JPS6078999A - HBs抗原の精製方法 - Google Patents
HBs抗原の精製方法Info
- Publication number
- JPS6078999A JPS6078999A JP58186187A JP18618783A JPS6078999A JP S6078999 A JPS6078999 A JP S6078999A JP 58186187 A JP58186187 A JP 58186187A JP 18618783 A JP18618783 A JP 18618783A JP S6078999 A JPS6078999 A JP S6078999A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antigen
- acid
- recombinant
- hbs antigen
- raw material
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 97
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 96
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 95
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 49
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 17
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims abstract description 17
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims abstract description 15
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 15
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 10
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000005185 salting out Methods 0.000 claims abstract description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 11
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims description 9
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 6
- 238000011276 addition treatment Methods 0.000 claims description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 13
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 229910052586 apatite Inorganic materials 0.000 description 7
- VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;fluoride;triphosphate Chemical compound [F-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 4
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- KYARBIJYVGJZLB-UHFFFAOYSA-N 7-amino-4-hydroxy-2-naphthalenesulfonic acid Chemical compound OC1=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(N)=CC=C21 KYARBIJYVGJZLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229960002520 hepatitis vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000002333 serotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- GGZZISOUXJHYOY-UHFFFAOYSA-N 8-amino-4-hydroxynaphthalene-2-sulfonic acid Chemical compound C1=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(N)=CC=CC2=C1O GGZZISOUXJHYOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- -1 DEAE-pharose Polymers 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101710137302 Surface antigen S Proteins 0.000 description 1
- 241001655798 Taku Species 0.000 description 1
- 244000111306 Torreya nucifera Species 0.000 description 1
- 235000006732 Torreya nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241001105470 Valenzuela Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N acetic acid 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011076 safety test Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はB型肝炎ウィルスの表面抗原(以下HBs抗原
と略称する)の精製法、さらに詳しくは、組換えDNA
技術を利用した組換え体により産生されるHBs抗原の
工業的精製法に関するものである。
と略称する)の精製法、さらに詳しくは、組換えDNA
技術を利用した組換え体により産生されるHBs抗原の
工業的精製法に関するものである。
発明の技術的背景と産業上利用分野
Bfi肝炎は、B型肝炎ウィルス(以下) LI3Vと
略称する)によって起こり、疫学的にも、臨床的にも非
稀′に重大なる問題を含む、いまだ有効な治療対策が見
出されていない疾病である。これは世界II iこ広く
分布しているが、特にアジア、アフリカ地域に多発し問
題となっている。
略称する)によって起こり、疫学的にも、臨床的にも非
稀′に重大なる問題を含む、いまだ有効な治療対策が見
出されていない疾病である。これは世界II iこ広く
分布しているが、特にアジア、アフリカ地域に多発し問
題となっている。
予防する対策としては、1413 s抗原を有効成分と
するワクチンが最も有効であると考えられ、天川化段階
に入っている。すなわち、キャリアーと称されるB型肝
炎ウィルス潜伏持続感染者の血漿より得られるHBS抗
原を高度に精製し、これを不活化して”Jl肝炎ワクチ
ンがつくられている。
するワクチンが最も有効であると考えられ、天川化段階
に入っている。すなわち、キャリアーと称されるB型肝
炎ウィルス潜伏持続感染者の血漿より得られるHBS抗
