CN102985536B - 生产高效价、高纯度的病毒母液的方法及使用其的方法 - Google Patents

生产高效价、高纯度的病毒母液的方法及使用其的方法 Download PDF

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Abstract

用于病毒清除研究的病毒母液的纯度和效价对研究结果具有重要影响，且影响缩尺模型可以多好地代表生产规模方法。病毒母液中的杂质在测试小病毒保持性过滤器的过程中尤为重要，因为这些杂质可能引起过滤器过早地结垢，导致过滤器的真实通量能力被低估以及随后对生产规模单元的尺寸确定不当。另外，杂质也可通过改变结垢机制以及随后经过病毒过滤器的流体传递来影响所观察到的病毒清除程度。本文描述制备、生产和使用具有高效价的高纯度病毒母液的方法。

Description

生产高效价、高纯度的病毒母液的方法及使用其的方法
相关申请案
本申请案要求2010年4月14日提交的美国临时申请案第61/324,220号的权益。以上申请案的全部教示内容以引用的方式并入本文中。
背景技术
生物医药产品（例如单克隆抗体、重组蛋白、疫苗、血液衍生物和畜产品）携带传播感染性病毒的风险。这是由于来源物质可能内部受病毒污染。另外，生物医药产品的制造方法易受外部来源的病毒污染。因此，生物医药产品的制造商需要在其制造方法中并入足够的病毒清除步骤，以确保其产品无污染病毒。安全性和管理规则要求，生物医药产品的制造方法并入这些病毒清除步骤。
对制造方法中病毒清除步骤的有效性进行评估是必要的。病毒清除评估的目的是评定制造生产方法使潜在病毒污染物去活化和/或去除潜在病毒污染物的能力。掺加研究典型地在生产规模方法的缩尺模型中用于评估和验证病毒清除步骤。然而，用于病毒清除研究的病毒母液的纯度和效价对研究结果具有重要影响。病毒母液的纯度和效价影响缩尺模型可以多好地代表生产规模方法。
例如，病毒母液中的杂质会不利地影响病毒清除步骤中所用的小病毒保持性过滤器的测试过程。杂质由于验证性掺加研究中使用的不纯病毒母液而被引入，且不反映生产规模方法上的典型制造方法。由于杂质，测试单元（例如过滤器）过早地结垢，展现改变的结垢条件，并且不利地影响经过病毒过滤器的流体传递。从而，过滤器的真实通量容量被低估，这又导致对生产规模单元的尺寸确定不当。因此，生产规模单元尺寸过大以弥补验证研究中这一单元的明显较低性能。这增加了生产成本。另外，这低估了测试单元在生产方法中清除病毒的实际能力，因为病毒母液的效价通常决定着掺加入测试物质中的病毒的最大可能浓度，当所有病毒均被测试单元有效清除时，效价限制了测试单元的病毒清除要求。
当前生产病毒母液（例如用于掺加研究）的方法无法生产具有低杂质含量的病毒母液。此外，需要具有尽可能高效价的病毒母液，因为可以加入测试***中的病毒掺加物的体积受管理准则的限制。当前的方法无法生产高效价和高纯度的病毒母液。因此，需要制备具有高纯度以及高效价的病毒母液的方法。
发明内容
本文中描述生产高纯度病毒母液的方法，以及通过所述方法生产的病毒和病毒母液。病毒可以是所期望的任何合适的病毒，例如哺乳动物病毒或噬菌体。这些病毒母液适合用作例如评估和/或验证研究中的病毒掺加物。
因此，本发明的一个实施例是一种制备高纯度病毒的方法。所述方法包含以下连续步骤：获得在低蛋白质条件下制备的病毒样品，在合适的缓冲剂中浓缩病毒样品，以及在病毒样品中沉淀病毒，使得沉淀的病毒是高纯度病毒。在一个实施例中，高纯度病毒是高纯度病毒母液。
在本发明的另一个实施例中，制备高纯度病毒的方法包含色谱精制（chromatographic polishing）。在一个实施例中，制备高纯度病毒的方法包含以下连续步骤：获得在低蛋白质条件下制备的病毒样品，在合适的缓冲液中浓缩病毒样品，在病毒样品中沉淀病毒以及对沉淀的病毒进行色谱精制，从而生产高纯度病毒。在一个实施例中，高纯度病毒是高纯度病毒母液。
在一个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有低于50ug/ml的蛋白质浓度。在另一个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有低于100fg/TCID50的蛋白质浓度。在一个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有低于60fg/TCID50的蛋白质浓度。在另一个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有低于50fg/TCID50的DNA浓度。在一个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有低于15fg/TCID50的DNA浓度。
在另一个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有低于100fg/TCID50的蛋白质浓度和低于50fg/TCID50的DNA浓度。在一个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有低于60fg/TCID50的蛋白质浓度和低于15fg/TCID50的DNA浓度。
在另一个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有至少106TCID50/ml的病毒浓度。
本发明的另一个实施例是一种评估和/或验证病毒清除处理和其中所用物质的方法。缩尺病毒清除处理是通过使用测试样品和分析病毒清除处理的结果来测试。病毒清除的量评估并且决定着病毒清除处理以及病毒清除处理中所用物质的验证。如果病毒充分地从测试样品中去除来满足管理标准，那么病毒清除处理以及清除处理中所用物质经过验证。
在一个实施例中，评估和/或验证病毒清除处理的方法包含向样品中掺加高纯度病毒母液，以生产测试样品。在一个实施例中，高纯度病毒溶液包含低于100fg/TCID50的蛋白质浓度和低于50fg/TCID50的DNA浓度。
本发明的另一个实施例是在包含向样品中掺加病毒溶液的方法中评估和/或验证病毒清除处理的一种方法，其中病毒溶液是通过包含流通色谱、基于珠粒的色谱、分子排阻处理或基于疏水性的处理的方法来制备。在一个实施例中，病毒溶液是通过阳离子交换流通色谱来制备。在另一个实施例中，病毒溶液是通过阴离子交换流通色谱来制备。在一个实施例中，流通色谱包含在膜或基于珠粒的基质上的阳离子交换流通色谱。
在一个实施例中，评估和/或验证病毒清除处理和其中所用物质的方法包含向样品中掺加高纯度病毒母液，所述病毒母液包含至少107TCID50/ml的病毒、低于100fg/TCID50的蛋白质浓度和低于50fg/TCID50的DNA浓度。
附图说明
图1是概括的病毒生产方案和特异性小鼠微小病毒（MVM）生产方法的一个实例的方框图。
图2是展示本发明的一个实施例的流程图。
图3A到图3C说明本发明的一个实施例。
图3A是在样品病毒制备方法中的不同阶段取出的样品的银染色SDS-PAGE凝胶。泳道1、14和15是标准分子量标记。泳道2是在第3天的MVM感染的细胞培养基的样品，紧接着将所述培养基从具有1%胎牛血清（FBS）的达尔伯克氏改良伊格尔培养基（DMEM）改变成无血清的DMEM。泳道3是在第14天感染完成时混合细胞裂解液的样品。泳道4是澄清裂解液的样品。泳道5是来自用于病毒浓缩的超滤的滤液样品。泳道6是来自用于病毒浓缩的超滤的稀释过的滞留物样品。泳道7是在通过超速离心进行病毒沉淀后的上清液样品。泳道8是在通过超速离心进行病毒沉淀后的病毒颗粒样品。泳道9是在通过超速离心进行病毒沉淀和经过0.22微米过滤器过滤后的病毒颗粒样品。泳道10和12是使用阳离子交换（CEX）膜吸附剂进行色谱精制时的早期部分的样品，所述阳离子交换（CEX）膜吸附剂包含通过聚醚砜（PES）基质上的MBAm（N,N'-亚甲基双丙烯酰胺）交联的AMPS（2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸）。泳道11和13是使用CEX膜吸附剂进行色谱精制时的后期部分。
