KR20210013090A - 당단백질 vi를 표적으로 하는 항체 - Google Patents
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Abstract
현 공개는 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 특히, 이는 조합된 유리한 성질을 갖는 항체 또는 항체 단편에 관련되며 및 그러므로 GPVI 관련된 장애 또는 컨디션, 예를 들어 혈전성 또는 맥관성 장애를, 치료 또는 예방하는데 유용하다.
Description
현 출원은 당단백질 VI (Glycoprotein VI)(GPVI) 에 결합하는 항체 또는 항체 단편 (Fabs와 같은)과 관련된 것이다. 현 공개는 또한 상기 항체 또는 항체 단편을 발현할 수 있는 핵산, 벡터 및 숙주, 상기 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 상기 항체 또는 항체 단편을 특정한 질환을 치료하는데 사용하는 용도에 관련된다.
혈소판 활성화는 동맥 혈전증 및 심혈관 질환을 전개하는데 기본적으로 중요하다. 그러한 질환으로부터 고통을 받고 있는 환자는 보통 이 과정의 후반기를 타겟으로 하는 혈전 형성을 방해하는 항 혈소판 약물로 처치된다. 이러한 약물들의 심각한 부작용은 장기적인 출혈로서 이는 이들의 사용을 제한하게 한다.
GPVI는 혈소판 및 거핵구 (megakaryocytes)에서 독점적으로 발현되는 주된 콜라겐 수용체다. GPVI의 콜라겐 ((내피하 질의 혈전 형성에서 가장 중요한 성분 중의 하나) ((Lockyer S. et al, Thromb Res. 2006; 1 18(3):371 -80)) 에의 결합은 수용체 응집을 유도하며 및 이어서 혈소판 활성화를 유도한다. 그렇게 함으로써, GPVI는 혈소판 활성화 초기 상황에서 중점적으로 중요하며, 그러므로 이 기전의 간섭에 주 타겟이 된다 (Nieswandt B and Watson SP, Blood. 2003 Jul 15; 102(2):449-61).
GPVI의 항 혈소판 및 항 혈전성 효과는 생쥐 및 인간으로부터의 혈소판을 사용하여 시험관 내 및 생체 내 연구에서 잘 서술 되어왔다. 예를 들어, GPVI 결여된 혈소판은 콜라겐에 반응하지 않는다. 더욱이, GPI가 없는 생쥐는 자연 출혈 감수성의 증가 없이 손상된 혈관 벽에 동맥 혈전을 효과적으로 억제함을 보였다. 이 모든 데이터는 GPVI는 인간에서 혈전성 및 맥관성 질환의 효과적이고 안전한 타겟이라는 것을 제시 한다.
GPVI-콜라겐 상호작용을 방해할 수 있는 GPVI에 대한 억제적 또는 중화하는 단일클론 항체에 대해 이전의 기술에서 서술되었다. 예를 들어, EP1224942 (EP1228768) (Nieswandt, Bernhard), WO2001/000810 (MILLENNIUM PHARMACEUTICALS), WO2003/054020A3 (CAMBRIDGE UNIVERSITY TECHNICAL SERVICES LTD, GB), EP1538165A1 (Procorde GmbH / GSF-Forschungszentrum fur Umwelt und Gesundheit GmbH), WO2005/111083 (EP1745076B1) (OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD.), WO2006/118350 (EP1876240) (MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO. LTD., JP), WO2008/049928 (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM), FR), WO2011/073954 (SANOFI)참조.
그러나 보고된 GPVI 특이 항체들 대부분은 인간에서 임상적인 전개 및 치료적 용도에는 적절하지 않다, 왜냐하면 특히 이들이 동물에 기원하기 (이는 인간 환자에서 면역성을 일으킨다) 때문이고, 상관되는 동물 종에 상호-반응성의 결여, 이들의 상당히 낮은 친화력, 이들의 짧은 반감기 또는 혈소판의 표면으로부터 GPVI를 유도하는 것과 같은, 바람직하지 않은 기능적 성질 때문이다. GPVI 고갈은 수용체 활성화를 제시할 수 있으며 및 이는 조정될 수 없고 및 비가역적이므로, 이는 피해야만 한다.
현재, 단지 하나의 GPVI 특이 단일클론 Fab 항체 ACT-017 (WO2017/021539 참조)가 허혈성 뇌졸중 (ischemic stroke)의 치료를 위해 임상적 개발하에 있는 것 같다. 그러나, 이 항체는 일전에 공개된 항체 9012.2 (WO 2001000810 참조)의 인간화 된 형태이며 및 그러므로 설치류 GPVI에 대한 교차-반응성이 결여되어 있으며, 이는 보통 생체 내 연구에서 관련되는 모델로서 사용된다. 추가로, Fab 중쇄의 C-말단의 구조 때문에, 환자의 혈청에 존재하는 항-Fab 항체에 의해 인식될 위험성을 지니고 있다. 그러한 면역 반응은 바람직하지 않은 2가 GPVI 결합을 회복하게 하고 및 혈소판에서 GPVI의 활성화 결과를 가져오게 할 수 있다.
그러므로 더 나아가 이전의 이 분야 기술에서의 중화 항체에 비교하여 인간에서 좀 더 좋은 친화력, 효능 및 안전성 프로파일을 보이는 임상적 개발 및 치료적 용도에 적합한 GPVI에 특이적인 개선된 항체 또는 항체 단편의 개발이 필요하다.
따라서, 현 공개는 이전에 이 분야 기술에서 알려진 GPVI 특이 항체보다 월등히 좋은 새로운 항체 및 항체 단편 (특히 Fab 단편)을 제공한다. 특히, 현 공개의 항체는 비-인간 영장류 ((사이노몰거스 원숭이 (dynamo monkey)와 같은))에는 물론 설치류 (쥐 및/또는 생쥐와 같은) GPVI에도 결합하고, 높은 친화력을 보이고 및 전에는 전혀 관찰되지 않았던 바람직한 기능 및 안전성이 조합된 인간 항체 또는 항체 단편을 제공한다.
이런 관점에서, 현 공개의 GPVI 특이 항체 단편은 또한 Fab 중쇄의 C-말단의 (예를 들어, 수정된 중 쇄 고정 부위) 수정을 포함할 수 있다. 현 출원서의 발명자들은 그러한 수정은 더 나아가 환자의 혈청 속에 있는 항-Fab 항체에 의해 (이미-존재하는) Fab가 인식되는 것을 방해하여 혈소판 표면에 GPVI의 교차-연결을 통한 Fab의 혈소판 활성을 유도하는 능력을 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다. 위에서 개괄한 대로, 그러한 인식은 2가 또는 다 가의 GPVI-결합을 회복시키는 결과를 가져올 수 있으며, 이의 자연 작동제, 콜라겐과 같은, 리간드의 활성과 비슷하게, 혈소판 표면에 GPVI 응집을 초래할 수 있다.
따라서, 현 공개의 GPVI 특이 항체는 허혈성 사건의 특별히 안전한 치료를 제공한다.
이러한 특성은 본 공개의 항체 및 항체 단편이 혈전성 및 맥관성 질환을 예방 및/또는 치료하는 치료적 용도로서 매우 바람직하게 한다.
현 공개는 새로운 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 특히 현 발명은 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 항체 단편은
a) 서열번호 11의 HCDR1 부위, 서열번호 12의 HCDR2 부위, 서열번호 13의 HCDR3 부위, 서열번호 14의 LCDR1 부위, 서열번호 15의 LCDR2 부위 및 서열번호 16의 LCDR3 부위, 또는
b) 서열번호 22의 HCDR1 부위, 서열번호 23의 HCDR2 부위, 서열번호 24의 HCDR3 부위, 서열번호 25의 LCDR1 부위, 서열번호 26의 LCDR2 부위 및 서열번호 27의 LCDR3 부위, 또는
c) 서열번호 33의 HCDR1 부위, 서열번호 34의 HCDR2 부위, 서열번호 35의 HCDR3 부위, 서열번호 36의 LCDR1 부위, 서열번호 37의 LCDR2 부위 및 서열번호 38의 LCDR3 부위, 또는
d) 서열번호 44의 HCDR1 부위, 서열번호 45의 HCDR2 부위, 서열번호 46의 HCDR3 부위, 서열번호 47의 LCDR1 부위, 서열번호 48의 LCDR2 부위 및 서열번호 49의 LCDR3 부위를 포함한다.
현 발명은 GPVI 특이 항체 또는 항체 단편의 새로운 서열에 있는 수정된 고정 중 쇄 서열이 감소된 면역성을 가진 인간 항체 또는 항체 단편을 제공한다는 인식에 근거한다. 더욱이, 여기서 공개되는 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI에 결합하고 및 또한, 시아노몰거스 원숭이, 생쥐 (mouse) 및 쥐 (rat)로부터의 GPVI에도 또한, 결합한다.
현 공개의 항체 또는 항체 단편은 GPVI의 활성을 중화한다.
추가로, 공개된 항체 또는 항체 단편은 인간, 생쥐, 및 시아노몰거스 원숭이 GPVI가 콜라겐에 결합하는 것을 IC50 농도 27 nM 또는 그 미만의 농도로 억제한다. 바람직한 실시 예에서, 공개되는 항체 또는 항체 단편은 인간, 생쥐, 및 시아노몰거스 원숭이 GPVI가 콜라겐에 결합하는 것을 IC50 농도 9 nM 또는 그 미만의 농도로 억제한다. 추가로, 공개되는 항체 또는 항체 단편은 콜라겐-유도된 혈소판 응집을 억제한다.
여기서 공개되고 및 예시화된 대로, 이 항체 또는 항체 단편들은 생체 내 혈전증 생쥐 모델에서 효과적인 것으로 증명되었다.
따라서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편들은 효과적인 측면에서 월등하며 및 예를 들어, 혈전성 및 맥관 질환으로부터 고통받고 있는 인간의 치료를 위해 잘 맞고 및 전망이 좋은 화합물을 제공한다.
현 공개는 여기서 공개된 표 1-4에 따른 CDR 부위를 갖는 인간 GPVI에 결합하는 항체 또는 항체 단편들을 제공한다.
현 공개는 또한 여기서 공개된 표 1-4에 따른 가변 중 쇄 (variable heavy chain) (VH) 및 가변 경 쇄 (variable light chain) (VL)를 가진 항체 또는 항체 단편들을 제공한다.
현 공개는 또한 여기서 공개된 표 1-4에 따른 중 쇄 (heavy chain) (HC) 및 경 쇄 (light chain)(LC)를 가진 항체 또는 항체 단편들을 제공한다.
현 공개는 또한 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편들을 제공하고, 상기 항체 또는 항체 단편은 Fab이다.
현 공개는 또한 여기서 공개된 대로, 수정된 중 쇄 고정 부위 (heavy chain constant region) 를 포함하는 Fab를 제공하며, 상기 수정된 중 쇄 고정 부위는 상기 항체 또는 항체 단편이 환자의 혈청에 존재하는 항-Fab 항체에 의해 인식되는 것을 예방 또는 억제한다.
현 공개는 또한 여기서 공개된 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편과 경쟁하는 항체 또는 항체 단편을 제공한다.
현 공개는 또한 여기서 공개된 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편과 같은 에피톱에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 제공한다.
현 공개는 또한 현 공개에 따른 GPVI에 특이한 분리된 항체 또는 항체 단편의 의학적 용도를 제공한다.
현 공개는 또한 혈전성 또는 맥관성 질환과 같은 질환으로부터 고통을 받고 있는 개체를, 현 공개의 GPVI 특이한 항체 또는 항체 단편의 효과적인 양을 상기 개체에 투여하여, 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 개체 또는 환자는 인간이다.
현 공개는 또한 현 공개의 GPVI 특이한 분리된 항체 또는 항체 단편, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
현 공개는 또한 현 공개의 GPVI 특이한 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 조성물을 제공한다.
현 공개는 또한 현 공개의 GPVI 특이한 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 조성물을 포함하는 벡터 조성물을 제공한다.
현 공개는 또한 벡터를 포함하거나 또는 현 공개의 GPVI 특이한 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 조성물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
청구되는 항체 또는 항체 단편의 용도가 있다. 더 나아가, 청구되는 방법에서 그러한 항체 또는 단편을 동정하는 용도가 있다. 청구되는 항체 또는 항체 단편의 용도는 인간 GPVI의 생물학적 활성을 변경시키는 것이다.
특히, 청구되는 항체 또는 항체 단편은, 혈전성 또는 맥관성 질환 치료와 같은 치료적인 용도이다.
도 1: A - D) 3 공여자까지로부터의 혈소판-풍부한 혈장 (Platelet-rich plasma) (PRP)으로부터 얻은 인간, 시아노몰거스 원숭이 및 생쥐의 혈소판 세포 표면에 발현하는 GPVI에의 Fab#1, Fab#2, Fab#3, Fab#4 (수정된 중 쇄 고정 부위를 포함) 의 결합. 보여주는 것은 한 예시적 공여자 (도 1A, 1B 및 1C)의 결과 또는 3 공여자의 평균 ± 표준 오차 (SD) (도 1D)의 결과이다.
도 2: 정지 상태 (static conditions) 에서 Fab#1, Fab#2, Fab#3 및 Fab#4 (수정된 중 쇄 고정 부위를 포함) 에 의해 재조합 인간 콜라겐 비트로컬 (VitroCol) (A) 및 사이노 대동맥 콜라겐 (cyno aorta collagen) 유도된 인간 혈소판 응집의 시험관 내 억제. 혈소판 응집은 멀티플레이트 (Multiplate®) 장치에서 6분의 시간 동안에 걸쳐 증가 된 임피던스(impedance)로서 측정되었다. 보여주는 것은 4-7 공여자로부터의 혈액 샘플의 평균 값 ± SD 이다.
도 3: 정지 상태 (static conditions) 에서 Fab#1, Fab#2, Fab#3 및 Fab#4 (수정된 중 쇄 고정 부위를 포함) 에 의해 인간 죽상 경화성 플라크 (Atherosclerotic Plaque) 유도된 인간 혈소판 응집의 시험관 내 억제. 혈소판 응집은 멀티플레이트 (Multiplate®) 장치에서 6분의 시간 동안에 걸쳐 증가 된 임피던스(impedance)로서 측정되었다. 보여준 것은 6 공여자로부터의 혈액 샘플의 평균값± SD 이다.
도 4: A - D) 흐르는 컨디션 (flow conditions) 하에서 Fab#1, Fab#2, Fab#3 및 Fab#4 (수정된 중 쇄 고정 부위를 포함) 에 의한 인간 죽상 경화성 플라크 (Atherosclerotic Plaque) 유도된 인간 혈소판 부착/응집의 시험관 내 억제; 도 4E) 아세틸살리실에시드 (acetylsalicylacid) (ASA) 및 티카그레러 (Ticagrelor)의 조합에 의한 억제; 도 4F) 음성 대조군 Fab에 의한 억제. 데이터 포인트는 초당 1프레임 (frame)으로 기록되었다. 보여주는 것은 14 공여자로부터의 혈액 샘플로의 실험으로부터의 각 데이터 포인트 (검정색) + SD (회색) 의 평균값이다.
도 5: 생쥐의 동맥 혈전증 (arterial thrombosis) 모델 ((결찰 유도된 혈전 모델 (ligation-induced thrombosis model)) 에서 3mg/kg IV 일 회 분 투여 후에 생체 내 혈전 형성에서의 항-GPVI Fab Fab#3 (수정된 중 쇄 고정 부위를 포함) (도 5A) 및 음성 대조군 Fab (도 5B) 효과. 혈전 형성은 형광 혈소판을 검출하는 생체 내 비디오 현미경 (intravital video microscopy)으로 가시화되었으며 및 혈관 당 20분 동안 기록되었다. 보여주는 것은 다른 시간 포인트에서 한군 당 6마리 생쥐의 결과이다.
도 6: 생쥐의 동맥 혈전증 (arterial thrombosis) 모델 ((결찰 유도된 혈전 모델 (ligation-induced thrombosis model)) 에서 3mg/kg IV 일 회 분 투여 후에 생체 내 혈전 형성에서의 항-GPVI Fab Fab#3 (수정된 인간 중 쇄 고정 부위를 포함) (도 6A) 및 음성 대조군 Fab (도 6B) 효과. Y-축은 혈전 면적(thrombus area)/혈관 면적 vessel area)를 [%] 로 형광 혈소판의 형광 강도의 함수로 서술된다. 보여주는 것은 다른 시간 포인트에서 한군 당 6마리 생쥐의 결과이다.
도 7: 인간 혈장 샘플에 이미 존재하는 항-Fab 항체를 통한 GPVI 수용체 활성화를 유도하는 잠재력에 대한 FACS 근거한 Fab#1, Fab#2, Fab#3 및 Fab#4의 성질 규명. Fab는 야생형 인간 중 쇄 고정 부위나 (Fab#1, Fab#2, Fab#3 및 Fab#4) 또는 현 공개의 서열 번호 113 에 따른 수정된 인간 중 쇄 고정 부위(Fab#1 mod. HC, Fab#2 mod. HC, Fab#3 mod HC. 및 Fab#4 mod. HC)로 검사되었다. 혈소판 활성화는 PBS 대조군에서 발현된 CD62P에 대하여 정상화시킨 상대적인 CD62P의 인간 혈소판 표면에서의 발현으로 표시된다. 55 공여자로부터의 PRP 샘플의 평균값 ± SD를 보여준다.
도 8: 출혈 시간에 대한 항-GPVI Fab (수정된 중 쇄 고정 부위) (Fab#1, Fab#2, Fab#3 및 Fab#4) 매개하는 GPVI-차단 효과. C57BL/6J 생쥐에서 메스 칼날로 꼬리에서 2mm 떨어진 곳을 자르고 꼬리를 따듯한 PBS에 담가 꼬리-출혈을 유도하였다. 출혈 시간은 꼬리 끝으로부터 30초 내에 다시 흐름이 없이 피가 흐르는 것이 멈출 때까지 기록되었다. 왼쪽 팬넬은 ASA 동시-투여 없이 출혈 시간을 나타낸다. 오른쪽 팬넬은 ASA의 동시 투여의 출혈 시간을 나타낸다. 치료 군 당 3-6 생쥐의 평균 출혈 시간 ± SD 를 보여준다.
도 9: A - D) C57BL/6J 생쥐에 일회 용량으로 10 mg/kg 항-GPVI Fab 을 (수정된 중 쇄 고정 부위) (Fab#1, Fab#2, Fab#3 및 Fab#4) 정맥 주사 (I.V.)로 투여 후 혈소판 수 (count) 에 대한 항-GPVI Fab 의 효과: 치료 군 당 1-6 생쥐로부터의 다른 시간 포인트에서의 평균 혈소판 수 ± SD 를 보여준다.
도 10: A - D) CD-1 생쥐에 일회 용량으로 10mg/kg 항-GPVI Fab (수정된 인간 중 쇄 고정 부위를 포함하는) (Fab#1, Fab#2, Fab#3 또는 Fab#4) 를 정맥 주사 (I.V.)로 투여 후 GPVI의 생쥐 혈소판 표면에의 발현의 평가. 치료 군 당 4-6 생쥐의 다른 시간 포인트에서의 평균 GPVI 카피 수 (copy numbers) ± SD를 보여준다.
도 2: 정지 상태 (static conditions) 에서 Fab#1, Fab#2, Fab#3 및 Fab#4 (수정된 중 쇄 고정 부위를 포함) 에 의해 재조합 인간 콜라겐 비트로컬 (VitroCol) (A) 및 사이노 대동맥 콜라겐 (cyno aorta collagen) 유도된 인간 혈소판 응집의 시험관 내 억제. 혈소판 응집은 멀티플레이트 (Multiplate®) 장치에서 6분의 시간 동안에 걸쳐 증가 된 임피던스(impedance)로서 측정되었다. 보여주는 것은 4-7 공여자로부터의 혈액 샘플의 평균 값 ± SD 이다.
도 3: 정지 상태 (static conditions) 에서 Fab#1, Fab#2, Fab#3 및 Fab#4 (수정된 중 쇄 고정 부위를 포함) 에 의해 인간 죽상 경화성 플라크 (Atherosclerotic Plaque) 유도된 인간 혈소판 응집의 시험관 내 억제. 혈소판 응집은 멀티플레이트 (Multiplate®) 장치에서 6분의 시간 동안에 걸쳐 증가 된 임피던스(impedance)로서 측정되었다. 보여준 것은 6 공여자로부터의 혈액 샘플의 평균값± SD 이다.
도 4: A - D) 흐르는 컨디션 (flow conditions) 하에서 Fab#1, Fab#2, Fab#3 및 Fab#4 (수정된 중 쇄 고정 부위를 포함) 에 의한 인간 죽상 경화성 플라크 (Atherosclerotic Plaque) 유도된 인간 혈소판 부착/응집의 시험관 내 억제; 도 4E) 아세틸살리실에시드 (acetylsalicylacid) (ASA) 및 티카그레러 (Ticagrelor)의 조합에 의한 억제; 도 4F) 음성 대조군 Fab에 의한 억제. 데이터 포인트는 초당 1프레임 (frame)으로 기록되었다. 보여주는 것은 14 공여자로부터의 혈액 샘플로의 실험으로부터의 각 데이터 포인트 (검정색) + SD (회색) 의 평균값이다.
도 5: 생쥐의 동맥 혈전증 (arterial thrombosis) 모델 ((결찰 유도된 혈전 모델 (ligation-induced thrombosis model)) 에서 3mg/kg IV 일 회 분 투여 후에 생체 내 혈전 형성에서의 항-GPVI Fab Fab#3 (수정된 중 쇄 고정 부위를 포함) (도 5A) 및 음성 대조군 Fab (도 5B) 효과. 혈전 형성은 형광 혈소판을 검출하는 생체 내 비디오 현미경 (intravital video microscopy)으로 가시화되었으며 및 혈관 당 20분 동안 기록되었다. 보여주는 것은 다른 시간 포인트에서 한군 당 6마리 생쥐의 결과이다.
도 6: 생쥐의 동맥 혈전증 (arterial thrombosis) 모델 ((결찰 유도된 혈전 모델 (ligation-induced thrombosis model)) 에서 3mg/kg IV 일 회 분 투여 후에 생체 내 혈전 형성에서의 항-GPVI Fab Fab#3 (수정된 인간 중 쇄 고정 부위를 포함) (도 6A) 및 음성 대조군 Fab (도 6B) 효과. Y-축은 혈전 면적(thrombus area)/혈관 면적 vessel area)를 [%] 로 형광 혈소판의 형광 강도의 함수로 서술된다. 보여주는 것은 다른 시간 포인트에서 한군 당 6마리 생쥐의 결과이다.
도 7: 인간 혈장 샘플에 이미 존재하는 항-Fab 항체를 통한 GPVI 수용체 활성화를 유도하는 잠재력에 대한 FACS 근거한 Fab#1, Fab#2, Fab#3 및 Fab#4의 성질 규명. Fab는 야생형 인간 중 쇄 고정 부위나 (Fab#1, Fab#2, Fab#3 및 Fab#4) 또는 현 공개의 서열 번호 113 에 따른 수정된 인간 중 쇄 고정 부위(Fab#1 mod. HC, Fab#2 mod. HC, Fab#3 mod HC. 및 Fab#4 mod. HC)로 검사되었다. 혈소판 활성화는 PBS 대조군에서 발현된 CD62P에 대하여 정상화시킨 상대적인 CD62P의 인간 혈소판 표면에서의 발현으로 표시된다. 55 공여자로부터의 PRP 샘플의 평균값 ± SD를 보여준다.
도 8: 출혈 시간에 대한 항-GPVI Fab (수정된 중 쇄 고정 부위) (Fab#1, Fab#2, Fab#3 및 Fab#4) 매개하는 GPVI-차단 효과. C57BL/6J 생쥐에서 메스 칼날로 꼬리에서 2mm 떨어진 곳을 자르고 꼬리를 따듯한 PBS에 담가 꼬리-출혈을 유도하였다. 출혈 시간은 꼬리 끝으로부터 30초 내에 다시 흐름이 없이 피가 흐르는 것이 멈출 때까지 기록되었다. 왼쪽 팬넬은 ASA 동시-투여 없이 출혈 시간을 나타낸다. 오른쪽 팬넬은 ASA의 동시 투여의 출혈 시간을 나타낸다. 치료 군 당 3-6 생쥐의 평균 출혈 시간 ± SD 를 보여준다.
도 9: A - D) C57BL/6J 생쥐에 일회 용량으로 10 mg/kg 항-GPVI Fab 을 (수정된 중 쇄 고정 부위) (Fab#1, Fab#2, Fab#3 및 Fab#4) 정맥 주사 (I.V.)로 투여 후 혈소판 수 (count) 에 대한 항-GPVI Fab 의 효과: 치료 군 당 1-6 생쥐로부터의 다른 시간 포인트에서의 평균 혈소판 수 ± SD 를 보여준다.
도 10: A - D) CD-1 생쥐에 일회 용량으로 10mg/kg 항-GPVI Fab (수정된 인간 중 쇄 고정 부위를 포함하는) (Fab#1, Fab#2, Fab#3 또는 Fab#4) 를 정맥 주사 (I.V.)로 투여 후 GPVI의 생쥐 혈소판 표면에의 발현의 평가. 치료 군 당 4-6 생쥐의 다른 시간 포인트에서의 평균 GPVI 카피 수 (copy numbers) ± SD를 보여준다.
본 공개는 인간 GPVI을 인식하는 다수의 항체 또는 항체 단편과 관계가 있다.
정의
"GPVI" 이란 용어는 당단백질 VI (Glycoprotein VI)로 알려진 단백질을 의미한다.
인간 GPVI-1A (1-339) 는 아미노산 서열 ((유니플럿 (Uniprot): Q9HCN6-1, 일베체형 (haplotype)'a'))을 가진다:
신호 펩티드 (Signal peptide) /세포 외 도메인 (Extracellular Domain) / 막 통과 및 세포질 도메인(Tansmembrane and cytoplasmic domains)
시아노몰거스 원숭이 (Cynomolgus monkey) GPVI (1-318) 는 아미노산 서열 ((유니플럿 (UniProt) B0I1T7))을 가진다:
쥐 GPVI (1-313) 는 아미노산 서열 ((유니플럿 (UniProt) P0C191))을 갖는다:
인간 GPVI-1A의 세포 외 도메인 (위치 21-269) 은 아미노산 서열 ((유니플럿 (Uniprot): Q9HCN6-1, 일베체형 'a')) 을 가진다:
인간 GPVI-1B의 세포 외 도메인 (위치 21-269) 은 아미노산 서열 ((유니플럿 (Uniprot): Q9HCN6-1, 일베체형 'b')) 을 가진다:
인간 GPVI-2A 세포 외 도메인 (위치 21-251) 은 아미노산 서열 ((유니플럿 (Uniprot): Q9HCN6-2, 일베체형 'a')) 을 가진다:
"GPVI-1" 및 "GPVI-2"라는 용어는 발표된 GPVI의 동형질체 (isotype)이다. 접미사 "A" 및 "B"는 빈도 수가 높은 대립 형질 (allele) "a" (아미노산 S219, K237, T249를 포함하는) 및 빈도 수가 낮은 "b" (Pro219, Glu237, Ala249)를 각각 서술함을 의미한다 (Joutsi-Korhonen et al., 2003).
인간 GPVI의 세포 외 도메인은 두 개의 Ig-유사 C2-유형 도메인, 즉 힌지-내부도메인으로 연결된 D1 도메인 및 D2 도메인으로 구성된다. D1 도메인은 서열번호 1의 아미노산 잔기 21 에서 109를 포함한다. D2 도메인은 서열번호 1의 아미노산 잔기 114에서 207를 포함한다.
시아노몰거스 원숭이 (cynomolgus monkey) GPVI의 세포 외 도메인 (위치 21-249)은 아미노산 서열 ((유니플럿 (Uniprot): B0I1T7))을 가진다:
생쥐 GPVI의 세포 외 도메인 (위치 21-266) 은 아미노산 서열 ((유니플럿 (Uniprot): P0C191))을 가진다:
쥐 (rat) GPVI의 세포 외 도메인 (위치 21-269) 은 아미노산 서열 ((유니플럿 (Uniprot: XP_008757241.2))을 가진다:
GPVI-ECD-Fc 융합 단백질을 생성하기 위하여 사용된 인간 IgG1-Fc 도메인 (K105-K330)은 아미노산 서열을 가진다:
숫자 전에 "약 (about)" 이란 용어는 언급된 숫자 값의 10% 플러스 또는 10% 적은 값을 의미한다.
여기서 사용된 대로 "항체 (antibody)" 란 용어는 항원과 상호작용하는 이 황화 결합 (disulfide bonds) 에 의해 서로-연결되어 있는 적어도 두 개의 중 쇄 ((heavy (H) chains)) 및 두 개의 경 쇄 ((light (L) chains)) 를 포함하는 단백질을 의미한다. 각 중 쇄 (heavy chain) (HC) 는 중 쇄 가변 부위 (heavy chain variable region) (여기서 VH로 축약) 및 중 쇄 고정 부위 (heavy chain constant region)로 구성된다. 중 쇄 고정 부위는 세 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경 쇄 (light chain) (LC)는 경 쇄 가변 부위 (light chain variable region) (여기서 VL로 축약) 및 경 쇄 고정 부위 (light chain constant region)로 구성된다. 경 쇄 고정 부위는 하나의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 부위는 더 나아가, 소위 프레임워크 (framework regions) (FR) 부위라고 불리는 좀 더 보존적인 부위로 배치되어 있는 소위 보완성 결정 부위 (complementarity determining regions) (CDR) 라는 고도로 가변인 (hypervariability) 부위로 더 나누어질 수 있다. 각 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카복시-말단으로 세 개의 CDRs 및 네 개의 FR로 다음의 순서로 배열로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 중 쇄 및 경 쇄의 가변 부위는 항원과 결합하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 고정 부위는 면역글로블린이 숙주 조직 또는 면역 시스템의 여러 세포 ((예를 들어, 주효 세포 (effector cell)) 및 고전적인 보완 시스템인 첫 번째 성분 (the first component) (Clq) 을 포함하는, 인자들과 결합하는 것을 매개할 수 있다. "항체 (antobody)" 라는 용어는 예를 들어, 단일 클론 항체 (monoclonal antibodies), 인간 항체 (human antibodies), 인간화된 항체 (humanized antibodies), 카멜화된 항체 (camelised antibodies) 및 키메릭 항체 (chimeric antibodies) 를 포함한다. 항체는 어느 아이소타입 (isotype) (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류 (class) ((예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2), 또는 아류 (sublass) 가 될 수 있다. 경 쇄 및 중 쇄는 둘 다 구조적 및 기능적인 상동성 부위로 나뉠 수 있다.
"항체 단편 (antibody fragment)" 구절은, 여기서 사용된 대로, 항원과 특이적으로 상호 작용하는 능력을 유지하고 있는 (예를 들어, 결합, 입체적 방해, 공간적인 분포의 안정화에 의해) 하나 또는 그 이상의 항체 부분을 의미한다. 결합하는 단편의 예에는, 이것에만 국한하지 않으나, Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 단일가 단편; Fab' 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인 및 면역글로블린의 힌지 부위의 N-말단 부분으로 구성된 단일 가 단편; F(ab)2 단편, 힌지 부위에 이 황화 브리지에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; 항체의 단일 팔 (single arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; VH 도메인으로 구성된, dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 분리된 상보성 결정 부위 (complementarity determining region) (CDR) 를 포함한다. 더 나아가, Fv 단편의 두 도메인, VL 및 VH, 이 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은, 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 부위가 단가 분자 ((단일 체인 Fv (scFv)로 알려진; 예를 들어, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883) 참조)) 를 형성하도록 단일 단백질로서 만들어질 수 있게 하는 합성적 링커에 의해 연결 시킬 수 있다. 그러한 단일 체인 항체도 또한 "항체 단편 (antibody fragment)" 이란 용어 내에 포함하려는 의도가 있다. 이러한 항체 단편은 이 분야 기술에서 알려진 전통적인 기술을 사용하여 얻어질 수 있으며, 및 이 단편들은 온전한 항체와 같은 방식으로 그 용도에 대해 스크린 된다. 항체 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디 (maxibodies), 미니바디(minibodies), 인트라바디 (intrabodies), 디아바디 (diabodies), 트리아바디 (triabodies), 테트라바디 (tetrabodies), v-NAR 및 비스-scFv (bis-scFv)로 병합될 수 있다 ((예를 들어, Hollinger and Hudson, (2005) Nature Biotechnology 23:1126-1136 참조)). 항체 단편은 피브로넥틴 타입 III (Fibronectin type III)(Fn3)와 같은 폴리펩티드에 근거한 스카폴드 (scaffolds)로 이식될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩티드 모노바다를 서술한, U.S. Pat. No. 6,703,199, 참조). 항체 단편은 상보성 경 쇄 (complementary light chain) 폴리펩티드와 함께, 항원-결합 부위 쌍을 형성하는 나란한 Fv 조각 쌍 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 단일 체인 분자로 병합될 수 있다 ((Zapata et al., (1995) Protein Eng. 8:1057-1062; and U.S. Pat. No. 5,641,870)).
여기서 사용된 대로, " 힌지 부위 (hinge region)" 라는 용어는 CH1 도메인을 CH2 도메인에 결합시키는 항체 중 쇄의 부위를 포함한다. 힌지 부위는 세 개의 뚜렷한 도메인으로 다시 나누어질 수 있다: 상부, 중부, 및 하부 힌지 도메인 (Roux et ah, J. Immunol. 1998 161 :4083).
"CH1 도메인 (CH1 domain)" 이란 용어는 가변 도메인을 힌지 부위에 연결하는 항체의 중 쇄 고정 도메인을 의미한다. CH1 도메인 (CH1 domain)" 이란 용어는 야생형 CH1 도메인 및 자연적으로 존재하는 알로 타입 (allotype) 중 하나는 물론 이들의 변이체도 포함한다.
"인간 항체 (human antibody)" 또는 "인간 항체 단편 (human antibody fragment)"은, 여기서 사용된 대로, 프레임워크 및 CDR 부위 둘 다 인간 기원한 서열로부터 유래한 가변 부위를 가진 항체 및 항체 단편을 포함한다. 더 나아가, 만약 항체가 고정 부위를 함유한다면, 이 고정 부위 또한 그러한 서열로부터 유래한다. 인간 기원에는 예를 들어, 인간 생식세포계열 서열, 또는 인간 생식세포계열 서열이 돌연 변이된 것 또는 예를 들어, 크나피크 등에서 ((Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86)) 서술된 대로, 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래한 일치되는 프레임워크 서열을 함유하는 항체를 포함한다. 면역글로블린 가변 도메인의, 예를 들어 CDRs, 의 구조 및 위치는 잘 알려진 숫자 매김 계획 (numbering schemes), 예를 들어, 카벳 숫자 매김 계획 (Kabat numbering scheme), 쵸티아 숫자 매김 계획 (Chothia numbering scheme), 또는 카벳(Kabat) 및 쵸티아 (Chothia)의 조합을 사용하여 정의될 수 있다 ((예를 들어, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.; Lazikani et al., (1997) J. Mol. Bio. 273:927-948); Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883; 및 Al-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948 참조)). 인간 항체는 또한, 각 시스템이 프레임워크 및 CDR 부위가 인간 기원한 서열로부터 유래한 가변 부위를 가진 항체를 생산한다면, 합성 라이브러리로부터 또는 형질전환된 생쥐 ((예를 들어, 지노나우스 (xenomouse))로부터 분리될 수 있다.