原を高度に精製し、これを不活化して”Jl肝炎ワクチ
ンがつくられている。
しかしながら、このように血液由来のワクチンは原料を
血液にもとめるため、またB型肝炎ウィルスあるいは他
の血液由来のウィルスなどの感染性ノ因子の残存を否定
するために、チンパンジーによる安全性確認試験が必要
であること、検定用のチンパンジーの確保が非常に困難
であることなどの問題点もあり、製造上に多くの制約が
ある。
血液にもとめるため、またB型肝炎ウィルスあるいは他
の血液由来のウィルスなどの感染性ノ因子の残存を否定
するために、チンパンジーによる安全性確認試験が必要
であること、検定用のチンパンジーの確保が非常に困難
であることなどの問題点もあり、製造上に多くの制約が
ある。
このような懸案を解消する方策として、組換えDNA技
術を利用して、大腸菌や、酵母菌に1Ins抗原蛋白質
をコードするI(BVのI)NAを導入、発現させるこ
とにより、ワクチンの原材料となるHB s抗原のみを
大量に作り出す研究か多くの研究者らによって推進され
てきた。最近、これら組換え体によるHBs抗原の発現
が成功を収め、特に組換え酵母によるHBs抗原の産生
については、工業的応用を可能とする段階に至った。な
お、実用化のためには、残された重要課題として、組換
え体によって産生されたHB s抗原を、ワクチン材料
あるいは診断用試薬材料となしつる程度まで、高度に精
製する方法の開発が挙Uノられる。
術を利用して、大腸菌や、酵母菌に1Ins抗原蛋白質
をコードするI(BVのI)NAを導入、発現させるこ
とにより、ワクチンの原材料となるHB s抗原のみを
大量に作り出す研究か多くの研究者らによって推進され
てきた。最近、これら組換え体によるHBs抗原の発現
が成功を収め、特に組換え酵母によるHBs抗原の産生
については、工業的応用を可能とする段階に至った。な
お、実用化のためには、残された重要課題として、組換
え体によって産生されたHB s抗原を、ワクチン材料
あるいは診断用試薬材料となしつる程度まで、高度に精
製する方法の開発が挙Uノられる。
従来技術
血液由来のHBs抗原の精製法としては、密度勾配遠心
法[Vyas 、 G、 N等、 J、 Immuno
logy。
法[Vyas 、 G、 N等、 J、 Immuno
logy。
108.1114 (1972)) 、ポリエチレング
リコール分画とゲル口過、遠心分離を組み合わせた方法
(特公昭57−21246)および、硫安塩析とゲル口
過を組み合わせた方法(特開昭53−38617)など
が提案されている。また組換え体由来のHBs抗原の精
製を試みた例として、水性ニー分配とイオン交換、ゲル
口過を組み合わせた精製法〔出tzeman、 R,A
等、 NucleicAc id 几ascrcb、
11−2745 (1983) )等がある。しかしな
がら、これらの方法は、組換え体由来のHBs抗原の精
製における種々の問題点に対し、いずれも対処できるも
のではなく、いわんや工業的精製法として適用すること
は難がしい。
リコール分画とゲル口過、遠心分離を組み合わせた方法
(特公昭57−21246)および、硫安塩析とゲル口
過を組み合わせた方法(特開昭53−38617)など
が提案されている。また組換え体由来のHBs抗原の精
製を試みた例として、水性ニー分配とイオン交換、ゲル
口過を組み合わせた精製法〔出tzeman、 R,A
等、 NucleicAc id 几ascrcb、
11−2745 (1983) )等がある。しかしな
がら、これらの方法は、組換え体由来のHBs抗原の精
製における種々の問題点に対し、いずれも対処できるも
のではなく、いわんや工業的精製法として適用すること
は難がしい。
すなわち、組換え体由来のHBs抗原を精製するうえで
解決すべき重要な課題は、原材料中の夾雑成分たとえば
組換え由来の蛋白質、脂質類その他の成分が、質的およ
び量的に人血液山来i(B s抗原の場合と全く異なっ
ていることであり、またその量が産出されるHBs抗原
量に比して非常に多いことである。さらに次の問題点と
して本発明者らは夾雑物中に存在する細胞由来のプロテ
アーゼ活性物質によって、i(B s抗原が急速に失活
されることを見出した。このためHBs抗原とプロテア
ーゼ活性物質を、出来るたり早い段階で完全に分離しな
ければ、精製工程において収率の大l]な低下をきたし
てしまうという問題点を解決する必要かある。
解決すべき重要な課題は、原材料中の夾雑成分たとえば
組換え由来の蛋白質、脂質類その他の成分が、質的およ
び量的に人血液山来i(B s抗原の場合と全く異なっ
ていることであり、またその量が産出されるHBs抗原
量に比して非常に多いことである。さらに次の問題点と
して本発明者らは夾雑物中に存在する細胞由来のプロテ
アーゼ活性物質によって、i(B s抗原が急速に失活
されることを見出した。このためHBs抗原とプロテア
ーゼ活性物質を、出来るたり早い段階で完全に分離しな
ければ、精製工程において収率の大l]な低下をきたし
てしまうという問題点を解決する必要かある。
さらに、組換え体由来11B s抗原は、そのアフィニ
ティー(生物学的親和力)の特性か人血液由来1−IB
s抗原と必すしも同一でない面があり、このことも精
製においての重要な問題点の1っである。
ティー(生物学的親和力)の特性か人血液由来1−IB
s抗原と必すしも同一でない面があり、このことも精
製においての重要な問題点の1っである。
これらのことから、先に挙げた血液由来のt4Bs抗原
の精製法に関する従来技術のみでは、組換え体由来のH
B s抗原含有にみられる特異条件を克服し充分な精製
効果を発揮することができない。組換え体由来HBs抗
原の精製を試みた口itzcma+iらの方法等におい
ても、その精製の内容は、いずれもHBs抗原の生化学
的分析用の標品をうるためになされたもので、単に分析
可能な程度にまで精製したにすぎず、ワクチンや診断用
試薬に11」い得る程度の精製効果を期待しうる方法で
はない。さらに精製工程における収率等も検討されてお
らす、またプロテアーゼ活性物質等による[iB s抗
原の失活に対する考慮は全くなされておらず、工業的精
製法として応用しつるものではない。
の精製法に関する従来技術のみでは、組換え体由来のH
B s抗原含有にみられる特異条件を克服し充分な精製
効果を発揮することができない。組換え体由来HBs抗
原の精製を試みた口itzcma+iらの方法等におい
ても、その精製の内容は、いずれもHBs抗原の生化学
的分析用の標品をうるためになされたもので、単に分析
可能な程度にまで精製したにすぎず、ワクチンや診断用
試薬に11」い得る程度の精製効果を期待しうる方法で
はない。さらに精製工程における収率等も検討されてお
らす、またプロテアーゼ活性物質等による[iB s抗
原の失活に対する考慮は全くなされておらず、工業的精
製法として応用しつるものではない。
発明の目的
本発明者らは、組換え体に由来する141λS抗13X
の工業的精製法を見出すべく、種々検fl’Jを重ねた
結果、組換え体の培養物から得られる、細胞由来成分等
を含有するHBs抗原原材オニ4液に、酸を添加してp
Hを酸性側にもってゆくことにより、クロマトグラフィ
ーの妨げとなる脂質類や夾雑蛋白質の大部分を沈殿物と
してl−lBs抗原と分別・除去できること、および、
次の工程でハイドロキシアパタイトによるアフイニテイ
クロマトグラフイーを行えば、)113 s抗原がきわ
めて高度に精製できることを見出し、本発明を完成する
に至った。
の工業的精製法を見出すべく、種々検fl’Jを重ねた
結果、組換え体の培養物から得られる、細胞由来成分等
を含有するHBs抗原原材オニ4液に、酸を添加してp
Hを酸性側にもってゆくことにより、クロマトグラフィ
ーの妨げとなる脂質類や夾雑蛋白質の大部分を沈殿物と
してl−lBs抗原と分別・除去できること、および、
次の工程でハイドロキシアパタイトによるアフイニテイ
クロマトグラフイーを行えば、)113 s抗原がきわ
