ES2307832T3 - Clasificacion de anticuerpos basada en las caracteristicas de union. - Google Patents
Clasificacion de anticuerpos basada en las caracteristicas de union. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2307832T3 ES2307832T3 ES02804495T ES02804495T ES2307832T3 ES 2307832 T3 ES2307832 T3 ES 2307832T3 ES 02804495 T ES02804495 T ES 02804495T ES 02804495 T ES02804495 T ES 02804495T ES 2307832 T3 ES2307832 T3 ES 2307832T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- antibodies
- antibody
- matrix
- antigen
- value
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
- G16B40/30—Unsupervised data analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in eptitope analysis
-
- G—PHYSICS
- G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
- G06F—ELECTRIC DIGITAL DATA PROCESSING
- G06F17/00—Digital computing or data processing equipment or methods, specially adapted for specific functions
- G06F17/10—Complex mathematical operations
- G06F17/16—Matrix or vector computation, e.g. matrix-matrix or matrix-vector multiplication, matrix factorization
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Data Mining & Analysis (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Databases & Information Systems (AREA)
- Software Systems (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Artificial Intelligence (AREA)
- Bioethics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Evolutionary Computation (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
- Mathematical Physics (AREA)
- Pure & Applied Mathematics (AREA)
- Mathematical Optimization (AREA)
- Mathematical Analysis (AREA)
Abstract
Método de ensayo de competición de anticuerpos para determinar anticuerpos que se unen a un epítopo sobre un antígeno, que comprende: proporcionar un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno; marcar cada anticuerpo de dicho conjunto para formar un conjunto de anticuerpos de referencia marcados de modo que cada anticuerpo de referencia marcado puede distinguirse de todos los demás anticuerpos de referencia marcados en dicho conjunto de anticuerpos de referencia marcados; proporcionar un anticuerpo sonda que se une a dicho antígeno; poner en contacto dicho anticuerpo sonda con dicho conjunto de anticuerpos de referencia marcados en presencia de dicho antígeno; detectar el anticuerpo sonda unido en un complejo que comprende dicho antígeno, un anticuerpo de referencia marcado unido a dicho antígeno y dicho anticuerpo sonda unido a dicho antígeno; identificar cada dicho anticuerpo de referencia marcado unido a dicho antígeno en cada dicho complejo; determinar si dicho anticuerpo sonda compite con cualquier anticuerpo de referencia en dicho conjunto de anticuerpos de referencia marcados, en el que la competición indica que dicho anticuerpo sonda se une al mismo epítopo que otro anticuerpo en dicho conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno.
Description
Clasificación de anticuerpos basada en las
características de unión.
La presente invención se refiere a agrupar
anticuerpos basándose en los epítopos que reconocen y a identificar
anticuerpos que tienen distintas características de unión. En
particular, la presente invención se refiere a métodos de ensayo de
competición de anticuerpos para determinar anticuerpos que se unen a
un epítopo, y a procedimientos de análisis de datos para dividir
anticuerpos específicos de antígeno en agrupaciones o
"combinaciones" que representan distintas especificidades de
unión. Específicamente, la invención se refiere al ensayo de
competición de anticuerpos de alto rendimiento, combinación de
anticuerpos competitiva múltiple ("Multiplex Competitive Antibody
Binning") (MCAB) y al procedimiento de análisis de datos de
reconocimiento del patrón competitivo (Competitive Pattern
Recognition (CPR)) para analizar los datos generados por los ensayos
de alto rendimiento.
Los anticuerpos monoclonales (AcM) muestran una
importante utilidad terapéutica en el tratamiento de una amplia
variedad de enfermedades tales como enfermedades infecciosas,
enfermedad cardiovascular, inflamación y cáncer. (Storch (1998)
Pediatrics 102:648-651; Coller et al. (1995)
Thromb, Haemostasis 74:302-308; Present et
al. (1999) New Eng. J. Med. 6:1398-1405;
Goldenberg (1999) Clin. Ther. 21:309-318). Las
células producen anticuerpos en respuesta a la infección o
inmunización con un antígeno o una sustancia extraña. La utilidad
terapéutica potencial de los anticuerpos monoclonales se debe en
parte a su unión específica y de alta afinidad a una diana. Los
anticuerpos se unen específicamente a un antígeno diana reconociendo
un sitio particular, o epítopo, sobre el antígeno. Con el uso de la
tecnología XenoMouse^{TM} desarrollada recientemente (Abgenix,
Inc., Fremont, CA) junto con procedimientos establecidos para
células B o células de hibridoma (Kohler y Milstein (1975) Nature
256:495-497) y aislar linfocitos (Babcook et
al. (1996) Proc. Natl. Acad Sci. 93:7843-7848),
es posible generar grandes números de anticuerpos monoclonales
humanos específicos de antígeno frente a casi cualquier antígeno
humano. (Green (1999) Jnl. Immunol. Methods
231:11-23, Jakobovits et al. (1993) Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:2551-2555, Mendez et
al. (1997) Nat. Genet. 15:146-156; Green y
Jakobivits, J. Exp. Med. (1998), 188:483-495).
Se han desarrollado métodos para localizar
sitios antigénicos para anticuerpos monoclonales mediante unión
competitiva de anticuerpos monoclonales. Perton et al. (1996)
Jnl. Immunol. Methods 190(1):1 117-125. Se
han usado ensayos de competición e inhibición mutua en fase sólida
usando antígeno biotinilado para determinar las especificidades de
epítopo de los anticuerpos monoclonales. Kuroki et al. (1992)
Immunological. Investigations
21(6):523-5381; Kuroki (1996) Methods in
Molecular Biology 66:47-53.
Los grandes números de anticuerpos generados
frente a un antígeno diana particular pueden variar sustancialmente
en cuanto a cómo de fuerte es su unión al antígeno así como el
epítopo particular al que se unen sobre el antígeno diana.
Diferentes anticuerpos generados frente a un antígeno reconocen
diferentes epítopos y tienen afinidades de unión variables para
cada epítopo. Con el fin de identificar anticuerpos terapéuticamente
útiles del gran número de anticuerpos candidatos generados, es
necesario examinar grandes números de anticuerpos para determinar
sus afinidades de unión y propiedades de reconocimiento de epítopo.
Por esta razón, sería ventajoso tener un método de examen rápido de
anticuerpos generados frente a un antígeno diana particular para
identificar aquellos anticuerpos que es más probable que tengan un
efecto terapéutico. Además, sería ventajoso proporcionar un
mecanismo para clasificar los anticuerpos generados según sus sitios
de unión al epítopo diana.
La presente descripción proporciona métodos para
clasificar anticuerpos basándose en sus características de unión a
epítopo. Un aspecto proporciona métodos y sistemas para determinar
las propiedades de reconocimiento de epítopo de diferentes
anticuerpos. Otro aspecto proporciona procedimientos de análisis de
datos para agrupar anticuerpos basándose en sus propiedades de
reconocimiento de epítopo y para identificar anticuerpos que tienen
características de unión a epítopo distintas. La clasificación o
"combinación" de anticuerpos tal como se da a conocer y se
reivindica en el presente documento abarca métodos de ensayo y
procedimientos de análisis de datos para determinar las
características de unión a epítopo de una combinación de anticuerpos
específicos de antígeno, agrupar anticuerpos en
"combinaciones" que representan características de unión a
epítopo distintas e identificar anticuerpos que tienen
características de unión deseadas.
Una realización de la presente invención
proporciona un método de ensayo de competición de anticuerpos para
determinar anticuerpos que se unen a un epítopo o un antígeno, que
comprende:
- \quad
- proporcionar un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno;
- \quad
- marcar cada anticuerpo de dicho conjunto para formar un conjunto de anticuerpos de referencia marcados de modo que cada anticuerpo de referencia marcado puede distinguirse de todos los demás anticuerpos de referencia marcados en dicho conjunto de anticuerpos de referencia marcados;
- \quad
- proporcionar un anticuerpo sonda que se une a dicho antígeno;
- \quad
- poner en contacto dicho anticuerpo sonda con dicho conjunto de anticuerpos de referencia marcados en presencia de dicho antígeno;
- \quad
- detectar el anticuerpo sonda unido en un complejo que comprende dicho antígeno, un anticuerpo de referencia marcado unido a dicho antígeno y dicho anticuerpo sonda unido a dicho antígeno;
- \quad
- identificar cada dicho anticuerpo de referencia marcado unido a dicho antígeno en cada dicho complejo;
- \quad
- determinar si dicho anticuerpo sonda compite con cualquier anticuerpo de referencia en dicho conjunto de anticuerpos de referencia marcados, en el que la competición indica que dicho anticuerpo sonda se une al mismo epítopo que otro anticuerpo en dicho conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno.
El método para clasificar anticuerpos basándose
en las características de unión incluye
- a)
- proporcionar un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno, marcar cada anticuerpos en el conjunto para formar un conjunto de anticuerpos de referencia marcados de modo que cada anticuerpo de referencia marcado puede distinguirse de todos los todos anticuerpos de referencia marcados en el conjunto de anticuerpos de referencia marcados, seleccionar un anticuerpo sonda del conjunto de anticuerpos que se unen al antígeno, poner en contacto el anticuerpo sonda con el conjunto de anticuerpos de referencia marcados en presencia del antígeno, detectar el anticuerpo sonda en un complejo que incluye un anticuerpo de referencia marcado unido al antígeno, el antígeno y el anticuerpo sonda unido al antígeno; y
- b)
- proporcionar datos de entrada que representan los resultados de al menos un ensayo de competición de anticuerpos usando un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno como en la etapa a), normalizar los datos de entrada para generar una matriz de intensidad normalizada, calcular al menos una matriz de disimilitud que comprende generar una matriz umbral a partir de la matriz de intensidad normalizada y calcular una matriz de disimilitud a partir de la matriz umbral, y agrupar anticuerpos basándose en los valores de disimilitud en celdas de la matriz de disimilitud, para determinar los patrones de unión a epítopo del conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno. Los datos de entrada pueden generarse mediante un ensayo de alto rendimiento, preferiblemente mediante el ensayo combinación de anticuerpos competitiva multiplexada (MCAB). Preferiblemente, se usa el procedimiento de reconocimiento del patrón competitivo para el análisis de datos.
Para el método de ensayo de competición de
anticuerpos, el anticuerpo sonda puede marcarse y detectarse en un
complejo que incluye un anticuerpo de referencia marcado unido al
antígeno, el antígeno y el anticuerpo sonda marcado unido al
antígeno, que permite la determinación de si el anticuerpo sonda
marcado compite con cualquier anticuerpo de referencia en el
conjunto de anticuerpos de referencia marcados, porque la
competición indica que el anticuerpo sonda se une al mismo epítopo
que otro anticuerpo en el conjunto de anticuerpos que se unen a un
antígeno. El anticuerpo sonda puede marcarse, por ejemplo, con un
marcador enzimático, o un marcador colorimétrico, o un marcador
fluorescente o un marcador radiactivo.
En una realización preferida del método de
ensayo de competición de anticuerpos, se usa un anticuerpo de
detección para detectar el anticuerpo sonda unido, en el que el
anticuerpo de detección se une sólo al anticuerpo sonda y no al
anticuerpo de referencia. El anticuerpo de detección detecta el
anticuerpo sonda unido en el complejo que incluye un anticuerpo de
referencia marcado unido al antígeno, el antígeno y el anticuerpo
sonda marcado unido al antígeno. Se usa un anticuerpo de detección
marcado para detectar el anticuerpo sonda unido, en el que puede
marcarse el anticuerpo de detección, por ejemplo, con un marcador
enzimático, o un marcador colorimétrico, o un marcador fluorescente
o un marcador radiactivo. Alternativamente, el anticuerpo de
detección se detecta usando un medio de detección tal como una
proteína de unión a anticuerpo.
En particular, el método de ensayo de
competición de anticuerpos para determinar anticuerpos que se unen a
un epítopo sobre un antígeno incluye proporcionar un conjunto de
anticuerpos que se unen a un antígeno, marcar cada anticuerpo en el
conjunto con una perla coloreada de manera única para formar un
conjunto de anticuerpos de referencia marcados de modo que cada
anticuerpo de referencia marcado puede distinguirse de todos los
demás anticuerpos de referencia marcados en el conjunto de
anticuerpos de referencia marcados, seleccionar un anticuerpo sonda
del conjunto de anticuerpos que se unen al antígeno, poner en
contacto el anticuerpo sonda con el conjunto de anticuerpos de
referencia marcados en presencia del antígeno, detectar el
anticuerpo sonda unido en un complejo que incluye un anticuerpo de
referencia marcado unido al antígeno, el antígeno y el anticuerpo
sonda unido al antígeno, y determinar si el anticuerpo sonda
compite con cualquier anticuerpo de referencia en el conjunto de
anticuerpos de referencia marcados, en el que la competición indica
que el anticuerpo sonda se une al mismo epítopo que otro anticuerpo
en el conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno. Cada perla
coloreada de manera única puede tener un espectro de emisión
distinto. El anticuerpo sonda puede marcarse, por ejemplo, con un
marcador enzimático, o un marcador colorimétrico, o un marcador
fluorescente, o un marcador radiactivo. Alternativamente, se usa un
anticuerpo de detección para detectar el anticuerpo sonda unido, en
el que el anticuerpo de detección puede estar marcado. El anticuerpo
de detección marcado puede marcarse, por ejemplo, con un marcador
enzimático, o un marcador colorimétrico, o un marcador fluorescente,
o un marcador radiactivo.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona un método para clasificar anticuerpos basándose en las
características de unión proporcionando datos de entrada a partir
de un ensayo de competición tal como se describió anteriormente,
representando dichos datos de entrada los resultados de al menos un
ensayo de competición de anticuerpos usando un conjunto de
anticuerpos que se unen a un antígeno, normalizando los datos de
entrada para generar una matriz de intensidad normalizada,
calculando al menos una matriz de disimilitud que comprende generar
una matriz umbral a partir de la matriz de intensidad normalizada y
calcular una matriz de disimilitud a partir de la matriz umbral y
agrupar anticuerpos basándose en los valores de disimilitud en
celdas de la matriz de disimilitud, para determinar los patrones de
unión a epítopo del conjunto de anticuerpos que se unen a un
antígeno.
Los datos de entrada pueden ser valores de
intensidad de señal que representan los resultados de un ensayo de
competición de anticuerpos usando un conjunto de anticuerpos que se
unen a un antígeno. Los datos de entrada que representan los
resultados de un ensayo de competición de anticuerpos pueden
almacenarse en forma de matriz. Los datos de entrada almacenados en
forma de matriz pueden estar en una matriz bidimensional o una
matriz multidimensional, y pueden almacenarse en una pluralidad de
matrices. Los datos de entrada almacenados en forma de matriz
pueden ser valores de intensidad de señal que representan los
resultados de un ensayo de competición de anticuerpos. El ensayo de
competición de anticuerpos puede ser el ensayo de combinación de
anticuerpos competitiva múltiple (MCAB). Los datos de entrada
almacenados en forma de matriz puede ser al menos una matriz en la
que cada celda de la matriz comprende el valor de intensidad de
señal de un ensayo de competición de anticuerpos individual.
La normalización de los datos de entrada para
generar una matriz de intensidad normalizada puede incluir generar
una matriz de intensidad normalizada para el fondo restando una
primera matriz con valores de intensidad de señal a partir de un
primer ensayo de competición de anticuerpos en el que no se añadió
antígeno (control negativo) de una segunda matriz con valores de
intensidad de señal a partir de un segundo ensayo de competición de
anticuerpos en el que se añadió antígeno. Se fija un valor umbral
mínimo para los valores de tampón de bloqueo, y cualquier valor de
tampón de bloqueo por debajo del valor umbral se ajusta hasta el
valor umbral antes de dicha generación de la matriz de intensidad
normalizada.
Si se desea, la etapa de normalización incluye
generar una matriz normalizada para la intensidad dividiendo cada
valor en una columna de la matriz de intensidad normalizada para el
fondo entre el valor de intensidad del tampón de bloqueo para la
columna. La etapa de normalización puede incluir además la
normalización con respecto a la señal de nivel inicial para
anticuerpos sonda dividiendo cada columna de la matriz normalizada
para la intensidad entre su valor diagonal correspondiente para
generar una matriz final normalizada para la intensidad. Antes de
dividir cada columna entre su valor diagonal correspondiente, se
compara cada valor diagonal con un valor umbral definido por el
usuario y cualquier dicho valor diagonal por debajo del valor
umbral definido por el usuario se ajusta hasta el valor umbral.
Si se desea, la etapa de normalización incluye
la generación de una matriz normalizada para la intensidad
dividiendo cada valor en una fila de la matriz de intensidad
normalizada para el fondo entre el valor de intensidad del tampón
de bloqueo para la fila. La etapa de normalización puede incluir
además la normalización con respecto a la señal de nivel inicial
para anticuerpos sonda dividiendo cada fila de la matriz normalizada
para la intensidad entre su correspondiente valor diagonal para
generar una matriz final normalizada para la intensidad. Antes de
dividir cada fila entre su correspondiente valor diagonal, se
compara cada valor diagonal con un valor umbral definido por el
usuario y cualquier dicho valor diagonal por debajo del valor umbral
definido por el usuario se ajusta hasta el valor umbral.
La generación de la matriz umbral implica fijar
el valor normalizado en cada celda de la matriz de intensidad
normalizada a un valor de uno (1) o cero (0), en la que los valores
normalizados inferiores o iguales a un valor umbral se fijan a un
valor de cero (0) y los valores normalizados superiores a un valor
umbral se fijan a un valor de uno
(1).
(1).
Se calcula al menos una matriz de disimilitud a
partir de la matriz umbral de unos y ceros determinando el número
de posiciones en las que difiere cada par de filas. Puede calcularse
una pluralidad de matrices de disimilitud usando una pluralidad de
valores umbral. El promedio de una pluralidad de matrices de
disimilitud puede calcularse y usarse como entrada para la etapa de
agrupación.
La agrupación de anticuerpos basándose en dichos
valores de disimilitud en celdas de dicha matriz de disimilitud
puede incluir una agrupación jerárquica. La agrupación jerárquica
incluye generar una jerarquía de subconjuntos anidados de
anticuerpos dentro de un conjunto de anticuerpos que se unen a un
antígeno determinando el par de anticuerpos en el conjunto que
tiene el valor de disimilitud más bajo, determinando luego el par de
anticuerpos que tiene el siguiente nivel de disimilitud más bajo y
repitiendo de manera interactiva esta determinación de cada par de
anticuerpos que tiene el siguiente valor de disimilitud más bajo
hasta que queda un par de anticuerpos, de modo que se genera una
jerarquía de subconjuntos anidados que indica la similitud de los
patrones de competición dentro del conjunto de anticuerpos. Se
determinan las agrupaciones basándose en los patrones de
competición.
Alternativamente, el procedimiento de análisis
de datos implica restar la matriz de datos para el experimento
llevado a cabo con antígeno de la matriz de datos para el
experimento sin antígeno. Entonces se usa el valor de cada celda
diagonal como valor de fondo para determinar la afinidad de unión
del anticuerpo en la columna correspondiente. Las celdas en la
matriz restada que tienen valores significativamente superiores al
valor diagonal correspondiente se destacan o se indican de otra
manera.
Pueden capturarse datos de la etapa de
agrupación, incluyendo mediante medios automatizados. En particular,
pueden capturarse datos de la etapa de agrupación en un formato
compatible con un ordenador o dispositivo de entrada de datos. La
etapa de agrupación puede generar una presentación visual, que puede
estar en un formato compatible con un ordenador o dispositivo de
entrada de datos. La presentación visual generada por la etapa de
agrupación puede ser una matriz de disimilitud. Pueden determinarse
agrupaciones mediante inspección visual del valor de disimilitud en
cada celda de la matriz de disimilitud. La matriz de disimilitud
puede incluir celdas que tienen un indicador visual de la
agrupación a la que pertenece el par de anticuerpos representado
por dicha celda, en la que el indicador visual puede ser un color, o
un sombreado, o un dibujo. Alternativamente, la presentación visual
puede ser un dendrograma definido mediante valores de disimilitud
calculados para un conjunto de anticuerpos. Un dendrograma de este
tipo tiene ramas que representan anticuerpos en el conjunto de
anticuerpos, en el que la disposición de las ramas representa
relaciones entre anticuerpos dentro del conjunto de anticuerpos, y
la disposición representa adicionalmente agrupaciones de anticuerpos
dentro del conjunto de anticuerpos. En un dendrograma de este tipo,
la longitud de cualquier rama representa el grado de similitud
entre el patrón de unión de los anticuerpos o agrupación de
anticuerpos representados por dicha rama.
Pueden analizarse datos de entrada que
representan los resultados de una pluralidad de ensayos de
competición de anticuerpos, en los que cada ensayo representa un
experimento individual usando un conjunto de anticuerpos que se
unen a un antígeno, en el que además cada experimento incluye al
menos un anticuerpo que también se somete a prueba en al menos otro
experimento. Cuando se analiza una pluralidad de experimentos, puede
generarse una matriz de intensidad normalizada individual para cada
experimento individual y puede generarse una única matriz de
intensidad normalizada calculando el valor de intensidad promedio de
cada par de anticuerpos representado en cada matriz de intensidad
normalizada individual. Puede generarse una única matriz de
disimilitud que representa cada par de anticuerpos sometidos a
prueba en la pluralidad de ensayos de competición de anticuerpos a
partir de la única matriz de intensidad normalizada.
Figura 1. Ilustración esquemática de una
realización de un ensayo de combinación por epítopos usando
tecnología de perlas marcadas en un único pocillo de una placa de
microtitulación. Cada anticuerpo de referencia se acopla a una
perla con un espectro de emisión distinto, formando un anticuerpo de
referencia marcado de manera única. Se coloca el conjunto completo
de anticuerpos de referencia marcados de manera única en el pocillo
de una placa de microtitulación de múltiples pocillos y se incuba
con antígeno. Se añade un anticuerpo sonda y se determina la
interacción del anticuerpo sonda con cada anticuerpo de referencia
marcado de manera única.
Figura 2. Correlación entre los valores de
intensidad del tampón de bloqueo y la intensidad promedio.
Figura 2A. Correlación entre la intensidad del tampón de bloqueo
y la intensidad promedio dentro de las filas. Valor de
intensidad del tampón de bloqueo para cada fila (eje y) representado
frente al valor de intensidad promedio de la fila omitiéndose el
valor del tampón del bloqueo (eje x). El ajuste de una línea a los
datos muestra una fuerte correlación lineal entre los valores del
tampón de bloqueo y los valores de intensidad promedio del resto de
la fila. Figura 2B. Correlación entre la intensidad del tampón de
bloqueo y la intensidad promedio dentro de las columna. Valor
de intensidad del tampón de bloqueo para cada columna (eje y)
representado frente al valor de intensidad promedio de la columna
omitiéndose el valor del tampón de bloqueo (eje-x).
El ajuste de una línea a los datos muestra una correlación lineal
relativamente débil entre los valores del tampón de bloqueo y los
valores de intensidad promedio del resto de la columna. Figura 2C.
Gráfico de dispersión de los valores de intensidad para la matriz
con antígeno y la matriz normalizada para el fondo. Este
gráfico muestra una fuerte correlación lineal (pendiente de
aproximadamente 1,0) para valores de señal restados altos,
indicando que la señal de fondo es mínima en relación con la señal
en presencia de antígeno. Los puntos se sombrean según el valor de
la fracción, calculado como la señal restada dividida por la señal
para el experimento con antígeno presente. Los valores de fracción
más pequeños (más cercanos a cero) corresponden a una contribución
del fondo alta y tienen un sombreado claro. Los valores de fracción
más grandes (más cercanos a 1) corresponden a una contribución del
fondo inferior y tienen un sombreado más oscuro.
Figura 3. Comparación de los resultados de la
combinación por epítopos con los resultados de FACS. Se
muestran los resultados de los experimentos con anticuerpos usando
el anticuerpo frente al ANTIGEN39, que comparan resultados usando
el método de combinación por epítopos descrito en el presente
documento con resultados usando citometría de flujo (citometría de
flujo activada por fluorescencia, FACS). Se asignan anticuerpos a
las combinaciones 1-15, tal como se indica mediante
las filas 1-15 en la columna izquierda lejana usando
el ensayo de combinación por epítopos. El sombreado de las celdas
indica anticuerpos que son positivos por FACS para células que
expresan el ANTIGEN39 (línea celular 786-0), y
cuando no hay sombreado indica anticuerpos que son negativos para
células que no expresan el ANTÍGENO29 (línea celular M14).
Figura 4. Disimilitud frente al valor de
fondo: efecto de la elección del valor de límite del umbral. La
figura muestra la cantidad de disimilitud entre los anticuerpos 2.1
y 2.25 calculada a diversos valores umbral. La cantidad de
disimilitud representa el valor para la matriz de disimilitud para
la entrada correspondiente a los dos anticuerpos, Ac 2.1 y Ac 2.25
para una serie de matrices de disimilitud calculadas usando
diferentes valores umbral. En este caso, el eje x es el valor
umbral y el eje y es el valor de disimilitud calculado usando ese
valor de límite umbral.
\newpage
Figura 5. Dendrograma para anticuerpos frente
al ANTÍGENO14. La longitud de las ramas que conectan dos
anticuerpos es proporcional al grado de similitud entre los dos
anticuerpos. Esta figura muestra que hay dos epítopos muy distintos
reconocidos por estos anticuerpos. Un epítopo es reconocido por los
anticuerpos 2.73, 2.4, 2.16, 2.15, 2.69, 2.19, 2.45, 2.1 y 2.25. Se
reconoce un epítopo diferente por los anticuerpos 2.13, 2.78, 2.24,
2.7, 2.76, 2.61, 2.12, 2.55, 2.31, 2.56 y 2.39. El anticuerpo 2.42
no tiene un patrón que sea muy similar a cualquier otro anticuerpo,
pero tiene alguna similitud perceptible con la segunda agrupación,
aunque puede reconocer aún un tercer epítopo que se solapa
parcialmente con el segundo epítopo.