"키메릭 항체 (chimeric antibody)" 또는 "키메릭 항체 단편 (chimeric antibody fragment)" 은 한 종에서 발견된 서열로부터 유래하거나 또는 그에 해당하는 서열을 가진 고정 항체 부위 (constant antibody regions) 및 다른 종으로부터 유래한 가변 항체 부위 (variable antibody regions) 를 가진 항체 분자로 여기서 정의한다. 바람직하게, 고정 항체 부위는 인간에서 발견된 서열로부터, 또는 해당하는 서열로부터 유래하고, 및 가변 항체 부위는 (예를 들어, VH, VL, CDR 또는 FR 부위) 비-인간 동물, 예를 들어, 생쥐, 쥐, 토끼 또는 햄스터, 에서 발견된 서열로부터 유래한다.
"인간화 항체 (humanized antibody)" 또는 "인간화 항체 단편 (humanized antibody fragment)" 은 인간 기원한 서열로부터 유래한 고정 항체 부위 및 다른 종으로부터 유래한 가변 항체 부위 또는 이의 일부분 또는 CDRs 부분만을 가진 항체 분자로 여기서 정의한다. 예를 들어, 인간화 항체는 CDR-이식된 것일 수 있으며, 여기서 가변 도메인의 CDRs은 비-인간 기원으로부터이고, 반면에 가변 부위의 하나 또는 그 이상이 프레임워크는 인간 기원이고 및 고정 도메인은 (만약 있다면) 인간 기원이 될 수 있다.
"분리된(isolated)"이란 용어는 예를 들어, 다른 항원 특이성을 가진 항체 또는 항체 단편이 상당히 없는 항체 또는 항체 단편이 될 수 있는, 화합물을 의미한다. 더욱이, 분리된 항체 또는 항체 단편은 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질이 상당히 없을 수 있다. 그러므로 어떤 실시 예에서는, 제공되는 항체 또는 항체 단편은 다른 특이성을 가진 항체로부터 격리된 분리된 항체 또는 항체 단편이다. 분리된 항체는 단일 클론 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 분리된 항체 또는 항체 단편은 재조합 단일클론 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 에피톱, 아이소폼 또는 타겟의 변이체에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 항체 단편은, 그러나, 다른 관련된 항원, 예를 들어, 다른 종으로부터 (예를 들어, 종 호모로그)의 항원, 에 교차-반응성을 가질 수 있다.
"재조합 항체 (recombinant antibody)" 또는 "재조합 항체 단편 (recombinant antibody fragment)이란 용어는, 여기서 사용된 대로, 자연에 존재하지 않은 방법에 의해 제조되거나, 발현되거나, 창조되거나, 또는 분리된 모든 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 예를 들어, 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 분리된 항체, 재조합, 조합적인 인간 항체 라이브러리로부터 선택되고 및 분리된 항체, 및 인간 면역글로블린 유전자, 서열 모두 또는 일부를 쪼개 다른 서열로 하는 것이 관련된 다른 어느 방법에 의해 제조되고, 발현되고, 창조되고 또는 분리된 항체, 또는 인간 면역글로블린 유전자에 대해 형질전환되거나 (trnasgenic) 또는 염색체 전환된 (transchromosoml) 동물 (예를 들어, 생쥐) 로부터 분리된 항체 또는 이로부터 제조된 하이브리도마. 바람직하게, 그러한 재조합 항체는 프레임워크 및 CDR 부위가 인간 생식세포계열 면역글로블린 서열로부터 유래한 가변 부위를 가지고 있다. 어떤 특정 실시 예에서, 그러나, 그러한 재조합 인간 항체는 시험관 내 돌연변이 제조가 되게 할 수 있으며 (또는 인간 Ig 서열을 위해 동물 형질전환체가 사용될 때, 생체 내 체세포 돌연변이 제조) 및 그러므로 재조합 항체의 VH 및 VL 부위의 아미노산 서열은, 인간 생식세포계열 VH 및 VL 서열로부터 유래하고 및 관련되는 반면에, 생체 내 인간 항체 생식세포계열 레파토아 (repertoire) 내에 자연적으로 존재하지 않은 서열일 수 있다. 재조합 항체는 단일클론 항체 일 수 있다. 한 실시 예에서, 여기서 공개되는 항체 또는 항체 단편은, 여기 두 개 다 참고 문헌으로 병합된 US 13/321,564 또는 US 13/299,367 에 공개된 대로, 이란티아 항체 라이브러리 (Ylanthia® antibody library) 로부터 분리되었다.
여기서 사용된 대로, "단일클론 항체 (monoclonal antibody)" 또는 "단일클론 항체 단편 (monoclonal antibody fragment)" 이란 용어는 어느 진핵 세포, 비진핵 세포, 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 유래 된 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 및 이들이 생산되는 방법의 의미하는 것은 아니다. 여기서 공개되는 대로의 단일클론 항체 또는 항체 단편은 콜라 등 ((Kohler et a/.; Nature, 256:495 (1975)) 에서 서술된 대로 하이브리도마 방법에 의해 만들어질 수 있거나 또는 예를 들어, 여기서 서술된 대로의 기술을 사용하여 파지 라이브러리 (phage libraries) 로부터 분리될 수 있다. 클론적 세포주의 제조 및 이에 의해 발현되는 단일 항체의 제조하는 다른 방법들은 이 분야 기술에서 잘 알려졌다 ((Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York 참조)).
여기서 사용된 대로, "∼에 특이적으로 결합하는 (binds specifically to)", "특이적으로 ∼에 결합하는 (specifically binds to)", " ∼에 특이적인 (specific to/for)", 또는 "특이적으로 인식되는 (specifically recognizes)", 또는 이와 유사한 용어는 타겟과 항체 또는 항체 단편 사이의 결합과 같은 측정할 만하고 및 재생할 수 있는 상호 작용을 의미하며. 이는 생물학적 분자를 포함하는 이질적인 집단의 분자들의 존재하에서 타겟의 존재를 결정하는 것이다. 예를 들어, 타겟에 (이는 항원 또는 항원의 에피톱이 될 수 있다) 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 다른 타겟에 결합하는 것보다 이 타겟과 좀 더 큰 친화력, 결합성을 갖고, 좀 더 쉽게 결합하며, 및/또는 더 큰 지속기간을 가지는 항체 또는 항체 단편이다. 어떤 특정 실시 예에서, 항체 또는 항체 단편은 다른 종으로부터의 단백질 사이에서 보존적인 단백질의 에피톱에 특이적으로 결합한다. 다른 실시 예에서, 특이적인 결합은 이를 요구하는 것은 아니나 독점적인 결합을 포함할 수 있다. 여기서 공개되는 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 인간 GPVI에 특이적인 공개되는 항체 또는 항체 단편은 생쥐, 쥐 및/또는 시아노몰거스 원숭이 (cynomolgus monkey)의 GPVI와 같은 다른 종의 GPVI에 특이적으로 결합한다. 좀 더 바람직하게, 여기서 공개되는 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI, 생쥐 GPVI 및 쥐 GPVI에 특이적이다. 두 분자가 특이적으로 결합하는지를 결정하는 방법은 이 분야 기술에 잘 알려졌으며 및 예를 들어, 표준 ELISA 에세이를 포함한다. 스코어링 (scoring) 은 표준 색 전개 (standard color development) ((예를 들어, 호스레디쉬 퍼옥사이드 (horseradish peroxide) 와 함께 2차 항체 및 하이드로겐 퍼옥사이드 (hydrogen peroxide) 와 함께 테트라메틸 벤지딘 (tetramethyl benzidine)) 에 의해 수행될 수 있다. 어떤 웰에서 반응은 광학적 밀도로 (optical density), 예를 들어, 450nm에서, 점수를 매길 수 있다. 전형적인 백그라운드 (background) (음성적 반응)는 0.1 OD 일 수 있으며; 전형적인 양성 반응은 1 OD 일 수 있다. 이는 양성/음성 차이는 5-배 이상일 수 있음을 의미한다. 전형적으로, 결합 특이성의 결정은 단일 참조 항원을 사용하여 수행되는 것이 아니고, 우윳가루, BSA, 트란스페린 (transferrin) 또는 이와 유사한 것과 같은 3-5개의 관계없는 항원의 세트를 사용하여 수행된다.
여기서 사용된 대로, "친화력 (affinity)" 이란 용어는 단일 부위에서 폴리펩티드와 이의 타겟 사이의 상호 작용의 강도를 의미한다. 각 부위 내에서, 폴리펩티드의 결합 부위는 약한 비-공유 결합력을 통해 이의 타겟의 여러 부위에 상호작용한다; 상호작용이 더 많으면, 친화력은 더 강하다.
"KD"란 용어는, 여기서 사용된 대로, 해리 항수를 의미하며, 이는 Ka 대비 Kd의 비율 (즉, Kd/Ka) 로 부터 얻어지며 및 몰수 농도 (M) 로 표현된다. 예를 들어, 단일 클론 항체와 같은 항원 결합 잔기의 KD 값은 이 분야 기술에서 잘 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 단일 클론 항체와 같은 항원 결합 잔기의 KD 값을 결정하는 방법은 SET ((soluble equilibrium titration (용해성 평형 적정)) 또는 비아코아 시스템 (Biacore® system)과 같은 바이오센서 시스템을 사용한 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance) 이다. 현 공개에서 GPVI에 특이적인 항체는 분리 비율 항수 (dissociation rate constant) (KD) (koff/kon) 가 5x10-2M 미만, 1x10-2M 미만, 5x10-3M 미만, 1x10-3M 미만, 5x10-4M 미만, 1x10-4M 미만, 5x10-5M 미만, 1x10-5M 미만, 5x10-6M 미만, 1x10-6M 미만, 5x10-7M 미만, 1x10-7M 미만, 5x10-8M 미만, 1x10-8M 미만, 5x10-9M 미만, 1x10-9M 미만, 5x10-10M 미만, 1x10-10M 미만, 5x10-11M 미만, 1x10-11M 미만, 5x10-12M 미만, 1x10-12M 미만, 5x10-13M 미만, 1x10-13M 미만, 5x10-14M 미만, 1x10-14M 미만, 5x10-15M 미만, 또는 1x10-15M 미만 또는 이보다 더 낮다.
현 공개의 조성물 (Compositions) 은 치료적 또는 예방적 적용에 사용될 수 있다. 현 공개는 그러므로, 여기서 공개된 대로의 항체 또는 항체 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 그 대신 함유하는 약학적 조성물을 포함한다. 관련되는 실시 예에서, 현 공개는 혈전성 또는 맥관성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 이가 있어야 하는 개체에게 여기서 서술된 대로 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 함유하는 약학적 조성물의 효과적인 (effective)양을 투여하는 단계를 포함한다.
현 공개는 그러한 처치가 필요한 개체에게 여기서 공개된 대로의 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편의 치료적으로 효과 있는 양의 투여를 포함하는 치료적 (therapeutic) 방법을 제공한다. "치료적으로 효과적인 양 (therapeutically effective amount)" 또는 효과적인 양 (therapeutically effective amount)" 은, 여기서 사용된 대로, 바람직한 생물학적 반응을 끌어내기에 필요한 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편의 양을 의미한다. 현 공개에 따라, 치료적으로 효과적인 양은 질환을 치료 및/또는 방지 (예를 들어, 예방적) 하는데 필요한, GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편의 양을 의미한다.
"투여 (Administration)" 및 "치료 (treatment)" 는 동물, 인간, 실험 개체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 액체에 적용되는 대로, 외부 유래 약학적, 치료적, 진단적 제제, 또는 조성물이 동물, 인간, 개체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 액체와 접촉하는 것을 의미한다. "투여 (Administration)" 및 "치료 (처치)(treatment)"는, 예를 들어, 치료적, 약동학적, 진단적, 연구 및 실험적 방법을 의미할 수 있다. 세포의 처치는 세포에 시약을 접촉시키는 것은 물론 액체에 시약을 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 액체는 세포와 접촉되어 있다. "투여 (Administration)" 및 "치료 (treatment)" 는 또한 예를 들어, 세포의, 시약, 진단적, 결합 조성물에 의한, 또는 다른 세포에 의한 시험관 내, 또는 생체 밖 처치를 의미한다. "치료 (처치) (Treatment)" 는 인간, 수의과학, 또는 연구 개체에 적용되는 대로, 치료적 처치, 예방적 또는 방지적 조치, 연구 및 진단적 적용을 의미한다. 치료 (처치) (Treatment)" 는 인간, 수의과학, 또는 연구 개체, 또는 세포, 조직 또는 기관에 적용되는 대로, 한 제제가 동물 개체, 세포, 조직, 생리적 부분 (physiological compartment) 또는 생리적 액체와 접촉하는 것을 포함한다. 세포의 치료 (Treatment of a cell)" 는 또한 제제가 예를 들어, 액체 상에서 또는 콜로이드상 (colloidal phase)에서, PILR와 접촉하는 경우를 포함하지만, 작동제 (agonist) 또는 길항제 (antagonist) 가 세포 또는 수용체와 접촉하지 않는 경우도 포함한다.
"개체 (subject)" 라는 용어는 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어, 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 및 파충류와 같은, 포유류 및 비-포유류를 포함한다. 주지될 때를 제외하고, "환자 (patient)" 또는 "개체 (subject)" 라는 용어는 여기서 서로 교환되게 사용된다.
"폴리펩티드 (polypeptide)" 및 "단백질 (protein)" 은 아미노산 잔기의 중합체 (polymer)를 의미하기 위하여 여기서 서로 교환되게 사용된다. 이 용어는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 자연적으로 존재하는 아미노산에 해당하는 인공적인 화학적 모사체인 아미노산 중합체에 적용되는 것은 물론, 자연적으로 존재하는 아미노산 중합체 및 비-자연으로 존재하는 아미노산 중합체에 적용된다. 달리 제시되지 않는 한, 특별한 폴리펩티드 서열은 또한 이의 보존적으로 수정된 변이체를 암시적으로 포함한다.
"EC 50 "란 용어는 여기서 사용된 대로, 에세이에서 베이스라인 (baseline)과 최대치 사이에서 반의 반응을 유도하는 항체 또는 항체 단편의 농도를 의미한다. 이는 그러므로 최대 효과의 50%가 관찰되는 항체의 농도이다.
"IC 50 "란 용어는 여기서 사용된 대로, 에세이에서 반응을 최대 반응과 베이스라인 (baseline) 사이에서 반으로 억제하는 항체 또는 항체 단편의 농도를 의미한다. 이는 그러므로 주어진 반응을 50%로 감소시키는 항체의 농도를 나타낸다.
"억제 (inhibition)" 또는 "억제하는 (inhibit)" 또는 "감소 (reduction)" 또는 "감소하는 (reduce)" 또는 "중화(neutralization)" 또는 "중화하는 (neutralize)"라는 용어는 어떤 표현형적 특징을 (결합, 생물학적 활성 또는 기능과 같은) 감소 또는 중단함을 의미하거나 또는 그런 특징의 발생, 정도 또는 그런 특징과 비슷한 것을 감소 또는 중단함을 의미한다. '억제 (inhibition)", "감소 (reduction)", 또는 "중화 (neutralization)"는 적절한 에세이를 사용하여 검출될 수만 있으면 완전할 필요는 없다. 어떤 실시 예에서, "감소하는 (reduce)" 또는 "억제하는 (inhibit)" 은 20% 또는 그 이상의 감소를 하게 하는 능력을 의미한다. 다른 실시 예에서, "감소하는 (reduce)" 또는 "억제하는 (inhibit)" 은 50% 또는 그 이상의 감소를 하게 하는 능력을 의미한다. 또 다른 실시 예에서, 감소하는 (reduce)" 또는 "억제하는 (inhibit)" 은 전체적으로 75%, 85%, 90% 또는 그 이상의 감소를 하게 하는 능력을 의미한다.
"길항적 (antagonistic)" 항체 또는 항체 단편이란 용어는, 여기서 사용된 대로, GPVI과 상호작용하고 및 부분적으로 또는 전적으로 생물학적 활성 또는 기능 또는 GPVI의 표현형적인 특징을 억제 또는 중화하는 항체 또는 항체 단편을 의미한다.
"교차 경쟁 (Cross competes)"은 항체 또는 항체 단편 또는 다른 항원-결합 잔기가 표준 경쟁적 결합 에세이에서 다른 항체, 항체 단편 또는 다른 항원-결합 잔기가 특정한 항원에 결합하는 것을 방해하는 능력을 의미한다. 항체 또는 항체 단편 또는 다른 항원-결합 잔기가 다른 항체, 항체 단편 또는 다른 항원-결합 잔기가 특정한 항원에 결합하는 것을 방해할 수 있는 능력 또는 정도, 및 그러므로 본 발명에 따른 교차-경쟁이라고 말할 수 있는지는, 표준 경쟁 결합에세이를 사용하여 측정될 수 있다. 한 적절한 에세이는 비아코아 기술 ((Biacore technology) (예를 들어, BIAcore 3000 기기를 사용하여 (Biacore, Uppsala, Sweden))의 사용이 관련되며, 이는 표면 플라스몬 공명 기술 (surface plasmon resonance technology)을 사용하여 상호작용의 정도를 측정할 수 있다. 교차-경쟁을 측정하는 다른 에세이는 ELISA-근거한 접근방법을 사용한다. 교차-경쟁에 근거하여 "에피톱 비닝 (epitope binning)" 항체를 위한 대용량 처리 과정 (high throughput process)은 국제 특허 출원 번호 WO 2003/48731 (International Patent Application No. WO 2003/48731) 에 서술되어 있다. 만약 조사 중에 있는 항체 또는 항체 단편이 표 1-4에 공개된 항체 또는 항체 단편 중 하나가 GPVI에 결합하는 것을 60% 또는 그 이상을 감소시키면, 특이적으로 70% 또는 그 이상 및 더 특이적으로 80% 또는 그 이상을 감소시키면 및 표 1-4에 서술된 항체 중 하나가 상기 항체 또는 항체 단편이 GPVI에 결합하는 것을 60% 또는 그 이상, 특이적으로 70% 또는 그 이상 및 더 특이적으로 80% 또는 그 이상을 감소시키면, 교차-경쟁은 존재한다.
" 에피톱 ( epitope )" 이란 용어는 항체 또는 이의 단편 또는 T-세포 수용체에 의해 특이적으로 인식되거나 또는 그렇지 않으면 한 분자와 상호작용하는 단백질성 부위를 포함한다. 일반적으로, 에피톱은 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측 쇄 (sugar side chains)와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 군이며 및 일반적으로 특이적인 3차원 구조의 특징을 가질 수 있음은 물론 특이적인 전하 (charge)의 특징을 가질 수 있다. 이 분야 기술에 전문가에 의해 인지될 것이듯이, 실질적으로 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 어느 것은 다 에피톱이 될 수 있다.
"와 같은 에피톱에 결합한다 (Binds the same epitope as)" 는 항체 또는 항체 단편이 특이적인 항원에 결합하는 능력을 의미하며 및 항체 비교를 위한 같은 에피톱 맵핑 기술 (epitope mapping technique)을 사용하였을 때 예시적 항체와 같은 에피톱에 결합한다. 예시적 항체 및 다른 항체의 에피톱은 에피톱 맵핑 기술을 사용하여 결정할 수 있다. 에피톱 맵핑 기술은 이 분야 기술에서 잘 알려졌다. 예를 들어, 구조적인 에피톱은, 예를 들어, 수소/중수소 교환, x-레이 결정구조학 및 2차원 핵자기 공명 (nuclear magnetic resonance)에 의한 것과 같은 아미노산의 공간적 구조 결정에 의해 쉽게 동정 될 수 있다.
"제작된 (engineered)" 또는 "수정된 (modified)" 이란 용어는 여기서 서술된 대로 합성적 방법으로 (예를 들어, 재조합 기술, 시험관 내 펩티드 합성, 펩티드의 효소적 또는 화학적 커플링에 의하거나 또는 이들 기술의 어떤 조합으로) 핵산 또는 폴리펩티드 분자를 조작하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 본 공개의 항체 또는 항체 단편은 제작되거나 또는 수정되며, 예를 들어 인간화된 및/또는 키메릭화된 항체, 및 항원 결합, 안정성/반감기, 주 효능 기능, 면역성, 안전성 및 이와 유사한 것과 같은 하나 또는 그 이상의 성질이 개선되도록 제작된 항체를 포함한다.
"야생형 ( wildtype )" 단백질 또는 이의 부분은 자연에서 발견되는 대로의 단백질 형태이다. 야생형 단백질의 아미노산 서열은, 예를 들어, 중 쇄 고정 부위 (heavy chain constant regions), 자연에 존재하는 대로의 단백질의 아미노산 서열이다. 알로 타입 차이 (allotypic differences) 때문에, 하나의 야생형 단백질에는 하나 이상의 아미노산 서열이 있을 수 있다. 예를 들어, 자연에 존재하는 몇 가지 알로 타입의 인간 IGg1 중 쇄 고정 부위가 있다 ((예를 들어, Jeffries et al. (2009) mAbs 1:1 참조)).
"알로 타입 ( Allotype )" 은 특정한 아이소타입 군 (isotype group) 내에 자연적으로 존재하는 변이체를 의미하며, 이변이체는 몇몇 아미노산이 다르다 ((예를 들어, Jeffries et al. (2009) mAbs 1:1 참조)). 여기서 서술된 항체는 어느 알로 타입도 될 수 있다.
여기서 사용된 대로, "이미-존재하는 (pre-existing)" 항체라는 용어는 개체 또는 유기체에 정상적으로 존재하는 항체를 의미한다.
실시예
서열
한 실시 예에서, 현 공개는 당단백질 VI (Glycoprotein VI) (GPVI)에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 당단백질 VI (Glycoprotein VI) (GPVI)에 특이한 분리된 항체 또는 항체 단편을 의미한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 당단백질 VI (Glycoprotein VI) (GPVI)에 특이한 표 1-4에 공개된 어느 한 항체의 가변 중 쇄 (variable heavy chain) (VH) 및 가변 경 쇄 (variable light chain) (VL)를 포함하는 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편을 의미한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 당단백질 VI (Glycoprotein VI) (GPVI)에 특이한 표 1-4에 공개된 어느 한 항체의 중 쇄 (heavy chain) (HC) 및 경 쇄 (light chain) (VL)를 포함하는 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편을 의미한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 표 1-4에 공개된 어느 한 항체의 카펫 (Kabat)에 의해 정의된 6CDRs을 포함하는 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편을 의미한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 표 1-4에 공개된 어느 한 항체의 6CDRs을 포함하는 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편을 의미한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은
a) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중 쇄 (variable heavy chain) CDR1 (HCDR1) 부위, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중 쇄 CDR2 (HCDR2) 부위, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중 쇄 CDR3 (HCDR3) 부위, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경 쇄 (variable light chain) CDR1 (LCDR1) 부위, 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경 쇄 CDR2 (LCDR2) 부위 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경 쇄 CDR3 (LCDR3) 부위, 또는
b) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 부위, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 부위, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 부위, 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 부위, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 부위 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 부위, 또는
c) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 부위, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 부위, 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 부위, 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 부위, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 부위 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3부위, 또는
d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 부위, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 부위, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 부위, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 부위, 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 부위 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3부위를 포함한다.
한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 단일클론 인간 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 단편은 Fab, Fab', Fv, scFv 로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 실시 예에서, 항체 단편은 Fab이다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은
a) 서열번호 11의 HCDR1 부위, 서열번호 12의 HCDR2 부위, 서열번호 13의 HCDR3 부위, 서열번호 14의 LCDR1 부위, 서열번호 15의 LCDR2 부위 및 서열번호 16의 LCDR3 부위, 또는
b) 서열번호 22의 HCDR1 부위, 서열번호 23의 HCDR2 부위, 서열번호 24의 HCDR3 부위, 서열번호 25의 LCDR1 부위, 서열번호 26의 LCDR2 부위 및 서열번호 27의 LCDR3 부위, 또는
c) 서열번호 33의 HCDR1 부위, 서열번호 34의 HCDR2 부위, 서열번호 35의 HCDR3 부위, 서열번호 36의 LCDR1 부위, 서열번호 37의 LCDR2 부위 및 서열번호 38의 LCDR3 부위, 또는
d) 서열번호 44의 HCDR1 부위, 서열번호 45의 HCDR2 부위, 서열번호 46의 HCDR3 부위, 서열번호 47의 LCDR1 부위, 서열번호 48의 LCDR2 부위 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 부위를 포함한다.
한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 단일클론 인간 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 단편은 Fab, Fab', Fv, scFv 로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 실시 예에서, 항체 단편은 Fab이다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은
a) 서열번호 11의 HCDR1 부위, 서열번호 12의 HCDR2 부위, 서열번호 13의 HCDR3 부위, 서열번호 14의 LCDR1 부위, 서열번호 15의 LCDR2 부위 및 서열번호 16의 LCDR3 부위, 및 더 나아가 서열번호 17의 VH 및 서열번호 16의 VL을 포함하고, 또는
b) 서열번호 22의 HCDR1 부위, 서열번호 23의 HCDR2 부위, 서열번호 24의 HCDR3 부위, 서열번호 25의 LCDR1 부위, 서열번호 26의 LCDR2 부위 및 서열번호 27의 LCDR3 부위, 및 더 나아가 서열번호 28의 VH 및 서열번호 29의 VL을 포함하고, 또는
c) 서열번호 33의 HCDR1 부위, 서열번호 34의 HCDR2 부위, 서열번호 35의 HCDR3 부위, 서열번호 36의 LCDR1 부위, 서열번호 37의 LCDR2 부위 및 서열번호 38의 LCDR3 부위, 및 더 나아가 서열번호 39의 VH 및 서열번호 40의 VL을 포함하고, 또는
d) 서열번호 44의 HCDR1 부위, 서열번호 45의 HCDR2 부위, 서열번호 46의 HCDR3 부위, 서열번호 47의 LCDR1 부위, 서열번호 48의 LCDR2 부위 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 부위 및 더 나아가 서열번호 50의 VH 및 서열번호 51의 VL을 포함한다.
한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 단일클론 인간 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 단편은 Fab, Fab', Fv, scFv 로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 실시 예에서, 항체 단편은 Fab이다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 11의 HCDR1 부위, 서열번호 12의 HCDR2 부위, 서열번호 13의 HCDR3 부위, 서열번호 14의 LCDR1 부위, 서열번호 15의 LCDR2 부위 및 서열번호 16의 LCDR3 부위를 포함한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 22의 HCDR1 부위, 서열번호 23의 HCDR2 부위, 서열번호 24의 HCDR3 부위, 서열번호 25의 LCDR1 부위, 서열번호 26의 LCDR2 부위 및 서열번호 27의 LCDR3 부위를 포함한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 33의 HCDR1 부위, 서열번호 34의 HCDR2 부위, 서열번호 35의 HCDR3 부위, 서열번호 36의 LCDR1 부위, 서열번호 37의 LCDR2 부위 및 서열번호 38의 LCDR3 부위를 포함한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 44의 HCDR1 부위, 서열번호 45의 HCDR2 부위, 서열번호 46의 HCDR3 부위, 서열번호 47의 LCDR1 부위, 서열번호 48의 LCDR2 부위 및 서열번호 49의 LCDR3 부위를 포함한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은
a) 서열번호 17의 VH 및 서열번호 18의 VL 또는
b) 서열번호 28의 VH 및 서열번호 29의 VL 또는
c) 서열번호 39의 VH 및 서열번호 40의 VL 또는
d) 서열번호 50의 VH 및 서열번호 51의 VL 또는
서열번호 17, 28, 39 또는 50의 VH 및 서열번호 18, 29, 40 또는 51의 VL과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90, 또는 적어도 95% 상동성을 갖는 VH 및 VL을 포함한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은
a) 서열번호 17의 VH 및 서열번호 18의 VL 또는
b) 서열번호 28의 VH 및 서열번호 29의 VL 또는
c) 서열번호 39의 VH 및 서열번호 40의 VL 또는
d) 서열번호 50의 VH 및 서열번호 51의 VL을 포함한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 17의 VH 및 서열번호 18의 VL을 포함하거나 또는 이들 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상동성을 가지나 상기 항체 또는 항체 단편과 똑같은 활성을 유지하고 있는 서열을 포함한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 17의 VH 및 서열번호 18의 VL을 포함한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 28의 VH 및 서열번호 29의 VL을 포함하거나 또는 이들 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상동성을 가지나 상기 항체 또는 항체 단편과 똑같은 활성을 유지하고 있는 서열을 포함한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 28의 VH 및 서열번호 29의 VL을 포함한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 39의 VH 및 서열번호 40의 VL을 포함하거나 또는 이들 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상동성을 가지나 상기 항체 또는 항체 단편과 똑같은 활성을 유지하고 있는 서열을 포함한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 39의 VH 및 서열번호 40의 VL을 포함한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 50의 VH 및 서열번호 51의 VL을 포함하거나 또는 이들 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상동성을 가지나 상기 항체 또는 항체 단편과 똑같은 활성을 유지하고 있는서열을 포함하고 있다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 50의 VH 및 서열번호 51의 VL을 포함한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 20의 HC 및 서열번호 19의 LC를 포함하거나 또는 이들 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상동성을 가지나 상기 항체 또는 항체 단편과 똑같은 활성을 유지하고 있는 서열을 포함한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 20의 HC 및 서열번호 19의 LC를 포함한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 20의 HC 및 서열번호 19의 LC로 구성된다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 21의 HC 및 서열번호 19의 LC를 포함하거나 또는 이들 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상동성을 가지나 상기 항체 또는 항체 단편과 똑같은 활성을 유지하고 있는 서열을 포함한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 21의 HC 및 서열번호 19의 LC를 포함한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 21의 HC 및 서열번호 19의 LC로 구성된다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 31의 HC 및 서열번호 30의 LC를 포함하거나 또는 이들 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상동성을 가지나 상기 항체 또는 항체 단편과 똑같은 활성을 유지하고 있는 서열을 포함한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 31의 HC 및 서열번호 30의 LC를 포함한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 31의 HC 및 서열번호 30의 LC로 구성된다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 32의 HC 및 서열번호 30의 LC를 포함하거나 또는 이들 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상동성을 가지나 상기 항체 또는 항체 단편과 똑같은 활성을 유지하고 있는 서열을 포함한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 32의 HC 및 서열번호 30의 LC를 포함한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 32의 HC 및 서열번호 30의 LC로 구성된다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 42의 HC 및 서열번호 41의 경 쇄 LC를 포함하거나 또는 이들 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상동성을 가지나 상기 항체 또는 항체 단편과 똑같은 활성을 유지하고 있는 서열을 포함한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 42의 HC 및 서열번호 41의 경 쇄 LC를 포함한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 42의 HC 및 서열번호 41의 경 쇄 LC로 구성된다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 43의 HC 및 서열번호 41의 LC를 포함하거나 또는 이들 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상동성을 가지나 상기 항체 또는 항체 단편과 똑같은 활성을 유지하고 있는 서열을 포함한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 43의 HC 및 서열번호 41의 LC를 포함한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 43의 HC 및 서열번호 41의 LC로 구성된다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 53의 HC 및 서열번호 52의 LC를 포함하거나 또는 이들 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상동성을 가지나 상기 항체 또는 항체 단편과 똑같은 활성을 유지하고 있는 서열을 포함한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 53의 HC 및 서열번호 52의 LC를 포함한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 53의 HC 및 서열번호 52의 LC로 구성된다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 54의 HC 및 서열번호 52의 LC를 포함하거나 또는 이들 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상동성을 가지나 상기 항체 또는 항체 단편과 똑같은 활성을 유지하고 있는 서열을 포함한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 54의 HC 및 서열번호 52의 LC를 포함한다. 한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 54의 HC 및 서열번호 52의 LC로 구성된다.
더 나아간 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 하기를 포함한다:
a) 서열번호 20의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
b) 서열번호 21의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
c) 서열번호 31의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
d) 서열번호 32의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
e) 서열번호 42의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
f) 서열번호 43의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
g) 서열번호 53의 HC 및 서열번호 52의 LC 또는
h) 서열번호 54의 HC 및 서열번호 52의 LC.
한 실시 예에서, 상기 언급된 GPVI 에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 분리된 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 단일클론 인간 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 Fab, Fab', Fv, scFv로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 실시 예에서, 상기 항체 단편은 Fab이다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 인간 중 쇄 고정 부위 및 인간 경 쇄 고정 부위를 포함한다.
형식 (Formats)
어떤 특정 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 단일클론 항체 또는 항체 단편이다.
현 공개의 한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 인간, 인간화된, 키메릭 또는 합성 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 또는 인간화된 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 키메릭 항체 또는 항체 단편이다.
현 공개의 한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 인간, 인간화된, 키메릭 또는 합성 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 또는 인간화된 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 키메릭 항체 또는 항체 단편이다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 재조합 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 분리된 항체 또는 항체 단편이다. 더 나아간 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 분리된 재조합 항체 또는 항체 단편이다. 더 나아간 실시 예에서, 상기 분리된 재조합 인간 항체 또는 항체 단편은 분리된 재조합 인간 항체 또는 힝체 단편이다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편이다.
한 실시 예에서, 상기 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 IgG이다. 다른 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 IgG1 아이소타입 (isotype)이다.
한 실시 예에서, 현 공개의 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편은 전장-항체, scFv, Fv, Fab 및 Fab'로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 단편은 Fab이다.
핵산-벡터-세포
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열들을 포함하는 핵산 조성물과 관련이 있으며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 11의 HCDR1 부위, 서열번호 12의 HCDR2 부위, 서열번호 13의 HCDR3 부위, 서열번호 14의 LCDR1 부위, 서열번호 15의 LCDR2 부위 및 서열번호 16의 LCDR3 부위, 또는
b) 서열번호 22의 HCDR1 부위, 서열번호 23의 HCDR2 부위, 서열번호 24의 HCDR3 부위, 서열번호 25의 LCDR1 부위, 서열번호 26의 LCDR2 부위 및 서열번호 27의 LCDR3 부위, 또는
c) 서열번호 33의 HCDR1 부위, 서열번호 34의 HCDR2 부위, 서열번호 35의 HCDR3 부위, 서열번호 36의 LCDR1 부위, 서열번호 37의 LCDR2 부위 및 서열번호 38의 LCDR3 부위, 또는
d) 서열번호 44의 HCDR1 부위, 서열번호 45의 HCDR2 부위, 서열번호 46의 HCDR3 부위, 서열번호 47의 LCDR1 부위, 서열번호 48의 LCDR2 부위 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 부위를 포함한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편의 중 쇄 서열 및/또는 경 쇄 서열을 암호화하는 하나의 분리된 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열들과 괸련있으며, 이 핵산은 하기를 포함한다:
a) 서열번호 55의 HCDR1 부위, 서열번호 56의 HCDR2 부위, 서열번호 57의 HCDR3 부위, 서열번호 58의 LCDR1 부위, 서열번호 59의 LCDR2 부위 및 서열번호 60의 LCDR3 부위, 또는
b) 서열번호 66의 HCDR1 부위, 서열번호 67의 HCDR2 부위, 서열번호 68의 HCDR3 부위, 서열번호 69의 LCDR1 부위, 서열번호 70의 LCDR2 부위 및 서열번호 71의 LCDR3 부위, 또는
c) 서열번호 77의 HCDR1 부위, 서열번호 78의 HCDR2 부위, 서열번호 79의 HCDR3 부위, 서열번호 80의 LCDR1 부위, 서열번호 81의 LCDR2 부위 및 서열번호 82의 LCDR3 부위, 또는
d) 서열번호 88의 HCDR1 부위, 서열번호 89의 HCDR2 부위, 서열번호 90의 HCDR3 부위, 서열번호 91의 LCDR1 부위, 서열번호 92의 LCDR2 부위 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 부위.
