CN1354787A - 纯化人***瘤病毒样颗粒的方法 - Google Patents
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Abstract
纯化***瘤病毒样颗粒(VLP)的方法包括将含部分纯化的VLP溶液通过羟磷灰石层析柱的步骤。然后用含磷酸阴离子的缓冲液洗脱VLP。本方法的优点在于回收得到高产量的完整VLP。
Description
发明领域
本发明涉及制备和纯化***瘤病毒(HPV)样颗粒(VLP)的方法,该病毒样颗粒可用作疫苗成分。
发明背景
***瘤病毒感染见于多种动物,包括人类、绵羊、狗、猫、兔、猴、蛇以及母牛。***瘤病毒感染上皮细胞,通常在感染部位引起良性上皮或纤维上皮瘤。***瘤病毒是种特异性的传染因子;人***瘤病毒不能感染人类以外的动物。
***瘤病毒可以根据它们所感染的宿主而分类为不同种群。人***瘤病毒(HPV)根据DNA序列同源性进一步分为70多个型(综述,参见***瘤病毒与人类癌症,H.Pfister(编辑),CRC Press,Inc.,1990)。***瘤病毒各型可能是型特异性免疫原,因为一种类型的***瘤病毒感染的中和免疫不能免疫另一种类型的***瘤病毒。
***瘤病毒是无包膜二十面体小(50-60nm)DNA病毒,它编码最多达8个早期基因和2个晚期基因。该病毒基因组可读框(ORF)称为E1-E7以及L1和L2,其中“E”表示早期基因而“L”表示晚期基因。L1和L2编码病毒衣壳蛋白。早期基因(E)与其功能有关,如与病毒的复制以及细胞转化有关。
L1蛋白是主要衣壳蛋白,分子量为55-60kDa。L2蛋白是次要衣壳蛋白,按聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,其预期分子量为55-60kDa,表观分子量为75-100kDa。免疫学资料提示大部分L2蛋白在L1蛋白内侧。L2蛋白在不同***瘤病毒之间是高度保守的,特别是C-末端的10个碱性氨基酸。L1可读框在不同***瘤病毒之间是高度保守的。
已用各种宿主制备重组L1蛋白,而且在适当的条件下重组L1蛋白单独或与L2蛋白一起自我组装成病毒样颗粒(VLP)。VLP可作为商业疫苗的候选者。然而,为了用作人类疫苗,VLP必须是高度纯化的而且不含宿主细胞污染物。过去应用渗滤方式中的交叉流超滤去除污染的生物分子。但是,这种方法导致HPV L1的蛋白水解降解。因此需要一种可以获得高纯度、无降解产品的L1蛋白纯化方法。
发明概述
本发明涉及纯化重组***瘤病毒(HPV)样颗粒(VLP)的方法,该方法包括以下步骤:在VLP可与羟磷灰石介质结合的条件下,将部分纯化的含VLP的细胞溶解物与层析柱中的羟磷灰石介质接触,;用含磷酸根阴离子的溶液洗脱结合VLP;回收洗脱的VLP。
该纯化方法可用于基本上由L1蛋白组成的VLP,也可用于包含L1和L2蛋白的VLP。除此之外,还可用于嵌合型VLP,嵌合型VLP包含L1蛋白和L2:融合蛋白。通常优选仅含L1蛋白的VLP用于疫苗。
该方法事实上适用于任何***瘤病毒株VLP。但是优选用于人***瘤病毒(HPV)。优选HPV株是已知能引起多种严重疾病和病症的HPV株,包括:6a型HPV、6b型HPV、11型HPV、16型HPV、18型HPV、31型HPV、33型HPV以及45型HPV。
一般来说,用编码L1或L1和L2蛋白、或L1和L2:融合蛋白的载体转化宿主细胞。
在整个说明书和权利要求书使用的术语“L2:融合蛋白”意指编码L2蛋白的DNA与另一个编码所需蛋白的DNA有效连接在一起,而且另一种所需蛋白最好为HPV蛋白质如E1、E2、E3、E4、E5、E6或E7。该融合蛋白的L2部分可以是完整长度,或可以具有缺失和/或截断。可在同时申请的同时待审的美国临时专利申请S.N.60/096,638(Attorney Docket Number 20276PV,通过引用结合到本文中)中找到实例。
