitivas de los anticuerpos en el conjunto que está sometiéndose a prueba. Esta medición de las afinidades competitivas se usa entonces para clasificar cada anticuerpo en el conjunto basándose en cómo de fuerte o de débil se unen a los mismos epítopos en el antígeno diana. Esto proporciona un método rápido para agrupar anticuerpos en un conjunto basándose en sus características de unión.

En una realización, pueden examinarse simultáneamente grandes números de anticuerpos para determinar sus propiedades de reconocimiento de epítopo en un único experimento según realizaciones de la presente invención, tal como se describe a continuación. Generalmente, el término "experimento" se usa de manera no exclusiva en el presente documento para indicar una colección de ensayos de anticuerpo individuales y controles adecuados. El término "ensayo" se usa de manera no exclusiva en el presente documento para referirse a ensayos individuales, por ejemplo reacciones llevadas a cabo en un único pocillo de una placa de microtitulación usando un único anticuerpo sonda, o puede usarse para referirse a una colección de ensayos o para referirse a un método de medición de la unión y competición de anticuerpos tal como se describe en el presente documento.

En una realización, se examinan simultáneamente grandes números de anticuerpos para determinar sus propiedades de reconocimiento de epítopo usando un ensayo de tipo "sándwich" que implica un conjunto de anticuerpos de referencia en el que cada anticuerpo de referencia en el conjunto está unido a un anticuerpo de "captura" marcado de manera única. El anticuerpo de captura puede ser, por ejemplo, un anticuerpo marcado colorimétricamente que tiene una fuerte afinidad por los anticuerpos del conjunto. Como ejemplo, el anticuerpo de captura puede se un anticuerpo anti-IgG humana o anti-Igkappa humana de ratón, cabra o bovino marcado. Aunque las realizaciones descritas en el presente documento usan un anticuerpo anti-IgG humana monoclonal de ratón, otros anticuerpos de captura similares que se unen a los anticuerpos que están estudiándose están dentro del alcance de la invención. Por tanto, un experto en la técnica puede seleccionar un anticuerpo de captura apropiado basándose en el origen del conjunto de anticuerpos que está sometiéndose a prueba.

Por tanto, una realización de la presente invención proporciona un método de clasificación, por ejemplo, de qué epítopos en un antígeno diana se unen a cincuenta (50) anticuerpos diferentes generados frente al antígeno diana. Una vez que se ha determinado que los 50 anticuerpos tienen alguna afinidad por un antígeno diana, se usan los métodos descritos a continuación para determinar qué anticuerpos del grupo de 50 se unen al mismo epítopo. Estos métodos se realizan usando cada uno de los 50 anticuerpos como anticuerpo sonda para competir de manera cruzada frente a una mezcla de todos los 50 anticuerpos (los anticuerpos de referencia), en los que los 50 anticuerpos de referencia marcados de manera única en la mezcla están marcados cada uno mediante un anticuerpo de captura. Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo competirán entre sí, mientras que los anticuerpos que no compiten se asume que no se unen al mismo epítopo. Mediante el marcaje de manera única de un gran número de anticuerpos en una única reacción, tal como se describe a continuación, estos métodos permiten que un anticuerpo preseleccionado compita frente a 10, 25, 50, 100, 200, 300 o más anticuerpos al mismo tiempo. Por esta razón, la elección de los 50 anticuerpos de prueba en un experimento es arbitraria, y no debe observarse como limitativa de la invención.

Preferiblemente, se usa el ensayo de combinación de anticuerpos competitiva múltiple (MCAB). Más preferiblemente, se pone en práctica el ensayo de MCAB utilizando el sistema LUMINEX (Luminex Corp., Austin TX), en el que pueden combinarse simultáneamente hasta 100 anticuerpos usando el método ilustrado en la figura 1. El ensayo de MCAB se basa en la unión competitiva de dos anticuerpos a una única molécula de antígeno. Se usa dos veces el conjunto completo de anticuerpos que va a caracterizarse en el ensayo de MCAB, en los modos de "captura" y "detección" en el ensayo de tipo sándwich de MCAB.

En un experimento, cada anticuerpo de captura está marcado de manera única. Una vez que el anticuerpo de captura se ha marcado de manera única, se expone a uno de los conjuntos de anticuerpos que están sometiéndose a prueba, formando un anticuerpo de referencia que está marcado de manera única. Se repite esto para el resto de anticuerpos del conjunto de modo que se marca cada anticuerpo con un anticuerpo de captura coloreado diferente. Por ejemplo, cuando están sometiéndose a prueba 50 anticuerpos, se crea una mezcla de anticuerpos de referencia marcados mezclando todos los 50 anticuerpos de referencia marcados de manera única en un único pocillo de reacción. Por esta razón, es útil que cada marcador tenga una propiedad distinta que permita distinguirlo o detectarlo cuando se mezcla con otros marcadores. En una realización preferida, cada anticuerpo de captura se marca con un patrón distinto de fluorocromos de modo que puedan distinguirse colorimétricamente entre sí.

Una vez que se crea la mezcla de anticuerpo de prueba, se coloca en múltiples pocillos de, por ejemplo, una placa de microtitulación. En este ejemplo, la misma mezcla de anticuerpos se colocaría en cada uno de los 50 pocillos de microtitulación y entonces se incubaría la mezcla de cada pocillo con el antígeno diana como una primera etapa del ensayo de competición. Tras la incubación con el antígeno diana, se añade a cada posillo un único anticuerpo sonda seleccionado del conjunto original de 50 anticuerpos. En este ejemplo, sólo se añade anticuerpo sonda a cada mezcla de anticuerpo de referencia. Si cualquier anticuerpo de referencia marcado en el pocillo se une al antígeno diana en el mismo epítopo que el anticuerpo sonda, competirán entre sí por el sitio de unión del epítopo. Un experto en la técnica entiende que las realizaciones de la invención no se limitan a añadir sólo un único anticuerpo sonda a cada pocillo. Se contemplan otros métodos en los que se añaden a la mezcla múltiples anticuerpos sonda, cada uno marcado de manera distinguible entre sí.

Con el fin de determinar si el anticuerpo sonda se ha unido a cualquiera de los 50 anticuerpos de referencia marcados en el pocillo, se añade un anticuerpo de detección marcado a cada una de las 50 reacciones. En una realización, el anticuerpo de detección marcado en una versión marcada de manera diferente del mismo anticuerpo usado como anticuerpo de captura. Por tanto, por ejemplo, el anticuerpo de detección puede ser un anticuerpo anti-IgG humana o un anticuerpo anti-Igkappa humana de ratón. El anticuerpo de detección se unirá a, y marcará, el anticuerpo sonda que se colocó en el pocillo.

El marcador sobre el anticuerpo de detección permite la detección y medición de la cantidad de anticuerpo sonda unido a un complejo formado por un anticuerpo de referencia, el antígeno y el anticuerpo sonda. Este complejo sirve como una medición de la competición entre el anticuerpo sonda y el anticuerpo de referencia. El anticuerpo de detección puede marcarse con cualquier marcador adecuado que facilite la detección del anticuerpo secundario. Por ejemplo, un anticuerpo de detección puede marcarse con biotina, que facilita la detección fluorescente del anticuerpo sonda cuando se añade estreptavidina-ficoeritrina (PE). El anticuerpo de detección puede marcarse con cualquier marcador que determine de manera única su presencia como parte de un complejo, tal como biotina, digoxigenina, lectina, radioisótopos, enzimas u otros marcadores. Si se desea, el marcador también puede facilitar el aislamiento de perlas u otras superficies con complejos unidos de anticuerpo-antígeno.

La cantidad de anticuerpo de detección marcado unido a cada anticuerpo de referencia marcado de manera única indica la cantidad de anticuerpo sonda unido, y se une el anticuerpo de detección marcado al anticuerpo sonda unido al antígeno unido al anticuerpo de referencia marcado. La medición de la cantidad de anticuerpo de detección marcado unido a cada uno de los 50 anticuerpos de referencia marcados indica la cantidad de anticuerpo sonda unido que puede obtenerse, en la que la cantidad de anticuerpo sonda unido es un indicador de la similitud o disimilitud de las propiedades de reconocimiento de epítopo de los dos anticuerpos (sonda y referencia). Si se detecta una cantidad medible del anticuerpo de detección marcado sobre el complejo de anticuerpo de referencia marcado-antígeno, se entiende que indica que el anticuerpo sonda y el anticuerpo de referencia no se unen al mismo epítopo en el antígeno. A la inversa, si se detecta poco o nada del anticuerpo de detección medible sobre el complejo de anticuerpo de referencia marcado-antígeno, entonces se entiende que indica que el anticuerpo sonda para esa reacción se une a epítopos idénticos o muy similares en el antígeno. Si se detecta una cantidad pequeña de anticuerpo de detección sobre el complejo anticuerpo de referencia-antígeno, se entiende que indica que los anticuerpos de referencia y sonda pueden tener propiedades de reconocimiento de epítopo similares pero no idénticas, por ejemplo, la unión del anticuerpo de referencia a su epítopo interfiere con, pero no inhibe completamente la unión del anticuerpo sonda a su epítopo.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para detectar tanto el anticuerpo de referencia como la cantidad de anticuerpo sonda unido a un antígeno. Si se han mezclado complejos de anticuerpos que contienen anticuerpos de referencia, entonces puede usarse la propiedad única proporcionada por los marcadores únicos sobre el anticuerpo de captura para identificar el anticuerpo de referencia acoplado a esa perla. Preferiblemente, esa propiedad distinta es un espectro de emisión único.

La cantidad de anticuerpo sonda unido a cualquier anticuerpo de referencia puede determinarse midiendo la cantidad de marcador de detección unido al complejo. El marcador de detección puede ser un anticuerpo de detección marcado unido al anticuerpo sonda unido al complejo, o puede ser un marcador unido al anticuerpo sonda. Por tanto, pueden medirse las propiedades de reconocimiento de epítopo tanto de un anticuerpo de referencia como de un anticuerpo sonda usando una medición comparativa de la competición entre los dos anticuerpos para un epítopo.

Pueden determinarse las condiciones para optimizar los procedimientos mediante métodos empíricos y el conocimiento de un experto en la técnica. Pueden variarse el tiempo de incubación, temperatura, tampones, reactivos y otros factores hasta que se obtiene una señal fuerte o clara. Por ejemplo, un experto en la técnica puede determinar empíricamente la concentración óptima de diversos anticuerpos, sometiendo a prueba anticuerpos y antígenos a diferentes concentraciones y buscando la concentración que produce la señal más fuerte u otro resultado deseado. En una realización, se determina la concentración óptima de anticuerpos primario y secundario (es decir, anticuerpos que van a combinarse) mediante una doble titulación de dos anticuerpos producidos frente a epítopos diferentes del mismo antígeno, en presencia de un anticuerpo de control negativo que no reconoce el antígeno.

Ensayos usando perlas coloreadas

En una realización preferida, se examinan simultáneamente grandes números de anticuerpos para determinar sus propiedades de reconocimiento de epítopo en un único ensayo usando microesferas o perlas codificadas por color para identificar múltiples reacciones en un único tubo o pocillo, preferiblemente usando un sistema disponible de Luminex Corporation (Luminex Corp, Austin TX), y lo más preferiblemente usando el sistema Luminex 100. Preferiblemente, se lleva a cabo el ensayo de MCAB usando la tecnología Luminex. En otra realización preferida, se unen hasta 100 anticuerpos diferentes que van a someterse a prueba perlas Luminex con 100 colores distintos. Este sistema proporciona 100 conjuntos diferentes de perlas de poliestireno con cantidades variables de fluorocromos incrustados. Esto da a cada conjunto de perlas un espectro de emisión fluorescente distinto y por tanto un código de color distinto.

Para caracterizar las propiedades de unión de anticuerpos usando el sistema Luminex 100, se recubren las perlas con un anticuerpo de captura que se une covalentemente a cada perla; preferiblemente se usa un anticuerpo monoclonal anti-IgG humana o anti-Igkappa humana de ratón. Cada conjunto de perlas se incuba entonces en un pocillo que contiene un anticuerpo de referencia que va a caracterizarse (por ejemplo, que contiene sobrenadante de hibridoma) de manera que si se forma un complejo entre la perla, el anticuerpo de captura y el anticuerpo de referencia (en lo sucesivo, un "complejo de anticuerpo de referencia-perla") que tiene un espectro de emisión de fluorescencia distinto y por tanto, un código de color, que proporciona un marcador único para ese anticuerpo de referencia.

En esta realización preferida, cada complejo de anticuerpo de referencia-perla de cada reacción con cada anticuerpo de referencia se mezcla con otros complejos de anticuerpo de referencia-perla para formar una mezcla que contiene todos los anticuerpos de referencia que están sometiéndose a prueba, en la que cada anticuerpo de referencia está marcado de manera única acoplándose a una perla. Se toman alícuotas de la mezcla en cuantos pocillos de una placa de 96 pocillos sean necesarios para el experimento. Generalmente, el número de pocillos se determinará mediante el número de anticuerpos sonda que están sometiéndose a prueba, junto con diversos controles. Cada uno de estos pocillos que contienen una alícuota de la mezcla de complejos de anticuerpo de referencia-perla se incuba en primer lugar con antígeno y luego con anticuerpo sonda (uno de los anticuerpos que va a caracterizarse), y luego anticuerpo de detección (una versión marcada del anticuerpo de captura original), en el que el anticuerpo de detección se usa para la detección de anticuerpo sonda unido. En una realización preferida, el anticuerpo de detección es un anticuerpo monoclonal anti-IgG humana de ratón. Este procedimiento se ilustra en la figura 1.