다른 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편의 중 쇄 서열 및/또는 경 쇄 서열을 암호화하는 하나의 분리된 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열들과 관련 있으며, 이 핵산은 하기를 포함한다:
a) 서열번호 55의 핵산 서열을 포함하는 HCDR1 부위, 서열번호 56의 핵산 서열을 포함하는 HCDR2부위, 서열번호 57의 핵산 서열을 포함하는 HCDR3 부위, 서열번호 58의 핵산 서열을 포함하는 LCDR1 부위, 서열번호 59의 핵산 서열을 포함하는 LCDR2 부위, 서열번호 60의 핵산 서열을 포함하는 LCDR3 부위, 또는
b) 서열번호 66의 핵산 서열을 포함하는 HCDR1 부위, 서열번호 67의 핵산 서열을 포함하는 HCDR2 부위, 서열번호 68의 핵산 서열을 포함하는 HCDR3 부위, 서열번호 69의 핵산 서열을 포함하는 LCDR1 부위, 서열번호 70의 핵산 서열을 포함하는 LCDR2 부위, 서열번호 71의 핵산 서열을 포함하는 LCDR3 부위, 또는
c) 서열번호 77의 핵산 서열을 포함하는 HCDR1 부위, 서열번호 78의 핵산 서열을 포함하는 HCDR2 부위, 서열번호 79의 핵산 서열을 포함하는 HCDR3 부위, 서열번호 80의 핵산 서열을 포함하는 LCDR1 부위, 서열번호 81의 핵산 서열을 포함하는 LCDR2 부위, 서열번호 82의 핵산 서열을 포함하는 LCDR3 부위, 또는
d) 서열번호 88의 핵산 서열을 포함하는 HCDR1 부위, 서열번호 89의 핵산 서열을 포함하는 HCDR2 부위, 서열번호 90의 핵산 서열을 포함하는 HCDR3 부위, 서열번호 91의 핵산 서열을 포함하는 LCDR1 부위, 서열번호 92의 핵산 서열을 포함하는 LCDR2 부위, 서열번호 93의 핵산 서열을 포함하는 LCDR3 부위.
다른 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열에 관련되며, 여기서 그 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열들은 서열번호 61의 VH 및/또는 서열번호 62의 VL를 포함하거나, 또는 서열번호 61의 VH 및/또는 서열번호 62의 VL과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상동성을 가진 VH 및 VL을 포함한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열에 관련되며, 여기서 그 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열들은 서열번호 72의 VH 및/또는 서열번호 73의 VL를 포함하거나, 또는 서열번호 72의 VH 및/또는 서열번호 73의 VL과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상동성을 가진 VH 및 VL을 포함한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열에 관련되며, 여기서 그 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열들은 서열번호 83의 VH 및/또는 서열번호 84의 VL를 포함하거나, 또는 서열번호 83의 VH 부위 및/또는 서열번호 84의 VL과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상동성을 가진 VH 및 VL을 포함한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열에 관련되며, 여기서 그 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열들은 서열번호 94의 VH 및/또는 서열번호 95의 VL를 포함하거나, 또는 서열번호 94의 VH 부위 및/또는 서열번호 95의 VL과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상동성을 가진 VH 및 VL을 포함한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열에 관련되며, 여기서 그 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열들은 서열번호 64의 HC 및/또 서열번호 63의 LC를 포함한다. 다른 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열에 관련되며, 여기서 그 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열들은 서열번호 65의 HC 및/또 서열번호 63의 LC를 포함한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열에 관련되며, 여기서 그 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열들은 서열번호 75의 HC 및/또 서열번호 74의 LC를 포함한다. 다른 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열에 관련되며, 여기서 그 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열들은 서열번호 76의 HC 및/또 서열번호 74의 LC를 포함한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열에 관련되며, 여기서 그 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열들은 서열번호 86의 HC 및/또 서열번호 85의 LC를 포함한다. 다른 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열에 관련되며, 여기서 그 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열들은 서열번호 87의 HC 및/또 서열번호 85의 LC를 포함한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열에 관련되며, 여기서 그 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열들은 서열번호 97의 HC 및/또 서열번호 96의 LC를 포함한다. 다른 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열에 관련되며, 여기서 그 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열들은 서열번호 98의 HC 및/또 서열번호 96의 LC를 포함한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열에 관련되며, 여기서 그 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열들은 표 1-4에 공개된 항체들 중 어느 하나의 VH 및/또는 VL을 포함한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 표 1-4에 공개된 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열들 중 어느 하나에 의해 암호화되는, GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 제공한다.
어떤 특정 실시 예에서, 표 1-4에 공개된 항체 또는 항체 단편 중 어느 하나를 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 제공한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적으로 결합하는 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 제공한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열에 관여하며 여기서 이 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열은 표 1-4에 공개된 항체 또는 항체 단편 중 어느 하나의 HC 및/또는 LC를 포함한다.
벡터 (Vectors)
한 실시 예에서, 현 공개는 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 하나의 벡터 또는 복수의 벡터을 포함하는 벡터 조성물에 괸련된 것이다.
한 실시 예에서, 현 공개는 표 1-4 에 공개된 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 하나의 벡터 또는 복수의 벡터을 포함하는 벡터 조성물에 괸련된 것이다.
한 실시 예에서, 현 공개는 표 1-4 에 공개된 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 하나의 벡터 또는 복수의 벡터를 포함하는 벡터 조성물에 관련된 것이다.
한 실시 예에서, 현 공개는 현 공개에 따른, GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 포함하는 하나의 벡터를 포함하는 벡터 조성물을 제공한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 표 1-4에 공개된 하나의 핵산을 포함하는 하나의 벡터를 제공한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 표 1-4에 공개된 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산을 포함하는 하나의 벡터를 제공한다.
숙주 세포 (Host cell)
한 실시 예에서, 현 공개는 현 공개에 따른, GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열들을 포함하는 하나의 벡터 또는 복수의 벡터를 포함하는 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포에 관련된 것이다.
한 실시 예에서, 현 공개는 표 1-4에 공개된 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 하나의 벡터 또는 복수의 벡터를 포함하는 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포에 괸련된 것이다.
한 실시 예에서, 현 공개는 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 하나의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 현 공개의 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 표 1-4에 공개된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 분리된 숙주 세포를 제공한다.
한 실시 예에서, 상기 숙주 세포는 벡터에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 더 나아간 실시 예에서, 상기 숙주 세포는 분리된 세포다. 더 나아간 실시 예에서, 상기 숙주 세포는 포유류 세포다. 한 실시 예에서, 상기 포유류 세포는 인간 세포다. 다른 실시 예에서, 포유류 세포는 CHO 세포다.
현 공개의 어떤 특정 실시 예에서, 예를 들어, 발현 또는 정제를 돕기 위하여 또는 현 공개의 Fab의 안정성을 증가시키기 위하여 추가의 아미노산 잔기, 폴리펩티드 또는 잔기가 현 공개의 항체 또는 항체 단편에 첨가된다.
현 공개의 항체 또는 항체 단편의 중 쇄 및 경 쇄의 코딩 서열은 재조합 DNA 분자가 될 수 있으며, 이는 이 DNA를 유전자 발현에 요구되는 필요한 발현 조절 부위 (예를 들어, 조정 부위)에 작동적으로 연결시켜 발현 벡터에 도입된다. 전문가는 중 쇄 및 경 쇄를 암호화하는 폴리펩티드는 다른 벡터 또는 같은 벡터에 클론 될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 바람직한 실시 예에서, 상기 폴리펩티드는 같은 벡터에 클론 된다. 벡터는 비진핵 세포 (예를 들어, 박테리아) 또는 진핵 세포 (예를 들어, 이스트 또는 포유류) 와 같은 적절한 숙주 세포에 이 분야 기술에서 잘 알려진 방법에 의해 도입시킬 수 있다 ((예를 들어, "Current Protocol in Molecular Biology", Ausubel et al. (eds.), Greene Publishing Assoc. and John Wiley Interscience, New York, 1989 and 1992) 참조)). 여러 수많은 클로닝 벡터가 이 분야 전문가들에게는 잘 알려졌으며, 및 적절한 클로닝 벡터의 선택은 선택의 문제이다. 유전자는 프로모터, 리보좀 결합 부위 (박테리아 발현) 및 선택적으로 작동자의 조절하에 놓일 수 있어 ((총체적으로 여기서 "조절 (control)"요소라고 불린다)), 원하는 단백질을 암화화하는 DNA 서열은 이 발현 구조체를 함유하는 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포에서 RNA로 전사된다. 코딩 서열은 신호 펩티드 (signal peptide) 또는 리더 서열 (leader sequence)을 함유할 수도 또는 함유하지 않을 수도 있다. 숙주 세포에서 발현 시, 현 공개의 항체 또는 항체 단편이 얻어진다. 이 단계는, 이 분야 기술 전문가들에게 알려진 대로 여러 가지 다른 방법으로 달성될 수 있다. 일반적으로, 그러한 단계는 전형적으로 적절한 숙주 세포를 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 또는 벡터 또는 감염 입자로 형질 전환 또는 형질 감염시키는 것을 포함한다. 더 나아가, 그러한 단계는 상기 숙주 세포가 증식하기에 (증식, 성장) 적절한 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 것 및 암호화된 항체 또는 항체 단편을 생산하기에 적절한 조건하에서 배양하는 단계를 포함한다. 증식 또는 발현에 적합한 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 것은 전형적으로 세포의 성장 및 발현 유도에 적절한 성분을 포함하는 배지 존재하에서 성취된다. 특정한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편의 생산을 위한 방법은 더 나아가 생산된 항체 또는 항체 단편을 숙주 세포 또는 배지로부터 분리하는 단계를 포함한다. 발현 시스템 및 선책 된 숙주에 따라, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 상기 서술된 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 관심 있는 단백질이 발현되는 조건하에서 길러 생산된다. 그 후 단백질은 숙주 세포로부터 분리되고 및 정제된다. 만약 발현 시스템이 단백질을 성장 배지로 분비한다면, 단백질은 배지로부터 직접 정제될 수 있다. 만약 단백질이 분비되지 않는다면, 세포 용해물로부터 분리되거나 또는 세포막 분획으로부터 회수될 수 있다. 적절한 성장 조건의 선택 및 회수 방법은 이 분야 기술 내에 있다. 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 그 후 이 분야 기술 전문가에게 알려진 여러 기술로 정제될 수 있다.
결합 (Binding)
한 실시 예에서, 현 공개는 인간 GPVI에 특이적인 분리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
한 실시 예에서, 현 공개는 아미노산 서열 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 5 및/또는 서열번호 6을 포함하는 인간 GPVI의 동형단백질(isoform) 및 일배체 (haplotype)에 특이적인 분리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다. 한 실시 예에서, 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열에 의해 암호화되는 인간 GPVI에 특이적이다. 한 실시 예에서, 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편은 서열번호 4, 서열번호 5 및/또는 서열번호 6의 아미노산 서열에 의해 암호화되는 인간 GPVI의 세포 외 도메인에 특이적이다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적이다. 한 실시 예에서, 현 공개는 서열번호 1에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 특이적인 항체 또는 항체 단편에 관련된다. 한 실시 예에서, 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 5 및/또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적인 상기 항체 또는 항체 단편은 단일 클론 항체이다. 더 나아간 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 항체 또는 항체 단편이다.
한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 GPVI의 세포 외 도메인에 결합한다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI의 세포 외 도메인의 D1 도메인에 결합한다. 다른 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI의 세포 외 도메인의 D2 도메인에 결합한다.
현 공개의 항체 또는 항체 단편은 시아노몰거스 원숭이 GPVI 및, 생쥐 (mouse) 또는 쥐 (rat)의 GPVI와 같은, 설치류 GPVI에 교차-반응한다. 한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은, 생쥐, 쥐 및/또는 시아노몰거스 원숭이와 같은 다른 종의 GPVI과 교차-반응한다. 한 실시 예에서, 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI, 생쥐 GPVI 및 쥐 GPVI에 특이적이다. 한 실시 예에서, 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편은 시아노몰거스 원숭이 GPVI에 특이적이다. 한 실시 예에서, 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편은 생쥐 GPVI에 특이적이다. 한 실시 예에서, 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편은 쥐 GPVI에 특이적이다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI 및 생쥐 GPVI에 특이적이다. 한 실시 예에서, 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI, 및 생쥐 GPVI에 특이적이다. 이 공개는 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI 및 시아노몰거스 원숭이 GPVI에 결합한다. 한 실시 예에서, 상기 설치류 GPVI는 생쥐 및 쥐 GPVI이다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 항체 또는 항체 단편에 관련된 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI에, 시아노몰거스 원숭이 GPVI에, 생쥐 GPVI에 및 쥐 GPVI에 결합한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI, 생쥐 GPVI 및 쥐 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 11의 HCDR1 부위, 서열번호 12의 HCDR2 부위, 서열번호 13의 HCDR3 부위, 서열번호 14의 LCDR1 부위, 서열번호 15의 LCDR2 부위 및 서열번호 16의 LCDR3 부위, 또는
b) 서열번호 22의 HCDR1 부위, 서열번호 23의 HCDR2 부위, 서열번호 24의 HCDR3 부위, 서열번호 25의 LCDR1 부위, 서열번호 26의 LCDR2 부위 및 서열번호 27의 LCDR3 부위, 또는
c) 서열번호 33의 HCDR1 부위, 서열번호 34의 HCDR2 부위, 서열번호 35의 HCDR3 부위, 서열번호 36의 LCDR1 부위, 서열번호 37의 LCDR2 부위 및 서열번호 38의 LCDR3 부위, 또는
d) 서열번호 44의 HCDR1 부위, 서열번호 45의 HCDR2 부위, 서열번호 46의 HCDR3 부위, 서열번호 47의 LCDR1 부위, 서열번호 48의 LCDR2 부위 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 부위를 포함한다.
더 나아간 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 17의 VH 및 서열번호 18의 VL 또는
b) 서열번호 28의 VH 및 서열번호 29의 VL 또는
c) 서열번호 39의 VH 및 서열번호 40의 VL 또는
d) 서열번호 50의 VH 및 서열번호 51의 VL 또는
서열번호 17, 28, 39 또는 50의 VH 및 서열번호 18, 29, 40 또는 51의 VL과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90, 또는 적어도 95% 상동성을 갖는 VH 및 VL을 포함한다.
더 나아간 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 20의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
b) 서열번호 21의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
c) 서열번호 31의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
d) 서열번호 32의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
e) 서열번호 42의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
f) 서열번호 43의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
g) 서열번호 53의 HC 및 서열번호 52의 LC 또는
h) 서열번호 54의 HC 및 서열번호 52의 LC 를 포함한다.
한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편은 scFv, Fv, Fab 및 Fab'로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편은 Fab 이다.
친화력 (Affinity)
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 항체 및 항체 단편에 관련된 것이고, 여기서 상기 항체 및 항체 단편은 GPVI에 대한 단일가 친화력은 해리 비율 항수 (dissociation rate constant)(KD) 5x10-2M 미만, 1x10-2M 미만, 5x10-3M 미만, 1x10-3M 미만, 5x10-4M 미만, 1x10-4M 미만, 5x10-5M 미만, 1x10-5M 미만, 5x10-6M 미만, 1x10-6M 미만, 5x10-7M 미만, 1x10-7M 미만, 5x10-8M 미만, 1x10-8M 미만, 5x10-9M 미만, 1x10-9M 미만, 5x10-10M 미만, 1x10-10M 미만, 5x10-11M 미만, 1x10-11M 미만, 5x10-12M 미만, 1x10-12M 미만, 5x10-13M 미만, 1x10-13M 미만, 5x10-14M 미만, 1x10-14M 미만, 5x10-15M 미만, 또는 1x10-15M 미만으로 가진다.
어떤 특정 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 항체 및 항체 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 및 항체 단편은 GPVI에 대한 단일가 친화력은 해리 비율 항수 (KD)1x10-7M, 1x10-8M, 1x10-9M, 1x10-10M, 1x10-11M, 1x10-12M 또는 1x10-13M 미만으로 가진다.
어떤 특정 실시 예에서, 현 공개는 표 1-4에 공개된 GPVI에 특이적인 항체 및 항체 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 및 항체 단편은 GPVI에 단일가 친화력 10 nM 또는 그 미만으로 결합하며, 좀 더 바람직하게, 1 nM 또는 그 미만으로, 및 아직 더 바람직하게는 0.5 nM 또는 그 미만으로 결합한다.
더 나아간 실시 예에서, 현 공개는 인간 GPVI에 단일가 친화력 70 pM 또는 그 미만으로 결합하는 분리된 항체 또는 항체 단편에 관련된 것이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 시아노몰거스 원숭이 GPVI에 단일가 친화력 90 pM 또는 그 미만으로 결합한다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI 및 시아노몰거스 원숭이 GPVI에 단일가 친화력 100 pM 또는 그 미만으로 결합한다.
아직 더 나아간 실시 예에서, 현 공개는 생쥐 GPVI에 단일가 친화력 30 pM 또는 그 미만으로, 바람직하게는 9 nM 또는 그 미만, 바람직하게는 1 nM 또는 그 미만으로 결합하는 분리된 항체 또는 항체 단편에 관련된 것이다. 아직 더 나아간 실시 예에서, 현 공개는 인간 및 시아노몰거스 원숭이 GPVI에 단일가 친화력 100 pM 또는 그 미만 및 생쥐 GPVI에 단일가 친화력 9000 pM 또는 그 미만, 바람직하게는 1000 pM 또는 그 미만으로 결합하는 분리된 항체 또는 항체 단편에 관련된 것이다.
더 나아간 실시 예에서, 현 공개는 인간 GPVI에 단일가 친화력 100 pM 또는 그 미만 및 생쥐 GPVI에 단일가 친화력 1000 pM 또는 그 미만으로 결합하는 현 공개에 따른 항체 및 항체 단편에 관련된 것이다. 실시 예에서, 상기 단일가 친화력은 Fab 포멧 (Fab format)에서 결정된다.
한 실시 예에서, 상기 분리된 항체 또는 항체 단편의 단일가 친화력은 여기 실시 예시 5 에서 서술된 대로 용해성 GPVI를 사용하여 용액 평형 적정 (Solution Equilibrium Titration) (SET)으로 결정된다.
한 실시 예에서, GPVI 특이적인 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 11의 HCDR1 부위, 서열번호 12의 HCDR2 부위, 서열번호 13의 HCDR3 부위, 서열번호 14의 LCDR1 부위, 서열번호 15의 LCDR2 부위 및 서열번호 16의 LCDR3 부위, 또는
b) 서열번호 22의 HCDR1 부위, 서열번호 23의 HCDR2 부위, 서열번호 24의 HCDR3 부위, 서열번호 25의 LCDR1 부위, 서열번호 26의 LCDR2 부위 및 서열번호 27의 LCDR3 부위, 또는
c) 서열번호 33의 HCDR1 부위, 서열번호 34의 HCDR2 부위, 서열번호 35의 HCDR3 부위, 서열번호 36의 LCDR1 부위, 서열번호 37의 LCDR2 부위 및 서열번호 38의 LCDR3 부위, 또는
d) 서열번호 44의 HCDR1 부위, 서열번호 45의 HCDR2 부위, 서열번호 46의 HCDR3 부위, 서열번호 47의 LCDR1 부위, 서열번호 48의 LCDR2 부위 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 부위를 포함한다.
더 나아간 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 17의 VH 및 서열번호 18의 VL 또는
b) 서열번호 28의 VH 및 서열번호 29의 VL 또는
c) 서열번호 39의 VH 및 서열번호 40의 VL 또는
d) 서열번호 50의 VH 및 서열번호 51의 VL 또는
서열번호 17, 28, 39 또는 50의 VH 및 서열번호 18, 29, 40 또는 51의 VL과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90, 또는 적어도 95% 상동성을 갖는 VH 및 VL을 포함한다.
더 나아간 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 20의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
b) 서열번호 21의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
c) 서열번호 31의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
d) 서열번호 32의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
e) 서열번호 42의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
f) 서열번호 43의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
g) 서열번호 53의 HC 및 서열번호 52의 LC 또는
h) 서열번호 54의 HC 및 서열번호 52의 LC를 포함한다.
한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 항체 또는 항체 단편이다, 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편은 scFv, Fv, Fab 및 Fab'로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편은 Fab 이다.
어떤 특정 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 항체 또는 항체 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 ELISA 에세이로 결정된 대로 GPVI에 EC50 농도 60 nM 또는 그 미만, 50 nM 또는 그 미만, 40 nM 또는 그 미만, 30 nM 또는 그 미만, 20 nM 또는 그 미만, 10 nM 또는 그 미만, 5 nM 또는 그 미만, 1 nM 또는 그 미만, 0.9 nM 또는 그 미만, 0.8 nM 또는 그 미만, 0.7 nM 또는 그 미만, 0.6 nM 또는 그 미만, 0.5 nM 또는 그 미만, 0.4 nM 또는 그 미만, 0.4 nM 또는 그 미만, 0.2 nM 또는 그 미만, 0.1 nM 또는 그 미만으로 결합한다.
어떤 특정 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 항체 또는 항체 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 ELISA 에세이로 결정되었을 때 인간 GPVI에, 시아노몰거스 원숭이 GPVI에, 및 생쥐 GPVI에 EC50 농도 10 nM 또는 그 미만으로 결합한다. 어떤 특정 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 항체 또는 항체 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 ELISA 에세이로 결정되었을 때 인간 GPVI 및 시아노몰거스 원숭이 GPVI에 EC50 농도 1 nM로, 생쥐 GPVI에 EC50 농도 10 nM 또는 그 미만으로 및 쥐 GPVI에 EC50 농도 60 nM 또는 그 미만으로 결합한다. 바람직한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 항체 또는 항체 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 ELISA 에세이로 결정 되었을 때 인간 GPVI 및 시아노몰거스 원숭이 GPVI에 EC50 농도 1 nM로, 생쥐 GPVI에 EC50 농도 5 nM 또는 그 미만으로 및 쥐 GPVI에 EC50 농도 20 nM 또는 그 미만으로 결합한다. 어떤 특정 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 항체 또는 항체 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 ELISA 에세이로 결정 되었을 때 인간 GPVI에, 시아노몰거스 원숭이 GPVI에, 생쥐 GPVI에, 및 쥐 GPVI에 EC50 농도 16 nM 또는 그 미만으로 결합한다. 어떤 특정 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 항체 또는 항체 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 ELISA 에세이로 결정되었을 때 인간 GPVI에, 시아노몰거스 원숭이 GPVI에, 생쥐 GPVI에, 및 쥐 GPVI에 EC50 농도 16 nM 또는 그 미만으로 결합한다. 어떤 특정 실시 예에서, 현 공개는, GPVI에 특이적인, 분리된 항체 또는 항체 단편을 제공하며, 이는 ELISA 에세이로 결정되었을 때 인간 GPVI에, 시아노몰거스 원숭이 GPVI에 및 생쥐 GPVI에 EC50 2 nM 또는 그 미만으로 특별하게 결합한다.
더 나아간 실시 예에서, 상기 GPVI는 플레이트 (plate)의 표면에 코트 된다.
한 실시 예에서, 상기 EC50 농도는 여기 실시예시 3 에서 서술된 대로 용해성 GPVI/Fc를 사용하여 ELISA 에세이로 결정된다.
한 실시 예에서, GPVI에 특이적인 상기 항체 및 항체 단편은:
a) 서열번호 11의 HCDR1 부위, 서열번호 12의 HCDR2 부위, 서열번호 13의 HCDR3 부위, 서열번호 14의 LCDR1 부위, 서열번호 15의 LCDR2 부위 및 서열번호 16의 LCDR3 부위, 또는
b) 서열번호 22의 HCDR1 부위, 서열번호 23의 HCDR2 부위, 서열번호 24의 HCDR3 부위, 서열번호 25의 LCDR1 부위, 서열번호 26의 LCDR2 부위 및 서열번호 27의 LCDR3 부위, 또는
c) 서열번호 33의 HCDR1 부위, 서열번호 34의 HCDR2 부위, 서열번호 35의 HCDR3 부위, 서열번호 36의 LCDR1 부위, 서열번호 37의 LCDR2 부위 및 서열번호 38의 LCDR3 부위, 또는
d) 서열번호 44의 HCDR1 부위, 서열번호 45의 HCDR2 부위, 서열번호 46의 HCDR3 부위, 서열번호 47의 LCDR1 부위, 서열번호 48의 LCDR2 부위 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 부위를 포함한다.
더 나아간 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 17의 VH 및 서열번호 18의 VL 또는
b) 서열번호 28의 VH 및 서열번호 29의 VL 또는
c) 서열번호 39의 VH 및 서열번호 40의 VL 또는
d) 서열번호 50의 VH 및 서열번호 51의 VL 또는
서열번호 17, 28, 39 또는 50의 VH 및 서열번호 18, 29, 40 또는 51의 VL과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90, 또는 적어도 95% 상동성을 갖는 VH 및 VL을 포함한다.
더 나아간 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 20의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
b) 서열번호 21의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
c) 서열번호 31의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
d) 서열번호 32의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
e) 서열번호 42의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
f) 서열번호 43의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
g) 서열번호 53의 HC 및 서열번호 52의 LC 또는
h) 서열번호 54의 HC 및 서열번호 52의 LC를 포함한다.
한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 항체 또는 항체 단편이다, 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편은 scFv, Fv, Fab 및 Fab'로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편은 Fab 이다.
어떤 특정 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 항체 또는 항체 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 세포-ELISA (Cell-ELISA) 에세이로 결정된 대로 GPVI에 EC50 농도 15 nM 또는 그 미만, 14 nM 또는 그 미만, 13 nM 또는 그 미만, 12 nM 또는 그 미만, 11 nM 또는 그 미만, 10 nM 또는 그 미만, 9 nM 또는 그 미만, 8 nM 또는 그 미만, 7 nM 또는 그 미만, 6 nM 또는 그 미만, 5 nM 또는 그 미만, 4 nM 또는 그 미만, 3 nM 또는 그 미만, 2 nM 또는 그 미만, 1 nM 또는 그 미만, 0.9 nM 또는 그 미만, 0.8 nM 또는 그 미만, 0.7 nM 또는 그 미만, 0.6 nM 또는 그 미만, 0.5 nM 또는 그 미만, 0.4 nM 또는 그 미만, 0.4 nM 또는 그 미만, 02 nM 또는 그 미만, 0.1 nM 또는 그 미만으로 결합한다.
한 실시 예에서, 상기 EC50 농도는 여기 실시예시 4 에서 서술된 대로 세포-ELISA 에세이에서 결정된다.
어떤 특정 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 항체 또는 항체 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 세포-ELISA (Cell-ELISA) 에세이로 결정된 대로 인간 GPVI에, 시아노몰거스 원숭이 GPVI에 및 생쥐 GPVI에 EC50 농도 15 nM 또는 그 미만으로 결합하며, 바람직하게는 6 nM 또는 그 미만으로 결합한다.
어떤 특정 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 항체 또는 항체 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 세포-ELISA (Cell-ELISA) 에세이로 결정된 대로 인간 GPVI에 EC50 농도 1 nM 또는 그 미만으로 결합하며, 시아노몰거스 원숭이 GPVI에 EC50 농도 2 nM 또는 그 미만으로 결합하며 및 생쥐 GPVI에 EC50 농도 6 nM 또는 그 미만으로 결합한다. 어떤 특정 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 분리된 항체 또는 항체 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 세포-ELISA (Cell-ELISA) 에세이로 결정된 대로 생쥐 GPVI에 EC50 농도 15nM 또는 그 미만으로, 바람직하게는 6 nM 또는 그 미만으로 결합한다.
더 나아간 실시 예에서, 상기 GPVI은 세포의 표면에 존재한다. 더 나아간 실시 예에서, 상기 GPVI은 재조합 세포의 표면에 존재한다. 더 나아간 실시 예에서, 상기 GPVI은 혈소판 표면에 존재한다. 더 나아간 실시 예에서, 상기 GPVI은 인간, 시아노몰거스 원숭이 또는 생쥐 혈소판의 표면에 존재한다.
한 실시 예에서, 상기 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 11의 HCDR1 부위, 서열번호 12의 HCDR2 부위, 서열번호 13의 HCDR3 부위, 서열번호 14의 LCDR1 부위, 서열번호 15의 LCDR2 부위 및 서열번호 16의 LCDR3 부위, 또는
b) 서열번호 22의 HCDR1 부위, 서열번호 23의 HCDR2 부위, 서열번호 24의 HCDR3 부위, 서열번호 25의 LCDR1 부위, 서열번호 26의 LCDR2 부위 및 서열번호 27의 LCDR3 부위, 또는
c) 서열번호 33의 HCDR1 부위, 서열번호 34의 HCDR2 부위, 서열번호 35의 HCDR3 부위, 서열번호 36의 LCDR1 부위, 서열번호 37의 LCDR2 부위 및 서열번호 38의 LCDR3 부위, 또는
d) 서열번호 44의 HCDR1 부위, 서열번호 45의 HCDR2 부위, 서열번호 46의 HCDR3 부위, 서열번호 47의 LCDR1 부위, 서열번호 48의 LCDR2 부위 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 부위를 포함한다.
더 나아간 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 17의 VH 및 서열번호 18의 VL 또는
b) 서열번호 28의 VH 및 서열번호 29의 VL 또는
c) 서열번호 39의 VH 및 서열번호 40의 VL 또는
d) 서열번호 50의 VH 및 서열번호 51의 VL 또는
서열번호 17, 28, 39 또는 50의 VH 및 서열번호 18, 29, 40 또는 51의 VL과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90, 또는 적어도 95% 상동성을 갖는 VH 및 VL을 포함한다.
더 나아간 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 20의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
b) 서열번호 21의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
c) 서열번호 31의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
d) 서열번호 32의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
e) 서열번호 42의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
f) 서열번호 43의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
g) 서열번호 53의 HC 및 서열번호 52의 LC 또는
h) 서열번호 54의 HC 및 서열번호 52의 LC를 포함한다.
한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 항체 또는 항체 단편이다, 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편은 scFv, Fv, Fab 및 Fab'로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편은 Fab 이다. 한 실시 예에서, 상기 Fab는 인간 Fab 이다.
기능적 실시 예 (Functional embodiments)
일반적으로, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 GPVI 과 콜라겐 (collagen )사이의 상호작용을 방지 또는 억제하는데 사용될 수 있어, 이로써 GPVI에 의해서 매개 되는 신호 경로를 방지, 억제 또는 감소시키고 및/또는 GPVI이 관여하는 생물학적 경로 및 기전을 조정한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편에 관련되며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 GPVI-매개하는 산호전달을 특별하게 간섭할 수 있는 능력이 있다.
기능적 활성에 대한 에세이 방법은, 효소-연결된 면역흡착 에세이 (enzyme-linked immunosorbent assay) (ELISA), 방사성 면역에세이 (radioimmunoassay) (RIA), 형광 활성화된 세포 분류 (fluorescence activated cell sorting)(FACS) 및 이 분야 기술에서 잘 알려진 방법들과 같은 결합 에세이를 사용할 수 있다 ((Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN) and Maddox, D.E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216) 참조)). 다른 한편으로, 에세이는 현 공개의 항체 또는 항체 단편이, 생체 내에서 또는 시험관 내에서, GPV에 결합 결과로서 생물학적 반응을 끌어내는 능력을 검사할 수 있다. 그러한 에세이가 여기 서술된다. 다른 적절한 에세이는 이 분야 기술에 전문가들에게는 알려질 것이다. GPVI의 콜라겐에의 결합을 측정하는 방법은 특별한 방법에 제한되는 것은 아니며 및 다른 전통적인 방법에 의해 또한 수행될 수 있다.
한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 GPVI 활성에 길항한다 (antagonizes). 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 GPVI 활성을 중화한다 (neutralizes). 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 GPVI 신호 전달을 억제한다.
GPVI-콜라겐 결합 억제 (GPVI - Collagen binding inhibition)
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 GPVI의 콜라겐에의 결합을 억제할 수 있다. 한 실시 예에서, GPVI에 특이적인 상기 항체 또는 항체 단편은 GPVI의 콜라겐에의 결합을 억제한다. 실시 예들에서, 상기 GPVI는 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI, 및 생쥐 GPVI로 구성된 군으로부터 선택된다.
어떤 특정 실시 예에서, GPVI에 특이적인 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI, 또는 생쥐 GPVI의 콜라겐에의 결합을 억제한다.
한 실시 예에서, GPVI에 특이적인 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI, 및 생쥐 GPVI의 콜라겐에의 결합을 억제한다. 더 나아간 실시 예에서, GPVI에 특이적인 상기 항체 또는 항체 단편은 GPVI의 콜라겐에의 결합을 억제하며, 여기서 상기 GPVI는 생쥐 GPVI이다. 어떤 특정 실시 예에서, GPVI에 특이적인 상기 항체 또는 항체 단편은 GPVI의 콜라겐에의 결합을 억제하며, 여기서 상기 콜라겐은 인간 콜라겐, 쥐 대동맥 콜라겐, 토끼 대동맥 콜라겐 또는 시아노몰거스 원숭이 대동맥 콜라겐이다.
어떤 특정 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI 및 생쥐 GPVI의 콜라겐에의 결합을 IC50 농도 30 nM 미만, 20 nM 미만, 10 nM 미만, 9 nM 미만, 8 nM 미만, 7 nM 미만, 6 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 100 pM 미만, 90 pM 미만, 80 pM 미만, 70 pM 미만, 60 pM 미만, 50 pM 미만, 40 pM 미만, 30 pM 미만, 20 pM 미만, 10 pM 미만, 9 pM 미만, 8 pM 미만, 7 pM 미만, 6 pM 미만, 5 pM 미만, 4 pM 미만, 3 pM 미만, 2 pM 미만 또는 1 pM 미만으로 억제한다.