宿主细胞可以是本领域已知的任何容易培养的宿主细胞,包括酵母(啤酒酵母)、昆虫细胞、细菌或哺乳动物细胞。特别优选酵母细胞。
所述载体也可以包含本领域已知的其它元件,如转录和翻译控制元件和/或标记基因。表达的L1、L1和L2、或L1和L2:融合蛋白自动组装成VLP。常规溶解宿主细胞,然后部分纯化细胞溶解物。
部分纯化步骤可以包括常规使用的纯化步骤,在本发明中却不是关键步骤。例如,可将细胞溶解物进行微滤程序,并且至少进行一个层析步骤如阳离子-交换层析。
依照本发明发现,层析步骤从部分纯化的细胞溶物中去除大量污染物,所述层析步骤是:应用羟磷灰石作为柱子的介质,然后用含磷酸根阴离子的溶液洗脱。准确地说,发现大部分污染的生物分子(包括DNA、脂类和蛋白质)已从溶胞产物中去除。
依照本发明,按SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,最终纯化的VLP制品一般至少为75%纯度,优选为至少80%纯度,更好优选为至少90%纯度。
事实上,本发明可使用任何市售羟磷灰石柱子填料。最好使用粒子大小约为20-50μm且孔径约为800的陶瓷羟磷灰石。BioRad所售的“II型陶瓷羟磷灰石”就是这样一种市售羟磷灰石。然而,同样可用其它羟磷灰石。
在准备纯化程序的层析步骤中,建议使用pH6-8、最好约7的缓冲液对柱子进样。优选缓冲液是50mM MOPS[3-(N-吗啉代)丙烷磺酸],pH7.0且含有1.25M NaCl。
也可使用本领域技术人员熟知的的其它缓冲***,包括:MES[2-(N-吗啉代)乙烷磺酸];BIS-TRIS[二-(2-羟乙基)-氨基]三-(羟甲基)甲烷];ADA[N-2-乙酰氨基亚氨基二乙酸,一钠盐];ACES[N-2-乙酰氨基-2-氨基乙烷磺酸];PIPES[哌嗪-N,N′-二-(2-乙烷-磺酸)];MOPSO[(3-N-吗啉代)-2-羟基丙烷-磺酸];BIS-TRIS PROPANE[1,3-二[三(羟甲基)甲基-氨基]丙烷];BES[N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基-乙烷磺酸];TES[N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷-磺酸和2-2([2-羟基-1,1-二(羟甲基)乙基)氨基]乙烷磺酸];HEPES[N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙烷-磺酸];DIPSO[3-(N,N-二(2-羟乙基)氨基)-2-羟基-丙烷磺酸)];TAPSO[3-N-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基-丙烷磺酸];TRIS[三-(羟甲基)-氨基甲烷];HEPPSO[N-(2-羟乙基)-哌嗪-N′-(2-羟基-丙烷磺酸)];POPSO[(哌嗪-N,N′-二[2-羟基丙烷磺酸)];EPPS[N-[2-羟乙基]-哌嗪-N′-[3-丙烷磺酸和HEPPS];TEA[三乙醇胺];TRICINE[N[三-(羟甲基)甲基]甘氨酸];BICINE[N,N-二-(2-羟乙基)-甘氨酸];TAPS[3-{[三-(羟甲基)甲基]氨基}-丙烷磺酸];咪唑;HEPPS[N-2-羟乙基哌嗪-N′-3-丙烷-磺酸];甘氨酰胺;盐酸盐;双甘氨肽;枸橼酸盐;乙酸盐;以及琥珀酸盐缓冲液。
在VLP可以与羟磷灰石结合的条件下,使在缓冲液中的部分纯化的VLP与羟磷灰石介质接触。这些条件包括温度范围宽;优选室温。流速可以大幅度地变化,优选范围大约是90厘米/小时。
在VLP与羟磷灰石结合后,下一步是用洗脱缓冲液从羟磷灰石上回收纯化的VLP。优选的洗脱缓冲液包含磷酸根阴离子,如磷酸钠或磷酸钾溶液。优选的摩尔浓度范围是从大约0.05M到1M,大约0.2M最佳。洗脱缓冲液的pH范围大约pH6-8,优选pH约7。