图3B由维尔王（Willwand）等人,病毒学杂志（J Virol）(1993)67:5660改编而来，其展示MVM衣壳蛋白VP1的分子大小是83kDa并且MVM衣壳蛋白VP2的分子大小是64kDa。在最终纯化过的病毒产品（图3A）中通过银染色SDS-PAGE明显可见的两个主要蛋白色带具有与已知MVM病毒壳体蛋白VP1和VP2相同的大小并以相同的比例呈现，这表明极纯病毒母液中主要残留蛋白是病毒而非杂质。
图3C是对应于图3A中的SDS-PAGE凝胶的泳道2到13中每个样品的计算MVM病毒效价（log TCID50/ml）、蛋白质浓度（ug/ml和fg/TCID50）和DNA浓度（ug/ml和fg/TCID50）的表格。
图4是展示本文所述MVM生产方法的再现性的表格。
图5A到图5B说明本发明的一个实施例。
图5A是对应于图5B中的SDS-PAGE凝胶的泳道2到11中每个样品的计算MVM病毒效价（log TCID50/ml）和蛋白质浓度（ug/ml和fg/TCID50）的表格。
图5B是在样品病毒制备方法中的不同阶段取出的样品的银染色SDS-PAGE凝胶。泳道1和12是标准分子量标记。泳道2是在第3天的MVM感染的细胞培养基的样品，紧接着将所述培养基从具有1%FBS的AdvancedTMDMEM改变成无血清的AdvancedTM DMEM。泳道3是在第14天感染完成时的混合细胞裂解液样品。泳道4和5是澄清裂解液样品。泳道6是来自用于病毒浓缩的超滤的滤液样品。泳道7是来自用于病毒浓缩的超滤的稀释过的滞留物样品。泳道8是在通过超速离心进行病毒沉淀之后的上清液样品。泳道9是在通过超速离心进行病毒沉淀之后再悬浮的病毒颗粒样品。泳道10是使用CEX膜吸附剂进行色谱精制时的第三部分样品。泳道11是使用CEX膜吸附剂进行色谱精制时的第二十七部分样品。
图6是关于使用如本文所述的方法生产高效价和高纯度病毒的数据的表格。
图7是展示测试过滤器（Pro（V-Pro））水力性能的曲线图，其使用掺加如本文所述而制备的病毒的样品，并且所述样品与掺加典型地用于验证研究的标准病毒制备物且由合同测试组织（CTO）提供的样品相比较。CTO的病毒制备使用超速离心方法。掺加如本文所述而制备的MVM到单克隆抗体进料（9.1g/L）中，所述单克隆抗体进料由于与病毒掺加物相互作用，已预先存在过滤方面的挑战。与未掺加的进料基线（无病毒）相比，掺加由CTO生产的MVM达到2×105TCID50/ml的浓度导致过滤器V-Pro的通量的显著下降。相比之下，如本文所述而制备的MVM在5×105TCID50/ml的掺加含量下对水力性能不具有影响，掺加扩大十倍到6×106TCID50/ml仍不具有影响。
图8是通过不同方法制备的三种CTO MVM掺加母液当掺加到单克隆抗体（Mab）进料中以及在Viresolve Pro间处理时对其水力性能评估的曲线图。
图9是三种标准CTO MVM制备物和通过本发明方法获得的MVM制备物的SDS-PAGE凝胶分析照片。在4%到15%梯度的凝胶中的蛋白可通过银染色显现。每个样品泳道负载10μl的样品。泳道1：分子量标记；泳道2：CTO粗MVM制备物（2.3×107TCID50/ml）；泳道3：CTO超速离心纯化的MVM制备物（1.8×107TCID50/ml）；泳道4（2.3×107TCID50/ml）：CTO Q膜结合/洗脱纯化的MVM制备物；泳道5：本发明的MVM制备物（6.5×108TCID50/ml）；泳道6：分子量标记。
具体实施方式
由细菌、病毒、朊病毒等对生物医药产品（例如抗体、重组蛋白、疫苗、血液衍生物、血浆和畜产品等）造成的污染是一个需要充分应对的严重风险。污染可以通过不同的方式发生。例如，它可以因为来源物质（例如细胞培养物中的细胞、血液产品等）内部受病毒污染而发生。生物医药产品的制造方法还易于受外部来源的病毒（例如，由于使用非无菌或不当灭菌的物质而无意间引入）污染。因为这些产品的性质，生物医药产品的制造商受到高度管理并需要并入足够的病毒清除步骤到其制造方法中，以确保其产品无污染物。多个病毒清除步骤可以并入到制造方法中。这些病毒清除步骤各自需要对其有效性进行评估且因此，在核准生物医药制造方法之前需要进行验证。病毒清除步骤典型地涉及病毒去除步骤或者病毒去活化步骤。
病毒去除是使得病毒通过物理方式从样品中去除的方法。此举通常通过纳滤或色谱法来实现。纳滤技术通过分子排阻来去除病毒。色谱方法在去除病毒方面成功与否取决于柱组成和使用的试剂（例如缓冲液）。
病毒去活化是使得病毒可能残留在最终产物中但呈非感染性（非活性）形式的方法。许多病毒含有可以通过化学改变去活化的脂质或蛋白壳。或者，一些病毒去活化方法使病毒完全变性。病毒去活化方法的实例包括溶剂和/或清洁剂去活化、巴氏灭菌法（例如加热到高温）、pH去活化（例如使用酸性pH）和照射（例如紫外线（UV）或γ照射）。
制造方法中污染病毒的浓度或病毒污染的风险可能极低，但因为病毒在其性质上具有感染性，因此即使一个病毒粒子就足以破坏制造方法中的整体运作。出于此原因，须采取特定措施来确定制造方法中的适当去除或去活化方法。同样地，需要评估和验证这些病毒清除方法的有效性。出于此目的，特定地建立掺加研究。
掺加研究使用生产规模方法的病毒清除步骤的缩尺模型来评估和/或验证病毒清除步骤以及评估和/或验证病毒清除方法中使用的设备。病毒母液的纯度和效价影响缩尺模型可以多好地代表生产规模方法。病毒母液中的杂质（例如DNA、RNA、蛋白质、脂质、非感染性粒子和病毒聚集体）不利地影响掺加研究的结果。例如，杂质可以通过阻碍病毒去活化化学品的作用来改变病毒清除速率，阻碍辐射的有效性，改变与靶向剂的色谱介质的结合（例如不当地抑制与色谱介质的结合或不当地增加与色谱介质的结合），或通过过滤器的结垢（例如，阻塞或堵塞）。当测试单元（例如过滤器或色谱介质）过早地结垢或展现改变的结垢特征时，它最终降低了经过病毒过滤器的流体的传递。因此，过滤器的实际通量容量被低估，因为这些杂质不是正常地存在于生产规模单元中的。从而，生产规模单元尺寸过大以弥补验证研究中这一单元的明显较低性能。当前生产病毒母液（例如用于掺加研究）的工业标准方法通常生产出具有高杂质含量的病毒母液。
另外，还需要具有尽可能高效价的病毒母液。这部分是因为可以加入测试***中的病毒掺加物的体积受管理准则的限制。病毒母液的效价因此决定着掺加到测试物质中的病毒的最大可能浓度。因此，测试单元在生产方法中清除病毒的实际能力可能被低估。当前的方法缺乏生产具有高纯度和高效价的病毒母液的能力。
本文所述的病毒制备方法生产具有特别高纯度和高效价的病毒。这些清洁病毒母液是设计成能使病毒清除研究中掺加的浓度较高而不影响缩尺单元操作的性能。这尤其适用于评估和验证小病毒保持性过滤器，其尤其当与某些给料物质组合时，可以对病毒母液杂质敏感。另外，较高病毒效价允许展示较大的病毒减少因数并且允许对病毒清除单元的操作造成更严格的挑战。
用于病毒清除研究并且可以使用本文所述方法以高效价和高纯度生产的示范性病毒包括哺乳动物病毒和噬菌体，例如而不限于：RNA包膜病毒（例如反转录病毒，例如1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）、2型人类免疫缺陷病毒（HIV-2）、猿猴免疫缺陷病毒（SIV）、异嗜性、兼嗜性和亲嗜性重组鼠类反转录病毒（例如异嗜性鼠类白血病病毒（X-MuLV））、绵羊髓鞘脱落病毒；黄病毒，例如牛病毒性腹泻病毒（BVDV）；弹状病毒，例如水泡性口炎病毒（VSV）；副粘病毒，例如3型副流感（PIV3））；RNA非包膜病毒（例如呼肠孤病毒，例如3型呼肠孤病毒（reo-3）；小核糖核酸病毒，例如1型脊髓灰质炎病毒（PV-1）；小核糖核酸病毒，例如脑心肌炎（EMC）病毒和A型肝炎病毒（HAV））；DNA包膜病毒（例如疱疹病毒，例如假狂犬病毒（PRV）、传染性牛鼻气管炎（IBR）病毒和1型单纯性疱疹病毒（HSV-1）；痘病毒，例如口疮病毒）；DNA非包膜病毒（例如腺病毒，例如人类腺病毒；多瘤病毒，例如猿猴病毒40（SV40）；以及细小病毒，例如猪细小病毒（PPV）、犬细小病毒（CPV）、细小病毒B19和小鼠微小病毒（MVM）（也称为小鼠微小病毒、鼠类微小病毒，MMV））；以及噬菌体，例如Phi-X 174（或Phi-X）、假单胞菌噬菌体PP7、肠细菌噬菌体PR772和假单胞菌噬菌体Phi-6。