실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI 및 생쥐 GPVI의 콜라겐에의 결합을 IC50 농도 15 nM 또는 그 미만, 더욱이 더 바람직하게는 10 nM 또는 그 미만으로 억제한다. 어떤 특정 실시 예에서, GPVI에 특이적인 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI 및 생쥐 GPVI의 콜라겐에의 결합을 IC50 농도 10 nM 또는 그 미만으로 억제한다.
어떤 특정 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 생쥐 GPVI의 콜라겐에의 결합을 IC50 농도 30 nM 또는 그 미만, 바람직하게는 IC50 농도 15 nM 또는 그 미만, 바람직하게는 IC50 농도 10 nM 또는 그 미만으로 억제한다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI, 생쥐 GPVI 및 쥐 GPVI에 특별하게 결합하고 및 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI 및 생쥐 GPVI의 콜라겐에의 결합을 IC50 농도 30 nM 미만, 20 nM 미만, 10 nM 미만, 9 nM 미만, 8 nM 미만, 7 nM 미만, 6 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 100 pM 미만, 90 pM 미만, 80 pM 미만, 70 pM 미만, 60 pM 미만, 50 pM 미만, 40 pM 미만, 30 pM 미만, 20 pM 미만, 10 pM 미만, 9 pM 미만, 8 pM 미만, 7 pM 미만, 6 pM 미만, 5 pM 미만, 4 pM 미만, 3 pM 미만, 2 pM 미만 또는 1 pM 미만으로 억제한다.
더 나아간 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI, 생쥐 GPVI 및 쥐 GPVI에 특별하게 결합하고 및 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI 및 생쥐 GPVI의 콜라겐에의 결합을 IC50 농도 15 nM 또는 그 미만, 더 바람직하게는 IC50 농도 10 nM 또는 그 미만으로 억제한다. 다른 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 생쥐 GPVI 및 쥐 GPVI에 특이적으로 결합하고 및 생쥐 GPVI의 콜라겐에의 결합을 IC50 농도 15 nM 또는 그 미만, 바람직하게는 IC50 농도 10 nM 또는 그 미만으로 억제한다
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 GPVI의 콜라겐에의 결합을 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%까지, 적어도 98%까지, 100%까지 억제한다.
한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 GPVI의 콜라겐에의 결합을 200 nM 농도에서, 적어도 30%까지, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 100% 까지 억제한다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 GPVI의 콜라겐에의 결합을 200 nM 농도에서 적어도 98%까지 억제한다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI 및 생쥐 GPVI의 콜라겐에의 결합을 200 nM 농도에서 적어도 98%까지 억제한다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI, 생쥐 GPVI 및 쥐 GPVI에 결합하고 및 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI 및 생쥐 GPVI의 콜라겐에의 결합을 적어도 98%까지 억제한다.
또 다른 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI, 생쥐 GPVI 및 쥐 GPVI에 특별하게 결합하고 및 200 nM 농도에서 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI 및 생쥐 GPVI의 콜라겐에의 결합을 적어도 98%까지 억제한다.
더 나아간 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI, 생쥐 GPVI 및 쥐 GPVI에 특별하게 결합하고 및 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI 및 생쥐 GPVI의 콜라겐에의 결합을 IC50 농도 15 nM 또는 그 미만으로 억제하며, 바람직하게는 IC50 농도 10 nM 또는 그 미만으로 억제하며 및 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI 및 생쥐 GPVI의 콜라겐에의 결합을 적어도 98%까지 억제한다.
더 나아간 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI, 생쥐 GPVI 및 쥐 GPVI에 특별하게 결합하고 및 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI 및 생쥐 GPVI의 콜라겐에의 결합을 IC50 농도 15 nM 또는 그 미만으로 억제하며, 바람직하게는 IC50 농도 10 nM 또는 그 미만으로 억제하며 및 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI 및 생쥐 GPVI의 콜라겐에의 결합을 200 nM에서 적어도 98%까지 억제한다.
그래도 또 다른 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI, 생쥐 GPVI 및 쥐 GPVI에 특별하게 결합하고 및 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI 및 생쥐 GPVI의 콜라겐에의 결합을 IC50 농도 15 nM 또는 그 미만에서 적어도 적어도 98%까지 억제하며, 바람직하게는 IC50 농도 10 nM 또는 그 미만에서 억제하며 및 GPVI에 단일가 친화력 해리 비율 항수 10nM 또는 그 미만으로, 바람직하게는 1 nM 또는 그 미만으로 억제한다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 11의 HCDR1 부위, 서열번호 12의 HCDR2 부위, 서열번호 13의 HCDR3 부위, 서열번호 14의 LCDR1 부위, 서열번호 15의 LCDR2 부위 및 서열번호 16의 LCDR3 부위, 또는
b) 서열번호 22의 HCDR1 부위, 서열번호 23의 HCDR2 부위, 서열번호 24의 HCDR3 부위, 서열번호 25의 LCDR1 부위, 서열번호 26의 LCDR2 부위 및 서열번호 27의 LCDR3 부위, 또는
c) 서열번호 33의 HCDR1 부위, 서열번호 34의 HCDR2 부위, 서열번호 35의 HCDR3 부위, 서열번호 36의 LCDR1 부위, 서열번호 37의 LCDR2 부위 및 서열번호 38의 LCDR3 부위, 또는
d) 서열번호 44의 HCDR1 부위, 서열번호 45의 HCDR2 부위, 서열번호 46의 HCDR3 부위, 서열번호 47의 LCDR1 부위, 서열번호 48의 LCDR2 부위 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 부위를 포함한다.
더 나아간 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 17의 VH 및 서열번호 18의 VL 또는
b) 서열번호 28의 VH 및 서열번호 29의 VL 또는
c) 서열번호 39의 VH 및 서열번호 40의 VL 또는
d) 서열번호 50의 VH 및 서열번호 51의 VL 또는
서열번호 17, 28, 39 또는 50의 VH 및 서열번호 18, 29, 40 또는 51의 VL과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90, 또는 적어도 95% 상동성을 갖는 VH 및 VL을 포함한다.
더 나아간 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 20의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
b) 서열번호 21의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
c) 서열번호 31의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
d) 서열번호 32의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
e) 서열번호 42의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
f) 서열번호 43의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
g) 서열번호 53의 HC 및 서열번호 52의 LC 또는
h) 서열번호 54의 HC 및 서열번호 52의 LC를 포함한다.
한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 항체 또는 항체 단편이다, 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편은 scFv, Fv, Fab 및 Fab'로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편은 Fab 이다. 한 실시 예에서, 상기 Fab는 인간 Fab 이다.
IC50 농도 및/또는 최대 달성된 억제 효과 (maximum achieved inhibitory effect)는 ELISA, SET, FACS 또는 MSD (Meso Scale Discovery)로 결정될 수 있다. 한 실시 예에서, IC50 농도 및/또는 최대 달성된 억제 효과는 여기 실시 예시 6에 서술된 대로 수용체 억제 에세이 (Receptor Inhibition Assay)에서 결정될 수 있다. 한 실시 예에서, IC50 농도 및/또는 최대 달성된 억제 효과는 여기 실시 예시 6에 서술된 방법에 의해 결정될 수 있다.
세포 부착 (Cell adhesion)
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI을 발현하는 세포가, 콜라겐과 같은, GPVI 리간드에 부착하는 것을 억제한다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 GPVI 발현하는 세포의 콜라겐에의 부착을 억제한다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI 발현하는 세포의 콜라겐에의 부착을 억제한다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI 발현하는 세포의 콜라겐 코트 된 표면에의 부착을 억제한다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI 발현하는 세포의 콜라겐 코트 된 표면에의 부착을 억제한다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 GPVI 발현하는 세포의 콜라겐에의 부착을 IC50 농도 3 nM 또는 그 미만, 2 nM 또는 그 미만, 1 nM 또는 그 미만, 100 pM 또는 그 미만, 90 pM 또는 그 미만, 80 pM 또는 그 미만, 70 pM 또는 그 미만, 60 pM 또는 그 미만, 50 pM 또는 그 미만, 40 pM 또는 그 미만, 30 pM 또는 그 미만, 20 pM 또는 그 미만, 10 pM 또는 그 미만, 9 pM 또는 그 미만, 8 pM 또는 그 미만, 7 pM 또는 그 미만, 6 pM 또는 그 미만, 5 pM 또는 그 미만, 4 pM 또는 그 미만, 3 pM 또는 그 미만, 2 pM 또는 그 미만 또는 1 pM 또는 그 미만으로 억제한다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI를 발현하는 세포의 콜라겐에의 부착을 IC50 농도 3 nM 또는 그 미만, 바람직하게는 IC50 농도 2 nM 또는 그 미만으로 억제한다.
또 다른 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI, 생쥐 GPVI 및 쥐 GPVI에 특별하게 결합하고 및 인간 GPVI 발현하는 세포의 콜라겐에의 결합을 IC50 농도 3 nM 또는 그 미만에서, 바람직하게는 IC50 농도 2 nM 또는 그 미만에서 억제한다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 GPVI를 발현하는 세포의 콜라겐에의 부착을 적어도 10%까지, 적어도 20%까지, 적어도 30%까지, 적어도 40%까지, 50%, 적어도 60%까지, 적어도 70%까지, 적어도 80%까지, 적어도 90%까지, 적어도 95%까지, 본질적으로 100%까지 억제한다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 GPVI를 발현하는 세포의 콜라겐에의 부착을 200 nM 농도에서, 적어도 10%까지, 적어도 20%까지, 적어도 30%까지, 적어도 40%까지, 50%, 적어도 60%까지, 적어도 70%까지, 적어도 80%까지, 적어도 90%까지, 적어도 98%까지, 100%까지 억제한다.
한 실시 예시에서, 현 공개의 상기 항체 또는 항체 단편을 200 nM에서 인간 GPVI 발현하는 세포의 콜라겐에의 부착을 적어도 85%까지 억제한다.
또 다른 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI, 생쥐 GPVI 및 쥐 GPVI에 특별하게 결합하고 및 인간 GPVI를 발현하는 세포의 콜라겐에의 부착을 200 nM 농도에서 적어도 85%까지 억제한다.
또 다른 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 GPVI, 생쥐 GPVI 및 쥐 GPVI에 특별하게 결합하고 및 인간 GPVI를 발현하는 세포의 콜라겐에의 부착을 IC50 농도 3 nM 또는 그 미만에서, 바람직하게는 IC50 농도 2 nM 또는 그 미만에서 억제하고 및 인간 GPVI를 발현하는 세포의 콜라겐에의 부착을 200 nM 농도에서 적어도 85%까지 억제한다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 11의 HCDR1 부위, 서열번호 12의 HCDR2 부위, 서열번호 13의 HCDR3 부위, 서열번호 14의 LCDR1 부위, 서열번호 15의 LCDR2 부위 및 서열번호 16의 LCDR3 부위, 또는
b) 서열번호 22의 HCDR1 부위, 서열번호 23의 HCDR2 부위, 서열번호 24의 HCDR3 부위, 서열번호 25의 LCDR1 부위, 서열번호 26의 LCDR2 부위 및 서열번호 27의 LCDR3 부위, 또는
c) 서열번호 33의 HCDR1 부위, 서열번호 34의 HCDR2 부위, 서열번호 35의 HCDR3 부위, 서열번호 36의 LCDR1 부위, 서열번호 37의 LCDR2 부위 및 서열번호 38의 LCDR3 부위, 또는
d) 서열번호 44의 HCDR1 부위, 서열번호 45의 HCDR2 부위, 서열번호 46의 HCDR3 부위, 서열번호 47의 LCDR1 부위, 서열번호 48의 LCDR2 부위 및 서열번호 49의 LCDR3 부위를 포함한다.
더 나아간 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 17의 VH 및 서열번호 18의 VL 또는
b) 서열번호 28의 VH 및 서열번호 29의 VL 또는
c) 서열번호 39의 VH 및 서열번호 40의 VL 또는
d) 서열번호 50의 VH 및 서열번호 51의 VL 또는
서열번호 17, 28, 39 또는 50의 VH 및 서열번호 18, 29, 40 또는 51의 VL과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90, 또는 적어도 95% 상동성을 갖는 VH 및 VL을 포함한다.
더 나아간 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 20의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
b) 서열번호 21의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
c) 서열번호 31의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
d) 서열번호 32의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
e) 서열번호 42의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
f) 서열번호 43의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
g) 서열번호 53의 HC 및 서열번호 52의 LC 또는
h) 서열번호 54의 HC 및 서열번호 52의 LC를 포함한다.
한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 항체 또는 항체 단편이다, 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편은 scFv, Fv, Fab 및 Fab'로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편은 Fab 이다. 한 실시 예에서, 상기 Fab는 인간 Fab 이다.
IC50 농도 및/또는 최대 달성된 억제 효과 (maximum achieved inhibitory effect)는 ELISA, SET, FACS 또는 MSD (Meso Scale Discovery)로 결정될 수 있다. 한 실시 예에서, IC50 농도 및/또는 최대 달성된 억제 효과는 여기 실시 예시 7에 서술된 대로 세포 부착 에세이 (Cell Adhesion Assay) 에서 결정될 수 있다. 한 실시 예에서, IC50 농도 및/또는 최대 달성된 억제 효과는 여기 실시 예시 7에 서술된 방법에 의해 결정될 수 있다.
응집 (Aggregation)
현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 상기 항체 또는 항체 단편은, 인간 혈소판 풍부한 혈장 및 인간 전 혈액 (whole blood) 모두에서 콜라겐과 같은, GPVI 리간드에 의해 유도된 혈소판 응집을 억제한다.
한 실시 예에서, 상기 항체 및 항체 단편은 콜라겐과 같은, GPVI 리간드에 반응하여 혈소판 응집을 억제한다. 한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 상기 항체 또는 항체 단편은 콜라겐-유도된 혈소판 응집을 억제한다. 한 실시 예에서, 상기 콜라겐은 인간, 토끼 또는 시아노몰거스 원숭이 콜라겐이다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 상기 항체 또는 항체 단편은 0.25 μg/mL 또는 그 이상의 농도로, 0.5 μg/mL 또는 그 이상, 1 μg/mL 또는 그 이상, 2 μg/mL 또는 그 이상, 3.3 μg/mL 또는 그 이상, 5 μg/mL 또는 그 이상, 10 μg/mL 또는 그 이상의 농도로 사용하였을 때 콜라겐-유도된 인간 혈소판 응집을 억제한다.
한 실시 예시에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 상기 항체 또는 항체 단편은 콜라겐-유도된 인간 혈소판 응집을 적어도 50%까지, 적어도 60%까지, 적어도 70%까지, 적어도 80%까지, 적어도 90%까지, 적어도 95%까지, 적어도 98%까지, 100%까지 억제한다. 한 실시 예에서, 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편은 적어도 3.3 μg/ml 농도로 사용되었을 때 콜라겐-유도된 인간 혈소판 응집을 적어도 50%까지, 적어도 60%까지, 적어도 70%까지, 적어도 80%까지, 적어도 90%까지, 적어도 95%까지, 적어도 98%까지, 100%까지 억제한다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편은 콜라겐-유도된 인간 혈소판 응집을 100%까지 억제한다. 한 실시 예에서, 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편은 10 μg/mL 또는 그 이상의 농도로 사용되었을 때 콜라겐-유도된 인간 혈소판 응집을 근본적으로 100%까지 억제한다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편은 3.3 μg/mL의 농도로 사용되었을 때 콜라겐-유도된 인간 혈소판 응집을 적어도 70%까지 억제한다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편은 시아노몰거스 원숭이 대동맥 콜라겐-유도된 인간 혈소판 응집을 억제한다. 더 나아간 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI 특이적인 항체 또는 항체 단편은 적어도 3.3 μg/mL 또는 그 이상의 농도로 사용되었을 때, 바람직하게는 10 μg/mL의 농도로 사용되었을 때, 시아노몰거스 대동맥 콜라겐-유도된 인간 혈소판 응집을 억제한다. 한 실시 예에서, 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편은 10 μg/mL의 농도로 사용되었을 때 시아노몰거스 대동맥 콜라겐-유도된 인간 혈소판 응집을 적어도 50%까지 억제한다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편은 콜라겐-유도된 혈소판 응집을 억제하나, 그러나 ADP, TRAP 또는 PAR1와 같은 다른 혈소판 응집 유도하는 물질 (예를 들어, GPVI의 다른 작동제)에 의해서 유도된 혈소판 응집에는 효과가 없다.
더 나아가, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 인간 죽상 경화성 플라크 물질-유도된 혈소판 응집을 또한 억제할 수 있다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 인간 죽상 경화성 플라크 물질-유도된 혈소판 응집을 근본적으로 100%까지 억제한다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 2 μg/mL 또는 그 이상의 농도에서 사용되었을 때, 인간 죽상 경화성 플라크 -유도된 인간 혈소판 응집을 100%까지 억제한다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 11의 HCDR1 부위, 서열번호 12의 HCDR2 부위, 서열번호 13의 HCDR3 부위, 서열번호 14의 LCDR1 부위, 서열번호 15의 LCDR2 부위 및 서열번호 16의 LCDR3 부위, 또는
b) 서열번호 22의 HCDR1 부위, 서열번호 23의 HCDR2 부위, 서열번호 24의 HCDR3 부위, 서열번호 25의 LCDR1 부위, 서열번호 26의 LCDR2 부위 및 서열번호 27의 LCDR3 부위, 또는
c) 서열번호 33의 HCDR1 부위, 서열번호 34의 HCDR2 부위, 서열번호 35의 HCDR3 부위, 서열번호 36의 LCDR1 부위, 서열번호 37의 LCDR2 부위 및 서열번호 38의 LCDR3 부위, 또는
d) 서열번호 44의 HCDR1 부위, 서열번호 45의 HCDR2 부위, 서열번호 46의 HCDR3 부위, 서열번호 47의 LCDR1 부위, 서열번호 48의 LCDR2 부위 및 서열번호 49의 LCDR3 부위를 포함한다.
한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 17의 VH 및 서열번호 18의 VL 또는
b) 서열번호 28의 VH 및 서열번호 29의 VL 또는
c) 서열번호 39의 VH 및 서열번호 40의 VL 또는
d) 서열번호 50의 VH 및 서열번호 51의 VL 또는
서열번호 17, 28, 39 또는 50의 VH 및 서열번호 18, 29, 40 또는 51의 VL과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90, 또는 적어도 95% 상동성을 갖는 VH 및 VL을 포함한다.
더 나아간 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 20의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
b) 서열번호 21의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
c) 서열번호 31의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
d) 서열번호 32의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
e) 서열번호 42의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
f) 서열번호 43의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
g) 서열번호 53의 HC 및 서열번호 52의 LC 또는
h) 서열번호 54의 HC 및 서열번호 52의 LC를 포함한다.
한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 항체 또는 항체 단편이다, 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편은 scFv, Fv, Fab 및 Fab'로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편은 Fab 이다. 한 실시 예에서, 상기 Fab는 인간 Fab 이다.
응집에 대해 달성된 억제효과는 여기 실시예시 9 또는 실시예시 10에서 서술된 대로 임피던스 응집검출법 (Impedance Aggregometry)으로 결정될 수 있다.
현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 또한 콜라겐 코트 된 표면에 흐름 하에서 혈소판 응집을 억제할 수 있다. 더욱이, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 또한 인간 죽상경화증 플라크 코트 된 표면에 흐름 하에서 인간 혈소판 응집을 억제할 수 있다. 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 인간 죽상경화증 플라크 코트 된 표면에 흐름 하에서 혈소판 응집을 억제할 수 있다. 현 공개의 GPVI 특이한 항체 또는 항체 단편은 또한 인간 죽상경화증 플라크에 의해 유도된 흐름 하에서 혈소판 응집을 억제 할 수 있다.
어떤 특정 실시 예에서, 현 공개의 GPVI에 특이한 항체 또는 항체 단편은 인간 죽상경화증 플라크-유도된 혈소판 응집을 흐름 하에서 적어도 95%까지 억제한다. 어떤 특정 실시 예에서, 본 공개의 항체 또는 항체 단편은, 2.0 μg/mL 또는 그 이상의 농도로 사용되었을 때, 인간 죽상경화증 플라크-유도된 혈소판 응집을 흐름 하에서 적어도 95%까지 억제할 수 있다. 어떤 특정 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 2.0 μg/mL 또는 그 이상의 농도로 사용되었을 때, 인간 죽상경화증 플라크-유도된 혈소판 응집을 흐름 하에서 및 시간에 따라 적어도 95%까지 억제한다.
어떤 특정 실시 예에서, 본 공개의 항체 또는 항체 단편은 죽상 경화성 플라크-유도된 혈소판 응집을 흐름 하에서 및 시간 지남에 따라 억제하는 데는 아세틸살리실릭 에시드 (acetylsalicylic acid) 및 티카그렐러 (Ticagrelor)의 조합에 비교하였을 때보다 좀 더 효과적이다. 어떤 특정 실시 예에서, 본 공개의 항체 또는 항체 단편은 2.0 μg/mL의 항체 농도로 사용하였을 때 아세틸살리실릭 에시드 (acetylsalicylic acid) 및 티카그렐러 (Ticagrelor)의 조합에 비교하여 죽상 경화성 플라크-유도된 혈소판 응집을 흐름 하 시간 지남에 따라 억제하는데 좀 더 효과적이다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 11의 HCDR1 부위, 서열번호 12의 HCDR2 부위, 서열번호 13의 HCDR3 부위, 서열번호 14의 LCDR1 부위, 서열번호 15의 LCDR2 부위 및 서열번호 16의 LCDR3 부위, 또는
b) 서열번호 22의 HCDR1 부위, 서열번호 23의 HCDR2 부위, 서열번호 24의 HCDR3 부위, 서열번호 25의 LCDR1 부위, 서열번호 26의 LCDR2 부위 및 서열번호 27의 LCDR3 부위, 또는
c) 서열번호 33의 HCDR1 부위, 서열번호 34의 HCDR2 부위, 서열번호 35의 HCDR3 부위, 서열번호 36의 LCDR1 부위, 서열번호 37의 LCDR2 부위 및 서열번호 38의 LCDR3 부위, 또는
d) 서열번호 44의 HCDR1 부위, 서열번호 45의 HCDR2 부위, 서열번호 46의 HCDR3 부위, 서열번호 47의 LCDR1 부위, 서열번호 48의 LCDR2 부위 및 서열번호 49의 LCDR3 부위를 포함한다.
한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 17의 VH 및 서열번호 18의 VL 또는
b) 서열번호 28의 VH 및 서열번호 29의 VL 또는
c) 서열번호 39의 VH 및 서열번호 40의 VL 또는
d) 서열번호 50의 VH 및 서열번호 51의 VL 또는
서열번호 17, 28, 39 또는 50의 VH 및 서열번호 18, 29, 40 또는 51의 VL과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90, 또는 적어도 95% 상동성을 갖는 VH 및 VL을 포함한다.
더 나아간 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 20의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
b) 서열번호 21의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
c) 서열번호 31의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
d) 서열번호 32의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
e) 서열번호 42의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
f) 서열번호 43의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
g) 서열번호 53의 HC 및 서열번호 52의 LC 또는
h) 서열번호 54의 HC 및 서열번호 52의 LC를 포함한다.
한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 항체 또는 항체 단편이다, 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편은 scFv, Fv, Fab 및 Fab'로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편은 Fab 이다. 한 실시 예에서, 상기 Fab는 인간 Fab 이다.
흐름 조건 하에서 달성된 억제 효과는 여기 실시예시 11에 서술된 바에 의해 결정 될 수 있다.
생체 내 활성 (In vivo activity)
현 공개에 따른 GPVI 특이적인 항체 또는 항체 단편은 또한 생체 내에서 혈전 형성 (thrombus formation) (예를 들어, 혈소판 응집 및 부착) 을 억제 또는 예방 할수 있다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편은 생체 내 콜라겐 결합 반응에 따라 혈소판이 혈전을 형성하는 능력을 억제한다.
실시예시 12에 서술된 방법에서, 현 공개에 따른 항체 및 항체 단편은 투여하기 전 값 또는 대조군 값에 비교하여 항체 농도 3mg/kg 또는 미만, 1mg/kg 또는 미만, 0.3 mg/kg 또는 미만, 0.1 mg/kg 또는 미만에서, 혈소판의 콜라겐-유도된 혈전의 생성을 20%까지, 40%에 동등하게 또는 그 이상, 60%에 동등하게 또는 그 이상, 80%에 동등하게 또는 그 이상, 90%에 동등하게 또는 그 이상, 또는 95%에 동등하게 또는 그 이상 감소 시킨다.
여기 실시예시 12에 서술된 방법에서, 항체 단편은 투여하기 전 값 또는 대조군 값에 비교하여 항체 농도 약 3.3 mg/kg에서 혈소판의 혈전 생성을 20%와 동등하게까지 감소하게 하는, 40%에 동등하게 또는 그 이상, 좀 더 바람직하게는 60%에 동등하게 또는 그 이상, 80%에 동등하게 또는 그 이상, 90%에 동등하게 또는 그 이상, 또는 95%에 동등하게 또는 그 이상 감소하게 하는 생체 내 활성을 가진다.
여기 실시예시 12에 서술된 방법에서, 항체 단편은 항체 농도 약 3.3 mg/kg에서 생체 내에서 혈전 생성을 상당히 전적으로 예방하는 생체 내 활성을 가진다.
안전성(Safety)
출혈 (Bleeding)
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI 특이적인 항체 및 항체 단편은 개체에서 출혈 시간의 증가를 유도하지 않는다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 및 항체 단편은 개체에서 출혈시간을 상당히 또는 의미 있게 연장하지는 않는다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 및 항체 단편은 개체에서 출혈시간을 연장하지 않는다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 및 항체 단편의 개체에서의 출혈시간의 연장은 약하다.
출혈 시간은 공공적으로 알려진 방법에 의하여 에세이 될 수 있으며, 및 특별히, 실시예시 14에 서술된 방법이 적용될 수 있다.
한 실시 예에서, 현 공개의 GPVI에 특이적인 항체 및 항체 단편은 치료적으로 효과적인 양, 0.3 mg/kg, 1mg/kg, 3mg/kg, 또는 10mg/kg을 받고 있는 개체에서 출혈 시간을 상당히 지연시키지는 않는다. 한 실시 예에서, 현 공개의 GPVI에 특이적인 항체 및 항체 단편은 10mg/kg의 농도에서 출혈 시간을 상당히 지연시키지는 않는다.
특히, 출혈 시간은 투여 전 값, 정상값 또는 대조군 값에 5-배 미만 또는 5-배와 같게, 바람직하게는 3-배 미만 또는 3-배와 같게, 2-배 미만 또는 2-배와 같게, 1.5-배 미만 또는 1.5-배와 같게, 또는 상당히 같다.
현 공개의 항체 및 항체 단편은 치료적으로 효과적인 양에서 아세틸살리실릭 에시드 (acetylsalicylic acid)와 함께 투여되었을 때 아세틸살리실릭 에시드 단독으로 투여되었을 때와 비교하여 출혈 시간을 상당히 지연시키지는 않는다.
현 공개의 항체 및 항체 단편은 치료적으로 효과적인 양에서, 예를 들어, 0.3mg/kg, 1mg/kg, 3mg/kg 또는 10mg/kg, 아세틸살리실릭 에시드 (acetylsalicylic acid)(ASA) 와 함께 투여되었을 때 아세틸살리실릭 에시드 단독으로 투여되었을 때와 비교하여 출혈 시간을 상당히 지연시키지는 않는다.
혈소판 수 (Platelet Count)
현 공개에 따른 GPVI 특이적인 항체 또는 항체 단편은 생체 내에서 혈소판 수의 감소를 상당히 유도하지 않는다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 개체에 투여되었을 때, 생체 내에서 혈소판 수의 감소를 상당히 유도하지 않는다. 바람직하게, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 생체 내에서 혈소판 수 활성은 가지고 있지 않다.
따라서, 한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI 특이적인 항체 또는 항체 단편은 개체에 투여되었을 때 혈소판감소 (thrombocytopenia) 를 상당히 유도하지는 않는다. 더 나아간 실시 예에서 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 생체 내에서 혈소판감소 (thrombocytopenia) 를 상당히 유도하지는 않는다.
생체 내 혈소판감소증 (thrombocytopenia)은 현 공개의 항체 또는 항체 단편을 생체 내에 투여한 후에 시간에 따라 혈액을 수집하고, 전통적인 방법에 따라 혈소판 수를 계산하고 및 그 숫자를 투여하기 전 값 또는 대조군으로서 한 개인의 혈소판 수와 비교하여 결정할 수 있다. 생체 내 혈소판감소증 (thrombocytopenia)는 현 공개의 실시예시 15에 서술된 대로 결정될 수 있다.
한 실시 예에서, 현 공개의 GPVI 특이적인 항체 또는 항체 단편은 생체 내 투여되었을 때, 예를 들어, 치료적으로 효과 있는 양으로 투여되었을 때와 같이, 혈소판 수의 감소, 즉 혈소판감소증 (thrombocytopenia) 을, 유도하지 않는다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은, 예를 들어, 0.01 mg/kg 에서 100mg/kg 범위의 양으로 투여되었을 때와 같은, 생체 내에 투여되었을 때, 혈소판 수의 감소, 즉 혈소판감소증 (thrombocytopenia) 을, 유도하지 않는다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 10mg/kg의 농도로 투여되었을 때 생체 내 투여되었을 때, 혈소판 수의 감소, 즉 혈소판감소증 (thrombocytopenia) 을, 유도하지 않는다.
현 공개의 항체 또는 항체 단편에 의해 감소한 혈소판 수는 투여하기 전의 값 또는 대조군의 값이 100%로 정해졌을 때 바람직하게 50%와 동등하게 또는 그 이상, 70%와 동등하게 또는 그 이상, 90%와 동등하게 또는 그 이상 또는 상기 항체를 투여하기 전의 또는 대조군의 혈소판 수과 상당히 같다.
현 공개의 항체 또는 항체 단편에 의해 감소한 혈소판 수는 투여하기 전의 값 또는 대조군의 값이 100%로 정해졌을 때 및 항체가 예를 들어 0.3 mg/kg, 바람직하게 1mg/kg, 더 바람직하게 3mg/kg, 더 나아가 바람직하게 10mg/kg의 농도로 투여되었을 때, 50%와 동등하게 또는 그 이상, 70%와 동등하게 또는 그 이상, 90%와 동등하게 또는 그 이상, 또는 바람직하게 상기 항체를 투여하기 전의 또는 대조군의 혈소판 수와 거의 같다.
세포 표면 발현/탈피/내면화 (Cell surface expression / Shedding / Internalization)
GPVI는 하향 조절되거나 또는 혈소판 막 또는 표면으로부터 고갈될 수 있다. 이 GPVI 단백질 수준의 조정은 리간드 (콜라겐과 같은) 결합에 의해 촉발될 수 있으며 및 이어서 수용체 활성화로 예를 들어 GPVI의 엑토도메인 (ectoderm)의 분열 (예를 들어, 탈피) 또는 리간드-유도되는 GPVI 수용체 내면화 결과가 될 수 있다. 혈소판 활성화는 또한 항체가 리간드 기능을 모사 하는 GPVI에 특이적으로 결합할 때 또한 일어날 수 있다. GPVI 특이적인 항체가 GPVI의 작동제 리간드 기능을 모사하는 경우, 그 항체는 GPVI의 작동제로 간주 될 수 있다.
한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 혈소판을 상당히 활성화 시키지 않으며, 바람직하게는 활성이 없다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 생체 내에서 혈소판을 상당히 활성화 시키지 않으며, 바람직하게는 활성이 없다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 혈소판 표면의 GPVI에 결합하며 및 혈소판에서 GPVI 경로의 활성화를 막는다.
한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 생체 내에서 혈소판 표면으로부터 GPVI의 고갈을 유도하지 않는다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 개체에 투여되었을 때 혈소판 표면으로부터 GTV의 고갈을 유도하지 않는다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 생체 내에서 혈소판 표면으로부터 GPVI의 고갈을 상당히 유도하지 않는다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 생체 내에서 상기 항체 또는 항체 단편을 혈소판과 접촉시켰을 때 혈소판 표면으로부터 GPVI의 고갈을 상당히 유도하지 않는다.
한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은, 예를 들어, 0.01 에서 500mg의 범위의 치료적으로 효과 있는 양으로 투여되었을 때와 같은, 생체 내에 투여되었을 때 혈소판 표면으로부터 GPVI의 고갈을 유도하지 않는다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 10mg/kg의 농도로 생체 내에 투여되었을 때 혈소판 표면으로부터 GPVI의 고갈을 유도하지 않는다.
한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은, 혈소판 GPVI를 탈피시키고, 특히 메탈로프로테아제-매개하는 (metalloprotease-mediated) 분열에 의한 혈소판 GPVI를 탈피시키고, 상기 항체 또는 항체 단편이 상기 혈소판과 접촉될 때, 혈소판 활성화가 동반되어, 혈소판 표면으로부터 GPVI를 상당히 고갈시키지 않는다.
현 공개의 항체 또는 항체 단편은 혈소판 표면으로부터 GPVI의 탈피를, 특히 혈소판 활성화가 동반되는 메탈로프로테아제-매개하는 (metalloprotease-mediated) 분열에 의한 혈소판으로부터의 GPVI의 탈피를, 상당히 유도하지 않는다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 현 공개에 따른 GPVI 특이적인 항체 또는 항체 단편을 혈소판과 접촉하게 함으로서, 특히, 상기 항체 또는 항체 단편을 생체 내에서 혈소판과 접촉하게 함으로서, 혈소판 표면으로부터 GPVI의 고갈을 유도하지 않는다.
그러한 활성은 현 공개의 항체 또는 항체 단편을 주어진 시간에 혈소판과 접촉하게 하고 이어서 혈소판을 분리하고, 및 표면에서 GPVI의 발현 수준을 에세이하여 확인할 수 있다. GPVI의 발현 수준은 FACS, 등을 사용한 전통적인 방법에 의해 측정될 수 있으며, 및 특별한 방법이 실시예시 16에 보여준다.
현 공개의 항체 또는 항체 단편은 0.1 mg/kg 또는 그 이상, 0.3 mg/kg 또는 그 이상, 1mg/kg 3mg/kg 또는 그 이상, 10mg/kg 또는 그 이상의 농도에서 개체에 투여 전의 값 또는 대조군 값과 비교하여 20%와 동등하게 또는 그 이상, 40%와 동등하게 또는 그 이상, 60%와 동등하게 또는 그 이상, 80%와 동등하게 또는 그 이상, 90%와 동등하게 또는 그 이상으로 혈소판으로부터 GPVI의 고갈을 유도하지 않는다.
현 공개의 항체 또는 항체 단편은 혈소판을 현 공개의 항체 또는 항체 단편과 접촉되게 함으로 혈소판으로부터 GPVI을 내면화시켜 혈소판 표면에 GPVI 고갈을 상당히 시키지 않는다.