本发明方法的其它优点包括:
(a)无需特殊的层析装置和技术;(b)本方法快速,无需更换缓冲液;以及(c)本方法提供高产量的HPV L1。
提供下列非限制性实例更好地阐明本发明。实施例
实施例1
部分纯化溶胞产物的制备
收获转化表达VLP的酵母细胞并冷冻保存于-70℃。取出冷冻保存的酵母细胞悬浮液,在室温下解冻大约3小时,跟着在4℃解冻大约18个小时。将BENZONASE(Nycomed Pharma A/S,Copenhagen,Denmark)(2.8×105单位/毫升,0.21毫克蛋白/毫升)加入细胞悬浮液至最终浓度为每克细胞湿重750单位,在一个实验中减少至每克细胞湿重335单位。搅拌细胞15分钟,然后两次经过洁净APV Gaulin 30CD匀浆器在14,500至16,000磅的操作压力下破碎细胞,使95%细胞破碎。剩余溶胞产物在4℃下轻轻搅拌18个小时。
微滤澄清 如下通过渗滤方式中的交叉流微滤澄清细胞溶胞产物。将溶胞产物转移至一个带有一英寸直径的进口和出口的无菌操作槽(process tank)中。微滤器是置于A/G TechnologiesFlexStandBenchtop Pilot中空纤维***中的5平方英尺表面积、0.65微米孔径大小的中空纤维滤管。滞留物用3个体积的渗滤缓冲液(见下文)渗滤产生澄清的溶胞产物。渗滤缓冲液是0.2M(Na+)MOPS,pH7.0+0.4M NaCl。
澄清溶胞产物的层析 应用POROS50 HS强阳离子-交换层析树脂(PerSeptive Biosystems,Framingham,MA)填充层析柱,经柱层析分级分离澄清溶胞产物。该柱在使用前用0.5N NaOH清洁消毒。在室温下用HPV渗滤缓冲液[0.2M(Na+)MOPS,pH7.0+0.4M NaCl]平衡层析柱。将冷的(4℃)澄清的溶胞产物以125毫升/分钟的速度泵上柱,用8个柱体积HPV室温柱缓冲液A[0.05M(Na+)MOPS,pH7.0+0.5M NaCl]以125毫升/分钟、100%HPV柱缓冲液A到100%HPV柱缓冲液B[0.05M(Na+)MOPS,pH7.0+1.5M NaCl]的线性梯度洗脱层析柱。总的线性梯度是10个柱体积,收集10个等体积的流分。梯度洗脱后,用2个柱体积室温HPV柱缓冲液B以125毫升/分钟冲洗柱,收集2份额外流分。用2升无菌塑料瓶收集各流分,并将其贮藏在4℃下。将在梯度中包含最后紫外吸收峰(A280nm和A230nm)的各流分合并,用MILLIPAK-200一次性过滤器(Millipore,Bedford,MA)过滤并保存在4℃下。
实施例2
羟磷灰石层析
所有步骤均在室温下进行。用II型陶瓷羟磷灰石(BioRadCat.#7320081,Hercules,CA)填充层析柱(13mm ID×36mm)后,将其在50mM MOPS,pH7.0+1.25M NaCl中预平衡。将实施例1的部分纯化HPV溶液以90厘米/小时的线性流速上柱。上样完成后用8个柱体积预平衡缓冲液冲洗柱子直至柱子流出物的光密度值接近零为止。HPV疫苗产物用0%到100%线性梯度洗脱缓冲液(0.2M磷酸钠,pH7.0+1.25M NaCl)洗脱,同样为90厘米/小时线性流速。梯度的总体积是4个柱体积。通过放射免疫测定和Bradford蛋白测定来鉴定含有疫苗产物的流分。疫苗产物的的蛋白浓度是100μg/mL。