めて高度に精製できることを見出し、本発明を完成する
に至った。
すなわち本発明の目的は、安全で有効なり型肝炎ワクチ
ンを安定かつ大量に供給することを可能ならしめること
にあり、本発明は、組み換えDNA技術を利用した組み
換え体により産生されるI(E s抗原を、工業的に効
率よく、大量に、しかもきわめて高純度に精製する方法
を提供するものである。
ンを安定かつ大量に供給することを可能ならしめること
にあり、本発明は、組み換えDNA技術を利用した組み
換え体により産生されるI(E s抗原を、工業的に効
率よく、大量に、しかもきわめて高純度に精製する方法
を提供するものである。
発明の構成および効果
本発明は、組換えDNA技術を利用した組換え体により
産生されるHB s抗原を精製するに除し、組換え体の
培養物から得られる、llBs抗jJλおよび♀i1j
胞由来成分を含有する原材料液に、酸を添加し原材料液
のpHを酸性側に移行せしめ、クロマトグラフィー法の
妨げとなる脂質類や夾雑蛋白質等の大部分を沈殿として
除去し、次いてそのままの状態でもしくは、必要に応じ
硫安塩析による精製および該縮操作を加えたのち、ハイ
ドロキンアパタイトによるアフィニティークロマトクラ
フィーを行うことをも徴とする。
産生されるHB s抗原を精製するに除し、組換え体の
培養物から得られる、llBs抗jJλおよび♀i1j
胞由来成分を含有する原材料液に、酸を添加し原材料液
のpHを酸性側に移行せしめ、クロマトグラフィー法の
妨げとなる脂質類や夾雑蛋白質等の大部分を沈殿として
除去し、次いてそのままの状態でもしくは、必要に応じ
硫安塩析による精製および該縮操作を加えたのち、ハイ
ドロキンアパタイトによるアフィニティークロマトクラ
フィーを行うことをも徴とする。
本発明におけるHB s抗原材料液とは、組換え1)N
A技術を利用して、1(BS抗原を産生ずるように)1
ジ賃転換された組換え体、例えば犬腸閑あるいは酵1:
j菌等を、適当な、培地および培養条件で培養して、H
Bs抗原を産生、蓄積させた後に、この培介物から適当
な方法でHBs抗原を粗抽出して得られるものである。
A技術を利用して、1(BS抗原を産生ずるように)1
ジ賃転換された組換え体、例えば犬腸閑あるいは酵1:
j菌等を、適当な、培地および培養条件で培養して、H
Bs抗原を産生、蓄積させた後に、この培介物から適当
な方法でHBs抗原を粗抽出して得られるものである。
抽出の方法は、まず菌体を遠心分周lLにより培疵物か
ら分離し、適当な緩衝液中て破壊する。破壊の方法とし
ては、超音波破砕、クラスヒーズ破砕、マントン・ゴー
リン破砕、あるいは細胞の扁胞壁を酵素的に溶解せしめ
てスフェロプラストとした後、これに界面活性剤を作用
させて破壊する等の陳々の方法を用いうる。この細胞破
壊物を低速遠心分離にかけ、細胞壁破片等を分離し、さ
らに必要に応じメンブランフィルタ−で口過して)−[
3s抗原原材料とする。
ら分離し、適当な緩衝液中て破壊する。破壊の方法とし
ては、超音波破砕、クラスヒーズ破砕、マントン・ゴー
リン破砕、あるいは細胞の扁胞壁を酵素的に溶解せしめ
てスフェロプラストとした後、これに界面活性剤を作用
させて破壊する等の陳々の方法を用いうる。この細胞破
壊物を低速遠心分離にかけ、細胞壁破片等を分離し、さ
らに必要に応じメンブランフィルタ−で口過して)−[
3s抗原原材料とする。
本発明において、酸添加処理に用いる酸としては、塩酸
、硫酸、リン酸等の無機酸類および、酢酸、シュウ酸等
の有機酸類などm Via’ J4Jいられるものがい
ずれも適用される。酸添加処理の方法は、原材料液のp
Hが6以下、好ましくは5.0〜5.5の範囲に収まる
ように、酸を加えてphのw1M整を行う。酸処理の温
度は好ましくは20℃以下、さらに好ましくは10℃以
下で実施した方がよい。pHの調整がすんだ後、析出沈
殿物を遠心分離しJ−4Bs抗原を含む上清液を得る。
、硫酸、リン酸等の無機酸類および、酢酸、シュウ酸等
の有機酸類などm Via’ J4Jいられるものがい
ずれも適用される。酸添加処理の方法は、原材料液のp
Hが6以下、好ましくは5.0〜5.5の範囲に収まる
ように、酸を加えてphのw1M整を行う。酸処理の温
度は好ましくは20℃以下、さらに好ましくは10℃以
下で実施した方がよい。pHの調整がすんだ後、析出沈
殿物を遠心分離しJ−4Bs抗原を含む上清液を得る。
つぎに必要であれば、硫安塩析による精製および譲縮の
操作を行う。酸添加処理によって得られたHBs抗原含
有上清液に、適当な濃度のアンモニア水を加え、上清液
のpHを6.0〜8.0の範囲に保ちなから硫安を7゛
つ≦加し、lBs抗原を沈殿さぜ、これを遠心分離にか
け上(θと分)llILする。得られた沈殿をイオン強
度が0.001〜1.0 程度である中性付近の適当な
緩衝液、例えは0.1 I’vi IJン酸緩mi液等
に溶解し、これを同緩衝液に透析してハイドロキシアパ
タイトによるクロマトグラフィーに付すサンプルとする
。
操作を行う。酸添加処理によって得られたHBs抗原含
有上清液に、適当な濃度のアンモニア水を加え、上清液
のpHを6.0〜8.0の範囲に保ちなから硫安を7゛
つ≦加し、lBs抗原を沈殿さぜ、これを遠心分離にか
け上(θと分)llILする。得られた沈殿をイオン強
度が0.001〜1.0 程度である中性付近の適当な
緩衝液、例えは0.1 I’vi IJン酸緩mi液等
に溶解し、これを同緩衝液に透析してハイドロキシアパ
タイトによるクロマトグラフィーに付すサンプルとする
。
硫安塩析を実施しない場合は、li貼抗原含有上清液に
アンモニア水を加えてp 1−iを70に=1整した後
、前目己と同様の緩衝液に透析あるいは希釈することに
よりクロマトグラフィー用サンプルとする。
アンモニア水を加えてp 1−iを70に=1整した後
、前目己と同様の緩衝液に透析あるいは希釈することに
よりクロマトグラフィー用サンプルとする。
本発明において用いるハイドロギンアパタイトとは、リ
ン酸カルシウムかその成分であるアフイニテイクロマト
グラフイー用ケルのことてあり、l−1ydroxya
patite (生化学工業社、ALB IOC[庄I
VI−BEHRII’C社)、14ydroxylap
atite(Bio −Rad社)の名称で市販されて
おり、これらのものを用いるとよい。このハイドロキシ
アパタイトを用いたアフイニテイクロマトグラフイーを
欠施するにあたっては次のような方法で行う。
ン酸カルシウムかその成分であるアフイニテイクロマト
グラフイー用ケルのことてあり、l−1ydroxya
patite (生化学工業社、ALB IOC[庄I
VI−BEHRII’C社)、14ydroxylap
atite(Bio −Rad社)の名称で市販されて
おり、これらのものを用いるとよい。このハイドロキシ
アパタイトを用いたアフイニテイクロマトグラフイーを
欠施するにあたっては次のような方法で行う。
ハイドロキンアパタイトへのl113s抗原の吸着は、
カラム法およびハツチ法の両方法か実施可能である。カ
ラム法の場合、ハイドロキシアパタイトを充填したカラ
ムに、クロマトグラフィー用ザンプル調整時に用いたと
同一の緩衝牧を通液して平衡化を行った後、サンプルを
通液し 1(J3s抗原を吸着させることにより、プロ
テアーゼ活性物質をはしめとする夾雑物質と分離する。
カラム法およびハツチ法の両方法か実施可能である。カ
ラム法の場合、ハイドロキシアパタイトを充填したカラ
ムに、クロマトグラフィー用ザンプル調整時に用いたと
同一の緩衝牧を通液して平衡化を行った後、サンプルを
通液し 1(J3s抗原を吸着させることにより、プロ
テアーゼ活性物質をはしめとする夾雑物質と分離する。
通液終了後、平衡化緩衝液を通液し、カラムを洗浄し、
夾雑物を洗い出す。
夾雑物を洗い出す。
またバッチ法の場合は、緩衝液にて平衡化したハイドロ
キシアパタイトを、サンプル液に添加し緩速度にて0.
5〜2時間程度攪拌して1113s抗原を吸着させる。
キシアパタイトを、サンプル液に添加し緩速度にて0.