혈소판 활성화 (Platelet Activation)
항체는 전체 면역글로블린으로서 존재할 때 2가 분자 (bivalent molecules)이며 및 그럼으로써 혈소판 표면에 GPVI 수용체 군집을 유도할 수 있고 및 그러므로 콜라겐과 같은 이의 자연적인 작동제 리간드와 비슷하게, 혈소판 활성화를 유도할 수 있다. 이를 극복하기 위하여, 현 공개의 발명자들은 단일가의 항체 또는 항체 단편, 특히 GPVI에 특이적인 Fab 단편을 개발하였다.
그러나 자연에서는 단지 면역글로블린의 분해 산물로만이 존재하는 Fabs는 환자 특이적인 방식으로 아직도 혈소판 활성화를 유도하는 잠재성을 보인다. 이는 Fab의 C-말단 끝(C-말단)에 의해 원인이 되는 것으로 생각되며, 이는 개체의 혈청 존재하는 이미-존재하는 항체들 (pre-existing antibodies)에 의해 인식되고 및 특별히 결합하는 에피톱을 형성한다. 이 이미-존재하는 항체들은 그 후 면역 반응을 끌어내어 2가 또는 다가 (multivalent) 항체 분자를 부활시키기 때문에 원하지 않는 혈소판 활성화를 초래할 수 있다. 그러한 항-Fab 항체에 대한 에피톱을 형성하는 아미노산 서열은 자가-항원적 서열이라고 언급될 수 있다 (Kormeier et al. (1968) J. Immunol. 100(3); 612-21; Persselin and Stevens (1985) J. Clin. Invest. 76; 723-30). 따라서, 여기서 사용된 대로, "비-자가-항원적 서열 (non-auto-antigenic sequence)" 은 개체에 존재하는 이미-존재하는 항체에 의해 인식되는 에피톱이 아니거나 또는 에피톱을 형성하지 않는 아미노산 서열을 의미한다.
한 아미노산 서열이 자가-항원성 서열로서 작용하는지를 결정하기 위하여, 검사할 특별한 서열을 포함하는 펩티드 구조체를, 펩티드 구조체를 인식하고 및 특이적으로 결합하는 항체가 혈청에 존재하는지를 결정하기 위하여, 인간 혈청에 노출 시킬 수 있다. 좀 더 특별하게, 면역글로블린의 특정 아미노산이 자가-항원적 서열인지 아닌지를 동정하기 위하여, 예를 들어, IgG 분자는 프로테아제 패널로 쪼개질 수 있어 C-말단 부위에 다른 서열을 함유하는 IgG 단편이 제공된다. 다른 한편으로, 펩티드 또는 폴리펩티드는 IgG C-말단의 서열을 본떠서 펩티드 합성 또는 재조합 DNA 기술로 생산될 수 있다. 각 경우에, 특별히 노출된 C-말단 아미노산 서열 또는 합성 펩티드에 결합하는 이미-존재하는 항체가 존재하는지 아닌지를 결정하기 위하여 인간 혈청은 각각 스크린 될 수 있다.
허혈성 사건의 치료를 위한 안전한 치료제를 제공하기 위하여, Fab와 같은 개발된 항체 단편의 이 활성화 잠재성은 존재하지 않거나 또는 아주 약한 것이 확실해야만 한다. 따라서, 한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 Fab는 혈소판을 상당히 활성화 시키지 않으며, 바람직하게는 활성을 가지지 않는다. 혈소판의 활성화는 알려진 방법에 의해 측정될 수 있으며, 및 혈소판 표면 항원, 바람직하게는 CD62P이 지수로서 (index) 사용될 수 있다.
예를 들어, 주어진 기간 후에 단일가 항체 또는 항체 단편이 투여된 개체로부터 혈소판을 분리하고 및 전통적인 방법에 의해 CD62P의 발현 수준을 측정하는 방법, 현 공개에 따른 GPVI 특이적인 단일가 항체 또는 항체 단편을 개체로부터 분리된 혈소판과 접촉하게 하고 및 주어진 기간 후에 전통적인 방법에 의해 CD62P 발현 수준을 에세이 하는 방법 및 이와 유사한 것이 포함된다. 한 특별한 방법이 실시예시 13에 보여진다.
따라서, 한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 Fab는 개체의 혈청에 존재하는 항-Fab 항체에 의한 상기 Fab의 인식 때문에 혈소판을 상당히 활성화하지 않는다. 더 나아간 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 Fab는 CD62P와 같은 혈소판의 세포 표면 활성화 마커의 발현을 상당히 유도하지 않는다.
현 출원의 발명가들은 Fab 중쇄의 C-말단에의 수정은 더 나아가, 예를 들어, 개체의 혈청에 존재하는 항-Fab 항체에 의해 GPVI에 특이적인 상기 Fab의 인식을 방지하여, 그러한 Fab가 혈소판 활성화를 유도하는 잠재력을 감소, 방지 또는 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
여기서, "에 의한 인식의 방지 (prevention of recognition by)" 또는"의 결합의 방지 (prevention of binding of)" 는 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 Fab는 개체의 혈청에 존재하는 항-Fab 항체의 존재 때문에 혈소판 표면에 GPVI에 교차-링크 (cross-link) 되지 않으며 및 GPVI 신호전달을 활성화하지 않음을 의미한다. 그러한 교차-링크는 자연적인 리간드 (콜라겐과 같은) 의 활성을 모사 할 수 있어 GPVI 수용체의 활성화 결과를 가져올 수 있다. 다른 말로, 현 공개의 Fab는 길항제 (antagonists) 로 작용하는 대신 작동제 (agonist) 로서 작용할 수 있다. GPVI 수용체의 기능을 중화하는 길항적인 GPVI 특이적인 항체 또는 항체 단편 또는 GPVI 기능을 활성화하는 작동제적인 GPVI 특이적인 항체 또는 항체 단편은 GPVI의 기능을 반영하는 생체 내 마커를 에세이 하여 평가할 수 있다.
따라서, 현 공개는 수정된 중 쇄 고정 부위를 포함하는 GPVI에 특이적인 항체 단편을 제공한다. 한 실시 예에서, 상기 항체 단편은 Fab 이다. 중 쇄 고정 부위의 그러한 수정은 Fab 중 쇄의 C-말단에 또는 C-말단으로 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기(들) 의 첨가 또는 치환을 포함한다.
따라서, 현 공개는 수정된 중 쇄 고정 부위를 포함하는 GPVI에 특이적인 Fab를 제공하며, 여기서 수정된 중 쇄 고정 부위는 개체의 혈청에 존재하는 항-Fab 항체에 의한 상기 Fab의 인식을 방지 또는 억제한다.
현 공개의 한 실시 예에서, GPVI에 특이적인 Fab의 중 쇄 고정 부위는 하나 또는 그 이상의 아미노산 (들)의 첨가 또는 치환, 바람직하게는 아미노산 서열 (예를 들어, 폴리펩티드) 과 같은 하나의 아미노산 이상의 첨가 또는 치환에 의해 수정될 수 있다. 그러한 첨가된 또는 치환된 폴리펩티드는 현 공개의 Fab에 도입될 때 이것이 비-자가-항원적인 서열 (non-auto-antigenic sequence)로 구성될 수 있는한, 그러나 상기 Fab가 GPVI에 결합하는 것을 간섭하지 않을 수 있는 한 어느 아미노산 서열도 될 수 있다.
여기서 사용된 대로, "제작된 (engineered)" 또는 "수정된 (modified)" 은 Fab 중쇄의 C-말단에 아미노산 확장 (예를 들어, 첨가) 또는 치환을 함유하도록 유전적으로 제작된 Fab를 의미한다.
한 실시 예에서, Fab 중쇄의 C-말단에 폴리펩티드가 첨가된다. 한 실시 예에서, Fab의 CH1 도메인의 C-말단에 첨가된다. 다른 한편으로는, 폴리펩티드는 만약 존재한다면 Fab 중쇄의 C-말단의 힌지 부분 (hinge portion) 을 치환한다. 한 실시 예에서, 상기 Fab의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSC (서열번호 101) 로 구성된다.
그렇게 함으로서, 현 공개는 수정된 중 쇄 고정부위를 포함하는 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 Fab를 제공하며, 여기서 수정된 중 쇄 고정부위는 N-말단에서 C-말단으로 순서대로 비-자가-항원적 서열 (non-auto-antigenic sequence) 을 구성할 수 있는 CH1 도메인 및 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 수정된 중 쇄 고정 부위는 개체의 혈청에 존재하는 항-Fab 항체에 의한 상기 Fab의 인식을 방지 또는 억제한다.
한 실시 예에서, 상기 개체는 인간이다. 한 실시 예에서, 상기 CH1 도메인은 인간 CH1 도메인이다.
한 실시 예에서, 상기 폴리펩티드는 비-자가-항원적 서열 (non-auto-antigenic sequence)로 구성된다. 한 실시 예에서, 상기 폴리펩티드는 1 내지 100 아미노산, 1 내지 50 아미노산, 1 내지 20 아미노산, 1 내지 15 아미노산, 또는 1 내지 10 아미노산, 또는 1 내지 5 아미노산, 또는 1 아미노산을 포함한다.
한 실시 예에서, 상기 폴리펩티드는 Fab의 중 쇄 및 경 쇄 사이에 하나의 이 황화 결합 (disulfide bond)을 형성하게 하고 및 그러므로 분자를 안정화하는 단지 하나의 시스테인 (cysteine) 을 포함한다. 특별한 실시 예에서, 상기 시스테인은 현 공개의 Fab의 수정된 중 쇄 고정 부위의 마지막 아미노산 잔기이다. 본 공개의 더 나아간 실시 예에서, 시스테인은 첫 번째 Fab 분자의 중 쇄 고정 부위와 두 번째 Fab 분자의 중 쇄 고정 부위 사이에 이 황화 결합 형성을 하게 하지 않는다. 본 공개의 더 나아간 실시 예에서, 비-자가-항원적 서열 (non-auto-antigenic sequence)은 (Fab)2 분자의 형성을 방지한다. 본 공개의 더 나아간 실시 예에서, 상기 폴리펩티드는 하나의 시스테인 이상은 함유하지 않는다.
한 실시 예에서, 비-자가-항원적 서열을 구성할 수 있는 폴리펩티드는 아미노산 서열 ERRX2X3GIGHKC (서열번호 102) 를 포함하며, 여기서 X2 및 X3는 시스테인 (cysteine) 을 제외한 어느 자연적으로 존재하는 아미노산 잔기가 될 수 있다. 한 실시 예에서, 상기 폴리펩티드는 ERRNGGIGHKC (서열번호 103), EERNGGIGHKC (서열번호 104), ERRQGGIGHKC (서열번호 105) 및 VPREC (서열번호 106)으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 한 실시 예에서, 상기 폴리펩티드는 아미노산 서열 ERRQGGIGHKC (서열번호105)로 구성된다. 예를 들어, 잠재적인 번역-후 수정 부위 또는 현 공개의 생산된 Fab에 존재하는 잠재적인 T-세포 에피톱을 제거하기 위하여, 비-자가-항원적 서열을 구성할 수 있는 상기 폴리펩티드는 추가의 아미노산 치환을 포함할 수 있다는 것은 이 공개의 범위 내에 있다.
그렇게 함으로써, 현 공개는 수정된 중 쇄 고정 부위를 포함하는 현 공개에 따른 GPVI 특이적인 Fab를 제공하며, 여기서 수정된 중 쇄 고정 부위는 N-말단에서부터 C-말단으로 순서대로 상기 Fab의 C-말단에 첨가되었을 때 비-자가-항원적 서열을 구성할 수 있는 CH1 도메인 및 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 아미노산 서열 ERRQGGIGHKC (서열번호 105) 로 구성되며, 여기서 상기 수정된 중 쇄 고정 부위는 개체 혈청에 존재하는 항-Fab-항체에 의해 상기 Fab가 인식되는 것을 방지 또는 억제한다.
한 실시 예에서, 상기 CH1 도메인은: 인간 IgG1 CH1 도메인, 인간 IgG2 CH1 도메인, 인간 IgG3 CH1 도메인 및 인간 IgG4 CH1 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 실시 예에서, 상기 CH1 도메인은 인간 IgG1 CH1 도메인이다. 한 실시 예에서, 상기 CH1 도메인은 야생형 인간 IgG1 CH1 도메인, 야생형 인간 IgG1 CH1 도메인의 어느 알로타입 (allotype) 이거나 또는 야생형 인간 IgG1 CH1 도메인의 아미노산 서열과 적어도 95& 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
어떤 특정 실시 예에서, 상기 수정된 중 쇄 고정 부위는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산으로 구성된다:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKIVPREC (서열번호 107),
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVERRNGGIGHKC (서열번호 108)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVEKKVERRNGGIGHKC (서열번호 109),
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKGVERRNGGIGHKC (서열번호 110),
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKEVERRNGGIGHKC (서열번호 111),
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEERNGGIGHKC (서열번호 112), 및
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKEVERRQGGIGHKC (서열번호 113)
또는 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112 또는 서열번호 113 로부터 최대로 10 아미노산이 다른 아미노산 서열 또는 이들 서열 중 어는 서열과 적어도 90% 동일한 서열.
한 실시 예에서, 현 공개는 여기서 공개된 대로, 수정된 중 쇄 고정 부위를 포함하는 GPVI에 특이적인 Fab를 제공하며, 여기서 상기 수정된 중 쇄 고정 부위는 아미노산 서열:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKEVERRQGGIGHKC (서열번호 113)로 구성 된다.
어떤 특정 실시 예에서, 현 공개는 수정된 중 쇄 고정 부위 및 하기로 구성된 군으로부터 선택된 VH 및 VL의 조합을 포함하는 GPVI 특이적인 Fab를 제공한다:
a) 서열번호 17의 VH 및 서열번호 18의 VL,
b) 서열번호 28의 VH 및 서열번호 29의 VL,
c) 서열번호 39의 VH 및 서열번호 40의 VL, 및
d) 서열번호 50의 VH 및 서열번호 51의 VL, 및
여기서 상기 수정된 중 쇄 고정 부위는 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112 및 서열번호 113 로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된다.
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI 특이적인 Fab를 제공하며, 여기서, 상기 Fab는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 VH 및 VL의 조합을 포함하고:
a) 서열번호 17의 VH 및 서열번호 18의 VL,
b) 서열번호 28의 VH 및 서열번호 29의 VL,
c) 서열번호 39의 VH 및 서열번호 40의 VL,
d) 서열번호 50의 VH 및 서열번호 51의 VL,
및 더 나아가 수정된 중 쇄 고정 부위는 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112 및 서열번호 113 로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시 예에서, 상기 수정된 중 쇄 고정 부위는 서열번호 113으로 구성된다.
한 실시 예에서, 현 공개는 수정된 중 쇄 고정 부위를 포함하는 GPVI 특이적인 Fab에 관련되며, 여기서 상기 Fab는 서열번호 21의 중 쇄 및 서열번호 19의 경 쇄를 포함한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 수정된 중 쇄 고정 부위를 포함하는 GPVI 특이적인 Fab에 관련되며, 여기서 상기 Fab는 서열번호 32의 중 쇄 및 서열번호 30의 경 쇄를 포함한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 수정된 중 쇄 고정 부위를 포함하는 GPVI 특이적인 Fab에 관련되며, 여기서 상기 Fab는 서열번호 43의 중 쇄 및 서열번호 41의 경 쇄를 포함한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 수정된 중 쇄 고정 부위를 포함하는 GPVI 특이적인 Fab에 관련되며, 여기서 상기 Fab는 서열번호 54의 중 쇄 및 서열번호 52의 경 쇄를 포함한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 수정된 중 쇄 고정 부위를 포함하는 GPVI 특이적인 Fab에 관련되며, 여기서 상기 Fab는 서열번호 21의 중 쇄 및 서열번호 19의 경 쇄로 구성된다.
한 실시 예에서, 현 공개는 수정된 중 쇄 고정 부위를 포함하는 GPVI 특이적인 Fab에 관련되며, 여기서 상기 Fab는 서열번호 32의 중 쇄 및 서열번호 30의 경 쇄로 구성된다.
한 실시 예에서, 현 공개는 수정된 중 쇄 고정 부위를 포함하는 GPVI 특이적인 Fab에 관련되며, 여기서 상기 Fab는 서열번호 43의 중 쇄 및 서열번호 41의 경 쇄로 구성된다.
한 실시 예에서, 현 공개는 수정된 중 쇄 고정 부위를 포함하는 GPVI 특이적인 Fab에 관련되며, 여기서 상기 Fab는 서열번호 54의 중 쇄 및 서열번호 52의 경 쇄로 구성된다.
더 나아간 실시 예에서, 현 공개는 수정된 중 쇄 고정 부위를 포함하는 GPVI 특이적인 Fab에 관련되며 상기 Fab 는:
a) 서열번호 20의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
b) 서열번호 21의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
c) 서열번호 31의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
d) 서열번호 32의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
e) 서열번호 42의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
f) 서열번호 43의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
g) 서열번호 53의 HC 및 서열번호 52의 LC 또는
h) 서열번호 54의 HC 및 서열번호 52의 LC를 포함한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 수정된 중 쇄 고정 부위를 포함하는 현 공개에 따른 GPVI 특이적인 Fab를 제공하며, 여기서 수정된 중 쇄 고정 부위는 N-말단에서부터 C-말단으로 순서대로 비-자가-항원적 서열을 구성할 수 있는 CH1 도메인 및 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 수정된 중 쇄 고정 부위는 개체 혈청에 존재하는 항-Fab-항체에 의해 상기 Fab가 인식되는 것을 방지 또는 억제하며 및 여기서 상기 Fab는 서열번호 43의 중 쇄 및 서열번호 41의 경 쇄로 구성된다.
따라서, 현 공개는 또한 GPVI 특이적인 Fab가 사용될 때, 하기를 포함하는 개체의 혈청에 존재하는 항-Fab 항체에 의한 혈소판 활성화를 방지하는 방법을 제공한다:
(a) 중 쇄 고정 부위 및 경 쇄 고정 부위를 포함하는 GPVI에 특이적인 Fab를 제공하고
(b)상기 Fab의 중 쇄 고정 부위의 C-말단에 비-자가-항원성을 구성할 수 있는 폴리펩티드를 첨가하거나 또는 치환한다.
교차-경쟁/에피톱 (Cross-competition / Epitope)
실시 예들에서, 이 공개는 표 1-4에 공개된 항체 또는 항체 단편과 교차-경쟁하는 항체 또는 항체 단편에 관련된다. 한 실시 예에서, 현 공개는 항체 또는 항체 단편에 관련되며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 표 1-4에 공개된 항체들 중의 하나의 카벳 (Kabat)에 의해 정의된 6CDRs를 포함하는 항체 또는 항체 단편과 교차-경쟁한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 항체 또는 항체 단편에 관련되며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 6 CDRs을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 교차-경쟁하고, 여기서 HCDR1은 서열번호 11의 아미노산 서열이고, HCDR2는 서열번호 12의 아미노산 서열이고, HCDR3은 서열번호 13의 아미노산 서열이고, LCDR1은 서열번호 14의 아미노산 서열이고, LCDR2는 서열번호 15의 아미노산 서열이고 및 LCDR3은 서열번호 16의 아미노산 서열이다. 다른 실시 예에서, 현 공개는 항체 또는 항체 단편에 관련되며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 17 에 따른 VH 및 서열번호 18에 따른 VL을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 교차-경쟁한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 항체 또는 항체 단편에 관련되며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 6 CDRs을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 교차-경쟁하고, 여기서 HCDR1은 서열번호 22의 아미노산 서열이고, HCDR2는 서열번호 23의 아미노산 서열이고, HCDR3은 서열번호 24의 아미노산 서열이고, LCDR1은 서열번호 25의 아미노산 서열이고, LCDR2는 서열번호 26의 아미노산 서열이고 및 LCDR3은 서열번호 27의 아미노산 서열이다. 다른 실시 예에서, 현 공개는 항체 또는 항체 단편에 관련되며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 28 에 따른 VH 및 서열번호 29에 따른 VL을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 교차-경쟁한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 항체 또는 항체 단편에 관련되며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 6 CDRs을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 교차-경쟁하고, 여기서 HCDR1은 서열번호 34의 아미노산 서열이고, HCDR2는 서열번호 34의 아미노산 서열이고, HCDR3은 서열번호 35의 아미노산 서열이고, LCDR1은 서열번호 36의 아미노산 서열이고, LCDR2는 서열번호 37의 아미노산 서열이고 및 LCDR3은 서열번호 38의 아미노산 서열이다. 다른 실시 예에서, 현 공개는 항체 또는 항체 단편에 관련되며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 39 에 따른 VH 및 서열번호 40에 따른 VL을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 교차-경쟁한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 항체 또는 항체 단편에 관련되며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 6 CDRs을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 교차-경쟁하고, 여기서 HCDR1은 서열번호 44의 아미노산 서열이고, HCDR2는 서열번호 45의 아미노산 서열이고, HCDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열이고, LCDR1은 서열번호 47의 아미노산 서열이고, LCDR2는 서열번호 48의 아미노산 서열이고 및 LCDR3은 서열번호 49의 아미노산 서열이다. 다른 실시 예에서, 현 공개는 항체 또는 항체 단편에 관련되며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 50 에 따른 VH 및 서열번호 51에 따른 VL을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 교차-경쟁한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 표 1-4에 공개된 항체 또는 항체 단편과 교차-경쟁하고 및 표 1-4에 공개된 어느 한 항체가 GPVI에 결합하는 것을 ELISA-근거한 교차-경쟁 에세이 (ELISA-based cross-competition assay)에서 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90%로 감소하는 항체 또는 항체 단편에 관련된다. 어떤 실시 예에서, 표 1-4에 공개된 항체 또는 항체 단편과 교차-경쟁하는 항체 또는 항체 단편은 표 1-4에 서술된 항체 중 하나의 GPVI에의 결합을 실시예시 17에 따른 ELISA-근거한 교차-경쟁 에세이 (ELISA-based cross-competition assay)에서 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90%로 감소시킨다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 표 1-4에 공개된 항체들 중 어느 하나의 에피톱과 같은 에피톱에 결합하는 (예를 들어, 결합, 안정화, 공간적 분포에 의해) 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다. 더 나아간 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 표 1-4에 공개된 항체들 중 하나의 카벳 (Kabat)에 의해 정의된 6 CDR을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 같은 에피톱에 결합한다 (예를 들어, 결합으로, 안정화에 의해, 공간적 분포로). 또 다른 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 표 1-4에 공개된 항체들 중 하나의 카벳 (Kabat)에 의해 정의된 6 CDR을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 같은 GPVI의 에피톱에 결합한다 (예를 들어, 결합으로, 안정화에 의해, 공간적 분포로). 또 다른 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 표 1-4에 공개된 항체들 중 하나의 카벳 (Kabat)에 의해 정의된 6 CDR을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 같은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 같은 에피톱에 결합한다 (예를 들어, 결합으로, 안정화에 의해, 공간적 분포로).
다른 실시 예에서, 현 공개는 항체 또는 항체 단편에 관련되며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 6 CDRs을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 같은 에피톱에 결합하며, 여기서 HCDR1은 서열번호 11의 아미노산 서열이고, HCDR2는 서열번호 12의 아미노산 서열이고, HCDR3은 서열번호 13의 아미노산 서열이고, LCDR1은 서열번호 14의 아미노산 서열이고, LCDR2는 서열번호 15의 아미노산 서열이고 및 LCDR3은 서열번호 16의 아미노산 서열이다. 다른 실시 예에서, 현 공개는 항체 또는 항체 단편에 관련되며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 17 에 따른 VH 및 서열번호 18에 따른 VL을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 같은 에피톱에 결합한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 항체 또는 항체 단편에 관련되며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 6 CDRs을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 같은 에피톱에 결합하며, 여기서 HCDR1은 서열번호 22의 아미노산 서열이고, HCDR2는 서열번호 23의 아미노산 서열이고, HCDR3은 서열번호 24의 아미노산 서열이고, LCDR1은 서열번호 25의 아미노산 서열이고, LCDR2는 서열번호 26의 아미노산 서열이고 및 LCDR3은 서열번호 27의 아미노산 서열이다. 다른 실시 예에서, 현 공개는 항체 또는 항체 단편에 관련되며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 28에 따른 VH 및 서열번호 29에 따른 VL을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 같은 에피톱에 결합한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 항체 또는 항체 단편에 관련되며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 6 CDRs을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 같은 에피톱에 결합하며, 여기서 HCDR1은 서열번호 34의 아미노산 서열이고, HCDR2는 서열번호 34의 아미노산 서열이고, HCDR3은 서열번호 35의 아미노산 서열이고, LCDR1은 서열번호 36의 아미노산 서열이고, LCDR2는 서열번호 37의 아미노산 서열이고 및 LCDR3은 서열번호 38의 아미노산 서열이다. 다른 실시 예에서, 현 공개는 항체 또는 항체 단편에 관련되며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 39 따른 VH 및 서열번호 40에 따른 VL을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 같은 에피톱에 결합한다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 항체 또는 항체 단편에 관련되며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 6 CDRs을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 같은 에피톱에 결합하며, 여기서 HCDR1은 서열번호 44의 아미노산 서열이고, HCDR2는 서열번호 45의 아미노산 서열이고, HCDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열이고, LCDR1은 서열번호 47의 아미노산 서열이고, LCDR2는 서열번호 48의 아미노산 서열이고 및 LCDR3은 서열번호 49의 아미노산 서열이다. 다른 실시 예에서, 현 공개는 항체 또는 항체 단편에 관련되며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열번호 50 따른 VH 및 서열번호 51 따른 VL을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 같은 에피톱에 결합한다.
에피톱을 포함하는 주어진 폴리펩티드의 부위는 이 분야 기술에서 잘 알려진 어느 수의 에피톱 맵핑 기술을 사용하여 동정 될 수 있다. 예를 들어, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey 참조. 예를 들어, 에피톱은, 예를 들어, 고체 지지체에 많은 수의 펩티드를 동시에 합성하고, 단백질 분자의 부분에 해당하는 펩티드, 이 펩티드들이 아직 지지체에 붙어있는 상태에서 펩티드들을 항체와 반응시켜 결정할 수 있다. 그러한 기술은 이 분야 기술에서 잘 알려졌으며 및 미국 특허 번호 4,708,871 (U.S. Patent No. 4,708,871); Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715 에 서술되어 있다. 비슷하게 에피톱은 예를 들어 수소/중수소 교환 (hydrogen/deuterium exchange), x-레이 결정구조학 (x-ray crystallography) 및 2-차원 핵자기 공명 (two-dimensional nuclear magnetic resonance) 에 의한 것과 같이 아미노산의 공간적 구조를 결정하여 쉽게 동정 될 수 있다. 예를 들어, Epitope Mapping Protocols, supra 참조. 단백질의 항원성 부위는 또한, 예를 들어, 옥스퍼드 분자 그룹 (Oxford Molecular Group)으로부터 얻을 수 있는 오미가 1.0 버전 소프트웨어 프로그램 (Omiga version 1.0 software program)을 사용하여 계산된 그러한 것과 같은 표준 항원성 및 소수성 (hydropathy) 플럿을 사용하여 동정 될 수 있다. 이 컴프터 프로그램은 Hopp/Woods 방법을 사용하며, 호프 등 ((Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828)); 항원성 프로파일을 결정하기 위해를, 및 케이트-둘리틀 기술을 사용한다 (Kyte-Doolittle technique), 케이트 등 ((Kyte et al., (1982) J.MoI. 157:105-132)); 소수성 플럿을 위해.
어떤 특정실시 예에서, 현 공개의 항체와 같은 GPVI의 같은 에피톱에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 인간 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 어떤 특정실시 예에서, 현 공개의 항체와 같은 GPVI의 같은 직선 에피톱 (linear epitope) 에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 인간 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 어떤 특정실시 예에서, 현 공개의 항체와 같은 GPVI의 같은 구조적 에피톱 (conformational epitope) 에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 인간 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 그러한 인간 단일클론 항체 또는 항체 단편은 여기서 서술된 대로 제조되고 및 분리될 수 있다.
치료 방법 (Method of treatment)
현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 원하지 않는 GPVI의 존재와 관련된 혈전성 또는 맥관성 장애 또는 컨디션을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
한 실시 예에서, 현 공개는 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편을 의약품으로 사용하는 것과 관련된다. 한 실시 예에서, 현 공개는 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편을 요구하는 개체의 치료에 사용하는 것과 관련된다. 한 실시 예에서, 현 공개는 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편을 의약품 제조에 사용하는 것과 관련된다. 한 실시 예에서, 여기서 공개된 방법은 필요로 하는 개체에 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편을 투여하는 것을 포함한다. 현 공개는 또한 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 원하지 않는 GPVI의 존재와 관련된 혈전성 또는 맥관성 장애 또는 컨디션의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품의 제조에 사용하는 것과 관련이 있다.
어떤 특정 실시 예에서, 현 공개는 개체에서 혈전성 또는 맥관성 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 방법을 제공한다.
GPVI와 관련된 혈전성 또는 맥관성 (예를 들어, 심혈관) 장애 또는 컨디션은, 이것에만 국한하지는 않으나, 예를 들어, 죽상혈전증 (atherothrombosis), 허혈성 사건 (ischemic events), 급성 관상동맥 증상 (acute coronary artery syndrome), 심근 경색 (myocardial infarction) ((심장마비 (heart attack)), 급성 뇌혈관 허혈 (acute cerebrovascular ischemia) ((중풍 (stroke)), 경피적 관상동맥 중재술 (percutaneous coronary intervention), 스탠팅 혈전증 (stenting thrombosis), 허혈성 (ischemic), 재발협착증 (restenosis), 국소성빈혈 (ischemia), (급성 및 만성), 대동맥 및 이의 가지에의 장애 (disorders of the aorta and its branches) ((대동맥 동맥류 (aortic aneurysm), 혈전 (thrombosis)과 같은)), 말초 동맥 장애 (peripheral artery disorders), 정맥 혈전 (venous thrombosis), 급성 정맥염 및 폐 색전 (acute phlebitis and pulmonary embolism), 암-연관된 혈전 (cancer-associated thrombosis) ((투루소 증후군 (Trousseau syndrome)), 염증성 혈전 (inflammatory thrombosis) 및 염증에 연관된 혈전 (thrombosis associated to infection)을 포함하는 동맥 혈전을 포함할 수 있다. 더 나아가 원하지 않는 GPVI의 존재와 연관된 장애 또는 컨디션은, 이것에만 국한하지는 않으나, 예를 들어, 특발 혈소판감소 자색반증 (idiopathic thrombocytopenic purpura) (ITP) 또는 면역성 혈소판감소 (immune thrombocytopenia)와 같은 혈소판감소와 같은 출혈 장애 또는 컨디션 (예를 들어, 출혈 경향 및/또는 지속되는 출혈 시간과 같은) 이 있을 수 있다. 또 다른 실시 예에서, 원하지 않는 GPVI의 존재와 연관된 장애 또는 컨디션은 염증 및/또는 암을 포함할 수 있다.
한 실시 예에서, 여기서 공개된 방법은 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편의 치료적으로 효과 있는 양을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시 예에서, 상기 개체는 인간이다. 다른 한편의 실시 예에서는, 상기 개체는 쥐 (rat) 또는 생쥐 (mouse) 와 같은 설치류이다. 한 실시 예에서, 현 공개는 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 원하지 않는 GPVI의 존재와 연관된 장애 또는 컨디션을 치료하는데 사용에 관한 것이다.
현 공개는 더 나아가 GPVI 수용체 기능 및 그 하부 신호전달을 억제하여, 그럼으로써, 원하지 않는 GPVI의 존재와 연관된 장애 또는 컨디션을 방지 또는 치료하는 방법과 관련되며, 여기서 상기 방법은 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편을 개체에 투여하는 것을 포함한다.
현 공개는 GPVI 수용체 기능 및 그 하부 신호전달을 억제하나 혈소판 수, 혈소판 표면에 GPVI의 존재 또는 출혈 시간에는 영향을 주지 않는 방법에 관련된다.
현 공개는 더 나아가 GPVI의 콜라겐에의 결합을 방지하거나 또는 억제하여, 그럼으로써, 원하지 않는 GPVI의 존재와 연관된 장애 또는 컨디션을 치료 또는 방지하는 방법과 관련되며, 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 방법은 현 공개에 따른 GPVI 특이성인 항체 또는 항체 단편을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 한 실시 예에서, GPVI의 콜라겐에의 결합을 방지하거나 또는 억제하는 방법은 개체에서 혈소판 수, 혈소판 표면에 GPVI의 존재 또는 출혈 시간에는 영향을 주지 않는다.
현 공개는 더 나아가 콜라겐에 혈소판 부착을 억제 또는 방지하여, 이로써 GPVI 관련된 컨디션을 치료하는 방법에 관련되며, 여기서 상기 방법은 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 한 실시 예에서, GPVI의 콜라겐에의 부착을 방지하거나 또는 억제하는 방법은 개체에서 혈소판 수, 혈소판 표면에 GPVI의 존재 또는 출혈 시간에는 영향을 주지 않는다.
다른 실시 예에서, 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편은 혈소판 응집을 억제하는데 사용된다. 그러므로 현 공개는 더 나아가 콜라겐-유도된 혈소판 응집을 억제 또는 방지하여, 이로써 GPVI 관련된 컨디션을 치료하는 방법과 관련되며, 여기서 상기 방법은 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 한 실시 예에서, 콜라겐-유도된 혈소판 응집을 방지 또는 억제하는 방법은 개체에서 혈소판 수, 혈소판 표면에 GPVI의 존재 또는 출혈 시간에는 영향을 주지 않는다.
현 공개는 더 나아가 혈소판 활성화를 억제 또는 방지하여, 이로써 GPVI 관련된 컨디션을 치료하는 방법에 관련되며, 여기서 상기 방법은 현 공개에 따른 항체 또는 항체 단편을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 한 실시 예에서, 혈소판 활성화를 방지 또는 억제하는 방법은 개체에서 혈소판 수, 혈소판 표면에 GPVI의 존재 또는 출혈 시간에는 영향을 주지 않는다.
현 공개는 더 나아가 콜라겐 결합에 반응하여 개체에서 혈전 형성을 방지 또는 억제하는 방법과 관련되며, 여기서 상가 방법은 현 공개 따른 항체 또는 항체 단편을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 한 실시 예에서, 콜라겐 결합에 반응하여 개체에서 혈전 형성을 방지 또는 억제하는 방법은 개체에서 혈소판 수, 혈소판 표면에 GPVI의 존재 또는 출혈 시간에는 영향을 주지 않는다.
어떤 실시 예에서, 여기서 공개된 방법은 혈소판을 현 공개에 다른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 것이 포함된다.
한 실시 예에서, 개체는 GPVI과 관련된 장애 또는 컨디션, 바람직하게는 혈전성 또는 맥관성 장애 및/또는 사건에 의해 영향을 받고, 바람직하게는 이로 진단된다. 한 실시 예에서, 개체는 GPVI과 관련된 장애 또는 컨디션, 바람직하게는 혈전성 또는 맥관성 장애 및/또는 사건을 전개할 위험성이 있다. 위험성의 예시에는, 이것에만 국한하지 않으나, 가족력 (예를 들어, 유전적 성향과 같은), 민족성, 나이, 담배 노출, 높은 혈압 (고혈압), 높은 콜레스테롤, 비만, 신체적 비활동성, 당뇨 (특히 제 2형 당뇨), 건강하지 않은 음식 및 해로운 알콜 사용이 포함된다.