分析:用牛血清白蛋白(BSA)作为标准品,采用Coomassie PlusAssay Reagent(Pierce,Rockford,IL)进行Bradford蛋白测定。用BSA作为校准标准品根据Lowry等1951 J.Biol.Chem.193:265-270的方法进行Lowry蛋白质测定。用识别VLP构象表位的单克隆抗体通过多层酶联免疫吸附反应来测定抗原。用多克隆山羊抗HPV VLP抗体包被微量滴定板。标准品和测试样品用1%(w/v)BSA、0.1%TWEEN-20和0.1%叠氮化钠的PBS稀释并且加入各孔中,在各孔中由结合在微量滴板上的抗体捕获抗原。将抗-HPV L1 VLP单克隆抗体(Chemicon,Temecula,CA)加入到各孔中,以结合包被板抗体捕获的抗原。用结合辣根过氧化物酶的抗小鼠IgG抗体检测抗-HPV VLP单克隆抗体。加入辣根过氧化物酶的显色底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(Pierce),在450nm处的吸光度与样品中的L1 VLP浓度成正比。
用于疫苗产物的柱动态容量(dynamic capacity)按Bradford测定是每毫升树脂2.9毫克,按放射免疫测定是每毫升树脂4.6毫克。当柱以100%装载容量填充时,通过这一步骤的回收率用Bradford蛋白测定是90%,而按放射免疫测定是82%。当柱子以8%装载容量填充时,按Bradford测定的回收率下降至63%,而以放射免疫测定下降至50%。
实施例3
其它生物分子的去除
用基于PCR的检测方法测定在基本上按实施例1和2所述制备的HPV 11 L1样品中存在的DNA量。列于下表的结果表明,这一层析方法能高效去除最终产品中的杂质DNA。
样品 | 蛋白质(μg/mL) | DNA(pg/mL) | DNA/蛋白质比率(pg/μg) |
柱子装载量 | 107 | 3270 | 30.6 |
直流物(flowthrough)(流分#6) | <10 | 196 | >19.6 |
洗出液(流分#20) | 230 | <2.6 | <0.011 |
实施例4
嵌合型VLP的纯化
16型HPV L1/L2mini/E2嵌合型VLP的纯化L2修饰基因的构建YP3载体(基本型L2)
这一载体保有HPV16 L2的氨基末端69个氨基酸和羧基-末端84个氨基酸(aa)的编码序列,它通过合成多接头按读框融合,引入一个NotI,SacI以及XhoI限制酶切位点,导致***一个谷氨酸残基和一个丝氨酸残基突变为谷氨酸的。
设计PCR引物(Midland Certified Reagents)从pGal110 HPV16 L1+L2载体包含的原L2基因扩增L2序列。
引物I(5′-CTT CCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGC-3′;SEQ.ID.NO.1)和C(5′-CTC GAG CTC GCG GCC GCC TGT ACC CGACCC-3′;SEQ.ID.NO.2)扩增编码氨基末端69个氨基酸的265bp序列和包括一个Sma I限制酶切位点的23bp上游非翻译序列。引物C修饰并延伸L2氨基末端编码区,而且在L2编码序列下游添加Not I、Sac I以及Xho I限制酶切位点。
引物A (5′-GCG GCC GCG AGC TCG AGG GTT ATA TTC CTGCAA ATA CAA-3′;SEQ.ID.NO.3)、C和D(5′-CCC TCC AGA TCT CTAGGC AGC CAA AGA GAC ATC TG-3′;SEQ.ID.NO.4)扩增编码L2羧基末端84个氨基酸的285bp序列和加入一个Bgl II限制酶切位点的6个bp。引物A还加入包含L2编码序列上游的Not I、Sac I以及Xho I位点的17bp序列。
通过引物A和C加入的互补序列组装基本型L2表达载体。在包含作为扩增引物的I和D寡聚物的PCR反应中同时使用从上述I/C和A/D扩增反应中分离的DNA产物。为促进通过其17bp互补序列的连接所述片段,以37℃退火温度进行三个PCR循环,然后在57℃下进行15个PCR循环。将获得的扩增产物平端连接入pcrScript(Stratagene,LaJolla)且转化入XL-1 Blue MRF’细胞(Stratagene,La Jolla)。用引物I和D经PCR鉴定阳性克隆,并经限制性消化分析确证阳性克隆。然后通过自动序列分析(Perkin Elmer,Inc.,FosterCity,CA)验证所述构建物。