En la realización ilustrativa presentada en la figura 1, se acopla cada anticuerpo de referencia a una perla con espectro de emisión distinto, en la que el anticuerpo de referencia se acopla a través de un anticuerpo de captura monoclonal anti-ser humano de ratón, formando un anticuerpo de referencia marcado de manera única. Se coloca el conjunto completo de anticuerpos de referencia marcados de manera única en el pocillo de una placa de microtitulación de múltiples pocillos. Se incuba el conjunto de anticuerpos de referencia con antígeno, y entonces se añade un anticuerpo sonda al pocillo. Un anticuerpo sonda se unirá sólo a un antígeno que esté unido a un anticuerpo de referencia que reconozca un epítopo diferente. La unión de un anticuerpo sonda al antígeno formará un complejo que consiste en un anticuerpo de referencia acoplado a una perla a través de un anticuerpo de captura, el antígeno y el anticuerpo sonda unido. Se añade un anticuerpo de detección marcado para detectar el anticuerpo sonda unido. En este caso, el anticuerpo de detección se marca con biotina, y se detecta el anticuerpo sonda unido mediante la interacción de estreptavidina-PE y el anticuerpo de detección biotinilado. Tal como se muestra en la figura 1, se usa el anticuerpo nº 50 como anticuerpo sonda, y los anticuerpos de referencia son el anticuerpo nº 50 y el anticuerpo nº 1. El anticuerpo sonda nº 50 se unirá al antígeno que se une al anticuerpo de referencia nº 1 porque los anticuerpos se unen a diferentes epítopos, y puede detectarse un complejo marcado. El anticuerpo sonda nº 50 no se unirá al antígeno que se une al anticuerpo de referencia nº 50 porque ambos anticuerpos compiten por el mismo epítopo, de modo que no se forma complejo marcado.

En esta realización, tras completar las etapas de incubación, se alinean las perlas de un pocillo dado en una única fila en una cubeta y una perla pasa al mismo tiempo a través de dos láseres. El primer láser excita los fluorocromos incrustados en las perlas, identificando qué anticuerpo de referencia está unido a cada perla. Un segundo láser excita las moléculas fluorescentes unidas al complejo de perlas, lo que cuantifica la cantidad de anticuerpo de detección unido y por tanto, la cantidad de anticuerpo sonda unido al antígeno sobre un complejo de anticuerpo de referencia-perla. Cuando se mide una señal fuerte para el anticuerpo de detección sobre una perla, eso indica que los anticuerpos de referencia y sonda unidos a esa perla están unidos a sitios diferentes sobre el antígeno y por tanto reconocen epítopos diferentes en el antígeno. Cuando se mide una señal débil para el anticuerpo de detección unido sobre una perla, eso indica que los anticuerpos de referencia y sonda correspondientes compiten por el mismo epítopo. Eso se ilustra en la figura 1. Una ventaja clave de esta realización es que puede llevarse a cabo en un modo de alto rendimiento, de manera que pueden realizarse simultáneamente múltiples ensayos de competición en un único pocillo, ahorrando tanto tiempo como recursos.

El ensayo descrito en el presente documento puede incluir mediciones de al menos un parámetro adicional de las propiedades de reconocimiento de epítopo de anticuerpos primarios y secundarios que están caracterizándose, por ejemplo el efecto de la temperatura, concentración iónica, disolventes (incluyendo detergente) o cualquier otro factor de interés. Un experto en la técnica relevante puede usar la presente descripción para desarrollar un diseño experimental que permita someter a prueba al menos un factor adicional. Si es necesario, pueden llevarse a cabo múltiples duplicados de un ensayo, en los que se varían factores tales como la temperatura, concentración iónica, disolvente u otros según el diseño experimental. Cuando se someten a prueba factores adicionales, pueden ajustarse los métodos de análisis de datos en consecuencia para incluir los factores adicionales en el análisis.

Análisis de datos

Otro aspecto de la presente invención proporciona procedimientos para analizar datos generados a partir de al menos un ensayo, preferiblemente a partir de al menos un ensayo de alto rendimiento, con el fin de identificar anticuerpos que tienen propiedades de reconocimiento de epítopo similares o distintas. Un enfoque comparativo, basado en la comparación de las propiedades de reconocimiento de epítopo de una colección de anticuerpos, permite la identificación de aquellos anticuerpos que tienen propiedades de reconocimiento de epítopo similares, que es probable que compitan por el mismo epítopo, así como la identificación de aquellos anticuerpos que tienen propiedades de reconocimiento de epítopo distintas, que es probable que se unan a diferentes epítopos. De esta forma, pueden clasificarse anticuerpos, o "combinarse", basándose en qué epítopo reconocen. Una realización preferida proporciona el procedimiento de reconocimiento del patrón competitivo (CPR) para analizar datos generados mediante un ensayo de alto rendimiento. Más preferiblemente, se usa el CPR para analizar datos generados mediante el ensayo competitivo de alto rendimiento combinación de anticuerpos competitiva multiplexada (MCAB). La aplicación de procedimientos de análisis de datos tal como se da a conocer y se reivindica en el presente documento hace posible eliminar la redundancia identificando las especificidades de unión distintas representadas dentro de un grupo de anticuerpos específicos de antígeno caracterizado mediante un ensayo tal como el ensayo de MCAB.

Una realización preferida de la presente invención proporciona un procedimiento que agrupa anticuerpos en "combinaciones" o categorías que representan especificidades de unión distintas para la diana de antígeno. Aún en otra realización preferida, se aplica el procedimiento de CPR a los datos que representan los resultados del ensayo de competición de alto rendimiento de MCAB en el que cada anticuerpo compite con todos los demás anticuerpos por los sitios de unión sobre las moléculas de antígeno. Las realizaciones llevadas a cabo usando conjuntos de datos diferentes de anticuerpos generados a partir de animales XenoMouse, proporcionan una demostración de que la aplicación del procedimiento de la presente invención produce resultados coherentes y reproducibles.

El análisis de los datos generados a partir de un experimento implica normalmente operaciones de múltiples etapas para normalizar datos a través de diferentes pocillos en los que se ha llevado a cabo el ensayo y agrupar datos identificando y clasificando los patrones de competición de los anticuerpos sometidos a prueba. Entonces se realiza un procedimiento informático basado en matrices para agrupar anticuerpos basándose en la similitud de sus patrones de competición, en el que se aplica el procedimiento para clasificar conjuntos de anticuerpos, preferiblemente anticuerpos generados a partir de células de hibridoma.

Los anticuerpos que se agrupan basándose en la similitud de sus patrones de competición se considera que se unen al mismo epítopo o epítopos similares. Estas agrupaciones pueden presentarse opcionalmente en formato de matriz, o en formato de "árbol" como un dendrograma, o en un formato legible por ordenador, o en cualquier formato compatible con un dispositivo de entrada de datos. La información con respecto a las agrupaciones puede capturarse a partir de una matriz, un dendrograma o mediante un ordenador u otro dispositivo informático. La captura de datos puede ser visual, manual, automatizada o cualquier combinación de los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, el término "combinación" puede usarse como nombre para referirse a agrupaciones de anticuerpos identificadas como que tienen una competición similar según los métodos de la presente invención. El término "combinación" también puede usarse como verbo para referirse a la puesta en práctica de los métodos de la presente invención. El término "ensayo de unión a epítopo" tal como se usa en el presente documento, se refiere al ensayo basado en competición descrito en el presente documento, e incluye cualquier análisis de datos producidos mediante el ensayo.

Se describen en detalle las etapas del análisis de datos en la siguiente descripción, y se proporciona una orientación práctica mediante la referencia a los datos y resultados presentados en el ejemplo 2. Las referencias a los datos del ejemplo 2, especialmente las matrices o dendrogramas generados realizando diversas etapas de análisis de datos sobre los datos de entrada del ejemplo 2, sirven simplemente como ilustraciones y no limitan el alcance de la presente invención de ningún modo.

Cuando se genera un gran número y tamaños de los conjuntos de datos, se necesita un método sistemático para analizar las matrices de las intensidades de señal para determinar qué anticuerpos tienen patrones de intensidad de señal similares. A modo de ejemplo, se generan dos matrices que contienen m filas y m columnas en un único experimento, en el que m es el número de anticuerpos que están examinándose. Una matriz tiene intensidades de señal para el conjunto de ensayos de competición en el que está presente el antígeno. La segunda matriz tiene las intensidades de señal correspondientes para un experimento de control negativo en el que está ausente el antígeno. Cada fila de una matriz representa un único pocillo de una placa de microtitulación de múltiples pocillos, que identifica un único anticuerpo sonda. Cada columna representa un único código espectral de perla, que identifica un único anticuerpo de referencia. La intensidad de la señal detectada en cada celda de una matriz representa el resultado de un ensayo de competición individual que implica un anticuerpo de referencia y un anticuerpo sonda. La última fila de la matriz corresponde al pocillo en el que se añade el tampón de bloqueo en lugar de un anticuerpo sonda. De manera similar, la última columna de la matriz corresponde al código espectral de perla al que se añade tampón de bloqueo en lugar de anticuerpo de referencia. El tampón de bloqueo sirve como control negativo y determina la cantidad de señal presente cuando sólo está presente un anticuerpo (del par de anticuerpo de referencia-anticuerpo sonda).

Los patrones del valor de intensidad de señal similares para dos filas indican que los dos anticuerpos sonda presentan comportamientos de unión similares, y por tanto compiten probablemente por el mismo epítopo. Asimismo, los patrones de intensidad de señal similares para dos columnas indican que los dos anticuerpos de referencia presentan comportamientos de unión similares, y por tanto compiten probablemente por el mismo epítopo. Los anticuerpos con patrones de señal distintos probablemente se unen a epítopos diferentes. Los anticuerpos pueden agruparse, o "combinarse", según el epítopo al que reconocen, agrupando entre sí filas con patrones de señal similares o agrupando entre sí columnas con patrones de señal similares. Tal ensayo descrito anteriormente se denomina ensayo de combinación por epítopos.

Programa para aplicar procedimientos de reconocimiento del patrón competitivo (CPR)

Un aspecto de la presente invención proporciona un programa para aplicar el procedimiento de CPR que tiene dos etapas principales: (1) normalización de las intensidades de señal; y (2) generación de matrices de disimilitud y agrupación de anticuerpos basándose en sus intensidades de señal normalizadas. Se entiende que la expresión "etapa principal" abarca múltiples etapas que pueden llevarse a cabo según sea necesario, dependiendo de la naturaleza del material experimental usado y la naturaleza del análisis de datos deseado. También se entiende que pueden ponerse en práctica etapas adicionales como parte de la presente invención.

Normalización para el fondo de las intensidades de señal

Los datos de entrada se someten a una serie de etapas de procesamiento previo que mejoran la capacidad de detectar patrones significativos. Preferiblemente, los datos de entrada comprenden intensidades de señal almacenadas en una matriz bidimensional, y se lleva a cabo una serie de etapas de normalización para eliminar fuentes de ruido o sesgos de la señal antes del análisis de agrupamiento.

Los datos de entrada que van a analizarse comprenden los resultados de un ensayo completo de propiedades de reconocimiento de epítopo. Preferiblemente, los resultados comprenden intensidades de señal medidas a partir de un ensayo llevado a cabo usando anticuerpos secundarios marcados. Más preferiblemente, se analizan los resultados usando el ensayo de MCAB tal como se describe en el presente documento. Se generan dos archivos de entrada: un archivo de entrada a partir de un ensayo en el que se añadió antígeno; y un segundo archivo de entrada a partir de un ensayo en el que estaba ausente el antígeno. El experimento en el que estaba ausente el antígeno sirve como control negativo que permite cuantificar la cantidad de unión de los anticuerpos marcados que no es al antígeno. Preferiblemente, se sometió a ensayo cada combinación de anticuerpo primario y anticuerpo secundario que está sometiéndose a prueba en presencia y ausencia de antígeno, de manera que cada combinación está representada en ambos conjuntos de datos de entrada. Incluso más preferiblemente, el ensayo se lleva a cabo usando los procedimientos para someter a ensayo propiedades de reconocimiento de epítopo de múltiples anticuerpos usando un formato de múltiples pocillos dado a conocer en otra parte en la presente descripción.

Los datos de entrada comprenden normalmente intensidades de señal almacenadas en una matriz bidimensional. En primer lugar, la matriz correspondiente al experimento sin antígeno (control negativo), A_{B}, se resta de la matriz correspondiente al experimento con antígeno, A_{E}, para dar la matriz normalizada para el fondo dada por A_{N} = A_{E} - A_{B}. Esta etapa de resta elimina la señal de fondo que no se debe a la unión de anticuerpos al antígeno. Las matrices anteriores son de dimensión (m + 1) X (m +1) en la que m es el número de anticuerpos que van a agruparse. La última fila y la última columna contienen valores de intensidad para experimentos en los que se añadió tampón de bloqueo en lugar de un anticuerpo sonda o anticuerpo de referencia, respectivamente.

En una realización ilustrativa, la figura 8A y 8B ilustra las matrices de intensidad generadas en la realización dada a conocer en el ejemplo 2, que se usan como matrices de datos de entrada para etapas posteriores en el análisis de datos. La figura 8A es la matriz de intensidad para un experimento realizado con antígeno, y la figura 8B es la matriz de intensidad para el mismo experimento realizado sin antígeno. Cada fila de la matriz corresponde a las intensidades de señal para las diferentes perlas de un pocillo, en el que cada pocillo representa un único anticuerpo de detección. Cada columna representa las intensidades de señal correspondientes a la competición de un único anticuerpo primario con cada uno de los anticuerpos secundarios. Cada celda de la matriz representa un ensayo de competición individual para un par diferente de anticuerpos primario y secundario. En ensayos de propiedades de reconocimiento de epítopo, la adición de tampón de bloqueo en lugar de uno de los anticuerpos sirve como control negativo. En la realización ilustrada por las figuras 8A y 8B, la última fila de la matriz corresponde al pocillo en el que se añade tampón de bloqueo en lugar de un anticuerpo secundario, y la última columna de la matriz corresponde a las perlas a las que se añade tampón de bloqueo en lugar de anticuerpo primario. Pueden usarse otras disposiciones de las celdas dentro de una matriz para poner en práctica aspectos de la presente invención, de modo que un experto en la técnica relevante puede diseñar matrices de datos que tienen otros formatos y adaptar posteriores manipulaciones de estas matrices de datos para que reflejen el formato particular elegido.