한 실시 예에서, 여기서 공개되는 방법에서 투여되는 GPVI에 특이적인 상기 항체 및 항체 단편은:
a) 서열번호 11의 HCDR1 부위, 서열번호 12의 HCDR2 부위, 서열번호 13의 HCDR3 부위, 서열번호 14의 LCDR1 부위, 서열번호 15의 LCDR2 부위 및 서열번호 16의 LCDR3 부위, 또는
b) 서열번호 22의 HCDR1 부위, 서열번호 23의 HCDR2 부위, 서열번호 24의 HCDR3 부위, 서열번호 25의 LCDR1 부위, 서열번호 26의 LCDR2 부위 및 서열번호 27의 LCDR3 부위, 또는
c) 서열번호 33의 HCDR1 부위, 서열번호 34의 HCDR2 부위, 서열번호 35의 HCDR3 부위, 서열번호 36의 LCDR1 부위, 서열번호 37의 LCDR2 부위 및 서열번호 38의 LCDR3 부위, 또는
d) 서열번호 44의 HCDR1 부위, 서열번호 45의 HCDR2 부위, 서열번호 46의 HCDR3 부위, 서열번호 47의 LCDR1 부위, 서열번호 48의 LCDR2 부위 및 서열번호 49의 LCDR3 부위를 포함한다.
더 나아간 실시 예에서 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 17의 VH 및 서열번호 18의 VL 또는
b) 서열번호 28의 VH 및 서열번호 29의 VL 또는
c) 서열번호 39의 VH 및 서열번호 40의 VL 또는
d) 서열번호 50의 VH 및 서열번호 51의 VL 또는
서열번호 17, 28, 39 또는 50의 VH 및 서열번호 18, 29, 40 또는 51의 VL과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90, 또는 적어도 95% 상동성을 갖는 VH 및 VL을 포함한다.
더 나아간 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 20의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
b) 서열번호 21의 HC 및 서열번호 19의 LC 또는
c) 서열번호 31의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
d) 서열번호 32의 HC 및 서열번호 30의 LC 또는
e) 서열번호 42의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
f) 서열번호 43의 HC 및 서열번호 41의 LC 또는
g) 서열번호 53의 HC 및 서열번호 52의 LC 또는
h) 서열번호 54의 HC 및 서열번호 52의 LC를 포함한다.
한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 항체 또는 항체 단편이다, 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 단일클론 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편은 scFv, Fv, Fab 및 Fab'로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 실시 예에서, 상기 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편은 Fab 이다.
조성물 (Compositions)
현 공개의 조성물은, 혈전성 및 맥관성 장애를 예방 또는 치료하기 위한, 바람직하게는 다. 그러한 담체, 희석제 또는 부형제는 이 분야 기술에서 잘 알려졌으며, 및 이 분야 기술 전문가는 개체를 현 공개의 GPVI 항체 및 항체 단편으로 치료하기에 가장 적합한 제형 및 투여 경로를 찾을 것이다.
한 실시 예에서, 현 공개는 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관련된 것이다.
이 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 부형제는, 이것에만 국한되지 않으나, 이온 교환기 (ion exchangers), 알루미나 (alumina), 알루미늄 스테아레이트 (aluminum stearate), 레시틴 (lecithin), 인간 혈청 알부민 (albumin)과 같은 혈청 단백질 (serum proteins), 인산염과 같은 버퍼 물질 (buffer substances), 글라이신 (glycine), 소르빅 에시드 (sorbic acid), 포타슘 소르베이트 (potassium sorbate), 포화 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물 (partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids), 물, 소금 또는 프로타민 설페이트 (protamine sulfate)와 같은 전해질 (electrolytes), 디소듐 하이드로젠 포스페이트 (disodium hydrogen phosphate), 포타슘 하이드로젠 포스페이트 (potassium hydrogen phosphate), 소듐 클로라이드 (sodium chloride), 아연 염 (zinc salt), 콜로이드성 실리카 (colloidal silica), 마그네슘 트리실리케이트 (magnesium trisilicate), 폴리비닐 피롤리돈 (polyvinyl pyrrolidone), 셀루로오즈-근거한 물질 (cellulose-based substances) ((예를 들어, 소듐 카복시메틸셀루로오즈 (sodium carboxymethylcellulose)), 폴리에틸렌 글라이콜 (polyethylene glycol), 폴리아크릴레이트 (polyacrylates), 왁스 (waxes), 폴리에틸렌- 폴리옥시프로필렌-블럭 폴리머 (polyethylene- polyoxypropylene- block polymers), 폴리에틸렌 글라이콜 (polyethylene glycol) 및 울 지방 (wool fat)이 포함된다.
한 실시 예에서, GPVI에 특이적인 상기 항체 또는 항체 단편은 약학적으로 또는 치료적으로 효과적인 양이 존재한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약학적 조성물을 원하지 않는 GPVI의 존재와 연관된 장애 또는 컨디션을 치료하는데 사용하는 것과 관련된다. 다른 실시 예에서, 원하지 않는 GPVI의 존재와 연관된 상기 컨디션은 혈전성 또는 맥관성 장애이다. 한 실시 예에서, 현 공개는 여기서 공개된 대로 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 포함하는 상기 약학적 조성물을 원하지 않는 GPVI의 존재와 연관된 장애 또는 컨디션을 치료하는 의약품 제조에 사용하는 것과 관련된다. 다른 실시 예에서, 원하지 않는 GPVI의 존재와 연관된 상기 장애 또는 컨디션은 혈전성 또는 맥관성 장애이다. 한 실시 예에서, 현 공개는 원하지 않는 GPVI의 존재와 연관된 장애 또는 컨디션을 치료하는 상기 약학적 조성물을 사용하는 것과 관련된다. 다른 실시 예에서, 원하지 않는 GPVI의 존재와 연관된 상기 장애 및 컨디션은 혈전성 또는 맥관성 장애이다.
여기서 제공된 다른 실시 예에서는, 개체에서 혈전성 또는 맥관성 장애를 치료하는 방법이며, 이 방법은 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편의 치료적으로 효과적인 양을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법이다. 다른 실시 예에서, 개체는 이를 요구하는 개체이다. 바람직한 실시 예에서 상기 개체는 인간이다. 다른 한편의 실시 예에서 상기 개체는 쥐 또는 생쥐와 같은, 설치류이다. 한 실시 예에서, 현 공개는 표 1-4에 공개된 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 한 실시 예에서, 상기 약학적 조성물은 혈전성 및 맥관성 장애를 치료 또는 예방하기 위한 것이다.
다른 실시 예에서, 현 공개는 개체에서 혈전성 및 맥관성 장애를 예방하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 현 공개의 항체 또는 항체 단편 또는 그러한 항체 또는 항체 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 혈전성 및 맥관성 장애 치료를 위하여 투여하는 것을 포함한다.
이 문맥에서 사용된 대로 "예방 ("Prophylaxis)" 은 장애의 시작을 방지하는 목적의 방법 또는 장애의 시작을 연기하는 방법을 의미한다. 어떤 실시 예에서는 상기 개체는 인간이다. 다른 한편의 실시 예에서 상기 개체는 쥐 또는 생쥐와 같은 설치류이다.
여기서 사용된 "투여 (administration)" 라는 용어는 피하 (subcutaneous), 정맥 (intravenous), 근육 내 (intramuscular), 관절-내 (intra-articular), 척수 내의 (intraspinally), 윤활액 내 (intra-synovial), 흉골 내 (intrasternal), 척추강 내 (intrathecal), 간 내 (intrahepatic), 병변 내 (intralesional) 및 두개 내 (intracranial) 주사 또는 주입 기술이 포함된다.
한 실시 예에서, 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 포함하는 현 공개의 조성물은 정맥으로 투여된다. 바람직하게는, 치료적으로 효과 있는 양의 현 공개의 항체 또는 항체 단편이 이를 필요로 하는 개체에게 투여된다.
현 공개의 항체 또는 항체 단편, 현 공개의 조성물, 약학적 조성물 또는 의약품의 총 하루 용법은 건전한 의학적 판단 내에서 주치의에 의해 결정될 것이라는 것이 이해될 것이다. 어느 특정한 환자를 위한 특별한 치료적으로 효과적인 용량 수준은 치료될 장애 및 장애의 심각도; 적용되는 특정한 단백질의 활성; 적용되는 특별한 조성물, 이, 몸무게, 일반적이 건강, 성별 및 개체의 음식; 투여 시간, 투여 경로, 및 적용된 특별한 단백질의 배출 비율; 치료 기간: 적용된 특별한 단백질과 조합으로 또는 동시에 사용된 약물; 및 의학 기술분야에서 잘 알려진 인자들과 같은 인자들을 포함하는 다양한 인자들에 의존할 것이다. 예를 들어, 화합물의 용량을 원하는 치료적 효과를 달성하는데 필요한 용량보다 더 낮은 수준에서 용량을 시작하고 및 원하는 효과가 달성될 때까지 점차 용량을 증가하는 것이 이 분야의 기술 내에 잘 있다. 그러나 항체 또는 항체 단편의 하루의 용량은 개체 당 하루 당 0.01 에서 500mg의 넓은 범위에 따라 변화할 수 있다. 바람직하게, 조성물은 치료될 환자에 증상적 조절을 위한 용량 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500mg의 활성 성분을 함유한다. 투약은 전형적으로 0.01 mg 내지 1000mg의 활성 성분을, 바람직하게는 1mg에서 500mg의 활성 성분을 함유한다.
한 실시 예에서, 현 공개는 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물을 원하지 않는 GPVI의 존재와 관련된 장애 또는 컨디션 또는 GPVI 관련된 컨디션의 치료 및/또는 방지 및/또는 예방 및/또는 치유를 동시에, 별도로, 또는 연속적으로 사용을 위한 약학적 제제의 제조를 위하여 사용하는 것에 관련된다. 바람직한 실시 예에서, 현 공개의 조성물은 바람직하게는 GPVI에 특이적인 Fab를 포함하는 약학적 조성물이다.
동정 방법 (Methods of Identification)
한 실시 예에서, 현 공개는 GPVI에 특이적인 길항적 항체 또는 항체 단편을 동정하는 하기의 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
a) 포유류의 혈소판 풍부한 혈장을 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편과 접촉시키고
b) 콜라겐을 첨가하여 혈소판 응집을 시작하고
c) 단계 b)에서 결정된 대로의 응집을 단계 a)의 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 첨가하지 않고 혈소판 풍부한 혈장에 콜라겐을 첨가했을 때 얻어진 응집과 비교하고,
여기서 단계 (a)에서 서술된 대로 항체 또는 항체 단편의 존재에서 혈소판 응집의 감소는 상기 항체 또는 항체 단편이 현 공개에 따른 GPVI의 억제제 또는 길항제임을 제시한다.
한 실시 예에서, 혈소판 응집의 감소는 단계 (a)에서 서술된 항체 또는 항체 단편의 존재하에서 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%까지 감소된다.
진단제 (Diagnostics)
현 공개는 더 나아가 현 공개에 따른 GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 생물학적 샘플에서 GPVI을 검출하기 위하여 사용하는 것과 관련된다. 현 공개의 항체 또는 항체 단편이 사용될 수 있는 에세이의 예시에는, 이것에만 국한하지 않으나, ELISA, 샌드위치 ELISA (sandwich ELISA), RIA, FRCS, 조직 면역조직화학 (tissue immunohistochemistry), 웨스턴-블럿 (Western-blot), 및 면역 침강 (immunoprecipitation)이 포함된다. 한 실시 예에서, 현 공개의 항체 또는 항체 단편은 진단을 위해 또는 검출 목적으로 라벨 될 수 있다. 여기서 라벨은 화합물의 검출을 할 수 있게 붙어 있는 적어도 하나의 요소, 동위원소 또는 화학적 화합물을 갖는 것을 의미한다.
현 공개의 한 실시 예에서, GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편은 GPVI 발현의 변화를 진단하는데 사용될 수 있다. 혈소판 표면에 GPVI 발현의 변화는 물론 혈장에 용해성 GPVI (GPVI의 쪼개진 세포 외 도메인)의 존재 및 농축은 급성 관상동맥 증후군, 일과성 허혈성 발작 또는 중풍과 같은 병리 생리학적 컨디션과 연관될 수 있는 것으로 서술된다 (Bigalke B, et al., Eur J Neurol., 2009Jul 21 ; Bigalke B. et al., Semin Thromb Hemost. 2007 Mar;33(2): 179-84).
그러므로 이들 계수의 측정은 항-혈전성 치료를 요구하고 및 항-GPVI 치료에 가능하게 특별하게 감수성이 있는 위에서 언급된 컨디션의 위험성이 있는 개체를 동정하는데 사용될 수 있다. 그러므로 여기서 서술된 항체 및 항체 단편은 진단 도구로서 사용될 수 있으며 및 혈소판 표면은 물론 혈장 샘플에서 GPVI의 존재 및 정량적 변화를 결정하는 진단 키트의 일부로 사용될 수 있다.
개체에서 GPVI의 변화를 진단하는 그러한 방법은:
a) 상기 환자의 혈소판 또는 혈장 샘플을 현 공개에 따른 항체 및 항체 단편과 접촉시키고
b) 상기 항체 및 항체 단편의 상기 샘플에 있는 세포에의 결합을 측정하고, 및
c) 단계 (ii)에서 측정된 결합을 정상 참조 개체 또는 표준의 결합과 비교하는 것을 포함할 수 있다.
현 공개의 다른 목적은 적어도 이 공개의 항체 및 항체 단편을 포함하는 키트다. "키트 (kit)"는 적어도 하나의 시약, 즉, 예를 들어, GPVI의 발현을 특별히 검출하기 위한 항체 및 항체 단편을 포함하는 어느 제작물 (예를 들어, 포장 또는 용기)을 의미한다. 키트는 현 발명의 방법을 수행하기 위하여 하나의 유닛으로서 홍보되고, 배포되고 및 팔릴 수 있다. 더 나아가, 키트 시약의 어느 또는 모두는 봉인된 용기와 같은, 외부 환경으로부터 보호될 수 있는 용기 내로 제공될 수 있다. 키트는 키트 및 이의 사용방법을 서술하는 포장 삽입물을 또한 함유할 수 있다.
항체 서열 (Antibody Sequences)
표 1: Fab #1의 항체 서열
표 2: Fab #2의 항체 서열
표 3: Fab #3의 항체 서열
표 4: Fab #4의 항체 서열
표 13: WO2011073954로부터 유래 된 참조Fab #1 (RefFab#1) 항체
작업용 실시 예시 (Working Examples)
실시예시 1: 항원 생성 및 품질 관리 (Antigen Generation and Quality Control)
인간, 시아노몰거스 원숭이 (cynomolgus monkey), 생쥐 (mouse) 및 쥐 (rat) 로부터의 GPVI 아미노산 서열은 공공으로 구할 수 있는 소스로부터 ((예를 들어, 유니프로트 (Uniprot)) 추출하였으며 및 자체적으로 (in-house) 생산되었다.
재조합 용해성 세포 외 도메인 (Recombinant soluble
Extracellular
Domains)
용해성 GPVI는 인간 Fc 서열에 이의 C-말단이 융합된 GPVI의 세포 외 도메인에 해당한다. 이 용해성 GPVI는 GPVI-Fc로서 언급될 수도 있다.
인간 GPVI-1A (서열번호 4), 인간 GPVI-1B (서열번호 5), 인간 GPVI-2A; 서열번호 6), 시아노몰거스 원숭이 (cynomolgus monkey) GPVI (서열번호 7), 생쥐 (mouse) GPVI (서열번호 8) 및 쥐 (rat) GPVI (서열번호 9) 의 세포 외 도메인(extracellular domain) (ECD)이 발현 벡터 pMAX_vk_Fc2(K105-K330)에 KpnI 및 EcoRV 를 사용하여 클론되어 결과적으로 C-말단 Fc2(K105-K330) 융합 구조체가 되었다. Fc2(K105-K330)는 서열번호 10에 공개된 아미노산 서열을 가지고 있다.
인간, 시아노몰거스 원숭이, 생쥐, 쥐의 세포 외 도메인을 암호화하는 DNA는 N-말단 Vκ 리더 서열 및 C-말단 인간 IgG Fc-tag 에 프레임에 맞게, pcDNA3 에 근거한 수정된 발현 벡터인, pMAX 발현 벡터에 ((터모휘셔 (Thermo Fisher)) 클론 되었다. HKB11 #52 ((모 클론 (Parental clone): US patent 6,136599. J. Biomed. Sci. 2002;9:631-638)) 세포는 2.0 mM L-알라닐 (Alanyl)-L-글루타민 (Glutamine), 0.1 % PF-68을 함유하는 MAC1.0 배지에서 습기 있는 CO2 배양기에서 37 °C 로 6 % CO2로 유지시켰다. HKB11 #52 세포는 접종 일일 후에 제조사의 안내에 따라FectoProTM 및 FectoProTM 부스터 (Booster) (Polyplus) 로 일시적으로 형질감염 (transfect) 시켰다. 세포는 3일 동안 배양하였으며 및 컨디션 된 세포 배양 상등액은 원심분리로 모으고 이어서 멸균 여과시켰다. 항원은 HiTrap MabSelect SuRe 컬럼 (GE Healthcare)를 사용하여 단백질 A 크로마토그래피 (Protein A chromatography) 로 정제하였다. 결합 및 세척 후에 단백질은 100 mM 글라이신 (Glycin) pH 3.0으로 용출시켰다. 모든 친화력 크로마토그래피 단계는 
KTA Express (GE Healthcare) 크로마토그래피 시스템을 사용하여 수행되었다. 샘플은 이어서 중화시키고 (3M Tris pH 8로) 및 PD10 컬럼을 사용하여 PBS로 버퍼-교환시켰다. 샘플의 질은 변형시킨, 환원성 또는 비-환원성 SDS-PAGE, HP-SEC 및 DLS로 분석하였다.
GPVI 과발현하는 재조합 세포 (Recombinant cells overexpressing GPVI
CHO 세포를 인간 GPVI (서열번호 1) 나, 시아노몰거스 원숭이 (cynomolgus monkey) GPVI (서열번호 2) 나 또는 생쥐 (mouse) GPVI (서열번호 3) 로 안정적으로 형질감염시켰다.
Flp-In CHO 세포 ((인비트로젠 (Invitrogen))를 인간, 시아노몰거스 또는 생쥐 GPVI의 전장 단백질을 암호화하는 pcDNA5/FRT/TO 벡터로 리포펙타민 2000 (Lipofectamine 2000) (Invitrogen) 을 형질감염 시약으로 사용하여 안정적으로 형질감염시켰다. 세포는 하이그로마이신 B (Hygromycin B)(Roth) 을 함유하는 선택 배지에서 하기에 서술된 대로 유동세포분석 (fluorocytometry) 으로 균일하게 GPVI-발현하는 세포 집단이 관찰될 때까지 배양시켰다. 세포 은행 (cell bank)이 만들어졌으며 및 다음 실험에 사용되었다.
쥐 호염기성 RBL-2H3 세포 (ACC 312, DSMZ)에 전장 인간 GPVI를 암호화하는 pcDNA3.1 벡터를 리포펙타민 2000 (Lipofectamine 2000) (Invitrogen) 을 형질감염 시약으로 사용하여 안정적으로 형질감염시켰다. 세포는 제네티신 (Geneticin) (Gibco)을 함유하는 선택 배지에서 4주 동안 배양시켰다. 높은 GPVI 발현을 가진 세포의 단일 클론 (single clone) 선택을 FACS Aria 세포 분류기 (FACS Aria cell sorter) (BD Biosciences)를 사용하여 수행하였다. 단일 클론은 선택 배지에서 확장시켰으며 및 GPVI의 발현 수준은 유동세포분석으로 체크 하였다. 가장 강한 GPVI 발현을 가진 세포 클론을 세포 은행 생성을 위해 선택하였으며 및 더 나아간 실험에 사용되었다.
형질감염된 세포의 GPVI 발현 수준의 유동세포분석 평가를 위하여, 세포는 슈퍼블록 (Superblock) (Thermo Scientific)에 블록 시키고 (blocked) 및 이어서 슈퍼블록에 최종 농도 5 μg/ml로 희석시킨 GPVI-특이 Fab로 얼음에서 60분 동안 배양시켰다. 3% 태아 소 혈청 (fetal calf serum )(FCS) 및 0.02% 소듐 아자이드 (sodium azide)로 보충된 PBS로 세척 후, 세포는 슈퍼블록에 희석시킨 PE-접합 된 항-F(ab')2 검출 항체 (PE-conjugated anti-F(ab')2 detection antibody) (Jackson Immuno Research)로 얼음에서 30분 동안 배양시켰다. 세포는 다시 세척시키고 및 세포는 FACS 어레이 (FACS Array) (BD Biosciences)에서 평가되었다.
실시예시 2:
모르포시
-
이란티아
TM
라이브러리 (
MorphoSys
-
Ylanthia
TM
library)로부터 GPVI 특이적인 항체 선택
항체 생성을 위하여 GPVI에 대한 Fab 단편을 선택하기 위하여 모르포시스-이란티아® 라이브러리 (MorphoSys Ylanthia® library) 가 사용되었다. 모르포시스-이란티아® 라이브러리 (MorphoSys Ylanthia® library) (Tiller et al. mAbs 5:3, 1-26; May/June (2013) 및 U.S. Patent No. 8,728,981)는 상업적으로 구할 수 있는 파게미드 라이브러리 (phagemid library)이며 및 파지 표면 (phage surface)에 Fab를 내보이는 시스디스플레이 (CysDisplay®) 기술을 적용한다 (Lohning et al., WO2001/05950).
GPVI 특이적인 항체를 동정하기 위하여 다른 패닝 전략 (panning strategies)이 적용되었다. 각 패닝 전략은 실시예시 1에 서술된 대로 다른 종으로부터의 여러 GPVI 항원에 (용해성 ECD-Fc 융합으로서 또는 CHO-세포에 과발현으로서) 대하여 적어도 3회의 개별적인 패닝을 포함한다. 분리되고 및 동정 된 클론은 친화력, 기능성 및 안정성을 증가시키기 위하여 성숙시키고 및 조작되었다. 따라서, 몇백 개 클론들이 스크리닝 되었으며 및 그 기능성은 예를 들어, 하기를 포함하는 시험관 내 에세이에서 철저하게 검사되었다:
ELISA, 세포-ELISA (Cell-ELISA) 및/또는 용액 평형 적정 (Solution equilibrium titration) (SET)에 의해 결정된 인간, 시아노몰거스 원숭이, 생쥐 및 쥐 GPVI에의 결합,
GPVI의 다른 콜라겐 기질에의 GPVI 결합의 억제.
최종으로, 4개의 선도 분자 (lead molecules) (Fab#1, Fab#2, Fab#3, Fab#4) 가 선택되었으며 및 하기에 요약된 대로 작업용 실시예시들 (working examples)에서 더 나아가 서술된다.
4개의 선도 Fab 분자 각 각이 생성되었으며 및 두 개의 변이체로 생산되었다; 야생형 인간 Fab 중 쇄 고정 부위를 가지거나 또는 서열번호 113에 따른 인간 중 쇄 고정 부위를 가진다.
포유류 생산을 위하여, 인간 Fab 단편은 서브-클로닝 과정으로 박테리아에서 포유류 Fab 형태 (format) 로 전환되었다. 항체를 암호화하는 벡터는 효소적으로 소화되고 및 결과로 얻어진 벡터 뼈대를 이란티아 포유류 발현 카세트 (Ylanthia® mammalian expression cassette)와 연결 시키고 및 더 나아가 해당하는 포유류 인간 Fab 벡터에 서부-클론하였다.
현 공개에 따른 수정된 중 쇄 고정 부위 (modified heavy chain constant regions)를 생성하기 위하여, 전체 디자인된 중 쇄 고정 부위를 암호화하는 DNA가 이중-나선 DNA 단편으로 합성되었다. 호모로지가 겹치는 서열을 가진 수정된 중 쇄 고정 부위를 포함하는 결과의 합성 선상 DNA 단편은 이어서 모 Fab (parent Fab) 중 쇄 고정 부위를 대체하면서 매끄럽게 해당하는 포유류 인간 Fab 벡터에 클론 되었다.
발현과 정제를 위하여, 진핵 HKB11 세포는 Fab 중 쇄 및 경 쇄 둘 다를 암호화하는 pYMex10 진핵 발현 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후에 세포 배양 상등액이 수집되고 및 항체 정제를 위하여 캡처 선택 IgG-CH1 친화력 크로마토그래피 (Capture select IgG-CH1 affinity chromatography) (MabSelect SURE, GE Healthcare)가 수행되도록 하였다. 모든 샘플은 멸균 여과되었다 (0.2 μm 구멍크기). Fab의 순도는 변성된, 환원된 및 비-환원된 컨디션 하에서 랩칩 시스템 (Labchip System) (Caliper GXII, Perkin Elmer)을 사용하여 또는 SDS-PAGE 에서 분석되었다. 단백질 농도는 UV-스펙트로포토메트리 (UV-spectrophotometry )로 결정되었으며 및 IgG 제조물을 자연 상태에서 분석하기 위하여 HP-SEC가 수행되었다.
참조 대조군 항체 RefFab #1 (Reference Control Antibody RefFab #1): WO2011073954A2 (SANOFI) 에 공개된 인간화된 GPVI 항체의 VH (서열번호 99) 및 VL (서열번호 100) 을 암호화하는 핵산 서열은 적절한 인접 부위와 (예를 들어, 적절한 제한효소 인식부위, 링커 서열) 함께 자체적으로 또는 외부 공급자에 의해 선상 DNA 단편으로서 유전자 합성되었다. 모든 합성된 DNA 단편은 추가로 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 Fab 중 쇄의 C-말단에 글라이신-세린 링커 glycin-serin linker (G4S)2 를 첨가하여 적합한 포유류 Fab 발현 벡터 (위에서 서술된 대로)에 클론 되었다.
실시예시 3: ELISA로 측정된 단일가
Fab의
인간,
시아노몰거스
원숭이, 생쥐, 및 쥐
GPVI에의
결합 (Binding of
monovalent
Fab
to human,
cynomolgus
monkey, mouse, and rat GPVI determined by ELISA)
재료 및 방법 (Materials and methods)
0.5 - 2 nM의 재조합 GPVI-Fc-융합 단백질 (실시 예시 1에서 서술된 대로)을 맥시솝 마이크로타이터 플레이트 (Maxisorp microtiter plates)에 4°C 에서 하룻밤 동안 코팅 시켰다. 플레이트를 0.05% Tween-20 로 보충된 PBS (PBST)로 세척하고 및 이어서 PBS에 희석시킨 5% 스킴 밀크 가루 (skim milk powder) (MPBS)로 1시간 동안 실온에서 (RT) 차단 시켰다. PBST로 세척한 후에, 5% 스킴 밀크 가루가 있는 PBST (MPBST) 에 600 nM 에서 1 pM의 범위의 농도로 시리즈로 희석시킨 Fabs ((수정된 중 쇄 고정 부위 (modified heavy chain constant region)를 포함하는))를 1시간 동안 RT에서 첨가하였다. 플레이트는 PBST로 세척시켰다. 결합한 Fab는 MPBST에 희석시키고 및 인간 F(ab')2 단편 ((human F(ab')2 fragment)) 에 대하여 만들어진 알카라인 포스파타아제-접합 된 검출 항체 (alkaline phosphatase-conjugated detection antibody)(Jackson Immuno Research) 를 사용하여 검출하였다. 0.05% Tween-20으로 보충된 TBS로 (TBST) 세척 후에, ddH2O로 희석된 AttoPhos 기질을 첨가시키고 및 형광 강도는 테칸 인피니트 200프로 리더 (Tecan Infinite 200Pro reader)에서 측정하였다. EC50 값은 프리즘 5 소프트웨어 (Prism 5 software) (GraphPad)를 사용하여 계산되었다.
인간, 시아노몰거스 원숭이, 생쥐 및 쥐 GPVI의 세포 외 도메인에 사용된 서열은 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9에서 서술된다.
결과 및 결론 (Results and conclusions)
표 5에서 보여준 대로, 모든 Fabs (수정된 중 쇄 고정 부위 포함하는)는 인간 GPVI 아이소폼 (isoforms) 및 일배체 (haplotypes)에 결합했고 및 시아노몰거스 원숭이 GPVI와 교차-반응적이었다. 현 공개에 따른 Fab#1 - Fab#4와 반대로, RefFab#1는 재조합 생쥐 및 쥐 GPVIdp 결합하지 않았다.
표 5: ELISA에서 다른 종의 재조합 GPVI-Fc 융합 단백질에 Fab의 결합. 두 실험의 평균 EC50 값 ± 표준 오차 (SD)가 보여진다. Fab#2 에는 단지 하나의 데이터 세트만이 얻을 수 있다. nep: 평가 불가능 (불완전한 적정 때문에 EC50 계산 없음)
실시 예시 4: 세포-ELISA 측정된 재조합 세포의 세포 표면에 발현된 인간, 시아노몰거스 원숭이, 또는 생쥐
GPVI에의
단일가
Fab
결합 (Binding of monovalent
Fab
to human,
cynomolgus
monkey or mouse
GPVI
expressed on the cell surface of recombinant cells determined by Cell-ELISA)
재료 및 방법
인간, 시아노몰거스 원숭이, 또는 생쥐 GPVI ((서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 각각 및 실시 예시 1에서 서술된 대로)로 안정적으로 형질감염된 CHO 세포를 96 웰 높은 결합 플레이트 (96 well high bind plate) (Meso Scale Discovery)에 성장 배지에서 5000 세포/웰의 밀도로 접종시키고 및 37°C 및 5% CO2에서 하룻밤 동안 배양시켰다. 세포는 5% BSA로 보충된 PBS로 차단 시키고 (blocked) 및 그 후 5% BSA로 보충된 PBS로 300 nM 에서 5 pM 사이의 농도로 시리즈로 희석시킨 Fab (수정된 중 쇄 고정 부위를 포함) 와 함께 배양시켰다. 세척 후, 결합 된 Fab는 인간 F(ab')2 단편에 대한 ECL-접합 된 검출 항체 (Jackson Immuno Research)를 사용하여 검출되었다. 섹터 이메져 6000 (Sector Imager6000) (Meso Scale Discovery)에서 읽기(readout) 전에 MSD 리드 버퍼 (MSD read buffer) (Meso Scale Discovery) 가 세포에 첨가되었다. EC50 값은 프리즘 5 소프트웨어 (Prism 5 software) (GraphPad)를 사용하여 계산되었다
결과 및 결론 (Results and conclusions)
표 6 에서 보여준 대로, Fab#1 - Fab#4 (수정된 중 쇄 고정 부위를 포함) 는 세포에 발현된 인간 및 시아노몰거스 원숭이 GPVI 를 인식했으며 및 세포 표면에 발현된 생쥐 GPVI에 결합을 보였다. ELISA에서 보여준 대로, RefFab#1은 설치류 GPVI를 발현하는 세포에 결합하지 않았다.
표 6: 세포 ELISA (Cell ELISA)에서 다른 종으로부터의 GPVI를 과발현하는 CHO세포에의 Fabs의 결합. 2-3 실험의 평균 EC50 값 ± SD을 보여준다. nep: 평가가 불가능 (불완전한 적정 때문에 EC50 계산 없음).
실시 예시 5: 용액 평형 적정 (solution equilibrium titration) (SET)에 의해 결정된 단일가
Fabs의
GPVI에
친화력 결정 (Affinity determination for monovalent Fabs on GPVI determined by solution equilibrium titration)(SET)
재료 및 방법 (Materials and methods)
KD 결정을 위해, 분석적 SEC (analytical SEC)로 분석된 대로, 적어도 90%의 단량체 내용을 함유하는 Fab 단백질의 단량체 부분이 사용되었다. 용액에서의 친화력 결정은 기본적으로 문헌 (Friguet et al. 1985) 에 서술된 대로 수행되었다. SET 방법의 민감도 및 정확도를 개선 시키기 위하여, 고전적인 ELISA에서 ECL-근거한 기술 (Haenel et al. 2005)로 이전하였다.
1 mg/mL 염소-항-인간 (Fab)2 단편 특이 항체 ((goat-anti-human (Fab)2 fragment specific antibodies)) (Dianova) 를 제조사의 안내에 따라 MSD Sulfo TAGTM NHS-Ester (Meso Scale Discovery │ Gaithersburg MD │ USA) 로 라벨 시켰다. 실험은 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트에서 0.5% BSA 및 0.02% Tween20을 함유하는 PBS (GIBCO 14190 │pH 7.0-7.2)를 에세이 버퍼로 하여 수행되었다. 라벨 되지 않은 인간 GPVI-Fc (서열번호 4), 시아노몰거스 원숭이 GPVI-Fc (서열번호 7), 및 생쥐 GPVI-Fc (서열번호 8) (실시 예시 1에서 제조된 대로)의 시리즈 희석 (serial dilutions) 이 적어도 예상되는 KD보다 10배 더 높은 농도에서 시작하여 제조되었다. 항원이 없는 웰은 Bmax 값을 결정하기 위하여 사용되었다; 단지 에세이 버퍼만 함유하는 웰은 배경 (background)을 결정하기 위하여 사용되었다. 적절한 양의 결합제를 (예상되는 KD와 비슷한 또는 낮은 항체 농도, 60 μL 최종 부피) 첨가한 후, 혼합물은 RT에서 하룻밤 동안 배양시켰다. MSD 플레이트는 항원 또는 바이오티닐화된 항원 (biotinylated antigen) 으로 각각 표준 (standard) 및 스트랩타비딘 (streptavidin) 플레이트 (plates)에 코팅시켰다 (웰 당 30 μL). 0.05% Tween 20이 있는 PBS로 플레이트를 세척한 후, 평형 된 샘플이 플레이트로 옮겨졌으며 및 20분 동안 배양되었다. 배양 후 웰 당 30 μL의 MSD-Sulfo-tag 라벨 된 검출 항체 ((항-인간 (Fa)2 │ 최종 희석 전형적으로 1:2,000))가 세척된 MSD 플레이트에 첨가되었으며 및 RT에서 에펜도르프 진탕기 (Eppendorf shaker)(700 rpm)에서 30분 동안 배양시켰다. MDS 플레이트를 세척시키고 및 30 μL/웰의 계면활성제가 있는 MSD 리드 버퍼 T (TMSD Read Buffer T)를 첨가한 후, 전기화학적발광 신호 (electrochemiluminescence signals)가 섹터 이메져 6000 (Sector Imager 6000)(Meso Scale Discovery │ Gaithersburg MD │ USA)를 사용하여 검출되었다. 데이터는 맞춤형 적용 모델 (customized fitting models)을 적용하여 XLfit (IDBS) 소프트웨어로 평가되었다. Fabs의 KD 결정을 위하여 (Haenel et al. 2005)에 따른 적용 모델 (fit model), (Abraham et al.)에 따른 수정된 모델이 사용되었다.