5〜2時間程度攪拌して1113s抗原を吸着させる。
吸堝後、口過器上てハイドロキシアパタイトを口過し、
このゲルに平衡化緩衝液を加えて洗浄・口過分離を数回
繰り返す。
このゲルに平衡化緩衝液を加えて洗浄・口過分離を数回
繰り返す。
次に溶出操作は、吸着をハツチ法で実施した場合も、H
Bs抗原を吸着したハイドロキシアパタイトをカラムに
充填して、カラム法による溶出を実施した方かよい。
Bs抗原を吸着したハイドロキシアパタイトをカラムに
充填して、カラム法による溶出を実施した方かよい。
浴出は、イオン強度か01〜50杆度であり、かつ平衡
化緩衝液よりイオン強度か犬である中性付近の緩衝液を
用いて、段階1容出あるいは一度勾配溶出を実施し、成
層夾雑物質とl−In5抗原を分YIF溶出させ、HB
s抗原を含有するフラクションを分取する。かかる操作
により、きわめて有効にかつ高度にHB s抗原を精製
することかてきる。V一度勾配溶出は例えば、0.11
質−〇、51ν孟のリン酸緩衝液濃度勾配を用いてもよ
いし、0.1 M’ !Jン酸緩衝液・食塩添加0.1
M −1,OPVI履fl勾配を月」いてもよく、H
B s抗原と夾雑物質との分離良好な他の適当な013
度勾配緩衝液を用いてもよい。段階溶出の場合は、l′
iBs抗原と夾雑物質のとちらか一方のみが射出される
イオン強度の緩衝液を血液し、続いて他方かイオン強度
の大きい緩衝液を通液することにより、高度に精製され
たHBs抗原を含有するフラクションを分取する。
化緩衝液よりイオン強度か犬である中性付近の緩衝液を
用いて、段階1容出あるいは一度勾配溶出を実施し、成
層夾雑物質とl−In5抗原を分YIF溶出させ、HB
s抗原を含有するフラクションを分取する。かかる操作
により、きわめて有効にかつ高度にHB s抗原を精製
することかてきる。V一度勾配溶出は例えば、0.11
質−〇、51ν孟のリン酸緩衝液濃度勾配を用いてもよ
いし、0.1 M’ !Jン酸緩衝液・食塩添加0.1
M −1,OPVI履fl勾配を月」いてもよく、H
B s抗原と夾雑物質との分離良好な他の適当な013
度勾配緩衝液を用いてもよい。段階溶出の場合は、l′
iBs抗原と夾雑物質のとちらか一方のみが射出される
イオン強度の緩衝液を血液し、続いて他方かイオン強度
の大きい緩衝液を通液することにより、高度に精製され
たHBs抗原を含有するフラクションを分取する。
このようにして得られた1(Bs抗原を、次の工程とし
て、蔗糖ステップグラジェント超遠心または蔗糖リニア
グラジェント超遠心、および必要てあれは塩化センラム
を用いた沈降平衡超遠心またはリニアグラジェント超遠
心にかりることにより、はぼ完全に精製された)IBs
抗原を得ることができる。
て、蔗糖ステップグラジェント超遠心または蔗糖リニア
グラジェント超遠心、および必要てあれは塩化センラム
を用いた沈降平衡超遠心またはリニアグラジェント超遠
心にかりることにより、はぼ完全に精製された)IBs
抗原を得ることができる。
本発明の方法によれは、酸処理−ハイドロキシアパタイ
トクロマトグラフィーの組み合わせという、簡単でしか
も工業的に実施できる方法により、組換え体由来l−l
Bs抗原を、きわめて効率よく、かつ高純度に精製する
ことか可能である。
トクロマトグラフィーの組み合わせという、簡単でしか
も工業的に実施できる方法により、組換え体由来l−l
Bs抗原を、きわめて効率よく、かつ高純度に精製する
ことか可能である。
酸処理寥より、クロマトグラフィーの妨けとなる夾雑蛋
白質、脂質類等の大部分か沈殿として除去されるため、
ハイドロキシアパタイトケル1−当たりl m1以上の
[iBS抗原が吸Ziされ、これによりクロマトグラフ
ィーゲルの使用量、設備ともに小規模で済み非常に効率
的である。このハイドロキンアパタイトクロマトグラフ
ィーの工程において、比活性(f−iBs抗原量/含有
蛋白質J51 )は100〜150倍程度上昇し、著し
く精製効果が得られる。
白質、脂質類等の大部分か沈殿として除去されるため、
ハイドロキシアパタイトケル1−当たりl m1以上の
[iBS抗原が吸Ziされ、これによりクロマトグラフ
ィーゲルの使用量、設備ともに小規模で済み非常に効率
的である。このハイドロキンアパタイトクロマトグラフ
ィーの工程において、比活性(f−iBs抗原量/含有
蛋白質J51 )は100〜150倍程度上昇し、著し
く精製効果が得られる。
また酸処理−ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ーの工程で、原材料中に含まれる7”oテアーゼ活性物
質か完全に除去されるため、収率も高く、クロマトグラ
フィー終了まてのt113 s抗1tiの収率は50〜
60%というきわめて高い値に達する。このプロテアー
ゼ活性物質の存在は実際1113S抗原の安定性に係わ
る重要な問題であって、原材料液のflB s抗原粗抽
出液を4℃あるいは一20°Cて保存しても、わずか1
週間はどて、HBs抗原のほとんどが失活してしまうほ
どの悪影響を与える。
ーの工程で、原材料中に含まれる7”oテアーゼ活性物
質か完全に除去されるため、収率も高く、クロマトグラ
フィー終了まてのt113 s抗1tiの収率は50〜
60%というきわめて高い値に達する。このプロテアー
ゼ活性物質の存在は実際1113S抗原の安定性に係わ
る重要な問題であって、原材料液のflB s抗原粗抽
出液を4℃あるいは一20°Cて保存しても、わずか1
週間はどて、HBs抗原のほとんどが失活してしまうほ
どの悪影響を与える。
さらに精製の条件によっては、プロテアーゼ活i生が更
に強まり、わずかの時間で)(1\S抗原か失活してし
まうこともある。
に強まり、わずかの時間で)(1\S抗原か失活してし
まうこともある。
本発明者らは、ハイドロキシアパタイトに替えて、D
E A Eセルロース、DEAEファロース、CMセル
ロース、6Mセファロース、リン酸セルロース、ブルー
デキストランセファロース等のクロマトグラフィー用ゲ
ルを、種々条件を変えて、組敦え体由来HBs抗原の精
製に用いるべく試みたか、精製効果が全く期待されない
はかりか、HB s抗原の失活を主原因とする極端な低
収率のため、工業11′」な応用の用能性を見い出すこ
とはできなかった。
E A Eセルロース、DEAEファロース、CMセル
ロース、6Mセファロース、リン酸セルロース、ブルー
デキストランセファロース等のクロマトグラフィー用ゲ
ルを、種々条件を変えて、組敦え体由来HBs抗原の精
製に用いるべく試みたか、精製効果が全く期待されない
はかりか、HB s抗原の失活を主原因とする極端な低
収率のため、工業11′」な応用の用能性を見い出すこ
とはできなかった。
本発明の方法において、ハイドロギノアパタイトクロマ
トグラフイーによって得られたl−143s抗原を、蔗
糖グラ/エンド超遠心および塩化センウムクラジエント
