ES2248823T3 - Neutroquina alfa. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA PROTEINA DE NEUTROQUINA AL , QUE ES UN MIEMBRO DE LA FAMILIA DE PROTEINAS TNF. ESPECIALMENTE, SE PROPORCIONAN MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO AISLADAS, QUE CODIFICAN PARA LA PROTEINA DE NEUTROQUINA AL HUMANA, INCLUYENDO FORMAS SOLUBLES DEL DOMINIO EXTRACELULAR. SE PROPORCIONAN ASIMISMO POLIPEPTIDOS DE NEUTROQUINA AL , ASI COMO VECTORES, CELULAS HUESPED Y PROCEDIMIENTOS RECOMBINANTES PARA PRODUCIRLOS. LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO A PROCEDIMIENTOS DE SELECCION PARA IDENTIFICAR AGONISTAS Y ANTAGONISTAS DE LA ACTIVIDAD NEUTROQUINA AL . ASIMISMO, SE PROPORCIONAN PROCEDIMIENTOS DIAGNOSTICOS PARA DETECTAR ALTERACIONES RELACIONADAS CON EL SISTEMA INMUNITARIO Y PROCEDIMIENTOS TERAPEUTICOS PARA TRATAR ALTERACIONES RELACIONADAS CON EL MISMO.

Description

Neutroquina \alpha.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una nueva citoquina expresada por los neutrófilos que ha sido denominada proteína Neutroquina-\alpha ("Neutroquina-\alpha"). En particular, se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína Neutroquina-\alpha. También se proporcionan polipéptidos Neutroquina-\alpha, así como vectores, células hospedantes y métodos recombinantes para producir los mismos.

Técnica relacionada

Los factores de necrosis tumoral (TNF-\alpha) y (TNF-\beta, o linfotoxina), son miembros relacionados de una amplia clase de polipéptidos mediadores, que incluyen interferones, interleuquinas y factores de crecimiento, colectivamente llamados citoquinas (Beutler, B. y Cerami, A., Annu. Ret. Immunol., 7:625-655 (1989)). El análisis de secuencias de los receptores de citoquinas han definido varias subfamilias de proteínas de membrana (1) la superfamilia de Ig, (2) la superfamilia de la hematopoyetina (receptor de citoquina) y (3) la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF)/receptor del factor de crecimiento del nervio (NGF) (para revisar la superfamilia del TNF véase, Gruss y Doler, Blood 85(12):3378-3404 (1995) y Aggarwal y Natarajan, Eur. Cytokine Netw., 7(2):93-124 (1996)). La superfamilia del TNF/receptor del NGF contiene al menos 10 proteínas diferentes. Gruss y Doler, arriba. Se han identificado los ligandos para esos receptores y pertenecen a al menos dos superfamilias de citoquinas. Gruss y Dower, arriba.

El factor de necrosis tumoral (una mezcla de TNF-\alpha y TNF-\beta) fue descubierto originalmente como resultado de su actividad antitumoral, sin embargo, ahora es reconocido como una citoquina pleotrópica, capaz de numerosas actividades biológicas, que incluyen la apoptosis de algunas líneas celulares trasformadas, la mediación de la activación y proliferación celular, y también con papeles importantes en la regulación inmune y la inflamación.

Hasta el momento, miembros conocidos de la superfamilia de los ligandos del TNF incluyen TNF-\alpha, TNF-\beta (linfotoxina-\alpha), LT-\beta, OX40L, ligando de Fas, CD30L, CD27L, CD40L y 4-IBBL. Los ligandos de la superfamilia de los ligandos del TNF son moléculas similares al TNF, ácidas, con aproximadamente un 20% de homología de secuencias en los dominios extracelulares (intervalo, 12%-36%), y existen principalmente como formas unidas a membrana, siendo la forma biológicamente activa un complejo trimérico/multimérico. Las formas solubles de la superfamilia de los ligandos del TNF solo han sido identificadas hasta el momento para TNF, LT \beta, y ligando de Fas (para una revisión general, véase Gruss, H. y Dower, S.K., Blood, 85(12):3378-3404 (1995)), que se incorpora aquí mediante referencia en toda su extensión. Estas proteínas están implicadas en la regulación de la proliferación, activación y diferenciación celular, incluyendo el control de la supervivencia o muerte celular mediante apoptosis o citotoxicidad (Armitage, R.J., Curr. Opin. Immunol. 6:407 (1994) y Smith, C.A., Cell 75:959 (1994)).

El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-\alpha, también denominada caquectina; de aquí en adelante "TNF") es secretado primariamente por monolitos y macrófagos, en respuesta a la endotoxina u otros estímulos, como un heterodímero soluble de subunidades de proteína de 17 kD (Smith, R.A. et al., J. Biol. Chem. 262:6951-6954 (1987)). También se ha descrito una forma precursora de TNF de 26 kD unida a membrana (Kriegler, M. et al., Cell 53:45-53 (1988)).

La evidencia acumulada indica que el TNF es una citoquina reguladora con actividades biológicas pleotrópicas. Estas actividades incluyen: inhibición de la síntesis de lipoprotein-lipasa (actividad "caquectina") (Beutler, B. et al., Nature 316:552 (1985)), activación de leucocitos polimorfonucleares (Klebanoff, S.J. et al., J. Immunol. 136:4220 (1986); Perussia, B., et al., J. Immunol. 138:765 (1987)), inhibición del crecimiento celular o estimulación del crecimiento celular (Vilcek, J. et al., J. Exp. Med. 163:632 (1986); Sugarman, B.J. et al., Science 230:943 (1985); Lachman, L.B. et al., J. Immunol. 138:2913 (1987)), acción citotóxica de ciertos tipos de células trasformadas (Lachman, L.B. et al., arriba); Darzynkiewicz, Z, et al., Canc. Res. 44:83 (1984)), actividad antiviral (Kohase, M. et al., Cell 45:659 (1986); Wong, G.H.W. et al., Nature 323:819 (1986)), estimulación de la resorción ósea (Bertolini, D.R. et al., Nature 319:516 (1986); Saklatava, J., Nature 322:547 (1986)), estimulación de la producción de colagenasa y prostaglandina E2 (Dayer, J.M. et al., J. Exp. Med. 162:2163 (1985)); y acciones inmunorreguladoras, incluyendo activación de células T (Yolota, S. et al., J. Immunol. 140:531 (1988)), de células B (Kehrl, J.H. et al., J. Exp. Med. 166:786 (1987)), de monocitos (Philip, R. et al., Nature 323:86 (1986)), de timocitos (Ranges, G.E. et al., J. Exp. Med. 167:1472 (1988)), y estimulación de la expresión en la superficie celular de las moléculas de clase I y clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) (Collins, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:446 (1986); Pujol-Borrel, R. et al., Nature 326:304 (1987)).

El TNF es conocido por sus acciones pro-inflamatorias que dan como resultado la lesión tisular, tales como la inducción de actividad procoagulante en las células endoteliales vasculares (Pober, J.S. et al., J. Immunol. 136:1680 (1986)), el aumento de la adherencia de los neutrófilos y linfocitos (Pober, J.S. et al., J. Immunol. 138:3319 (1987)), y la estimulación de la liberación de factor activador de las plaquetas por los macrófagos, neutrófilos y células endoteliales vasculares (Camussi, G. et al., J. Exp. Med. 166:1390 (1987)).

Evidencias recientes implican al TNF en la patogénesis de muchas infecciones (Cerami, A. et al., Immunol. Today 9:28 (1988)), alteraciones inmunes, patología neoplásica, es decir, en la caquexia que acompaña a algunos cánceres (Oliff, A., et al., Cell 50:555 (1987)), y en las patologías autoinmunes y en la patología del injerto contra el huésped (Piguet, P.F. et al., J. Exp. Med. 166:1280 (1987)). La asociación de TNF con cáncer y patologías infecciosas se relaciona frecuentemente con el estado catabólico del huésped. Un problema principal en los pacientes con cáncer es la pérdida de peso, habitualmente asociado con anorexia. El intenso desgaste que resulta se conoce como "caquexia" (Kern, K.A. et al., J. Parent. Enter. Nutr. 12:286-298 (1988)). La caquexia incluye pérdida progresiva de peso, anorexia, y erosión persistente de la masa corporal, en respuesta al crecimiento del cáncer. El estado caquéctico está por lo tanto asociado con una morbilidad significativa, y es responsable de la mayoría de la mortalidad del cáncer. Un número de estudios han sugerido que el TNF es un mediador importante en la caquexia en el cáncer, la patología infecciosa y en otros estados catabólicos.