결과 및 결론 (Results and conclusions)
결과는 표 7에 요약되었다. 모든 검사된 현 공개의 Fabs (수정된 중 쇄 고정 부위를 포함) 는 인간 및 시아노몰거스 원숭이 GPVI에 두 자리 수 피코몰 범위 (double digit picomolar range)에서 친화력을 보였다. Fab#1 및 Fab#2 결합한 생쥐 GPVI이 각각 28 nM 및 7 nM의 약한 친화력을 가지는 반면에, Fab#4 및 Fab#3은 생쥐 GPVI에 서브-나노몰 (sub-nanomlar)의 친화력을 보였다. ELISA 및 세포 ELISA로 확인된 대로, RefFab#1 는 결합이 없기 때문에, RefFab#1에 대해서는 생쥐 GPVI에 대한 친화력이 결정되지 않았다.
표 7: 다른 GPVI 종에 대한 항-GPVI-Fabs의 친화력. 1-2 실험의 평균 KD 값 ± SD를 보여준다.
실시 예시 6:
FACS로
결정된 인간,
시아노몰거스
원숭이, 또는 생쥐 혈소판의 세포 표면에 발현된
GPVI에의
단일가
Fab
결합 (Binding of
monovlant
Fabs
to GPVI expressed on the cell surface of human,
cynomolgus
monkey or mouse platelets determined by FACS)
재료 및 방법 (Materials and methods)
시트르산 첨가된 전 혈 (citrated whole blood)을 150x g에서 정지 없이 15분 동안 원심분리하여 4 공여자까지로부터 혈소판-풍부한 혈장 (Platelet-rich plasma) (PRP)이 제조 되었다. 결과의 상등액은 아래에 놓여있는 백혈구 풍부한 중간상을 교란시키지 않으면서 PRP로서 새로운 샘플 튜브에 옮겼다. 프로스타사이클린 I2 (Prostacyclin I2) (PGI2; Epoprostenol-Rotexmedica)로 보충된 티로이드 버퍼 (Tyrode's buffer)로 조심하여 세척한 후, 혈소판은 Tyrode's/PGI2 에 재현 탁 시키고 및 96 웰 V-바닥 마이크로타이터 플레이트에 옮겼다. 혈소판은 Fab (수정된 중 쇄 고정 부위를 포함)로 스파이크시키고 (spiked), 최종농도 0.015 - 30 μg/ml 사이로 Tyrode's/PGI2로 희석시키고 및 RT에서 30분 동안 배양시켰다. 혈소판은 결합하지 않은 Fab를 제거하기 위하여 조심스럽게 세척시키고 및 그 후 RT에서 30분 동안 파이코에리트린 (PE))-접합 된 검출 항체 (Phycoerythrine (PE)-conjugated detection antibody) (Jackson ImmunoResearch) 로 배양시켰다. RT에서 30분 동안 배양한 후, 혈소판은 FACS Canto II (Becton Dickinson)에서 유동세포분석으로 분석되었다. PE (도 1D)와 직접 접합 된 Fab의 경우, 검출 항체와의 배양은 배제하였다. 데이터는 FACS Diva 소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용하여 평가되었다. EC50 값은 프리즘 5 소프트웨어 (Prism 5 software) (Graph Pad)를 사용하여 계산되었다.
결과 및 결론 (Results and conclusions)
한 예시적인 공여자로부터의 혈액 혈소판에 현 공개의 모든 Fab (수정된 중 쇄 고정 부위를 포함) 에 대해 얻은 결과는 도 1A-C에 보여준다. 세 인간 공여 자로부터의 혈액 혈소판에 검사한 PE-직접 접합으로서의 GPVI Fabs Fab#3 및 Fab#4 (수정된 중 쇄 고정 부위를 포함) 에 대한 추가의 결과는 도 1D에 나타낸다.
Fab#1 에서 Fab#4는 특이성을 보이나 인간, 시아노몰거스 원숭이 및 생쥐 혈소판 세포 표면에 발현된 GPVI에 대해 공여자 의존적 결합을 보인다. Fab#1 에서 Fab#4와는 반대로, RefFab#1 에서는 설치류 혈소판의 GPVI에의 결합은 관찰되지 않았으며 이는 이전의 ELISA 및 세포 ELISA 결과와 일치한다.
실시 예시 7: 단일가
Fab의
경쟁적 결합- ELISA로 결정된 인간,
시아노몰거스
원숭이 및 생쥐
GPVI의
다른 콜라겐
기질에 대한 결합 억제
(Competitive binding of
monovalent
Fabs
- Binding inhibition of human,
cynomolgus
monkey and mouse GPVI to different collagen substrates determined by ELISA)
재료 및 방법
1 또는 10 μg/ml의 재조합 GPVI 콜라겐 기질 ((교차링크된 콜라겐-관련된 펩티드 (crosslinked collagen-related peptide)) (CRP-XL (Anaspec, Inc.), 쥐-꼬리 콜라겐 (rat-tail collagen) (Enzo Life Sciences) 또는 VitroCol (Advanced BioMatrix, Inc.) 이 MSD-플레이트에 4°C에서 하룻밤 동안 코팅되었고, PBST로 세척되고, 0.05% Tween-20 및 3% 스킴 밀크 가루 (skim milk powder)로 보충된 PBS로 RT에서 1시간 동안 차단 시키고, 및 이어서 다시 PBST로 세척시켰다. 정제된 재조합 GPVI 항원 (실시 예시 1에서 제조된 대로 인간, 시아노몰거스 원숭이 또는 생쥐 GPVI)은 PBS로 희석시키고 및 PBS로 희석시킨 여러 농도 (최종 농도 200 - 0.3 μg/ml 범위)의 Fab (수정된 중 쇄 고정 부위를 포함)를 폴리프로필렌 플레이트에서 RT에서 30분 동안 배양시켰다. Fab/GPVI-Fc 혼합물을 코팅된 콜라겐 기질에 RT에서 1시간 동안 첨가하였다. PBST로 세척한 후에, 다른 종으로부터의 결합한 GPVI는 인간 Fc에 대한 ECL-접합 된 검출 항체 (ECL-conjugated detection antibody directed against human Fc) (Jackson Immuno Research) 를 사용하여 RT에서 1시간 동안 검출되었다. Sector Imager6000 (Meso Scale Discovery)로 읽기 전에 MSD 리드 버퍼 (MSD read buffer) (Meso Scale Discovery)를 첨가시켰다. Fab에 의한 GPVI/리간드 상호작용 억제는 감소 된 신호의 결과를 보였다.
결과 및 결론
결과는 표 8 (인간 GPVI에 대해), 표 9 (시아노몰거스 원숭이에 GTV에 대해) 및 표10 (생쥐 GPVI에 대해)에 요약되어있다. 표시되는 것은 IC50 값 및 다른 GPVI 콜라겐 기질에 대한 항-GPVI Fabs (수정된 중 쇄 고정 부위를 포함)의 최대 달성된 억제효과이다.
모든 검사된 Fabs에 대해, 생쥐 GPVI 만 제외하고 각 GPVI/기질 조합에 대해 비교될만한 IC50 값이 얻어졌다. 여기서, 다른 기질에의 결합은 생쥐 교차-반응성 (cross-reactivity)이 없기때문에 RefFab#1 에 의해서는 차단되지 않았다.
GPVI/기질-결합의 최대 억제에 관한 한, Fab#2 및 Fab#3은 200 nM에서 GPVI의 다른 콜라겐 기질에의 결합을 완전히 억제하였으며, Fab#1 및 Fab#4는 완전한 억제에 도달하지 않았다. 가장 강력한 차이는 CRP-XL를 사용하였을 때 나타났다: 이 기질의 GPVI에의 결합은 Fab#1 및 Fab#4에 의해 47%에서 77%까지 억제되었다.
표 8: 다른 코팅된 GPVI 콜라겐 기질에 대한 인간 GPVI-Fc 결합의 억제. Fabs의 역가 (potency)는 IC50 값으로써 제시되고 및 효력 (efficacy) 은 최고의 Fab 농도에서 얻어진 GPVI/기질 결합의 %로써 표시된다. 보여주는 것은 두 번의 실험의 평균값 ± SD이다.
표 9: 다른 코팅된 GPVI 콜라겐 기질에 대한 시아노몰거스 GPVI-Fc 결합의 억제. Fabs의 역가 (potency)는 IC50 값으로써 제시되고 및 효력 (efficacy) 은 최고의 Fab 농도에서 얻어진 GPVI/기질 결합의 %로써 표시된다. 보여주는 것은 두 번의 실험의 평균값 ± SD이다.
표 10: 다른 코팅된 GPVI 콜라겐 기질에 대한 생쥐 GPVI-Fc 결합의 억제. Fabs의 역가 (potency)는 IC50 값으로써 제시되고 및 효력 (efficacy) 은 검사된 최고의 Fab 농도에서 얻어진 GPVI/기질 결합의 % 억제로써 표시된다. 보여주는 것은 두 번의 실험의 평균값 ± SD이다.
실시 예시 8: 세포 부착 에세이 (Cell adhesion assay)
재료 및 방법
카보네이트 버퍼 (carbonate buffer) (15 mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9.6)에 희석된 재조합 GPVI-기질 ((1 μg/ml의 교차링크된 콜라겐-관련된 펩티드 (crosslinked collagen-related peptide)(CRP-XL (Anaspec, Inc.), 또는 10 μg/ml VitroCol (Advanced BioMatrix, Inc.))을 96-웰 마이크로타이터 맥시솝 플레이트 (Maxisorp plates) 에 4°C에서 하룻밤 동안 코팅시켰다. PBS로 세척시긴 후, 웰은 2% BSA로 보충된 PBS로 차단했다. 인간 GPVI로 안정적으로 형질감염시킨 쥐 호염기성 RBL-2H3 세포를 배양 플라스크로부터 떼어내고, 부착 버퍼 (0.5% BSA 및 10mM HEPES로 보충된 OptiMEM)로 세척시키고, 및 2.5 μg/ml 칼세인-AM (Calcein-A) (Molecular Probes) 으로 37°C에서 30분 동안 염색시켰다. 세포는 부착 버퍼에 희석시킨 항-GPVI Fabs (수정된 중 쇄 고정 부위 포함)와 96-웰 폴리프로필렌 맥시솝 플레이트에서 30분 동안 흔들면서 RT에서 어두운 곳에서 배양시켰다. 코팅되고 및 차단된 맥시솝 플레이트는 PBS로 세척시키고 및 세포-항체-혼합물로 30분 동안 RT에서 배양시키고 및 이어서 30분 동안 37°C에서 배양시켰다. 살살 더 세척시킨 후에, 결합한 세포는 테칸 인피니티 M1000 프로 리더 (Tecan Infinite M1000 Pro reader)에서 형광 강도를 (485 nm에서 흥분, 530 nm 에서 방출) 측정하여 평가되었다. 세포 부착의 억제는 처치하지 않은 세포에 비교하여 신호의 감소결과가 되었다.
결과 및 결론
인간 GPVI 및 재조합 콜라겐 기질 CRP-XL 및 VitroCol 을 발현하는 RBL-2H3 세포에 대한 결과는 표 11에 요약된다. 제시되는 것은 IC50 값 및 200 nM 항체 농도에서의 항-GPIV Fab 단편의 최대 달성된 억제 효과이다.
Fab#1 에서 Fab#4 (수정된 중 쇄 고정 부위 포함)는 비교될 만한 최대 농도의 반이 0.57 에서 1.17 nM 범위로 코팅된 VitroCol에 세포의 결합을 강력하게 억제하였다. CRP-XL에 대해서는, Fab#2 및 Fab#3에서는 비슷한 결과가 얻어졌으며, 반면에 Fab#1 및 Fab#4는 이 기질에 대하여 세포의 결합에 해당하는 효과는 없었다.
효력에 관한 한, Fab#2 및 Fab#3은 완전히 (100%) 및 거의 완전히 (91 - 93 %) 세포의 CRP-XL 및 VitroCol에의 결합을 각각 억제 시켰다. Fab#1 및 Fab#4의 VitroCol에 대한 최대 억제 효과는 각 각 55% 및 59%이었다.
표 11: 인간 GPV1 과발현하는 RBL-2H3 세포의 다른 코팅된 콜라겐 기질에의 결합의 억제. Fabs의 역가 (potency)는 IC50 값으로써 제시되고 및 효력 (efficacy) 은 검사된 최고의 Fab 농도에서 얻어진 세포/기질 결합의 % 억제로써 표시된다. 보여주는 것은 두 번의 실험의 평균값 ± SD이다.
실시 예시 9: 콜라겐 유도된 인간 혈소판 응집 억제- Multiplate ® 장애 응집검출법 (Inhibition of Collagen Induced Human Platelet Aggregation - Multiplate® Impedance Aggregometry)
재료 및 방법
히루딘-항-응고 혈액 (Hirudin-anti-coagulated blood)을 0.9 % NaCl로 Multi plate® 표준검사 세포 (Multiplate® standard test cells) (Roche)에서 1:1로 희석하고, PBS로 10, 3.3, 1.1 및 0.37 μg/ml로 미리-희석시킨 항-GPVI Fab (수정된 중 쇄 고정 부위 포함)로 스파이크시키고 (spiked), 및 교반시키면서 37°C에서 3분 동안 미리-배양시켰다. 이어서, 다른 혈소판 작동제 기질을 ((CRP-XL (1 μg/ml; Anaspec, Inc.), VitroCol (100 μg/ml; Advanced BioMatrix, Inc.), 토끼 대동맥 콜라겐 (rabbit aorta collagen) (4 μg/ml; AdvanceCor), 시노 대동맥 콜라겐 (cyno aorta collagen) (7.4 μg/ml; AdvanceCor), TRAP-6 (8 μM; TRAPtest, Roche), ADP (6.5 μM; ADPtest, Roche)) 첨가하여 혈소판 응집을 유도하였다. 항 GPVIFab의 혈소판 자체에 대한 내부적인 작동제 잠재력을 평가하기 위하여, Fab의 효과도 또한 작동제 없이 조사되었다. 혈소판 응집은 그 후 Multiplate® 장치에서 6분 동안 37°C 에서 계속 저으면서 검사 세포의 센서 와이어 (sensor wires) 사이의 시간이 지남에 따른, 응집된 혈소판에 의해 유도되는, 장애의 증가를 측정하여 결정하였다.
결과 및 결론
표 12는 항-GPVI Fabs Fab#1 에서 Fab#4의 (수정된 중 쇄 고정 부위 포함) GPVI-의존적 및 GPVI-독립적 작동제에 의해 유도되는 혈소판 응집에 대한 억제활성을 나타낸다. GPVI 작동제 비트로콜 (VitroCol) 및 시노 대동맥 콜라겐 (Cyno Aorta Collagen)에 대한 상세한 결과는 도 2A 및 2B에 각각 요약된다.
요약하면, 결과는 현 공개에 따른 GPVI 특이적인 Fabs는 GPVI-의존적인 콜라겐 작동제에 의해 유도되는 혈소판 응집을 억제함을 보여준다. 억제 정도는 사용된 Fab 및 작동제에 의존한다. Fab#2 및 Fab#3은 Fab 농도 10 μg/ml에서 인간 혈소판 응집을 전적으로 억제하는 활성을 가지면서 인간 콜라겐 기질 CRP-XL 및 VitroCol에 의해 유도된 인간 혈소판 응집에 대해 가장 강력한 용량 의존적인 억제 활성을 나타낸다. 이 두 Fabs의 RefFab#1보다 기능적 월등함은 검사된 모든 콜라겐 기질에 대해 보여준다. GPVI 독립적인 작동제 TRAP 및 ADP에서는 억제 효과가 관찰되지 않았으며 이는 GPVI 특이적인 효과를 제시한다. 더욱이, 검사된 Fabs 아무것도 작동제 없이는 혈소판 응집을 유도하지 않았으며, 그러므로, Fabs의 내부적인 작동제 활성을 배제시킨다.
표 12: Multiplate® 장치를 사용한 다가 전극 응집검출법 (multiple electrode aggregometry)에 의해 평가된 다른 작동제 또는 작동제 부재로 유도된 혈소판 응집에 대한 항-GPVI Fabs의 효과. 각 Fab-작동제 조합은 4-7 공여자의 혈액 샘플로 검사되었다. Fabs에 의한 응집 억제의 정도는 "강력한 용량 의존적 억제 (strong dose dependent inhibition)(+++)"에서 "억제 없음 (no inhibition)(0)"의 4 카테고리로 나타낸다.
실시 예시 10: 인간 동맥경화성 플라크-유도된 인간 혈소판 응집-
Multiplate
® 장애 응집검출법 (Inhibition of Human Atherosclerotic Plaque-Induced Human Platelet Aggregation - Multiplate® Impedance Aggregometry)
재료 및 방법
항-GPVI Fabs (수정된 중 쇄 고정 부위 포함)의 상응하는 질병 세팅을 반영하는 인간 혈소판 응집에 대한 억제적 활성을 평가하기 위하여, 동맥경화성 플라크-유도된 혈소판 응집이 정지된 시스템에서 Multiplate® 장치를 사용하여 최근에 수정된 프로토콜 (Bampalis et al., J Thromb Haemost, 2012) 에 따라 이전에 서술된 대로 (Toth et al., Thromb Haemost, 2006) 다가 전극 응집검출법 (Multiple Electrode Aggregometry)에 의해 (MEA) 측정되었다. 인간 동맥경화성 플라크 재료는 높은 등급의 경동맥 협착 (carotid artery stenosis)애 대한 동맥 내막절제술(endarterectomy)을 거친 환자로부터 얻었다.
인간의 합친 플라크 호모게네이트 (human pooled plaque homogenate) 로 스파이킹 (333 μg/ml)하여 응집을 유도하기 전에 항체는 2, 1, 0.5 및 0.2 μg/ml의 농도로 Multiplate® 큐벳 (cuvette)에서 3분 동안 37°C에서 0.3 ml의 생리 식염수로 희석시킨 0.3 ml의 항응고 된 피에서 배양되었다. 전기적 장애의 증가가 6분 동안 연속적으로 기록되었다. 항-GPVI 항체의 특이성은 GPVI 독립적인 작동제 ADP (0.5-2 μM) 및 PAR-1 작동제 TRAP (2-10 μM)에 의한 응집 유도로 평가되었다.]
결과 및 결론 (Results and conclusions)
도 3은 현 공개의 항-GPVI Fabs (수정된 중 쇄 고정 부위 포함하고; 표 12에 따른 중 쇄 및 경 쇄 서열과 함께)의 인간의 합친 플라크 호모게네이트에 의해 유도되는 혈소판 응집에 대한 억제적 활성을 제시한다. 이 결과는 모든 검사된 Fabs 들의 인간 혈소판의 인간 플라크 유도된 응집에 대한 거의 완전히 또는 Fabs 농도 2 μg/ml에서 완전히 응집의 억제로 강력한 용량 의존성 억제 활성을 확인한다.
실시 예시 11: FLOW 컨디션-흐름 챔버 (Flow Chamber) 하에서 인간 동맥경화성 플라크-유도된 인간 혈소판 응집의 억제 (Inhibition of Human Atherosclerotic Plaque-Induced Human Platelet Aggregation under FLOW Conditions - Flow Chamber)
재료 및 방법
유리 커버 슬립 (Glass cover slips)이 높은-등급의 경동맥 협착 (carotid artery stenosis)에 대한 동맥 내막절제술(endarterectomy)을 거친 환자로부터 얻은 합친 플라크 호모지네이트 (pooled plaque homogenates) (PBS에서 1:20으로 희석)로 코팅되었다. 커버 슬립은 4% 인간 혈청 알부민 (human serum albumin) (HSA)으로 보충된 PBS로 차단된 0.1 루어 스티키 슬라이드 (Luer sticky slides) (ibidi®) 를 사용하여 평행 플레이트 흐름 챔버 (parallel plate flow chambers)에 올려놓았다. 흐름 챔버 (flow chamber) 는 배양 챔버 (incubation chamber) (37°C)로 장치된 TE2000-E 형광 현미경 (fluorescence microscope) (Nikon) 의 스태지에 올려놓았다. 플라크-코팅된 흐름 챔버는 PBS로 관류시키고 (perfused) 및 이어서 4% HSA를 함유하는 PBS로 차단했다. 히루딘화시킨 인간 전 혈액 (hirudinzed human whole blood)에 있는 혈소판을 1 μM DiOC6 로 염색시키고 및 2 μg/ml 항-GPVI Fab (수정된 중 쇄 고정 부위 포함), P2 Y12 길항제 티카그렐라 (ticagrelor) 또는 대조군으로 10분 동안 배양시켰다. 제시된 곳에서, 혈액 수집 동안에 혈액에 1 mM ASA가 첨가되었다. 혈액은 흐름 챔버 내로 600/s의 전단속도 (shear rate)로 관류시켰다. 라벨 된 혈소판의 부착 (Adhesion) 및 응집 (aggregation)은 실시간으로 연속적으로 6분 (1 프레임(frame)/초) 동안 10x 대물렌즈 (objective) 및 CoolSNAP HQ2 CCD 카메라를 사용하여 기록되었다. 혈소판 범위는 NIS-요소 3.2 소프트웨어 패키지 (NIS-element 3.2 software package) (Nikon)를 사용하여 2진수 형광 면적 부분 (binary fluorescent area fraction) 을 정량하여 분석하였다.
결과 및 결론
도 4A-D는 생리적 흐름 컨디션 하에서 인간 합친 플라크 호모제네이트에 의해 유도된 혈소판 응집에 대한 항-GPVI Fabs Fab#1 에서 Fab#4 (수정된 중 쇄 고정 부위 포함하고; 표 12에 따른 중 쇄 및 경 쇄 서열과 함께)의 억제적 활성을 제시한다.
결과는 Fab#1 에서 Fab#4는 인간 플라크 재료 2 μg/ml 농도의 존재 하에서 혈소판 활성/응집을 거의 완전하게 억제할 수 있음을 강력하게 제시한다. 더욱이, 모든 Fab는 ASA 및 트리카그렐라 (Ticagrelor) 표준 케어 조합 (도 4E)보다 분명히 월등하다.
실시 예시 12: 생체 내 효력-동맥 혈전증 생쥐 모델에서
GPVI
특이적인 단일가
Fab의
효과-
결찰
-유도된 혈전 모델 (In
Vivo
Efficacy - Effect of
GPVI
specific
monovalent
Fab
in a mouse model of arterial thrombosis - Ligation-induced thrombosis model)
재료 및 방법
생존중 형광 현미경 관찰이 이전에 서술된 대로 (Seizer et al., 2015) 수행되었다. 간략하게, C57Bl/6J 백그라운드에 유전적으로 수정된 생쥐 ("ROSA"-strain)가 혈전 형성 이미징을 위해 사용되었다. 생쥐는 초록색 형광 혈소판을 가진 "야생형(wildtype)"이다. 생쥐는 미다졸람 (midazolame) (5 mg/kg 몸무게), 메데토미딘 (medetomidine) (0.5 mg/kg 몸무게) 및 팬타닐 (fentanyl) (0.05 mg/kg 몸무게)로 주사하여 마취시켰다. 공통 경동맥을 절개하고, 및 이어서 5분 동안의 표준화된 심한 결찰 (standardized vigorous ligation)로 상처 주었다 (Seizer et al., 2015). 결찰 전에, 3.3 mg/kg 항-GPVI 또는 대조군 Fab를 i.v.로 꼬리 정맥에 투여하였다. 상처 전 및 바로 후에, 혈전 형성은, 즉 손상된 혈관 벽에 형광 혈소판의 부착 및 응집은, 생체 내 비디오 현미경 관찰로 가시화되었다. 혈관 당 기록시간은 20분이었다. 분석은 엑시오비젼 소프트웨어 (AxioVision Software) (Carl Zeiss)를 사용하여 제시된 시간 포인트에서 총 상처 난 부분에 대비하여 혈전이 커버 된 면적의 퍼센트를 결정하여 수행되었다. 모든 동물 실험은 실험실 동물 케어 및 사용에 대한 독일의 법에 따라 수행되었으며 및 지역 관계 당국의 허가를 받았다.
결과 및 결론
도 5 및 도 6 는 음성 대조군 Fab와 비교하여 항-GPVI Fab Fab#3 (수정된 중 쇄 고정 부위 포함; 서열 번호43의 중 쇄 서열 및 서열번호 41의 경 쇄 서열)의 6 검사된 동물에서 7 다른 시간 포인트에서 혈전 형성 (Thrombus formation)에 대한 억제활성을 보여준다. 혈전 형성은 음성 대조군으로 처치한 모든 동물에서 관찰되었으며 반면에 3.3 mg/kg 항-GPVI Fab Fab#3 일회분 투여는 5/6 동물에서 혈전 형성을 의미 있게 억제했다. Fab#3으로 처치된 1/6 에서, 초기 혈전 형성은 일어나지 않았으나, 시간이 지남에 따라 지속하지는 않았다.
실시 예시 13: 혈소판활성화-생체 밖
CD62P
표면 발현 (Platelet Activation - Ex vivo CD62P Surface expression)
재료 및 방법
수용체 활성 및 이어서 하위 신호전달이 혈소판 활성화 마커 CD62P의 세포 표면 발현의 형광 측정으로 평가되었다. 혈소판-풍부 혈장 (Platelet-rich plasma) (PRP)이 시트르산 첨가된 전 혈 (citrated whole blood)을 500x g에서 정지 없이 15분 동안 RT에서 원심분리하여 생성되었다. 결과의 상등액은 아래에 놓여있는 백혈구 풍부한 중간상을 교란시키지 않으면서 PRP로서 새로운 샘플 튜브에 옮겼다. PR에 있는 혈소판은 96 엘 V-바닥 플레이트에서 PBS로 희석시킨 수정된 또는 야생형 인간 중 쇄 고정 부위를 함유하는 10μg/ml의 항-GPVI Fab 과 배양시켰으며 및 RT에서 30분 동안 배양시켰다. 이어서 CD62P에 대하여 얻어진 파이코에리트린 (PE))-접합 된 항체 (Phycoerythrine (PE)-conjugated antibody) (BD Pharmingen)가 첨가되었고 이어서 20분 동안 RT에서 빛으로부터 보호되면서 배양시켰다. 세포는 1% 포름알데히드 용액 (1% formaldehyde solution)으로 적어도 30분 동안 4°에서 고정하고 및 BD FACS CANTOTM II (BD Biosciences)를 사용하여 분석되었다. 기본 CD62P 발현은 Fab 대신 PBS로 배양시켜 결정하였다. Fab-유도된 GPVI 활성화는 PBS 존재 하에서의 기본 발현 수준과 정상화시켜 Fab 존재하에서의 활성마커 발현의 수준으로서 나타낸다.
결과 및 결론
결과는 도 7에 보여준다. 수정된 중 쇄 고정 부위를 포함하는 항-GPVI Fabs는 (Fab#1 mod. HC, Fab#2 mod. HC, Fab#3 mod. HC and Fab#4 mod. HC) 항-GPVI IgG에 비교하여 단일가 결합의 결과 때문에 GPVI 교차-링크가 부족하기 때문에 아주 약한 정도로 CD62P 발현을 유도한다. 잔여 혈소판 활성화는 인간 혈청 내에 존재하는 이미-존재하는 항-Fab 항체에 의한 GPVI-결합된 Fabs의 교차-링크의 잠정적인 결과로부터이다. 수정된 중 쇄 고정 부위를 포함하는 항-GPVI Fab (Fab#1 mod. HC, Fab#2 mod. HC, Fab#3 mod. HC, Fab#4 mod. HC)는 더 나아가 수정되지 않은 인간 Fab 중 쇄 고정 부위를 포함하는 Fabs (Fab#1, Fab#2, Fab#3, Fab#4) 와 비교하였을 때 혈소판 활성화 마커 CD62P의 발현을 감소시켰으며 이는 수정은 인간 혈청에 존재하는 항-Fab 항체가 이 Fabs에 결합하는 것을 효과적으로 방지함을 제시한다. 이 효과는 RefFab#1에 대해 서술된 대로 글라이신-세린-링커 (glycin-serin-linker)를 Fab 중 쇄 C-말단에 부착시켰을 때는 관찰되지 않았다.
표 14: 검사된 인간 수정되지 않은 Fab 구조체 (Fab constructs)의 중 쇄 및 경 쇄 서열
표 15: 수정된 인간 중 쇄 고정 부위를 가진 검사된 Fab 구조체 (Fab constructs)의 중 쇄 및 경 쇄 서열
실시 예시 14: 생체 내 출혈 시간-생쥐 꼬리
클립핑
(clipping) 모델 (In Vivo Bleeding Time - Mouse tail clipping model)
재료 및 방법
출혈에 대한 Fab-매개하는 GPVI-차단 효과가 생쥐 꼬리 클립핑 모델 (clipping model)에서 평가되었다. 꼬리-출혈은 C57BL/6J 생쥐에서 꼬리의 먼 부분 2mm을 수술용 칼로 절개하고 및 꼬리를 따듯한 PBS에 담가 유도하였다. 생쥐는 꼬리를 횡단하기 약 10분 전에 메데토미딘 (medetomidine) (Domitor® 0.5 mg/kg), 미다조램 (midazolam) (Dormicum® 5 mg/kg) 및 팬타닐 (fentanyl) (Fentanyl B. Braun 0.05 mg/kg) 로 복강으로 마취시켰다. 항-GPVI Fab (수정된 중 쇄 고정 부위 포함) 또는 대조군은 꼬리 횡단 전 30분에 꼬리 정맥에 정맥 주사로 적용하였다. 표시된 곳에서, 꼬리 횡단 전 60분에 ASA가 정맥으로 주사되었다. 출혈 시간은 횡단 후 바로 기록되었으며 및 30초 내에 다시 시작함이 없이 꼬리 끝으로부터 혈액이 흐르기를 멈출 때까지 계속 되었다. 연구 종료시점에, 마취된 동물은 자궁 탈구 (cervical dislocation)로 죽였다. 실험은 실험실 동물 케어 및 사용에 대한 독일의 법에 따라 수행되었으며 및 지역 관계 당국의 허가를 받았다.
결과 및 결론
도 8에서 보여준 대로, 수정된 중 쇄 고정 부위 (표 12에 따른 중 쇄 및 경 쇄를 서열과 함께)를 포함하는 항-GPVI Fabs ((Fab#1, Fab#2, Fab#3, Fab#4) 단독으로는 생쥐 꼬리 클립핑 모델에서 출혈 시간을 연장하게 하지는 않았다. 더 나아가, 항-GPVI Fabs와 ASA의 조합은 더 나아가 아스피린 (Aspirin) 단독과 비교하여 출혈 시간을 증가시키지 않았다. 이 결과들은 항-GPVI Fabs로의 치료는 증가된 출혈 위험성을 초래하지 않음을 암시한다.
실시 예시 15: 혈소판 수
재료 및 방법
혈소판 수에 대한 이의 영향을 평가하기 위하여 10 mg/kg의 수정된 중 쇄 고정 부위 (Fab#1, Fab#2, Fab#3 및 Fab#4) (표 12에 따른 중 쇄 및 경 쇄 서열과 함께)를 포함하는 항-GPVI Fab 또는 대조군을 i.v.로 C57BL/6J 생쥐의 꼬리 정맥에 적용하였다. 화합물 주사 바로 전 및 30분 후에 혈액 샘플이 약물 적용에 사용된 정맥의 반대쪽 꼬리 정맥으로부터 수집되었다. 혈액 샘플은 끝에서 끝 모세관 (end-to-end capillary) 25 μl K2E 튜브 (Sanguis Counting) 에 수집되었으며 및 티로데 버퍼 (Tyrode's buffer) (pH 7.3)에서 1:50으로 희석되었다. 희석된 혈액 샘플은 APC-접합 된 항-CD41 항체 (Biolegend) 로 RT 어두운 곳에서 10분 동안 염색시키고, 더 나아가 티로데 버퍼 (Tyrode's buffer) (pH 7.3)에서 1:50으로 희석시켰으며, 및 이어서 BD FACS CANTOTM II (BD Biosciences)에서 분석하였다. 25 μl의 CD41-양성 사건 (CD41-positive events)이 기록되었다. 혈소판 수는 방정식: Events*2500/25=Events*100 [혈소판/μl]에 따라 결정되었다.
결과 및 결론
도 9에서 보여준 대로, 48 또는 72시간 후 및 10 mg/kg의 수정된 중 쇄 고정 부위 (Fab#1, Fab#2, Fab#3 또는 Fab#4) 를 포함하는 항 GPVI Fab 의 투여 후 혈소판감소의 징후는 관찰되지 않았다. 이는 현 공개의 항-GPVI Fabs로 치료는 항상성 (homeostasis)에 악영향을 주지 않음을 제시하며, 및 상기 서술된 대로 (실시 예시 13) 관찰된 출혈 시간의 연장이 없는 것과 일치한다.
실시 예시 16: 혈소판에의
GPVI
표면 발현 (
GPVI
surface expression on platelets)
재료 및 방법
항-GPVI 항체로의 혈소판 치료는 GPVI의 내부화 (internalization)를 유도하거나 또는 혈소판 표면의 탈루형태를 유도할 수 있으며 이는 이 화합물의 작동제적 활성 및 그러므로 원하지 않는 혈소판 활성화를 암시할 수 있다. 이를 배제하기 위하여, 10 mg/kg의 수정된 중 쇄 고정 부위 (Fab#1, Fab#2, Fab#3 및 Fab#4) (표 12에 따른 중 쇄 및 경 쇄 서열과 함께)를 포함하는 항-GPVI Fab 및 대조군을 i.v.로 CD-1 생쥐의 꼬리 정맥으로 주사하였다. 화합물 주사 바로 전 및 어떤 특정한 시간-포인트 후에 혈액 샘플이 약물 적용에 사용된 정맥의 반대쪽 꼬리 정맥으로부터 수집되었다. 혈액 샘플은 끝에서 끝 모세관 (end-to-end capillary) 30 μl K2E 튜브 (Sanguis Counting) 에 수집되었다. 혈액은 바로 모세관으로부터 1 μl의 30x 응고 및 혈소판 억제제 혼합물 ((54 mg/ml K2-EDTA, 10 mg/ml 아세틸살리실릭 에시드 (acetylsalicylic acid) (ASA), 167 μg/ml 티카그렐라 (Ticagrelor) 및 3 μg/ml PGI2))을 함유하는 튜브로 옮겼다. 혈액은 APC-접합 된 항-CD41 항체 (Biolegend) 및 PE-접합 된-경쟁적 항-GPVI Fab (자체 제작)를 함유하는 티로데 버퍼 (Tyrode's buffer) (pH 7.3)에서 1:20으로 희석되었으며 및 RT 어두운 곳에서 10분 동안 배양되었다. 이어서, 샘플은 더 나아가 1:25로 PBS에서 희석시키고 및 BD FACS CANTOTM II (BD Biosciences)에서 분석되었다. CD41-양성 집단의 PE 신호는 퀀티부라이트TM PE 형광 정량 키트 (QuantibriteTM PE Fluorescence Quantitation KIT) (BD Biosciences)를 사용하여 혈소판 당 GPVI 분자의 절대 수로 전환 시켰다.