超遠心により精製してえられた精製NBs抗原は、S
l) S−ポリアクリルアミドケル電気泳動分析におい
て、i4B s抗原の単一バンドを示し、きわめて高純
度のものである。
トグラフイーによって得られたl−143s抗原を、蔗
糖グラ/エンド超遠心および塩化センウムクラジエント
超遠心により精製してえられた精製NBs抗原は、S
l) S−ポリアクリルアミドケル電気泳動分析におい
て、i4B s抗原の単一バンドを示し、きわめて高純
度のものである。
つきに実施例を挙けて本発明をさらに具体的に説明する
。
。
実施例1
組換え酵母サツカロミセス・セレビシェA)(22/P
ASIOI (特11jl昭57−142460号を参
照)を培養後、遠心により果菌した画像線I Kグに、
o、IM IJン酸緩衝液(pH7,2)51を加え、
これを600〜700 K9/caの圧力で約7回マン
トン・コーリン破砕機にかけ菌体を破壊する。菌体破壊
物を遠心にかけ、粗大菌体破片を分に1[シて、NBs
抗原−&1.3μ9/ml [RIAキッI−Au5r
ia 11(アボット社)にて測定〕、蛋白質iJ[7
,8’2〜/171/(LOWry法にて測定)である
)II込抗原粗抽出液を得る。次いて、pHメーターで
チェックしつつ粗抽出液に酢酸(60%水浴液)を滴下
し、PIiを5.2に調整する。4℃で約30分間攪拌
した後、遠心により沈殿物を除去する。
ASIOI (特11jl昭57−142460号を参
照)を培養後、遠心により果菌した画像線I Kグに、
o、IM IJン酸緩衝液(pH7,2)51を加え、
これを600〜700 K9/caの圧力で約7回マン
トン・コーリン破砕機にかけ菌体を破壊する。菌体破壊
物を遠心にかけ、粗大菌体破片を分に1[シて、NBs
抗原−&1.3μ9/ml [RIAキッI−Au5r
ia 11(アボット社)にて測定〕、蛋白質iJ[7
,8’2〜/171/(LOWry法にて測定)である
)II込抗原粗抽出液を得る。次いて、pHメーターで
チェックしつつ粗抽出液に酢酸(60%水浴液)を滴下
し、PIiを5.2に調整する。4℃で約30分間攪拌
した後、遠心により沈殿物を除去する。
遠心上澄にアンモニア水を加えてPIiを約6.5に保
ぢつつ、最終謡度2,5Mとなるように硫安を徐々に加
える。約30分放置後遠心により口Bs抗原を含有する
沈殿を分離回収する。
ぢつつ、最終謡度2,5Mとなるように硫安を徐々に加
える。約30分放置後遠心により口Bs抗原を含有する
沈殿を分離回収する。
回収した沈殿を、0.1Mリン酸緩衝液(Yi47.2
)約300rnlに懸濁させ、透析チューブにて約10
0倍量の同緩衝液に対して透析する。
)約300rnlに懸濁させ、透析チューブにて約10
0倍量の同緩衝液に対して透析する。
透析後0.1 +vi リン酸緩衝液で約3倍に希釈し
、同緩衝液で平衡化しておいたハイドロキンアパタイト
カラム1(ゲル同約11)に通液り、 f4Bs抗原を
吸着させる。平衡化緩4txi液てカラムを充分に洗浄
した後、約41の0.1−0.5 M’713t’勾配
リン酸緩衝液を通液し溶出を行い、11]3S抗原を含
むフラクションを氷める。
、同緩衝液で平衡化しておいたハイドロキンアパタイト
カラム1(ゲル同約11)に通液り、 f4Bs抗原を
吸着させる。平衡化緩4txi液てカラムを充分に洗浄
した後、約41の0.1−0.5 M’713t’勾配
リン酸緩衝液を通液し溶出を行い、11]3S抗原を含
むフラクションを氷める。
次にBeckman SW −28用超遠心チユーブに
、50%蔗糖溶液、20%蔗糖溶液、 HBsBs抗原
フラクションれぞれ6 ml 、 17 ml 、 1
5 m1重層し、27.00Orpm、4℃て16時1
14」超遠心を行い、NBs抗原を2124’Jjj液
脂界而にθ畏縮・精製する。
、50%蔗糖溶液、20%蔗糖溶液、 HBsBs抗原
フラクションれぞれ6 ml 、 17 ml 、 1
5 m1重層し、27.00Orpm、4℃て16時1
14」超遠心を行い、NBs抗原を2124’Jjj液
脂界而にθ畏縮・精製する。
得られた精製l−In5抗原画分を0.11vll’B
S緩衝液に透析した後、塩化セシウムを1.2 &/m
l の一度となるように加えて、Bcckman 5W
−28で25、OClOrPm、10℃で60時間超遠
心しml縮・精製されたNBs抗原を得る。
S緩衝液に透析した後、塩化セシウムを1.2 &/m
l の一度となるように加えて、Bcckman 5W
−28で25、OClOrPm、10℃で60時間超遠
心しml縮・精製されたNBs抗原を得る。
各工程までのNBs抗原の回収率(対粗抽出液中11B
s抗原量)、及び精製度を表わす比活性値の比(対粗抽
出液)を第1表に示す。
s抗原量)、及び精製度を表わす比活性値の比(対粗抽
出液)を第1表に示す。
ハイドロキンアパタイトクロマト溶出画分の精製度は6
37倍に及び、本方法か極めて精製効果か高いことを示
している。
37倍に及び、本方法か極めて精製効果か高いことを示
している。
第1表
注) 1−iTP画分:ハイドロキンアパタイトクロマ
トグラフィー画分 なお、各工程のサンプルにつきプロテアーゼ活性をPr
otease 5ubstrate Gel 1’ab
lcts (Bi。
トグラフィー画分 なお、各工程のサンプルにつきプロテアーゼ活性をPr
otease 5ubstrate Gel 1’ab
lcts (Bi。
Rad社)をハ]いて測定した、その結果粗抽出液はト
リプシン含量約800μ97m1相当のプロテアーゼ活
性があったか、硫安塩析沈殿は間約50μI/−の活性
であり、ハイドロキンアパタイトクロマトグラフィー画
分は全く活性か存在しなかった。
リプシン含量約800μ97m1相当のプロテアーゼ活
性があったか、硫安塩析沈殿は間約50μI/−の活性
であり、ハイドロキンアパタイトクロマトグラフィー画
分は全く活性か存在しなかった。
実施例2
組換、j n filサツカロミセス・セレヒソエ甜2
2/1’A112Q3 (特願昭57−14246(J
号を参照)を培養後、遠心により釆菌した菌1イ、(1
00g)に、0.1 M酸緩衝液(pH7,2)5uu
−を加え、これを約90分間、I U ’C以下にて超
音波処理にかけ菌シI・を破壊する。
2/1’A112Q3 (特願昭57−14246(J
号を参照)を培養後、遠心により釆菌した菌1イ、(1
00g)に、0.1 M酸緩衝液(pH7,2)5uu
−を加え、これを約90分間、I U ’C以下にて超
音波処理にかけ菌シI・を破壊する。
遠心により菌体(ll)片を除き粗抽出液を得る。次い
て、I)HメーターでpHをチェックしながらこの粗抽
出液に塩酸を滴下しpHを約5.2に1JrlJ整する
。4℃で約30分間攪拌した後、遠心により沈殿物を除
去する。遠心上清にアンモニア水を加えテpHを約7.