Puede generarse una matriz diferente restando la matriz correspondiente a los valores obtenidos a partir del experimento sin antígeno de la matriz correspondiente a los valores obtenidos a partir del experimento con antígeno. Esta etapa se realiza para restar de la señal total la cantidad de señal que no se atribuye a la unión del anticuerpo sonda marcado al antígeno. Esta etapa de resta genera una matriz de diferencias tal como se ilustra en la figura 9. Tras esta resta, se señala cualquier anticuerpo que tenga intensidades excepcionalmente altas para sus valores diagonales en relación con los otros valores diagonales. Valores altos para una columna tanto a lo largo como fuera de la diagonal sugieren que los datos asociados con esta perla particular pueden no ser fiables. Los anticuerpos correspondientes a estas columnas se señalan en esta etapa y se consideran como combinaciones individuales.

Eliminación de señales de fondo debidas a unión no específica: normalización de intensidades de señal dentro de filas o columnas de la matriz

En algunos casos, hay una disparidad significativa en las intensidades de señal globales entre diferentes filas o columnas en la matriz de intensidad de señal normalizada por fondo. Las variaciones en filas se deben probablemente a variaciones en la intensidad entre pocillos, mientras que la variación en columnas se debe probablemente a la variación en las afinidades y concentraciones de diferentes anticuerpos sonda. Según un aspecto de la presente invención, a menudo hay una correlación lineal entre los valores de tampón de bloqueo de las filas o columnas y los valores de intensidad de señal promedio de las filas o columnas. Si se observa una variación de intensidad, se realiza una etapa adicional de normalización de fila y/o columna tal como se describe a continuación.

Normalización de filas. La normalización de filas se realiza cuando hay cualquier sesgo de señal específico de pocillo significativo, y se lleva a cabo para eliminar cualquier "artefacto de señal" que de otro modo se introduciría en el análisis de datos. Un experto en la técnica puede determinar si la etapa es deseable basándose en la distribución de valores de intensidad de los controles negativos de tampón de bloqueo. A modo de ilustración, en la figura 2A, se representa el valor de intensidad de tampón de bloqueo para cada fila frente al valor de intensidad promedio (excluyendo el valor de tampón de bloqueo) para la fila correspondiente. El diagrama en la figura 2A muestra una correlación lineal clara entre los valores de tampón de bloqueo y el valor de intensidad promedio para una fila. Esta figura muestra que hay un sesgo de señal específico de pocillo en las muestras que están analizándose, y que el valor de intensidad para el tampón de bloqueo se correlaciona con la intensidad de señal global dentro de una fila. Los diferentes sesgos de intensidad observados en las diferentes filas se deben probablemente en parte a la variación en la afinidad para los anticuerpos secundarios por el antígeno así como las variaciones de concentración de estos anticuerpos secundarios. Obsérvese que la figura 2B muestra que, para la misma realización, hay una correlación más débil entre los valores de intensidad del tampón de bloqueo para las columnas y los valores de intensidad de columna promedio.

Para las variaciones de intensidad en las filas, las intensidades de cada fila en la matriz se ajustan dividiendo cada valor en una fila entre el valor de intensidad del tampón de bloqueo para esa fila. En el caso en el que se carece de datos del tampón de bloqueo, cada valor de fila se divide entre el valor de intensidad promedio para la fila. En una realización que aplica el procedimiento CPR, la matriz normalizada por intensidad viene dada por

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en la que I es un vector que contiene las intensidades de tampón de bloqueo o promedio y k = i si la normalización se realiza con respecto a las filas.

Normalización de columnas. En esta etapa previa al procesamiento final, cada columna en la matriz con filas normalizadas (que no se señaló en la etapa en la que se generó la matriz diferencia) se divide entre su valor diagonal correspondiente. Las celdas a lo largo de la diagonal representan ensayos de competición para los que los anticuerpos primario y secundario son los mismos. De manera ideal, los valores a lo largo de la diagonal deben ser pequeños ya que dos copias del mismo anticuerpo deben competir por el mismo epítopo. La división de cada columna entre su diagonal correspondiente se realiza para medir cada intensidad con respecto a una intensidad que se sabe que refleja la competición (es decir, competición de un anticuerpo contra sí mismo).

Para las variaciones de intensidad en columnas, las intensidades de cada columna en la matriz se ajustan dividiendo cada valor en una columna entre el valor de intensidad del tampón de bloqueo para esa fila. En el caso en el que se carece de datos del tampón de bloqueo, cada valor de columna se divide entre el valor de intensidad promedio para la columna. En una realización que aplica el procedimiento CPR, la matriz normalizada por intensidad viene dada por

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en la que I es un vector que contiene las intensidades de tampón de bloqueo o promedio y k = j si la normalización se realiza con respecto a columnas.

Fijar valores umbral antes de la normalización de filas o columnas. Para evitar inflar artificialmente valores de señal bajos en esta etapa de normalización, todos los valores de tampón de bloqueo que son inferiores a un valor umbral mínimo definido por el usuario se señalan y después se ajustan al valor umbral definido por el usuario que representa el menor valor de intensidad de señal fiable, antes de la división de filas o columnas. Este umbral se fija basándose en un histograma de las intensidades de señal. Esta etapa de normalización compensa las variaciones de intensidad entre pocillos.

A modo de ejemplo, la figura 17 ilustra una matriz diferencia ajustada para los datos del ejemplo 2, en la que la menor intensidad de señal fiable se fija a 200 unidades de intensidad. Cada fila en la matriz se ajusta dividiéndola por el último valor de intensidad en la fila. Tal como se observó anteriormente, el último valor de intensidad en cada fila corresponde al valor de intensidad para perlas a las que se añade tampón de bloqueo en vez de anticuerpo primario. Esta etapa compensa la variación entre pocillos de valores de intensidad a lo largo de la fila. La figura 18 ilustra una matriz con filas normalizadas para los datos del ejemplo 2.

Adicionalmente a modo de ejemplo, la figura 2A presenta datos de una realización en la que el valor de intensidad de tampón de bloqueo para cada fila se representó frente al valor de intensidad promedio para la fila correspondiente. Este diagrama muestra una correlación lineal entre los valores de tampón de bloqueo y el valor de intensidad promedio para cada fila, y sugiere que hay sesgos de intensidad específicos para pocillos. Estos sesgos pueden deberse en parte a la variación en la afinidad para los anticuerpos sonda por el antígeno y las variaciones de concentración de los anticuerpos sonda. La figura 2B presenta datos de una realización en la que el valor de intensidad del tampón de bloqueo para cada columna se representó frente al valor de intensidad promedio para la columna correspondiente.

En otra realización ilustrativa, la figura 2C muestra un diagrama de dispersión de las intensidades de la matriz diferencia normalizada para el fondo representada frente a las intensidades para la matriz de resultados de una realización usando antígeno. Este diagrama muestra una correlación lineal estrecha (pendiente = 1) para valores de señal superiores a 1000, y una correlación más dispersa para valores de señal inferiores. Los puntos en la figura 2C están sombreados según el valor de una fracción calculada como la señal sustraída dividida entre la señal para el experimento con antígeno presente. Los valores de fracción menores (próximos a cero) corresponden a una alta contribución del fondo y tienen un sombreado claro en la figura 2C. Los valores de fracción mayores (próximos a 1) corresponden a una contribución de fondo menor y tienen un sombreado más oscuro. En la figura 2C, los valores de fracción menores están predominantemente en la región inferior izquierda del diagrama de dispersión, lo que sugiere que la contribución del fondo se vuelve menor para valores de señal sustraída superiores a 1000.

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El diagrama mostrado en la figura 2C sugiere que para esta realización, los valores de intensidad de la matriz normalizada para el fondo superiores a 1000 tienen una baja contribución de señal de fondo con respecto a la señal debida a la unión al antígeno. Estas celdas de matriz corresponden probablemente a pares de anticuerpos que no compiten por el mismo epítopo. Por el contrario, los valores de intensidad inferiores a 1000 corresponden probablemente a pares de anticuerpos que se unen al mismo epítopo. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se espera que los valores de intensidad a lo largo de la diagonal sean pequeños, ya que anticuerpos de referencia y sonda idénticos compiten por el mismo epítopo. En la realización ilustrada en la figura 2C, todos menos uno de los valores diagonales de la matriz de intensidad de señal normalizada para el fondo tienen valores de intensidad inferiores a 1000.

Normalización de intensidades de señal con respecto a la señal de nivel inicial para anticuerpos sonda

En una etapa final, se ajustan los datos dividiendo cada columna o fila entre su valor diagonal correspondiente para generar la matriz normalizada final que viene dada por

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De nuevo, para evitar inflar artificialmente los valores de señal bajos en esta etapa de normalización, todos los valores diagonales inferiores a un valor umbral mínimo definido por el usuario se ajustan al valor umbral antes de realizar la división diagonal. Esta etapa se realiza para todas las columnas o filas, excepto aquellas que tengan valores diagonales que son significativamente elevados con respecto a otros valores en la columna o fila. Esta etapa normaliza cada valor de intensidad con respecto a la intensidad correspondiente al ensayo de competición individual para el que los anticuerpos de referencia y sonda son los mismos. Este valor de intensidad debe ser bajo y de manera ideal refleja el valor de intensidad de señal de nivel inicial para la columna o fila, dado que dos anticuerpos idénticos deben competir por el mismo epítopo y por tanto no pueden unirse simultáneamente al mismo antígeno. Las columnas que tienen valores diagonales inhabitualmente grandes se identifican como datos aberrantes y se excluyen del análisis. Los valores de intensidad diagonal elevados pueden indicar que el antígeno tiene dos copias del mismo epítopo, por ejemplo, cuando el antígeno es un homodímero.

Análisis de reconocimiento de patrones: matrices de disimilitud

Según otro aspecto presente invención, una segunda etapa en el análisis de datos implica generar una matriz de disimilitud a partir de la matriz de intensidad normalizada en dos etapas. En primer lugar, se fijan a cero (y por tanto representan la competición) los valores de intensidad normalizados que están por debajo de un valor umbral definido por el usuario para el fondo y se fijan a 1 los valores restantes, indicando que los anticuerpos se unen a dos epítopos diferentes. En consecuencia, los valores de intensidad que son inferiores a la intensidad igual a este umbral multiplicada por el valor de intensidad del valor diagonal se consideran lo bastante bajos como para representar la competición para el mismo epítopo por el par de anticuerpos. Se calcula la matriz de disimilitud o matriz de distancia para un valor umbral a partir de la matriz de ceros y unos mediante la determinación del número de posiciones en las que difiere cada par de filas. La entrada en la fila i y la columna j corresponde a la fracción del número total de anticuerpos primarios que se diferencian en sus patrones de competición con los anticuerpos secundarios representados en las filas i y j.

A modo de ejemplo, la figura 14 muestra el número de posiciones (de un total de 22) en las que se diferencian los patrones para dos anticuerpos cualesquiera. En esta realización, se calculan las disimilitudes con respecto a filas en lugar de columnas porque las intensidades de fila ya se han ajustado para sesgos de intensidad específicos de pocillos y por tanto se han extraído los efectos indeseables de concentraciones y afinidades de anticuerpos secundarios desiguales. Además, las concentraciones y afinidades de anticuerpos primarios son coherentes entre filas. Sin embargo, para las columnas, no hay una tendencia coherente aparente entre la intensidad promedio y la intensidad de fondo lo que sugiere que no hay una forma obvia de extraer los efectos indeseables de las afinidades y concentraciones de anticuerpos primarios variables. Por tanto, la comparación de las señales entre columnas podría ser menos
válida.

Matriz de disimilitud usando CPR. En una realización que aplica el procedimiento de CPR, se genera una matriz umbral, A_{T}, de ceros y unos, tal como se describe a continuación. Se fijan a cero los valores normalizados que son inferiores o iguales a un valor umbral para indicar que los pares correspondientes de anticuerpos compiten por el mismo epítopo. La matriz umbral viene dada por

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Los valores de intensidad normalizados restantes se fijan a uno, y los valores representan pares de anticuerpos que se unen a diferentes epítopos.

La matriz de disimilitud se calcula a partir de la matriz umbral fijando el valor en la fila i y la columna j de la matriz de disimilitud a la fracción de las posiciones en las que se diferencian las dos filas, i y j de la matriz de ceros y unos. Una matriz de disimilitud para un valor umbral especificado, T, viene dada por

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en la que N_{1} es el número de unos presentes cuando se suman las filas i y j.

A modo de ejemplo, para la matriz mostrada en la tabla 1 a continuación, el valor de disimilitud correspondiente a las filas primera y segunda es de 0,4, porque el número de posiciones en las que se diferencian las dos filas es de 2 de 5. Para un experimento ideal, la matriz de disimilitud que se genera basándose en una comparación de filas de la matriz de intensidad de señal original, debe ser la misma que la matriz de disimilitud que se genera basándose en la comparación de columnas.