Se piensa que el TNF juega un papel central en las consecuencias patofisiólogicas de la sepsis por Gram negativos y en el shock endotóxico (Michie, H.R., et al., Br. J. Surg. 76:670-671 (1989); Debets, J.M.H. et al., Second Viena Shock Forum, pag. 463-466 (1989); Simpson, S.Q. et al., Crit. Care Clin. 5:27-47 (1989)), incluyendo fiebre, malestar general, anorexia, y caquexia. La endotoxina es un potente activador de monocitos/macrófagos, que estimula la producción y la secreción de TNF (Kornbluth, S.K. et al., J. Immunol 137:2585-2591 (1986)) y otras citoquinas. Como el TNF podría simular muchos efectos biológicos de la endotoxina, se concluyó que es un mediador central, responsable de las manifestaciones clínicas de las enfermedades relacionadas con la endotoxina. El TNF y otras citoquinas derivadas de monocitos median las respuestas metabólicas y neurohormonales a la endotoxina (Michie, H.R. et al., N. Eng. J. Med. 318:1481-1486 (1988)). La administración de endotoxina a voluntarios humanos produce una enfermedad aguda con síntomas similares a un resfriado, incluyendo fiebre, taquicardia, tasa metabólica aumentada y liberación de hormonas de estrés (Revhaug, A. et al., Arch. Surg. 123:162-170 (1988)). También se han encontrado niveles circulante elevados de TNF en pacientes que padecen sepsis por Gram negativos (Waage, A. et al., Lancet I:355-357 (1987); Hammerle, A.F. et al., Second Vienna Shock Forum pag. 715-718 (1989); Debets, J.M.H. et al., Crit. Care Med. 17:489-497 (1989); Calandra, T. et al., J. Infec. Dis. 161:982-987
(1990)).

La inmunoterapia pasiva dirigida a neutralizar el TNF puede tener un efecto beneficioso en la sepsis por Gram negativos y en la endotoxemia, debido a la producción aumentada de TNF y los niveles aumentados de TNF existentes en estos estados patológicos, como se ha discutido previamente. Cerami et al., han descrito anticuerpos contra un material "modulador" que se caracterizó como caquectina (después identificado como idéntico a TNF) (Publicación de Patente EPO 0.212.489, 4 de Marzo de 1987). Tales anticuerpos parecían ser útiles para inmunoensayos diagnósticos y como terapia del shock en las infecciones bacterianas. Rubin et al. (Publicación de Patente EPO 0.218.868, 22 de abril de 1987) describieron anticuerpos monoclonales contra el TNF humano, los hibridomas que secretan dichos anticuerpos, métodos para producir dichos anticuerpos, y el uso de dichos anticuerpos en inmunoensayos de TNF. Yone et al. (Publicación de Patente EPO 0.288.088, 26 de octubre de 1988), describieron anticuerpos anti-TNF, incluyendo mAbs, y su utilidad en el diagnóstico por inmunoensayo de patologías, en particular la enfermedad de Kawasaki y la infección bacteriana. Los líquidos orgánicos corporales de los pacientes con enfermedad de Kawasaki (síndrome agudo febril nodular linfático mucocutáneo infantil; Kawasaki, T. Allergy 16:178 (1967); Kawasaki, T., Shonica (Pediatrics) 26:935 (1985)) contienen niveles elevados de TNF que están relacionados con la progresión de la enfermedad (Yone et al., arriba).

Otros investigadores han descrito mAbs específicos para TNF recombinante humano, que tenían actividad neutralizante in vitro (Liang, C.M. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847-854 (1986); Meager, A. et al., Hybridoma 6:305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6:359-369 (1987); Bringman, T.S. et al., Hybridoma 6:489-507 (1987); Hirai, M. et al., J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987); Moller, A. et al., Cytokine 2:162-169 (1990)). Algunos de estos mAbs se utilizaron para localizar epítopos de TNF humano y desarrollar inmunoensayos enzimáticos (Fendly et al., arriba; Hirai et al., arriba; Moller et al., arriba), y para ayudar a la purificación de TNF recombinante (Bringman et al., arriba). Sin embargo, estos estudios no proporcionan una base para producir anticuerpos neutralizantes para TNF que puedan ser utilizados para uso diagnóstico in vivo o uso terapéutico en humanos, debido a la inmunogenicidad, falta de especificidad y/o adecuación farmacéutica.

Los sueros neutralizantes o los mAbs contra el TNF han demostrado, en mamíferos diferentes al hombre, eliminar los cambios fisiológicos adversos, y prevenir la muerte después de un estímulo mortal en endotoxemia y bacteriemia experimental. Este efecto ha sido demostrado, por ejemplo, en ensayos de mortalidad de roedores y en sistemas de modelo de patología en primates (Mathison, J.C. et al., J. Clin. Invest. 81:1925-1937 (1988); Beutler, B. et al., Science 229:869-871 (1985); Tracey, K.J. et al., Nature 330:662-664 (1987); Shimamoto, Y. et al., Immunol. Lett. 17:311-318 (1988); Silva, A.T. et al., J. Infect. Dis. 162:421-427 (1990); Opal, S.M. et al., J. Infect. Dis. 161:1148-1152 (1990); Hinshaw, L.B. et al., Circ. Shock 30:279-292 (1990)).

Hasta el momento, la experiencia con terapia con mAb anti-TNF en humanos es limitada, pero muestra resultados terapéuticos beneficiosos, por ejemplo en artritis y sepsis. Véase, por ejemplo, Elliott, M.J. et al., Baillieres Clin. Rheumatol. 9:633-52 (1995); Feldmann M, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. USA 766:272-8 (1995); van der Poll, T. et al., Shock 3:1-12 (1995); Wherry et al., Crit. Care Med. 21:S436-40 (1993); Tracey K.J., et al., Crit. Care Med. 21:S415-22 (1993).

El desarrollo de mamíferos es dependiente tanto de la proliferación y la diferenciación de las células, como de la muerte celular programada que ocurre a través de la apoptosis (Walter, et al., Methods Achiev. Exp. Pathol. 13:18 (1988). La apoptosis juega un papel crítico en la destrucción de los timocitos inmunes que reconocen a los antígenos propios. El fracaso de este proceso de eliminación normal puede jugar un papel en las enfermedades autoinmunes (Gammon et al., Immunology Today 12:193 (1991)).

Itoh et al. (Cell 66:233 (1991)), describieron un antígeno de superficie celular, el Fas/CD23, que media la apoptosis y está implicado en la deleción clonal de las células T. El Fas se expresa en células T activadas, células B, neutrófilos y en el timo, el hígado, el corazón y el pulmón y el ovario en ratones adultos (Watanabe-Fukunaga et al., J. Immunol. 148:1274 (1992)), además de en células T activadas, células B y neutrófilos. En experimentos en los que un anticuerpo monoclonal se entrecruza con Fas, se induce la apoptosis (Yonehara et al., J. Exp. Med. 169:1747 (1989); Trauth et al., Science 245:301 (1989)). Además, hay un ejemplo en el que la unión de un anticuerpo monoclonal a Fas es estimuladora para las células T bajo ciertas condiciones (Alderson et al., J. Exp. Med. 178:2231 (1993)).

El antígeno Fas es una proteína de superficie celular de MW relativo de 45 Kd. Tanto el gen humano como el murino han sido clonados por Watanabe-Fukunaga et al., (J. Immunol. 148:1274 (1992)) e Itoh et al. (Cell 66:233 (1991)). Las proteínas codificadas por estos genes son ambas proteínas transmembrana, con homología estructural con la superfamilia de los receptores del Factor de Crecimiento del Nervio/Factor de Necrosis Tumoral, que incluye dos receptores de TNF, el receptor del Factor de Crecimiento de Nervio de baja afinidad y el CD40, el CD27, el CD30 y el OX40.

Recientemente se ha descrito el ligando de Fas (Suda et al., Cell 75:1169 (1993)). La secuencia de aminoácidos indica que el ligando de Fas es una proteína transmembrana de tipo II, perteneciente a la familia del TNF. Así, el polipéptido ligando de Fas contiene tres dominios principales: un dominio intracelular corto en el extremo amino y un dominio extracelular más largo en el extremo carboxilo, conectados por un dominio transmembrana hidrófobo. El ligando de Fas es expresado en los esplenocitos y timocitos, en consistencia con la citotoxicidad mediada por células T. El ligando de Fas purificado tiene un MW de 40 kD.