Figura 6. Dendrogramas para anticuerpos
frente al ANTIGEN39. Figura 6A. Dendrograma para anticuerpos
frente al ANTIGEN39 para cinco conjuntos de datos experimentales de
entrada. El número o agrupaciones únicas de anticuerpos
sugieren que son varios epítopos diferentes, algunos de los cuales
pueden solaparse. Por ejemplo, la agrupación que contiene los
anticuerpos 1.17, 1.55, 1.16, 1.11 y 1.12 y la agrupación que
contiene 1.21, 2.12, 2.38, 2.35 y 2.1 parecen estar bastante
estrechamente relacionadas, siendo cada par de anticuerpos con la
excepción de 2.35 y 1.11 diferentes en no más del 25%. Este alto
grado de similitud a través de las dos agrupaciones sugiere que los
dos epítopos diferentes tienen por sí mismos un alto grado de
similitud. Figura 6B. Dendrograma para anticuerpos frente al
ANTIGEN39 para el experimento 1. Los anticuerpos 1.12, 1.63,
1.17, 1.55 y 2.12 se agrupan entre sí de manera coherente en este
experimento así como en otros experimentos, al igual que los
anticuerpos 1.46, 1.31, 2.17 y 1.29. Figura 6C. Dendrograma para
anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 2. Los
anticuerpos 1.57 y 1.61 se agrupan entre sí de manera coherente en
este experimento así como en otros experimentos. Figura 6D.
Dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el
experimento 3. Los anticuerpos 1.55, 1.12, 1.17, 2.12, 1.11 y
1.21 se agrupan entre sí de manera coherente en este experimento
así como en otros experimentos. Figura 6E. Dendrograma para
anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 4. Los
anticuerpos 1.17, 1.16, 1.55, 1.11 y 1.12 se agrupan entre sí de
manera coherente en este experimento así como en otros experimentos,
a igual que los anticuerpos 1.31, 1.46, 1.65, y 1.29, así como los
anticuerpos 1.57 y 1.61. Figura 6F. Dendrograma para anticuerpos
frente al ANTIGEN39 para el experimento 5. Los anticuerpos
1.21, 1.12, 2.12, 2.38, 2.35 y 2.1 se agrupan entre sí de manera
coherente en este experimento así como en otros experimentos.
Figura 7. Dendrogramas para agrupación de
anticuerpos monoclonales frente a IL-8. Figura
7A. Dendrogramas para una agrupación de siete anticuerpos
monoclonales frente a IL-8. El dendrograma de la
izquierda se genera mediante la agrupación de columnas, y el
dendrograma de la derecha mediante la agrupación de filas de una
matriz de intensidad de señal normalizada para el fondo. Ambos
dendrogramas indican que hay dos epítopos, usando un límite de
disimilitud de 0,25: un epítopo es reconocido por los anticuerpos
monoclonales HR26, a215, a203, a393 y a452; un segundo epítopo es
reconocido por los anticuerpos monoclonales K221 y a33. Figura 7B.
Dendrogramas para anticuerpos monoclonales frente a
IL-8 a partir de un análisis de agrupación combinada
que confluye con cinco conjuntos de datos experimentales
diferentes. Se generó el dendrograma de la izquierda mediante
la agrupación de columnas, mientras que se generó el dendrograma de
la derecha mediante la agrupación de filas de la matriz de
intensidad de señal normalizada para el fondo. Ambos dendrogramas
indican que hay dos epítopos, usando un límite de disimilitud de
0,25: un epítopo es reconocido por los anticuerpos monoclonales
a809, a928, HR26, a215 y D111; un segundo epítopo es reconocido por
los anticuerpos monoclonales a837, K221, a33, a142, a358, y a203,
a393 y a452. Figura 7C. Dendrogramas para una agrupación de nueve
anticuerpos monoclonales frente a IL-8. Se
generó el dendrograma de la derecha mediante la agrupación de
columnas y el dendrograma de la izquierda mediante la agrupación de
filas de la matriz de intensidad de señal normalizada para el fondo.
Ambos dendrogramas indican que hay dos epítopo, usando un límite de
disimilitud de 0,25: un epítopo es reconocido por los anticuerpos
monoclonales HR26 y a215; un segundo epítopo es reconocido por los
anticuerpos monoclonales K221, a33, a142, a203, a358, a393, y
a452.
Figura 8. Matrices de intensidad generadas en
la realización dada a conocer en el ejemplo 2 usando un conjunto de
anticuerpos frente al ANTÍGENO 14. La figura 8A es una tabla que
muestra la matriz de intensidad para el experimento realizado con
antígeno. La figura 8B es una tabla que muestra la matriz de
intensidad para el mismo experimento realizado sin antígeno
(control). Estas matrices se usan en matrices de datos de entrada
para etapas posteriores en el análisis de datos.
Figura 9. Matriz de diferencias para
anticuerpos frente a la diana ANTÍGENO14. Se genera la matriz de
diferencias restando la matriz correspondiente a valores obtenidos
a partir del experimento sin antígeno (véase la figura 8B) de la
matriz correspondiente a valores obtenidos a partir del experimento
con antígeno (véase la figura 8A) dada a conocer en el ejemplo
2.
Figura 10. Matriz de diferencias ajustada con
el valor umbral mínimo. Para los valores de intensidad del
ejemplo 2, se fija la intensidad de señal fiable mínima a 200
unidades de intensidad y se fijan los valores por debajo del umbral
mínimo al umbral de 200.
Figura 11. Matriz normalizada para las
filas. Se ajusta cada fila en la matriz de diferencias ajustada
de la figura 10 dividiéndola entre el último valor de intensidad de
la fila, que corresponde al valor de intensidad para perlas a las
que se añade tampón de bloqueo en lugar de anticuerpo primario. Esto
ajusta para la intensidad entre pocillos.
Figura 12. Matriz normalizada diagonal.
Todas las columnas excepto la correspondiente al anticuerpo 2.42
estaban normalizadas para las columnas. Se lleva a cabo la división
de cada columna entre su diagonal correspondiente para medir cada
intensidad en relación con una intensidad que se sabe que refleja la
competición, es decir, la competición frente a sí misma.
Figura 13. Matriz de reconocimiento del
patrón de anticuerpos. Para los datos a partir de la realización
dada a conocer en el ejemplo 2, se fijaron hasta cero los valores
de intensidad por debajo del umbral definido por el usuario. Se
fijó el umbral definido por el usuario hasta dos (2) veces los
valores de intensidad diagonales. Se fijaron los valores restantes
a uno.
Figura 14. Matriz de disimilitud. Para
los datos a partir de la realización dada A conocer en el ejemplo
2, se genera una matriz de disimilitud a partir de la matriz de
ceros y unos mostrada en la figura 13, fijando la entrada en la
fila i y la columna j con respecto a la fracción de las posiciones
en las que difieren las dos filas, i y j. La figura 14 muestra el
número de posiciones, de un total de 22, en las que se diferencian
los patrones para dos anticuerpos cualesquiera para el conjunto de
anticuerpos generados frente a la diana ANTÍGENO14.
Figura 15. Matriz de disimilitud
promedio. Después de que se generaran matrices de disimilitud
separadas a partir de cada uno de varios valores umbral que
oscilaban desde 1,5 hasta 2,5 veces los valores de las diagonales,
se calculó el promedio de estas matrices de disimilitud (figura 15)
y se usó como entrada para el procedimiento de agrupación.
Figura 16. Matriz de disimilitud promedio
permutada. Para los datos a partir de la realización dada a
conocer en el ejemplo 2, pueden visualizarse agrupaciones en las
matrices. En la figura 16, se dispusieron las filas y columnas de
la matriz de disimilitud según el orden de las "hojas" o clados
en el dendrograma mostrado en la figura 5, y se visualizaron las
celdas individuales codificadas según el grado de disimilitud.
Figura 17. Matriz de intensidad normalizada
permutada. Para los datos a partir de la realización dada a
conocer en el ejemplo 2, se dispusieron las filas y las columnas de
la matriz de intensidad normalizada según el orden de las hojas en
el dendrograma mostrado en la figura 5, y se codificaron las celdas
visualmente según sus valores de intensidad normalizados.
Figura 18. Matriz de disimilitud promedio
permutada para cinco conjuntos de dados de entrada para el
ANTIGEN39. Los datos a partir de cinco experimentos que se
realizaron usando anticuerpos frente a la diana ANTIGEN39 (véase el
ejemplo 3) produjeron cinco conjuntos de datos de entrada. Se
generaron matrices de disimilitud para cada conjunto de datos de
entrada y se generó una matriz de disimilitud promedio, y se
dispusieron (permutaron) las filas y columnas según la disposición
del/de los correspondiente(s) dendrograma(s)
mostrado(s) en la figura 6.
Figura 19. Matriz de intensidad normalizada
permutada para cinco conjuntos de datos de entrada para el
ANTIGEN39. Los datos a partir de cinco experimentos que se
realizaron usando anticuerpos frente a la diana ANTIGEN39 (véase el
ejemplo 3) produjeron cinco conjuntos de datos de entrada. Se generó
una matriz de intensidad normalizada para los cinco conjuntos de
datos de entrada y se dispusieron (permutaron) las filas y columnas
según la disposición del/de los correspondiente(s)
dendrograma(s) mostrado(s) en la figura 6.
Figura 20. Matriz de disimilitud promedio
permutada para el experimento 1 usando un conjunto de anticuerpos
frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del
conjunto de anticuerpos analizados en el experimento 1 (ejemplo 3).
Véase el dendrograma mostrado en la figura 6B.
Figura 21. Matriz de intensidad normalizada
permutada para el experimento 1 usando un conjunto de anticuerpos
frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del
conjunto de anticuerpos analizado en el experimento 1 (ejemplo 3).
Véase el dendrograma mostrado en la figura 6B.
Figura 22. Matriz de disimilitud promedio
permutada para el experimento 2 usando un conjunto de anticuerpos
frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del
conjunto de anticuerpos analizado en el experimento 2 (ejemplo 3).
Véase el dendrograma mostrado en la figura 6C.
Figura 23. Matriz de intensidad normalizada
permutada para el experimento 2 usando un conjunto de anticuerpos
frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del
conjunto de anticuerpos analizado en el experimento 2 (ejemplo 3).
Véase el dendrograma mostrado en la figura 6C.
Figura 24. Matriz de disimilitud promedio
permutada para el experimento 3 usando un conjunto de anticuerpos
frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del
conjunto de anticuerpos analizado en el experimento 3 (ejemplo 3).
Véase el dendrograma mostrado en la figura 6D.
Figura 25. Matriz de intensidad normalizada
permutada para el experimento 3 usando un conjunto de anticuerpos
frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del
conjunto de anticuerpos analizado en el experimento 3 (ejemplo 3).
Véase el dendrograma mostrado en la figura 6D.
Figura 26. Matriz de disimilitud promedio
permutada para el experimento 4 usando un conjunto de anticuerpos
frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del
conjunto de anticuerpos analizado en el experimento 4 (ejemplo 3).
Véase el dendrograma mostrado en la figura 6E.
Figura 27. Matriz de intensidad normalizada
permutada para el experimento 4 usando un conjunto de anticuerpos
frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del
conjunto de anticuerpos analizado en el experimento 4 (ejemplo 3).
Véase el dendrograma mostrado en la figura 6E.
Figura 28. Matriz de disimilitud promedio
permutada para el experimento 5 usando un conjunto de anticuerpos
frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del
conjunto de anticuerpos analizado en el experimento 5 (ejemplo 3).
Véase el dendrograma mostrado en la figura 6F.
Figura 29. Matriz de intensidad normalizada
permutada para el experimento 5 usando un conjunto de anticuerpos
frente a la diana ANTIGEN39. Se analizaron datos a partir del
conjunto de anticuerpos analizado en el experimento 5 (Ejemplo 3).
Véase el dendrograma mostrado en la figura 6F.
Figura 30. Agrupaciones identificadas en los
experimentos 1-5 usando conjuntos de anticuerpos
frente a la diana ANTIGEN39. La figura 30 resume las
agrupaciones identificadas para cada uno de los cinco conjuntos de
datos individuales y para el conjunto de datos combinados para todos
los anticuerpos generados en los cinco experimentos dados a conocer
en el ejemplo 3.
Con el aumento de la eficacia de fusión
produciendo grandes números de anticuerpos específicos de antígeno
a partir de cada experimento de fusión
hibridoma-célula, un método de selección de manejo y
priorización de grandes números de anticuerpos se hace cada vez más
importante. Cuando se ha generado un conjunto de anticuerpos
monoclonales frente a un antígeno diana, diferentes anticuerpos del
conjunto reconocerán diferentes epítopos, y también tendrán
afinidades de unión variables. Por tanto, para seleccionar
eficazmente grandes números de anticuerpos, es importante
determinar qué anticuerpo se une a cada epítopo, y determinar la
afinidad de unión para cada anticuerpo.
La combinación por epítopos, tal como se
describe en el presente documento, es el proceso de agrupar
anticuerpos basándose en los epítopos que reconocen. Más
particularmente, la combinación por epítopos comprende métodos y
sistemas para discriminar las propiedades de reconocimiento de
epítopo de diferentes anticuerpos, combinado con procedimientos
informáticos para agrupar anticuerpos basándose en sus propiedades
de reconocimiento de epítopo e identificando anticuerpos que tienen
especificidades de unión distintas. En consecuencia, las
realizaciones incluyen ensayos para determinar las propiedades de
unión a epítopo de los anticuerpos, y procedimientos para analizar
datos generados a partir de tales ensayos.
La invención es un método basado en competición
de clasificación de un conjunto de anticuerpos que se han generado
frente a un antígeno. Este método depende de la realización de una
serie de ensayos en los que cada anticuerpo a partir del conjunto
se somete a prueba para determinar la unión competitiva frente a
todos los demás anticuerpos del conjunto. Por tanto, se usará cada
anticuerpo en dos modos diferentes: en al menos un ensayo, se usará
cada anticuerpo en el modo de "detección" como el "anticuerpo
sonda" que se somete a prueba frente a todos los demás
anticuerpos en el conjunto; en otros ensayos, se usará el anticuerpo
en el modo de "captura" como un "anticuerpo de
referencia" dentro del conjunto de anticuerpos de referencia que
está sometiéndose a ensayo. Dentro del conjunto de anticuerpos de
referencia, cada anticuerpo de referencia estará marcado de manera
única de una forma que permita la detección e identificación de cada
anticuerpo de referencia dentro de una mezcla de anticuerpos de
referencia. El método depende de la formación de "sándwiches" o
complejos que implican anticuerpos de referencia, antígeno y
anticuerpo sonda, y la detección de la formación o falta de
formación de estos complejos. Debido a que cada anticuerpo de
referencia en el conjunto está marcado de manera única, es posible
determinar de manera accesible si se ha formado un complejo para
cada anticuerpo de referencia presente en el conjunto de
anticuerpos de referencia que está sometiéndose a ensayo.
El método comienza seleccionando un anticuerpo a
partir del conjunto de anticuerpos frente a un antígeno, en el que
el anticuerpo seleccionado servirá como "anticuerpo sonda" que
va a someterse a prueba para determinar la unión competitiva frente
a todos los demás anticuerpos del conjunto. Una mezcla que contiene
todos los anticuerpos servirá como conjunto de "anticuerpos de
referencia" para el ensayo, en el que cada anticuerpo de
referencia en la mezcla está marcado de manera única. En un ensayo,
se pone en contacto el anticuerpo sonda con el conjunto de
anticuerpos de referencia en presencia del antígeno diana. En
consecuencia, se formará un complejo entre el anticuerpo sonda y
cualquier otro anticuerpo en el conjunto que no compite por el mismo
epítopo en el antígeno diana. No se formará un complejo entre el
anticuerpo sonda y cualquier otro anticuerpo en el conjunto que
compite por el mismo epítopo en el antígeno diana. Se detecta la
formación de complejos usando un anticuerpo de detección marcado
que se une al anticuerpo sonda. Debido a que cada anticuerpo de
referencia en la mezcla está marcado de manera única, es posible
determinar para cada anticuerpo de referencia si ese anticuerpo de
referencia forma o no forma un complejo con el anticuerpo sonda. Por
tanto, puede determinarse qué anticuerpos en la mezcla compiten con
el anticuerpo sonda y se unen al mismo epítopo que el anticuerpo
sonda.
Se usa cada anticuerpo como anticuerpo sonda en
al menos un ensayo. Repitiendo esta método de someter a prueba cada
anticuerpo individual del conjunto frente al conjunto completo de
anticuerpos, pueden generarse las afinidades de unión competitiva
para el conjunto completo de anticuerpos frente a un antígeno. A
partir de tales mediciones de afinidad, puede determinarse qué
anticuerpos del conjunto tienen características de unión similares a
otros anticuerpos del conjunto, permitiendo de ese modo el
agrupamiento o "combinación" de cada anticuerpo basándose en
su perfil de unión a epítopo. Una tabla de las mediciones de la
afinidad de unión competitiva es un método adecuado para
representar visualmente los resultados del ensayo. Una realización
preferida de este método es el ensayo de combinación de anticuerpos
competitiva multiplexada (MCAB) para la selección de anticuerpos de
alto rendimiento.
Debido a que esta realización depende de someter
a prueba la competición de anticuerpos, en la que se somete a
prueba un único anticuerpo frente al conjunto completo de
anticuerpos generados frente a un antígeno, un desafío para
implementar este método se refiere al mecanismo usado para
identificar de manera única y medir cuantitativamente complejos
formados entre el único anticuerpo y uno cualquiera de los otros
anticuerpos en el conjunto. Es esta medición cuantitativa la que
proporciona una estimación de si dos anticuerpos están compitiendo
por el mismo epítopo sobre el antígeno.
Tal como se describe a continuación, las
realizaciones de la invención se refieren al marcaje de manera única
de cada anticuerpo de referencia en el conjunto antes de crear una
mezcla de todos los anticuerpos. Este marcador único, tal como se
discute a continuación, no se limita a ningún mecanismo particular.
En su lugar, se contempla que sería adecuado cualquier método que
proporcione una forma de identificar cada anticuerpo de referencia
dentro de la mezcla, permitiendo distinguir cada anticuerpo de
referencia en el conjunto de todos los demás anticuerpos de
referencia en el conjunto. Por ejemplo, cada anticuerpo de
referencia puede marcarse colorimétricamente de modo que puede
determinarse el color particular de cada anticuerpo en el conjunto.
Alternativamente, cada anticuerpo de referencia en el conjunto
podría marcarse radiactivamente usando diferentes isótopos
radiactivos. El anticuerpo de referencia puede marcarse acoplando,
uniendo o enlazando el anticuerpo a un objeto marcado tal como una
perla u otra superficie.
Una vez que cada anticuerpo de referencia en el
conjunto se ha marcado de manera única, se forma una mezcla que
contiene todos los anticuerpos de referencia. Se añade el antígeno a
la mezcla y se añade el anticuerpo sonda a la mezcla. Es necesario
un marcador de detección con el fin de detectar complejos que
contienen anticuerpo sonda unido. Un anticuerpo de detección puede
ser un anticuerpo de detección marcado o puede ser otro marcador
que se une al anticuerpo sonda. Por ejemplo, cuando está
sometiéndose a prueba un conjunto de anticuerpos monoclonales
humanos, un anticuerpo monoclonal de ratón anti-ser
humano es adecuado para su uso como anticuerpo de detección. El
marcador de detección se elige para que sea distinto de todos los
demás marcadores en la mezcla que se usan para marcar anticuerpos
de referencia. Por ejemplo, un anticuerpo de detección marcado
podría marcarse con un único color, o marcarse radiactivamente o
marcarse mediante un marcador fluorescente particular tal como
ficoeritrina (PE).
El diseño de un experimento debe incluir
seleccionar condiciones tales que el anticuerpo de detección se una
sólo al anticuerpo sonda, y no se una a los anticuerpos de
referencia. En realizaciones en las que los anticuerpos de
referencia se acoplan a perlas u otros materiales a través de
anticuerpos, el anticuerpo que acopla el anticuerpo de referencia a
la perla (el "anticuerpo de captura") será el mismo anticuerpo
que el anticuerpo de detección. Según esta realización de la
invención, el anticuerpo de detección se elige o modifica
específicamente de modo que el anticuerpo de detección se une sólo
al anticuerpo sonda y no se une al anticuerpo de referencia. Usando
el mismo anticuerpo tanto para la detección como para la captura,
cada uno bloqueará la unión del otro a sus dianas respectivas. En
consecuencia, cuando el anticuerpo de captura se une al anticuerpo
de referencia, bloqueará la unión del anticuerpo de detección al
mismo epítopo en el anticuerpo de referencia y producirá un
resultado de falso positivo. Los anticuerpos adecuados para su uso
como anticuerpos de detección incluyen anticuerpos
anti-IgG2, IgG3 e IgG4 humanas de ratón disponibles
de Calbiochem, (número de catálogo 411427, Ig kappa de ratón
anti-ser humano disponible de Southern Biotechnology
Associates, Inc. (números de catálogo 9220-01 y
9220-08, y anticuerpo anti-hIgG de
ratón de PharMingen (números de catálogo 555784 y 555785).
Una vez que el anticuerpo de detección se ha
añadido a la mezcla, entonces puede analizarse la mezcla completa
para detectar complejos entre el anticuerpo de detección marcado, el
anticuerpo sonda unido, el antígeno y el anticuerpo de referencia
marcado de manera única. El método de detección debe permitir la
detección de complejos (o falta de los mismos) para cada anticuerpo
de referencia marcado de manera única en la mezcla.
La detección de un complejo formado entre un
anticuerpo sonda y cada anticuerpo de referencia en el conjunto
indica, para cada anticuerpo de referencia, si ese anticuerpo de
referencia compite con el anticuerpo sonda por la unión al mismo (o
casi) epítopo. Debido a que la mezcla de anticuerpos de referencia
incluirá el anticuerpo que está usándose como anticuerpo de
referencia, se espera que éste proporcione un control negativo. La
detección de la formación de complejo permite la medición de las
afinidades competitivas de los anticuerpos en el conjunto que está
sometiéndose a prueba. Esta medición de las afinidades competitivas
se usa entonces para clasificar cada anticuerpo en el conjunto
basándose en cómo de fuerte o de débil se unen a los mismos epítopos
en el antígeno diana. Esto proporciona un método rápido para
agrupar anticuerpos en un conjunto basándose en sus características
de unión.
En una realización, pueden examinarse
simultáneamente grandes números de anticuerpos para determinar sus
propiedades de reconocimiento de epítopo en un único experimento
según realizaciones de la presente invención, tal como se describe
a continuación. Generalmente, el término "experimento" se usa
de manera no exclusiva en el presente documento para indicar una
colección de ensayos de anticuerpo individuales y controles
adecuados. El término "ensayo" se usa de manera no exclusiva
en el presente documento para referirse a ensayos individuales, por
ejemplo reacciones llevadas a cabo en un único pocillo de una placa
de microtitulación usando un único anticuerpo sonda, o puede usarse
para referirse a una colección de ensayos o para referirse a un
método de medición de la unión y competición de anticuerpos tal
como se describe en el presente documento.
En una realización, se examinan simultáneamente
grandes números de anticuerpos para determinar sus propiedades de
reconocimiento de epítopo usando un ensayo de tipo "sándwich"
que implica un conjunto de anticuerpos de referencia en el que cada
anticuerpo de referencia en el conjunto está unido a un anticuerpo
de "captura" marcado de manera única. El anticuerpo de captura
puede ser, por ejemplo, un anticuerpo marcado colorimétricamente
que tiene una fuerte afinidad por los anticuerpos del conjunto. Como
ejemplo, el anticuerpo de captura puede se un anticuerpo
anti-IgG humana o anti-Igkappa
humana de ratón, cabra o bovino marcado. Aunque las realizaciones
descritas en el presente documento usan un anticuerpo
anti-IgG humana monoclonal de ratón, otros
anticuerpos de captura similares que se unen a los anticuerpos que
están estudiándose están dentro del alcance de la invención. Por
tanto, un experto en la técnica puede seleccionar un anticuerpo de
captura apropiado basándose en el origen del conjunto de
anticuerpos que está sometiéndose a prueba.
Por tanto, una realización de la presente
invención proporciona un método de clasificación, por ejemplo, de
qué epítopos en un antígeno diana se unen a cincuenta (50)
anticuerpos diferentes generados frente al antígeno diana. Una vez
que se ha determinado que los 50 anticuerpos tienen alguna afinidad
por un antígeno diana, se usan los métodos descritos a continuación
para determinar qué anticuerpos del grupo de 50 se unen al mismo
epítopo. Estos métodos se realizan usando cada uno de los 50
anticuerpos como anticuerpo sonda para competir de manera cruzada
frente a una mezcla de todos los 50 anticuerpos (los anticuerpos de
referencia), en los que los 50 anticuerpos de referencia marcados
de manera única en la mezcla están marcados cada uno mediante un
anticuerpo de captura. Los anticuerpos que reconocen el mismo
epítopo competirán entre sí, mientras que los anticuerpos que no
compiten se asume que no se unen al mismo epítopo. Mediante el
marcaje de manera única de un gran número de anticuerpos en una
única reacción, tal como se describe a continuación, estos métodos
permiten que un anticuerpo preseleccionado compita frente a 10, 25,
50, 100, 200, 300 o más anticuerpos al mismo tiempo. Por esta
razón, la elección de los 50 anticuerpos de prueba en un experimento
es arbitraria, y no debe observarse como limitativa de la
invención.