TABLA 1 Matriz usada para calcular valores de disimilitud

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Efecto de calcular matrices de disimilitud en múltiples valores umbral

Si se desea, se repite el procedimiento de generar matrices de disimilitud para valores umbral de fondo incrementados entre dos valores umbral definidos por el usuario, inclusive, que representan valores umbral inferior y superior para la intensidad (en los que el valor umbral es tal como se describió anteriormente). Se calcula el promedio de las matrices de disimilitud generadas a lo largo de un intervalo de valores umbral de fondo y se usa como entrada para el algoritmo de agrupación. El procedimiento de calcular el promedio a lo largo de varios umbrales se realiza para minimizar la sensibilidad de la matriz de disimilitud final frente a cualquier elección particular del valor umbral. El efecto de la variación del valor umbral sobre la disimilitud aparente se ilustra en la figura 4, que muestra la fracción de disimilitudes para un par de anticuerpos (2.1 y 2.25) como función del valor umbral para valores umbral que oscilan entre 1,5 y 2,5. A medida que el valor umbral cambia desde 1,8 hasta 1,9 la cantidad de disimilitud entre los patrones de señal para los dos anticuerpos cambia sustancialmente desde el 15% hasta casi el 0%. Esta figura muestra cómo la cantidad de disimilitud entre los patrones de señal para un par de anticuerpos puede ser sensible a una elección particular para un valor límite, ya que puede variar sustancialmente para diferentes valores umbral. La sensibilidad se atenúa tomando el valor de disimilitud promedio a lo largo de un intervalo de diferentes valores umbral.

Cálculo de matrices de disimilitud en múltiples valores umbral usando CPR. En una realización preferida, el procedimiento de calcular matrices de disimilitud usando CPR se repite para varios valores umbral incrementales dentro de un intervalo de valores definido por el usuario. Se calcula el promedio de estas matrices de disimilitud y se usa como entrada para la etapa de agrupación en la que se calcula el promedio como

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en la que N_{T} es el número de umbrales diferentes de los que debe calcularse el promedio.

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Este procedimiento de calcular el promedio a lo largo de varios umbrales se realiza para minimizar la sensibilidad de la matriz de disimilitud frente a un valor límite particular para el umbral.

Matrices de disimilitud a partir de múltiples experimentos

Si hay conjuntos de datos de entrada para más de un experimento, en primer lugar se generan matrices de intensidad normalizadas tal como se describió anteriormente para cada experimento individual. Después se fijan a este valor umbral los valores normalizados por encima de un valor umbral (normalmente fijados a 4). El fijar los valores de intensidad elevada al valor umbral se realiza para evitar que cualquier valor de intensidad individual tenga demasiado peso cuando se calculen los valores de intensidad normalizados promedio para esa celda. La matriz de intensidad promedio se calcula tomando promedios individuales de todos los puntos de datos para cada par de anticuerpos del grupo que consiste en anticuerpos que están en al menos uno de los conjuntos de datos de entrada. Se señalan los pares de anticuerpos para los que no hay valores de intensidad. La generación de la matriz de disimilitud es tal como se describió anteriormente con la excepción de que la entrada en la fila i y columna j corresponde a la fracción de las posiciones en las que se diferencian las dos filas, i y j, del número total de posiciones para las que ambas filas tienen un valor de intensidad. Si las dos filas no tienen tales posiciones, entonces el valor de disimilitud se fija de manera arbitraria elevado y se señala.

Agrupación de anticuerpos basándose en sus intensidades de señal normalizadas

Otro aspecto de la presente invención proporciona procedimientos para agrupar anticuerpos basándose en sus intensidades de señal normalizadas, usando diversos enfoques informáticos para identificar patrones subyacentes en datos complejos. Preferiblemente, cualquiera de tales procedimientos utiliza enfoques informáticos desarrollados para agrupar puntos en un espacio multidimensional. Estos procedimientos pueden aplicarse directamente a datos experimentales para determinar patrones de unión a epítopos de conjuntos de anticuerpos considerando que los niveles de señales para los ensayos de competición n^{2} de n anticuerpos sonda en n anticuerpos de referencia tomados como muestra definen n puntos en un espacio de n dimensiones. Estos métodos pueden aplicarse directamente a la combinación por epítopos considerando que los niveles de señal para los ensayos de competición de cada anticuerpo secundario con todos de los n anticuerpos primarios diferentes definen un punto en un espacio de n dimensiones.

Los resultados del análisis de agrupación pueden expresarse usando presentaciones visuales. Además, o como alternativa, los resultados del análisis de agrupación pueden recogerse y almacenarse independientemente de cualquier presentación visual. Las presentaciones visuales son útiles para comunicar los resultados de un ensayo de combinación por epítopos a al menos una persona. La presentación visual también puede usarse como medio para proporcionar datos cuantitativos para su recogida y almacenamiento. En una realización preferida, se presentan agrupaciones en un formato de matriz y se recoge información referente a las agrupaciones a partir de una matriz. Las celdas de una matriz pueden tener intensidades diferentes de sombreado o patrón para indicar el valor numérico de cada celda; alternativamente, las celdas de una matriz pueden tener un código de colores para indicar el valor numérico de cada celda. En otra realización preferida, se presentan agrupaciones como dendrogramas o "árboles" y se recoge información referente a agrupaciones a partir de un dendrograma basándose en la longitud de una rama y la altura (distancia) de las ramas. Aún en otra realización preferida, se identifican agrupaciones mediante medios automatizados, y se recoge información referente a agrupaciones mediante un procedimiento de análisis de datos automatizado usando un ordenador o cualquier dispositivo de introducción de datos.

Un enfoque que ha demostrado ser valioso para el análisis de grandes conjuntos de datos biológicos es la agrupación jerárquica (Eisen et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14863-14868). Aplicando este método, pueden forzarse anticuerpos en una jerarquía estricta de subconjuntos anidados basándose en sus valores de disimilitud. En una realización ilustrativa, en primer lugar se agrupa el par de anticuerpos con el menor valor de disimilitud. A continuación se agrupa el par o agrupación/agrupaciones de anticuerpos con el siguiente menor valor de (o disimilitud promedio). Este procedimiento se repite de manera iterativa hasta que queda una agrupación. De esta manera, los anticuerpos se agrupan según lo similares que son sus patrones de competición, en comparación con otros anticuerpos. En una realización, se agrupan anticuerpos en un dendrograma (a veces denominado un "árbol filogenético") cuyas longitudes de rama representan el grado de similitud entre los patrones de unión de los dos anticuerpos. Longitudes de rama largas entre dos anticuerpos indican que probablemente se unen a epítopos diferentes. Longitudes de rama cortas indican que los dos anticuerpos probablemente compiten por el mismo epítopo.

En una realización preferida, se agrupan los anticuerpos correspondientes a las filas en la matriz mediante agrupación jerárquica basándose en los valores en la matriz de disimilitud promedio usando una subrutina de anidación por aglomeración que incorpora la métrica Manhattan con una matriz de disimilitud de entrada de la matriz de disimilitud promedio. En una realización especialmente preferida, se agrupan anticuerpos mediante agrupación jerárquica basándose en los valores en la matriz de disimilitud promedio usando la subrutina de anidación por aglomeración SPLUS 2000 usando la métrica Manhattan con una matriz de disimilitud de entrada de la matriz de disimilitud promedio. (SPLUS 2000 Statistical Analysis Software, Insightful Corporation, Seattle, WA).

Según otro aspecto de la presente invención, el grado de similitud entre dos dendrogramas proporciona una medición de la auto-coherencia del análisis realizado por un programa aplicando el procedimiento CPR. Una teoría no limitativa referente a la similitud y coherencia predice que un dendrograma generado agrupando filas y un dendrograma generado agrupando columnas de la misma matriz de intensidad de señal normalizada para el fondo deben ser idénticos, o casi, porque: si el anticuerpo nº 1 y el anticuerpo nº 2 compiten por el mismo epítopo, entonces la intensidad debe ser baja cuando el anticuerpo nº 1 es el anticuerpo de referencia y el anticuerpo nº 2 es el anticuerpo sonda, así como cuando el anticuerpo nº 2 es el anticuerpo de referencia y el anticuerpo nº 1 es el anticuerpo sonda. Igualmente, cuando los dos anticuerpos se unen a epítopos diferentes, las intensidades deben ser uniformemente elevadas. Mediante este razonamiento, el grado de similitud entre dos filas de la matriz de intensidad de señal debe ser el mismo que entre dos columnas de la matriz de similitud. Un alto nivel de autocoherencia entre la agrupación de filas y la agrupación de columnas sugiere que, para un experimento dado, el protocolo experimental descrito en el presente documento, puesto en práctica con el programa para aplicar el procedimiento de la presente invención, produce resultados robustos.

Según un aspecto adicional de la presente invención, el grado de solapamiento entre dos epítopos también puede deducirse basándose en las longitudes de las ramas más largas que conectan las agrupaciones en un dendrograma. Por ejemplo, si un antígeno diana tiene dos epítopos distintos, completamente no solapantes, entonces se esperará que un anticuerpo que se une a uno de los epítopos tenga un patrón de intensidad de señal opuesto al de un anticuerpo que se une a otro epítopo. Según este razonamiento, si los sitios de unión no son solapantes, los patrones de señal para el conjunto de anticuerpos que se unen a un epítopo deben estar completamente anticorrelacionados con el patrón de señal para el conjunto de anticuerpos que reconocen el otro epítopo. Por tanto, los valores de disimilitud que están próximos a uno (1) para dos agrupaciones diferentes sugieren que los epítopos correspondientes no interfieren entre sí ni se solapan en sus sitios de unión sobre el antígeno.

La realización descrita en el ejemplo 2 a continuación demuestra cómo pueden presentarse los resultados de agrupación como un dendrograma (figura 5) o en forma de matriz (figuras 16 y 17). Los puntos de datos (valores de anticuerpos frente a la diana ANTIGEN14) se agruparon en un dendrograma cuyas longitudes de rama representan el grado de similitud entre dos anticuerpos, en el que el dendrograma se generó usando el módulo de anidación por aglomeración del software de análisis estadístico SPLUS 2000. Para facilitar la comparación, en la figura 16 y 17, el orden de los anticuerpos en filas y columnas de las matrices es el mismo que el orden de los anticuerpos según se presentan de izquierda a derecha en el dendrograma en la figura 5. Las celdas individuales están codificadas de manera visual mediante celdas sombreadas según su valor numérico. En la figura 16, las celdas con valores inferiores a un valor umbral inferior tienen un sombreado más oscuro. Las celdas con valores inferiores a un umbral inferior y un umbral superior no están sombreadas. Las celdas con valores superiores al umbral superior tienen un sombreado más claro. Un bloque que tiene celdas que no están sombreadas o tienen un sombreado más oscuro indica que todos los anticuerpos correspondientes a ese bloque reconocen el mismo epítopo. Las celdas con sombreado más claro corresponden a anticuerpos que reconocen epítopos diferentes. En la figura 17, las celdas son los valores de intensidad normalizados y también tienen códigos visuales según su valor. Las celdas que tienen un sombreado más claro tienen intensidades inferiores a un umbral inferior, las celdas sin sombreado tienen intensidades entre un umbral inferior y uno superior, mientras que las celdas con un sombreado más oscuro tienen intensidades superiores a un umbral superior. Una celda con un sombreado más claro indica que los anticuerpos en su fila y columna correspondientes compiten por el mismo epítopo (ya que la intensidad es baja). Una celda más oscura corresponde a una intensidad superior y es indicativa de que los anticuerpos en la fila y columna correspondientes se unen a epítopos diferentes.

Los resultados de esta realización ilustrativa (ejemplo 2) indican que los procedimientos de la presente invención proporcionan un alto nivel de autocoherencia para los datos con respecto a revelar si dos anticuerpos compiten o no por el mismo epítopo. La simetría del sombreado en las figuras 16 y 17 con respecto a la diagonal muestra claramente esta autocoherencia. El motivo es que los anticuerpos en la fila A y la columna B son el mismo par que en la fila B y la columna A. Por tanto, si el par de anticuerpos compite por el mismo epítopo, entonces la intensidad debe ser baja tanto cuando el anticuerpo A es el anticuerpo primario y el anticuerpo B es el anticuerpo secundario, como cuando el anticuerpo B es el anticuerpo primario y el anticuerpo B es el anticuerpo secundario. Por tanto, la intensidad para la celda de la fila i y la columna j así como la de la fila j y la columna i deben ser bajas. Igualmente, si estos dos anticuerpos reconocen epítopos diferentes, entonces ambas intensidades correspondientes deben ser altas. De los aproximadamente 200 pares de celdas en la figura 17, sólo un par mostró una discrepancia en la que un miembro del par tenía una intensidad inferior a 1,5 mientras que el otro miembro tenía una intensidad superior a 2,5. El nivel de autocoherencia de las matrices normalizadas resultantes producidas mediante el algoritmo proporciona una medición de la fiabilidad tanto de los datos generados como del análisis mediante el algoritmo de los datos. El alto nivel de autocoherencia para el conjunto de datos (superior al 99%) de anticuerpos frente a la diana ANTIGEN14 sugiere que los procedimientos de análisis de datos dados a conocer y reivindicados en el presente documento generan resultados fiables.

Agrupación de anticuerpos a partir de múltiples experimentos

Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para combinar conjuntos de datos para superar las limitaciones de sistemas experimentales usados para seleccionar anticuerpos. Realizando múltiples experimentos en los que cada experimento tiene al menos x anticuerpos en común con otro experimento, y proporcionando los múltiples conjuntos de datos resultantes como entrada para el procedimiento de agrupación, debe poderse agrupar de manera fiable cantidades muy grandes de anticuerpos. Teniendo un conjunto de m anticuerpos en común entre los m experimentos, se vuelve posible deducir a qué agrupación es probable que pertenezcan los anticuerpos aunque no se sometan a prueba frente a todos los demás anticuerpos. Esto sugiere que usando este método para el análisis de datos con múltiples conjuntos de datos, puede ser posible lograr un rendimiento incluso superior con menos ensayos.