Recientemente, se ha demostrado que las interacciones Fas/ligando de Fas se requieren para la apoptosis después de la activación de las células T (Ju et al., Nature 373:444 (1995); Brunner et al., Nature 373:441 (1995)). La activación de las células T induce ambas proteínas sobre la superficie celular. La interacción posterior entre el ligando y el receptor da como resultado la apoptosis de las células. Esto apoya el posible papel regulador de la apoptosis inducido por la interacción Fas/ligando de Fas durante la respuesta inmune normal.

De acuerdo con esto, existe una necesidad para proporcionar citoquinas similares a TNF que estén implicadas en las situaciones patológicas. Dichas nuevas citoquinas podrían utilizarse para fabricar nuevos anticuerpos u otros antagonistas que se unan a las citoquinas similares a TNF, para la terapia de enfermedades relacionadas con las citoquinas similares a TNF.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica una citoquina que es estructuralmente similar al TNF y las citoquinas relacionadas, y que se cree que tiene efectos biológicos y actividades similares. Esta citoquina se denomina Neutroquina-\alpha, y la invención incluye polipéptidos Neutroquina-\alpha que tienen al menos una parte de la secuencia de aminoácidos de la Figura 1 (SEQ ID NO:2), o una secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA depositado en un hospedante bacteriano el 22 de octubre de 1996, asignado con el número 97768 de ATCC. La secuencia de nucleótidos determinada por secuenciación del clon de la Neutroquina-\alpha depositado, que se muestra en la Figura 1 (SEQ ID NO:1), contiene un marco de lectura abierta que codifica un polipéptido completo de 285 residuos de aminoácidos, incluyendo una metionina N-terminal, un dominio intracelular predicho de alrededor de 46 residuos de aminoácidos, un dominio transmembrana predicho de alrededor de 26 aminoácidos, un dominio extracelular predicho de alrededor de 213 residuos de aminoácidos, y un peso molecular deducido para la proteína completa de alrededor de 31 kDa. Como para otros tipos de proteínas transmembrana de tipo II, las formas solubles de la Neutroquina-\alpha incluyen todo o una parte del dominio extracelular escindido del dominio transmembrana, y un polipéptido que contiene el polipéptido Neutroquina-\alpha completo, que carece del dominio transmembrana, es decir, el dominio extracelular ligado al dominio intracelular.

Así, un aspecto de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que contiene un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de un grupo que consiste en: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido Neutroquina-\alpha de longitud completa, que tiene la secuencia de aminoácidos completa de la Figura 1 (SEQ ID NO:2), o como la codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito de ATCC del 22 de octubre de 1996, con el Número 97768 de ATCC; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio extracelular predicho del polipéptido Neutroquina-\alpha, que tiene la secuencia de aminoácidos de la posición 73 a la 285 de la Figura 1 (SEQ ID NO:2), o como la codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito de ATCC del 22 de octubre de 1996, con el Número 97768 de ATCC; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que contiene el dominio intracelular de la Neutroquina-\alpha (residuos de aminoácidos desde alrededor del 1 hasta alrededor del 46 de la Figura 1 (SEQ ID NO:2)), o como la codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito de ATCC del 22 de octubre de 1996, con el Número 97768 de ATCC; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que contiene el dominio transmembrana de la Neutroquina-\alpha (residuos de aminoácidos desde alrededor del 47 hasta alrededor del 72 en la Figura 1 (SEQ ID NO:2), o como la codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito de ATCC del 22 de octubre de 1996, con el Número 97768 de ATCC; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido Neutroquina-\alpha soluble, que contiene los dominios extracelular e intracelular, pero que carece del dominio transmembrana; y (f) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos de (a), (b), (c), (d) o (e) anteriores.

Otras realizaciones de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas, que contienen un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos idéntica al menos en un 90%, y más preferiblemente, idéntica al menos en un 95%, 96%, 97%, 98% ó 99%, a cualquiera de las secuencias de nucleótidos de (a), (b), (c), (d) o (e) anteriores, y que codifican un polipéptido que tiene actividad de Neutroquina-\alpha, o un polinucleótido que se hibrida, bajo condiciones astringentes de hibridación, a un polinucleótido descrito anteriormente en (a), (b), (c), (d), (e) o (f), y que codifica un polipéptido que tiene actividad de Neutroquina-\alpha. Este polinucleótido que se hibrida, no se hibrida bajo condiciones astringentes de hibridación a un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que consiste solo en residuos A o solo en residuos T. La presente invención adicionalmente describe una molécula de ácido nucleico, que contiene un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos de una parte del polipéptido Neutroquina-\alpha que contiene el epítopo, que tiene una secuencia de aminoácidos como la descrita anteriormente en (a), (b), (c), (d) o (e).

La presente invención también se refiere a vectores recombinantes, que incluyen las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, y a células hospedantes que contienen los vectores recombinantes, así como a métodos para fabricar dichos vectores y células hospedantes, para utilizarlas para la producción de polipéptidos o péptidos Neutroquina-\alpha mediante técnicas recombinantes.

La invención además proporciona un polipéptido Neutroquina-\alpha que contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido Neutroquina-\alpha de longitud completa, que tiene la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:2), o como la codificada por el clon de cDNA contenido en el ATCC Nº 97768, depositado el 22 de octubre de 1996; (b) la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular predicho del polipéptido Neutroquina-\alpha, que tiene la secuencia de aminoácidos de la Figura 1 (SEQ ID NO:2) desde la posición 73 hasta la 285, o como la codificada por el clon de cDNA contenido en el ATCC Nº 97768, depositado el 22 de octubre de 1996; (c) la secuencia de aminoácidos del dominio intracelular de la Neutroquina-\alpha (residuos de aminoácidos desde alrededor del 1 hasta alrededor del 46 en la FIG 1 (SEQ ID NO:2)), o como la codificada por el clon de cDNA contenido en el ATCC Nº 97768, depositado el 22 de octubre de 1996; (d) la secuencia de aminoácidos del dominio transmembrana de la Neutroquina-\alpha (residuos de aminoácidos desde alrededor del 47 hasta alrededor del 72 en la FIG 1 (SEQ ID NO:2), o como la codificada por el clon de cDNA contenido en el ATCC Nº 97768, depositado el 22 de octubre de 1996; y (e) la secuencia de aminoácidos del polipéptido Neutroquina-\alpha soluble, que tiene los dominios intracelular y extracelular, pero que carece del dominio transmembrana, donde cada uno de estos dominios está definido como se describió anteriormente.

Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos el 90% de similitud, y más preferiblemente al menos el 95% de similitud a los descritos en (a), (b), (c), (d) o (e) anteriormente, así como polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 90%, y todavía más preferiblemente idéntica en un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a los anteriores, donde dichos polipéptidos similares tienen actividad de Neutroquina-\alpha.

Además, la presente invención describe un péptido o polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una parte del polipéptido Neutroquina-\alpha portadora del epítopo, que tiene una secuencia de aminoácidos como la descrita en (a), (b), (c), (d) o (e) anteriormente. Los péptidos o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de una parte del polipéptido Neutroquina-\alpha de la invención, portadora del epítopo, incluyen partes de dichos polipéptidos con al menos seis o siete, preferiblemente al menos nueve, y más preferiblemente al menos desde alrededor de 30 aminoácidos hasta alrededor de 50 aminoácidos, aunque los polipéptidos portadores del epítopo de cualquier longitud, incluyendo los que tienen la secuencia de aminoácidos entera de un polipéptido de la invención descrito anteriormente, también están descritos en la invención. En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en (a), (b), (c), (d) o (e) anteriormente.

La invención además proporciona métodos para aislar anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido Neutroquina-\alpha que tiene una secuencia de aminoácidos como la descrita aquí. Tales anticuerpos son útiles desde el punto de vista diagnóstico o terapéutico, como se describe más adelante.

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que contienen polipéptidos Neutroquina-\alpha solubles, particularmente polipéptidos Nuetroquina-\alpha humanos, que pueden emplearse por ejemplo, para tratar tumores y metástasis de tumores, infecciones por bacterias, virus y otros parásitos, inmunodeficiencias, enfermedades inflamatorias, linfadenopatía, enfermedades autoinmunes, enfermedades injerto contra huésped, y para estimular la tolerancia periférica, destruir algunas líneas celulares trasformadas, mediar la activación y la proliferación celular, y que están ligadas funcionalmente como mediadores primarios de la regulación inmune y las respuestas inflamatorias.