所述方法已经成功地适用于小鼠微小病毒（MVM）。这种细小病毒，在最小的且最难以去除或去活化的病毒之中，对病毒清除（尤其对于生物医药产品的病毒过滤）来说是一个“金标准”。因此，这种方法还适用于其它病毒，尤其性质上与MVM相似的病毒（例如由相对较高效价的细胞产生的非包膜病毒）。例如，猪细小病毒（PPV），一种对于血浆产业来说重要的金标准病毒，在结构上与MVM极其相似。
出于实际原因，待评估和验证的方法步骤按比例缩小。这是因为，由于病毒掺加测试中需要的病毒的体积，对病毒清除研究使用实际生产规模将是不切实际的。此外，如显而易见的，将感染性病毒引入当前良好制造规范（cGMP）中，以致制造设施本身用于测试将是不适当的。病毒清除率是通过比较掺加的起始物质的病毒负荷与从测试单元获得的后处理物质，以获得病毒减少因数（本文中也称为“病毒减少因数（virus reduction factor）”或“VRF”）来计算的。
高纯度和高效价的病毒生产的概括程序以及用于MVM的特定病毒纯化技术图解描绘于图1中。
本发明的一个实施例是一种制备高纯度病毒或高纯度病毒母液的方法。如本文中所用的“高纯度病毒”是具有极低杂质（例如，蛋白质、DNA、脂质）浓度的病毒。在一个实施例中，高纯度病毒具有低于50ug/ml、低于45ug/ml、低于40ug/ml、低于35ug/ml、低于30ug/ml、低于25ug/ml、低于20ug/ml、低于15ug/ml、低于10ug/ml、低于5ug/ml或更低的蛋白质浓度。
在另一个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有低于100fg/TCID50、低于90fg/TCID50、低于80fg/TCID50、低于70fg/TCID50、低于60fg/TCID50、低于50fg/TCID50、低于40fg/TCID50、低于30fg/TCID50、低于20fg/TCID50、低于10fg/TCID50、低于5fg/TCID50或更低的蛋白质浓度。
在另一个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有低于50fg/TCID50、低于45fg/TCID50、低于40fg/TCID50、低于35fg/TCID50、低于30fg/TCID50、低于25fg/TCID50、低于20fg/TCID50、低于15fg/TCID50、低于10fg/TCID50、低于5fg/TCID50、低于1fg/TCID50、低于0.5fg/TCID50或更低的DNA浓度。
在另一个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有如以上所定义的蛋白质浓度和如以上所定义的DNA浓度。在一个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有低于100fg/TCID50的蛋白质浓度和低于50fg/TCID50的DNA浓度。在另一个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有低于60fg/TCID50的蛋白质浓度和低于15fg/TCID50的DNA浓度。在另一个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有低于5fg/TCID50的蛋白质浓度和低于0.5fg/TCID50的DNA浓度。
如所属领域的技术人员应了解的，TCID50/ml是在接种病原体的50%的细胞培养物中会产生病理变化的病原体的量的量度，表示为“组织培养物感染剂量50”（TCID50）。用于测定TCID50值的技术在所属领域是已知的。一般来说，制备病毒母液的连续稀释液并将其接种到例如呈多孔形式（例如96孔塑料板）的复制细胞培养物上。接着，典型地通过寻找细胞病变效应（CPE）来测定在一段细胞培养时间后各病毒稀释液中受到感染的细胞培养物数目。在一个典型研究中，在高病毒连续稀释液下，并无细胞培养物受到感染，因为并无粒子存在。在低病毒连续稀释液下，每个细胞培养物都受到感染。当一半的细胞培养物在特定的病毒连续稀释下显示细胞病变效应时，这种稀释就是使得50%的细胞培养物受到感染的病毒稀释。这一数字可由数据计算且表示为每毫升50%组织培养物感染剂量（TCID50）。
在一个实施例中，病毒母液具有至少或至少约105TCID50/ml、5×105TCID50/ml、106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高的病毒浓度。
所述方法包含以下连续步骤：获得在低蛋白质条件下制备的病毒样品，浓缩病毒样品，改变成合适的缓冲液以及在病毒样品中沉淀病毒，使得沉淀的病毒为高纯度病毒。在一个实施例中，高纯度病毒具有如上所述的病毒效价。
在低蛋白质条件下制备的病毒样品可以使用任何合适的方法获得。例如，病毒样品可以获自在低血清、无血清、确定成分培养基培养物或其组合中培养的病毒感染细胞。在一个实施例中，细胞在含低血清的细胞培养基（例如具有1%胎牛血清（FBS）的达尔伯克氏改良伊格尔培养基（DMEM））中受到感染，且随后在无血清的细胞培养基（例如不含FBS的DMEM或不含FBS的Advanced DMEM）或确定成分无血清细胞培养基中培养。在另一个实施例中，细胞在无血清细胞培养基（例如不含FBS的DMEM或不含FBS的Advanced DMEM）或确定成分无血清细胞培养基中受到感染。
浓缩病毒且将细胞培养基更换成合适的缓冲液。例如，在以下合适的缓冲液中浓缩病毒：Tris-NaCl-EDTA（TNE）缓冲液（例如，10mM Tris，pH 8.0，150mM NaCl，1mM EDTA）；磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）缓冲液（例如，137mM NaCl，2.7mM KCl，100mM Na2HPO4，2mMKH2PO4，pH 7.4）；Tris缓冲生理盐水（TBS）（例如，50mM Tris，150mM NaCl，pH pH 7.6）；Tris-EDTA（TE）缓冲液（例如，10mM Tris，1mM EDTA）；或10mM Tris。
在一个实施例中，病毒样品通过超滤（例如超滤离心装置）、切向流过滤、透析或其组合来浓缩。在超滤过程中，样品通过传递流体和小分子（例如，盐、糖和直径小于膜的孔径的蛋白质）但保留病毒的膜来处理。流体可以利用许多方法驱动经过超滤膜，这些方法包括（但不限于）离心法、蠕动泵、真空和气压。病毒接着再悬浮到期望体积的新缓冲液中。在切向流过滤（也称为交叉流过滤）中，进料溶液垂直流动到超滤膜上的表面。产生的跨膜压差使得流体和小分子可以流经膜而病毒却不会穿过，从而减少样品的体积。接着可以通过将新缓冲液进料到切向流过滤***中，同时继续跨膜抽取流体来改变缓冲液。在透析过程中，样品放置于允许流体和小分子自由传递但将病毒保留在内部中的膜袋内。通过将这一“透析袋”放置到具有规定的摩尔渗透压浓度的较大体积缓冲液中，将样品中的细胞培养基稀释成新的缓冲液且袋内的体积得以降低，从而实现了缓冲液更换和病毒浓缩。在一个特定实施例中，病毒样品通过超滤和将缓冲液更换成TNE来浓缩。
在病毒样品中沉淀病毒可以通过任何合适的方法来实现。例如，超速离心、化学诱导的沉淀、色谱结合、聚合物诱导的聚集或其组合。超速离心技术是所属领域中的标准。例如，病毒样品可以使用标准装置在约4℃、至少约25,000RPM（112600×g）下进行超速离心持续至少约4小时，并在管底部以颗粒形式收集。重介质（例如甘油）“垫层”可以在添加样品之前放置到管底部，使得病毒必须穿过这一致密层以在管底部成粒，而杂质却不会穿过。病毒还可以通过密度梯度介质（例如氯化铯或碘克沙醇（iodixanol））来进行离心，且病毒以浓缩层的形式在沿着这一密度梯度的某一点处收集。病毒沉淀使用的化学试剂可以是结合病毒并形成不溶性聚集体的任何试剂（例如，具有任何合适分子量（MW）的聚乙二醇（PEG），例如约MW6,000到约MW10,000）。色谱结合可以通过使用适于结合病毒的色谱介质（例如，琼脂糖、受控多孔玻璃或膜介质上的Q型或S型化学组成）来实现。诱导性聚集的可溶性聚合物也可以用于在病毒样品中沉淀病毒（例如智能聚合物，例如聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯和聚乙烯醇）。在一个实施例中，病毒通过超速离心来沉淀。