uとした後、0.1Mリン酸緩独」l夜(pH7,2)
で3〜5倍に希釈する。次いて、同じ緩衝液で平衡化し
ておいたハイドロキシアパタイトカラムに超液し、1−
IBs抗原を吸着さぜる。ifl衡化緩衝液て充分に洗
浄した後、約3UL1mlの0.2へ4リン酸緩衝液(
pH7,2)を前液して吸着している夾雑物を溶出する
。次に約 300m1の0.5 M ’Jン酸緩衝液(
pH7,2)を通液し、HBs抗原を含む画分を回収す
る。
て、I)HメーターでpHをチェックしながらこの粗抽
出液に塩酸を滴下しpHを約5.2に1JrlJ整する
。4℃で約30分間攪拌した後、遠心により沈殿物を除
去する。遠心上清にアンモニア水を加えテpHを約7.
uとした後、0.1Mリン酸緩独」l夜(pH7,2)
で3〜5倍に希釈する。次いて、同じ緩衝液で平衡化し
ておいたハイドロキシアパタイトカラムに超液し、1−
IBs抗原を吸着さぜる。ifl衡化緩衝液て充分に洗
浄した後、約3UL1mlの0.2へ4リン酸緩衝液(
pH7,2)を前液して吸着している夾雑物を溶出する
。次に約 300m1の0.5 M ’Jン酸緩衝液(
pH7,2)を通液し、HBs抗原を含む画分を回収す
る。
以下実施例1と同様にして、蔗糖超遠心およびCsCl
超咲心を実施し、精製1−fBs抗原を得る。
超咲心を実施し、精製1−fBs抗原を得る。
各工程までのHBs抗原の回収率、精製度を第2表に示
す。
す。
実施例1における、蔗糖超遠心画分および実施例2のC
sC1超遠心画分の各ザンプルを、S■)S−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動分析にかけたところ、いずれも
団り抗原の構成サブユニット蛋白質である分子量約24
,000 の単一ハンドを示し、きわめて高純度なもの
であった。
sC1超遠心画分の各ザンプルを、S■)S−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動分析にかけたところ、いずれも
団り抗原の構成サブユニット蛋白質である分子量約24
,000 の単一ハンドを示し、きわめて高純度なもの
であった。
特許出願人 財団法人化学及血清療法m[究所代理人弁
理士青山 葆ほか1名 手続補正書(し恨〕 ] 事件の表示 昭和58年特許願第 186187 号2発明の名称 11Bs抗原のii’j製方法 3補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 熊不県熊木市清水町太窪668番地名称 財団法
人化学及血清療法4i1F究所4代理人 手続補正書(l牧) 昭和59年5 月 91」 チ 特許庁長官 殿 1事件の表示 昭和58年特許願第 186187 号2発明の名称 ■旧3S抗原の精製方法 3補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 熊本県熊本市清水町大窪668番地名称 1し団
法人化学及血清療法研究ノッr4代理人 5補正命令の日付 自発 7 補正の内容 明細よ(昭和59イト2月91−1イ・]f′−鯖袖I
Iよにで提出のもの)の下記箇所を補ji−Uる。
理士青山 葆ほか1名 手続補正書(し恨〕 ] 事件の表示 昭和58年特許願第 186187 号2発明の名称 11Bs抗原のii’j製方法 3補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 熊不県熊木市清水町太窪668番地名称 財団法
人化学及血清療法4i1F究所4代理人 手続補正書(l牧) 昭和59年5 月 91」 チ 特許庁長官 殿 1事件の表示 昭和58年特許願第 186187 号2発明の名称 ■旧3S抗原の精製方法 3補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 熊本県熊本市清水町大窪668番地名称 1し団
法人化学及血清療法研究ノッr4代理人 5補正命令の日付 自発 7 補正の内容 明細よ(昭和59イト2月91−1イ・]f′−鯖袖I
Iよにで提出のもの)の下記箇所を補ji−Uる。
(1ン第?は20行:(−1卒酋′tの1を[J)1′
茅、1の1と補jF。
茅、1の1と補jF。
(2)第5頁1′1行:[絹19λ1を[911換え体
」と補正1゜ (,3) Wj6頁8?+ : N−113s抗16j
’Cr右l ノil’+とに「材料」を挿入。
」と補正1゜ (,3) Wj6頁8?+ : N−113s抗16j
’Cr右l ノil’+とに「材料」を挿入。
(7′I)第7Eri I II tiiL3.J:U
1 !’ii’i : r絹み換工1)N△」および
「組み換え(41」をされそれ[組換え1) N A
Jおよび「l1fJ換え1本」どン山1■−6(5)第
8v(8イーT : [7、/ イーーtイー 1を1
アフイニiイ」と補IF0 ((3)第8い1G行:「であく:)1、」のあとにつ
き゛の文ト;を挿入。
1 !’ii’i : r絹み換工1)N△」および
「組み換え(41」をされそれ[組換え1) N A
Jおよび「l1fJ換え1本」どン山1■−6(5)第
8v(8イーT : [7、/ イーーtイー 1を1
アフイニiイ」と補IF0 ((3)第8い1G行:「であく:)1、」のあとにつ
き゛の文ト;を挿入。
「該組換えイホ山来l−l B s抗1京(よ、粗挽え
I)NΔ技術を用いて、B型肝炎ウィルスのDNAから
取出されたl−I B s抗原をコー1−りる逍仏了を
・大腸菌、酵1′81.!!IJ物培養細胞などに尋人
し、形質転換さけ、HB S IA原原遺吊子1すjが
ぜてl−1+3 S抗B:ミを1111さけることによ
り11ノら1+るもの(あ−)て、Jl)らの方法はづ
てに公5.aである。(91jえ(」、相換え酵し]由
来のHE’r s )A原のq二成法としく(3L、ハ
レンス[)の方法[V alenzuela、N at
ure、 2 !1 P+ 、 347<1982)、
待聞昭58−7°7823F3 ’、i 、 −?:之
Iikらのbi人[P roc、 N at l 、△
c;+d Soi 、 、 IJ s△、化工、1 (
1983) 、’l’+191111it、’)7−1
424(io号1、ヒララマンらのyj法[il ニア
enlall。
I)NΔ技術を用いて、B型肝炎ウィルスのDNAから
取出されたl−I B s抗原をコー1−りる逍仏了を
・大腸菌、酵1′81.!!IJ物培養細胞などに尋人
し、形質転換さけ、HB S IA原原遺吊子1すjが
ぜてl−1+3 S抗B:ミを1111さけることによ
り11ノら1+るもの(あ−)て、Jl)らの方法はづ
てに公5.aである。(91jえ(」、相換え酵し]由
来のHE’r s )A原のq二成法としく(3L、ハ
レンス[)の方法[V alenzuela、N at
ure、 2 !1 P+ 、 347<1982)、
待聞昭58−7°7823F3 ’、i 、 −?:之
Iikらのbi人[P roc、 N at l 、△
c;+d Soi 、 、 IJ s△、化工、1 (
1983) 、’l’+191111it、’)7−1
424(io号1、ヒララマンらのyj法[il ニア
enlall。
N uclcic A cids Ros(!(+rc
l+、↓二しN−))、2745(1983)、特開1
1858−109/l 27シ〕1など、組換え動物細
胞由来の11]3δ抗1東(h/1八にン人とじC1野
萌らの方法I u: 30回[−1本ウィルスを会総会
、演説抄録11106ε) (1982) 、 ls+
願昭57 14 b O92Lj ] /丁どの1.1
か、i′+ IFI 1li158−56685号、特
開昭58−0りJl)シ′Jdi 、J、ひ9Jj間昭
57−3978/I昼41とに1並載のツノ()、が挙
げられる。」 (7)第12員1/1行;I’(I!!/jが」のあと
に、「)8出される。」を挿入。
l+、↓二しN−))、2745(1983)、特開1
1858−109/l 27シ〕1など、組換え動物細
胞由来の11]3δ抗1東(h/1八にン人とじC1野
萌らの方法I u: 30回[−1本ウィルスを会総会
、演説抄録11106ε) (1982) 、 ls+
願昭57 14 b O92Lj ] /丁どの1.1
か、i′+ IFI 1li158−56685号、特
開昭58−0りJl)シ′Jdi 、J、ひ9Jj間昭
57−3978/I昼41とに1並載のツノ()、が挙
げられる。」 (7)第12員1/1行;I’(I!!/jが」のあと
に、「)8出される。」を挿入。
(8)第13貞18?j:M’;L・(1のあとに1良
θ141]を挿入。
θ141]を挿入。
(1))第一11j’N7行、I−絹変;4:組換Jと