A modo de ejemplo, la tecnología Luminex proporciona 100 fluorocromos únicos, de modo que es posible estudiar 100 anticuerpos como máximo en un único experimento. La coherencia de los resultados producidos por la etapa de agrupación para conjuntos de datos individuales y el conjunto de datos combinados indican que puede deducirse qué epítopo se reconoce por qué anticuerpo, incluso si el epítopo y/o el anticuerpo no se someten a prueba frente a todos los demás anticuerpos. En una realización preferida, puede usarse el procedimiento CPR para caracterizar los patrones de unión de más de 100 anticuerpos realizando múltiples experimentos usando conjuntos de anticuerpos solapantes. Diseñando experimentos de una manera tal que cada experimento tiene un conjunto de anticuerpos en común con los otros experimentos, la matriz promedio combinada no le faltará ningún dato.

Un aspecto adicional proporciona que los resultados del análisis de datos para un conjunto de anticuerpos dado son útiles para ayudar al diseño racional de experimentos posteriores. Por ejemplo, si un conjunto de datos para un primer experimento muestra que aparecen agrupaciones bien definidas, entonces el conjunto de anticuerpos para un segundo experimento debe incluir anticuerpos representativos del primer conjunto de anticuerpos así como anticuerpos no sometidos a prueba. Este enfoque garantiza que cada conjunto de anticuerpos tiene material suficiente para definir los dos epítopos, y que los conjuntos se solapan de manera suficiente para permitir la comparación entre conjuntos. Comparando los patrones de competición de un conjunto de anticuerpos no sometidos prueba en el segundo experimento con un conjunto muestra de anticuerpos conocidos del primer experimento, debe poderse determinar si los anticuerpos no sometidos a prueba reconocen o no el/los mismo(s) epítopo(s) que el primer conjunto de anticuerpos. Este diseño experimental solapante permite una comparación fiable de los patrones de competición del primer conjunto con el segundo conjunto de anticuerpos, para determinar si los anticuerpos en el segundo experimento reconocen epítopos existentes, o si reconocen uno o más epítopos completamente novedosos. Además, pueden diseñarse experimentos de manera iterativa de una manera óptima, de manera que pueden someterse a prueba múltiples conjuntos de anticuerpos frente a agrupaciones existentes y nuevas.

Análisis de datos de múltiples experimentos

Los resultados de la realización descrita en el ejemplo 3 a continuación, usando anticuerpos frente a la diana ANTIGEN39, demuestran que los procedimientos dados a conocer y reivindicados en el presente documento son adecuados para analizar datos de múltiples experimentos. En esta realización, se sometieron a prueba anticuerpos frente al ANTIGEN39 para determinar su unión a antígeno ANTIGEN39 de superficie celular, en el que el antígeno ANTIGEN39 es una proteína de superficie celular. En primer lugar, se generaron matrices de intensidad normalizadas para cada experimento individual, en las que los valores normalizados superiores a un valor umbral seleccionado se fijan al valor umbral seleccionado para evitar que cualquier valor de intensidad normalizado individual tenga demasiada influencia sobre el valor promedio para ese par de anticuerpos. Se generó una única matriz normalizada a partir de matrices normalizadas individuales tomando el promedio de los valores de intensidad normalizados a lo largo de todos los experimentos para cada par de anticuerpos para los que había datos disponibles. Después se generó una única matriz de disimilitud tal como se describió anteriormente, con la excepción de que la fracción de las posiciones en las que se diferencian dos filas, i y j, sólo considera el número de posiciones para las que ambas filas tienen un valor de intensidad.

Para cinco experimentos usando anticuerpos frente al ANTIGEN39, los resultados de agrupación para los cinco conjuntos de datos de entrada mostraron que había un gran número de agrupaciones de diversos grados de similitud, lo que sugiere la presencia de varios epítopos diferentes, algunos de los cuales pueden solaparse. Esto se muestra en la figura 6A, la figura 18, la figura 19 y la figura 30. Por ejemplo, la agrupación que contiene los anticuerpos 1.17, 1.55, 1.16, 1.11 y 1.12 y la agrupación que contiene los 1.21, 2.12, 2.38, 2.35 y 2.1 están relacionadas de manera bastante estrecha, ya que cada par de anticuerpos muestra una diferencia no superior al 25%, con la excepción de 2.35 y 1.11. Este alto grado de similitud entre las dos agrupaciones sugirió que los dos epítopos diferentes pueden tener un alto grado de similitud.

Los cinco conjuntos de datos de experimentos separados usando anticuerpos frente al ANTIGEN39 también se agruparon independientemente, para demostrar que los procedimientos dados a conocer y reivindicados en el presente documento produce resultados de agrupación coherentes. Los resultados de agrupación se resumen en las figuras 6B-6F y en las figuras 20-30, en las que la figura 30 resume las agrupaciones para cada uno de los conjuntos de datos individuales y para el conjunto de datos combinados con todos los anticuerpos para los cinco experimentos. La figura 6B muestra el dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 1: anticuerpos 1.12, 1.63, 1.17, 1.55 y 2.12 agrupados de manera coherente entre sí en este experimento así como en otros experimentos al igual que los anticuerpos 1.46, 1.31, 2.17 y 1.29. La figura 6C muestra el dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 2: anticuerpos 1.57 y 1.61 agrupados de manera coherente entre sí en este experimento así como en otros experimentos.

La figura 6D muestra el dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 3: anticuerpos 1.55, 1.12, 1.17, 2.12, 1.11 y 1.21 agrupados de manera coherente entre sí en este experimento así como en otros experimentos. La figura 6E muestra el dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 4: anticuerpos 1.17, 1.16, 1.55, 1.11 y 1.12 agrupados de manera coherente entre sí en este experimento así como en otros experimentos al igual que los anticuerpos 1.31, 1.46, 1.65 y 1.29, así como los anticuerpos 1.57 y 1.61. La figura 6F muestra el dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 5: anticuerpos 1.21, 1.12, 2.12, 2.38, 2.35 y 2.1 agrupados de manera coherente entre sí en este experimento así como en otros experimentos.

En general, el algoritmo de agrupación produjo resultados coherentes tanto entre los experimentos individuales como entre los conjuntos de datos combinados e individuales. Los anticuerpos que se agrupan entre sí o están en agrupaciones vecinas para múltiples conjuntos de datos individuales también se agrupan entre sí o están en agrupaciones vecinas para el conjunto de datos combinados. Por ejemplo, las celdas que tienen un sombreado más claro indican anticuerpos que se agrupan de manera coherente entre sí en el conjunto de datos combinados y en todos los conjuntos de datos en los que están presentes (experimentos 1, 3, 4 y 5). Estos resultados indican que el algoritmo produce resultados de agrupación coherentes tanto entre múltiples experimentos individuales como que conserva la coherencia tras combinar conjuntos de datos múltiples.

Finalmente, hay un alto nivel de autocoherencia para los datos con respecto a revelar si dos anticuerpos compiten o no por el mismo epítopo. El porcentaje de pares de anticuerpos para los que los datos revelan de manera coherente si compiten o no por el mismo epítopo se resume para cada conjunto de datos en la tabla 2, a continuación, que revela que la coherencia fue de casi el 90% para cuatro de los cinco conjuntos de datos individuales así como para el conjunto de datos combinados.

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TABLA 2 Valores de coherencia en porcentaje para experimentos de anticuerpos frente al ANTIGEN39

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8

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Coherencia de resultados de combinación por epítopos con resultados de citometría de flujo (FAGS)

Los resultados de la realización descrita en el ejemplo 3 a continuación, usando anticuerpos frente a la diana ANTIGEN39, demuestran adicionalmente que los resultados generados mediante combinación por epítopos según los métodos de la presente invención son coherentes con los resultados generados usando citometría de flujo (citometría de flujo activada por fluorescencia, FACS). Se clasificaron las células que expresaban ANTIGEN39 mediante FACS, y se usaron células negativas para ANTIGEN39 como controles negativos también clasificadas mediante FACS. Los sitios de unión de superficie celular reconocidos por los anticuerpos de diferentes combinaciones representan epítopos diferentes. La figura 3 muestra una comparación de los resultados de experimentos con anticuerpos usando el anticuerpo anti-ANTIGEN39, con resultados usando FACS. Tal como se muestra en la figura 3, los anticuerpos en una combinación dada o bien son todos positivos (combinaciones 1, 4, 5) o bien todos negativos (combinaciones 2 y 3) en FACS, lo que indica que el ensayo de unión a epítopos de anticuerpos combina realmente los anticuerpos basándose en sus propiedades de unión a epítopos. Por tanto, la unión a epítopos, tal como se describe en el presente documento, proporciona un método eficaz, rápido y fiable para determinar las propiedades de reconocimiento de epítopos de anticuerpos, y clasificar y catalogar anticuerpos basándose en el epítopo que reconocen.

Procedimiento de análisis de datos alternativo y coherencia de la combinación por epítopos con los resultados de secuencia

Un procedimiento de análisis de datos alternativo implica restar la matriz de datos para el experimento llevado a cabo con antígeno a la matriz de datos para el experimento sin antígeno para generar una matriz de intensidad de fondo normalizada. Después se usa el valor en cada celda diagonal como valor de fondo para determinar la afinidad de unión del anticuerpo en la columna correspondiente. Las celdas en cada columna de la matriz de intensidad de fondo normalizada (la matriz restada) que tienen valores significativamente superiores al valor de la celda diagonal para esa columna, se resaltan o se indican de otro modo. Generalmente, un valor de aproximadamente dos veces la diagonal correspondiente se considera "significativamente superior", aunque un experto en la técnica puede determinar qué aumento con respecto al fondo es el umbral para "significativamente superior" en una realización particular, teniendo en cuenta los reactivos y condiciones usados, y el "ruido" de los datos introducidos. Las columnas con patrones de unión similares se agrupan como una combinación, y las diferencias minoritarias dentro de la combinación se identifican como subcombinaciones. Este análisis de datos puede llevarse a cabo de manera automática para un conjunto dado de datos de entrada. Por ejemplo, puede almacenarse datos de entrada en una aplicación de base de datos informática en la que las celdas en la diagonal se marcan automáticamente, y se resaltan las celdas en cada columna en comparación con los números en la diagonal, y se agrupan las columnas con patrones de unión
similares.

En una realización preferida usando cincuenta y dos (52) anticuerpos frente al ANTIGEN54, los resultados de combinación usando el procedimiento de análisis de datos descrito anteriormente se correlacionaron con el análisis de secuencia de las regiones CDR de anticuerpos combinados usando el ensayo de anticuerpos competitivo MCAB. Los 52 anticuerpos consistieron en 2 ó 3 clones a partir de 20 líneas celulares. Tal como se esperaba, las secuencias de clones de la misma línea fueron idénticas, de modo que sólo se secuenció un clon representativo de cada línea. La correspondencia entre los resultados de combinación por epítopos y el análisis de secuencia de anticuerpos combinados mediante este método indica que este enfoque es adecuado para identificar anticuerpos que tienen patrones de unión similares. Además, la correspondencia entre los resultados de combinación por epítopos y el análisis de secuencia de anticuerpos combinados mediante este método significa que el método de combinación por epítopos proporciona información y orientación sobre qué secuencias de anticuerpo son importantes para determinar la especificidad de epítopo de la unión del anticuerpo.

Ejemplos Ejemplo 1 Ensayo de propiedades de reconocimiento de epítopo Generación y caracterización preliminar de anticuerpos

Se recogieron los sobrenadantes de hibridoma que contenían anticuerpos monoclonales de IgG humanos específicos para antígeno usados para la combinación a partir de células de hibridoma cultivadas que se habían transferido desde placas de fusión hasta placas de 24 pocillos. Se recogió el sobrenadante a partir de placas de 24 pocillos para el análisis de la combinación. Se seleccionaron anticuerpos específicos para el antígeno de interés mediante detección de hibridoma, usando detección mediante ELISA frente a sus antígenos. Se clasificaron los anticuerpos positivos para unión al antígeno mediante su afinidad de unión a través de una combinación de un método de clasificación de afinidad en placas de 96 pocillos y medición de afinidad por BIAcore. Se seleccionaron los anticuerpos con alta afinidad para el antígeno de interés para la combinación por epítopos. Se usarán estos anticuerpos como los anticuerpos de prueba de referencia y sonda en el ensayo.

Ensayo usando perlas Luminex

En primer lugar, se midió la concentración de anticuerpos monoclonales anti-IgG humana de ratón (mxhIgG) usados como anticuerpo de captura para capturar el anticuerpo de referencia, y se dializaron los anticuerpos mxhIgG en PBS para eliminar azidas u otros conservantes, que podrían interferir en el procedimiento de acoplamiento. Luego se acoplaron los anticuerpos mxhIgG a las perlas Luminex (sistema Luminex 100, Luminex Corp., Austin TX) según las instrucciones del fabricante en el Manual de Usuario de Luminex ("Luminex User Manual"), páginas 75-76. En resumen, se combinó el anticuerpo de captura mxhIgG a 50 \mug/ml en 500 \mul de PBS con perlas a 1,25x10^{7} perlas/ml en 300 \mul. Tras el acoplamiento, se contaron las perlas usando un hemocitómetro y se ajustó la concentración hasta 1x10^{7} perlas/ml.

Se recogieron los anticuerpos específicos para antígeno y se detectaron tal como se describió anteriormente, y se determinaron sus concentraciones. Se seleccionaron hasta 100 anticuerpos para la combinación por epítopos. Se diluyeron los anticuerpos según la fórmula siguiente para unir los anticuerpos a hasta 100 perlas marcadas de manera única para formar anticuerpos de referencia marcados:

Volumen total de las muestras en cada tubo:

10

en la que n = número total de muestras incluyendo los controles.