在一个实施例中，所述方法进一步包含对沉淀的病毒进行色谱精制。如本文中所用的“色谱精制”是指通过将样品传递通过基于杂质的静电荷或疏水性来保留杂质同时大多数病毒可以穿过的介质来去除微量杂质。色谱精制典型地去除通过病毒沉淀未去除的杂质。在一个实施例中，对病毒进行流通色谱精制（例如，使用阳离子交换（CEX）膜吸附剂，或阴离子交换介质，例如ChromaSorbTM）。这些色谱精制基于病毒样品中杂质的静电荷来去除杂质（例如蛋白质、核酸、脂质和糖）。可使用其它色谱精制方法，例如其它膜吸收剂（例如Pall Mustang S）；具有适当化学性质的基于珠粒的色谱介质（S型或Q型，取决于病毒和缓冲条件）；尺寸排阻介质；基于疏水性的介质）。所属领域的技术人员应了解，选择使用的色谱精制装置取决于待纯化病毒、待去除污染物的性质和纯化规模。
在本文所述方法的一个实施例中，病毒流经色谱精制介质且不发生结合，而杂质与介质结合，且由此从样品中去除。可以调整（例如，改变盐含量和/或pH值）缓冲条件以使病毒传递和杂质去除最大化。在一个实施例中，TNE缓冲液（pH 7）中的MVM穿过阳离子交换（CEX）膜吸附装置，使得蛋白质和DNA杂质被吸附到膜并被去除，而大部分病毒却穿过。
在另一个实施例中，色谱精制应用于任何病毒制备和纯化方法以纯化病毒并生产高纯度病毒。举例来说，除本文所述方法外还有用于病毒制备和纯化的其它方法，病毒可以通过色谱精制进一步纯化，包括通过超速离心成粒、梯度纯化、超滤所制备的病毒。色谱精制也可用于从未纯化的病毒制备物（仅通过澄清进行处理以去除细胞碎片）中纯化病毒。这些病毒制备物可以例如以流通模式使用适于所用特定病毒的色谱介质、缓冲条件和方法规模来纯化。在一个实施例中，通过超速离心成粒浓缩的病毒（例如MVM）穿过阳离子交换（CEX）膜。在一个实施例中，CEX膜包含在聚醚砜（PES）基质上通过MBAm（N,N'-亚甲基双丙烯酰胺）交联的AMPS（2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸）。病毒（例如MVM）穿过膜且不发生显著结合，而例如蛋白质和DNA等杂质与膜结合且从病毒样品中去除。
本文所述的方法显著减少病毒母液中存在的杂质。例如，病毒母液中的杂质总量得到显著降低。“杂质总量”意味着杂质数量得以减少（例如杂质（例如蛋白质、DNA等）的微克或飞克数减少约90%到约99%，如通过标准分析法所测定，例如用于蛋白质定量的二喹啉甲酸（BCA）分析、用于DNA定量的PicoGreenTM等）。另外，杂质数目显著减少。例如，在蛋白质凝胶上可识别的蛋白质杂质可能只有少数不同蛋白质（例如，2种、3种、5种、10种或20种），与如通过例如蛋白质SDS-PAGE凝胶的银染色等方法所测定的数百种、数千种或数万种不同蛋白质形成对比。杂质是病毒制备污染物，例如DNA、RNA、蛋白质、脂质、非感染性粒子和病毒聚集体。
在一个实施例中，病毒母液具有至少或至少约105TCID50/ml、5×105TCID50/ml、106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高的病毒浓度，和低于或低于约100ug/ml、90ug/ml、80ug/ml、70ug/ml、60ug/ml、50ug/ml、40ug/ml、30ug/ml、20ug/ml、10ug/ml或更低的蛋白质浓度。
在一个实施例中，病毒母液具有至少或至少约105TCID50/ml、5×105TCID50/ml、106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高的病毒浓度，和低于或低于约100fg/TCID50、90fg/TCID50、80fg/TCID50、70fg/TCID50、60fg/TCID50、50fg/TCID50、40fg/TCID50、30fg/TCID50、20fg/TCID50、15fg/TCID50、10fg/TCID50、5fg/TCID50或更低的蛋白质浓度。
在一个实施例中，病毒母液具有至少或至少约105TCID50/ml、5×105TCID50/ml、106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高的病毒浓度，和低于或低于约30fg/TCID50、25fg/TCID50、20fg/TCID50、15fg/TCID50、10fg/TCID50、5fg/TCID50、1fg/TCID50、0.5fg/TCID50或更低的DNA浓度。
在一个实施例中，病毒母液具有至少或至少约105TCID50/ml、5×105TCID50/ml、106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高的病毒浓度；低于或低于约100fg/TCID50、90fg/TCID50、80fg/TCID50、70fg/TCID50、60fg/TCID50、50fg/TCID50、40fg/TCID50、30fg/TCID50、20fg/TCID50、15fg/TCID50、10fg/TCID50、5fg/TCID50或更低的蛋白质浓度；和低于或低于约30fg/TCID50、25fg/TCID50、20fg/TCID50、15fg/TCID50、10fg/TCID50、5fg/TCID50、1fg/TCID50、0.5fg/TCID50或更低的DNA浓度。
所属领域的技术人员应了解，本文所述的方法可以应用于将许多病毒纯化到至少或至少约以下浓度：106TCID50/ml、107TCID50/ml、108TCID50/ml、109TCID50/ml、1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高。因此，在一个实施例中，将病毒纯化到至少106TCID50/ml的浓度的方法包含以下连续步骤：获得在低蛋白质条件下制备的病毒样品，在合适的缓冲液中浓缩病毒样品，以及在病毒样品中沉淀病毒，其中沉淀的病毒具有至少107TCID50/ml的病毒浓度，从而将病毒纯化到至少107TCID50/ml的浓度。
在一个实施例中，所述方法将病毒纯化到至少或至少约以下浓度：105TCID50/ml、5×105TCID50/ml、106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高。
在另一个实施例中，所述方法将病毒纯化到至少或至少约以下浓度：106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高，且蛋白质浓度低于或低于约100ug/ml、90ug/ml、80ug/ml、70ug/ml、60ug/ml、50ug/ml、40ug/ml、30ug/ml、20ug/ml或更低的蛋白。
在一个实施例中，所述方法将病毒纯化到至少或至少约以下浓度：106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高，且蛋白质浓度低于或低于约100fg/TCID50、90fg/TCID50、80fg/TCID50、70fg/TCID50、60fg/TCID50、50fg/TCID50、40fg/TCID50、30fg/TCID50、20fg/TCID50、15fg/TCID50、10fg/TCID50、5fg/TCID50或更低。
在一个实施例中，所述方法将病毒纯化到至少或至少约以下浓度：106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高，且DNA浓度低于或低于约30ug/TCID50、25ug/TCID50、20ug/TCID50、15ug/TCID50、10ug/TCID50、5ug/TCID50、1ug/TCID50、0.5ug/TCID50或更低。