然后用Sma I和Bgl II消化得自合适分离物的质粒DNA;大约0.5kb的片段经凝胶纯化并与14kb SmaI和BglII pGAL110 HPV16 L1载体片段连接。用此连接混合物转化感受态DH5大肠杆菌细胞(GibcoBRL,Rockville,MD),在LB氨苄青霉素平板(Remel,Lenexa,KS)上选择转化子。通过其中应用引物D和I扩增L2的部分的PCR初步筛选克隆;然后经限制性消化分析确证适当的克隆。通过上述序列分析验证了候选克隆YP3#1。
然后将YP3#1用作编码HPV16 E1、E2或E7可读框的基因***其中的主要构建物。HPV E蛋白编码基因的***
编码HPV16 E2基因是通过PCR扩增HPV16阳性临床样品获得的,然后将其直接***亚克隆载体pCRII(Stratagene,La Jolla,CA)且如上所述进行序列验证。然后根据下列方法修饰E2基因序列:
1)将含Xho I、Nae I、Not I的DNA序列按读框加入到E2的氨基末端部分。另外,将含有Not I、Nae I和Xho I的序列加入到E2的羧基-末端部分,有助于在Not I、Xho I位点***E2内。
2)通过PCR诱变残基谷氨酸39和异亮氨酸73编码丙氨酸残基编码来改变DNA序列。这样是打算使E2蛋白功能失活。
用Not I、Xho I酶切上述修饰的HPV16 E2基因,并将其与用同样消化的YP3#1载体连接。经PCR选择含正确***E2序列的转化子并进行序列检验。
同样的策略可用于编码HPV16 E1和HPV16 E7的基因。对于E1,甘氨酸482改变为天冬氨酸;对于E7,半胱氨酸24和谷氨酸26均转变为甘氨酸从而使得蛋白功能失活。然后将获得的构建物用于转化酵母以进行表达分析。
实施例5
表达嵌合型VLP酵母的识别和培养
用YP3#1和上述衍生物的质粒DNA通过原生质球方法(Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929-1933)转化啤酒酵母(MATa,leu2-04,prb1∷HIS3,mnn9∷URA3,cir°)。将转化的原生质球平板接种在选择性(亮氨酸缺陷型)培养基(Remel,Lenexa,KS)上。通过两个周期单菌落选择分离出克隆。少量液体培养的候选克隆在含有半乳糖的培养基中培养成高细胞密度。用玻璃珠巨烈振荡,然后离心来制备粗提物。用单克隆抗体或单特异性多克隆抗血清通过各种方法(包括SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、ELISA、免疫印迹以及EIA)分析澄清提取物中的L1、L2组分和VLP表达,所述抗体识别L1或L2、或L2的氨基或羧基末端、或L1 VLP、或E1、或E2、或E7、或与修饰L2融合的任何其它蛋白质或肽VLP。选择表达L2组分并形成VLP的克隆以进一步进行特征鉴定。在含有半乳糖的培养基中培养1升或16升选择克隆培养物以大规模制备嵌合型VLP。
细胞沉淀物冷冻贮存在-70℃。将冷冻细胞(湿重=148克)解冻并重新悬浮在740毫升“破碎缓冲液”(200mM MOPS,pH7,1mM氯化钙)中,获得约20%(w/v)细胞淤浆。加入核酸酶BENZONASE(Nycomed Pharma)至750单位/克细胞湿重。用M110-Y Microfluidizer(Microfluidics Corp.,Newton,MA)以大约19,000磅压力下重复5次破碎细胞细胞淤浆。在破碎期间细胞淤浆在冰上收集并保存。细胞比容测定表明80%以上细胞破碎。