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Volumen de muestra individual necesaria para la dilución:

11

concentración de cada muestra. C = 0,2-0,5 \mul/ml.

\newpage

Se prepararon las muestras según la fórmula anterior, y se tomaron alícuotas de 150 \mul de cada muestra diluida que contenía un anticuerpo de referencia y se añadieron en un pocillo de una placa de 96 pocillos. Se conservaron alícuotas adicionales para su uso como anticuerpo sonda en una fase posterior del ensayo. Se agitó con vórtex la reserva de perlas acopladas a mxhIgG y se diluyeron hasta una concentración de 2500 de cada perla por pocillo ó 0,5 x 10^{5}/ml. Se incubaron los anticuerpos de referencia con perlas acopladas a mxhIgG en un agitador en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche.

Se humedeció previamente una placa filtrante de 96 pocillos añadiendo 200 \mul de tampón de lavado y aspirando. Tras la incubación durante la noche, se reunieron perlas (ahora con anticuerpos de referencia unidos a mxhIgG unidos a perlas), y se tomaron alícuotas de 100 \mul y se añadieron en cada pocillo de una placa filtrante de microtitulación de 96 pocillos a una concentración de 2000 perlas por pocillo. El número total de alícuotas de perlas era dos veces el número de muestras que iban a someterse a prueba, permitiendo de ese modo experimentos paralelos con y sin antígeno. Se aspiró inmediatamente el tampón para eliminar cualquier anticuerpo de referencia no unido y se lavaron las perlas tres veces.

Se añadió antígeno (50 \mul) a un conjunto de muestras; y se incubaron las perlas con antígeno a una concentración de 1 \mug/ml durante una hora. Se añade un control de tampón al otro conjunto de muestras, para proporcionar un control negativo sin antígeno.

Entonces se añadieron todos los anticuerpos que estaban usándose como anticuerpos sonda a todas las muestras (con antígeno y sin antígeno). En este experimento, cada anticuerpo que se usa como anticuerpo de referencia también se usó como anticuerpo sonda, con el fin de someter a prueba todas las combinaciones. El anticuerpo sonda debe tomarse de la misma disolución diluida que el anticuerpo de referencia, para garantizar que se usa el anticuerpo en la misma concentración. Se añadió el anticuerpo sonda (50 \mul/pocillo) a todas las muestras y se incubaron la mezclas en la oscuridad durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador. Se lavaron las muestras tres veces para eliminar el anticuerpo sonda no unido.

Anticuerpo de detección: se añadió mxhIgG biotinilado (50 \mul/pocillo) a una dilución de 1:500, y se incubó la mezcla en la oscuridad durante 1 hora en un agitador. Se lavaron las perlas tres veces para eliminar mxhIgG biotinilado no unido. Se añadió estreptavidina-PE a una dilución de 1:500, 50 \mul/pocillo. Se incubó la mezcla en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente en un agitador, y luego se lavó tres veces para eliminar componentes no unidos.

Según las instrucciones del fabricante, se encendió la base de Luminex 100 y XYP usando el software Luminex. Se inició una nueva sesión y se introdujeron el número de muestras y los números de denominación de las perlas usadas en el ensayo.

Se resuspendieron las perlas de cada pocillo en 80 \mul de tampón de dilución. Se colocó la placa de 96 pocillos en la base de Luminex y se leyó y registró el espectro de emisión de fluorescencia de cada pocillo.

Optimización del ensayo

Para optimizar el ensayo, se usó inicialmente el Manual de usuario de Luminex versión 1.0 para la orientación con respecto a las concentraciones de perlas, anticuerpos y tiempos de incubación. Se determinó empíricamente que un tiempo incubación más largo proporcionaba una saturación de unión garantizada y era más adecuado para las concentraciones de anticuerpo de nanogramos usadas en el ensayo.

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Ejemplo 2 Análisis de un único conjunto de datos: anticuerpos frente al ANTIGEN14 Entrada de Datos

Se sometieron a ensayo los anticuerpos tal como se describió en el ejemplo 1 y se recogieron los resultados. Los archivos de entrada consistían en matrices de entrada mostradas en la figura 8A (antígeno presente) y en la figura 8B (antígeno ausente) para un conjunto de datos que corresponde a un único experimento para la diana ANTIGEN14.

Normalización de los datos de la diana ANTIGEN14

En primer lugar, se restó la matriz correspondiente al experimento sin antígeno (control negativo, figura 8B) de la matriz correspondiente al experimento con antígeno (figura 8A), para eliminar la cantidad de señal de fondo debida a unión no específica del anticuerpo marcado. Se muestra la diferencia entre las dos matrices en la figura 9. La columna correspondiente al anticuerpo 2.42 tiene valores excepcionalmente grandes tanto en como fuera de la diagonal y se señala y se trata por separado en el análisis de datos tal como se describió anteriormente.

Normalización de filas

Se ajustó la diferencia de matriz fijando valores por debajo del valor umbral definido por el usuario de 200 para este valor umbral tal como se muestra en la figura 10. Se hizo este ajuste para evitar la inflación artificial significativa de valores de señal bajos en las etapas de normalización posteriores (tal como se describió anteriormente). Entonces se normalizaron las intensidades de cada fila en la matriz dividiendo cada valor en una fila entre el valor de la fila correspondiente al tampón de bloqueo (figura 11). Esto ajusta para la variación de intensidad pocillo a pocillo tal como se trató anteriormente y se ilustró en la figura 2A.

Normalización de columnas

Se normalizaron todas las columnas excepto la correspondiente al anticuerpo 2.42 tal como se describió anteriormente y se muestran en la figura 12.

Matriz de disimilitud

Se generó una matriz de disimilitud (o distancia) en un procedimiento de múltiples etapas. En primer lugar, se fijaron los valores de intensidad por debajo del umbral definido por el usuario (ajustado a dos veces los valores de intensidad diagonal) a cero y se fijaron los valores restantes a uno (figura 13). Esto significa que los valores de intensidad que son inferiores a dos veces el valor de intensidad del valor diagonal se consideran lo bastante bajos como para representar la competición para el mismo epítopo por el par de anticuerpos. Se genera la matriz de disimilitud a partir de la matriz de ceros y unos fijando la entrada en la fila i y la columna j a la fracción de posiciones en las que difieren dos filas, i y j. La figura 14 muestra el número de posiciones (de un total de 22) en las que se diferencian los patrones para dos anticuerpos cualesquiera para el conjunto de anticuerpos generado frente a la diana ANTIGEN14.

Se generó una matriz de disimilitud a partir de la matriz de ceros y unos generada a partir de cada uno de los varios valores umbral que oscilan desde 1,5 hasta 2,5 (veces los valores de las diagonales), en incrementos de 0,1. Se calculó el promedio de estas matrices de disimilitud (figura 15) y se usó como entrada para el algoritmo de agrupación. Se ilustra la significación de tomar el promedio de varias matrices de disimilitud en la figura 4. La figura 4 muestra la fracción de disimilitudes para un par de anticuerpos (2.1 y 2.25) como una función del valor umbral para valores umbral que oscilan desde 1,5 hasta 2,5. A medida que el valor umbral cambió desde 1,8 y 1,9 la cantidad de disimilitud entre los patrones de señal para los dos anticuerpos cambió sustancialmente desde el 0% hasta casi el 15%. Esta figura muestra cómo la cantidad de disimilitud entre los patrones de señal para un par de anticuerpos puede ser sensible a una elección particular para un valor de corte, ya que puede variar sustancialmente para diferentes valores umbral.

Agrupación

Agrupación jerárquica. Usando la subrutina de anidación por aglomeración en el software de análisis estadístico SPLUS 2000, se agruparon los anticuerpos usando la matriz de disimilitud promedio que se describió anteriormente como entrada. En este algoritmo, se forzaron los anticuerpos en una jerarquía estricta de subconjuntos anidados. En primer lugar se agrupó el par de anticuerpos con el menor valor de disimilitud correspondiente en toda la matriz. A continuación, se agrupó el par de anticuerpos, o agrupación de anticuerpos, con el segundo menor valor de disimilitud (o disimilitud promedio). Este procedimiento se repitió de manera iterativa hasta que se quedó una agrupación.

Visualización de agrupaciones en dendrogramas

El dendrograma calculado para la diana ANTIGEN14 se muestra en la figura 5. La longitud (o altura) de las ramas que conectan dos anticuerpos es inversamente proporcional al grado se similitud entre los anticuerpos a los que se une. Este dendrograma muestra que había dos epítopos muy distintos reconocidos por estos anticuerpos. Un epítopo se reconoció por los anticuerpos 2.73, 2.4, 2.16, 2.15, 2.69, 2.19, 2.45, 2.1, y 2.25. Un epítopo diferente se reconoció por los anticuerpos 2.13, 2.78, 2.24, 2.7, 2.76, 2.61, 2.12, 2.55, 2.31, 2.56, y 2.39. El anticuerpo 2.42 no tiene un patrón que fuera muy similar a cualquier otro anticuerpo pero tuvo alguna similitud perceptible a la segunda agrupación, lo que indica que podría reconocer aún un tercer epítopo que coincide parcialmente con el segundo epítopo.

Visualización de agrupaciones en matrices

En la figura 16 y en la figura 17 también puede observarse esta agrupación de estos anticuerpos. En la figura 16, se dispusieron las filas y las columnas de la matriz de disimilitud según el orden de las "hojas" o clados en el dendrograma y se codificaron visualmente las células individuales según el grado de disimilitud. Las celdas que tienen sombreado más oscuro corresponden a los pares de anticuerpos que eran muy similares (menos del 10% de disimilitud). Las celdas que no están sombreadas corresponden a aquellos anticuerpos que eran bastante similares (entre el 10% y el 25% de disimilitud). Las celdas que tienen sombreado más claro corresponden a los pares de anticuerpo que tenían más de un 25% de disimilitud. Los bloques con el sombreado más oscuro corresponden a agrupaciones diferentes de anticuerpos. Excluyendo el tampón de bloqueo, parecen ser dos, o posiblemente tres, bloques correspondientes a los grupos de anticuerpos mencionados anteriormente. La figura 16 también muestra que, permitiendo una tolerancia ligeramente más alta para la disimilitud, puede considerarse que el anticuerpo 2.42 es un miembro de la segunda agrupación.

En la figura 17, se dispusieron las filas y las columnas de la matriz de intensidad normalizada según el orden de las hojas en el dendrograma y se codificaron visualmente las celdas individuales según sus valores de intensidad normalizados. Las celdas que tienen sombreado más oscuro corresponden a los pares de anticuerpos que tenían una intensidad alta (al menos 2,5 veces mayor que el fondo). Las celdas que no están sombreadas tenían una intensidad entre 1,5 y 2,5 veces el fondo. Las celdas que tienen sombreado más claro corresponden a intensidades que eran inferiores a 1,5 veces el fondo. Cuando se comparan las marcas visuales de las filas de esta matriz, aparecieron dos patrones muy distintos de los correspondientes a los dos epítopos mostrados anteriormente. Además, debe observarse que la codificación visual es muy simétrica con respecto a la diagonal. Esto muestra que había un alto nivel de autoconsitencia para los datos con respecto a la revelación de si dos anticuerpos compiten por el mismo epítopo. La razón es que si el anticuerpo A y el anticuerpo B compiten por el mismo epítopo, entonces la intensidad debe ser baja tanto cuando el anticuerpo A es el anticuerpo primario y el anticuerpo B es el anticuerpo secundario, como cuando el anticuerpo B es el anticuerpo primario y el anticuerpo B es el anticuerpo secundario. Por tanto, la intensidad para la celda en la fila i y la columna j así como para la fila j y la columna i deben ser ambas bajas. Asimismo, si estos dos anticuerpos reconocieron diferentes epítopos, entonces ambas intensidades correspondientes deben haber sido altas. De los aproximadamente 200 pares de celdas, sólo un par tenía un miembro del par con una intensidad inferior a 1,5 mientras que el otro miembro tuvo una intensidad superior a 2,5. El nivel de autocoherencia de las matrices normalizadas resultantes producidas mediante el algoritmo proporciona una medición de la fiabilidad tanto de los datos generados como del análisis del algoritmo de los datos. El alto nivel de autocoherencia para el conjunto de datos de ANTIGEN14 (superior al 99%) sugiere que se puede confiar en los resultados del algoritmo para este conjunto de datos con un alto nivel de
confianza.

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Ejemplo 3 Análisis de conjuntos de datos múltiples: ANTIGEN39

Cuando existen conjuntos de datos de entrada para más de uno experimento, en primer lugar se generan matrices de intensidad normalizadas tal como se describió anteriormente para cada experimento individual. Se fijan al valor umbral correspondiente los valores normalizados por encima de un valor umbral (normalmente fijados a 4). Esto evita que cualquier valor de intensidad normalizado tenga demasiado peso en el valor promedio para ese par de anticuerpos. Se genera una única matriz normalizada a partir de las matrices normalizadas individuales tomando el promedio del los valores de intensidad normalizados a los largo de todos los experimentos para cada par de anticuerpos para los que hay datos. Se señalan los pares de anticuerpos sin valores de intensidad correspondientes. La generación de la matriz de disimilitud es tal como se describió anteriormente con la excepción de que la fracción de las posiciones en las que se diferencian dos filas, i y j solamente considera el número de posiciones para el que ambas filas tienen un valor de intensidad. Si las dos filas no tienen tales posiciones, entonces el valor de disimilitud se fija de manera arbitraria elevado y se señala.