在一个实施例中，所述方法将病毒纯化到至少或至少约以下浓度：106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高；蛋白质浓度低于或低于约100fg/TCID50、90fg/TCID50、80fg/TCID50、70fg/TCID50、60fg/TCID50、50fg/TCID50、40fg/TCID50、30fg/TCID50、20fg/TCID50、15fg/TCID50、10fg/TCID50、5fg/TCID50或更低；且DNA浓度低于或低于约30fg/TCID50、25fg/TCID50、20fg/TCID50、15fg/TCID50、10fg/TCID50、5fg/TCID50、1fg/TCID50、0.5fg/TCID50或更低。
本发明的另一个实施例是通过本文所述的方法生产的高纯度病毒或高纯度病毒母液。在一个实施例中是一种组合物，其包含通过本文所述的方法生产的高纯度病毒或高纯度病毒母液，基本上由通过本文所述的方法生产的高纯度病毒或高纯度病毒母液组成，或由通过本文所述的方法生产的高纯度病毒或高纯度病毒母液组成。
本发明的另一个实施例是一种评估和/或验证病毒清除处理和在清除处理中使用的病毒清除单元的操作（例如，以直流或切向流模式运作的平板膜或中空纤维型过滤器；色谱步骤，包括阳离子交换、阴离子交换、疏水***换、混合模式色谱法、亲和色谱法（例如基于蛋白A或其它配体的吸附）；病毒去活化处理，例如低pH值、溶剂/清洁剂、照射（γ或紫外线）、热处理）的方法。
如上文所论述，一种评估和/或验证病毒清除处理的方法是在病毒清除处理的缩尺模型（本文中也称为“缩尺病毒清除处理”）中的病毒掺加研究。病毒掺加研究的目的是评定病毒清除单元从产品（例如生物医药）制造处理中清除病毒的有效性。较高病毒效价允许展示较大的病毒减少因数并且允许对病毒清除单元的操作造成更为严格的挑战。然而，在掺加研究中，需要保持低的掺加物质体积（典型地10%或更低，（vol/vol）相对于待测试样品），以避免不可接受地改变样品产品组成。同样地，需要使用具有高病毒效价的病毒掺加物。用于验证或评估病毒清除处理和/或在病毒清除处理中使用的病毒清除单元的样品是制造处理进料的任何合适的样品。例如，合适的样品表示在生物医药制造期间生产的产品。实例包括样品溶液，其包含抗体、重组蛋白、疫苗、结合蛋白、血液衍生物、血浆和畜产品等。
因此，一个实施例是一种评估和/或验证病毒清除处理的方法，所述方法包含向样品中掺加高纯度病毒溶液。在一个实施例中，所述高纯度病毒溶液具有低于100fg/TCID50的蛋白质浓度和低于50fg/TCID50的DNA浓度，以生产测试样品。在一个实施例中，高纯度病毒母液具有至少或至少约106TCID50/ml到至少或至少约107TCID50/ml的病毒浓度，或更多的高纯度病毒。缩尺病毒清除处理是病毒清除处理的缩尺模型，它通过使用测试样品以及分析病毒清除处理的结果来测试，使得病毒清除的量评估并决定着病毒清除处理的验证。
在一个实施例中，用于评估和/或验证病毒清除处理的方法中的高纯度病毒溶液包含低于或低于约以下蛋白质浓度的蛋白：100ug/ml、90ug/ml、80ug/ml、70ug/ml、60ug/ml、50ug/ml、40ug/ml、30ug/ml、20ug/ml或更低。在另一个实施例中，用于评估和/或验证病毒清除处理的方法中的高纯度病毒溶液包含低于或低于约100fg/TCED50、90fg/TCED50、80fg/TCED50、70fg/TCED50、60fg/TCED50、50fg/TCED50、40fg/TCED50、30fg/TCED50、20fg/TCED50、15fg/TCED50、10fg/TCED50、5fg/TCED50或更低的蛋白质浓度。在另一个实施例中，用于评估和/或验证病毒清除处理的方法中的高纯度病毒溶液包含低于或低于约30fg/TCID50、25fg/TCID50、20fg/TCID50、15fg/TCID50、10fg/TCID50、5fg/TCID50、1fg/TCID50、0.5fg/TCID50或更低的DNA浓度。在另一个实施例中，用于评估和/或验证病毒清除处理的方法中的高纯度病毒溶液包含至少或至少约以下浓度的病毒：106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高。
在另一个实施例中，用于评估和/或验证病毒清除处理的方法中的高纯度病毒溶液包含至少或至少约以下浓度的病毒：105TCID50/ml、5×105TCID50/ml、106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高，和低于或低于约以下蛋白质浓度的蛋白：100ug/ml、90ug/ml、80ug/ml、70ug/ml、60ug/ml、50ug/ml、40ug/ml、30ug/ml、20ug/ml或更低。
在一个实施例中，用于评估和/或验证病毒清除处理的方法中的高纯度病毒溶液包含至少或至少约以下浓度的病毒：105TCID50/ml、5×105TCID50/ml、106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高，和低于或低于约100fg/ml、90fg/ml、80ug/ml、70fg/ml、60fg/ml、50fg/ml、40fg/ml、30fg/ml、20fg/ml、15fg/ml、10fg/ml、5fg/ml或更低的蛋白质浓度。
在一个实施例中，用于评估和/或验证病毒清除处理的方法中的高纯度病毒溶液包含至少或至少约以下浓度的病毒：105TCID50/ml、5×105TCID50/ml、106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高，和低于或低于约30fg/TCID50、25fg/TCID50、20fg/TCID50、15fg/TCID50、10fg/TCID50、5fg/TCID50、1fg/TCID50、0.5fg/TCID50或更低的DNA浓度。
在一个实施例中，用于评估和/或验证病毒清除处理的方法中的高纯度病毒溶液包含至少或至少约以下浓度的病毒：105TCID50/ml、5×105TCID50/ml、106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高；低于或低于约100fg/TCID50、90fg/TCID50、80fg/TCID50、70fg/TCID50、60fg/TCID50、50fg/TCID50、40fg/TCID50、30fg/TCID50、20fg/TCID50、15fg/TCID50、10fg/TCID50、5fg/TCID50或更低的蛋白质浓度；和低于或低于约30fg/TCID50、25fg/TCID50、20fg/TCID50、15fg/TCID50、10fg/TCID50、5fg/TCID50或更低的DNA浓度。
在评估和/或验证病毒清除处理的方法的一个实施例中，向测试样品中掺加至少或至少约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%（vol/vol）的任一种上述高纯度病毒溶液。在评估和/或验证病毒清除处理的方法的另一个实施例中，向测试样品中掺加至少或至少约以下浓度的来自任一种上述高纯度病毒溶液的病毒：105TCID50/ml、5×105TCID50/ml、106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高。
如果病毒充分地从测试样品中去除以便满足管理标准，那么这些数据可以应用于病毒清除处理的验证。在一个实施例中，缩尺病毒清除处理包含过滤器。
另一个实施例是一种评估和/或验证病毒清除单元的方法。所述方法包含向样品中掺加如上所述的高纯度病毒溶液。在一个实施例中，高纯度病毒包含低于100fg/TCID50的蛋白质浓度和低于50fg/TCID50的DNA浓度，以生产测试样品。在另一个实施例中，高纯度病毒溶液包含至少或至少约106TCID50/ml的病毒到至少或至少约107TCID50/ml或更多的病毒。病毒清除单元是病毒清除处理中使用的病毒清除单元的缩尺模型，它通过使用测试样品以及分析病毒清除单元的结果来测试，使得病毒清除的量决定着病毒清除单元的有效性。