La invención además proporciona composiciones que contienen un polinucleótido para Neutroquina-\alpha o un polipéptido Neutroquina-\alpha, para utilizar en la administración de células in vitro, y a células ex vivo. Dichas composiciones pueden ser adecuadas para ser administradas a células in vivo, o a un organismo multicelular. En ciertas realizaciones particularmente preferidas de este aspecto de la invención, las composiciones contienen un polinucleótido para Neutroquina-\alpha, para la expresión de un polipéptido Neutroquina-\alpha en un organismo hospedante, para el tratamiento de una enfermedad. Particularmente preferida en este aspecto es la expresión en un paciente humano, para el tratamiento de una disfunción asociada con actividad endógena aberrante de un gen de Neutroquina-\alpha.

La presente invención también describe un método de cribado para identificar compuestos capaces de aumentar o inhibir una respuesta celular inducida por Neutroquina-\alpha, que incluye poner en contacto células que expresan Neutroquina-\alpha con el compuesto candidato, analizar una respuesta celular, y comparar la respuesta celular con una respuesta celular estándar, siendo el estándar analizado el que se produce tras el contacto en ausencia del compuesto candidato; por lo tanto, una respuesta celular aumentada sobre el estándar, indica que el compuesto es un agonista, y una respuesta celular disminuida sobre el estándar indica que el compuesto es un antagonista.

En otro aspecto, se describe un método para identificar receptores de Neutroquina-\alpha, así como un ensayo de cribado para agonistas y antagonistas, utilizando dichos receptores. Este ensayo incluye la determinación del efecto que un compuesto candidato tiene sobre la unión de una Neutroquina-\alpha a un receptor de Neutroquina-\alpha. En particular, el método incluye poner en contacto un receptor de Neutroquina-\alpha con un polipéptido Neutroquina-\alpha y un compuesto candidato, y determinar si la unión del polipéptido Neutroquina-\alpha al receptor de Neutroquina-\alpha está aumentada o disminuida debido a la presencia del compuesto candidato. Los antagonistas pueden emplearse para prevenir el shock séptico, la inflamación, la malaria cerebral, la activación del virus HIV, el rechazo del injerto contra el huésped, la resorción ósea, la artritis reumatoide y la caquexia (debilitación o malnutrición).

Los presentes inventores han descubierto que la Neutroquina-\alpha no se expresa solo en neutrófilos, sino también en tejidos de riñón, pulmón, leucocitos de sangre periférica, médula ósea, células de linfoma T, células de linfoma B, células T activadas, cáncer de estómago, músculo liso, macrófagos y sangre de cordón. En un número de enfermedades de estos tejidos y células, tales como los tumores y las metástasis tumorales, las infecciones por bacterias, virus y otros parásitos, las inmunodeficiencias, el shock séptico, la inflamación, la malaria cerebral, la activación del virus HIV, el rechazo de injerto contra huésped, la resorción ósea, la artritis reumatoide y la caquexia (debilitación o malnutrición), se piensa que pueden detectarse niveles significativamente más altos o más bajos de expresión del gen de Neutroquina-\alpha en ciertos tejidos (por ejemplo, médula ósea), o líquidos orgánicos corporales (por ejemplo suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo espinal), extraídos de un individuo que tiene dicha enfermedad, en relación a un "estándar" de nivel de expresión del gen de Neutroquina-\alpha en tejidos o líquidos orgánicos corporales, de un individuo que no tiene la enfermedad. Así, la invención describe un método diagnóstico útil durante el diagnóstico de una enfermedad, que incluye: (a) analizar el nivel de expresión del gen de Neutroquina-\alpha con respecto a un nivel de expresión estándar del gen de Neutroquina-\alpha, de tal forma que tanto si el nivel de expresión del gen de Neutroquina-\alpha está aumentado como si está disminuido respecto del nivel de expresión estándar, es indicativo de una enfermedad.

La presente invención también describe una utilización de un polipéptido Neutroquina-\alpha de la invención, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar a un individuo con necesidad de un nivel de actividad de Neutroquina-\alpha aumentado en el organismo.

La presente invención además describe la utilización de anticuerpos específicos para Neutroquina-\alpha, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar a un individuo con necesidad de un nivel de actividad de Neutroquina-\alpha disminuido en el organismo.

Breve descripción de las figuras

La Fig 1 muestra las secuencias de nucleótidos (SEQ ID NO:1) y la deducida de aminoácidos (SEQ ID NO:2) de la proteína Neutroquina-\alpha. Los aminoácidos 1 al 46 representan el dominio intracelular, los aminoácidos 47 a 72 el dominio transmembrana (la secuencia subrayada), y los aminoácidos 73 a 285, el dominio extracelular (la secuencia restante).

La Figura 2 muestra las regiones de identidad entre las secuencias de aminoácidos de la proteína Neutroquina-\alpha y el TNF-\alpha (SEQ ID NO:3), TNF-\beta (linfotoxina; SEQ ID NO:4), y ligando de FAS (SEQ ID NO:5), determinado mediante la rutina "Megalign", que es parte del programa informático llamado "DNAStar".

La Figura 3 muestra un análisis de la secuencia de aminoácidos de la Neutroquina-\alpha. Se muestran las regiones alfa, beta, giro y espiral; la hidrofilicidad y la hidrofobicidad; las regiones amfifáticas; las regiones flexibles; el índice antigénico y la probabilidad de superficie. En el gráfico "Índice antigénico-Jameson-Wolf", la localización indicada de las regiones altamente antigénicas de la proteína Neutroquina-\alpha, es decir, las regiones de las cuales pueden obtenerse los péptidos portadores de epítopos de la invención.

La Figura 4 muestra el alineamiento de la secuencia de nucleótidos de la Neutroquina-\alpha, determinada a partir del cDNA depositado en el Depósito ATCC del 22 de octubre de 1996, con clones de cDNA humanos de la invención, que se han denominado HSOAD55R (SEQ ID NO:7), HSLAH84R (SEQ ID NO:8) y HLTBM08R (SEQ ID NO:9).

Descripción detallada

La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que contienen una polinucleótido que codifica un polipéptido Neutroquina-\alpha, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:2), que se determinó mediante secuenciación de un clon de cDNA de Neutroquina-\alpha. La secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1), se obtuvo mediante secuenciación del clon HNEDU15, que se depositó el 22 de octubre de 1996 en el American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland. El clon depositado está contenido en el plásmido pBluescript SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA).

La proteína Neutroquina-\alpha de la presente invención comparte homología de secuencia con el producto de tradución de los mRNA humanos para TNF-\alpha, TNF-\beta y ligando de Fas (Figura 2). Como se ha especificado anteriormente, se piensa que el TNF-\alpha es una citoquina importante que juega un papel en la citotoxicidad, la necrosis, la apoptosis, la co-estimulación, la proliferación, la formación de los ganglios linfáticos, el cambio de clase de las inmunoglobulinas, la diferenciación, la actividad antiviral, la regulación de moléculas de adhesión y otras citoquinas y factores de crecimiento.

Moléculas de Ácido Nucleico

A no ser que se especifique otra cosa, todas las secuencias de nucleótidos determinados mediante secuenciación de una molécula de DNA aquí incluida, se determinó utilizando un secuenciador automático de DNA (tal como el Modelo 373 de Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA), y todas las secuencias de polipéptidos codificadas por las moléculas de DNA determinadas aquí se predijo mediante la tradución de una secuencia de DNA determinada, como se especificó anteriormente. De este modo, como es conocido en la técnica, para cualquier secuencia de DNA determinada mediante esta aproximación automática, cualquier secuencia de nucelótidos determinada aquí puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas automáticamente son típicamente idénticas al menos en un 90%, más típicamente idénticas al menos desde alrededor de un 95% hasta al menos alrededor de un 99,9% a la secuencia de nucleótidos real de la molécula de DNA secuenciada. La secuencia real puede ser más precisamente determinada mediante otras aproximaciones, incluyendo métodos de secuenciación manual de DNA, bien conocidas en la técnica. Como también se conoce en la técnica, una inserción o deleción única en una secuencia de nucleótidos determinada, comparada con la secuencia real, ocasionará un cambio de marco en la tradución de la secuencia de aminoácidos, de tal forma que la secuencia de aminoácidos predicha codificada por una determinada secuencia de nucleótidos, será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos realmente codificada por la molécula de DNA secuenciada, comenzando en el punto de dicha inserción o deleción.

Por "secuencia de nucleótidos" de una molécula de ácido nucleico o polinucleótido, se entiende una molécula o polinucleótido de DNA, una secuencia de deoxirribonucleótidos, y una molécula o polinucleótido de RNA, la correspondiente secuencia de ribonucleótidos (A, G, C y U), en la que cada desoxirribonucleótido timidina (T) en la secuencia especificada de desoxirribonucleótidos, se reemplaza por el ribonucleótido uridina (U).