Se realizaron cinco experimentos usando anticuerpos frente a ANTIGEN39, usando los métodos descritos en los ejemplos 1 y 2, y a lo largo de la descripción. Se resumen los resultados de agrupación para los cinco conjuntos de datos de entrada de los anticuerpos frente a ANTIGEN39 en la figura 6A, la figura 18, la figura 19, y la tabla 30. Los resultados muestran que existen un gran número de agrupaciones de diversos grados de similitud. Esto sugiere que existen varios epítopos diferentes, algunos de los cuales pueden solaparse. Por ejemplo, la agrupación que contiene los anticuerpos 1.17, 1.55, 1.16, 1.11 y 1.12 y la agrupación que contiene los 1.21, 2.12, 2.38, 2.35 y 2.1 están relacionadas de manera bastante estrecha (siendo diferente cada par de anticuerpo con la excepción de 2.35 y 1.11 en no más del 25%). Este alto grado de similitud entre las dos agrupaciones sugiere que los dos epítopos diferentes pueden tener un alto grado de similitud.

Con el fin de probar la capacidad del algoritmo para producir resultados de agrupación coherentes, también se agruparon los cinco conjuntos de datos independientemente. Los resultados de agrupación se resumen para los diferentes experimentos en las figuras 6B-6F y en las figuras 20-30. La figura 30 resume las agrupaciones para cada uno de los conjuntos de datos individuales y para el conjunto de datos combinados con todos los anticuerpos para los cinco experimentos. La figura 6B muestra el dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 1: anticuerpos 1.12, 1.63, 1.17, 1.55 y 2.12 agrupados de manera coherente entre sí en este experimento así como en otros experimentos al igual que los anticuerpos 1.46, 1.31, 2.17, y 1.29. La figura 6C muestra el dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 2: anticuerpos 1.57 y 1.61 agrupados de manera coherente entre sí en este experimento así como en otros experimentos.

La figura 6D muestra el dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 3: anticuerpos 1.55, 1.12, 1.17, 2.12, 1.11 y 1.21 agrupados de manera coherente entre sí en este experimento así como en otros experimentos. La figura 6E muestra el dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 4: anticuerpos 1.17, 1.16, 1.55, 1.11, y 1.12 agrupados de manera coherente entre sí en este experimento así como en otros experimentos al igual que los anticuerpos 1.31, 1.46, 1.65, y 1.29, así como anticuerpos 1.57 y 1.61. La figura 6F muestra el dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 5: anticuerpos 1.21, 1.12, 2.12, 2.38, 2.35, y 2.1 agrupados de manera coherente entre sí en este experimento así como en otros experimentos.

En general, el algoritmo de agrupación produjo resultados coherentes tanto entre los experimentos individuales como entre los conjuntos de datos combinados e individuales. Los anticuerpos que se agrupan entre sí o están en agrupaciones vecinas para múltiples conjuntos de datos individuales también se agrupan entre sí o están en agrupaciones vecinas para el conjunto de datos combinados. Por ejemplo, las celdas que tienen un sombreado más claro indican anticuerpos que se agruparon de manera coherente entre sí en el conjunto de datos combinados y en todos los conjuntos de datos en los que estaban presentes (experimentos 1, 3, 4, y 5). De manera similar, las celdas con sombreado más oscuro indican anticuerpos que se agruparon de manera coherente entre sí en el conjunto de datos combinados y en los experimentos 1, 4, y 5. Estos resultados indican que el algoritmo produce resultados de agrupación coherentes tanto entre experimentos individuales múltiples como que conserva la coherencia tras combinar conjuntos de datos múltiples.

Finalmente, hay un alto nivel de autocoherencia para los datos con respecto a revelar si dos anticuerpos compiten o no por el mismo epítopo. El porcentaje de pares de anticuerpos para los que los datos revelan de manera coherente si compiten o no por el mismo epítopo se resume para cada conjunto de datos en la tabla 2, anterior. La tabla 2 revela que la coherencia era casi del 90% para cuatro de los cinco conjuntos de datos individuales así como para el conjunto de datos combinados.

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Ejemplo 4 Análisis de un conjunto pequeño de anticuerpos monoclonales humanos frente a IL-8 usando el procedimiento de análisis de datos de reconocimiento del patrón competitivo

Se usó un pequeño conjunto de anticuerpos monoclonales humanos bien caracterizados desarrollados frente a IL-8, un mediador proinflamatorio, para evaluar el programa aplicando el procedimiento RPC. Anteriormente, ELISA en placa habían demostrado que los anticuerpos dentro del conjunto se unían a dos epítopos diferentes: HR26, a215, y D111 reconocían un epítopo, mientras que K221 y a33 competían por un segundo epítopo. El análisis adicional usando estudios de mapeo de epítopo demostró que HR26, a809 y a928 se unían al mismo o a epítopos solapantes, mientras que a837 se unía a un epítopo diferente.

En un nuevo experimento para determinar el procedimiento RPC podía agrupar correctamente anticuerpos, se sometió a prueba el procedimiento en un conjunto de siete anticuerpos frente a IL-8, incluyendo algunos de los anticuerpos monoclonales enumerados anteriormente. Los resultados se resumen en los dendrogramas mostrados en la figura 7A. El dendrograma de la izquierda se generó mediante columnas de agrupación y el dendrograma de la derecha se generó mediante filas de agrupación de la matriz de intensidad de señal normalizada para el fondo. Ambos dendrogramas indicaron que existían dos epítopos para un valor límite de disimilitud de 0,25: un epítopo reconocido por HR26, a215, a203, a393 y a452, y un segundo epítopo reconocido por K221 y a33.

Estos resultados usando el procedimiento RPC para anticuerpos de agrupación eran coherentes con los datos de los ensayos de ELISA en placa resumidos anteriormente. Los resultados obtenidos usando el procedimiento RPC indicaron que el antígeno diana pareció tener dos epítopos distintos, lo que confirma los resultados observados usando ensayos de ELISA placa. El uso del procedimiento RPC para la agrupación indicó que HR26 y a215 se agruparon entre sí, al igual que lo hicieron K221 y a33, de nuevo coherente con los resultados a partir de ensayos de ELISA en placa.

El grado de similitud entre los dos dendrogramas proporcionó una medición de la autocoherencia de los análisis realizados mediante este procedimiento. De manera ideal, los dos dendrogramas (el de la izquierda generado agrupando columnas y el de la derecha generado agrupando filas) deberían haber sido idénticos por la siguiente razón: si el anticuerpo nº 1 y el anticuerpo nº 2 compiten por el mismo epítopo, entonces la intensidad debería ser baja cuando el anticuerpo nº 1 es el anticuerpo de referencia y el anticuerpo nº 2 es el anticuerpo sonda, así como cuando el anticuerpo nº 2 es el anticuerpo de referencia y anticuerpo nº 1 es el anticuerpo sonda. Asimismo, cuando los dos anticuerpos se unen a epítopos diferentes, las intensidades deberían ser uniformemente altas. Por esta razón, el grado de similitud entre las dos filas de la matriz de intensidad de señal debería ser el mismo que entre las dos columnas de la matriz de similitud. En el presente ejemplo, los dendrogramas a la izquierda y la derecha de la figura 7A son casi idénticos. En cada caso, los mismos anticuerpos aparecieron en las dos agrupaciones. Este alto nivel de autocoherencia entre las agrupaciones de fila y columna sugirió que el protocolo del experimento, junto con el procedimiento, produce resultados sólidos.

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Ejemplo 5 Análisis de conjuntos de datos múltiples de anticuerpos usando el procedimiento de análisis de datos de Reconocimiento de patrón competitivo (RPC)

Se llevaron a cabo experimentos de detección múltiple usando anticuerpos frente a IL-8, generando conjuntos de datos múltiples. En primer lugar se generaron matrices de intensidad normalizadas tal como se describió anteriormente para las matrices para cada experimento individual. Se fijaron los valores normalizados por encima del valor umbral definido por el usuario al valor umbral definido por el usuario. Se asignaron los valores de intensidad alta al valor umbral para evitar que cualquier valor de intensidad individual tenga demasiado peso cuando se calcule el valor de intensidad normalizado promedio para ese par de anticuerpos particular en una etapa posterior. Las filas y las columnas de la matriz de intensidad normalizada promedio correspondieron al conjunto de anticuerpos "únicos" identificados usando los métodos de la presente invención. Se identificaron estos anticuerpos "únicos" de entre todos los anticuerpos usados en todos los experimentos. Se calculó la intensidad promedio para cada celda en esta matriz para la cual existía al menos un valor de intensidad. Se identificaron las celdas que correspondían a los pares de anticuerpos sin datos como puntos de datos perdidos. Se generó la matriz de disimilitud tal como se describió anteriormente, excepto en que se determinó la fracción basándose en los número de posiciones en las que dos filas diferían con relación al número total de posiciones para que ambas filas tenían valores de intensidad. Si las dos filas no tenían datos comunes, entonces se señalaba el valor de disimilitud para la celda correspondiente y fijaba arbritariamente alto, de modo que los anticuerpos correspondientes no se agruparían entre sí como un artefacto.

Los resultados de agrupación para un conjunto de anticuerpos monoclonales a partir de cinco conjuntos solapantes de anticuerpos monoclonales se resumen en la figura 7B y en la tabla 3 (a continuación). Estos dendrogramas corroboran los resultados demostrando que hay dos epítopos diferentes en el antígeno diana. Se define el primer epítopo mediante los anticuerpos monoclonales a809, a928, HR26, a215, y D111 y se define el segundo epítopo mediante los anticuerpos monoclonales a837, K221, a33, a142, y a358, a203, a393, y a452. Las longitudes de las ramas que conectan los grupos indicaron que, mientras que la primera agrupación era muy diferente de los otros dos, la segunda y la tercera eran similares entre sí.

Para someter a prueba la capacidad del procedimiento RPC para producir resultados coherentes entre experimentos separados, también se agruparon los cinco conjuntos de datos independientemente separado. Los resultados de agrupación para los diferentes experimentos se resumen en los dendrogramas mostrados en las figuras 7A, 7B, 7C, y en la tabla B. Estos dendrogramas demostraron que el procedimiento de agrupación RPC produjo resultados coherentes entre los experimentos individuales y entre los conjuntos de datos combinados e individuales. Cada dendrograma tenía dos ramas principales, indicando dos epítopos. Los anticuerpos que se agruparon entre sí para los conjuntos de datos individuales múltiples también se agruparon entre sí o estaban en agrupaciones vecinas para el conjunto de datos combinados. Tal como se muestra en la tabla 3, a continuación, existieron solamente dos pequeñas discrepancias en los resultados de agrupación entre los diferentes experimentos o entre un experimento individual y el conjunto de datos combinados, en los que se indican estas discrepancias en negrita en la tabla 3. En un conjunto de datos generados en el experimento 3, se agrupó el D111 con los anticuerpos a33 y K221, en vez de HR26 y a215. En un grupo de datos generados en el experimento 4, los anticuerpos a203, a393, y a452 aparecieron en la primera agrupación, mientras que en otro experimento (así como en los conjuntos de datos combinados), aparecieron en una segunda agrupación. Esta ligera diferencia probablemente se atribuye a diferencias en la afinidad del anticuerpo individual entre experimentos en los que se usa el anticuerpo como un anticuerpo sonda y experimentos en los que se usa el mismo anticuerpo como un anticuerpo de referencia. Los anticuerpos con menor afinidad pueden tener una capacidad reducida para capturar antígeno fuera de la disolución cuando se usa como un anticuerpo de referencia. Sin embargo, la similitud global de los resultados de agrupación, así como la agrupación de los antígenos, indicó que el procedimiento produjo resultados de agrupación coherentes, lo que está en buena concordancia con los resultados de otros experimentos entre experimentos individuales múltiples, y con que los resultados seguían siendo coherentes cuando se combinaban conjuntos de datos múltiples.

Finalmente, existía un alto nivel de coherencia en los resultados de agrupación para cada uno de estos conjuntos de datos cuando se usó el procedimiento para agrupar por filas y por columnas, para los conjuntos de datos individuales y combinados. La única discrepancia en los resultados de agrupación entre las agrupaciones por filas y columnas era con D111 en el tercer conjunto de datos, en el que se agrupó con anticuerpos HR26 y a215 cuando se realizó agrupación por filas, mientras que D111 se agrupó con anticuerpos a33 y K221 cuando se realizó agrupación por columnas.

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(Tabla pasa a página siguiente)

12

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Los expertos en la técnica entenderán que pueden hacerse numerosas y diversas modificaciones sin apartarse del espíritu de la presente invención. Por tanto, debe entenderse claramente que las formas de la presente invención son únicamente ilustrativas y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.

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Referencias citadas en la descripción

La lista de referencias citadas por el solicitante es sólo para la conveniencia del lector. Ella no forma parte del documento de patente europeo. Incluso cuando se ha tenido un gran cuidado en recopilar las referencias, errores u omisiones no pueden excluirse y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.