袖1−8 Lスに 手続補正書(1啄) 昭和59年10月15]」 昭和58年特許願第 186187 号2発明の名称 1−I B s抗原の精製方法 3補正をする者 事件との関係 特許出願人 注所 熊本県熊本市清水町人窪668番地名称 財団法
人化学及血清療′別研究所4代理人 7補正の自答 (Il明薊書(IE和59年2月91」イー1−T続ソ
111正書にて提出のもの)の発明の詳細な説明の根・
1中、下記箇所を補正する。
袖1−8 Lスに 手続補正書(1啄) 昭和59年10月15]」 昭和58年特許願第 186187 号2発明の名称 1−I B s抗原の精製方法 3補正をする者 事件との関係 特許出願人 注所 熊本県熊本市清水町人窪668番地名称 財団法
人化学及血清療′別研究所4代理人 7補正の自答 (Il明薊書(IE和59年2月91」イー1−T続ソ
111正書にて提出のもの)の発明の詳細な説明の根・
1中、下記箇所を補正する。
(1)第10頁15行、「AL13IOCI II弘4
.jト、9ルe[CALBIOQ−IEM、 j と補
正。
.jト、9ルe[CALBIOQ−IEM、 j と補
正。
(2)第11頁5行「調整時」とあるを「調製時」と補
正。
正。
(3)第14頁14イ1、「フ111−ス」とあるを「
セフマロース」と補正。
セフマロース」と補正。
(4)第1,8頁下から8行、「(13ioj とある
をrtBio−」と補正。
をrtBio−」と補正。
(5)第19頁3行、「01Δ1酸」とあるを「01Δ
1リン酸」と補正。
1リン酸」と補正。
以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (ll HBs抗原を精製するにあたり、HB @抗原
原材料を酸添加処理し、つぎに硫安塩析を行うかまたは
行わないで、続いてハイドロキシアパタイトゲル・アフ
ィニティクロマトグラフィーを行うことを特徴とするH
Bg抗原の精製方法。 +21 )Ins抗原が、組換えDNA手法により形質
転換されHBs抗原産生能を付与された組換え体によっ
て発現生成されたものである前記第(1)項記載の方法
。 13) HBs抗原原材料が、組換え体細胞を超音波破
砕、グラスビーズ破砕、マントン・ゴーりン破砕、ある
いは界面活性剤処理等に、より破壊して得られるHBs
抗原粗抽出物である前記第(1)項記載の方法。 (4) 酸添加処理が、HBs抗原原材料に酸を加えて
夾雑蛋白質、および脂質を沈殿として分離することであ
る前記第(1)項、liじ載の方法。 (5)酸添加処理に用いる酸が、塩酸、硫酸、燐酸、酢
酸、シュウ酸の中から選ばれる少くとも1種である前記
第(1)項および第(4)項占己載の方法。 (6)ハイドロキシアパタイトゲル・アフイニテイクロ
マトグラフイーにおいて段階溶出または一度勾配溶出を
行う前記第(1)項記載の方法。 (7) HBs抗原原材料を酸添加処理し、つぎに硫安
塩析を行うかまたは行わないで、続いてハイドロキシア
パタイトゲル・アフイニテイクロマトグラフイーを行い
、プロテアーゼ活性物質を完全に除去したHBs抗原を
得る前&じ第(1)項記載の方法。 (8)組換え体が、組換え大腸菌または組換え酵母菌で
ある前記第(2)項記載の方法。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58186187A JPS6078999A (ja) | 1983-10-05 | 1983-10-05 | HBs抗原の精製方法 |
US06/656,315 US4612283A (en) | 1983-10-05 | 1984-10-01 | Method for purification of HBs antigen |
DE8484111917T DE3468623D1 (en) | 1983-10-05 | 1984-10-04 | Method for purification of hbs antigen |
EP84111917A EP0138167B1 (en) | 1983-10-05 | 1984-10-04 | Method for purification of hbs antigen |
KR1019840006164A KR910008643B1 (ko) | 1983-10-05 | 1984-10-05 | B형 간염 비루스 표면항원(HBs 항원)의 정제 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58186187A JPS6078999A (ja) | 1983-10-05 | 1983-10-05 | HBs抗原の精製方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6078999A true JPS6078999A (ja) | 1985-05-04 |
JPH051280B2 JPH051280B2 (ja) | 1993-01-07 |
Family
ID=16183908
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58186187A Granted JPS6078999A (ja) | 1983-10-05 | 1983-10-05 | HBs抗原の精製方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4612283A (ja) |
EP (1) | EP0138167B1 (ja) |
JP (1) | JPS6078999A (ja) |
KR (1) | KR910008643B1 (ja) |
DE (1) | DE3468623D1 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01228492A (ja) * | 1988-03-09 | 1989-09-12 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | エリスロポエチンの製造方法 |
JPH0665206U (ja) * | 1993-02-18 | 1994-09-13 | 株式会社トスカ | 動力式係止片取付機 |
KR20160063984A (ko) | 2014-11-27 | 2016-06-07 | 제이엔씨 주식회사 | 아미노기를 포함하는 이온 교환기와 부틸기를 포함하는 소수성기를 가지는 다공성 셀룰로오스 입자 및 그것을 포함하는 크로마토그래피 담체 및 b형 간염 바이러스의 바이러스 유사 입자의 정제 방법 |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE8402861L (sv) * | 1984-05-28 | 1985-11-29 | Stefan Svenson | Rening av biologiskt material |
JPS61103895A (ja) * | 1984-10-26 | 1986-05-22 | Green Cross Corp:The | HBsAgの精製方法 |
CA1268437A (en) * | 1984-12-21 | 1990-05-01 | Haruo Fujita | Method for purification of hbc antigen and method for measurement of hbc antibody by using said purified hbc antigen |
US5026828A (en) * | 1987-02-27 | 1991-06-25 | Merck & Co., Inc. | Method of purifying recombinant pres-1/S-2/S/S hepatitis B antigen from yeast |
US5004688A (en) * | 1988-04-15 | 1991-04-02 | Phillips Petroleum Company | Purification of hepatitis proteins |
KR0148119B1 (ko) * | 1989-02-07 | 1998-08-17 | 심 파쓰 | B형 간염백신의 제조방법 및 정제법 |
US5474900A (en) * | 1990-03-16 | 1995-12-12 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Process for preparing purified syphilis antigen from Treponema palljdum |