在一个实施例中，用于评估和/或验证病毒清除单元的方法中的高纯度病毒溶液包含低于或低于约以下蛋白质浓度的蛋白：100ug/ml、90ug/ml、80ug/ml、70ug/ml、60ug/ml、50ug/ml、40ug/ml、30ug/ml、20ug/ml或更低。在另一个实施例中，用于评估和/或验证病毒清除单元的方法中的高纯度病毒溶液包含低于或低于约100fg/TCED50、90fg/TCED50、80fg/TCED50、70fg/TCED50、60fg/TCED50、50fg/TCED50、40fg/TCED50、30fg/TCED50、20fg/TCED50、15fg/TCED50、10fg/TCED50、5fg/TCED50或更低的蛋白质浓度。在另一个实施例中，用于评估和/或验证病毒清除单元的方法中的高纯度病毒溶液包含低于或低于约30fg/TCED50、25fg/TCED50、20fg/TCED50、15fg/TCED50、10fg/TCED50、5fg/TCED50、1fg/TCED50、0.5fg/TCED50或更低的DNA浓度。在另一个实施例中，用于评估和/或验证病毒清除单元的方法中的高纯度病毒溶液包含至少或至少约以下浓度的病毒：106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml或更高。
在另一个实施例中，用于评估和/或验证病毒清除单元的方法中的高纯度病毒溶液包含至少或至少约以下浓度的病毒：105TCID50/ml、5×105TCID50/ml、106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高，和低于或低于约以下蛋白质浓度的蛋白：100ug/ml、90ug/ml、80ug/ml、70ug/ml、60ug/ml、50ug/ml、40ug/ml、30ug/ml、20ug/ml或更低。
在一个实施例中，用于评估和/或验证病毒清除单元的方法中的高纯度病毒溶液包含至少或至少约以下浓度的病毒：105TCID50/ml、5×105TCID50/ml、106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高，和低于或低于约100fg/TCID50、90fg/TCID50、80fg/TCID50、70fg/TCID50、60fg/TCID50、50fg/TCID50、40fg/TCID50、30fg/TCID50、20fg/TCID50、15fg/TCID50、10fg/TCID50、5fg/TCID50或更低的蛋白质浓度。
在一个实施例中，用于评估和/或验证病毒清除单元的方法中的高纯度病毒溶液包含至少或至少约以下浓度的病毒：105TCID50/ml、5×105TCID50/ml、106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高，和低于或低于约30fg/TCID50、25fg/TCID50、20fg/TCID50、15fg/TCID50、10fg/TCID50、5fg/TCID50、1fg/TCID50、0.5fg/TCID50或更低的DNA浓度。
在一个实施例中，用于评估和/或验证病毒清除单元的方法中的高纯度病毒溶液包含至少或至少约以下浓度的病毒：105TCID50/ml、5×105TCID50/ml、106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高；低于或低于约100fg/TCID50、90fg/TCID50、80fg/TCID50、70fg/TCID50、60fg/TCID50、50fg/TCID50、40fg/TCID50、30fg/TCID50、20fg/TCID50、15fg/TCID50、10fg/TCID50、5fg/TCID50或更低的蛋白质浓度；和低于或低于约30fg/TCID50、25fg/TCID50、20fg/TCID50、15fg/TCID50、10fg/TCID50、5fg/TCID50、1fg/TCID50、0.5fg/TCID50或更低的DNA浓度。
在评估和/或验证病毒清除单元的方法的一个实施例中，向测试样品中掺加至少或至少约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%（vol/vol）的任一种上述高纯度病毒溶液。在评估和/或验证病毒清除单元的方法的另一个实施例中，向测试样品中掺加至少或至少约以下浓度的来自任一种上述高纯度病毒溶液的病毒：105TCID50/ml、5×105TCID50/ml、106TCID50/ml、5×106TCID50/ml、107TCID50/ml、5×107TCID50/ml、108TCID50/ml、5×108TCID50/ml、109TCID50/ml、5×109TCID50/ml、1010TCID50/ml、5×1010TCID50/ml、1011TCID50/ml、5×1011TCID50/ml或更高。
如果病毒充分地从测试样品中去除以便满足管理标准，那么病毒清除单元经过验证。在一个实施例中，病毒清除单元包含过滤器。
综合缩尺病毒清除研究中实现的病毒去除可加入到药物申请案管理归档中报告的病毒清除权利要求中。
例证
实例1：具有324K细胞的MVM传播（参见图2到图4）
材料：
传播细胞系：324K细胞（猿猴病毒40转化的人类纤维母细胞），从母液新鲜解冻。
感染：使用从ATCC（目录号VR-1346）病毒母液衍生的小鼠微小病毒（MVM）来感染324K宿主细胞。
培养基：具有10%胎牛血清“FBS”的DMEM、具有1%FBS的DMEM和不含FBS的DMEM。全部补充有0.1mM非必需氨基酸、2mL L-谷氨酰胺、0.2个单位/ml的青霉素/链霉素。不含FBS的DMEM补充有0.1mM非必需氨基酸、2mL L-谷氨酰胺、0.1个单位/ml的青霉素/链霉素。
再悬浮缓冲液：TNE（10mM Tris[pH 8.0]、150mM NaCl、1mM EDTA）。
装置：密理博阳离子交换（CEX）膜吸附剂（包含在聚醚砜（PES）基质上通过MBAm（N,N'-亚甲基双丙烯酰胺）交联的AMPS（2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸）），密理博-70100kDa离心超滤装置，和密理博MillexTM Durapore 0.22μm过滤器。
方法：
在本文所述的病毒母液制备方法中的多个阶段进行分析。在这一实例中，在图2中以红色指示的点处进行分析。每个样品的分析组如下：病毒效价（参见下文）、BCA蛋白含量（不在样品上）、PicoGreenTM DNA含量和SDS-PAGE银染色。在各取样点处取出1ml样品进行分析。
病毒滴定：除非另外说明，否则各滴定过程中对50μl样品进行10-2稀释（即，稀释到4.95ml培养基中）。例外的是滤液，其以未稀释的样品开始分析。所有样品均在4℃下储存直到滴定，在滴定后接着在-80℃下储存。
324K宿主细胞系生长：三十个T150烧瓶中的324K细胞从新鲜解冻的研究母液小瓶生长到融合。生长培养基：具有10%FBS的DMEM。