Literatura no-patente citada en la descripción

\bulletSTORCH. Pediatrics, 1998, vol. 102, 648-651 [0002]

\bulletCOLLER et al. Thromb. Haemostasis, 1995, vol. 74, 302-308 [0002]

\bulletPRESENT et al. New Eng. J. Med., 1999, vol. 6, 1398-1405 [0002]

\bulletGOLDENBERG. Clin. Ther., 1999, vol. 21, 309-318 [0002]

\bulletKOHLER; MILSTEIN. Nature, 1975, vol. 256, 495-497 [0002]

\bulletBABCOOK et al. Proc. Natl. Acad Sci., 1996, vol. 93, 7843-7848 [0002]

\bulletGREEN. Jnl. Immunol. Methods, 1999, vol. 231, 11-23 [0002]

\bulletJAKOBOVITS et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993, vol. 90, 2551-2555 [0002]

\bulletMENDEZ. Nat. Genet., 1997, vol. 15, 146-156 [0002]

\bulletGREEN; JAKOBIVITS. J. Exp. Med., 1998, vol. 188, 483-495 [0002]

\bulletPERTON et al. Jnl. Immunol. Methods, 1996, vol. 190 (1), 1 117-125 [0003]

\bulletKUROKI et al. Immunological. Investigations, 1992, vol. 21 (6), 523-5381 [0003]

\bulletKUROKI. Methods in Molecular Biology, 1996, vol. 66, 47-53 [0003]

\bulletEISEN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, vol. 95,14863-14868[0090]

Claims

1. Método de ensayo de competición de anticuerpos para determinar anticuerpos que se unen a un epítopo sobre un antígeno, que comprende:

proporcionar un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno;

marcar cada anticuerpo de dicho conjunto para formar un conjunto de anticuerpos de referencia marcados de modo que cada anticuerpo de referencia marcado puede distinguirse de todos los demás anticuerpos de referencia marcados en dicho conjunto de anticuerpos de referencia marcados;

proporcionar un anticuerpo sonda que se une a dicho antígeno;

poner en contacto dicho anticuerpo sonda con dicho conjunto de anticuerpos de referencia marcados en presencia de dicho antígeno;

detectar el anticuerpo sonda unido en un complejo que comprende dicho antígeno, un anticuerpo de referencia marcado unido a dicho antígeno y dicho anticuerpo sonda unido a dicho antígeno;

identificar cada dicho anticuerpo de referencia marcado unido a dicho antígeno en cada dicho complejo;

determinar si dicho anticuerpo sonda compite con cualquier anticuerpo de referencia en dicho conjunto de anticuerpos de referencia marcados, en el que la competición indica que dicho anticuerpo sonda se une al mismo epítopo que otro anticuerpo en dicho conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende además marcar dicho anticuerpo sonda para formar un anticuerpo sonda marcado.

3. Método según la reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo sonda marcado comprende un marcador seleccionado de un marcador enzimático, un marcador colorimétrico, un marcador fluorescente o un marcador radiactivo.

4. Método según la reivindicación 1, que comprende además proporcionar un anticuerpo de detección marcado para detectar dicho anticuerpo sonda.

5. Método según la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo de detección marcado comprende un marcador seleccionado de un marcador enzimático, un marcador colorimétrico, un marcador fluorescente o un marcador radiactivo.

6. Método según la reivindicación 1, en el que cada anticuerpo del conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno está marcado con una perla coloreada de manera única para formar un conjunto de anticuerpos de referencia marcados de modo que cada anticuerpo de referencia marcado puede distinguirse de todos los demás anticuerpos de referencia marcados en dicho conjunto de anticuerpos de referencia marcados.

7. Método según la reivindicación 6, en el que cada dicha perla coloreada de manera única tiene un espectro de emisión distinto.

8. Método según la reivindicación 6, en el que dicho anticuerpo sonda es un anticuerpo sonda marcado.

9. Método según la reivindicación 6, que comprende además proporcionar un anticuerpo de detección marcado para detectar dicho anticuerpo sonda.

10. Método según la reivindicación 1, que comprende además un método para caracterizar anticuerpos basándose en las características de unión, que comprende:

proporcionar datos de entrada a partir de un ensayo de competición como en la reivindicación 1, representando dichos datos de entrada los resultados de al menos un ensayo de competición de anticuerpos usando un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno;

normalizar dichos datos de entrada para generar una matriz de intensidad normalizada;

calcular al menos una matriz de disimilitud que comprende generar una matriz umbral a partir de dicha matriz de intensidad normalizada y calcular una matriz de disimilitud a partir de dicha matriz umbral; y

agrupar anticuerpos basándose en los valores de disimilitud en celdas de dicha matriz de disimilitud, para determinar los patrones de unión a epítopos de dicho conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno.

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11. Método según la reivindicación 10, en el que dichos datos de entrada se generan mediante un ensayo de anticuerpos competitivo de alto rendimiento.

12. Método según la reivindicación 11, que comprende además seleccionar cada anticuerpo en dicho conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno para su uso como un anticuerpo sonda y para cada anticuerpo seleccionado poner en contacto dicho anticuerpo seleccionado con dicho conjunto de anticuerpos de referencia marcados en presencia de dicho antígeno.

13. Método según la reivindicación 10, en el que dichos datos de entrada comprenden valores de intensidad de señal que representan los resultados de al menos un ensayo de competición de anticuerpos usando un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno.

14. Método según la reivindicación 13, en el que dichos datos de entrada que comprenden valores de intensidad de señal que representan los resultados de al menos un ensayo de competición de anticuerpos comprenden datos de entrada almacenados en forma de matriz.

15. Método según la reivindicación 14, en el que dichos datos de entrada almacenados en forma de matriz comprenden una matriz bidimensional.

16. Método según la reivindicación 14, en el que dichos datos almacenados en forma de matriz comprenden una matriz multidimensional.

17. Método según la reivindicación 14, en el que dichos datos de entrada almacenados en forma de matriz comprenden una pluralidad de matrices.

18. Método según la reivindicación 14, en el que dichos datos de entrada almacenados en forma de matriz comprenden valores de intensidad de señal que representan los resultados de un ensayo de competición de anticuerpos llevado a cabo usando un formato de múltiples pocillos, en el que cada celda de dicha matriz representa el resultado del ensayo llevado a cabo en un pocillo de dicho formato de múltiples pocillos.

19. Método según la reivindicación 14, en el que dicha normalización de dichos datos de entrada para generar una matriz de intensidad normalizada comprende generar una matriz de intensidad normalizada para el fondo restando una primera matriz que comprende valores de intensidad de señal a partir de un primer ensayo de competición de anticuerpos en el que no se añadió antígeno, de una segunda matriz que comprende valores de intensidad de señal a partir de un segundo ensayo de competición de anticuerpos en el que se añadió antígeno.

20. Método según la reivindicación 19, que comprende fijar un valor umbral mínimo para valores de tampón de bloqueo y ajustar cualquier valor de tampón de bloqueo por debajo de dicho valor umbral hasta dicho valor umbral antes de dicha generación de dicha matriz de intensidad normalizada.

21. Método según la reivindicación 20, que comprende además dividir cada valor en una columna de dicha matriz de intensidad normalizada para el fondo entre el valor de intensidad del tampón de bloqueo para dicha columna.

22. Método según la reivindicación 21, en el que dicha etapa de normalización comprende además la normalización con respecto a la señal de nivel inicial para los anticuerpos sonda, que comprende dividir cada dicha columna de dicha matriz normalizada para la intensidad entre su valor diagonal correspondiente para generar una matriz final normalizada para la intensidad.

23. Método según la reivindicación 22, en el que cada dicho valor diagonal se compara con un valor umbral definido por el usuario y cualquier dicho valor diagonal por debajo de dicho valor umbral definido por el usuario se ajusta hasta dicho valor umbral antes de dicha división de cada columna entre su valor diagonal correspondiente.

24. Método según la reivindicación 20, en el que dicha etapa de normalización comprende además generar una matriz normalizada para la intensidad dividiendo cada valor en una fila de dicha matriz de intensidad normalizada para el fondo entre el valor de intensidad del tampón de bloqueo para dicha fila.

25. Método según la reivindicación 24, en el que dicha etapa de normalización comprende además la normalización con respecto a la señal de nivel inicial para los anticuerpos sonda, que comprende dividir cada dicha fila de dicha matriz normalizada para la intensidad entre su valor diagonal correspondiente para generar una matriz final normalizada para la intensidad.

26. Método según la reivindicación 25, en el que dicho valor diagonal se compara con un valor umbral definido por el usuario y cualquier dicho valor diagonal por debajo de dicho valor umbral definido por el usuario se ajusta hasta dicho valor umbral antes de dicha división de cada fila entre su valor diagonal correspondiente.

27. Método según la reivindicación 19, en el que dicha generación de dicha matriz umbral comprende fijar el valor normalizado en cada celda de dicha matriz de intensidad normalizada a un valor de uno (1) o cero (0), en el que los valores normalizados inferiores o iguales a un valor umbral se fijan a un valor de cero (0) y los valores normalizados superiores a dicho valor umbral se fijan a un valor de uno (1).

28. Método según la reivindicación 27, en el que dicha al menos una matriz de disimilitud se calcula proporcionando dicha matriz umbral de unos y ceros y determinando el número de posiciones en las que se diferencian cada par de filas.

29. Método según la reivindicación 28, en el que se calcula una pluralidad de matrices de disimilitud usando una pluralidad de valores umbral.

30. Método según la reivindicación 29, en el que se calcula el promedio de dicha pluralidad de matrices de disimilitud.

31. Método según la reivindicación 30, que comprende proporcionar dicho promedio de dicha pluralidad de matrices de disimilitud como entrada para dicha etapa de agrupación.

32. Método según la reivindicación 10, en el que dicha agrupación de anticuerpos basado en dichos valores de disimilitud en celdas de dicha matriz de disimilitud comprende la agrupación jerárquica.

33. Método según la reivindicación 32, en el que dicha agrupación jerárquico comprende generar una jerarquía de subconjuntos anidados de anticuerpos dentro de dicho conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno, que comprende:

determinar el par de anticuerpos en dicho conjunto que tiene el valor de disimilitud más bajo;

determinar el par de anticuerpos que tiene el siguiente valor de disimilitud más bajo;

repetir de manera interactiva dicha determinación de dicho par de anticuerpos que tiene el siguiente valor de disimilitud más bajo hasta que quede un par de anticuerpos, de modo que se genera una jerarquía de subconjuntos anidados que indica la similitud de los patrones de competición dentro de dicho conjunto de anticuerpos; y

determinar agrupaciones basadas en patrones de competición.

34. Método según la reivindicación 33, en el que se capturan datos a partir de dicha etapa de agrupación.

35. Método según la reivindicación 34, en el que se capturan datos por medios automatizados.

36. Método según la reivindicación 33, en el que dicha etapa de agrupación genera una presentación visual.

37. Método según la reivindicación 36, en el que dicha presentación visual está en un formato compatible con un ordenador o dispositivo de entrada de datos.

38. Método según la reivindicación 36, en el que dicha presentación visual comprende una matriz de disimilitud.

39. Método según la reivindicación 38, en el que se determinan las agrupaciones mediante la inspección visual del valor de disimilitud en cada celda de dicha matriz de disimilitud.

40. Método según la reivindicación 38, en el que dicha matriz de disimilitud comprende celdas que tienen un indicador visual de la agrupación a la que pertenece el par de anticuerpos representado por dicha celda.

41. Método según la reivindicación 40, en el que dicho indicador visual es un color.

42. Método según la reivindicación 40, en el que dicho indicador visual es un sombreado.

43. Método según la reivindicación 40, en el que dicho indicador visual es un dibujo.

44. Método según la reivindicación 36, en el que dicha presentación visual es un dendrograma definido mediante valores de disimilitud calculados para dicho conjunto de anticuerpos.

45. Método según la reivindicación 44, en el que dicho dendrograma comprende ramas que representan anticuerpos de dicho conjunto de anticuerpos, en el que la disposición de las ramas representa relaciones entre anticuerpos dentro de dicho conjunto de anticuerpos, en el que además dicha disposición representa agrupaciones de anticuerpos dentro de dicho conjunto de anticuerpos.

46. Método según la reivindicación 45, en el que además dicho dendrograma comprende ramas en las que la longitud de dicha rama representa el grado de similitud entre el patrón de unión de anticuerpos o agrupación de anticuerpos representados por dicha rama.

47. Método según la reivindicación 10, que comprende proporcionar datos de entrada que representan los resultados de una pluralidad de ensayos de competición de anticuerpos, en los que cada ensayo representa un experimento individual que usa un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno, en el que además cada dicho experimento comprende al menos un anticuerpo que también se somete a prueba en al menos otro experimento.

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48. Método según la reivindicación 47, que comprende generar una matriz de intensidad normalizada individual para cada dicho experimento individual y que comprende además generar una única matriz de intensidad normalizada calculando el valor de intensidad promedio de cada par de anticuerpos representado en cada matriz de intensidad normalizada individual.

49. Método según la reivindicación 48, que comprende además generar una única matriz de disimilitud que representa cada par de anticuerpos sometido a prueba en dicha pluralidad de ensayos de competición de anticuerpos.

50. Método según la reivindicación 1, que comprende además un método para caracterizar anticuerpos basado en las características de unión, que comprende:

proporcionar datos de entrada que representan los resultados de al menos un ensayo de competición de anticuerpos usando un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno, en el que además dichos datos de entrada comprenden valores de intensidad de señal que representan los resultados de al menos un ensayo de competición de anticuerpos usando un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno;

almacenar dichos datos de entrada en formato de matriz;

restar una primera matriz que comprende valores de intensidad de señal a partir de un primer ensayo de competición de anticuerpos en el que no se añadió antígeno, de una segunda matriz que comprende valores de intensidad de señal a partir de un segundo ensayo de competición de anticuerpos en el que se añadió antígeno, para formar una matriz de intensidad normalizada para el fondo;

calcular el valor de cada celda diagonal de dicha matriz de intensidad normalizada para el fondo;

determinar celdas en cada columna de dicha matriz de intensidad normalizada para el fondo que tienen valores significativamente superiores al valor de cada celda diagonal de dicha columna; y

agrupar columnas que tienen patrones de unión similares como una combinación.

51. Método según la reivindicación 50, en el que dichas celdas en dicha matriz de intensidad normalizada para el fondo que tienen valores significativamente superiores a dicho valor de cada celda diagonal correspondiente de dicha columna tienen valores de al menos dos veces dicho valor de cada celda diagonal.

52. Método según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo sonda se selecciona de dicho conjunto de anticuerpos que se unen a dicho antígeno.