Utilizando la información aquí proporcionada, tal como la secuencia de nucleótidos de la Figura 1, una molécula de ácido nucleico de la presente invención que codifica un polipéptido Neutroquina-\alpha, puede obtenerse utilizando procedimientos de clonación y cribado estándar, tales como los de clonación de cDNA utilizando mRNA como material de inicio. Como ilustrativo de la invención, la molécula de ácido nucleico descrita en la Figura 1 (SEQ ID NO:1), se descubrió en una biblioteca de cDNA derivada de neutrófilos. También se encontraron marcadores de secuencia, correspondientes a una parte del cDNA de la Neutroquina-\alpha, expresados en neutrófilos.

El gen de la Neutroquina-\alpha contiene un marco de lectura abierta, que codifica una proteína de alrededor de 285 residuos de aminoácidos, un dominio intracelular de alrededor de 46 aminoácidos (residuos de aminoácidos desde alrededor del 1 hasta alrededor del 46 en la Figura 1) (SEQ ID NO:2)), un dominio transmembrana de alrededor de 26 aminoácidos (residuos de aminoácidos desde alrededor del 47 hasta alrededor del 72 en la FIG 1 (SEQ ID NO:2)), un dominio extracelular de alrededor de 213 aminoácidos (residuos de aminoácidos desde alrededor del 73 hasta alrededor del 285 en la Figura 1 (SEQ ID NO:2)); y un peso molecular deducido de alrededor de 31 kDa. La proteína Neutroquina-\alpha mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:2) tiene una similitud de alrededor del 20% y es idéntica en un 10% al TNF-\alpha, al que puede accederse en el GenBank con el Nº de Acceso 339764.

Como cualquier experto normal podrá apreciar, debido a las posibilidades de error de secuencia discutidas previamente, el polipéptido Neutroquina-\alpha completo real, codificado por el cDNA depositado, que contiene alrededor de 285 aminoácidos, puede de alguna forma ser más corto. En particular, la secuencia determinada de Neutroquina-\alpha contiene un segundo codón de metionina, que puede servir como un codón de iniciación alternativo para la tradución del marco de lectura abierta, en los nucleótidos de las posiciones 210-213 en la Figura 1 (SEQ ID NO:1). Más generalmente, el marco de lectura abierta real puede estar en cualquier lugar en el intervalo de \pm20 aminoácidos, más preferiblemente en el intervalo de \pm10 aminoácidos, del predicho del primer o del segundo codón de metionina del extremo N mostrado en la Figura 1 (SEQ ID NO:1). Será además apreciado que, dependiendo de los criterios analíticos utilizados para identificar varios dominios funcionales, la "dirección" exacta de los dominios extracelular, intracelular y transmembrana del polipéptido Neutroquina-\alpha pueden diferir levemente. Por ejemplo, la localización exacta del dominio extracelular de la Neutroquina-\alpha en la Figura 1 (SEQ ID NO:2), puede variar levemente (por ejemplo, la dirección puede "moverse" alrededor de 1 a 20 residuos, más probablemente desde alrededor de 1 hasta alrededor de 5 residuos), dependiendo de los criterios utilizados para definir el dominio. En este caso, los extremos del dominio transmembrana y el comienzo del dominio extracelular se predecirán sobre la base de la identificación de la secuencia de aminoácidos hidrófoba en las posiciones indicadas anteriormente, como se muestra en la Figura 3. En cualquier evento, como se discutió mejor anteriormente, la invención además proporciona polipéptidos que tienen varios residuos deleccionados del extremo N del polipéptido completo, incluyendo polipéptidos que carecen de uno o más aminoácidos del extremo N del dominio extracelular aquí descrito, que constituyen formas solubles del dominio extracelular de la proteína Neutroquina-\alpha, sin embargo, retienen la actividad de Neutroquina-\alpha.

Como se ha indicado, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en forma de RNA, tal como mRNA, o en forma de DNA, incluyendo por ejemplo, cDNA y DNA genómico obtenido mediante clonación u obtenido sintéticamente. El DNA puede ser de doble cadena o de cadena única. El DNA de cadena única o el RNA pueden ser la hebra codificadora, también conocida como la hebra en sentido, o pueden ser la hebra no codificadora, también denominada hebra en anti-sentido.

Mediante molécula(s) de ácido nucleico "aislada(s)", se entiende una molécula de ácido nucleico, DNA o RNA, que se ha extraído de su ambiente natural. Por ejemplo, las moléculas de DNA recombinantes contenidas en un vector se consideran aisladas para los propósitos de la presente invención. Más ejemplos de moléculas de DNA aisladas incluyen moléculas de DNA recombinante mantenidas en células hospedantes heterólogas o moléculas de DNA purificadas (parcialmente o sustancialmente), en solución. Las moléculas de RNA aisladas incluyen, trascritos de RNA in vivo o in vitro de las moléculas de DNA de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico aisladas según la presente invención también incluyen las mismas moléculas producidas sintéticamente.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención incluyen moléculas de DNA que contienen un marco de lectura abierta (ORF) con un codón de iniciación en las posiciones 147-149 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1). Además, las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen moléculas de DNA que contienen una secuencia sustancialmente diferente de las descritas anteriormente pero que, debido a la degeneración del código genético, todavía codifican la proteína Neutroquina-\alpha. Por supuesto, el código genético es bien conocido en la técnica. Así, será rutinario para cualquier experto en la técnica generar las variantes degeneradas descritas anteriormente. En otro aspecto, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido Neutroquina-\alpha que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por el cDNA contenido en el plásmido depositado el 22 de octubre de 1996. Preferiblemente, esta molécula de ácido nucleico comprenderá una secuencia que codifica el dominio extracelular del polipéptido codificado por el clon de cDNA depositado descrito anteriormente.

La invención además proporciona una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1), o la secuencia de nucleótidos del cDNA de la Neutroquina-\alpha, contenida en clon depositado descrito anteriormente, o una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria a una de las secuencias anteriores. Dichas moléculas, particularmente las moléculas de DNA, son útiles como sondas para mapeo genético, mediante hibridación in situ con cromosomas, y para detectar la expresión del gen de la Neutroquina-\alpha en tejido humano, por ejemplo, mediante análisis de Northern blot.

La presente invención se dirige además a moléculas de ácido nucleico que codifican partes de las secuencias de nucleótidos descritas aquí, así como a fragmentos de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas aquí, donde dichas partes o fragmentos codifican un polipéptido que tiene actividad de Neutroquina-\alpha. En particular, la invención proporciona un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que representa la parte de la SEQ ID NO:1 que consiste en las posiciones 1-1001 de la SEQ ID NO:1.

Más generalmente, por un fragmento de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos del cDNA depositado, o la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1), se entiende fragmentos de al menos alrededor de 15 nt, y más preferiblemente al menos de alrededor de 20 nt, todavía más preferiblemente al menos de alrededor de 30 nt, e incluso todavía más preferiblemente, al menos alrededor de 40 nt de longitud, que son útiles como sondas y cebadores diagnósticos, como se ha discutido aquí. Por supuesto, fragmentos mayores, de 50-300 nt de longitud son también útiles según la presente invención, como son los fragmentos correspondientes a la mayoría, si no a todas, las secuencias de nucleótidos del cDNA depositado o como la mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1). Por un fragmento de al menos 20 nt de longitud, por ejemplo, se entienden fragmentos que incluyen 20 o más bases contiguas de la secuencia de nucleótidos del cDNA depositado, o de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1).

En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que contiene un polinucleótido que se hibrida, bajo condiciones de hibridación astringentes, con una parte del polinucleótido en una molécula de ácido nucleico de la invención descrita anteriormente, por ejemplo, el clon de cDNA contenido en el ATCC Nº 97768 depositado el 22 de octubre de 1996, y que codifica un polipéptido que tiene actividad de Neutroquina-\alpha. Por "condiciones de hibridación astringentes" se entiende incubación durante la noche a 42ºC en una solución que contiene formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico (pH 7,6) 50 mM, 5 x solución de Denhardt's, sulfato de dextrano al 10%, y 20 \mug/ml de esperma de salmón desnaturalizado, cortado, seguido de lavado de los filtros en 0,1 x SSC a alrededor de 65ºC.

Por un polinucleótido que se hibrida con una "parte" de un polinucleótido, se entiende un polinucleótido (cualquiera de DNA o RNA), que se hibrida al menos con alrededor de 15 nucleótidos (nt), y más preferiblemente al menos alrededor de 20 nt, todavía más preferiblemente alrededor de 30-70 (por ejemplo 50) nt del polinucleótido de referencia. Éstos son útiles como sondas y cebadores diagnósticos, como se ha discutido anteriormente, y se discutirá en más detalle más adelante.