Preferiblemente, se usa el ensayo de combinación
de anticuerpos competitiva múltiple (MCAB). Más preferiblemente, se
pone en práctica el ensayo de MCAB utilizando el sistema LUMINEX
(Luminex Corp., Austin TX), en el que pueden combinarse
simultáneamente hasta 100 anticuerpos usando el método ilustrado en
la figura 1. El ensayo de MCAB se basa en la unión competitiva de
dos anticuerpos a una única molécula de antígeno. Se usa dos veces
el conjunto completo de anticuerpos que va a caracterizarse en el
ensayo de MCAB, en los modos de "captura" y "detección"
en el ensayo de tipo sándwich de MCAB.
En un experimento, cada anticuerpo de captura
está marcado de manera única. Una vez que el anticuerpo de captura
se ha marcado de manera única, se expone a uno de los conjuntos de
anticuerpos que están sometiéndose a prueba, formando un anticuerpo
de referencia que está marcado de manera única. Se repite esto para
el resto de anticuerpos del conjunto de modo que se marca cada
anticuerpo con un anticuerpo de captura coloreado diferente. Por
ejemplo, cuando están sometiéndose a prueba 50 anticuerpos, se crea
una mezcla de anticuerpos de referencia marcados mezclando todos
los 50 anticuerpos de referencia marcados de manera única en un
único pocillo de reacción. Por esta razón, es útil que cada
marcador tenga una propiedad distinta que permita distinguirlo o
detectarlo cuando se mezcla con otros marcadores. En una
realización preferida, cada anticuerpo de captura se marca con un
patrón distinto de fluorocromos de modo que puedan distinguirse
colorimétricamente entre sí.
Una vez que se crea la mezcla de anticuerpo de
prueba, se coloca en múltiples pocillos de, por ejemplo, una placa
de microtitulación. En este ejemplo, la misma mezcla de anticuerpos
se colocaría en cada uno de los 50 pocillos de microtitulación y
entonces se incubaría la mezcla de cada pocillo con el antígeno
diana como una primera etapa del ensayo de competición. Tras la
incubación con el antígeno diana, se añade a cada posillo un único
anticuerpo sonda seleccionado del conjunto original de 50
anticuerpos. En este ejemplo, sólo se añade anticuerpo sonda a cada
mezcla de anticuerpo de referencia. Si cualquier anticuerpo de
referencia marcado en el pocillo se une al antígeno diana en el
mismo epítopo que el anticuerpo sonda, competirán entre sí por el
sitio de unión del epítopo. Un experto en la técnica entiende que
las realizaciones de la invención no se limitan a añadir sólo un
único anticuerpo sonda a cada pocillo. Se contemplan otros métodos
en los que se añaden a la mezcla múltiples anticuerpos sonda, cada
uno marcado de manera distinguible entre sí.
Con el fin de determinar si el anticuerpo sonda
se ha unido a cualquiera de los 50 anticuerpos de referencia
marcados en el pocillo, se añade un anticuerpo de detección marcado
a cada una de las 50 reacciones. En una realización, el anticuerpo
de detección marcado en una versión marcada de manera diferente del
mismo anticuerpo usado como anticuerpo de captura. Por tanto, por
ejemplo, el anticuerpo de detección puede ser un anticuerpo
anti-IgG humana o un anticuerpo
anti-Igkappa humana de ratón. El anticuerpo de
detección se unirá a, y marcará, el anticuerpo sonda que se colocó
en el pocillo.
El marcador sobre el anticuerpo de detección
permite la detección y medición de la cantidad de anticuerpo sonda
unido a un complejo formado por un anticuerpo de referencia, el
antígeno y el anticuerpo sonda. Este complejo sirve como una
medición de la competición entre el anticuerpo sonda y el anticuerpo
de referencia. El anticuerpo de detección puede marcarse con
cualquier marcador adecuado que facilite la detección del anticuerpo
secundario. Por ejemplo, un anticuerpo de detección puede marcarse
con biotina, que facilita la detección fluorescente del anticuerpo
sonda cuando se añade estreptavidina-ficoeritrina
(PE). El anticuerpo de detección puede marcarse con cualquier
marcador que determine de manera única su presencia como parte de un
complejo, tal como biotina, digoxigenina, lectina, radioisótopos,
enzimas u otros marcadores. Si se desea, el marcador también puede
facilitar el aislamiento de perlas u otras superficies con complejos
unidos de anticuerpo-antígeno.
La cantidad de anticuerpo de detección marcado
unido a cada anticuerpo de referencia marcado de manera única
indica la cantidad de anticuerpo sonda unido, y se une el anticuerpo
de detección marcado al anticuerpo sonda unido al antígeno unido al
anticuerpo de referencia marcado. La medición de la cantidad de
anticuerpo de detección marcado unido a cada uno de los 50
anticuerpos de referencia marcados indica la cantidad de anticuerpo
sonda unido que puede obtenerse, en la que la cantidad de
anticuerpo sonda unido es un indicador de la similitud o
disimilitud de las propiedades de reconocimiento de epítopo de los
dos anticuerpos (sonda y referencia). Si se detecta una cantidad
medible del anticuerpo de detección marcado sobre el complejo de
anticuerpo de referencia marcado-antígeno, se
entiende que indica que el anticuerpo sonda y el anticuerpo de
referencia no se unen al mismo epítopo en el antígeno. A la
inversa, si se detecta poco o nada del anticuerpo de detección
medible sobre el complejo de anticuerpo de referencia
marcado-antígeno, entonces se entiende que indica
que el anticuerpo sonda para esa reacción se une a epítopos
idénticos o muy similares en el antígeno. Si se detecta una
cantidad pequeña de anticuerpo de detección sobre el complejo
anticuerpo de referencia-antígeno, se entiende que
indica que los anticuerpos de referencia y sonda pueden tener
propiedades de reconocimiento de epítopo similares pero no
idénticas, por ejemplo, la unión del anticuerpo de referencia a su
epítopo interfiere con, pero no inhibe completamente la unión del
anticuerpo sonda a su epítopo.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona un método para detectar tanto el anticuerpo de
referencia como la cantidad de anticuerpo sonda unido a un
antígeno. Si se han mezclado complejos de anticuerpos que contienen
anticuerpos de referencia, entonces puede usarse la propiedad única
proporcionada por los marcadores únicos sobre el anticuerpo de
captura para identificar el anticuerpo de referencia acoplado a esa
perla. Preferiblemente, esa propiedad distinta es un espectro de
emisión único.
La cantidad de anticuerpo sonda unido a
cualquier anticuerpo de referencia puede determinarse midiendo la
cantidad de marcador de detección unido al complejo. El marcador de
detección puede ser un anticuerpo de detección marcado unido al
anticuerpo sonda unido al complejo, o puede ser un marcador unido al
anticuerpo sonda. Por tanto, pueden medirse las propiedades de
reconocimiento de epítopo tanto de un anticuerpo de referencia como
de un anticuerpo sonda usando una medición comparativa de la
competición entre los dos anticuerpos para un epítopo.
Pueden determinarse las condiciones para
optimizar los procedimientos mediante métodos empíricos y el
conocimiento de un experto en la técnica. Pueden variarse el tiempo
de incubación, temperatura, tampones, reactivos y otros factores
hasta que se obtiene una señal fuerte o clara. Por ejemplo, un
experto en la técnica puede determinar empíricamente la
concentración óptima de diversos anticuerpos, sometiendo a prueba
anticuerpos y antígenos a diferentes concentraciones y buscando la
concentración que produce la señal más fuerte u otro resultado
deseado. En una realización, se determina la concentración óptima de
anticuerpos primario y secundario (es decir, anticuerpos que van a
combinarse) mediante una doble titulación de dos anticuerpos
producidos frente a epítopos diferentes del mismo antígeno, en
presencia de un anticuerpo de control negativo que no reconoce el
antígeno.
En una realización preferida, se examinan
simultáneamente grandes números de anticuerpos para determinar sus
propiedades de reconocimiento de epítopo en un único ensayo usando
microesferas o perlas codificadas por color para identificar
múltiples reacciones en un único tubo o pocillo, preferiblemente
usando un sistema disponible de Luminex Corporation (Luminex Corp,
Austin TX), y lo más preferiblemente usando el sistema Luminex 100.
Preferiblemente, se lleva a cabo el ensayo de MCAB usando la
tecnología Luminex. En otra realización preferida, se unen hasta
100 anticuerpos diferentes que van a someterse a prueba perlas
Luminex con 100 colores distintos. Este sistema proporciona 100
conjuntos diferentes de perlas de poliestireno con cantidades
variables de fluorocromos incrustados. Esto da a cada conjunto de
perlas un espectro de emisión fluorescente distinto y por tanto un
código de color distinto.
Para caracterizar las propiedades de unión de
anticuerpos usando el sistema Luminex 100, se recubren las perlas
con un anticuerpo de captura que se une covalentemente a cada perla;
preferiblemente se usa un anticuerpo monoclonal
anti-IgG humana o anti-Igkappa
humana de ratón. Cada conjunto de perlas se incuba entonces en un
pocillo que contiene un anticuerpo de referencia que va a
caracterizarse (por ejemplo, que contiene sobrenadante de
hibridoma) de manera que si se forma un complejo entre la perla, el
anticuerpo de captura y el anticuerpo de referencia (en lo
sucesivo, un "complejo de anticuerpo de
referencia-perla") que tiene un espectro de
emisión de fluorescencia distinto y por tanto, un código de color,
que proporciona un marcador único para ese anticuerpo de
referencia.
En esta realización preferida, cada complejo de
anticuerpo de referencia-perla de cada reacción con
cada anticuerpo de referencia se mezcla con otros complejos de
anticuerpo de referencia-perla para formar una
mezcla que contiene todos los anticuerpos de referencia que están
sometiéndose a prueba, en la que cada anticuerpo de referencia está
marcado de manera única acoplándose a una perla. Se toman alícuotas
de la mezcla en cuantos pocillos de una placa de 96 pocillos sean
necesarios para el experimento. Generalmente, el número de pocillos
se determinará mediante el número de anticuerpos sonda que están
sometiéndose a prueba, junto con diversos controles. Cada uno de
estos pocillos que contienen una alícuota de la mezcla de complejos
de anticuerpo de referencia-perla se incuba en
primer lugar con antígeno y luego con anticuerpo sonda (uno de los
anticuerpos que va a caracterizarse), y luego anticuerpo de
detección (una versión marcada del anticuerpo de captura original),
en el que el anticuerpo de detección se usa para la detección de
anticuerpo sonda unido. En una realización preferida, el anticuerpo
de detección es un anticuerpo monoclonal anti-IgG
humana de ratón. Este procedimiento se ilustra en la figura 1.
En la realización ilustrativa presentada en la
figura 1, se acopla cada anticuerpo de referencia a una perla con
espectro de emisión distinto, en la que el anticuerpo de referencia
se acopla a través de un anticuerpo de captura monoclonal
anti-ser humano de ratón, formando un anticuerpo de
referencia marcado de manera única. Se coloca el conjunto completo
de anticuerpos de referencia marcados de manera única en el pocillo
de una placa de microtitulación de múltiples pocillos. Se incuba el
conjunto de anticuerpos de referencia con antígeno, y entonces se
añade un anticuerpo sonda al pocillo. Un anticuerpo sonda se unirá
sólo a un antígeno que esté unido a un anticuerpo de referencia que
reconozca un epítopo diferente. La unión de un anticuerpo sonda al
antígeno formará un complejo que consiste en un anticuerpo de
referencia acoplado a una perla a través de un anticuerpo de
captura, el antígeno y el anticuerpo sonda unido. Se añade un
anticuerpo de detección marcado para detectar el anticuerpo sonda
unido. En este caso, el anticuerpo de detección se marca con
biotina, y se detecta el anticuerpo sonda unido mediante la
interacción de estreptavidina-PE y el anticuerpo de
detección biotinilado. Tal como se muestra en la figura 1, se usa
el anticuerpo nº 50 como anticuerpo sonda, y los anticuerpos de
referencia son el anticuerpo nº 50 y el anticuerpo nº 1. El
anticuerpo sonda nº 50 se unirá al antígeno que se une al
anticuerpo de referencia nº 1 porque los anticuerpos se unen a
diferentes epítopos, y puede detectarse un complejo marcado. El
anticuerpo sonda nº 50 no se unirá al antígeno que se une al
anticuerpo de referencia nº 50 porque ambos anticuerpos compiten
por el mismo epítopo, de modo que no se forma complejo marcado.
En esta realización, tras completar las etapas
de incubación, se alinean las perlas de un pocillo dado en una
única fila en una cubeta y una perla pasa al mismo tiempo a través
de dos láseres. El primer láser excita los fluorocromos incrustados
en las perlas, identificando qué anticuerpo de referencia está unido
a cada perla. Un segundo láser excita las moléculas fluorescentes
unidas al complejo de perlas, lo que cuantifica la cantidad de
anticuerpo de detección unido y por tanto, la cantidad de anticuerpo
sonda unido al antígeno sobre un complejo de anticuerpo de
referencia-perla. Cuando se mide una señal fuerte
para el anticuerpo de detección sobre una perla, eso indica que los
anticuerpos de referencia y sonda unidos a esa perla están unidos a
sitios diferentes sobre el antígeno y por tanto reconocen epítopos
diferentes en el antígeno. Cuando se mide una señal débil para el
anticuerpo de detección unido sobre una perla, eso indica que los
anticuerpos de referencia y sonda correspondientes compiten por el
mismo epítopo. Eso se ilustra en la figura 1. Una ventaja clave de
esta realización es que puede llevarse a cabo en un modo de alto
rendimiento, de manera que pueden realizarse simultáneamente
múltiples ensayos de competición en un único pocillo, ahorrando
tanto tiempo como recursos.
El ensayo descrito en el presente documento
puede incluir mediciones de al menos un parámetro adicional de las
propiedades de reconocimiento de epítopo de anticuerpos primarios y
secundarios que están caracterizándose, por ejemplo el efecto de la
temperatura, concentración iónica, disolventes (incluyendo
detergente) o cualquier otro factor de interés. Un experto en la
técnica relevante puede usar la presente descripción para
desarrollar un diseño experimental que permita someter a prueba al
menos un factor adicional. Si es necesario, pueden llevarse a cabo
múltiples duplicados de un ensayo, en los que se varían factores
tales como la temperatura, concentración iónica, disolvente u otros
según el diseño experimental. Cuando se someten a prueba factores
adicionales, pueden ajustarse los métodos de análisis de datos en
consecuencia para incluir los factores adicionales en el
análisis.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona procedimientos para analizar datos generados a partir de
al menos un ensayo, preferiblemente a partir de al menos un ensayo
de alto rendimiento, con el fin de identificar anticuerpos que
tienen propiedades de reconocimiento de epítopo similares o
distintas. Un enfoque comparativo, basado en la comparación de las
propiedades de reconocimiento de epítopo de una colección de
anticuerpos, permite la identificación de aquellos anticuerpos que
tienen propiedades de reconocimiento de epítopo similares, que es
probable que compitan por el mismo epítopo, así como la
identificación de aquellos anticuerpos que tienen propiedades de
reconocimiento de epítopo distintas, que es probable que se unan a
diferentes epítopos. De esta forma, pueden clasificarse
anticuerpos, o "combinarse", basándose en qué epítopo
reconocen. Una realización preferida proporciona el procedimiento
de reconocimiento del patrón competitivo (CPR) para analizar datos
generados mediante un ensayo de alto rendimiento. Más
preferiblemente, se usa el CPR para analizar datos generados
mediante el ensayo competitivo de alto rendimiento combinación de
anticuerpos competitiva multiplexada (MCAB). La aplicación de
procedimientos de análisis de datos tal como se da a conocer y se
reivindica en el presente documento hace posible eliminar la
redundancia identificando las especificidades de unión distintas
representadas dentro de un grupo de anticuerpos específicos de
antígeno caracterizado mediante un ensayo tal como el ensayo de
MCAB.
Una realización preferida de la presente
invención proporciona un procedimiento que agrupa anticuerpos en
"combinaciones" o categorías que representan especificidades de
unión distintas para la diana de antígeno. Aún en otra realización
preferida, se aplica el procedimiento de CPR a los datos que
representan los resultados del ensayo de competición de alto
rendimiento de MCAB en el que cada anticuerpo compite con todos los
demás anticuerpos por los sitios de unión sobre las moléculas de
antígeno. Las realizaciones llevadas a cabo usando conjuntos de
datos diferentes de anticuerpos generados a partir de animales
XenoMouse, proporcionan una demostración de que la aplicación del
procedimiento de la presente invención produce resultados coherentes
y reproducibles.
El análisis de los datos generados a partir de
un experimento implica normalmente operaciones de múltiples etapas
para normalizar datos a través de diferentes pocillos en los que se
ha llevado a cabo el ensayo y agrupar datos identificando y
clasificando los patrones de competición de los anticuerpos
sometidos a prueba. Entonces se realiza un procedimiento
informático basado en matrices para agrupar anticuerpos basándose en
la similitud de sus patrones de competición, en el que se aplica el
procedimiento para clasificar conjuntos de anticuerpos,
preferiblemente anticuerpos generados a partir de células de
hibridoma.
Los anticuerpos que se agrupan basándose en la
similitud de sus patrones de competición se considera que se unen
al mismo epítopo o epítopos similares. Estas agrupaciones pueden
presentarse opcionalmente en formato de matriz, o en formato de
"árbol" como un dendrograma, o en un formato legible por
ordenador, o en cualquier formato compatible con un dispositivo de
entrada de datos. La información con respecto a las agrupaciones
puede capturarse a partir de una matriz, un dendrograma o mediante
un ordenador u otro dispositivo informático. La captura de datos
puede ser visual, manual, automatizada o cualquier combinación de
los mismos.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "combinación" puede usarse como nombre para referirse
a agrupaciones de anticuerpos identificadas como que tienen una
competición similar según los métodos de la presente invención. El
término "combinación" también puede usarse como verbo para
referirse a la puesta en práctica de los métodos de la presente
invención. El término "ensayo de unión a epítopo" tal como se
usa en el presente documento, se refiere al ensayo basado en
competición descrito en el presente documento, e incluye cualquier
análisis de datos producidos mediante el ensayo.
Se describen en detalle las etapas del análisis
de datos en la siguiente descripción, y se proporciona una
orientación práctica mediante la referencia a los datos y resultados
presentados en el ejemplo 2. Las referencias a los datos del
ejemplo 2, especialmente las matrices o dendrogramas generados
realizando diversas etapas de análisis de datos sobre los datos de
entrada del ejemplo 2, sirven simplemente como ilustraciones y no
limitan el alcance de la presente invención de ningún modo.
Cuando se genera un gran número y tamaños de los
conjuntos de datos, se necesita un método sistemático para analizar
las matrices de las intensidades de señal para determinar qué
anticuerpos tienen patrones de intensidad de señal similares. A
modo de ejemplo, se generan dos matrices que contienen m filas y m
columnas en un único experimento, en el que m es el número de
anticuerpos que están examinándose. Una matriz tiene intensidades
de señal para el conjunto de ensayos de competición en el que está
presente el antígeno. La segunda matriz tiene las intensidades de
señal correspondientes para un experimento de control negativo en el
que está ausente el antígeno. Cada fila de una matriz representa un
único pocillo de una placa de microtitulación de múltiples
pocillos, que identifica un único anticuerpo sonda. Cada columna
representa un único código espectral de perla, que identifica un
único anticuerpo de referencia. La intensidad de la señal detectada
en cada celda de una matriz representa el resultado de un ensayo de
competición individual que implica un anticuerpo de referencia y un
anticuerpo sonda. La última fila de la matriz corresponde al pocillo
en el que se añade el tampón de bloqueo en lugar de un anticuerpo
sonda. De manera similar, la última columna de la matriz corresponde
al código espectral de perla al que se añade tampón de bloqueo en
lugar de anticuerpo de referencia. El tampón de bloqueo sirve como
control negativo y determina la cantidad de señal presente cuando
sólo está presente un anticuerpo (del par de anticuerpo de
referencia-anticuerpo sonda).
Los patrones del valor de intensidad de señal
similares para dos filas indican que los dos anticuerpos sonda
presentan comportamientos de unión similares, y por tanto compiten
probablemente por el mismo epítopo. Asimismo, los patrones de
intensidad de señal similares para dos columnas indican que los dos
anticuerpos de referencia presentan comportamientos de unión
similares, y por tanto compiten probablemente por el mismo epítopo.
Los anticuerpos con patrones de señal distintos probablemente se
unen a epítopos diferentes. Los anticuerpos pueden agruparse, o
"combinarse", según el epítopo al que reconocen, agrupando
entre sí filas con patrones de señal similares o agrupando entre sí
columnas con patrones de señal similares. Tal ensayo descrito
anteriormente se denomina ensayo de combinación por epítopos.
Un aspecto de la presente invención proporciona
un programa para aplicar el procedimiento de CPR que tiene dos
etapas principales: (1) normalización de las intensidades de señal;
y (2) generación de matrices de disimilitud y agrupación de
anticuerpos basándose en sus intensidades de señal normalizadas. Se
entiende que la expresión "etapa principal" abarca múltiples
etapas que pueden llevarse a cabo según sea necesario, dependiendo
de la naturaleza del material experimental usado y la naturaleza
del análisis de datos deseado. También se entiende que pueden
ponerse en práctica etapas adicionales como parte de la presente
invención.
Los datos de entrada se someten a una serie de
etapas de procesamiento previo que mejoran la capacidad de detectar
patrones significativos. Preferiblemente, los datos de entrada
comprenden intensidades de señal almacenadas en una matriz
bidimensional, y se lleva a cabo una serie de etapas de
normalización para eliminar fuentes de ruido o sesgos de la señal
antes del análisis de agrupamiento.
Los datos de entrada que van a analizarse
comprenden los resultados de un ensayo completo de propiedades de
reconocimiento de epítopo. Preferiblemente, los resultados
comprenden intensidades de señal medidas a partir de un ensayo
llevado a cabo usando anticuerpos secundarios marcados. Más
preferiblemente, se analizan los resultados usando el ensayo de
MCAB tal como se describe en el presente documento. Se generan dos
archivos de entrada: un archivo de entrada a partir de un ensayo en
el que se añadió antígeno; y un segundo archivo de entrada a partir
de un ensayo en el que estaba ausente el antígeno. El experimento en
el que estaba ausente el antígeno sirve como control negativo que
permite cuantificar la cantidad de unión de los anticuerpos marcados
que no es al antígeno. Preferiblemente, se sometió a ensayo cada
combinación de anticuerpo primario y anticuerpo secundario que está
sometiéndose a prueba en presencia y ausencia de antígeno, de manera
que cada combinación está representada en ambos conjuntos de datos
de entrada. Incluso más preferiblemente, el ensayo se lleva a cabo
usando los procedimientos para someter a ensayo propiedades de
reconocimiento de epítopo de múltiples anticuerpos usando un
formato de múltiples pocillos dado a conocer en otra parte en la
presente descripción.
Los datos de entrada comprenden normalmente
intensidades de señal almacenadas en una matriz bidimensional. En
primer lugar, la matriz correspondiente al experimento sin antígeno
(control negativo), A_{B}, se resta de la matriz
correspondiente al experimento con antígeno, A_{E}, para
dar la matriz normalizada para el fondo dada por A_{N} =
A_{E} - A_{B}. Esta etapa de resta elimina la
señal de fondo que no se debe a la unión de anticuerpos al
antígeno. Las matrices anteriores son de dimensión (m + 1) X (m
+1) en la que m es el número de anticuerpos que van a agruparse.
La última fila y la última columna contienen valores de intensidad
para experimentos en los que se añadió tampón de bloqueo en lugar de
un anticuerpo sonda o anticuerpo de referencia,
respectivamente.
En una realización ilustrativa, la figura 8A y
8B ilustra las matrices de intensidad generadas en la realización
dada a conocer en el ejemplo 2, que se usan como matrices de datos
de entrada para etapas posteriores en el análisis de datos. La
figura 8A es la matriz de intensidad para un experimento realizado
con antígeno, y la figura 8B es la matriz de intensidad para el
mismo experimento realizado sin antígeno. Cada fila de la matriz
corresponde a las intensidades de señal para las diferentes perlas
de un pocillo, en el que cada pocillo representa un único
anticuerpo de detección. Cada columna representa las intensidades de
señal correspondientes a la competición de un único anticuerpo
primario con cada uno de los anticuerpos secundarios. Cada celda de
la matriz representa un ensayo de competición individual para un
par diferente de anticuerpos primario y secundario. En ensayos de
propiedades de reconocimiento de epítopo, la adición de tampón de
bloqueo en lugar de uno de los anticuerpos sirve como control
negativo. En la realización ilustrada por las figuras 8A y 8B, la
última fila de la matriz corresponde al pocillo en el que se añade
tampón de bloqueo en lugar de un anticuerpo secundario, y la última
columna de la matriz corresponde a las perlas a las que se añade
tampón de bloqueo en lugar de anticuerpo primario. Pueden usarse
otras disposiciones de las celdas dentro de una matriz para poner en
práctica aspectos de la presente invención, de modo que un experto
en la técnica relevante puede diseñar matrices de datos que tienen
otros formatos y adaptar posteriores manipulaciones de estas
matrices de datos para que reflejen el formato particular
elegido.
Puede generarse una matriz diferente restando la
matriz correspondiente a los valores obtenidos a partir del
experimento sin antígeno de la matriz correspondiente a los valores
obtenidos a partir del experimento con antígeno. Esta etapa se
realiza para restar de la señal total la cantidad de señal que no se
atribuye a la unión del anticuerpo sonda marcado al antígeno. Esta
etapa de resta genera una matriz de diferencias tal como se ilustra
en la figura 9. Tras esta resta, se señala cualquier anticuerpo que
tenga intensidades excepcionalmente altas para sus valores
diagonales en relación con los otros valores diagonales. Valores
altos para una columna tanto a lo largo como fuera de la diagonal
sugieren que los datos asociados con esta perla particular pueden
no ser fiables. Los anticuerpos correspondientes a estas columnas se
señalan en esta etapa y se consideran como combinaciones
individuales.