应用以渗滤方式运行的切向流微滤仪,通过一个0.65微米孔径中空纤维管(A/G Technologies)微滤澄清老化细胞溶胞产物。用3体积的0.25M枸橼酸钠、0.2M MOPS,pH7.0渗滤溶胞产物。使抗原通过膜并且收集渗透液。
将渗透的0.65mm渗透部分(3.9L)上样到325mL POROS50HS树脂(Perseptive Biosystems,Cambridge,MA)柱(11.2cm ID×3.3cm)上,所述柱用200mM MOPS,pH7,250mM枸橼酸钠平衡。该柱用8体积50mM MOPS,0.5M NaCl,5mM磷酸钠,pH7冲洗,用10体积的0.5到1.5M NaCl的线形梯度的相同缓冲液洗脱。洗脱过程中成批收集直流出物和冲洗部分同时以1体积收集流分。通过蛋白质印迹和利用胶体考马斯亮蓝检测的SDS-PAGE分析柱流分。合并主要含p55蛋白的流分。
通过BCA测定(Pierce)分析50 HS合并物中的总蛋白质量。根据总蛋白量(168mg)浇注(poure)II型陶瓷羟磷灰石(HA)柱(Bio-Rad),获得1mL树脂/2mg蛋白。该柱是2.6cm ID×15.7cm。该柱用50mMMOPS,pH7,1.25M NaCl,5mM磷酸钠平衡。经0.22mm过滤50HS合并物并以113cm/hr的流速上样到HA柱。大量收集直流出物(Flow-thru)。用5体积平衡缓冲液冲洗HA柱,用8体积的从5到200mM磷酸钠,pH7的1.25M NaCl的线形梯度洗脱。通过白质印迹和利用胶体考马斯亮蓝检测的SDS-PGAE分析洗脱收集的流分。合并纯度相当并富含L1蛋白的流分。合并流分经0.22mm膜过滤除菌并保存在4℃。
对过程保留物(process retains)和产物用特异性酶联免疫测定分析HPV 16 L1、用BCA测定蛋白质。最终纯化产物产量为27mg蛋白质,比活为1.00mg L1/mg蛋白质。电子显微镜证实存在平均直径为32nm的完整VLP颗粒。为了进行SDS-PAGE纯度分析,经TCA沉淀浓缩等份终产物并且通过蛋白质印迹和利用胶体考马斯亮蓝检测的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。用2.5mg载荷量定量L1,而以20.0mg载荷量定量酵母杂质。光密度分析法证实L1蛋白的纯度大于94%。过程流分(process fractions)的特异性免疫印迹分析证实共纯化的L1和L2mini/E2。
Claims (9)
1.纯化重组***瘤病毒样颗粒(VLP)的方法,包括:
(a)在VLP可与羟磷灰石介质结合的条件下,使含部分纯化VLP的细胞溶胞产物与层析柱中的羟磷灰石介质接触;
(b)用含磷酸根阴离子的溶液洗脱结合的VLP;和
(c)回收洗脱的VLP。
2.根据权利要求1的方法,其中所述VLP主要由L1蛋白组成。
3.根据权利要求1的方法,其中所述VLP是人***瘤病毒(HPV)VLP。
4.根据权利要求3的方法,其中所述VLP选自6a型HPV、6b型HPV、11型HPV、16型HPV、18型HPV、31型HPV、33型HPV以及45型HPV。
5.根据权利要求4的方法,其中所述洗脱VLP的纯度至少为75%。
6.根据权利要求4的方法,其中所述洗脱VLP的纯度至少为90%。
7.根据权利要求1的方法,其中所述VLP包含L1蛋白和L2:融合蛋白。
8.根据权利要求7的方法,其中所述L2:融合蛋白含有小于总长度的一个L2部分。
9.制备纯化的人***瘤病毒VLP产物的方法,所述产物适用于人类疫苗,该方法包括:
(a)部分纯化细胞溶胞产物,其中所述细胞溶胞产物得自转化表达HPV L1 VLP的酵母细胞;
(b)在VLP可与羟磷灰石介质结合的条件下,将含部分纯化VLP的细胞溶胞产物与层析柱中的羟磷灰石介质接触;
(c)用含磷酸根阴离子的溶液洗脱结合的VLP;和
(d)回收洗脱的VLP。
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