Por una parte de un polinucleótido de "al menos 20 nt de longitud", por ejemplo, se entiende 20 o más nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de referencia (por ejemplo, del cDNA depositado, o de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1)). Por supuesto, un polinucleótido que se hibrida solo con una secuencia de poli A (tal como el tracto de poli(A) del extremo 3' del cDNA de la Neutroquina-\alpha mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1)), o con el tracto complementario de residuos T (o U), no será incluido en un polinucleótido de la invención, utilizado para hibridar a una parte del ácido nucleico de la invención, ya que dicho polinucleótido se hibridará con cualquier molécula de ácido nucleico que contenga un tracto de poli (A) o su complementario (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de cDNA de doble cadena).

Como se ha indicado, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que codifican el polipéptido Neutroquina-\alpha pueden incluir, pero no se limitan a aquellas que codifican secuencias de aminoácidos del dominio extracelular del polipéptido y a secuencias adicionales, tales como las que codifican las secuencias de los dominios intracelular y transmembrana, o una secuencia de pre-, o pro-, o prepro-proteína; la secuencia de codificación del dominio extracelular del polipéptido, con o sin las secuencias de codificación adicionales mencionadas previamente.

También codificadas por los ácidos nucleicos de la invención son las secuencias de las proteínas anteriores, junto con secuencias adicionales, no codificantes, incluyendo por ejemplo, pero no limitándose a intrones y secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como las secuencias trascritas, no traducidas, que juegan un papel en la trascripción, el procesamiento del mRNA, incluyendo las señales de empalme y poliadenilación, por ejemplo la unión a ribosomas y la estabilidad del mRNA; y secuencias codificantes adicionales que codifican aminoácidos adicionales, tales como los que proporcionan funcionalidades adicionales.

Así, la secuencia de codificación del polipéptido puede fusionarse a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un péptido que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido hexa-histidina, tal como el marcador proporcionado en el vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como está descrito en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina permite la purificación conveniente de la proteína de fusión. El marcador "HA" es otro péptido útil para la purificación, que corresponde a un epítopo derivado de la proteína de hemaglutinación de la influenza, que ha sido descrito por Wilson et al., Cell 37:767 (1984). Como se discutirá más adelante, otras proteínas de fusión incluyen la Neutroquina-\alpha fusionada al Fc en el extremo N o el C.

Polinucleótidos variantes y mutantes

La presente invención además se refiere a variantes de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, que codifican partes, análogos o derivados de la proteína Neutroquina-\alpha que tienen actividad de Neutroquina-\alpha. Las variantes pueden ocurrir naturalmente, tales como las variantes alélicas naturales. Por una "variante alélica" se entiende una de las varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo. Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New Cork (1985). Las variantes que no ocurren naturalmente pueden producirse utilizando técnicas conocidas en la técnica de mutagénesis.

Tales variantes incluyen las producidas mediante sustituciones, delecciones o adiciones de nucleótidos. Las sustituciones, delecciones o adiciones pueden implicar a uno o más nucleótidos. Las variantes pueden estar alteradas en las regiones de codificación, las regiones de no codificación, o ambas. Las alteraciones en las regiones de codificación pueden producir sustituciones, delecciones o adiciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras. Especialmente preferidas entre éstas son las sustituciones, delecciones o adiciones silentes, que no alteran las propiedades y actividades de la proteína Neutroquina-\alpha o de sus partes. También especialmente preferidas en este aspecto son las sustituciones conservadoras.

Más altamente preferidas son las moléculas de ácido nucleico que codifican el dominio extracelular de la proteína que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:2), o el dominio extracelular de la secuencia de aminoácidos de la Neutroquina-\alpha, codificada por el clon de cDNA depositado. Más realizaciones incluyen una molécula de ácido nucleico que contiene un polinucleótido, que tiene una secuencia de nucleótidos idéntica al menos en un 90%, y más preferiblemente idéntica al menos en un 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido Neutroquina-\alpha, que tiene la secuencia de aminoácidos completa de la Figura 1 (SEQ ID NO:2); (b) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio extracelular predicho del polipéptido Neutroquina-\alpha, que tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones 73-285 en la Figura 1 (SEQ ID NO:2); (c) una secuencia de nucleótidos que codifica el polpéptido Neutroquina-\alpha, que tiene la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA contenido en el ATCC Nº 97768, depositado el 22 de octubre de 1996; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio extracelular del polipéptido Neutroquina-\alpha, que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA contenido en el ATCC Nº 97768, depositado el 22 de octubre de 1996; y (e) una secuencia de nucleótidos complementaria a la longitud completa de cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b), (c) o (d) anteriores.

Por un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos "idéntica" al menos en un 95% a la secuencia de nucleótidos de referencia, que codifica un polipéptido Neutroquina-\alpha, se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia del polinucleótido puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica el polipéptido Neutroquina-\alpha. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos idéntica al menos en un 95% a la secuencia de nucleótidos de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden deleccionarse o sustituirse con otro nucleótido, o un número de nucleótidos de hasta el 5% del total de nucleótidos en la secuencia de referencia pueden ser insertados en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones de los extremos 3' o 5' de la secuencia de nucleótidos de referencia, o en cualquier lugar entre esas dos posiciones terminales, intercaladas individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

De forma práctica, si cualquier molécula particular de ácido nucleico es idéntica al menos en un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% a, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1, o a la secuencia de nucleótidos del clon de cDNA depositado, puede determinarse convencionalmente utilizando programas informáticos conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Análisis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). El programa Bestfit utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se utiliza Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, idéntica en un 95% a una secuencia de referencia según la presente invención, los parámetros se establecen, por supuesto, de tal forma, que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia, y se permiten fallos en la homología de hasta el 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia.

La presente solicitud se dirige a moléculas de ácido nucleico idénticas en al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% a la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1), o a la secuencia de ácidos nucleicos del cDNA depositado, que codifica un polipéptido que tiene actividad de Neutroquina-\alpha. Incluso donde una molécula de ácido nucleico particular no codifica un polipéptido que tiene actividad de Neutroquina-\alpha, cualquier experto en la técnica todavía sabrá como utilizar la molécula de ácido nucleico, por ejemplo, como sonda de hibridación o como cebador para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los usos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no codifican un polipéptido que tiene actividad de Neutroquina-\alpha incluyen, entre otros, (1) aislamiento del gen de la Neutroquina-\alpha, o sus variantes alélicas en una biblioteca de cDNA; (2) hibridación in situ (por ejemplo "FISH") con preparaciones de cromosomas en metafase, para proporcionar la localización cromosómica precisa del gen de la Neutroquina-\alpha, como está descrito en Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); y análisis Northern Blot para la detección de la expresión de mRNA de Neutroquina-\alpha en tejidos específicos.

Preferidas, sin embargo, son las moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias idénticas en al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% a la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1), o a la secuencia de ácido nucleico del cDNA depositado, que de hecho codifican un polipéptido que tiene actividad de proteína Neutroquina-\alpha. Por "un polipéptido que tiene actividad de Neutroquina-\alpha", se entiende polipéptidos que exhiben actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad del dominio extracelular o de la proteína Neutroquina-\alpha de longitud completa de la invención, medido en un ensayo biológico particular. Por ejemplo, la proteína Neutroquina-\alpha de la presente invención modula la proliferación celular, la citotoxicidad y la muerte celular. Puede llevarse a cabo un ensayo in vitro de proliferación celular, citotoxicidad y muerte celular, para medir el efecto de una proteína sobre ciertas células, utilizando reactivos bien conocidos y habitualmente disponibles en la técnica, para la detección de replicación y/o muerte celular. Por ejemplo, numerosos de dichos ensayos para las actividades de las proteínas relacionadas con TNF, se describen en las diversas referencias en la sección de Antecedentes de este documento, arriba. Brevemente, dichos ensayos incluyen recolectar células humanas o animales (por ejemplo, de ratón), y mezclarlas con (1) sobrenadante de células hospedantes trasfectadas, que contiene proteína Neutroquina-\alpha (o un polipéptido candidato) o (2) sobrenadante de células hospedantes de control no trasfectadas, y medir el efecto sobre el número de células o su viabilidad, después de incubación durante cierto periodo de tiempo. Tales actividades de modulación de la proliferación celular, como pueden medirse en este tipo de ensayos, son útiles para tratar tumores, metástasis de tumores, infecciones, enfermedades autoinmunes, inflamación y otras enfermedades relacionadas con la inmunidad.