En algunos casos, hay una disparidad
significativa en las intensidades de señal globales entre diferentes
filas o columnas en la matriz de intensidad de señal normalizada
por fondo. Las variaciones en filas se deben probablemente a
variaciones en la intensidad entre pocillos, mientras que la
variación en columnas se debe probablemente a la variación en las
afinidades y concentraciones de diferentes anticuerpos sonda. Según
un aspecto de la presente invención, a menudo hay una correlación
lineal entre los valores de tampón de bloqueo de las filas o
columnas y los valores de intensidad de señal promedio de las filas
o columnas. Si se observa una variación de intensidad, se realiza
una etapa adicional de normalización de fila y/o columna tal como
se describe a continuación.
Normalización de filas. La normalización
de filas se realiza cuando hay cualquier sesgo de señal específico
de pocillo significativo, y se lleva a cabo para eliminar cualquier
"artefacto de señal" que de otro modo se introduciría en el
análisis de datos. Un experto en la técnica puede determinar si la
etapa es deseable basándose en la distribución de valores de
intensidad de los controles negativos de tampón de bloqueo. A modo
de ilustración, en la figura 2A, se representa el valor de
intensidad de tampón de bloqueo para cada fila frente al valor de
intensidad promedio (excluyendo el valor de tampón de bloqueo) para
la fila correspondiente. El diagrama en la figura 2A muestra una
correlación lineal clara entre los valores de tampón de bloqueo y
el valor de intensidad promedio para una fila. Esta figura muestra
que hay un sesgo de señal específico de pocillo en las muestras que
están analizándose, y que el valor de intensidad para el tampón de
bloqueo se correlaciona con la intensidad de señal global dentro de
una fila. Los diferentes sesgos de intensidad observados en las
diferentes filas se deben probablemente en parte a la variación en
la afinidad para los anticuerpos secundarios por el antígeno así
como las variaciones de concentración de estos anticuerpos
secundarios. Obsérvese que la figura 2B muestra que, para la misma
realización, hay una correlación más débil entre los valores de
intensidad del tampón de bloqueo para las columnas y los valores de
intensidad de columna promedio.
Para las variaciones de intensidad en las filas,
las intensidades de cada fila en la matriz se ajustan dividiendo
cada valor en una fila entre el valor de intensidad del tampón de
bloqueo para esa fila. En el caso en el que se carece de datos del
tampón de bloqueo, cada valor de fila se divide entre el valor de
intensidad promedio para la fila. En una realización que aplica el
procedimiento CPR, la matriz normalizada por intensidad viene dada
por
en la que I es un vector que
contiene las intensidades de tampón de bloqueo o promedio y k = i si
la normalización se realiza con respecto a las
filas.
Normalización de columnas. En esta etapa
previa al procesamiento final, cada columna en la matriz con filas
normalizadas (que no se señaló en la etapa en la que se generó la
matriz diferencia) se divide entre su valor diagonal
correspondiente. Las celdas a lo largo de la diagonal representan
ensayos de competición para los que los anticuerpos primario y
secundario son los mismos. De manera ideal, los valores a lo largo
de la diagonal deben ser pequeños ya que dos copias del mismo
anticuerpo deben competir por el mismo epítopo. La división de cada
columna entre su diagonal correspondiente se realiza para medir cada
intensidad con respecto a una intensidad que se sabe que refleja la
competición (es decir, competición de un anticuerpo contra sí
mismo).
Para las variaciones de intensidad en columnas,
las intensidades de cada columna en la matriz se ajustan dividiendo
cada valor en una columna entre el valor de intensidad del tampón de
bloqueo para esa fila. En el caso en el que se carece de datos del
tampón de bloqueo, cada valor de columna se divide entre el valor de
intensidad promedio para la columna. En una realización que aplica
el procedimiento CPR, la matriz normalizada por intensidad viene
dada por
en la que I es un vector que
contiene las intensidades de tampón de bloqueo o promedio y k = j si
la normalización se realiza con respecto a
columnas.
Fijar valores umbral antes de la
normalización de filas o columnas. Para evitar inflar
artificialmente valores de señal bajos en esta etapa de
normalización, todos los valores de tampón de bloqueo que son
inferiores a un valor umbral mínimo definido por el usuario se
señalan y después se ajustan al valor umbral definido por el
usuario que representa el menor valor de intensidad de señal fiable,
antes de la división de filas o columnas. Este umbral se fija
basándose en un histograma de las intensidades de señal. Esta etapa
de normalización compensa las variaciones de intensidad entre
pocillos.
A modo de ejemplo, la figura 17 ilustra una
matriz diferencia ajustada para los datos del ejemplo 2, en la que
la menor intensidad de señal fiable se fija a 200 unidades de
intensidad. Cada fila en la matriz se ajusta dividiéndola por el
último valor de intensidad en la fila. Tal como se observó
anteriormente, el último valor de intensidad en cada fila
corresponde al valor de intensidad para perlas a las que se añade
tampón de bloqueo en vez de anticuerpo primario. Esta etapa
compensa la variación entre pocillos de valores de intensidad a lo
largo de la fila. La figura 18 ilustra una matriz con filas
normalizadas para los datos del ejemplo 2.
Adicionalmente a modo de ejemplo, la figura 2A
presenta datos de una realización en la que el valor de intensidad
de tampón de bloqueo para cada fila se representó frente al valor de
intensidad promedio para la fila correspondiente. Este diagrama
muestra una correlación lineal entre los valores de tampón de
bloqueo y el valor de intensidad promedio para cada fila, y sugiere
que hay sesgos de intensidad específicos para pocillos. Estos sesgos
pueden deberse en parte a la variación en la afinidad para los
anticuerpos sonda por el antígeno y las variaciones de
concentración de los anticuerpos sonda. La figura 2B presenta datos
de una realización en la que el valor de intensidad del tampón de
bloqueo para cada columna se representó frente al valor de
intensidad promedio para la columna correspondiente.
En otra realización ilustrativa, la figura 2C
muestra un diagrama de dispersión de las intensidades de la matriz
diferencia normalizada para el fondo representada frente a las
intensidades para la matriz de resultados de una realización usando
antígeno. Este diagrama muestra una correlación lineal estrecha
(pendiente = 1) para valores de señal superiores a 1000, y una
correlación más dispersa para valores de señal inferiores. Los
puntos en la figura 2C están sombreados según el valor de una
fracción calculada como la señal sustraída dividida entre la señal
para el experimento con antígeno presente. Los valores de fracción
menores (próximos a cero) corresponden a una alta contribución del
fondo y tienen un sombreado claro en la figura 2C. Los valores de
fracción mayores (próximos a 1) corresponden a una contribución de
fondo menor y tienen un sombreado más oscuro. En la figura 2C, los
valores de fracción menores están predominantemente en la región
inferior izquierda del diagrama de dispersión, lo que sugiere que
la contribución del fondo se vuelve menor para valores de señal
sustraída superiores a 1000.
\newpage
El diagrama mostrado en la figura 2C sugiere que
para esta realización, los valores de intensidad de la matriz
normalizada para el fondo superiores a 1000 tienen una baja
contribución de señal de fondo con respecto a la señal debida a la
unión al antígeno. Estas celdas de matriz corresponden probablemente
a pares de anticuerpos que no compiten por el mismo epítopo. Por el
contrario, los valores de intensidad inferiores a 1000 corresponden
probablemente a pares de anticuerpos que se unen al mismo epítopo.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se espera que
los valores de intensidad a lo largo de la diagonal sean pequeños,
ya que anticuerpos de referencia y sonda idénticos compiten por el
mismo epítopo. En la realización ilustrada en la figura 2C, todos
menos uno de los valores diagonales de la matriz de intensidad de
señal normalizada para el fondo tienen valores de intensidad
inferiores a 1000.
En una etapa final, se ajustan los datos
dividiendo cada columna o fila entre su valor diagonal
correspondiente para generar la matriz normalizada final que viene
dada por
De nuevo, para evitar inflar artificialmente los
valores de señal bajos en esta etapa de normalización, todos los
valores diagonales inferiores a un valor umbral mínimo definido por
el usuario se ajustan al valor umbral antes de realizar la división
diagonal. Esta etapa se realiza para todas las columnas o filas,
excepto aquellas que tengan valores diagonales que son
significativamente elevados con respecto a otros valores en la
columna o fila. Esta etapa normaliza cada valor de intensidad con
respecto a la intensidad correspondiente al ensayo de competición
individual para el que los anticuerpos de referencia y sonda son los
mismos. Este valor de intensidad debe ser bajo y de manera ideal
refleja el valor de intensidad de señal de nivel inicial para la
columna o fila, dado que dos anticuerpos idénticos deben competir
por el mismo epítopo y por tanto no pueden unirse simultáneamente
al mismo antígeno. Las columnas que tienen valores diagonales
inhabitualmente grandes se identifican como datos aberrantes y se
excluyen del análisis. Los valores de intensidad diagonal elevados
pueden indicar que el antígeno tiene dos copias del mismo epítopo,
por ejemplo, cuando el antígeno es un homodímero.
Según otro aspecto presente invención, una
segunda etapa en el análisis de datos implica generar una matriz de
disimilitud a partir de la matriz de intensidad normalizada en dos
etapas. En primer lugar, se fijan a cero (y por tanto representan
la competición) los valores de intensidad normalizados que están por
debajo de un valor umbral definido por el usuario para el fondo y
se fijan a 1 los valores restantes, indicando que los anticuerpos
se unen a dos epítopos diferentes. En consecuencia, los valores de
intensidad que son inferiores a la intensidad igual a este umbral
multiplicada por el valor de intensidad del valor diagonal se
consideran lo bastante bajos como para representar la competición
para el mismo epítopo por el par de anticuerpos. Se calcula la
matriz de disimilitud o matriz de distancia para un valor umbral a
partir de la matriz de ceros y unos mediante la determinación del
número de posiciones en las que difiere cada par de filas. La
entrada en la fila i y la columna j corresponde a la fracción del
número total de anticuerpos primarios que se diferencian en sus
patrones de competición con los anticuerpos secundarios
representados en las filas i y j.
A modo de ejemplo, la figura 14 muestra el
número de posiciones (de un total de 22) en las que se diferencian
los patrones para dos anticuerpos cualesquiera. En esta realización,
se calculan las disimilitudes con respecto a filas en lugar de
columnas porque las intensidades de fila ya se han ajustado para
sesgos de intensidad específicos de pocillos y por tanto se han
extraído los efectos indeseables de concentraciones y afinidades de
anticuerpos secundarios desiguales. Además, las concentraciones y
afinidades de anticuerpos primarios son coherentes entre filas. Sin
embargo, para las columnas, no hay una tendencia coherente aparente
entre la intensidad promedio y la intensidad de fondo lo que
sugiere que no hay una forma obvia de extraer los efectos
indeseables de las afinidades y concentraciones de anticuerpos
primarios variables. Por tanto, la comparación de las señales entre
columnas podría ser menos
válida.
válida.
Matriz de disimilitud usando CPR. En una
realización que aplica el procedimiento de CPR, se genera una
matriz umbral, A_{T}, de ceros y unos, tal como se describe a
continuación. Se fijan a cero los valores normalizados que son
inferiores o iguales a un valor umbral para indicar que los pares
correspondientes de anticuerpos compiten por el mismo epítopo. La
matriz umbral viene dada por
Los valores de intensidad normalizados restantes
se fijan a uno, y los valores representan pares de anticuerpos que
se unen a diferentes epítopos.
La matriz de disimilitud se calcula a partir de
la matriz umbral fijando el valor en la fila i y la columna j de la
matriz de disimilitud a la fracción de las posiciones en las que se
diferencian las dos filas, i y j de la matriz de ceros y unos. Una
matriz de disimilitud para un valor umbral especificado, T, viene
dada por
en la que N_{1} es el número de
unos presentes cuando se suman las filas i y
j.
A modo de ejemplo, para la matriz mostrada en la
tabla 1 a continuación, el valor de disimilitud correspondiente a
las filas primera y segunda es de 0,4, porque el número de
posiciones en las que se diferencian las dos filas es de 2 de 5.
Para un experimento ideal, la matriz de disimilitud que se genera
basándose en una comparación de filas de la matriz de intensidad de
señal original, debe ser la misma que la matriz de disimilitud que
se genera basándose en la comparación de columnas.
Si se desea, se repite el procedimiento de
generar matrices de disimilitud para valores umbral de fondo
incrementados entre dos valores umbral definidos por el usuario,
inclusive, que representan valores umbral inferior y superior para
la intensidad (en los que el valor umbral es tal como se describió
anteriormente). Se calcula el promedio de las matrices de
disimilitud generadas a lo largo de un intervalo de valores umbral
de fondo y se usa como entrada para el algoritmo de agrupación. El
procedimiento de calcular el promedio a lo largo de varios umbrales
se realiza para minimizar la sensibilidad de la matriz de
disimilitud final frente a cualquier elección particular del valor
umbral. El efecto de la variación del valor umbral sobre la
disimilitud aparente se ilustra en la figura 4, que muestra la
fracción de disimilitudes para un par de anticuerpos (2.1 y 2.25)
como función del valor umbral para valores umbral que oscilan entre
1,5 y 2,5. A medida que el valor umbral cambia desde 1,8 hasta 1,9
la cantidad de disimilitud entre los patrones de señal para los dos
anticuerpos cambia sustancialmente desde el 15% hasta casi el 0%.
Esta figura muestra cómo la cantidad de disimilitud entre los
patrones de señal para un par de anticuerpos puede ser sensible a
una elección particular para un valor límite, ya que puede variar
sustancialmente para diferentes valores umbral. La sensibilidad se
atenúa tomando el valor de disimilitud promedio a lo largo de un
intervalo de diferentes valores umbral.
Cálculo de matrices de disimilitud en
múltiples valores umbral usando CPR. En una realización
preferida, el procedimiento de calcular matrices de disimilitud
usando CPR se repite para varios valores umbral incrementales
dentro de un intervalo de valores definido por el usuario. Se
calcula el promedio de estas matrices de disimilitud y se usa como
entrada para la etapa de agrupación en la que se calcula el promedio
como
en la que N_{T} es el número de
umbrales diferentes de los que debe calcularse el
promedio.
\newpage
Este procedimiento de calcular el promedio a lo
largo de varios umbrales se realiza para minimizar la sensibilidad
de la matriz de disimilitud frente a un valor límite particular para
el umbral.
Si hay conjuntos de datos de entrada para más de
un experimento, en primer lugar se generan matrices de intensidad
normalizadas tal como se describió anteriormente para cada
experimento individual. Después se fijan a este valor umbral los
valores normalizados por encima de un valor umbral (normalmente
fijados a 4). El fijar los valores de intensidad elevada al valor
umbral se realiza para evitar que cualquier valor de intensidad
individual tenga demasiado peso cuando se calculen los valores de
intensidad normalizados promedio para esa celda. La matriz de
intensidad promedio se calcula tomando promedios individuales de
todos los puntos de datos para cada par de anticuerpos del grupo
que consiste en anticuerpos que están en al menos uno de los
conjuntos de datos de entrada. Se señalan los pares de anticuerpos
para los que no hay valores de intensidad. La generación de la
matriz de disimilitud es tal como se describió anteriormente con la
excepción de que la entrada en la fila i y columna j corresponde a
la fracción de las posiciones en las que se diferencian las dos
filas, i y j, del número total de posiciones para las que ambas
filas tienen un valor de intensidad. Si las dos filas no tienen
tales posiciones, entonces el valor de disimilitud se fija de manera
arbitraria elevado y se señala.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona procedimientos para agrupar anticuerpos basándose en sus
intensidades de señal normalizadas, usando diversos enfoques
informáticos para identificar patrones subyacentes en datos
complejos. Preferiblemente, cualquiera de tales procedimientos
utiliza enfoques informáticos desarrollados para agrupar puntos en
un espacio multidimensional. Estos procedimientos pueden aplicarse
directamente a datos experimentales para determinar patrones de
unión a epítopos de conjuntos de anticuerpos considerando que los
niveles de señales para los ensayos de competición n^{2} de n
anticuerpos sonda en n anticuerpos de referencia tomados como
muestra definen n puntos en un espacio de n dimensiones. Estos
métodos pueden aplicarse directamente a la combinación por epítopos
considerando que los niveles de señal para los ensayos de
competición de cada anticuerpo secundario con todos de los n
anticuerpos primarios diferentes definen un punto en un espacio de
n dimensiones.
Los resultados del análisis de agrupación pueden
expresarse usando presentaciones visuales. Además, o como
alternativa, los resultados del análisis de agrupación pueden
recogerse y almacenarse independientemente de cualquier
presentación visual. Las presentaciones visuales son útiles para
comunicar los resultados de un ensayo de combinación por epítopos a
al menos una persona. La presentación visual también puede usarse
como medio para proporcionar datos cuantitativos para su recogida y
almacenamiento. En una realización preferida, se presentan
agrupaciones en un formato de matriz y se recoge información
referente a las agrupaciones a partir de una matriz. Las celdas de
una matriz pueden tener intensidades diferentes de sombreado o
patrón para indicar el valor numérico de cada celda;
alternativamente, las celdas de una matriz pueden tener un código de
colores para indicar el valor numérico de cada celda. En otra
realización preferida, se presentan agrupaciones como dendrogramas
o "árboles" y se recoge información referente a agrupaciones a
partir de un dendrograma basándose en la longitud de una rama y la
altura (distancia) de las ramas. Aún en otra realización preferida,
se identifican agrupaciones mediante medios automatizados, y se
recoge información referente a agrupaciones mediante un
procedimiento de análisis de datos automatizado usando un ordenador
o cualquier dispositivo de introducción de datos.
Un enfoque que ha demostrado ser valioso para el
análisis de grandes conjuntos de datos biológicos es la agrupación
jerárquica (Eisen et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95:14863-14868). Aplicando este método, pueden
forzarse anticuerpos en una jerarquía estricta de subconjuntos
anidados basándose en sus valores de disimilitud. En una
realización ilustrativa, en primer lugar se agrupa el par de
anticuerpos con el menor valor de disimilitud. A continuación se
agrupa el par o agrupación/agrupaciones de anticuerpos con el
siguiente menor valor de (o disimilitud promedio). Este
procedimiento se repite de manera iterativa hasta que queda una
agrupación. De esta manera, los anticuerpos se agrupan según lo
similares que son sus patrones de competición, en comparación con
otros anticuerpos. En una realización, se agrupan anticuerpos en un
dendrograma (a veces denominado un "árbol filogenético") cuyas
longitudes de rama representan el grado de similitud entre los
patrones de unión de los dos anticuerpos. Longitudes de rama largas
entre dos anticuerpos indican que probablemente se unen a epítopos
diferentes. Longitudes de rama cortas indican que los dos
anticuerpos probablemente compiten por el mismo epítopo.
En una realización preferida, se agrupan los
anticuerpos correspondientes a las filas en la matriz mediante
agrupación jerárquica basándose en los valores en la matriz de
disimilitud promedio usando una subrutina de anidación por
aglomeración que incorpora la métrica Manhattan con una matriz de
disimilitud de entrada de la matriz de disimilitud promedio. En una
realización especialmente preferida, se agrupan anticuerpos mediante
agrupación jerárquica basándose en los valores en la matriz de
disimilitud promedio usando la subrutina de anidación por
aglomeración SPLUS 2000 usando la métrica Manhattan con una matriz
de disimilitud de entrada de la matriz de disimilitud promedio.
(SPLUS 2000 Statistical Analysis Software, Insightful Corporation,
Seattle, WA).
Según otro aspecto de la presente invención, el
grado de similitud entre dos dendrogramas proporciona una medición
de la auto-coherencia del análisis realizado por un
programa aplicando el procedimiento CPR. Una teoría no limitativa
referente a la similitud y coherencia predice que un dendrograma
generado agrupando filas y un dendrograma generado agrupando
columnas de la misma matriz de intensidad de señal normalizada para
el fondo deben ser idénticos, o casi, porque: si el anticuerpo nº 1
y el anticuerpo nº 2 compiten por el mismo epítopo, entonces la
intensidad debe ser baja cuando el anticuerpo nº 1 es el anticuerpo
de referencia y el anticuerpo nº 2 es el anticuerpo sonda, así como
cuando el anticuerpo nº 2 es el anticuerpo de referencia y el
anticuerpo nº 1 es el anticuerpo sonda. Igualmente, cuando los dos
anticuerpos se unen a epítopos diferentes, las intensidades deben
ser uniformemente elevadas. Mediante este razonamiento, el grado de
similitud entre dos filas de la matriz de intensidad de señal debe
ser el mismo que entre dos columnas de la matriz de similitud. Un
alto nivel de autocoherencia entre la agrupación de filas y la
agrupación de columnas sugiere que, para un experimento dado, el
protocolo experimental descrito en el presente documento, puesto en
práctica con el programa para aplicar el procedimiento de la
presente invención, produce resultados robustos.
Según un aspecto adicional de la presente
invención, el grado de solapamiento entre dos epítopos también puede
deducirse basándose en las longitudes de las ramas más largas que
conectan las agrupaciones en un dendrograma. Por ejemplo, si un
antígeno diana tiene dos epítopos distintos, completamente no
solapantes, entonces se esperará que un anticuerpo que se une a uno
de los epítopos tenga un patrón de intensidad de señal opuesto al de
un anticuerpo que se une a otro epítopo. Según este razonamiento,
si los sitios de unión no son solapantes, los patrones de señal
para el conjunto de anticuerpos que se unen a un epítopo deben estar
completamente anticorrelacionados con el patrón de señal para el
conjunto de anticuerpos que reconocen el otro epítopo. Por tanto,
los valores de disimilitud que están próximos a uno (1) para dos
agrupaciones diferentes sugieren que los epítopos correspondientes
no interfieren entre sí ni se solapan en sus sitios de unión sobre
el antígeno.
La realización descrita en el ejemplo 2 a
continuación demuestra cómo pueden presentarse los resultados de
agrupación como un dendrograma (figura 5) o en forma de matriz
(figuras 16 y 17). Los puntos de datos (valores de anticuerpos
frente a la diana ANTIGEN14) se agruparon en un dendrograma cuyas
longitudes de rama representan el grado de similitud entre dos
anticuerpos, en el que el dendrograma se generó usando el módulo de
anidación por aglomeración del software de análisis estadístico
SPLUS 2000. Para facilitar la comparación, en la figura 16 y 17, el
orden de los anticuerpos en filas y columnas de las matrices es el
mismo que el orden de los anticuerpos según se presentan de
izquierda a derecha en el dendrograma en la figura 5. Las celdas
individuales están codificadas de manera visual mediante celdas
sombreadas según su valor numérico. En la figura 16, las celdas con
valores inferiores a un valor umbral inferior tienen un sombreado
más oscuro. Las celdas con valores inferiores a un umbral inferior
y un umbral superior no están sombreadas. Las celdas con valores
superiores al umbral superior tienen un sombreado más claro. Un
bloque que tiene celdas que no están sombreadas o tienen un
sombreado más oscuro indica que todos los anticuerpos
correspondientes a ese bloque reconocen el mismo epítopo. Las
celdas con sombreado más claro corresponden a anticuerpos que
reconocen epítopos diferentes. En la figura 17, las celdas son los
valores de intensidad normalizados y también tienen códigos visuales
según su valor. Las celdas que tienen un sombreado más claro tienen
intensidades inferiores a un umbral inferior, las celdas sin
sombreado tienen intensidades entre un umbral inferior y uno
superior, mientras que las celdas con un sombreado más oscuro
tienen intensidades superiores a un umbral superior. Una celda con
un sombreado más claro indica que los anticuerpos en su fila y
columna correspondientes compiten por el mismo epítopo (ya que la
intensidad es baja). Una celda más oscura corresponde a una
intensidad superior y es indicativa de que los anticuerpos en la
fila y columna correspondientes se unen a epítopos diferentes.
Los resultados de esta realización ilustrativa
(ejemplo 2) indican que los procedimientos de la presente invención
proporcionan un alto nivel de autocoherencia para los datos con
respecto a revelar si dos anticuerpos compiten o no por el mismo
epítopo. La simetría del sombreado en las figuras 16 y 17 con
respecto a la diagonal muestra claramente esta autocoherencia. El
motivo es que los anticuerpos en la fila A y la columna B son el
mismo par que en la fila B y la columna A. Por tanto, si el par de
anticuerpos compite por el mismo epítopo, entonces la intensidad
debe ser baja tanto cuando el anticuerpo A es el anticuerpo primario
y el anticuerpo B es el anticuerpo secundario, como cuando el
anticuerpo B es el anticuerpo primario y el anticuerpo B es el
anticuerpo secundario. Por tanto, la intensidad para la celda de la
fila i y la columna j así como la de la fila j y la columna i deben
ser bajas. Igualmente, si estos dos anticuerpos reconocen epítopos
diferentes, entonces ambas intensidades correspondientes deben ser
altas. De los aproximadamente 200 pares de celdas en la figura 17,
sólo un par mostró una discrepancia en la que un miembro del par
tenía una intensidad inferior a 1,5 mientras que el otro miembro
tenía una intensidad superior a 2,5. El nivel de autocoherencia de
las matrices normalizadas resultantes producidas mediante el
algoritmo proporciona una medición de la fiabilidad tanto de los
datos generados como del análisis mediante el algoritmo de los
datos. El alto nivel de autocoherencia para el conjunto de datos
(superior al 99%) de anticuerpos frente a la diana ANTIGEN14 sugiere
que los procedimientos de análisis de datos dados a conocer y
reivindicados en el presente documento generan resultados
fiables.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona un método para combinar conjuntos de datos para superar
las limitaciones de sistemas experimentales usados para seleccionar
anticuerpos. Realizando múltiples experimentos en los que cada
experimento tiene al menos x anticuerpos en común con otro
experimento, y proporcionando los múltiples conjuntos de datos
resultantes como entrada para el procedimiento de agrupación, debe
poderse agrupar de manera fiable cantidades muy grandes de
anticuerpos. Teniendo un conjunto de m anticuerpos en común entre
los m experimentos, se vuelve posible deducir a qué agrupación es
probable que pertenezcan los anticuerpos aunque no se sometan a
prueba frente a todos los demás anticuerpos. Esto sugiere que usando
este método para el análisis de datos con múltiples conjuntos de
datos, puede ser posible lograr un rendimiento incluso superior con
menos ensayos.