결과 및 결론
도 10에서 묘사된 대로, 수정된 중 쇄 고정 부위를 포함하는 GPVI Fab (Fab#1, Fab#2, Fab#3, Fab#4) 10 mg/kg의 투여는 Fab#1, Fab#2, 및 Fab#3 투여 후 48 또는 72시간 내에 혈소판 표면에서 GPVI의 감소 결과를 가져오지 않았다. Fab#4로 처치한 생쥐로부터의 혈소판은 24 및 48시간 후에 이들의 세포 표면에 ~20%의 GTV 카피 수의 약간의 감소를 보였다. 이는 검사된 Fabs는 GPVI의 탈루 (shedding) 또는 내부화의 유도가 없거나 또는 단지 약간 유도함을 제시한다. CD62P 혈소판 활성화 FACS (실시 예시 13) 에서 관찰된 것과 일치하게, 이는 더 나아가 검사된 Fabs는 내부적인 작동제적 혈소판 활성화 능력은 없음을 확인한다.
실시 예시 17: ELISA-근거한 교차-경쟁 에세이 (ELISA-based cross-competition assay)
GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편의 교차-경쟁 (cross-competition) 또는 다른 GPVI 결합 제제는 하기의 표준 공정에 따라 ELISA 에세이를 사용하여 검출될 수 있다.
ELISA-에세이의 일반적인 원리는 GPVIP 특이적인 항체 또는 항체 단편 (Fab#1, Fab#2, Fab#3, Fab#4과 같은)을 ELISA 플레이트 웰에 코팅하는 것이 관여된다. 과량의 2차, 잠재적으로 교차-경쟁적인, GPVI 특이적인 항원이 그 후 용액으로 첨가된다 (즉 ELISA 플레이트에 결합하지 않고). 이어서, 제한적인 양의 GPVI-Fc 가 그 후 웰에 첨가된다.
웰에 코팅된 항체와 용액에 있는 항체는 제한된 양의 GPVI 분자에의 결합에 경쟁할 것이다. 플레이트는 그 후 코팅된 항체에 결합하지 않은 GPVI 분자를 제거하기 위하여 및 또한 2차, 용액상 항체는 물론 2차, 용액상 항체와 GPVI 사이에 형성된 복합체를 제거하기 위하여 세척하였다. 결합 된 GPVI은 그 후 적절한 GPVI 검출 시약을 사용하여 측정하였다. 그러므로 GPVI는 태그 (tag)로, 예를 들어, Fc, Flag, 등으로 융합될 수 있으며, 이는 적절한 태그-특이적인 시약을 통해 검출될 수 있다.
코팅된 항체에 교차-경쟁적인 용액에 있는 항체는 코팅된 항체가 2차, 용액상 항체가 없을 때 결합할 수 있는 GPVI 분자의 수에 대비하여 코팅된 항체가 결합할 수 있는 GPVI 분자의 수를 감소 되게 할 수 있다.
이 에세이는 더 나아가 하기에 Ab-X 및 Ab-Y라 불리는 두 항체에 대해 좀 더 상세하게 서술된다. Ab-X가 고정된 항체로 선택된 곳에서, 이는 ELISA 플레이트에 코팅되고, 이후에 플레이트는 이어서 첨가되는 시약들의 비-특이적인 결합을 최소화하기 위하여 적절한 차단 용액 (blocking solution)으로 차단 시킨다. 웰 당 Ab-Y GPVI 결합부위의 몰수가 ELISA 플레이트에 코팅하는 동안에 웰 당 사용된 Ab-X GPVI 결합 부위 몰수보다 적어도 10배 더 높게 되도록 과량의 Ab-Y가 그 후 ELISA 플레이트에 첨가된다. 웰 당 첨가되는 GPVI의 몰수가 각 웰에 코팅시 사용된 Ab-X GPVI 결합 부위의 몰수보다 적어도 25-배 더 낮게 GPVI가 첨가된다. 적절한 배양기간 후에, ELISA 플레이트는 세척시키고 및 GPVI에 특이적인 코팅된 항체 (이 경우 Ab-X)에 의해 특별히 결합 된 GPVI 분자의 양을 측정하기 위하여 GPVI 항원에 특이적인 검출 시약이 첨가되었다. 에세이의 배경 신호는 코팅된 항체 (이 경우 Ab-X)가 있는 웰에서 얻은 신호, 2차 용액 상 항체 (이 경우 Ab-Y), 버퍼만 (즉 GPVI 없이) 및 검출 시약이 있는 웰에서 얻은 신호로 정의한다. 에세이의 양성 대조군 신호는 코팅된 항체 (이 경우 Ab-X), 2차 용액 상 항체 버퍼만 (즉, 2차 용액 상 항체 없이), GPVI 검출 시약이 있는 웰에서 얻은 신호로 정의한다. ELISA 에세이는 양성 대조군 신호가 적어도 배경 신호보다 6배를 갖도록 하는 방식으로 수행될 필요가 있다.
어느 항체를 코팅 항체로서 사용하고 및 어느 항체를 2차 (경쟁자) 항체로 사용하는가의 선택의 결과로부터의 인공적인 결과 (artifact) (예를 들어 IL-17C에 대하여 Ab-X 및 Ab-Y 사이의 의미 있게 다른 친화력)를 피하기 위하여, 교차-차단 에세이 (cross-blocking assay)를 두 가지 포멧으로 수행할 필요가 있다: 1) 포멧 1은 Ab-X가 ELISA 플레이트에 코팅되는 항체이고 및 Ab-Y가 용액에 있는 경쟁자 항체이며 및 2) 포멧 2는 Ab-Y가 ELISA 플레이트에 코팅되는 항체이고 및 Ab-X가 용액에 있는 경쟁자 항체이다.
<110> MORPHOSYS AG
<120> ANTIBODIES TARGETING GLYCOPROTEIN VI
<130> 2020FPI-10-001/EP
<160> 113
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 339
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ser Pro Ser Pro Thr Ala Leu Phe Cys Leu Gly Leu Cys Leu Gly
1 5 10 15
Arg Val Pro Ala Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala
20 25 30
Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys
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Ser Leu Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp
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Ser Leu Pro Ser Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala
100 105 110
Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly
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Tyr Arg Ala Ser Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly
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210 215 220
Glu Ala Thr Ala Glu Leu Thr Val Ser Phe Thr Asn Lys Val Phe Thr
225 230 235 240
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Ile Cys Leu Gly Ala Val Ile Leu Ile Ile Leu Ala Gly Phe Leu Ala
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Glu Asp Trp His Ser Arg Arg Lys Arg Leu Arg His Arg Gly Arg Ala
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Ser Asn Gly Gly Gln Asp Gly Gly Arg Gln Asp Val His Ser Arg Gly
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Leu Cys Ser
<210> 2
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<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 2
Met Ser Pro Ser Pro Thr Thr Leu Phe Cys Leu Gly Leu Cys Leu Gly
1 5 10 15
His Val Pro Ala Gln Arg Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala
20 25 30
Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys
35 40 45
Gln Gly Pro Pro Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser
50 55 60
Ser Arg Tyr Gln Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg
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85 90 95
Ser Pro Pro Ser Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala
100 105 110
Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Asp Val Thr Leu Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala
130 135 140
Leu Tyr Lys Glu Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp
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Tyr Arg Ala Ser Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly
165 170 175
Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Phe Ser Ser Gly Asp Pro Tyr Leu Trp Ser
180 185 190
Ala Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Met Val Thr Glu Phe Ser Glu Ala
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Thr Thr Glu Leu Thr Val Ser Leu Thr Asn Lys Val Phe Thr Thr Glu
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Thr Ser Arg Ser Ile Thr Ala Ser Pro Lys Glu Pro Gly Ser Pro Ala
225 230 235 240
Gly Pro Ala Arg Gln Tyr Tyr Thr Lys Gly Asn Leu Val Arg Ile Cys
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Leu Gly Ala Val Ile Leu Ile Leu Leu Ala Gly Phe Leu Ala Glu Asp
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275 280 285
Arg Pro Leu Pro Pro Leu Pro Pro Thr Arg Lys Ser His Gly Asp Gln
290 295 300
Asp Gly Gly Arg Pro Asp Val His Ser Arg Gly Leu Cys Ser
305 310 315
<210> 3
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 3
Met Ser Pro Ala Ser Pro Thr Phe Phe Cys Ile Gly Leu Cys Val Leu
1 5 10 15
Gln Val Ile Gln Thr Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln
20 25 30
Ala Gln Pro Ser Ser Leu Val Pro Leu Gly Gln Ser Val Ile Leu Arg
35 40 45
Cys Gln Gly Pro Pro Asp Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Lys
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Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Val Leu Val Val Thr Gly Leu Ser Ala
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala Leu Pro Ser Ser
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Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Pro Pro
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Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser Ser Arg Tyr Gln
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Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg Ser Leu Ala Gly
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Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp Ser Leu Pro Ser
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Pro Pro
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Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser Ser Arg Tyr Gln
35 40 45
Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg Ser Leu Ala Gly
50 55 60
Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp Ser Leu Pro Ser
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100 105 110
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Pro Thr Glu Pro Pro Ser Pro Val Ala Glu Phe Ser Glu Ala Thr Ala
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245
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala Leu Pro Ser Ser
1 5 10 15
Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Pro Pro
20 25 30
Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser Ser Arg Tyr Gln
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Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg Ser Leu Ala Gly
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Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp Ser Leu Pro Ser
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Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala Lys Pro Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly Asp Val Thr Leu
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Tyr Ser Phe Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser Ala Pro Ser Asp
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<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 7
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1 5 10 15
Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Pro Pro
20 25 30
Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser Ser Arg Tyr Gln
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Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp Ser Pro Pro Ser
65 70 75 80
Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala Lys Pro Ser Leu
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Gln Tyr Tyr Thr Lys
225
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<212> PRT
<213> Mus musculus
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Gly Asp Thr Gly Ser Tyr Lys Arg Pro Glu Lys Trp Tyr Arg Ala Asn
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<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 9
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Leu Val Pro Leu Gly His Pro Val Thr Leu Arg Cys Leu Gly Pro Ser
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65 70 75 80
Pro Ser Asp Gln Leu Glu Leu Ile Ala Thr Gly Val Tyr Ser Lys Pro
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Lys Glu Gly Asp Thr Arg Pro Tyr Lys Arg Pro Glu Lys Trp Tyr Arg
130 135 140
Ala Asn Phe Pro Val Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly Thr Tyr
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Arg Cys Tyr Ser Phe Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Leu Trp Ser Ala Pro
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Ser Asp Pro Leu Val Val Val Val Thr Gly Pro Ser Ala Thr Pro Ser
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Gln Val Pro Thr Glu Val Pro Ser Pro Met Thr Glu Ala Ser Arg Arg
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Pro Ser Met Leu Leu Thr Asn Lys Ile Ser Thr Thr Glu Lys Pro Met
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His Gln His Tyr Ala Lys Gly Asn
245
<210> 10
<211> 228
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Asp Ile Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
65 70 75 80
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85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
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Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
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Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
180 185 190
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Ser Pro Gly Lys
225
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 11
Ser His Tyr Met His
1 5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 12
Leu Ile Glu Pro Ser Glu Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Gln Arg Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 13
Asp Ser Ser Arg Ser Tyr Pro Leu Gly Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
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Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser
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Gly Leu Ile Glu Pro Ser Glu Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Gln Arg Phe
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Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
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Gln
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<212> PRT
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<211> 7
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Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ile Ile Glu Pro Thr Gly Ala Ser Thr Leu Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Ile Ala Leu Pro Leu Gly Phe Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 51
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Ser Thr Arg Phe
85 90 95
Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
<210> 52
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 52
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Ser Thr Arg Phe
85 90 95
Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
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Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
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<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ala Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Glu Pro Thr Gly Ala Ser Thr Leu Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Ile Ala Leu Pro Leu Gly Phe Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ala Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Glu Pro Thr Gly Ala Ser Thr Leu Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Ile Ala Leu Pro Leu Gly Phe Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Ile Gly His Lys Cys
225
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<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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tcccattaca tgcat 15
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<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 56
ctgatcgagc cctccgaggg agagactgag tatgctcaac ggttccaagg c 51
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 57
gacagcagcc gtagctaccc tctgggtttc gatatt 36
<210> 58
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 58
agcggcagca gcagcaacat cggcaacaac tacgttagc 39
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 59
gataacaaca aacgcccgag c 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 60
gctgcttggg acttccgttc ttctcgttgg gtg 33
<210> 61
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 61
caggtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac caggcgccag cgtgaaagtt 60
agctgcaaag ccagcggcta tacctttacc tcccattaca tgcattgggt tcgccaggcc 120
ccaggccagg gtctggaatg gatggggctg atcgagccct ccgagggaga gactgagtat 180
gctcaacggt tccaaggccg cgtgaccatg acccgcgata ccagcaccag caccgtgtat 240
atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgagacagc 300
agccgtagct accctctggg tttcgatatt tggggccagg gcaccctggt tactgtctcg 360
agc 363
<210> 62
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 62
cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgtt agcgccgcac caggccagaa agtgaccatt 60
agctgtagcg gcagcagcag caacatcggc aacaactacg ttagctggta tcagcagctg 120
ccgggcaccg ccccgaaact gctgatctat gataacaaca aacgcccgag cggcatcccg 180
gatcgcttta gcggtagcaa aagcggcacc agcgccaccc tgggcattac cggcctgcaa 240
accgaagacg aagccgatta ttactgcgct gcttgggact tccgttcttc tcgttgggtg 300
tttggcggcg gtaccaagct gaccgtgctg ggccag 336
<210> 63
<211> 648
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 63
cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgtt agcgccgcac caggccagaa agtgaccatt 60
agctgtagcg gcagcagcag caacatcggc aacaactacg ttagctggta tcagcagctg 120
ccgggcaccg ccccgaaact gctgatctat gataacaaca aacgcccgag cggcatcccg 180
gatcgcttta gcggtagcaa aagcggcacc agcgccaccc tgggcattac cggcctgcaa 240
accgaagacg aagccgatta ttactgcgct gcttgggact tccgttcttc tcgttgggtg 300
tttggcggcg gtaccaagct gaccgtgctg ggccagccca aagccgcccc tagcgtgacc 360
ctgttccccc caagcagcga ggaactccag gccaacaagg ccaccctcgt gtgcctgatc 420
agcgacttct accctggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgatagcag ccctgtgaag 480
gccggcgtgg aaaccaccac ccccagcaag cagagcaaca acaaatacgc cgccagcagc 540
tacctgagcc tgacccccga gcagtggaag tcccacagat cctacagctg ccaggtcaca 600
cacgagggca gcaccgtgga aaagaccgtg gcccccaccg agtgcagc 648
<210> 64
<211> 672
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 64
caggtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac caggcgccag cgtgaaagtt 60
agctgcaaag ccagcggcta tacctttacc tcccattaca tgcattgggt tcgccaggcc 120
ccaggccagg gtctggaatg gatggggctg atcgagccct ccgagggaga gactgagtat 180
gctcaacggt tccaaggccg cgtgaccatg acccgcgata ccagcaccag caccgtgtat 240
atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgagacagc 300
agccgtagct accctctggg tttcgatatt tggggccagg gcaccctggt tactgtctcg 360
agcgccagca caaagggacc cagcgtgttc cctctggccc ccagcagcaa gtctacatct 420
ggcggaacag ccgccctggg ctgcctcgtg aaggactact ttcccgagcc cgtgaccgtg 480
tcctggaact ctggcgctct gacaagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctccagagc 540
agcggcctgt actctctgag cagcgtcgtg acagtgccca gcagctctct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacaa aggtggacaa gcgggtggaa 660
cccaagtcct gc 672
<210> 65
<211> 690
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 65
caggtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac caggcgccag cgtgaaagtt 60
agctgcaaag ccagcggcta tacctttacc tcccattaca tgcattgggt tcgccaggcc 120
ccaggccagg gtctggaatg gatggggctg atcgagccct ccgagggaga gactgagtat 180
gctcaacggt tccaaggccg cgtgaccatg acccgcgata ccagcaccag caccgtgtat 240
atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgagacagc 300
agccgtagct accctctggg tttcgatatt tggggccagg gcaccctggt tactgtctcg 360
agcgccagca caaagggacc cagcgtgttc cctctggccc ccagcagcaa gtctacatct 420
ggcggaacag ccgccctggg ctgcctcgtg aaggactact ttcccgagcc cgtgaccgtg 480
tcctggaact ctggcgctct gacaagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctccagagc 540
agcggcctgt actctctgag cagcgtcgtg acagtgccca gcagctctct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacaa aggtggacaa ggaagtcgag 660
cgcagacagg gcggcatcgg ccataaatgc 690
<210> 66
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 66
gaccattaca tgagc 15
<210> 67
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 67
agcgttggga gcgagggcaa attcatcgac tatgctgcaa gcgtgaaagg g 51
<210> 68
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 68
cactaccgtg agttccgttg gcactactat tactttgact at 42
<210> 69
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 69
accggcagca gcagcaacat tggcgcaggc tatgatgtgc at 42
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 70
ggcaacagca atcgcccaag c 21
<210> 71
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 71
cagtctcatg acctgggtgc tcatgtttgg gtg 33
<210> 72
<211> 369
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 72
caggtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggtag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcgggtt tagcttttcc gaccattaca tgagctggat tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggttagcagc gttgggagcg agggcaaatt catcgactat 180
gctgcaagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa cagcctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgtcactac 300
cgtgagttcc gttggcacta ctattacttt gactattggg gtcagggcac cctggttact 360
gtctcgagc 369
<210> 73
<211> 339
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 73
cagagcgtgc tgacccagcc accaagcgtg agcggtgcac caggtcagcg cgtgaccatt 60
agctgcaccg gcagcagcag caacattggc gcaggctatg atgtgcattg gtatcagcag 120
ctgccaggca ccgcaccgaa actgctgatt tatggcaaca gcaatcgccc aagcggtgtg 180
ccggatcgct ttagcggcag caaaagcggc accagcgcca gcctggcgat taccggtctg 240
caagccgaag acgaagccga ttattactgc cagtctcatg acctgggtgc tcatgtttgg 300
gtgtttggcg gcggtaccaa gctgaccgtg ctgggccag 339
<210> 74
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 74
cagagcgtgc tgacccagcc accaagcgtg agcggtgcac caggtcagcg cgtgaccatt 60
agctgcaccg gcagcagcag caacattggc gcaggctatg atgtgcattg gtatcagcag 120
ctgccaggca ccgcaccgaa actgctgatt tatggcaaca gcaatcgccc aagcggtgtg 180
ccggatcgct ttagcggcag caaaagcggc accagcgcca gcctggcgat taccggtctg 240
caagccgaag acgaagccga ttattactgc cagtctcatg acctgggtgc tcatgtttgg 300
gtgtttggcg gcggtaccaa gctgaccgtg ctgggccagc ccaaagccgc ccctagcgtg 360
accctgttcc ccccaagcag cgaggaactc caggccaaca aggccaccct cgtgtgcctg 420
atcagcgact tctaccctgg cgccgtgacc gtggcctgga aggccgatag cagccctgtg 480
aaggccggcg tggaaaccac cacccccagc aagcagagca acaacaaata cgccgccagc 540
agctacctga gcctgacccc cgagcagtgg aagtcccaca gatcctacag ctgccaggtc 600
acacacgagg gcagcaccgt ggaaaagacc gtggccccca ccgagtgcag c 651
<210> 75
<211> 678
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 75
caggtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggtag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcgggtt tagcttttcc gaccattaca tgagctggat tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggttagcagc gttgggagcg agggcaaatt catcgactat 180
gctgcaagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa cagcctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgtcactac 300
cgtgagttcc gttggcacta ctattacttt gactattggg gtcagggcac cctggttact 360
gtctcgagcg ccagcacaaa gggacccagc gtgttccctc tggcccccag cagcaagtct 420
acatctggcg gaacagccgc cctgggctgc ctcgtgaagg actactttcc cgagcccgtg 480
accgtgtcct ggaactctgg cgctctgaca agcggcgtgc acacctttcc agccgtgctc 540
cagagcagcg gcctgtactc tctgagcagc gtcgtgacag tgcccagcag ctctctgggc 600
acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac aagcccagca acacaaaggt ggacaagcgg 660
gtggaaccca agtcctgc 678
<210> 76
<211> 696
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 76
caggtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggtag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcgggtt tagcttttcc gaccattaca tgagctggat tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggttagcagc gttgggagcg agggcaaatt catcgactat 180
gctgcaagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa cagcctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgtcactac 300
cgtgagttcc gttggcacta ctattacttt gactattggg gtcagggcac cctggttact 360
gtctcgagcg ccagcacaaa gggacccagc gtgttccctc tggcccccag cagcaagtct 420
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cagagcagcg gcctgtactc tctgagcagc gtcgtgacag tgcccagcag ctctctgggc 600
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<210> 77
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 77
gactattacg tgagc 15
<210> 78
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 78
gccattgggg ggtccggttc cgccgtgcaa tacgctgaat ccgtgaaggg c 51
<210> 79
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 79
cactaccgtg agttccgttg gcactactat tactttgact at 42
<210> 80
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 80
accggcagca gcagcaacat tggcgcaggc tatgatgtgc at 42
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 81
ggcaacagca atcgcccaag c 21
<210> 82
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 82
cagtctcatg acctgggtgc tcatgtttgg gtg 33
<210> 83
<211> 369
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 83
caggtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggtag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcgggtt tagcttcggc gactattacg tgagctggat tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggttagcgcc attggggggt ccggttccgc cgtgcaatac 180
gctgaatccg tgaagggccg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa cagcctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgtcactac 300
cgtgagttcc gttggcacta ctattacttt gactattggg gtcagggcac cctggttact 360
gtctcgagc 369
<210> 84
<211> 339
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 84
cagagcgtgc tgacccagcc accaagcgtg agcggtgcac caggtcagcg cgtgaccatt 60
agctgcaccg gcagcagcag caacattggc gcaggctatg atgtgcattg gtatcagcag 120
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caagccgaag acgaagccga ttattactgc cagtctcatg acctgggtgc tcatgtttgg 300
gtgtttggcg gcggtaccaa gctgaccgtg ctgggccag 339
<210> 85
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 85
cagagcgtgc tgacccagcc accaagcgtg agcggtgcac caggtcagcg cgtgaccatt 60
agctgcaccg gcagcagcag caacattggc gcaggctatg atgtgcattg gtatcagcag 120
ctgccaggca ccgcaccgaa actgctgatt tatggcaaca gcaatcgccc aagcggtgtg 180
ccggatcgct ttagcggcag caaaagcggc accagcgcca gcctggcgat taccggtctg 240
caagccgaag acgaagccga ttattactgc cagtctcatg acctgggtgc tcatgtttgg 300
gtgtttggcg gcggtaccaa gctgaccgtg ctgggccagc ccaaagccgc ccctagcgtg 360
accctgttcc ccccaagcag cgaggaactc caggccaaca aggccaccct cgtgtgcctg 420
atcagcgact tctaccctgg cgccgtgacc gtggcctgga aggccgatag cagccctgtg 480
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agctacctga gcctgacccc cgagcagtgg aagtcccaca gatcctacag ctgccaggtc 600
acacacgagg gcagcaccgt ggaaaagacc gtggccccca ccgagtgcag c 651
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 86
caggtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggtag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcgggtt tagcttcggc gactattacg tgagctggat tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggttagcgcc attggggggt ccggttccgc cgtgcaatac 180
gctgaatccg tgaagggccg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa cagcctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgtcactac 300
cgtgagttcc gttggcacta ctattacttt gactattggg gtcagggcac cctggttact 360
gtctcgagcg ccagcacaaa gggacccagc gtgttccctc tggcccccag cagcaagtct 420
acatctggcg gaacagccgc cctgggctgc ctcgtgaagg actactttcc cgagcccgtg 480
accgtgtcct ggaactctgg cgctctgaca agcggcgtgc acacctttcc agccgtgctc 540
cagagcagcg gcctgtactc tctgagcagc gtcgtgacag tgcccagcag ctctctgggc 600
acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac aagcccagca acacaaaggt ggacaagcgg 660
gtggaaccca agtcctgc 678
<210> 87
<211> 696
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 87
caggtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggtag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcgggtt tagcttcggc gactattacg tgagctggat tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggttagcgcc attggggggt ccggttccgc cgtgcaatac 180
gctgaatccg tgaagggccg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa cagcctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgtcactac 300
cgtgagttcc gttggcacta ctattacttt gactattggg gtcagggcac cctggttact 360
gtctcgagcg ccagcacaaa gggacccagc gtgttccctc tggcccccag cagcaagtct 420
acatctggcg gaacagccgc cctgggctgc ctcgtgaagg actactttcc cgagcccgtg 480
accgtgtcct ggaactctgg cgctctgaca agcggcgtgc acacctttcc agccgtgctc 540
cagagcagcg gcctgtactc tctgagcagc gtcgtgacag tgcccagcag ctctctgggc 600
acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac aagcccagca acacaaaggt ggacaaggaa 660
gtcgagcgca gacagggcgg catcggccat aaatgc 696
<210> 88
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 88
tccagctaca tgcat 15
<210> 89
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 89
attatcgagc ccactggggc atccacactg tacgcacagc ggttccaagg g 51
<210> 90
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 90
actggaatcg cactgcctct gggttttgac ctg 33
<210> 91
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 91
agcggcagca gcagcaacat cggcaacaac tacgttagc 39
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 92
gataacaaca aacgcccgag c 21
<210> 93
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 93
gccgcttgga gtactcgttt ccgttgggtg 30
<210> 94
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 94
caggtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac caggcgccag cgtgaaagtt 60
agctgcaaag ccagcggcgg cgcatttacc tccagctaca tgcattgggt tcgccaggcc 120
ccaggccagg gtctggaatg gatgggcatt atcgagccca ctggggcatc cacactgtac 180
gcacagcggt tccaagggcg cgtgaccatg acccgcgata ccagcaccag caccgtgtat 240
atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgaactgga 300
atcgcactgc ctctgggttt tgacctgtgg ggccagggca ccctggttac tgtctcgagc 360
360
<210> 95
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 95
cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgtt agcgccgcac caggccagaa agtgaccatt 60
agctgtagcg gcagcagcag caacatcggc aacaactacg ttagctggta tcagcagctg 120
ccgggcaccg ccccgaaact gctgatctat gataacaaca aacgcccgag cggcatcccg 180
gatcgcttta gcggtagcaa aagcggcacc agcgccaccc tgggcattac cggcctgcaa 240
accgaagacg aagccgatta ttactgtgcc gcttggagta ctcgtttccg ttgggtgttt 300
ggcggcggta ccaagctgac cgtgctgggc cag 333
<210> 96
<211> 645
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 96
cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgtt agcgccgcac caggccagaa agtgaccatt 60
agctgtagcg gcagcagcag caacatcggc aacaactacg ttagctggta tcagcagctg 120
ccgggcaccg ccccgaaact gctgatctat gataacaaca aacgcccgag cggcatcccg 180
gatcgcttta gcggtagcaa aagcggcacc agcgccaccc tgggcattac cggcctgcaa 240
accgaagacg aagccgatta ttactgtgcc gcttggagta ctcgtttccg ttgggtgttt 300
ggcggcggta ccaagctgac cgtgctgggc cagcccaaag ccgcccctag cgtgaccctg 360
ttccccccaa gcagcgagga actccaggcc aacaaggcca ccctcgtgtg cctgatcagc 420
gacttctacc ctggcgccgt gaccgtggcc tggaaggccg atagcagccc tgtgaaggcc 480
ggcgtggaaa ccaccacccc cagcaagcag agcaacaaca aatacgccgc cagcagctac 540
ctgagcctga cccccgagca gtggaagtcc cacagatcct acagctgcca ggtcacacac 600
gagggcagca ccgtggaaaa gaccgtggcc cccaccgagt gcagc 645
<210> 97
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 97
caggtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac caggcgccag cgtgaaagtt 60
agctgcaaag ccagcggcgg cgcatttacc tccagctaca tgcattgggt tcgccaggcc 120
ccaggccagg gtctggaatg gatgggcatt atcgagccca ctggggcatc cacactgtac 180
gcacagcggt tccaagggcg cgtgaccatg acccgcgata ccagcaccag caccgtgtat 240
atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgaactgga 300
atcgcactgc ctctgggttt tgacctgtgg ggccagggca ccctggttac tgtctcgagc 360
gccagcacaa agggacccag cgtgttccct ctggccccca gcagcaagtc tacatctggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgctctgac aagcggcgtg cacacctttc cagccgtgct ccagagcagc 540
ggcctgtact ctctgagcag cgtcgtgaca gtgcccagca gctctctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacacaaagg tggacaagcg ggtggaaccc 660
aagtcctgc 669
<210> 98
<211> 687
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 98
caggtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac caggcgccag cgtgaaagtt 60
agctgcaaag ccagcggcgg cgcatttacc tccagctaca tgcattgggt tcgccaggcc 120
ccaggccagg gtctggaatg gatgggcatt atcgagccca ctggggcatc cacactgtac 180
gcacagcggt tccaagggcg cgtgaccatg acccgcgata ccagcaccag caccgtgtat 240
atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgaactgga 300
atcgcactgc ctctgggttt tgacctgtgg ggccagggca ccctggttac tgtctcgagc 360
gccagcacaa agggacccag cgtgttccct ctggccccca gcagcaagtc tacatctggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgctctgac aagcggcgtg cacacctttc cagccgtgct ccagagcagc 540
ggcctgtact ctctgagcag cgtcgtgaca gtgcccagca gctctctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacacaaagg tggacaagga agtcgagcgc 660
agacagggcg gcatcggcca taaatgc 687
<210> 99
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 99
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Gln Ser Thr Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Arg Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Leu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Ser Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 100
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 100
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Ser Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Asn Leu Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr
100 105
<210> 101
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 101
Glu Pro Lys Ser Cys
1 5
<210> 102
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(5)
<223> Any natural occurring amino acid residue except cysteine
<400> 102
Glu Arg Arg Xaa Xaa Gly Ile Gly His Lys Cys
1 5 10
<210> 103
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 103
Glu Arg Arg Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys
1 5 10
<210> 104
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 104
Glu Glu Arg Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys
1 5 10
<210> 105
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 105
Glu Arg Arg Gln Gly Gly Ile Gly His Lys Cys
1 5 10
<210> 106
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 106
Val Pro Arg Glu Cys
1 5
<210> 107
<211> 103
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 107
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Ile Val Pro Arg Glu Cys
100
<210> 108
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 108
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Arg Arg Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys
100 105
<210> 109
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 109
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Glu Lys
85 90 95
Lys Val Glu Arg Arg Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys
100 105
<210> 110
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Gly Val Glu Arg Arg Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys
100 105
<210> 111
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 111
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Glu Val Glu Arg Arg Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys
100 105
<210> 112
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 112
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Glu Arg Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys
100 105
<210> 113
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 113
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Glu Val Glu Arg Arg Gln Gly Gly Ile Gly His Lys Cys
100 105
Claims (18)
- GPVI에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은:
e) 서열번호 11의 HCDR1 부위, 서열번호 12의 HCDR2 부위, 서열번호 13의 HCDR3 부위, 서열번호 14의 LCDR1 부위, 서열번호 15의 LCDR2 부위 및 서열번호 16의 LCDR3 부위, 또는
f) 서열번호 22의 HCDR1 부위, 서열번호 23의 HCDR2 부위, 서열번호 24의 HCDR3 부위, 서열번호 25의 LCDR1 부위, 서열번호 26의 LCDR2 부위 및 서열번호 27의 LCDR3 부위, 또는
g) 서열번호 33의 HCDR1 부위, 서열번호 34의 HCDR2 부위, 서열번호 35의 HCDR3 부위, 서열번호 36의 LCDR1 부위, 서열번호 37의 LCDR2 부위 및 서열번호 38의 LCDR3 부위, 또는
h) 서열번호 44의 HCDR1 부위, 서열번호 45의 HCDR2 부위, 서열번호 46의 HCDR3 부위, 서열번호 47의 LCDR1 부위, 서열번호 48의 LCDR2 부위 및 서열번호 49의 LCDR3 부위를 포함하는, 항체 또는 항체 단편.
- 제1항에 있어서, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 17의 VH 및 서열번호 18의 VL, 또는
b) 서열번호 28의 VH 및 서열번호 29의 VL, 또는
c) 서열번호 39의 VH 및 서열번호 40의 VL, 또는
d) 서열번호 50의 VH 및 서열번호 51의 VL, 을 포함하는, 항체 또는 항체 단편.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은:
a) 서열번호 20의 HC 및 서열번호 19의 LC, 또는
b) 서열번호 21의 HC 및 서열번호 19의 LC, 또는
c) 서열번호 31의 HC 및 서열번호 30의 LC, 또는
d) 서열번호 32의 HC 및 서열번호 30의 LC, 또는
e) 서열번호 42의 HC 및 서열번호 41의 LC, 또는
f) 서열번호 43의 HC 및 서열번호 41의 LC, 또는
g) 서열번호 53의 HC 및 서열번호 52의 LC, 또는
h) 서열번호 53의 HC 및 서열번호 52의 LC, 를 포함하는, 항체 또는 항체 단편.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 인간, 인간화된, 키메릭 또는 합성 항체 또는 항체 단편인, 항체 또는 항체 단편.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 분리된 항체 또는 항체 단편인, 항체 또는 항체 단편.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 재조합 항체 또는 항체 단편인, 항체 또는 항체 단편.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 단일클론항체 또는 항체 단편인, 항체 또는 항체 단편.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 단일가 (monovalent) 항체 또는 항체 단편인, 항체 또는 항체 단편.
- 제8항에 있어서, 여기서 상기 단일가 (monovalent) 항체 단편은 Fab인, 항체 또는 항체 단편.
- 제9항에 있어서, 여기서 상기 Fab는 수정된 중쇄 불변 부위를 포함하고, 여기서 수정된 중쇄 불변 부위는 개체의 혈청에 존재하는 항-Fab 항체에 의해 상기 Fab의 인식을 방지 또는 억제하는 특징이 있는. 항체 또는 항체 단편.
- 제10항에 있어서, 여기서 수정된 중쇄 불변 부위는 아미노산 서열ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKEVERRQGGIGHKC(서열번호 113)로 구성되는, 항체 또는 항체 단편.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 GPVI, 시아노몰거스 원숭이 (cynomolgus monkey) GPVI, 마우스 GPVI, 및 랫트 GPVI에 특이적인, 항체 또는 항체 단편.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 단편에 있어서, 의약품으로서의 용도,
- 제1항 내지 제11항에 있어서, 이를 필요로 하는 개체의 치료에 사용하는 용도.
- 제1항 내지 제11항에 따른 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 핵산 조성물.
- 제15항의 하나의 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 하나의 벡터 또는 복수의 벡터를 포함하는 벡터 조성물.
- 제16항의 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포.
- 제1항 내지 제11항에 따른 분리된 항체 또는 항체 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
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