La Neutroquina-\alpha modula la proliferación y la diferenciación celular de una forma dosis dependiente en los ensayos anteriormente descritos. Así, "un polipéptido que tiene actividad de proteína Neutroquina-\alpha", incluye polipéptidos que también exhiben cualquiera de las mismas actividades moduladoras de la célula (particularmente inmunomoduladoras), en los ensayos descritos anteriormente, de una forma dosis dependiente. Aunque el grado de actividad dosis dependiente no necesita ser idéntica a la de la proteína Neutroquina-\alpha, preferiblemente, "un polipéptido que tiene actividad de proteína Neutroquina-\alpha", exhibirá una dosis dependencia similar en una actividad dada, comparada con la proteína Neutroquina-\alpha (es decir, el polipéptido candidato exhibirá mayor actividad o no más de alrededor de 25 veces menos y, preferiblemente, no más de alrededor diez veces menos actividad relativa a la proteína Neutroquina-\alpha de referencia).

Como otros miembros de la familia de TNF, la Neutroquina-\alpha exhibe actividad sobre los leucocitos incluyendo por ejemplo monocitos, linfocitos y neutrófilos. Por esta razón, la Neutroquina-\alpha es activa en dirigir la proliferación, diferenciación y migración de este tipo de células. Tal actividad es útil para el aumento o la supresión inmune, mieloprotección, movilización de células progenitoras, control de inflamación aguda y crónica y tratamiento de la leucemia. Los ensayos para medir tal actividad son conocidas en la técnica. Por ejemplo, véase Peters et al., Immun. Today 17:273 (1996); Young et al., J. Exp. Med. 182:1111 (1995); Caux et al., Nature 390:258 (1992); y Santiago-Schwarz et al., Adv. Exp. Med, Biol. 378:7 (1995).

Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, cualquier experto en la técnica reconocerá inmediatamente que un gran número de las moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia idéntica en al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99%, a la secuencia de ácido nucleico del cDNA depositado o a la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1), codificará un polipéptido "que tiene actividad de proteína Neutroquina-\alpha". De hecho, como todas las variantes degeneradas de estas secuencias de nucleótidos codificarán el mismo polipéptido, esto estará claro para cualquier experto en la técnica, incluso sin llevar a cabo los ensayos de comparación descritos anteriormente. Será además reconocido en la técnica que, para tales moléculas de ácido nucleico que no son variantes degeneradas, un número razonable también codificará un polipéptido que tiene actividad de proteína Neutroquina-\alpha. Esto es porque cualquier experto se dará cuenta de las sustituciones de aminoácidos que afectan menos probablemente o no afectan significativamente la función de la proteína (por ejemplo, reemplazar un aminoácido alifático con un segundo aminoácido alifático), como se describirá mejor más adelante.

Vectores y Células Hospedantes

La presente invención también se refiere a vectores que incluyen las moléculas de DNA de la presente invención, a células hospedantes que se han modificado genéticamente con los vectores recombinantes, y a la producción de polipétidos Neutroquina-\alpha o sus fragmentos mediante técnicas recombinantes. El vector puede ser, por ejemplo un fago, un plásmido, o un vector viral o retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser competentes en replicación o defectuosos en replicación. En el último caso, la propagación viral generalmente ocurrirá solo en las células hospedantes complementarias. Los polinucleótidos pueden unirse a un vector que contiene un marcador seleccionable para la propagación en un hospedante. Generalmente, un vector plásmido se introduce en un precipitado, tal como precipitado de fosfato cálcico, o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, puede empaquetarse in vitro utilizando una línea celular de empaquetamiento apropiada, y después traspasarse a las células hospedantes.

El inserto de DNA deberá ligarse operativamente a un promotor apropiado, tal como el promotor PL del fago lambda, los promotores lac, trp, phoA y tac de E. coli, los promotores precoz y tardío del SV40, y promotores de LTRs virales, por nombrar algunos. Otros promotores adecuados serán conocidos por los expertos en la técnica. Las construcciones de expresión contendrían además lugares para la iniciación de la trascripción, la terminación y, en la región trascrita, un lugar de unión a ribosoma para tradución. La parte de codificación del dominio extracelular de los trascritos expresada por las construcciones, incluirá preferiblemente un codón de iniciación de la tradución al comienzo, y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG), posicionado apropiadamente al final del polipéptido que se está traduciendo.

Como se ha indicado, los vectores de expresión incluirán preferiblemente al menos un marcador seleccionable. Tales marcadores incluyen dihidrofolato reductasa, resistencia a G418 o a neomicina, para cultivo en células eucariotas, y genes de resistencia a tetraciclina, kanamicina o ampicilina para cultivo de E. coli y otras bacterias. Ejemplos representativos de hospedantes apropiados incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas, tales como E. coli, célula de Streptomyces y de Salmonella typhimurium; células de hongos, tales como células de levadura, células de insecto, tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como células CHO, COS, 293, y células de melanoma Bowes; y células de plantas. Los medios de cultivo y las condiciones apropiados para las células hospedantes descritas anteriormente son bien conocidos en la técnica.

Entre los vectores preferidos para utilizar en bacterias se incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles de QIAGEN, Inc., arriba; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles de Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, disponibles de Pharmacia. Entre los vectores eucarióticos preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG, disponibles de Pharmacia. Otros vectores adecuados serán aparentes para los expertos en la técnica.

La introducción de las construcciones en las células hospedantes puede efectuarse mediante transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípido catiónico, electroporación, transducción, infección u otros métodos. Tales métodos están descritos en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986).

El polipéptido puede expresarse de una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no solo señales de secreción, sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Por ejemplo, puede añadirse una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, al extremo N del polipéptido, para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula hospedante, durante la purificación, o durante el posterior manejo y almacenamiento. También pueden añadirse restos de péptidos al polipéptido, para facilitar la purificación. Tales regiones pueden eliminarse antes de la preparación final del polipéptido. La adición de restos de péptidos a los polipéptidos para producir secreción o excreción, para mejorar la estabilidad y para facilitar la purificación, entre otras, son técnicas familiares y rutinarias en la técnica. Una proteína de fusión preferida comprende una región heteróloga de una inmunoglobulina que es útil para estabilizar y purificar proteínas. Por ejemplo, el Documento EP-A-O 464 533 (Contrapartida Canadiense 2045869), describe proteínas de fusión que comprenden varias partes de la región constante de las moléculas de inmunoglobulina, junto con otra proteína humana o una de sus partes. En muchos casos, la parte Fc en una proteína de fusión es claramente ventajosa para utilizar en terapia y diagnóstico y de esta forma, da como resultado, por ejemplo, una mejora en las propiedades farmacocinéticas (Documento EP-A- 0232 262). Por otro lado, para algunos usos sería deseable ser capaz de eliminar la parte Fc después de que la proteína de fusión se ha expresado, detectado y purificado de la forma ventajosa descrita. Este es el caso cuando la parte Fc prueba ser un obstáculo para su utilización en terapia y diagnóstico, por ejemplo cuando la proteína de fusión va a utilizarse como antígeno para inmunización. En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, proteínas humanas tales como hIL-5 se han fusionado con partes Fc, con el propósito de tener ensayos de cribado de alto rendimiento para identificar antagonistas de hIL-5. Véase D.
Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995) y K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995).

La proteína Neutroquina-\alpha puede ser recuperada y purificada de cultivos celulares recombinantes mediante métodos bien conocidos, incluyendo la precipitación con sulfato amónico o con etanol, la extracción ácida, la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, la cromatografía de interacción hidrófoba, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de hidroxiapatita y la cromatografía de lectina. Más preferiblemente, se emplea cromatografía de alta resolución ("HPLC") para la purificación. Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos purificados naturalmente, productos de procedimientos sintéticos químicos, y productos producidos mediante técnicas recombinantes en hospedantes procarióticos y eucarióticos, incluyendo, por ejemplo, células de bacterias, levaduras, plantas más evolucionadas, insectos o mamíferos. Dependiendo del hospedante empleado en el procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados o pueden ser no glicosilados. Además, los polipéptidos de la invención pueden también incluir un residuo de metionina modificada inicial, en algunos casos como resultado de los procesos mediados por el hospedante.

Polipéptidos y fragmentos de Neutroquina-\alpha

La invención además proporciona un polipéptido Neutroquina-\alpha que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el cDNA depositado, o la secuencia de aminoácidos de la Figura 1 (SEQ ID NO:2), o un péptido o polipéptido que contiene una parte de los polipéptidos anteriores, que tienen actividad de Neutroquina-\alpha.