A modo de ejemplo, la tecnología Luminex
proporciona 100 fluorocromos únicos, de modo que es posible estudiar
100 anticuerpos como máximo en un único experimento. La coherencia
de los resultados producidos por la etapa de agrupación para
conjuntos de datos individuales y el conjunto de datos combinados
indican que puede deducirse qué epítopo se reconoce por qué
anticuerpo, incluso si el epítopo y/o el anticuerpo no se someten a
prueba frente a todos los demás anticuerpos. En una realización
preferida, puede usarse el procedimiento CPR para caracterizar los
patrones de unión de más de 100 anticuerpos realizando múltiples
experimentos usando conjuntos de anticuerpos solapantes. Diseñando
experimentos de una manera tal que cada experimento tiene un
conjunto de anticuerpos en común con los otros experimentos, la
matriz promedio combinada no le faltará ningún dato.
Un aspecto adicional proporciona que los
resultados del análisis de datos para un conjunto de anticuerpos
dado son útiles para ayudar al diseño racional de experimentos
posteriores. Por ejemplo, si un conjunto de datos para un primer
experimento muestra que aparecen agrupaciones bien definidas,
entonces el conjunto de anticuerpos para un segundo experimento
debe incluir anticuerpos representativos del primer conjunto de
anticuerpos así como anticuerpos no sometidos a prueba. Este
enfoque garantiza que cada conjunto de anticuerpos tiene material
suficiente para definir los dos epítopos, y que los conjuntos se
solapan de manera suficiente para permitir la comparación entre
conjuntos. Comparando los patrones de competición de un conjunto de
anticuerpos no sometidos prueba en el segundo experimento con un
conjunto muestra de anticuerpos conocidos del primer experimento,
debe poderse determinar si los anticuerpos no sometidos a prueba
reconocen o no el/los mismo(s) epítopo(s) que el
primer conjunto de anticuerpos. Este diseño experimental solapante
permite una comparación fiable de los patrones de competición del
primer conjunto con el segundo conjunto de anticuerpos, para
determinar si los anticuerpos en el segundo experimento reconocen
epítopos existentes, o si reconocen uno o más epítopos
completamente novedosos. Además, pueden diseñarse experimentos de
manera iterativa de una manera óptima, de manera que pueden
someterse a prueba múltiples conjuntos de anticuerpos frente a
agrupaciones existentes y nuevas.
Los resultados de la realización descrita en el
ejemplo 3 a continuación, usando anticuerpos frente a la diana
ANTIGEN39, demuestran que los procedimientos dados a conocer y
reivindicados en el presente documento son adecuados para analizar
datos de múltiples experimentos. En esta realización, se sometieron
a prueba anticuerpos frente al ANTIGEN39 para determinar su unión a
antígeno ANTIGEN39 de superficie celular, en el que el antígeno
ANTIGEN39 es una proteína de superficie celular. En primer lugar, se
generaron matrices de intensidad normalizadas para cada experimento
individual, en las que los valores normalizados superiores a un
valor umbral seleccionado se fijan al valor umbral seleccionado
para evitar que cualquier valor de intensidad normalizado individual
tenga demasiada influencia sobre el valor promedio para ese par de
anticuerpos. Se generó una única matriz normalizada a partir de
matrices normalizadas individuales tomando el promedio de los
valores de intensidad normalizados a lo largo de todos los
experimentos para cada par de anticuerpos para los que había datos
disponibles. Después se generó una única matriz de disimilitud tal
como se describió anteriormente, con la excepción de que la
fracción de las posiciones en las que se diferencian dos filas, i y
j, sólo considera el número de posiciones para las que ambas filas
tienen un valor de intensidad.
Para cinco experimentos usando anticuerpos
frente al ANTIGEN39, los resultados de agrupación para los cinco
conjuntos de datos de entrada mostraron que había un gran número de
agrupaciones de diversos grados de similitud, lo que sugiere la
presencia de varios epítopos diferentes, algunos de los cuales
pueden solaparse. Esto se muestra en la figura 6A, la figura 18, la
figura 19 y la figura 30. Por ejemplo, la agrupación que contiene
los anticuerpos 1.17, 1.55, 1.16, 1.11 y 1.12 y la agrupación que
contiene los 1.21, 2.12, 2.38, 2.35 y 2.1 están relacionadas de
manera bastante estrecha, ya que cada par de anticuerpos muestra una
diferencia no superior al 25%, con la excepción de 2.35 y 1.11.
Este alto grado de similitud entre las dos agrupaciones sugirió que
los dos epítopos diferentes pueden tener un alto grado de
similitud.
Los cinco conjuntos de datos de experimentos
separados usando anticuerpos frente al ANTIGEN39 también se
agruparon independientemente, para demostrar que los procedimientos
dados a conocer y reivindicados en el presente documento produce
resultados de agrupación coherentes. Los resultados de agrupación se
resumen en las figuras 6B-6F y en las figuras
20-30, en las que la figura 30 resume las
agrupaciones para cada uno de los conjuntos de datos individuales y
para el conjunto de datos combinados con todos los anticuerpos para
los cinco experimentos. La figura 6B muestra el dendrograma para
anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 1: anticuerpos
1.12, 1.63, 1.17, 1.55 y 2.12 agrupados de manera coherente entre sí
en este experimento así como en otros experimentos al igual que los
anticuerpos 1.46, 1.31, 2.17 y 1.29. La figura 6C muestra el
dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el
experimento 2: anticuerpos 1.57 y 1.61 agrupados de manera coherente
entre sí en este experimento así como en otros experimentos.
La figura 6D muestra el dendrograma para
anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 3: anticuerpos
1.55, 1.12, 1.17, 2.12, 1.11 y 1.21 agrupados de manera coherente
entre sí en este experimento así como en otros experimentos. La
figura 6E muestra el dendrograma para anticuerpos frente al
ANTIGEN39 para el experimento 4: anticuerpos 1.17, 1.16, 1.55, 1.11
y 1.12 agrupados de manera coherente entre sí en este experimento
así como en otros experimentos al igual que los anticuerpos 1.31,
1.46, 1.65 y 1.29, así como los anticuerpos 1.57 y 1.61. La figura
6F muestra el dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para
el experimento 5: anticuerpos 1.21, 1.12, 2.12, 2.38, 2.35 y 2.1
agrupados de manera coherente entre sí en este experimento así como
en otros experimentos.
En general, el algoritmo de agrupación produjo
resultados coherentes tanto entre los experimentos individuales
como entre los conjuntos de datos combinados e individuales. Los
anticuerpos que se agrupan entre sí o están en agrupaciones vecinas
para múltiples conjuntos de datos individuales también se agrupan
entre sí o están en agrupaciones vecinas para el conjunto de datos
combinados. Por ejemplo, las celdas que tienen un sombreado más
claro indican anticuerpos que se agrupan de manera coherente entre
sí en el conjunto de datos combinados y en todos los conjuntos de
datos en los que están presentes (experimentos 1, 3, 4 y 5). Estos
resultados indican que el algoritmo produce resultados de
agrupación coherentes tanto entre múltiples experimentos
individuales como que conserva la coherencia tras combinar
conjuntos de datos múltiples.
Finalmente, hay un alto nivel de autocoherencia
para los datos con respecto a revelar si dos anticuerpos compiten o
no por el mismo epítopo. El porcentaje de pares de anticuerpos para
los que los datos revelan de manera coherente si compiten o no por
el mismo epítopo se resume para cada conjunto de datos en la tabla
2, a continuación, que revela que la coherencia fue de casi el 90%
para cuatro de los cinco conjuntos de datos individuales así como
para el conjunto de datos combinados.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de la realización descrita en el
ejemplo 3 a continuación, usando anticuerpos frente a la diana
ANTIGEN39, demuestran adicionalmente que los resultados generados
mediante combinación por epítopos según los métodos de la presente
invención son coherentes con los resultados generados usando
citometría de flujo (citometría de flujo activada por
fluorescencia, FACS). Se clasificaron las células que expresaban
ANTIGEN39 mediante FACS, y se usaron células negativas para
ANTIGEN39 como controles negativos también clasificadas mediante
FACS. Los sitios de unión de superficie celular reconocidos por los
anticuerpos de diferentes combinaciones representan epítopos
diferentes. La figura 3 muestra una comparación de los resultados de
experimentos con anticuerpos usando el anticuerpo
anti-ANTIGEN39, con resultados usando FACS. Tal como
se muestra en la figura 3, los anticuerpos en una combinación dada
o bien son todos positivos (combinaciones 1, 4, 5) o bien todos
negativos (combinaciones 2 y 3) en FACS, lo que indica que el ensayo
de unión a epítopos de anticuerpos combina realmente los
anticuerpos basándose en sus propiedades de unión a epítopos. Por
tanto, la unión a epítopos, tal como se describe en el presente
documento, proporciona un método eficaz, rápido y fiable para
determinar las propiedades de reconocimiento de epítopos de
anticuerpos, y clasificar y catalogar anticuerpos basándose en el
epítopo que reconocen.
Un procedimiento de análisis de datos
alternativo implica restar la matriz de datos para el experimento
llevado a cabo con antígeno a la matriz de datos para el
experimento sin antígeno para generar una matriz de intensidad de
fondo normalizada. Después se usa el valor en cada celda diagonal
como valor de fondo para determinar la afinidad de unión del
anticuerpo en la columna correspondiente. Las celdas en cada columna
de la matriz de intensidad de fondo normalizada (la matriz restada)
que tienen valores significativamente superiores al valor de la
celda diagonal para esa columna, se resaltan o se indican de otro
modo. Generalmente, un valor de aproximadamente dos veces la
diagonal correspondiente se considera "significativamente
superior", aunque un experto en la técnica puede determinar qué
aumento con respecto al fondo es el umbral para
"significativamente superior" en una realización particular,
teniendo en cuenta los reactivos y condiciones usados, y el
"ruido" de los datos introducidos. Las columnas con patrones
de unión similares se agrupan como una combinación, y las
diferencias minoritarias dentro de la combinación se identifican
como subcombinaciones. Este análisis de datos puede llevarse a cabo
de manera automática para un conjunto dado de datos de entrada. Por
ejemplo, puede almacenarse datos de entrada en una aplicación de
base de datos informática en la que las celdas en la diagonal se
marcan automáticamente, y se resaltan las celdas en cada columna en
comparación con los números en la diagonal, y se agrupan las
columnas con patrones de unión
similares.
similares.
En una realización preferida usando cincuenta y
dos (52) anticuerpos frente al ANTIGEN54, los resultados de
combinación usando el procedimiento de análisis de datos descrito
anteriormente se correlacionaron con el análisis de secuencia de
las regiones CDR de anticuerpos combinados usando el ensayo de
anticuerpos competitivo MCAB. Los 52 anticuerpos consistieron en 2
ó 3 clones a partir de 20 líneas celulares. Tal como se esperaba,
las secuencias de clones de la misma línea fueron idénticas, de modo
que sólo se secuenció un clon representativo de cada línea. La
correspondencia entre los resultados de combinación por epítopos y
el análisis de secuencia de anticuerpos combinados mediante este
método indica que este enfoque es adecuado para identificar
anticuerpos que tienen patrones de unión similares. Además, la
correspondencia entre los resultados de combinación por epítopos y
el análisis de secuencia de anticuerpos combinados mediante este
método significa que el método de combinación por epítopos
proporciona información y orientación sobre qué secuencias de
anticuerpo son importantes para determinar la especificidad de
epítopo de la unión del anticuerpo.
Se recogieron los sobrenadantes de hibridoma que
contenían anticuerpos monoclonales de IgG humanos específicos para
antígeno usados para la combinación a partir de células de hibridoma
cultivadas que se habían transferido desde placas de fusión hasta
placas de 24 pocillos. Se recogió el sobrenadante a partir de placas
de 24 pocillos para el análisis de la combinación. Se seleccionaron
anticuerpos específicos para el antígeno de interés mediante
detección de hibridoma, usando detección mediante ELISA frente a sus
antígenos. Se clasificaron los anticuerpos positivos para unión al
antígeno mediante su afinidad de unión a través de una combinación
de un método de clasificación de afinidad en placas de 96 pocillos
y medición de afinidad por BIAcore. Se seleccionaron los
anticuerpos con alta afinidad para el antígeno de interés para la
combinación por epítopos. Se usarán estos anticuerpos como los
anticuerpos de prueba de referencia y sonda en el ensayo.
En primer lugar, se midió la concentración de
anticuerpos monoclonales anti-IgG humana de ratón
(mxhIgG) usados como anticuerpo de captura para capturar el
anticuerpo de referencia, y se dializaron los anticuerpos mxhIgG en
PBS para eliminar azidas u otros conservantes, que podrían
interferir en el procedimiento de acoplamiento. Luego se acoplaron
los anticuerpos mxhIgG a las perlas Luminex (sistema Luminex 100,
Luminex Corp., Austin TX) según las instrucciones del fabricante en
el Manual de Usuario de Luminex ("Luminex User Manual"),
páginas 75-76. En resumen, se combinó el anticuerpo
de captura mxhIgG a 50 \mug/ml en 500 \mul de PBS con perlas a
1,25x10^{7} perlas/ml en 300 \mul. Tras el acoplamiento, se
contaron las perlas usando un hemocitómetro y se ajustó la
concentración hasta 1x10^{7} perlas/ml.
Se recogieron los anticuerpos específicos para
antígeno y se detectaron tal como se describió anteriormente, y se
determinaron sus concentraciones. Se seleccionaron hasta 100
anticuerpos para la combinación por epítopos. Se diluyeron los
anticuerpos según la fórmula siguiente para unir los anticuerpos a
hasta 100 perlas marcadas de manera única para formar anticuerpos
de referencia marcados:
Volumen total de las muestras en cada tubo:
en la que n = número total de
muestras incluyendo los
controles.
\vskip1.000000\baselineskip
Volumen de muestra individual necesaria para la
dilución:
concentración de cada muestra. C =
0,2-0,5
\mul/ml.
\newpage
Se prepararon las muestras según la fórmula
anterior, y se tomaron alícuotas de 150 \mul de cada muestra
diluida que contenía un anticuerpo de referencia y se añadieron en
un pocillo de una placa de 96 pocillos. Se conservaron alícuotas
adicionales para su uso como anticuerpo sonda en una fase posterior
del ensayo. Se agitó con vórtex la reserva de perlas acopladas a
mxhIgG y se diluyeron hasta una concentración de 2500 de cada perla
por pocillo ó 0,5 x 10^{5}/ml. Se incubaron los anticuerpos de
referencia con perlas acopladas a mxhIgG en un agitador en la
oscuridad a temperatura ambiente durante la noche.
Se humedeció previamente una placa filtrante de
96 pocillos añadiendo 200 \mul de tampón de lavado y aspirando.
Tras la incubación durante la noche, se reunieron perlas (ahora con
anticuerpos de referencia unidos a mxhIgG unidos a perlas), y se
tomaron alícuotas de 100 \mul y se añadieron en cada pocillo de
una placa filtrante de microtitulación de 96 pocillos a una
concentración de 2000 perlas por pocillo. El número total de
alícuotas de perlas era dos veces el número de muestras que iban a
someterse a prueba, permitiendo de ese modo experimentos paralelos
con y sin antígeno. Se aspiró inmediatamente el tampón para eliminar
cualquier anticuerpo de referencia no unido y se lavaron las perlas
tres veces.
Se añadió antígeno (50 \mul) a un conjunto de
muestras; y se incubaron las perlas con antígeno a una concentración
de 1 \mug/ml durante una hora. Se añade un control de tampón al
otro conjunto de muestras, para proporcionar un control negativo
sin antígeno.
Entonces se añadieron todos los anticuerpos que
estaban usándose como anticuerpos sonda a todas las muestras (con
antígeno y sin antígeno). En este experimento, cada anticuerpo que
se usa como anticuerpo de referencia también se usó como anticuerpo
sonda, con el fin de someter a prueba todas las combinaciones. El
anticuerpo sonda debe tomarse de la misma disolución diluida que el
anticuerpo de referencia, para garantizar que se usa el anticuerpo
en la misma concentración. Se añadió el anticuerpo sonda (50
\mul/pocillo) a todas las muestras y se incubaron la mezclas en
la oscuridad durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador.
Se lavaron las muestras tres veces para eliminar el anticuerpo sonda
no unido.
Anticuerpo de detección: se añadió mxhIgG
biotinilado (50 \mul/pocillo) a una dilución de 1:500, y se
incubó la mezcla en la oscuridad durante 1 hora en un agitador. Se
lavaron las perlas tres veces para eliminar mxhIgG biotinilado no
unido. Se añadió estreptavidina-PE a una dilución de
1:500, 50 \mul/pocillo. Se incubó la mezcla en la oscuridad
durante 15 minutos a temperatura ambiente en un agitador, y luego se
lavó tres veces para eliminar componentes no unidos.
Según las instrucciones del fabricante, se
encendió la base de Luminex 100 y XYP usando el software Luminex.
Se inició una nueva sesión y se introdujeron el número de muestras y
los números de denominación de las perlas usadas en el ensayo.
Se resuspendieron las perlas de cada pocillo en
80 \mul de tampón de dilución. Se colocó la placa de 96 pocillos
en la base de Luminex y se leyó y registró el espectro de emisión de
fluorescencia de cada pocillo.
Para optimizar el ensayo, se usó inicialmente el
Manual de usuario de Luminex versión 1.0 para la orientación con
respecto a las concentraciones de perlas, anticuerpos y tiempos de
incubación. Se determinó empíricamente que un tiempo incubación más
largo proporcionaba una saturación de unión garantizada y era más
adecuado para las concentraciones de anticuerpo de nanogramos
usadas en el ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometieron a ensayo los anticuerpos tal como
se describió en el ejemplo 1 y se recogieron los resultados. Los
archivos de entrada consistían en matrices de entrada mostradas en
la figura 8A (antígeno presente) y en la figura 8B (antígeno
ausente) para un conjunto de datos que corresponde a un único
experimento para la diana ANTIGEN14.
En primer lugar, se restó la matriz
correspondiente al experimento sin antígeno (control negativo,
figura 8B) de la matriz correspondiente al experimento con antígeno
(figura 8A), para eliminar la cantidad de señal de fondo debida a
unión no específica del anticuerpo marcado. Se muestra la diferencia
entre las dos matrices en la figura 9. La columna correspondiente
al anticuerpo 2.42 tiene valores excepcionalmente grandes tanto en
como fuera de la diagonal y se señala y se trata por separado en el
análisis de datos tal como se describió anteriormente.
Se ajustó la diferencia de matriz fijando
valores por debajo del valor umbral definido por el usuario de 200
para este valor umbral tal como se muestra en la figura 10. Se hizo
este ajuste para evitar la inflación artificial significativa de
valores de señal bajos en las etapas de normalización posteriores
(tal como se describió anteriormente). Entonces se normalizaron las
intensidades de cada fila en la matriz dividiendo cada valor en una
fila entre el valor de la fila correspondiente al tampón de bloqueo
(figura 11). Esto ajusta para la variación de intensidad pocillo a
pocillo tal como se trató anteriormente y se ilustró en la figura
2A.
Se normalizaron todas las columnas excepto la
correspondiente al anticuerpo 2.42 tal como se describió
anteriormente y se muestran en la figura 12.
Se generó una matriz de disimilitud (o
distancia) en un procedimiento de múltiples etapas. En primer lugar,
se fijaron los valores de intensidad por debajo del umbral definido
por el usuario (ajustado a dos veces los valores de intensidad
diagonal) a cero y se fijaron los valores restantes a uno (figura
13). Esto significa que los valores de intensidad que son
inferiores a dos veces el valor de intensidad del valor diagonal se
consideran lo bastante bajos como para representar la competición
para el mismo epítopo por el par de anticuerpos. Se genera la
matriz de disimilitud a partir de la matriz de ceros y unos fijando
la entrada en la fila i y la columna j a la fracción de posiciones
en las que difieren dos filas, i y j. La figura 14 muestra el número
de posiciones (de un total de 22) en las que se diferencian los
patrones para dos anticuerpos cualesquiera para el conjunto de
anticuerpos generado frente a la diana ANTIGEN14.
Se generó una matriz de disimilitud a partir de
la matriz de ceros y unos generada a partir de cada uno de los
varios valores umbral que oscilan desde 1,5 hasta 2,5 (veces los
valores de las diagonales), en incrementos de 0,1. Se calculó el
promedio de estas matrices de disimilitud (figura 15) y se usó como
entrada para el algoritmo de agrupación. Se ilustra la
significación de tomar el promedio de varias matrices de disimilitud
en la figura 4. La figura 4 muestra la fracción de disimilitudes
para un par de anticuerpos (2.1 y 2.25) como una función del valor
umbral para valores umbral que oscilan desde 1,5 hasta 2,5. A medida
que el valor umbral cambió desde 1,8 y 1,9 la cantidad de
disimilitud entre los patrones de señal para los dos anticuerpos
cambió sustancialmente desde el 0% hasta casi el 15%. Esta figura
muestra cómo la cantidad de disimilitud entre los patrones de señal
para un par de anticuerpos puede ser sensible a una elección
particular para un valor de corte, ya que puede variar
sustancialmente para diferentes valores umbral.
Agrupación jerárquica. Usando la
subrutina de anidación por aglomeración en el software de análisis
estadístico SPLUS 2000, se agruparon los anticuerpos usando la
matriz de disimilitud promedio que se describió anteriormente como
entrada. En este algoritmo, se forzaron los anticuerpos en una
jerarquía estricta de subconjuntos anidados. En primer lugar se
agrupó el par de anticuerpos con el menor valor de disimilitud
correspondiente en toda la matriz. A continuación, se agrupó el par
de anticuerpos, o agrupación de anticuerpos, con el segundo menor
valor de disimilitud (o disimilitud promedio). Este procedimiento se
repitió de manera iterativa hasta que se quedó una agrupación.
El dendrograma calculado para la diana ANTIGEN14
se muestra en la figura 5. La longitud (o altura) de las ramas que
conectan dos anticuerpos es inversamente proporcional al grado se
similitud entre los anticuerpos a los que se une. Este dendrograma
muestra que había dos epítopos muy distintos reconocidos por estos
anticuerpos. Un epítopo se reconoció por los anticuerpos 2.73, 2.4,
2.16, 2.15, 2.69, 2.19, 2.45, 2.1, y 2.25. Un epítopo diferente se
reconoció por los anticuerpos 2.13, 2.78, 2.24, 2.7, 2.76, 2.61,
2.12, 2.55, 2.31, 2.56, y 2.39. El anticuerpo 2.42 no tiene un
patrón que fuera muy similar a cualquier otro anticuerpo pero tuvo
alguna similitud perceptible a la segunda agrupación, lo que indica
que podría reconocer aún un tercer epítopo que coincide
parcialmente con el segundo epítopo.
En la figura 16 y en la figura 17 también puede
observarse esta agrupación de estos anticuerpos. En la figura 16,
se dispusieron las filas y las columnas de la matriz de disimilitud
según el orden de las "hojas" o clados en el dendrograma y se
codificaron visualmente las células individuales según el grado de
disimilitud. Las celdas que tienen sombreado más oscuro
corresponden a los pares de anticuerpos que eran muy similares
(menos del 10% de disimilitud). Las celdas que no están sombreadas
corresponden a aquellos anticuerpos que eran bastante similares
(entre el 10% y el 25% de disimilitud). Las celdas que tienen
sombreado más claro corresponden a los pares de anticuerpo que
tenían más de un 25% de disimilitud. Los bloques con el sombreado
más oscuro corresponden a agrupaciones diferentes de anticuerpos.
Excluyendo el tampón de bloqueo, parecen ser dos, o posiblemente
tres, bloques correspondientes a los grupos de anticuerpos
mencionados anteriormente. La figura 16 también muestra que,
permitiendo una tolerancia ligeramente más alta para la disimilitud,
puede considerarse que el anticuerpo 2.42 es un miembro de la
segunda agrupación.
En la figura 17, se dispusieron las filas y las
columnas de la matriz de intensidad normalizada según el orden de
las hojas en el dendrograma y se codificaron visualmente las celdas
individuales según sus valores de intensidad normalizados. Las
celdas que tienen sombreado más oscuro corresponden a los pares de
anticuerpos que tenían una intensidad alta (al menos 2,5 veces
mayor que el fondo). Las celdas que no están sombreadas tenían una
intensidad entre 1,5 y 2,5 veces el fondo. Las celdas que tienen
sombreado más claro corresponden a intensidades que eran inferiores
a 1,5 veces el fondo. Cuando se comparan las marcas visuales de las
filas de esta matriz, aparecieron dos patrones muy distintos de los
correspondientes a los dos epítopos mostrados anteriormente.