JPH0743385B2 (ja) * | 1990-03-16 | 1995-05-15 | 積水化学工業株式会社 | 梅毒抗原の製造法 |
CN1063343C (zh) * | 1993-04-27 | 2001-03-21 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 氨端带前表面抗原决定簇的乙型肝炎表面抗原蛋白 |
PT1105466E (pt) | 1998-08-14 | 2006-07-31 | Merck & Co Inc | Processo para a purificacao de particulas tipo virus do papilomavirus humano |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IE52036B1 (en) * | 1979-05-24 | 1987-05-27 | Univ California | Non-passageable viruses |
US4301250A (en) * | 1979-11-02 | 1981-11-17 | Merck & Co., Inc. | Method of producing hepatitis B surface antigen |
EP0062574A3 (en) * | 1981-03-31 | 1982-12-29 | The Regents Of The University Of California | Virus protein synthesis |
GB2102006B (en) * | 1981-06-16 | 1984-11-28 | Takeda Chemical Industries Ltd | Deoxyribonucleic acids, their production and use |
GR76274B (ja) * | 1981-08-04 | 1984-08-04 | Univ California | |
ZW18282A1 (en) * | 1981-08-31 | 1983-03-23 | Genentech Inc | Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture |
NZ201705A (en) * | 1981-08-31 | 1986-03-14 | Genentech Inc | Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast |
US4442205A (en) * | 1981-09-22 | 1984-04-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Simian virus recombinant that directs the synthesis of hepatitis B surface antigen |
US4515714A (en) * | 1983-03-09 | 1985-05-07 | Juridicial Foundation, The Chemo-Semo-Sero-Therapeutic Research Institute | Method for purification of hepatitis B virus surface antigen |
-
1983
- 1983-10-05 JP JP58186187A patent/JPS6078999A/ja active Granted
-
1984
- 1984-10-01 US US06/656,315 patent/US4612283A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-10-04 DE DE8484111917T patent/DE3468623D1/de not_active Expired
- 1984-10-04 EP EP84111917A patent/EP0138167B1/en not_active Expired
- 1984-10-05 KR KR1019840006164A patent/KR910008643B1/ko not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01228492A (ja) * | 1988-03-09 | 1989-09-12 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | エリスロポエチンの製造方法 |
JPH0665206U (ja) * | 1993-02-18 | 1994-09-13 | 株式会社トスカ | 動力式係止片取付機 |
KR20160063984A (ko) | 2014-11-27 | 2016-06-07 | 제이엔씨 주식회사 | 아미노기를 포함하는 이온 교환기와 부틸기를 포함하는 소수성기를 가지는 다공성 셀룰로오스 입자 및 그것을 포함하는 크로마토그래피 담체 및 b형 간염 바이러스의 바이러스 유사 입자의 정제 방법 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE3468623D1 (en) | 1988-02-18 |
US4612283A (en) | 1986-09-16 |
KR910008643B1 (ko) | 1991-10-19 |
KR850003166A (ko) | 1985-06-13 |
EP0138167B1 (en) | 1988-01-13 |
EP0138167A1 (en) | 1985-04-24 |
JPH051280B2 (ja) | 1993-01-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4857317A (en) | Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them | |
JP2721699B2 (ja) | 肝炎蛋白質の精製 | |
JPH0439445B2 (ja) | ||
KR890000165B1 (ko) | 혈장분획을 열처리하는 방법 | |
US4649192A (en) | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate | |
JPS6078999A (ja) | HBs抗原の精製方法 | |
IE48639B1 (en) | Method for isolation of hbs ag | |
JPH06321994A (ja) | アンチトロンビン調製物およびその調製方法 | |
JPS60197629A (ja) | HBs抗原の精製方法 | |
US4565697A (en) | Process for producing a hepatitis B infection preventing vaccine | |
JPS62181220A (ja) | 冷沈澱により抗血友病因子を製造し且つ得られる抗血友病因子製品の溶解度を改善するための方法 | |
RU2122430C1 (ru) | Способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита b, содержащего пре s2 пептид, из рекомбинантных клеток дрожжей, вакцина для иммунизации против гепатита b | |
WO1981000050A1 (en) | Process for producing hepatitis b vaccine | |
EP0005864A1 (en) | Antigenic composition useful as a vaccine or vaccine intermediate, and process for preparing same | |
KR100194247B1 (ko) | 재조합 b형 간염 표면 항원의 정제방법 | |
JPS61103895A (ja) | HBsAgの精製方法 | |
KR0159716B1 (ko) | B형 간염 표면 항원의 정제방법 | |
JPH0574599B2 (ja) | ||
JPS60258127A (ja) | B型肝炎ワクチンの製造方法 | |
KR100307186B1 (ko) | 한국형씨(c)형간염바이러스의항원결정부위융합단백질인유비엔에스40i12-ii(ubns4e12-ii)의정제방법 |