生长和感染进度：第0天：324K感染-使用胰蛋白酶离散（lift）324K细胞。在1500RPM下汇合悬浮的细胞和颗粒并持续10分钟。倾析并舍弃培养基。通过在50ml具有1%FBS的完全DMEM中再悬浮来洗涤细胞。如上所述使细胞成粒。倾析并舍弃培养基。汇合再悬浮的细胞到单一无菌容器中并计算细胞数目。所得细胞计数是2.02E+06个细胞/毫升，总计60.0ml。细胞的总数是1.2E+08个细胞。因此，每个融合Tl50的细胞数目是9.2E+06个细胞。在具有1%FBS的DMEM中制备650ml体积的在2.0×105个细胞/毫升的密度下的细胞。具体来说，将60ml细胞悬浮液加入590ml具有1%FBS的DMEM中（总体积=650ml）。计算的细胞密度：2.7E+05个细胞/毫升。MVM直接以MOI 0.002TCID50/细胞加入悬浮的细胞中。这需要加入500TCID50/ml细胞×650ml=总计加入3.3×105TCID50。MVM母液效价：1×108TCID50/ml。3.3×105TCID50÷母液效价=0.0033ml=3.3μl的MVM母液加入650ml细胞中（可以加入33μl的1/10母液稀释液）。充分混合细胞悬浮液。将20ml细胞/病毒悬浮液转移到30个Tl50烧瓶（标号烧瓶1到30）中的每一者中。目标接种=4.0×106个细胞/Tl50烧瓶。实际接种5.4E6个细胞/Tl50烧瓶。在37℃、10%CO2下培育细胞。在第3天到第4天；改变成无血清培养基。在第3天到第4天的每一天改变1/2烧瓶中的培养基：在第3天，改变烧瓶1到15中的培养基；在第4天，改变烧瓶15到30中的培养基。
培养基改变程序：将各烧瓶中的培养基倾析到公共池中。一个池将用于每日收集：来***瓶1到15的培养基d3m/c（第3天培养基改变）；来***瓶15到30的培养基d4m/c。分析各倾析的培养基池。用20ml DMEM[无FBS]洗涤各烧瓶。倾倒并舍弃洗涤培养基。用20mlDMEM[无FBS]来替换培养基，接着继续细胞培育。
第14天：采集裂解液。当细胞展示完全CPE（病毒诱导的裂解）时，通过倾析烧瓶到3个池中来采集细胞裂解液。裂解液d3m/c；裂解液d4m/c。分析各裂解液池（仅病毒效价）。将裂解液合并到单个池中。分析合并的裂解液池（仅病毒效价）。在4℃下储存裂解液，直到通过其它步骤加以处理。
澄清：通过在2000×g下旋转15分钟来对裂解液进行离心。倾析并保留上清液（舍弃颗粒）。用0.22μm GP Express Plus（PVDF）Stericups来过滤上清液。澄清的裂解液总体积：532.6ml（通过比较空的Stericups和填满的Stericups来确定）。分析澄清的裂解液。
通过进行浓缩：将离心器预冷却到4℃。4个Plus 100kDa装置各自负载70ml澄清的裂解液，总计为280ml。旋转管，直到滞留物体积为1到2ml（Thermo Fisher台式离心机，转子：228，温度：4℃，速度：2390×g，总旋转时间（旋转1）：13分钟）。将滤液保留在公共滤液池中。再用每个装置约70ml的裂解液来再填充管（倾倒在先前滞留物之上）。再次如上述旋转管，直到滞留物体积为1到2ml。总旋转时间（旋转2）：16.45分钟。将滤液与来自之前旋转的先前滤液合并。分析滤液（以检测任何病毒大量增加并目测/定量通过方法去除的蛋白质和DNA）。搁置任何残留的澄清裂解液。通过填充约70mlTNE来洗涤管。如上述再次旋转管，直到滞留物体积为1ml到2ml。总旋转时间（旋转3-洗涤）：13分钟）。舍弃洗涤滤液。反转装置中心并通过离心法收集滞留物（转子：228，温度：4℃，速度：1000×g，时间：2分钟）。将滞留物合并到公共池中（达到31mL，因此可以取出1mL样品）。
超速离心：称量30ml有盖的超速离心管。空管重量：86.638g。使用TNE将滞留物池的体积提高到31ml（使得当在去除用于分析的1ml后封盖时，超速离心管将是满的）。分析稀释过的滞留物。此时澄清的裂解液的预期的病毒浓度因数是18X。将稀释过的滞留物池转移到30ml超速离心管中。如果需要完全填充管，则加入TNE。称量填满的封盖超速离心管。填满的管重量：115.692g。总的稀释过的滞留物体积（填满重量-空重量）：29.054ml。预冷却超速离心器到4℃。制造重量与病毒管相同的均压管。对病毒进行超速离心（超速离心器转子：SW28，温度：4℃，速度：25,000RPM（112600×g），时间：4小时）。小心地从管中倾倒上清液。分析上清液。通过上下移液在15ml的TNE中再悬浮颗粒。将再悬浮的病毒收集到新管中。通过上下移液用另外15ml的TNE来冲洗超速离心管。将冲洗液与第一颗粒再悬液液合并，以形成30ml的病毒池。分析再悬浮的颗粒池。
无菌过滤：使用0.22μm Durapore Millex注射过滤器的无菌过滤。分析0.22μm之后的滤液。
CEX膜吸附剂处理：使30ml的病毒池穿过CEX膜吸附剂装置。CEX程序：在30psi下用MilliQ对CEX装置进行预湿10分钟。用缓冲液重复装置预湿。在预湿后，从压力源去除装置并将疏水性Millex附接到V-Shield通风器上。使用无菌注射器，缓慢排出CEX装置中的残留体积。小心不要施加全压到装置上，一些液体应保留在膜层之间。使用注射泵，设定注射器直径和流速（2mL/min）。使注射器负载病毒制备物并从注射器去除全部空气。附接预湿的CEX到注射器并将其固定在注射泵夹具中。使用附接于CEX装置出口侧的管道***，发动注射泵并在无菌容器中收集滤液。在全部物质均已被推动通过CEX后，停止泵，去除注射器并使管道***中的体积抽引到收集容器中。以1ml等分试样形式收集CEX滤液，在2ml冷冻管中编号1到14。分析CEX处理过的病毒部分2（早期部分）和14（后期部分）。
病毒储存：通过浸入异丙醇/干冰浴中来迅速冷冻小瓶。立刻将样品转移到-80℃储存中。
对病毒样品进行解冻并通过过滤器尺寸确定检查聚集作用：在37℃水浴中使一等份病毒解冻。分析解冻的病毒。使各解冻的等分试样穿过0.1μm的注射过滤器。分析0.1μm过滤的病毒。
表1：结果（VSP-PROC-004-评估操作＃1）
表2：结果概述
结论
在未加工的裂解液中324K细胞产生约7.7log TClD50/ml。去除血清不会降低含FBS的制备物中先前可见的病毒的效价。允许回收大多数病毒，但不去除污染蛋白。离心法回收大多数残留病毒，使得纯度大幅提高。再悬浮的颗粒穿过密理博CEX膜吸附剂，去除大多数残留污染物。发现评估操作1到4中结果一致，这些评估操作全部使用这种方法进行。
实例2：A9细胞的MVM传播（参见图5到图7）
实例1的方法使用A9细胞（ATCC）替换324K宿主细胞以及AdvancedTMDMEM（英杰（Invitrogen）产品＃12491-015）替换DMEM来重复进行。后期CEX部分以1ml而非2ml部分收集。在其它方面，方案相同。结果在图5A、图5B和图6中显示。
结果
观察感染后的细胞进展：第2天：100%融和；第4天：90%融合-10%剥离；第7天：60%裂解；第8天：60%到70%裂解；第9天：与第8天相同；在第10天采集。
表3：结果（VSP-PROC-010-A9）
标号 样品名称 效价(log TCID50)
1 第3天倾析的培养基 6.69
2 第10天的CI.裂解液 9.75
3 第11天的CI.裂解液 9.75
4 汇合的澄清裂解液 9.88
5 CentriconTM滤液 6.69
6 稀释过的滞留物 10.31
7 U/C上清液 9.19
8 U/C颗粒 10.56
9 部分7 10.50
10 部分20 10.31
表4：结果概述
结论
A9细胞在未加工的细胞裂解液中产生9.75log TCID50/ml。采集物中提高的效价使得最终病毒母液具有10.5log TCID50/ml的浓度。SDS-PAGE显示来自A9传播的病毒采集物的蛋白多于324K裂解液。然而，尽管最终病毒母液中出现更多蛋白质（这些蛋白质可能是病毒蛋白质），但是如通过蛋白/感染性病毒测量的最终纯度是2到5fg蛋白质/TCID50。假定培养基仍无血清且细胞蛋白背景预期是相等的，这些蛋白质可能是病毒蛋白质（且因此结果具有较高病毒效价）。
实例3：对不同标准CTO掺加母液的水力性能的评估（参见图8到图9）。
通过不同方法制备的三种CTO MVM掺加母液当掺加到单克隆抗体（Mab）进料以及经过Viresolve Pro加以处理时，对所述掺加母液的水力性能进行评估。粗制备物仅经过澄清化以去除细胞碎片并不再进行其它纯化。经过超速离心的制备物是通过利用超速离心使病毒在感染的细胞培养裂解液中成粒，舍弃上清液并接着在FBS中再悬浮病毒而得到纯化。膜结合/洗脱纯化的制备物是通过使澄清的感染细胞培养裂解液穿过具有带正电的Q化学组成的膜吸附剂来制备。病毒与膜结合，且接着用含400mM NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱。通过超速离心以及膜结合/洗脱纯化方法制备的MVM制备物由CTO向顾客出售，以用于其掺加研究中。