Además, debe observarse que la codificación visual es muy simétrica
con respecto a la diagonal. Esto muestra que había un alto nivel de
autoconsitencia para los datos con respecto a la revelación de si
dos anticuerpos compiten por el mismo epítopo. La razón es que si
el anticuerpo A y el anticuerpo B compiten por el mismo epítopo,
entonces la intensidad debe ser baja tanto cuando el anticuerpo A es
el anticuerpo primario y el anticuerpo B es el anticuerpo
secundario, como cuando el anticuerpo B es el anticuerpo primario y
el anticuerpo B es el anticuerpo secundario. Por tanto, la
intensidad para la celda en la fila i y la columna j así como para
la fila j y la columna i deben ser ambas bajas. Asimismo, si estos
dos anticuerpos reconocieron diferentes epítopos, entonces ambas
intensidades correspondientes deben haber sido altas. De los
aproximadamente 200 pares de celdas, sólo un par tenía un miembro
del par con una intensidad inferior a 1,5 mientras que el otro
miembro tuvo una intensidad superior a 2,5. El nivel de
autocoherencia de las matrices normalizadas resultantes producidas
mediante el algoritmo proporciona una medición de la fiabilidad
tanto de los datos generados como del análisis del algoritmo de los
datos. El alto nivel de autocoherencia para el conjunto de datos de
ANTIGEN14 (superior al 99%) sugiere que se puede confiar en los
resultados del algoritmo para este conjunto de datos con un alto
nivel de
confianza.
confianza.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando existen conjuntos de datos de entrada
para más de uno experimento, en primer lugar se generan matrices de
intensidad normalizadas tal como se describió anteriormente para
cada experimento individual. Se fijan al valor umbral
correspondiente los valores normalizados por encima de un valor
umbral (normalmente fijados a 4). Esto evita que cualquier valor de
intensidad normalizado tenga demasiado peso en el valor promedio
para ese par de anticuerpos. Se genera una única matriz normalizada
a partir de las matrices normalizadas individuales tomando el
promedio del los valores de intensidad normalizados a los largo de
todos los experimentos para cada par de anticuerpos para los que
hay datos. Se señalan los pares de anticuerpos sin valores de
intensidad correspondientes. La generación de la matriz de
disimilitud es tal como se describió anteriormente con la excepción
de que la fracción de las posiciones en las que se diferencian dos
filas, i y j solamente considera el número de posiciones para el
que ambas filas tienen un valor de intensidad. Si las dos filas no
tienen tales posiciones, entonces el valor de disimilitud se fija
de manera arbitraria elevado y se señala.
Se realizaron cinco experimentos usando
anticuerpos frente a ANTIGEN39, usando los métodos descritos en los
ejemplos 1 y 2, y a lo largo de la descripción. Se resumen los
resultados de agrupación para los cinco conjuntos de datos de
entrada de los anticuerpos frente a ANTIGEN39 en la figura 6A, la
figura 18, la figura 19, y la tabla 30. Los resultados muestran que
existen un gran número de agrupaciones de diversos grados de
similitud. Esto sugiere que existen varios epítopos diferentes,
algunos de los cuales pueden solaparse. Por ejemplo, la agrupación
que contiene los anticuerpos 1.17, 1.55, 1.16, 1.11 y 1.12 y la
agrupación que contiene los 1.21, 2.12, 2.38, 2.35 y 2.1 están
relacionadas de manera bastante estrecha (siendo diferente cada par
de anticuerpo con la excepción de 2.35 y 1.11 en no más del 25%).
Este alto grado de similitud entre las dos agrupaciones sugiere que
los dos epítopos diferentes pueden tener un alto grado de
similitud.
Con el fin de probar la capacidad del algoritmo
para producir resultados de agrupación coherentes, también se
agruparon los cinco conjuntos de datos independientemente. Los
resultados de agrupación se resumen para los diferentes
experimentos en las figuras 6B-6F y en las figuras
20-30. La figura 30 resume las agrupaciones para
cada uno de los conjuntos de datos individuales y para el conjunto
de datos combinados con todos los anticuerpos para los cinco
experimentos. La figura 6B muestra el dendrograma para anticuerpos
frente al ANTIGEN39 para el experimento 1: anticuerpos 1.12, 1.63,
1.17, 1.55 y 2.12 agrupados de manera coherente entre sí en este
experimento así como en otros experimentos al igual que los
anticuerpos 1.46, 1.31, 2.17, y 1.29. La figura 6C muestra el
dendrograma para anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento
2: anticuerpos 1.57 y 1.61 agrupados de manera coherente entre sí
en este experimento así como en otros experimentos.
La figura 6D muestra el dendrograma para
anticuerpos frente al ANTIGEN39 para el experimento 3: anticuerpos
1.55, 1.12, 1.17, 2.12, 1.11 y 1.21 agrupados de manera coherente
entre sí en este experimento así como en otros experimentos. La
figura 6E muestra el dendrograma para anticuerpos frente al
ANTIGEN39 para el experimento 4: anticuerpos 1.17, 1.16, 1.55,
1.11, y 1.12 agrupados de manera coherente entre sí en este
experimento así como en otros experimentos al igual que los
anticuerpos 1.31, 1.46, 1.65, y 1.29, así como anticuerpos 1.57 y
1.61. La figura 6F muestra el dendrograma para anticuerpos frente al
ANTIGEN39 para el experimento 5: anticuerpos 1.21, 1.12, 2.12,
2.38, 2.35, y 2.1 agrupados de manera coherente entre sí en este
experimento así como en otros experimentos.
En general, el algoritmo de agrupación produjo
resultados coherentes tanto entre los experimentos individuales
como entre los conjuntos de datos combinados e individuales. Los
anticuerpos que se agrupan entre sí o están en agrupaciones vecinas
para múltiples conjuntos de datos individuales también se agrupan
entre sí o están en agrupaciones vecinas para el conjunto de datos
combinados. Por ejemplo, las celdas que tienen un sombreado más
claro indican anticuerpos que se agruparon de manera coherente entre
sí en el conjunto de datos combinados y en todos los conjuntos de
datos en los que estaban presentes (experimentos 1, 3, 4, y 5). De
manera similar, las celdas con sombreado más oscuro indican
anticuerpos que se agruparon de manera coherente entre sí en el
conjunto de datos combinados y en los experimentos 1, 4, y 5. Estos
resultados indican que el algoritmo produce resultados de
agrupación coherentes tanto entre experimentos individuales
múltiples como que conserva la coherencia tras combinar conjuntos
de datos múltiples.
Finalmente, hay un alto nivel de autocoherencia
para los datos con respecto a revelar si dos anticuerpos compiten o
no por el mismo epítopo. El porcentaje de pares de anticuerpos para
los que los datos revelan de manera coherente si compiten o no por
el mismo epítopo se resume para cada conjunto de datos en la tabla
2, anterior. La tabla 2 revela que la coherencia era casi del 90%
para cuatro de los cinco conjuntos de datos individuales así como
para el conjunto de datos combinados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un pequeño conjunto de anticuerpos
monoclonales humanos bien caracterizados desarrollados frente a
IL-8, un mediador proinflamatorio, para evaluar el
programa aplicando el procedimiento RPC. Anteriormente, ELISA en
placa habían demostrado que los anticuerpos dentro del conjunto se
unían a dos epítopos diferentes: HR26, a215, y D111 reconocían un
epítopo, mientras que K221 y a33 competían por un segundo epítopo.
El análisis adicional usando estudios de mapeo de epítopo demostró
que HR26, a809 y a928 se unían al mismo o a epítopos solapantes,
mientras que a837 se unía a un epítopo diferente.
En un nuevo experimento para determinar el
procedimiento RPC podía agrupar correctamente anticuerpos, se
sometió a prueba el procedimiento en un conjunto de siete
anticuerpos frente a IL-8, incluyendo algunos de los
anticuerpos monoclonales enumerados anteriormente. Los resultados
se resumen en los dendrogramas mostrados en la figura 7A. El
dendrograma de la izquierda se generó mediante columnas de
agrupación y el dendrograma de la derecha se generó mediante filas
de agrupación de la matriz de intensidad de señal normalizada para
el fondo. Ambos dendrogramas indicaron que existían dos epítopos
para un valor límite de disimilitud de 0,25: un epítopo reconocido
por HR26, a215, a203, a393 y a452, y un segundo epítopo reconocido
por K221 y a33.
Estos resultados usando el procedimiento RPC
para anticuerpos de agrupación eran coherentes con los datos de los
ensayos de ELISA en placa resumidos anteriormente. Los resultados
obtenidos usando el procedimiento RPC indicaron que el antígeno
diana pareció tener dos epítopos distintos, lo que confirma los
resultados observados usando ensayos de ELISA placa. El uso del
procedimiento RPC para la agrupación indicó que HR26 y a215 se
agruparon entre sí, al igual que lo hicieron K221 y a33, de nuevo
coherente con los resultados a partir de ensayos de ELISA en
placa.
El grado de similitud entre los dos dendrogramas
proporcionó una medición de la autocoherencia de los análisis
realizados mediante este procedimiento. De manera ideal, los dos
dendrogramas (el de la izquierda generado agrupando columnas y el
de la derecha generado agrupando filas) deberían haber sido
idénticos por la siguiente razón: si el anticuerpo nº 1 y el
anticuerpo nº 2 compiten por el mismo epítopo, entonces la
intensidad debería ser baja cuando el anticuerpo nº 1 es el
anticuerpo de referencia y el anticuerpo nº 2 es el anticuerpo
sonda, así como cuando el anticuerpo nº 2 es el anticuerpo de
referencia y anticuerpo nº 1 es el anticuerpo sonda. Asimismo,
cuando los dos anticuerpos se unen a epítopos diferentes, las
intensidades deberían ser uniformemente altas. Por esta razón, el
grado de similitud entre las dos filas de la matriz de intensidad de
señal debería ser el mismo que entre las dos columnas de la matriz
de similitud. En el presente ejemplo, los dendrogramas a la
izquierda y la derecha de la figura 7A son casi idénticos. En cada
caso, los mismos anticuerpos aparecieron en las dos agrupaciones.
Este alto nivel de autocoherencia entre las agrupaciones de fila y
columna sugirió que el protocolo del experimento, junto con el
procedimiento, produce resultados sólidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo experimentos de detección
múltiple usando anticuerpos frente a IL-8, generando
conjuntos de datos múltiples. En primer lugar se generaron matrices
de intensidad normalizadas tal como se describió anteriormente para
las matrices para cada experimento individual. Se fijaron los
valores normalizados por encima del valor umbral definido por el
usuario al valor umbral definido por el usuario. Se asignaron los
valores de intensidad alta al valor umbral para evitar que cualquier
valor de intensidad individual tenga demasiado peso cuando se
calcule el valor de intensidad normalizado promedio para ese par de
anticuerpos particular en una etapa posterior. Las filas y las
columnas de la matriz de intensidad normalizada promedio
correspondieron al conjunto de anticuerpos "únicos"
identificados usando los métodos de la presente invención. Se
identificaron estos anticuerpos "únicos" de entre todos los
anticuerpos usados en todos los experimentos. Se calculó la
intensidad promedio para cada celda en esta matriz para la cual
existía al menos un valor de intensidad. Se identificaron las
celdas que correspondían a los pares de anticuerpos sin datos como
puntos de datos perdidos. Se generó la matriz de disimilitud tal
como se describió anteriormente, excepto en que se determinó la
fracción basándose en los número de posiciones en las que dos filas
diferían con relación al número total de posiciones para que ambas
filas tenían valores de intensidad. Si las dos filas no tenían datos
comunes, entonces se señalaba el valor de disimilitud para la celda
correspondiente y fijaba arbritariamente alto, de modo que los
anticuerpos correspondientes no se agruparían entre sí como un
artefacto.
Los resultados de agrupación para un conjunto de
anticuerpos monoclonales a partir de cinco conjuntos solapantes de
anticuerpos monoclonales se resumen en la figura 7B y en la tabla 3
(a continuación). Estos dendrogramas corroboran los resultados
demostrando que hay dos epítopos diferentes en el antígeno diana. Se
define el primer epítopo mediante los anticuerpos monoclonales
a809, a928, HR26, a215, y D111 y se define el segundo epítopo
mediante los anticuerpos monoclonales a837, K221, a33, a142, y a358,
a203, a393, y a452. Las longitudes de las ramas que conectan los
grupos indicaron que, mientras que la primera agrupación era muy
diferente de los otros dos, la segunda y la tercera eran similares
entre sí.
Para someter a prueba la capacidad del
procedimiento RPC para producir resultados coherentes entre
experimentos separados, también se agruparon los cinco conjuntos de
datos independientemente separado. Los resultados de agrupación
para los diferentes experimentos se resumen en los dendrogramas
mostrados en las figuras 7A, 7B, 7C, y en la tabla B. Estos
dendrogramas demostraron que el procedimiento de agrupación RPC
produjo resultados coherentes entre los experimentos individuales y
entre los conjuntos de datos combinados e individuales. Cada
dendrograma tenía dos ramas principales, indicando dos epítopos. Los
anticuerpos que se agruparon entre sí para los conjuntos de datos
individuales múltiples también se agruparon entre sí o estaban en
agrupaciones vecinas para el conjunto de datos combinados. Tal como
se muestra en la tabla 3, a continuación, existieron solamente dos
pequeñas discrepancias en los resultados de agrupación entre los
diferentes experimentos o entre un experimento individual y el
conjunto de datos combinados, en los que se indican estas
discrepancias en negrita en la tabla 3. En un conjunto de datos
generados en el experimento 3, se agrupó el D111 con los anticuerpos
a33 y K221, en vez de HR26 y a215. En un grupo de datos generados
en el experimento 4, los anticuerpos a203, a393, y a452 aparecieron
en la primera agrupación, mientras que en otro experimento (así como
en los conjuntos de datos combinados), aparecieron en una segunda
agrupación. Esta ligera diferencia probablemente se atribuye a
diferencias en la afinidad del anticuerpo individual entre
experimentos en los que se usa el anticuerpo como un anticuerpo
sonda y experimentos en los que se usa el mismo anticuerpo como un
anticuerpo de referencia. Los anticuerpos con menor afinidad pueden
tener una capacidad reducida para capturar antígeno fuera de la
disolución cuando se usa como un anticuerpo de referencia. Sin
embargo, la similitud global de los resultados de agrupación, así
como la agrupación de los antígenos, indicó que el procedimiento
produjo resultados de agrupación coherentes, lo que está en buena
concordancia con los resultados de otros experimentos entre
experimentos individuales múltiples, y con que los resultados
seguían siendo coherentes cuando se combinaban conjuntos de datos
múltiples.
Finalmente, existía un alto nivel de coherencia
en los resultados de agrupación para cada uno de estos conjuntos de
datos cuando se usó el procedimiento para agrupar por filas y por
columnas, para los conjuntos de datos individuales y combinados. La
única discrepancia en los resultados de agrupación entre las
agrupaciones por filas y columnas era con D111 en el tercer
conjunto de datos, en el que se agrupó con anticuerpos HR26 y a215
cuando se realizó agrupación por filas, mientras que D111 se agrupó
con anticuerpos a33 y K221 cuando se realizó agrupación por
columnas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Los expertos en la técnica entenderán que pueden
hacerse numerosas y diversas modificaciones sin apartarse del
espíritu de la presente invención. Por tanto, debe entenderse
claramente que las formas de la presente invención son únicamente
ilustrativas y no pretenden limitar el alcance de la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La lista de referencias citadas por el
solicitante es sólo para la conveniencia del lector. Ella no forma
parte del documento de patente europeo. Incluso cuando se ha tenido
un gran cuidado en recopilar las referencias, errores u omisiones
no pueden excluirse y la OEP declina toda responsabilidad a este
respecto.
\bulletSTORCH. Pediatrics,
1998, vol. 102, 648-651 [0002]
\bulletCOLLER et al. Thromb.
Haemostasis, 1995, vol. 74, 302-308
[0002]
\bulletPRESENT et al. New Eng. J.
Med., 1999, vol. 6, 1398-1405 [0002]
\bulletGOLDENBERG. Clin. Ther.,
1999, vol. 21, 309-318 [0002]
\bulletKOHLER; MILSTEIN.
Nature, 1975, vol. 256, 495-497
[0002]
\bulletBABCOOK et al. Proc. Natl.
Acad Sci., 1996, vol. 93, 7843-7848
[0002]
\bulletGREEN. Jnl. Immunol.
Methods, 1999, vol. 231, 11-23
[0002]
\bulletJAKOBOVITS et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993, vol. 90,
2551-2555 [0002]
\bulletMENDEZ. Nat. Genet.,
1997, vol. 15, 146-156 [0002]
\bulletGREEN; JAKOBIVITS. J.
Exp. Med., 1998, vol. 188, 483-495
[0002]
\bulletPERTON et al. Jnl. Immunol.
Methods, 1996, vol. 190 (1), 1 117-125
[0003]
\bulletKUROKI et al. Immunological.
Investigations, 1992, vol. 21 (6),
523-5381 [0003]
\bulletKUROKI. Methods in Molecular
Biology, 1996, vol. 66, 47-53 [0003]
\bulletEISEN et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1998, vol.
95,14863-14868[0090]
Claims (52)
1. Método de ensayo de competición de
anticuerpos para determinar anticuerpos que se unen a un epítopo
sobre un antígeno, que comprende:
proporcionar un conjunto de anticuerpos que se
unen a un antígeno;
marcar cada anticuerpo de dicho conjunto para
formar un conjunto de anticuerpos de referencia marcados de modo
que cada anticuerpo de referencia marcado puede distinguirse de
todos los demás anticuerpos de referencia marcados en dicho
conjunto de anticuerpos de referencia marcados;
proporcionar un anticuerpo sonda que se une a
dicho antígeno;
poner en contacto dicho anticuerpo sonda con
dicho conjunto de anticuerpos de referencia marcados en presencia
de dicho antígeno;
detectar el anticuerpo sonda unido en un
complejo que comprende dicho antígeno, un anticuerpo de referencia
marcado unido a dicho antígeno y dicho anticuerpo sonda unido a
dicho antígeno;
identificar cada dicho anticuerpo de referencia
marcado unido a dicho antígeno en cada dicho complejo;
determinar si dicho anticuerpo sonda compite con
cualquier anticuerpo de referencia en dicho conjunto de anticuerpos
de referencia marcados, en el que la competición indica que dicho
anticuerpo sonda se une al mismo epítopo que otro anticuerpo en
dicho conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno.
2. Método según la reivindicación 1, que
comprende además marcar dicho anticuerpo sonda para formar un
anticuerpo sonda marcado.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
dicho anticuerpo sonda marcado comprende un marcador seleccionado
de un marcador enzimático, un marcador colorimétrico, un marcador
fluorescente o un marcador radiactivo.
4. Método según la reivindicación 1, que
comprende además proporcionar un anticuerpo de detección marcado
para detectar dicho anticuerpo sonda.
5. Método según la reivindicación 4, en el que
dicho anticuerpo de detección marcado comprende un marcador
seleccionado de un marcador enzimático, un marcador colorimétrico,
un marcador fluorescente o un marcador radiactivo.
6. Método según la reivindicación 1, en el que
cada anticuerpo del conjunto de anticuerpos que se unen a un
antígeno está marcado con una perla coloreada de manera única para
formar un conjunto de anticuerpos de referencia marcados de modo
que cada anticuerpo de referencia marcado puede distinguirse de
todos los demás anticuerpos de referencia marcados en dicho
conjunto de anticuerpos de referencia marcados.
7. Método según la reivindicación 6, en el que
cada dicha perla coloreada de manera única tiene un espectro de
emisión distinto.
8. Método según la reivindicación 6, en el que
dicho anticuerpo sonda es un anticuerpo sonda marcado.
9. Método según la reivindicación 6, que
comprende además proporcionar un anticuerpo de detección marcado
para detectar dicho anticuerpo sonda.
10. Método según la reivindicación 1, que
comprende además un método para caracterizar anticuerpos basándose
en las características de unión, que comprende:
proporcionar datos de entrada a partir de un
ensayo de competición como en la reivindicación 1, representando
dichos datos de entrada los resultados de al menos un ensayo de
competición de anticuerpos usando un conjunto de anticuerpos que se
unen a un antígeno;
normalizar dichos datos de entrada para generar
una matriz de intensidad normalizada;
calcular al menos una matriz de disimilitud que
comprende generar una matriz umbral a partir de dicha matriz de
intensidad normalizada y calcular una matriz de disimilitud a partir
de dicha matriz umbral; y
agrupar anticuerpos basándose en los valores de
disimilitud en celdas de dicha matriz de disimilitud, para
determinar los patrones de unión a epítopos de dicho conjunto de
anticuerpos que se unen a un antígeno.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
11. Método según la reivindicación 10, en el que
dichos datos de entrada se generan mediante un ensayo de anticuerpos
competitivo de alto rendimiento.
12. Método según la reivindicación 11, que
comprende además seleccionar cada anticuerpo en dicho conjunto de
anticuerpos que se unen a un antígeno para su uso como un
anticuerpo sonda y para cada anticuerpo seleccionado poner en
contacto dicho anticuerpo seleccionado con dicho conjunto de
anticuerpos de referencia marcados en presencia de dicho
antígeno.
13. Método según la reivindicación 10, en el que
dichos datos de entrada comprenden valores de intensidad de señal
que representan los resultados de al menos un ensayo de competición
de anticuerpos usando un conjunto de anticuerpos que se unen a un
antígeno.
14. Método según la reivindicación 13, en el que
dichos datos de entrada que comprenden valores de intensidad de
señal que representan los resultados de al menos un ensayo de
competición de anticuerpos comprenden datos de entrada almacenados
en forma de matriz.
15. Método según la reivindicación 14, en el que
dichos datos de entrada almacenados en forma de matriz comprenden
una matriz bidimensional.
16. Método según la reivindicación 14, en el que
dichos datos almacenados en forma de matriz comprenden una matriz
multidimensional.
17. Método según la reivindicación 14, en el que
dichos datos de entrada almacenados en forma de matriz comprenden
una pluralidad de matrices.
18. Método según la reivindicación 14, en el que
dichos datos de entrada almacenados en forma de matriz comprenden
valores de intensidad de señal que representan los resultados de un
ensayo de competición de anticuerpos llevado a cabo usando un
formato de múltiples pocillos, en el que cada celda de dicha matriz
representa el resultado del ensayo llevado a cabo en un pocillo de
dicho formato de múltiples pocillos.
19. Método según la reivindicación 14, en el que
dicha normalización de dichos datos de entrada para generar una
matriz de intensidad normalizada comprende generar una matriz de
intensidad normalizada para el fondo restando una primera matriz
que comprende valores de intensidad de señal a partir de un primer
ensayo de competición de anticuerpos en el que no se añadió
antígeno, de una segunda matriz que comprende valores de intensidad
de señal a partir de un segundo ensayo de competición de anticuerpos
en el que se añadió antígeno.
20. Método según la reivindicación 19, que
comprende fijar un valor umbral mínimo para valores de tampón de
bloqueo y ajustar cualquier valor de tampón de bloqueo por debajo
de dicho valor umbral hasta dicho valor umbral antes de dicha
generación de dicha matriz de intensidad normalizada.
21. Método según la reivindicación 20, que
comprende además dividir cada valor en una columna de dicha matriz
de intensidad normalizada para el fondo entre el valor de intensidad
del tampón de bloqueo para dicha columna.
22. Método según la reivindicación 21, en el que
dicha etapa de normalización comprende además la normalización con
respecto a la señal de nivel inicial para los anticuerpos sonda, que
comprende dividir cada dicha columna de dicha matriz normalizada
para la intensidad entre su valor diagonal correspondiente para
generar una matriz final normalizada para la intensidad.
23. Método según la reivindicación 22, en el que
cada dicho valor diagonal se compara con un valor umbral definido
por el usuario y cualquier dicho valor diagonal por debajo de dicho
valor umbral definido por el usuario se ajusta hasta dicho valor
umbral antes de dicha división de cada columna entre su valor
diagonal correspondiente.
24. Método según la reivindicación 20, en el que
dicha etapa de normalización comprende además generar una matriz
normalizada para la intensidad dividiendo cada valor en una fila de
dicha matriz de intensidad normalizada para el fondo entre el valor
de intensidad del tampón de bloqueo para dicha fila.
25. Método según la reivindicación 24, en el que
dicha etapa de normalización comprende además la normalización con
respecto a la señal de nivel inicial para los anticuerpos sonda, que
comprende dividir cada dicha fila de dicha matriz normalizada para
la intensidad entre su valor diagonal correspondiente para generar
una matriz final normalizada para la intensidad.
26. Método según la reivindicación 25, en el que
dicho valor diagonal se compara con un valor umbral definido por el
usuario y cualquier dicho valor diagonal por debajo de dicho valor
umbral definido por el usuario se ajusta hasta dicho valor umbral
antes de dicha división de cada fila entre su valor diagonal
correspondiente.
27. Método según la reivindicación 19, en el que
dicha generación de dicha matriz umbral comprende fijar el valor
normalizado en cada celda de dicha matriz de intensidad normalizada
a un valor de uno (1) o cero (0), en el que los valores
normalizados inferiores o iguales a un valor umbral se fijan a un
valor de cero (0) y los valores normalizados superiores a dicho
valor umbral se fijan a un valor de uno (1).
28. Método según la reivindicación 27, en el que
dicha al menos una matriz de disimilitud se calcula proporcionando
dicha matriz umbral de unos y ceros y determinando el número de
posiciones en las que se diferencian cada par de filas.
29. Método según la reivindicación 28, en el que
se calcula una pluralidad de matrices de disimilitud usando una
pluralidad de valores umbral.
30. Método según la reivindicación 29, en el que
se calcula el promedio de dicha pluralidad de matrices de
disimilitud.
31. Método según la reivindicación 30, que
comprende proporcionar dicho promedio de dicha pluralidad de
matrices de disimilitud como entrada para dicha etapa de
agrupación.
32. Método según la reivindicación 10, en el que
dicha agrupación de anticuerpos basado en dichos valores de
disimilitud en celdas de dicha matriz de disimilitud comprende la
agrupación jerárquica.