所有三种母液的目标掺加含量是1.4×105TCID50/ml。每个条件一式两份进行操作（操作＃1和操作＃2）。掺加后进料中实现的实际效价是粗制备物：2×105TCID50/ml；经过超速离心的：4×104TCID50/ml；和膜结合/洗脱纯化过的：6×104TCID50/ml。值得注意的是，膜结合/洗脱纯化的制备物的水力性能并不优于未纯化的粗病毒。在这一比较中，经过超速离心的制备物在三种CTO制备物中具有最佳性能，通量与未掺加的进料相似（在4×104TCID50/ml的掺加含量下）。然而，如以上实例中所述，本发明的病毒制备物的表现显著优于CTO病毒制备物（参见，例如图7）。
表5.标准CTO MVM病毒母液制备物（超速离心制备物和Q膜制备物）对比通过本发明方法获得的MVM病毒母液制备物的生物分子学表征的概述
蛋白质是通过Micro BCA分析来定量。*n.d.，未测出。粗病毒母液中存在的培养基组分干扰Micro BCA蛋白质分析。DNA是通过分析来定量。如表5中可见，CTO病毒制备物具有显著较高的蛋白质和DNA含量。
已经发现，蛋白质/病毒的量与病毒制备物导致过滤器结垢的潜力直接相关。除以上进行的分析之外，这三种标准CTO MVM制备物和通过本发明方法获得的MVM制备物还通过SDS-PAGE凝胶和银染色分析来进行分析。图9是经过银染色的4%到15%梯度SDS-PAGE凝胶的照片。每个样品泳道负载10μl样品。泳道1：分子量标记；泳道2：CTO粗MVM制备物（2.3×107TCID50/ml）；泳道3：CTO超速离心纯化过的MVM制备物（1.8×107TCID50/ml）；泳道4：CTO Q膜结合/洗脱纯化过的MVM制备物（2.3×107TCID50/ml）；泳道5：使用本发明方法获得的MVM制备物（6.5×108TCID50/ml）；泳道6：分子量标记。
如图9中所示，每种CTO病毒制备物中存在的蛋白质具有相当大的总数（参见每个泳道中蛋白质的色带数目和蛋白质拖尾现象），以及每个样品的蛋白质总量（展示为总染色量）。比较起来，本发明方法产生具有最小蛋白质含量（在数量和性质两个方面）的病毒制备物，如本文所述。
实例4：用于流通MVM病毒母液纯化的多种阳离子交换介质的比较
使MVM病毒母液（先前通过将缓冲液更换成TNE以及超速离心而纯化）穿过多种阳离子交换介质。接着通过遵循制造商方案的Micro BCA分析来分析流通物质的病毒效价和蛋白质含量。表6中所列的装置都去除大量的蛋白杂质，同时维持病毒制备物的效价。密理博CEX（膜吸附剂，包含在聚醚砜（PES）基质上通过MBAm（N,N'-亚甲基双丙烯酰胺）交联的AMPS（2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸））和Sartobind S15（赛多利斯公司（Sartorius））都是阳离子交换膜吸附剂。Pro Res-S（密理博）是单分散性聚甲基丙烯酸酯强阳离子交换树脂。
表6.用于流通MVM病毒母液纯化的多种阳离子交换介质的比较
如表6中所示，呈流通模式的多种阳离子交换介质可用于使用如本文所述的方法生产高纯度病毒溶液。
实例5：使用阳离子交换（CEX）膜吸附剂处理的多种缓冲液中的MVM母液。
多种缓冲液中的MVM母液是使用呈流通模式的阳离子交换（CEX）膜吸附剂（包含在聚醚砜（PES）基质上通过MBAm（N,N'-亚甲基双丙烯酰胺）交联的AMPS（2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸））来处理。如表7中所示，在这些条件的每一者中均实现蛋白杂质的去除，而无病毒效价的显著损失。
表7.使用阳离子交换（CEX）膜吸附剂处理的多种缓冲液中的MVM母液。
本文中所引用的所有专利、公开申请案以及参考文献的教示内容均以全文引用的方式并入本文中。
虽然已经参考本发明的例示性实施例特别显示并描述本发明，但所属领域的技术人员应了解，在不脱离随附的权利要求书所涵盖的本发明范围的情况下，可在本发明中进行形式和细节方面的各种变化。

Claims (15)

1.一种制备高纯度病毒母液的方法，其中所述病毒母液包含低于100fg/TCID50的蛋白质浓度，所述方法依序包含以下连续步骤：
(a)采集在低血清条件下生长的病毒感染的细胞的培养上清液，其中所述培养上清液是在病毒诱导细胞裂解后采集，从而获得病毒样品；
(b)通过超滤、切向流过滤、透析或其组合浓缩所述病毒样品，并以合适的缓冲液交换培养上清液；
(c)通过超速离心、化学诱导的沉淀、色谱结合、聚合物诱导的聚集或其组合在所述病毒样品中沉淀所述病毒，其中沉淀的病毒包含低于100fg/TCID50的蛋白质浓度；以及
(d)对沉淀的病毒进行色谱精制以去除微量杂质；
从而制备高纯度病毒母液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述低血清条件包含在无血清细胞培养基或确定成分培养基中使病毒感染的细胞生长。
3.根据权利要求1所述的方法，其中浓缩所述病毒样品包含超滤并且其中在所述病毒样品中沉淀所述病毒包含超速离心。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒母液具有低于60fg/TCID50的蛋白质浓度。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述病毒母液具有低于60fg/TCID50的蛋白质浓度和低于15fg/TCID50的DNA浓度。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述色谱精制包含阳离子交换流通色谱。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒是哺乳动物病毒或噬菌体或其组合。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒是细小病毒或异嗜性鼠类白血病病毒(X-MuLV)。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述细小病毒是小鼠微小病毒(MMV)。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒母液包含至少106TCID50/ml的浓度。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒母液具有低于20fg/TCID50的蛋白质浓度。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述病毒母液具有低于20fg/TCID50的蛋白质浓度和低于15fg/TCID50的DNA浓度。
13.一种评估病毒清除处理的方法，所述方法包含：
(a)向样品中掺加病毒溶液，其中所述病毒溶液是通过依序包含以下连续步骤的方法来制备，
(i)采集在低血清条件下生长的病毒感染的细胞的培养上清液，其中所述培养上清液是在病毒诱导细胞裂解后采集，从而获得病毒样品；
(ii)通过超滤、切向流过滤、透析或其组合浓缩所述病毒样品，并以合适的缓冲液交换培养上清液；
(iii)通过超速离心、化学诱导的沉淀、色谱结合、聚合物诱导的聚集或其组合在所述病毒样品中沉淀所述病毒，其中沉淀的病毒包含低于100fg/TCID50的蛋白质浓度；以及
(iv)对沉淀的病毒进行色谱精制以去除微量杂质；
从而生产测试样品；
(b)使用所述测试样品测试缩尺病毒清除处理；以及
(c)分析所述病毒清除处理的结果，
其中病毒清除的量决定所述病毒清除处理去除病毒的能力，从而评估所述病毒清除处理。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述病毒清除处理包含过滤器、色谱介质，或此两者。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述色谱精制包含在膜或基于珠粒的基质上的阳离子交换流通色谱。
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