33. Método según la reivindicación 32, en el que
dicha agrupación jerárquico comprende generar una jerarquía de
subconjuntos anidados de anticuerpos dentro de dicho conjunto de
anticuerpos que se unen a un antígeno, que comprende:
determinar el par de anticuerpos en dicho
conjunto que tiene el valor de disimilitud más bajo;
determinar el par de anticuerpos que tiene el
siguiente valor de disimilitud más bajo;
repetir de manera interactiva dicha
determinación de dicho par de anticuerpos que tiene el siguiente
valor de disimilitud más bajo hasta que quede un par de
anticuerpos, de modo que se genera una jerarquía de subconjuntos
anidados que indica la similitud de los patrones de competición
dentro de dicho conjunto de anticuerpos; y
determinar agrupaciones basadas en patrones de
competición.
34. Método según la reivindicación 33, en el que
se capturan datos a partir de dicha etapa de agrupación.
35. Método según la reivindicación 34, en el que
se capturan datos por medios automatizados.
36. Método según la reivindicación 33, en el que
dicha etapa de agrupación genera una presentación visual.
37. Método según la reivindicación 36, en el que
dicha presentación visual está en un formato compatible con un
ordenador o dispositivo de entrada de datos.
38. Método según la reivindicación 36, en el que
dicha presentación visual comprende una matriz de disimilitud.
39. Método según la reivindicación 38, en el que
se determinan las agrupaciones mediante la inspección visual del
valor de disimilitud en cada celda de dicha matriz de
disimilitud.
40. Método según la reivindicación 38, en el que
dicha matriz de disimilitud comprende celdas que tienen un indicador
visual de la agrupación a la que pertenece el par de anticuerpos
representado por dicha celda.
41. Método según la reivindicación 40, en el que
dicho indicador visual es un color.
42. Método según la reivindicación 40, en el que
dicho indicador visual es un sombreado.
43. Método según la reivindicación 40, en el que
dicho indicador visual es un dibujo.
44. Método según la reivindicación 36, en el que
dicha presentación visual es un dendrograma definido mediante
valores de disimilitud calculados para dicho conjunto de
anticuerpos.
45. Método según la reivindicación 44, en el que
dicho dendrograma comprende ramas que representan anticuerpos de
dicho conjunto de anticuerpos, en el que la disposición de las ramas
representa relaciones entre anticuerpos dentro de dicho conjunto de
anticuerpos, en el que además dicha disposición representa
agrupaciones de anticuerpos dentro de dicho conjunto de
anticuerpos.
46. Método según la reivindicación 45, en el que
además dicho dendrograma comprende ramas en las que la longitud de
dicha rama representa el grado de similitud entre el patrón de unión
de anticuerpos o agrupación de anticuerpos representados por dicha
rama.
47. Método según la reivindicación 10, que
comprende proporcionar datos de entrada que representan los
resultados de una pluralidad de ensayos de competición de
anticuerpos, en los que cada ensayo representa un experimento
individual que usa un conjunto de anticuerpos que se unen a un
antígeno, en el que además cada dicho experimento comprende al
menos un anticuerpo que también se somete a prueba en al menos otro
experimento.
\global\parskip1.000000\baselineskip
48. Método según la reivindicación 47, que
comprende generar una matriz de intensidad normalizada individual
para cada dicho experimento individual y que comprende además
generar una única matriz de intensidad normalizada calculando el
valor de intensidad promedio de cada par de anticuerpos representado
en cada matriz de intensidad normalizada individual.
49. Método según la reivindicación 48, que
comprende además generar una única matriz de disimilitud que
representa cada par de anticuerpos sometido a prueba en dicha
pluralidad de ensayos de competición de anticuerpos.
50. Método según la reivindicación 1, que
comprende además un método para caracterizar anticuerpos basado en
las características de unión, que comprende:
proporcionar datos de entrada que representan
los resultados de al menos un ensayo de competición de anticuerpos
usando un conjunto de anticuerpos que se unen a un antígeno, en el
que además dichos datos de entrada comprenden valores de intensidad
de señal que representan los resultados de al menos un ensayo de
competición de anticuerpos usando un conjunto de anticuerpos que se
unen a un antígeno;
almacenar dichos datos de entrada en formato de
matriz;
restar una primera matriz que comprende valores
de intensidad de señal a partir de un primer ensayo de competición
de anticuerpos en el que no se añadió antígeno, de una segunda
matriz que comprende valores de intensidad de señal a partir de un
segundo ensayo de competición de anticuerpos en el que se añadió
antígeno, para formar una matriz de intensidad normalizada para el
fondo;
calcular el valor de cada celda diagonal de
dicha matriz de intensidad normalizada para el fondo;
determinar celdas en cada columna de dicha
matriz de intensidad normalizada para el fondo que tienen valores
significativamente superiores al valor de cada celda diagonal de
dicha columna; y
agrupar columnas que tienen patrones de unión
similares como una combinación.
51. Método según la reivindicación 50, en el que
dichas celdas en dicha matriz de intensidad normalizada para el
fondo que tienen valores significativamente superiores a dicho valor
de cada celda diagonal correspondiente de dicha columna tienen
valores de al menos dos veces dicho valor de cada celda
diagonal.
52. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho anticuerpo sonda se selecciona de dicho conjunto de
anticuerpos que se unen a dicho antígeno.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US33724501P | 2001-12-03 | 2001-12-03 | |
US337245P | 2001-12-03 | ||
US41938702P | 2002-10-16 | 2002-10-16 | |
US419387P | 2002-10-16 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2307832T3 true ES2307832T3 (es) | 2008-12-01 |
Family
ID=26990607
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES02804495T Expired - Lifetime ES2307832T3 (es) | 2001-12-03 | 2002-12-02 | Clasificacion de anticuerpos basada en las caracteristicas de union. |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US7771951B2 (es) |
EP (1) | EP1461423B1 (es) |
JP (1) | JP2005512044A (es) |
AT (1) | ATE395413T1 (es) |
AU (1) | AU2002357060A1 (es) |
CA (1) | CA2467633C (es) |
DE (1) | DE60226641D1 (es) |
ES (1) | ES2307832T3 (es) |
WO (1) | WO2003048731A2 (es) |
Families Citing this family (236)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030207249A1 (en) * | 1999-04-15 | 2003-11-06 | Beske Oren E. | Connection of cells to substrates using association pairs |
US7253435B2 (en) * | 1999-04-15 | 2007-08-07 | Millipore Corporation | Particles with light-polarizing codes |
US20030166015A1 (en) * | 1999-04-15 | 2003-09-04 | Zarowitz Michael A. | Multiplexed analysis of cell-substrate interactions |
US20030134330A1 (en) * | 1999-04-15 | 2003-07-17 | Ilya Ravkin | Chemical-library composition and method |
US20040018485A1 (en) * | 1999-04-15 | 2004-01-29 | Ilya Ravkin | Multiplexed analysis of cells |
US20030129654A1 (en) * | 1999-04-15 | 2003-07-10 | Ilya Ravkin | Coded particles for multiplexed analysis of biological samples |
JP2004537712A (ja) * | 2000-10-18 | 2004-12-16 | バーチャル・アレイズ・インコーポレーテッド | 多重細胞分析システム |
US20030219800A1 (en) * | 2001-10-18 | 2003-11-27 | Beske Oren E. | Multiplexed cell transfection using coded carriers |
AU2002357060A1 (en) | 2001-12-03 | 2003-06-17 | Abgenix, Inc. | Antibody categorization based on binding characteristics |
AU2003224864A1 (en) * | 2002-04-04 | 2003-10-27 | Vitra Bioscience, Inc. | Connection of cells to substrates using association pairs |
US20040126773A1 (en) * | 2002-05-23 | 2004-07-01 | Beske Oren E. | Assays with coded sensor particles to sense assay conditions |
WO2004084823A2 (en) | 2003-03-19 | 2004-10-07 | Abgenix, Inc. | Antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen and uses thereof |
KR20140142311A (ko) | 2003-06-27 | 2014-12-11 | 암젠 프레몬트 인코포레이티드 | 상피 성장 인자 수용체의 결실 돌연변이체 지향 항체 및 그 용도 |
AR045563A1 (es) | 2003-09-10 | 2005-11-02 | Warner Lambert Co | Anticuerpos dirigidos a m-csf |
US20050084914A1 (en) * | 2003-09-15 | 2005-04-21 | Foulkes J. G. | Assays with primary cells |
US7488451B2 (en) * | 2003-09-15 | 2009-02-10 | Millipore Corporation | Systems for particle manipulation |
US20050136055A1 (en) * | 2003-12-22 | 2005-06-23 | Pfizer Inc | CD40 antibody formulation and methods |
WO2005092926A2 (en) | 2004-03-19 | 2005-10-06 | Amgen Inc. | Reducing the risk of human and anti-human antibodies through v gene manipulation |
CA2589374C (en) | 2004-11-30 | 2016-05-03 | Curagen Corporation | Antibodies directed to gpnmb and uses thereof |
US7807159B2 (en) | 2005-04-25 | 2010-10-05 | Amgen Fremont Inc. | Antibodies to myostatin |
EP2444419A1 (en) | 2005-04-26 | 2012-04-25 | Pfizer Inc. | P-Cadherin antibodies |
PE20080035A1 (es) | 2005-09-07 | 2008-01-30 | Amgen Fremont Inc | Anticuerpos monoclonales humanos para la quinasa-1 tipo receptor de activina |
EP2548583A3 (en) | 2005-11-10 | 2013-02-27 | Curagen Corporation | Method of treating ovarian and renal cancer using antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen |
US8014590B2 (en) * | 2005-12-07 | 2011-09-06 | Drvision Technologies Llc | Method of directed pattern enhancement for flexible recognition |
EP2006381B1 (en) | 2006-03-31 | 2016-02-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for controlling blood pharmacokinetics of antibodies |
CN101522717A (zh) | 2006-08-04 | 2009-09-02 | 阿斯利康(瑞典)有限公司 | 针对ErbB2的人抗体 |
RU2009140313A (ru) | 2007-04-02 | 2011-05-10 | Эмджен Фримонт Инк. (Us) | АНТИТЕЛА ПРОТИВ IgE |
PL2202245T3 (pl) | 2007-09-26 | 2017-02-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Sposób modyfikowania punktu izoelektrycznego przeciwciała poprzez podstawienie aminokwasu w cdr |
ES2526887T3 (es) | 2007-12-14 | 2015-01-16 | Bristol-Myers Squibb Company | Método para producir moléculas de unión al receptor OX40 humano |
ES2563483T3 (es) | 2008-04-11 | 2016-03-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Molécula de unión a antígeno capaz de unirse repetidamente a dos o más moléculas de antígeno |
US20120003235A1 (en) * | 2008-12-31 | 2012-01-05 | Biogen Idec Ma Inc. | Anti-lymphotoxin antibodies |
CN102459628A (zh) | 2009-05-13 | 2012-05-16 | 基酶有限公司 | 抗人cd52 免疫球蛋白 |
RU2750219C2 (ru) | 2010-08-02 | 2021-06-24 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Мыши, у которых вырабатываются связывающие белки, содержащие vl-домены |
WO2012019061A2 (en) | 2010-08-05 | 2012-02-09 | Stem Centrx, Inc. | Novel effectors and methods of use |
DK2606070T3 (en) | 2010-08-20 | 2017-03-27 | Novartis Ag | Antibodies for the epidermal growth factor receptor 3 (HER3) |
US20130224191A1 (en) | 2010-08-27 | 2013-08-29 | Robert A. Stull | Notum protein modulators and methods of use |
BR112013005116A2 (pt) | 2010-09-03 | 2019-09-24 | Stem Centrx Inc | moduladores e métodos de uso |
CA2809864A1 (en) | 2010-09-03 | 2012-03-08 | Stem Centrx, Inc. | Identification and enrichment of cell subpopulations |
WO2013119964A2 (en) | 2012-02-08 | 2013-08-15 | Stem Centrx, Inc. | Identification and enrichment of cell subpopulations |
EP2614082B1 (en) | 2010-09-09 | 2018-10-03 | Pfizer Inc | 4-1bb binding molecules |
MX361929B (es) | 2010-11-19 | 2018-12-19 | Eisai R&D Man Co Ltd Star | Anticuerpos anti-ligando de quimiocina cc 20 (ccl20) neutralizantes. |
US20140234340A1 (en) | 2010-11-30 | 2014-08-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly |
PE20171143A1 (es) | 2010-12-08 | 2017-08-10 | Stem Centrx Inc | Nuevos moduladores y metodos para su uso |
SA112330278B1 (ar) | 2011-02-18 | 2015-10-09 | ستيم سينتركس، انك. | مواد ضابطة جديدة وطرق للاستخدام |
US20120240072A1 (en) * | 2011-03-18 | 2012-09-20 | Serious Materials, Inc. | Intensity transform systems and methods |
WO2013010955A1 (en) | 2011-07-15 | 2013-01-24 | Morphosys Ag | Antibodies that are cross-reactive for macrophage migration inhibitory factor (mif) and d-dopachrome tautomerase (d-dt) |
HUE058350T2 (hu) | 2011-08-16 | 2022-07-28 | Morphosys Ag | Kombinációs terápia, CD19 elleni ellenanyag és nitrogénmustár alkalmazásával |
BR112013033916B1 (pt) | 2011-08-16 | 2022-11-16 | Morphosys Ag | Uso de um anticorpo específico para cd19 |
US20130058947A1 (en) | 2011-09-02 | 2013-03-07 | Stem Centrx, Inc | Novel Modulators and Methods of Use |
JP2014530836A (ja) | 2011-10-19 | 2014-11-20 | モルフォシス・アー・ゲー | 炎症障害治療用のil17cのアンタゴニスト |
RU2014114015A (ru) | 2011-11-08 | 2015-12-20 | Пфайзер Инк. | Способы лечения воспалительных расстройств с использованием антител против m-csf |
AP2014007638A0 (en) | 2011-11-16 | 2014-05-31 | Amgen Inc | Methods of treating epidermal growth factor deletion mutant VIII related disorders |
CA2857601A1 (en) | 2011-12-05 | 2013-06-13 | Novartis Ag | Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (her3) directed to domain ii of her3 |
ES2758433T3 (es) | 2011-12-05 | 2020-05-05 | Novartis Ag | Anticuerpos contra el receptor 3 del factor de crecimiento epidérmico (HER3) |
PE20190658A1 (es) | 2012-02-24 | 2019-05-08 | Abbvie Stemcentrx Llc | Moduladores y metodos de empleo novedosos |
EP3308798B1 (en) | 2012-06-11 | 2020-09-09 | Xiamen University | Polypeptides and antibodies for treating hbv infection and related diseases |
US20140004121A1 (en) | 2012-06-27 | 2014-01-02 | Amgen Inc. | Anti-mesothelin binding proteins |
JP6437913B2 (ja) | 2012-08-17 | 2018-12-12 | モルフォシス・アーゲー | 複合体特異的抗体及び抗体断片並びにその使用 |
CA2882272C (en) | 2012-08-24 | 2023-08-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Fc.gamma.riib-specific fc region variant |
WO2014030750A1 (ja) | 2012-08-24 | 2014-02-27 | 中外製薬株式会社 | マウスFcγRII特異的Fc抗体 |
WO2014048921A1 (en) | 2012-09-25 | 2014-04-03 | Morphosys Ag | Combinations and uses thereof |
EP2935324B1 (en) | 2012-12-20 | 2019-10-23 | MorphoSys AG | Anti-staphylococcal antibodies |
WO2014116706A1 (en) * | 2013-01-22 | 2014-07-31 | University Of Tennessee Research Foundation | Tissue plasminogen activator antibodies and methods of use thereof |
HUE043851T2 (hu) | 2013-02-22 | 2019-09-30 | Abbvie Stemcentrx Llc | Anti-DLL3-antitest-PBD konjugátumok és alkalmazásuk |
US9856313B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-01-02 | Xiamen University | Epitope of RSV fusion protein and antibody recognizing the same |
AR095199A1 (es) | 2013-03-15 | 2015-09-30 | Genzyme Corp | Anticuerpos anti-cd52 |
EP2982689B1 (en) | 2013-04-02 | 2020-08-26 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Fc region variant |
US9650434B2 (en) | 2013-04-02 | 2017-05-16 | Xiamen University | Broad-spectrum monoclonal antibody recognizing HA1 domain of hemagglutinin of influenza virus |
JP2016516092A (ja) | 2013-04-12 | 2016-06-02 | モルフォシス・アー・ゲー | M−csfを標的とする抗体 |
WO2014170317A1 (en) | 2013-04-17 | 2014-10-23 | Morphosys Ag | Antibodies targeting specifically human cxcr2 |
BR112016002008B1 (pt) | 2013-08-02 | 2021-06-22 | Pfizer Inc. | Anticorpos anti-cxcr4, seu uso, conjugado anticorpo-fármaco e composição farmacêutica |
EP3038634A4 (en) | 2013-08-28 | 2017-10-11 | AbbVie Stemcentrx LLC | Novel sez6 modulators and methods of use |
SG11201601424PA (en) | 2013-08-28 | 2016-03-30 | Stemcentrx Inc | Site-specific antibody conjugation methods and compositions |
US10825548B2 (en) * | 2013-12-02 | 2020-11-03 | Carterra, Inc. | Systems and methods of sensing and analyzing antibody blocking interactions |
MX2016009047A (es) | 2014-01-10 | 2017-04-13 | Anaptysbio Inc | Anticuerpos dirigidos contra interleucina-33 (il-33). |
JP2017514143A (ja) | 2014-02-21 | 2017-06-01 | アッヴィ・ステムセントルクス・エル・エル・シー | メラノーマに使用するための抗dll3抗体および薬物コンジュゲート |
US9817855B2 (en) * | 2014-03-17 | 2017-11-14 | SynerScope B.V. | Method and system for determining a measure of overlap between data entries |
WO2015143414A2 (en) | 2014-03-21 | 2015-09-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals that make single domain binding proteins |
ES2762640T3 (es) | 2014-03-21 | 2020-05-25 | Regeneron Pharma | Proteínas VL de unión a antígeno que exhiben diferentes características de unión |
EP3129055B1 (en) | 2014-04-11 | 2020-07-01 | MedImmune, LLC | Bispecific her2 antibodies |
BR112016025291A2 (pt) | 2014-04-30 | 2017-12-26 | Abbvie Stemcentrx Llc | conjugados de anticorpo anti-ptk7-fármaco |
SG11201700841QA (en) | 2014-12-19 | 2017-03-30 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use |
UY36449A (es) | 2014-12-19 | 2016-07-29 | Novartis Ag | Composiciones y métodos para anticuerpos dirigidos a bmp6 |
MA41463A (fr) | 2015-02-03 | 2017-12-12 | Anaptysbio Inc | Anticorps dirigés contre le gène d'activation 3 des lymphocytes (lag-3) |
CN107108729A (zh) | 2015-02-05 | 2017-08-29 | 中外制药株式会社 | 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体,fc区变体,il‑8‑结合抗体,及其应用 |
CN107438622A (zh) | 2015-03-19 | 2017-12-05 | 瑞泽恩制药公司 | 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物 |
MA41867A (fr) | 2015-04-01 | 2018-02-06 | Anaptysbio Inc | Anticorps dirigés contre l'immunoglobuline de cellule t et protéine 3 de mucine (tim-3) |
RU2754041C2 (ru) | 2015-04-03 | 2021-08-25 | Еурека Терапьютикс, Инк. | Конструкции, направленные на комплексы пептида afp/мнс, и виды их использования |
ES2914243T3 (es) | 2015-04-15 | 2022-06-08 | Anaptysbio Inc | Anticuerpos dirigidos contra el receptor de la interleuquina 36 (IL-36R) |
EP3302550B1 (en) | 2015-05-26 | 2019-08-28 | MorphoSys AG | Combination of an anti-cd19 antibody and a bruton's tyrosine kinase inhibitor and uses thereof |
SG11201707815RA (en) | 2015-06-05 | 2017-12-28 | Novartis Ag | Antibodies targeting bone morphogenetic protein 9 (bmp9) and methods therefor |
IL302353A (en) | 2015-08-19 | 2023-06-01 | Pfizer | TFPI inhibitory antibodies and their uses |
KR20240052084A (ko) | 2015-08-21 | 2024-04-22 | 모르포시스 아게 | 조합 및 이의 용도 |
HUE053914T2 (hu) | 2015-09-09 | 2021-07-28 | Novartis Ag | Csecsemõmirigy-stróma eredetû limfopoietinhez (TSLP-hez) kötõdõ ellenanyagok és az ellenanyagok alkalmazására szolgáló eljárások |
WO2017042701A1 (en) | 2015-09-09 | 2017-03-16 | Novartis Ag | Thymic stromal lymphopoietin (tslp)-binding antibodies and methods of using the antibodies |
TW202342532A (zh) * | 2015-09-18 | 2023-11-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | Il-8結合抗體及其用途 |
RU2018114657A (ru) | 2015-10-05 | 2019-11-07 | МорфоСис АГ | Антагонисты IL-17C для лечения и/или предупреждения атопического дерматита |
AU2016342041B2 (en) | 2015-10-23 | 2021-12-02 | Eureka Therapeutics, Inc. | Antibody/T-cell receptor chimeric constructs and uses thereof |
MA44334A (fr) | 2015-10-29 | 2018-09-05 | Novartis Ag | Conjugués d'anticorps comprenant un agoniste du récepteur de type toll |
EP3389711A1 (en) | 2015-12-18 | 2018-10-24 | Novartis AG | Antibodies targeting cd32b and methods of use thereof |
JP7141336B2 (ja) | 2015-12-25 | 2022-09-22 | 中外製薬株式会社 | 抗ミオスタチン抗体および使用方法 |
TW201734041A (zh) | 2016-02-19 | 2017-10-01 | 莫菲西斯公司 | 抗il-17c抗體 |
WO2017187307A1 (en) | 2016-04-27 | 2017-11-02 | Pfizer Inc. | Anti-il-33 antibodies, compositions, methods and uses thereof |
MY194084A (en) | 2016-04-29 | 2022-11-11 | Pfizer | Interferon beta antibodies and uses thereof |
KR102492057B1 (ko) | 2016-06-15 | 2023-01-26 | 노파르티스 아게 | 골 형태형성 단백질 6(bmp6)의 억제제를 사용한 질병의 치료 방법 |
SG11201810429UA (en) | 2016-06-27 | 2018-12-28 | Morphosys Ag | Anti-cd19 antibody formulations |
CA3026050A1 (en) | 2016-08-05 | 2018-02-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Composition for prophylaxis or treatment of il-8 related diseases |
SG10201607778XA (en) | 2016-09-16 | 2018-04-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use |
JP2019535306A (ja) | 2016-10-25 | 2019-12-12 | インセルム(インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラリシェルシェ メディカル) | Cd160膜貫通型アイソフォームと結合するモノクローナル抗体 |
RU2756405C2 (ru) | 2016-10-28 | 2021-09-30 | МорфоСис АГ | Комбинация антитела CD19 с ингибитором BCL-2 и пути ее применения |
US20190284280A1 (en) | 2016-11-01 | 2019-09-19 | Anaptysbio, Inc. | Antibodies directed against t cell immunoglobulin and mucin protein 3 (tim-3) |
JOP20190155A1 (ar) | 2016-12-21 | 2019-06-23 | Novartis Ag | مترافقات عقار جسم مضاد لإزالة خلايا جذعية مكونة للدم |
US11926665B2 (en) | 2017-01-09 | 2024-03-12 | Tesaro, Inc. | Methods of treating cancer with anti-TIM-3 antibodies |
US11274157B2 (en) | 2017-01-12 | 2022-03-15 | Eureka Therapeutics, Inc. | Constructs targeting histone H3 peptide/MHC complexes and uses thereof |
SG11201909541WA (en) | 2017-04-26 | 2019-11-28 | Eureka Therapeutics Inc | Chimeric antibody/t-cell receptor constructs and uses thereof |
AR111651A1 (es) | 2017-04-28 | 2019-08-07 | Novartis Ag | Conjugados de anticuerpos que comprenden agonistas del receptor de tipo toll y terapias de combinación |
WO2018217630A1 (en) * | 2017-05-21 | 2018-11-29 | University Of Tennessee Research Foundation | Methods and compositions for targeting tissue lesions |
AU2018279705A1 (en) | 2017-06-09 | 2019-11-14 | Boston Medical Center Corporation | Anti-ROBO2 antibodies, compositions, methods and uses thereof |
WO2018229715A1 (en) | 2017-06-16 | 2018-12-20 | Novartis Ag | Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof |
WO2019018647A1 (en) | 2017-07-20 | 2019-01-24 | Pfizer Inc. | ANTI-GD3 ANTIBODIES AND CONJUGATES ANTIBODY-MEDICATION |
DK3661954T3 (da) | 2017-08-03 | 2022-04-19 | Amgen Inc | Interleukin-21-muteiner og fremgangsmåder til behandling |
CN111511762A (zh) | 2017-08-21 | 2020-08-07 | 天演药业公司 | 抗cd137分子及其用途 |
WO2019046600A1 (en) | 2017-08-30 | 2019-03-07 | Amgen Inc. | INSULIN-RELATED GROWTH FACTOR 1 RECEPTOR BINDING PROTEINS (IGF-1R) AND METHODS OF USE |
EP3679040B1 (en) | 2017-09-08 | 2022-08-03 | Amgen Inc. | Inhibitors of kras g12c and methods of using the same |
BR112020005196A2 (pt) | 2017-09-18 | 2020-09-15 | The Regents Of The University Of California | anticorpos claudin6 e métodos para tratar câncer |
EP3470429A1 (en) | 2017-10-10 | 2019-04-17 | Numab Innovation AG | Antibodies targeting pdl1 and methods of use thereof |
CA3075969A1 (en) | 2017-10-10 | 2019-04-18 | Numab Therapeutics AG | Multispecific antibody |
EP3470428A1 (en) | 2017-10-10 | 2019-04-17 | Numab Innovation AG | Antibodies targeting cd137 and methods of use thereof |
EP3470426A1 (en) | 2017-10-10 | 2019-04-17 | Numab Therapeutics AG | Multispecific antibody |
WO2019081983A1 (en) | 2017-10-25 | 2019-05-02 | Novartis Ag | CD32B TARGETING ANTIBODIES AND METHODS OF USE |
AU2018375331A1 (en) | 2017-12-01 | 2020-05-14 | Pfizer Inc. | Anti-CXCR5 antibodies and compositions and uses thereof |
KR20200110358A (ko) | 2018-01-12 | 2020-09-23 | 암젠 인크 | 항-pd-1 항체 및 치료 방법 |
WO2019148445A1 (en) | 2018-02-02 | 2019-08-08 | Adagene Inc. | Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same |
WO2019148444A1 (en) | 2018-02-02 | 2019-08-08 | Adagene Inc. | Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same |
CA3093729A1 (en) | 2018-03-15 | 2019-09-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-dengue virus antibodies having cross-reactivity to zika virus and methods of use |
EP3767629A4 (en) * | 2018-03-16 | 2022-01-19 | KOTAI Biotechnologies, Inc. | EFFICIENT GROUPING OF IMMUNOLOGICAL ENTITIES |
JP6500144B1 (ja) * | 2018-03-28 | 2019-04-10 | Kotaiバイオテクノロジーズ株式会社 | 免疫実体の効率的クラスタリング |
WO2019217913A1 (en) | 2018-05-10 | 2019-11-14 | Sensei Biotherapeutics, Inc. | Aspartate beta-hydroxylase chimeric antigen receptors and uses thereof |
JP7411575B2 (ja) | 2018-05-11 | 2024-01-11 | ウーシー・バイオロジクス・(シャンハイ)・カンパニー・リミテッド | Ox40に対する完全ヒト抗体、それを調製する方法、およびその使用 |
KR20210013090A (ko) | 2018-05-16 | 2021-02-03 | 모르포시스 아게 | 당단백질 vi를 표적으로 하는 항체 |
JP2021525806A (ja) | 2018-06-01 | 2021-09-27 | タユー ファシャ バイオテック メディカル グループ カンパニー, リミテッド | 疾患または状態を処置するための組成物およびそれらの使用 |
WO2019245991A1 (en) | 2018-06-18 | 2019-12-26 | Eureka Therapeutics, Inc. | Constructs targeting prostate-specific membrane antigen (psma) and uses thereof |
TW202014209A (zh) | 2018-06-20 | 2020-04-16 | 瑞士商諾華公司 | 用於消融造血幹細胞之抗體藥物軛合物 |
WO2020001526A1 (zh) | 2018-06-29 | 2020-01-02 | 苏州智核生物医药科技有限公司 | Pd-l1结合多肽及其用途 |
US11530274B2 (en) | 2018-07-02 | 2022-12-20 | Amgen Inc. | Anti-STEAP1 antigen-binding protein |
MA53381A (fr) | 2018-07-24 | 2021-06-02 | Amgen Inc | Association d'inhibiteurs de la voie lilrb1/2 et d'inhibiteurs de la voie pd-1 |
CN112912395A (zh) | 2018-08-20 | 2021-06-04 | 辉瑞公司 | 抗gdf15抗体、组合物和使用方法 |
CN112823167A (zh) | 2018-09-07 | 2021-05-18 | 辉瑞大药厂 | 抗-αvβ8抗体和组合物及其用途 |
US20220048995A1 (en) | 2018-09-10 | 2022-02-17 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Use of an inhibitor of ntsr1 activation or expression for preventing weight loss, muscle loss, and protein blood level decrease in subjects in need thereof |
EP3861022A1 (en) | 2018-10-04 | 2021-08-11 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods and pharmaceutical composition for the treatment of mucosal inflammatory diseases |
AU2019359540B2 (en) | 2018-10-11 | 2024-07-11 | Pfizer Inc. | Dosage regimen for TFPI antagonists |
CA3116188A1 (en) | 2018-10-12 | 2020-04-16 | Xencor, Inc. | Pd-1 targeted il-15/il-15ralpha fc fusion proteins and uses in combination therapies thereof |
UY38407A (es) | 2018-10-15 | 2020-05-29 | Novartis Ag | Anticuerpos estabilizadores de trem2 |
US20230053449A1 (en) | 2018-10-31 | 2023-02-23 | Novartis Ag | Dc-sign antibody drug conjugates |
JP2022513708A (ja) | 2018-12-05 | 2022-02-09 | モルフォシス・アーゲー | 多重特異性抗原結合分子 |
BR112021013157A8 (pt) | 2019-01-03 | 2022-12-06 | Inst Nat Sante Rech Med | Usos de um inibidor de nrp-1, uso de uma combinação, uso de um anticorpo multiespecífico, método ex vivo para predizer, uso de um inibidor, anticorpo multiespecífico, população de células modificadas, método ex vivo de produção e uso de uma população de células t |
US20220162304A1 (en) | 2019-01-28 | 2022-05-26 | Tuojie Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Anti-cd79b antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof |
US11541086B2 (en) | 2019-03-14 | 2023-01-03 | Northwestern Univeristy | Compositions and methods for treating Alzheimer's disease |
WO2020191342A1 (en) | 2019-03-20 | 2020-09-24 | The Regents Of The University Of California | Claudin-6 antibodies and drug conjugates |
WO2020191344A1 (en) | 2019-03-20 | 2020-09-24 | The Regents Of The University Of California | Claudin-6 bispecific antibodies |
AU2020266083A1 (en) | 2019-04-30 | 2021-09-23 | Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes | Rank pathway inhibitors in combination with CDK inhibitors |
EP3978532A4 (en) | 2019-05-24 | 2023-10-18 | Sanyou Biopharmaceuticals Co., Ltd. | NEW BINDING MOLECULE CLDN18.2 |
WO2020254619A1 (en) | 2019-06-20 | 2020-12-24 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Anti- protease nexin-1 conformational single domain antibodies and uses thereof |
US20220305081A1 (en) | 2019-06-24 | 2022-09-29 | Amgen Inc. | Inhibitions of sirp-gamma for cancer treatment |
JP7315259B2 (ja) | 2019-07-01 | 2023-07-26 | スジョウ・アルファマブ・カンパニー・リミテッド | 百日咳毒素結合タンパク質 |
US20230002497A1 (en) | 2019-09-04 | 2023-01-05 | Inserm (Institut National De La Santè Et De La Recherch Médicale | Antibodies specific for il20-rb and uses thereof for the treatment of acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease |
EP4028053A1 (en) | 2019-09-11 | 2022-07-20 | Bausch Health Ireland Limited | Methods of treating nonalcoholic fatty liver disease (nafld) using il-17ra antibody |
TW202124446A (zh) | 2019-09-18 | 2021-07-01 | 瑞士商諾華公司 | 與entpd2抗體之組合療法 |
JP2022548881A (ja) | 2019-09-18 | 2022-11-22 | ノバルティス アーゲー | Entpd2抗体、組合せ療法並びに抗体及び組合せ療法を使用する方法 |
WO2021058729A1 (en) | 2019-09-27 | 2021-04-01 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Anti-müllerian inhibiting substance type i receptor antibodies and uses thereof |
EP3800201A1 (en) | 2019-10-01 | 2021-04-07 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Cd28h stimulation enhances nk cell killing activities |
TW202128757A (zh) | 2019-10-11 | 2021-08-01 | 美商建南德克公司 | 具有改善之特性的 PD-1 標靶 IL-15/IL-15Rα FC 融合蛋白 |
CN113045655A (zh) | 2019-12-27 | 2021-06-29 | 高诚生物医药(香港)有限公司 | 抗ox40抗体及其用途 |
CN115190814A (zh) | 2020-01-24 | 2022-10-14 | 辉瑞公司 | 抗e-选择素抗体、组合物和使用方法 |
EP4108683A4 (en) | 2020-02-21 | 2024-04-03 | Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. | ANTI-IL-2 ANTIBODIES AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT THEREOF AND MEDICAL USE THEREOF |
KR20220148209A (ko) | 2020-02-28 | 2022-11-04 | 상하이 헨리우스 바이오테크, 인크. | 항cd137 작제물 및 그 용도 |
AU2021228078A1 (en) | 2020-02-28 | 2022-09-22 | Shanghai Henlius Biotech, Inc. | Anti-CD137 constructs, multispecific antibody and uses thereof |
CN115003333A (zh) | 2020-03-13 | 2022-09-02 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | Pvrig结合蛋白及其医药用途 |
US20230174670A1 (en) | 2020-05-14 | 2023-06-08 | Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. | Anti-cd25 antibodies, antigen-binding fragments thereof, and medical uses thereof |
US20230220057A1 (en) | 2020-05-27 | 2023-07-13 | Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. | Antibodies specifically recognizing nerve growth factor and uses thereof |
CN116529260A (zh) | 2020-06-02 | 2023-08-01 | 当康生物技术有限责任公司 | 抗cd93构建体及其用途 |
EP4157462A1 (en) | 2020-06-02 | 2023-04-05 | Dynamicure Biotechnology LLC | Anti-cd93 constructs and uses thereof |
JP2023532726A (ja) | 2020-06-29 | 2023-07-31 | インサーム(インスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル) | 抗プロテインsシングルドメイン抗体及びそれを含むポリペプチド |
BR112022026533A2 (pt) | 2020-07-02 | 2023-01-17 | Beijing Tuo Jie Biopharmaceutical Co Ltd | Anticorpo anti-fxi/fxia, fragmento de ligação do mesmo, e antígenos e uso farmacêutico do mesmo |
AU2021302199A1 (en) | 2020-07-03 | 2023-02-23 | Suzhou Alphamab Co., Ltd. | Coagulation factor XI (FXI) binding protein |
TW202216778A (zh) | 2020-07-15 | 2022-05-01 | 美商安進公司 | Tigit及cd112r阻斷 |
CN116723857A (zh) | 2020-07-21 | 2023-09-08 | 苏州智核生物医药科技有限公司 | Cd8结合多肽及其用途 |
TW202221029A (zh) | 2020-07-29 | 2022-06-01 | 美商當康生物科技有限公司 | 抗cd93之構築體及其用途 |
WO2022026829A1 (en) | 2020-07-30 | 2022-02-03 | Anaptysbio, Inc. | Anti-interleukin 36 receptor (il-36r) therapy for skin toxicity |
AU2021319103A1 (en) | 2020-07-30 | 2023-02-09 | Anaptysbio, Inc. | Anti-interleukin 36 receptor (IL-36r) therapy for ichthyosis |
JP2023536737A (ja) | 2020-08-04 | 2023-08-29 | アボット・ラピッド・ダイアグノスティクス・インターナショナル・アンリミテッド・カンパニー | Sars-cov-2を検出するためのアッセイ |
JP7392200B2 (ja) | 2020-08-21 | 2023-12-05 | シャンハイ、ケンパーソー、バイオテクノロジー、カンパニー、リミテッド | グリコシル化ceacam5に特異的に結合した抗体 |
AR123728A1 (es) | 2020-10-09 | 2023-01-04 | Pfizer | Anticuerpos cd1a y su uso |
AU2021365611A1 (en) | 2020-10-23 | 2023-06-08 | Anaptysbio, Inc. | B and t lymphocyte attenuator (btla) modulators and method of using same |
US20240034776A1 (en) | 2020-10-30 | 2024-02-01 | Fudan University | Use of regulator of itpripl1 in preparation of drug that regulates immune responses or fights tumors |
EP4251648A2 (en) | 2020-11-24 | 2023-10-04 | Novartis AG | Anti-cd48 antibodies, antibody drug conjugates, and uses thereof |
CN112480248B (zh) | 2020-11-24 | 2023-05-05 | 三优生物医药(上海)有限公司 | 与cld18a2特异性结合的分子 |
WO2022150644A1 (en) | 2021-01-08 | 2022-07-14 | Anaptysbio, Inc. | Anti-interleukin 36 receptor (il-36r) therapy for acne |
WO2022150642A1 (en) | 2021-01-08 | 2022-07-14 | Anaptysbio, Inc. | Anti-interleukin 36 receptor (il-36r) therapy for hidradenitis suppurativa |
WO2022162569A1 (en) | 2021-01-29 | 2022-08-04 | Novartis Ag | Dosage regimes for anti-cd73 and anti-entpd2 antibodies and uses thereof |
KR20230142768A (ko) | 2021-02-08 | 2023-10-11 | 바이오트로이 테라퓨틱스 | Ccdc112를 기반으로 하는 종양세포 성장을 억제하는 방법 및 적용 |
US20240141048A1 (en) | 2021-03-05 | 2024-05-02 | Dynamicure Biotechnology Llc | Anti-vista constructs and uses thereof |
AU2022240549A1 (en) | 2021-03-16 | 2023-10-05 | Shanghai Biotroy Biotechnique Co., Ltd | Semenogelin neutralizing antibody and epitope and application thereof |
BR112023018676A2 (pt) | 2021-03-18 | 2023-10-10 | Seagen Inc | Conjugado anticorpo-fármaco, composição farmacêutica, métodos de tratamento de uma doença ou condição e de um câncer, e, composição de conjugado ligante-fármaco |
US20240150466A1 (en) | 2021-03-25 | 2024-05-09 | Dynamicure Biotechnology Llc | Anti-igfbp7 constructs and uses thereof |
US20240156865A1 (en) | 2021-04-05 | 2024-05-16 | Bionoxx Inc. | Viral vector-derived target protein for anticancer therapy and binding molecule or fragment thereof specifically binding thereto |
AU2021439961A1 (en) | 2021-04-05 | 2023-11-16 | Bionoxx Inc. | Chimeric antigen receptor targeting oncolytic virus-derived protein, immunocyte expressing same, and uses of both |
EP4331603A1 (en) | 2021-04-25 | 2024-03-06 | Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. | Anti-masp2 antibody, antigen-binding fragment thereof and medical use thereof |
EP4337257A1 (en) | 2021-05-12 | 2024-03-20 | AnaptysBio, Inc. | Antibody composition |
US20230115257A1 (en) | 2021-05-17 | 2023-04-13 | Curia Ip Holdings, Llc | Sars-cov-2 spike protein antibodies |
US20240239875A1 (en) | 2021-05-17 | 2024-07-18 | Curia Ip Holdings, Llc | Sars-cov-2 spike protein antibodies |
WO2022243536A1 (en) | 2021-05-21 | 2022-11-24 | Leo Pharma A/S | Anti il-1 receptor accessory protein antibodies |
WO2022253756A1 (en) | 2021-06-01 | 2022-12-08 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Use of b cell depleting agents for the treatment of rheumatic heart disease |
WO2022256740A1 (en) | 2021-06-04 | 2022-12-08 | Curia Ip Holdings, Llc | Polymeric fusion proteins and compositions for inducing an immune response against infection |
EP4355785A1 (en) | 2021-06-17 | 2024-04-24 | Amberstone Biosciences, Inc. | Anti-cd3 constructs and uses thereof |
AU2022301422A1 (en) | 2021-06-28 | 2024-02-01 | Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. | Anti-cd40 antibody, antigen-binding fragment and medical use thereof |
EP4367139A1 (en) | 2021-07-08 | 2024-05-15 | Staidson Biopharma Inc. | Antibodies specifically recognizing tnfr2 and uses thereof |
KR20240058075A (ko) | 2021-07-14 | 2024-05-03 | 스테이드슨 (베이징) 바이오팔마슈티칼스 캄퍼니 리미티드 | Cd40을 특이적으로 식별하는 항체 및 이의 응용 |
AU2022332499A1 (en) | 2021-08-24 | 2024-03-21 | Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. | Fap/cd40 binding molecule and medicinal use thereof |
CN117858903A (zh) | 2021-09-15 | 2024-04-09 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 一种含抗pvrig/tigit双特异性抗体的药物组合物 |
WO2023079430A1 (en) | 2021-11-02 | 2023-05-11 | Pfizer Inc. | Methods of treating mitochondrial myopathies using anti-gdf15 antibodies |
WO2023098637A1 (zh) | 2021-11-30 | 2023-06-08 | 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 | 预防和/或治疗血栓栓塞性疾病的方法 |
CN116829179A (zh) | 2021-12-06 | 2023-09-29 | 北京三诺佳邑生物技术有限责任公司 | 特异性结合肺炎克雷伯菌o2抗原和o1抗原的双特异性抗体以及组合物 |
WO2023137161A1 (en) | 2022-01-14 | 2023-07-20 | Amgen Inc. | Triple blockade of tigit, cd112r, and pd-l1 |
WO2023161412A1 (en) | 2022-02-25 | 2023-08-31 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antibodies for preventing the cleavage of cd95l by metalloproteases |
WO2023193239A1 (en) | 2022-04-08 | 2023-10-12 | Peter Peizhi Luo | Anti-cd28 antibodies and methods of use thereof |
WO2023212611A1 (en) | 2022-04-27 | 2023-11-02 | Anaptysbio, Inc. | B and t lymphocyte attenuator (btla) modulators and method of using same |
WO2023212298A1 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Broadwing Bio Llc | Bispecific antibodies and methods of treating ocular disease |
WO2023212294A1 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Broadwing Bio Llc | Angiopoietin-related protein 7-specific antibodies and uses thereof |
WO2023212293A1 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Broadwing Bio Llc | Complement factor h related 4-specific antibodies and uses thereof |
WO2024013724A1 (en) | 2022-07-15 | 2024-01-18 | Pheon Therapeutics Ltd | Antibody-drug conjugates |
WO2024038112A1 (en) | 2022-08-17 | 2024-02-22 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Improved anti-albumin nanobodies and their uses |
WO2024044622A1 (en) | 2022-08-24 | 2024-02-29 | Amgen Inc. | Anti-drug antibody assays |
WO2024050457A1 (en) | 2022-08-31 | 2024-03-07 | Boost Biopharma, Inc. | Sars-cov-2 binding agents and uses thereof |
WO2024054929A1 (en) | 2022-09-07 | 2024-03-14 | Dynamicure Biotechnology Llc | Anti-vista constructs and uses thereof |
US20240226313A1 (en) | 2022-11-17 | 2024-07-11 | Sanofi | Ceacam5 antibody-drug conjugates and methods of use thereof |
Family Cites Families (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5800815A (en) * | 1903-05-05 | 1998-09-01 | Cytel Corporation | Antibodies to P-selectin and their uses |
US5426029A (en) * | 1986-03-31 | 1995-06-20 | T Cell Diagnostics, Inc. | Therapeutic and diagnostic methods using leukocyte surface antigens |
US5300425A (en) * | 1987-10-13 | 1994-04-05 | Terrapin Technologies, Inc. | Method to produce immunodiagnostic reagents |
US6165469A (en) * | 1988-01-13 | 2000-12-26 | University Of Virginia | Recombinant Entamoeba histolytica lectin subunit peptides and reagents specific for members of the 170 kD subunit multigene family |
NO164622C (no) * | 1988-05-11 | 1990-10-24 | Tore Lindmo | Binaer immunometrisk partikkelbasert metode for maaling av spesifikke serum-antigener ved hjelp av vaeskestroemsmikrofotometri og et ferdigpreparert maaloppsett derav. |
US5434076A (en) * | 1989-12-18 | 1995-07-18 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Tumor-specific, cell surface-binding monoclonal antibodies |
GB8928874D0 (en) * | 1989-12-21 | 1990-02-28 | Celltech Ltd | Humanised antibodies |
EP0656367A1 (en) * | 1991-08-22 | 1995-06-07 | Becton, Dickinson and Company | Method and composition for cancer therapy and for prognosticating responses to cancer theraphy |
ATE221913T1 (de) | 1991-08-23 | 2002-08-15 | Univ Nebraska | Verfahren und zusammensetzungen für zelluläre reprogrammierung |
US5402285A (en) | 1991-09-30 | 1995-03-28 | Conner Peripherals, Inc. | Five and one-quarter inch form factor combination DAT tape drive and cassette magazine loader |
US5324633A (en) * | 1991-11-22 | 1994-06-28 | Affymax Technologies N.V. | Method and apparatus for measuring binding affinity |
US5958708A (en) * | 1992-09-25 | 1999-09-28 | Novartis Corporation | Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype |
US5501917A (en) * | 1994-01-28 | 1996-03-26 | Hong; Kuochih | Hydrogen storage material and nickel hydride batteries using same |
FR2717081B1 (fr) * | 1994-03-14 | 1996-06-21 | Centre Nat Rech Scient | Rétropeptides, anticorps dirigés contre ces derniers, et leurs utilisations pour la vaccination et le diagnostic in vitro. |
US5656499A (en) * | 1994-08-01 | 1997-08-12 | Abbott Laboratories | Method for performing automated hematology and cytometry analysis |
US5874409A (en) * | 1995-06-07 | 1999-02-23 | La Jolla Pharmaceutical Company | APL immunoreactive peptides, conjugates thereof and methods of treatment for APL antibody-mediated pathologies |
US5834597A (en) * | 1996-05-20 | 1998-11-10 | Protein Design Labs, Inc. | Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same |
US6449562B1 (en) * | 1996-10-10 | 2002-09-10 | Luminex Corporation | Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and method |
US20030118985A1 (en) * | 1997-05-14 | 2003-06-26 | Hunt Jeffrey C. | Mouse monoclonal antibody (5-21-3) to human immunodeficiency virus gp41 protein |
US6642062B2 (en) * | 1998-09-03 | 2003-11-04 | Trellis Bioinformatics, Inc. | Multihued labels |
US6687395B1 (en) * | 1999-07-21 | 2004-02-03 | Surromed, Inc. | System for microvolume laser scanning cytometry |
AU2002219789A1 (en) * | 2000-10-20 | 2002-05-15 | Children's Medical Center Corporation | Methods for analyzing dynamic changes in cellular informatics |
US7135296B2 (en) * | 2000-12-28 | 2006-11-14 | Mds Inc. | Elemental analysis of tagged biologically active materials |
JP4864240B2 (ja) * | 2001-07-12 | 2012-02-01 | 富士フイルム株式会社 | レトロフォーカス型撮影レンズ |
AU2002357060A1 (en) | 2001-12-03 | 2003-06-17 | Abgenix, Inc. | Antibody categorization based on binding characteristics |
JP2005512043A (ja) | 2001-12-03 | 2005-04-28 | アブジェニックス・インコーポレーテッド | 治療剤産物の発見 |
-
2002
- 2002-12-02 AU AU2002357060A patent/AU2002357060A1/en not_active Abandoned
- 2002-12-02 DE DE60226641T patent/DE60226641D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-02 AT AT02804495T patent/ATE395413T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-12-02 EP EP02804495A patent/EP1461423B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-02 CA CA2467633A patent/CA2467633C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-02 ES ES02804495T patent/ES2307832T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-02 JP JP2003549877A patent/JP2005512044A/ja not_active Withdrawn
- 2002-12-02 WO PCT/US2002/038531 patent/WO2003048731A2/en active Application Filing
- 2002-12-02 US US10/309,419 patent/US7771951B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-06-24 US US12/823,104 patent/US8206936B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-05-24 US US13/480,356 patent/US8568992B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-10-01 US US14/043,399 patent/US20140178905A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20110021373A1 (en) | 2011-01-27 |
US7771951B2 (en) | 2010-08-10 |
CA2467633A1 (en) | 2003-06-12 |
WO2003048731A3 (en) | 2004-01-15 |
EP1461423B1 (en) | 2008-05-14 |
DE60226641D1 (de) | 2008-06-26 |
WO2003048731A2 (en) | 2003-06-12 |
US8206936B2 (en) | 2012-06-26 |
US20130085074A1 (en) | 2013-04-04 |
ATE395413T1 (de) | 2008-05-15 |
EP1461423A2 (en) | 2004-09-29 |
US20030157730A1 (en) | 2003-08-21 |
EP1461423A4 (en) | 2006-03-22 |
AU2002357060A1 (en) | 2003-06-17 |
JP2005512044A (ja) | 2005-04-28 |
CA2467633C (en) | 2012-03-27 |
US8568992B2 (en) | 2013-10-29 |
US20140178905A1 (en) | 2014-06-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2307832T3 (es) | Clasificacion de anticuerpos basada en las caracteristicas de union. | |
AU2019204047C1 (en) | Immunosignaturing: a path to early diagnosis and health monitoring | |
US11067582B2 (en) | Peptide array quality control | |
Motulsky | Prism 5 statistics guide, 2007 | |
JP2024059673A (ja) | タンパク質同定のための方法およびシステム | |
White et al. | Bioinformatics strategies for proteomic profiling | |
Mallios | Predicting class II MHC/peptide multi-level binding with an iterative stepwise discriminant analysis meta-algorithm | |
CN110326051B (zh) | 用于识别生物样本中的表达区别要素的方法和分析*** | |
WO2006091734A9 (en) | Compositions and methods for classifying biological samples | |
CN101896605A (zh) | 适体在蛋白质组学中的用途 | |
CN109313184A (zh) | 用于治疗性抗体表征的基于阵列的肽文库 | |
US20240094209A1 (en) | Markers, methods and systems for identifying cell populations, diagnosing, monitoring, predicting and treating conditions | |
Senger et al. | Disease-associated multimolecular signature in the urine of patients with Lyme disease detected using Raman spectroscopy and chemometrics | |
US20060073611A1 (en) | Immunoassay | |
US20030175760A1 (en) | Discovery of therapeutic products | |
Ernst et al. | A single-molecule method for measuring fluorophore labeling yields for the study of membrane protein oligomerization in membranes | |
Malin et al. | Adaptive learning of immunosignaturing peptide array features for biothreat detection and classification | |
CN106053825A (zh) | 标定试剂和方法 | |
Carbone et al. | Harmonization of ANA testing challenge: quantification strategy to accurately predict end-point titers avoiding serial dilution | |
van Regenmortel | The contribution of optical biosensors to the analysis of structure-function relationships in proteins | |
Brus | A comparison of normalisatin methods for peptide microarrays | |
Plancoulaine et al. | Comprehensive Immunohistochemistry: Digital, Analytical and Integrated. |