Polipéptidos variantes y mutantes

Para mejorar o alterar las características de los polipéptidos Neutroquina-\alpha, puede emplearse ingeniería de proteínas. La tecnología de DNA recombinante conocida por los expertos en la técnica, puede utilizarse para crear nuevas proteínas mutantes o "muteínas", incluyendo sustituciones, delecciones o sustituciones de uno o múltiples aminoácidos, o proteínas de fusión. Tales polipéptidos modificados pueden mostrar, por ejemplo, actividad aumentada o estabilidad aumentada. Además, pueden purificarse con altos rendimientos y muestran mejor solubilidad que el polipéptido natural correspondiente, al menos bajo ciertas condiciones de purificación y almacenamiento.

Mutantes de delección N-terminal y C-terminal

Por ejemplo, para muchas proteínas, incluyendo el dominio extracelular o la(s) forma(s) madura(s) de la proteína secretada, es conocido en la técnica que pueden eliminarse uno o más aminoácidos del extremo N o del extremo C, sin pérdida sustancial de la función biológica. Por ejemplo, Ron et al., J. Biol. Chem. 268:2984-2988 (1993), describieron proteínas KGF modificadas, que tenían actividad de unión a heparina incluso si los residuos de aminoácidos aminoterminales 3, 8 ó 27 estaban ausentes.

En el presente caso, como la proteína de la invención es un miembro de la familia de polipétidos de TNF, las delecciones de los aminoácidos N-terminales hasta el residuo Gly (G) en la posición 191 en la Figura 1 (SEQ ID NO:2), pueden retener alguna actividad biológica tal como la citotoxicidad en células diana apropiadas. No se esperaría que los polipéptidos que tienen más delecciones N-terminales incluyendo el residuo Gly (G), retengan tales actividades biológicas, porque se sabe que este residuo, en los polipéptidos relacionados con TNF, está en el comienzo del dominio conservado requerido para las actividades biológicas. Sin embargo, incluso si la delección de uno o más aminoácidos del extremo N de una proteína da como resultado la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, todavía pueden retenerse otras actividades biológicas. Así, la capacidad de la proteína acortada para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconocen la proteína completa o el dominio extracelular de la proteína, será generalmente retenida cuando menos de la mayoría de los residuos de la proteína completa o del dominio extracelular de la proteína se eliminan del extremo N. Si un polipéptido particular que carece de residuos N-terminales de una proteína completa retiene tales actividades inmunológicas, puede determinarse fácilmente mediante métodos de rutina descritos aquí y por otro lado bien conocidos en la técnica.

Según esto, la presente invención además proporciona polipéptidos que tienen uno o más residuos del extremo amino de la secuencia de aminoácidos de la Neutroquina-\alpha mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:2), hasta el residuo Gly191 del extremo amino, y los polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. En particular, la presente invención proporciona polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de los residuos n-285 de la SEQ ID NO:2, donde n es un número entero en el intervalo de 2-190, y 191 es la posición del primer residuo del extremo N del polipéptido Neutroquina-\alpha completo (mostrado en la SEQ ID NO:2), que se cree que es requerido para la actividad de la proteína Neutroquina-\alpha. Más en particular, la invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de los residuos 2-285, 3-285, 4-285, 5-285, 6-285, 7-285, 8-285, 9-285, 10-285, 11-285, 12-285, 13-285, 14-285, 15-285, 16-285, 17-285, 18-285, 19-285, 20-285, 21-285, 22-285, 23-285, 24-285, 25-285, 26-285, 27-285, 28-285, 29-285, 30-285, 31-285, 32-285, 33-285, 34-285, 35-285, 36-285, 37-285, 38-285, 39-285, 40-285, 41-285, 42-285, 43-285, 44-285, 45-285, 46-285, 47-285, 48-285, 49-285, 50-285, 51-285, 52-285, 53-285, 54-285, 55-285, 56-285, 57-285, 58-285, 59-285, 60-285, 61-285, 62-285, 63-285, 64-285, 65-285, 66-285, 67-285, 68-285, 69-285, 70-285, 71-285, 72-285, 73-285, 74-285, 75-285, 76-285, 77-285, 78-285, 79-285, 80-285, 81-285, 82-285, 83-285, 84-285, 85-285, 86-285, 87-285, 88-285, 89-285, 90-285, 91-285, 92-285, 93-285, 94-285, 95-285, 96-285, 97-285, 98-285, 99-285, 100-285, 101-285, 102-285, 103-285, 104-285, 105-285, 106-285, 107-285, 108-285, 109-285, 110-285, 111-285, 112-285, 113-285, 114-285, 115-285, 116-285, 117-285, 118-285, 119-285, 120-285, 121-285, 122-285, 123-285, 124-285, 125-285, 126-285, 127-285, 128-285, 129-285, 130-285, 131-285, 132-285, 133-285, 134-285, 135-285, 136-285, 137-285, 138-285, 139-285, 140-285, 141-285, 142-285, 143-285, 144-285, 145-285, 146-285, 147-285, 148-285, 149-285, 150-285, 151-285, 151-285, 153-285, 154-285, 155-285, 156-285, 157-285, 158-285, 159-285, 159-285, 160-285, 161-285, 162-285, 163-285, 164-285, 165-285, 166-285, 167-285, 168-285, 169-285, 170-285, 171-285, 172-285, 173-285, 174-285, 175-285, 176-285, 177-285, 178-285, 179-285, 180-285, 181-285, 182-285, 183-285, 184-285, 185-285, 186-285, 187-285, 188-285, 189-285, 190-285, de la SEQ ID NO:2. También se proporcionan los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos.

De forma similar, se conocen muchos ejemplos de muteínas de delección del extremo C biológicamente funcionales. Por ejemplo, el Interferón gamma muestra hasta diez veces mayor actividad mediante la delección de los 8-10 residuos de aminoácidos del extremo carboxilo de la proteína (Döbeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988). Como la presente proteína es un miembro de la familia de polipéptidos del TNF, se espera que las delecciones de aminoácidos C-terminales hasta la Leu en la posición 284, retengan la mayoría, si no toda la actividad biológica, tal como la unión al receptor y la modulación de la replicación celular. Los polipéptidos que tienen deleciones de hasta alrededor de 10 residuos C-terminales adicionales (es decir, hasta el residuo Gly en la posición 273), también pueden retener alguna actividad, tal como la unión al receptor, aunque dichos polipéptidos carecerían de una parte del dominio conservado de TNF que comienza alrededor de la Leu284. Sin embargo, incluso si la delección de uno o más aminoácidos del extremo C de una proteína da como resultado la modificación o la pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, pueden retenerse aún otras actividades biológicas. Así, la capacidad de las proteínas acortadas para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconocen la proteína completa o madura, serán retenidos cuando menos de la mayoría de los residuos de la proteína completa o madura se eliminen del extremo C. Si un polipéptido particular que carece de los residuos C-terminales de una proteína completa retiene tales actividades inmunológicas, puede determinarse fácilmente mediante métodos de rutina descritos aquí y por otra parte conocidos en la técnica.

Según esto, la presente invención además proporciona polipéptidos que tienen uno o más residuos del extremo carboxilo de la secuencia de aminoácidos de la Neutroquina-\alpha mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:2), hasta el residuo Gly274 desde el extremo carboxilo, y los polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. En particular, la presente invención proporciona polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de los residuos 1-m de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, donde m es cualquier número entero en el intervalo entre 274 y 284. Más en particular, la invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos de los residuos 1-274, 1-275, 1-276, 1-277, 1-278, 1-279, 1-280, 1-281, 1-282, 1-283 y 1-284 de la SEQ ID NO:2. También se proporcionan los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos.

También se proporcionan polipéptidos que tienen uno o más aminoácidos deleccionados de ambos extremos amino y carboxilo, que pueden ser descritos generalmente como que tienen los residuos n-m de la SEQ ID NO:2, donde n y m son números enteros como los descritos anteriormente. También se incluyen secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que consiste en una parte de la secuencia de aminoácidos completa de la Neutroquina-\alpha, codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito ATCC del 22 de octubre de 1996, donde esta parte excluye del aminoácido 1 al 190 del extremo amino o desde el aminoácido 1 al 11 del extremo C de la secuencia de aminoácidos completa (o cualquier combinación de estas delecciones N-terminales o C-terminales), codificada por el clon de cDNA en el clon depositado. También se proporcionan los polinucleótidos codificados por todos los polipéptidos de delección anteriores.

Otros mutantes

Además de las formas de delección terminal de la proteína discutidas anteriormente, se reconocerá por cualquier experto en la técnica, que algunas secuencias de aminoácidos del polipéptido Neutroquina-\alpha pueden variar sin efecto significativo en la estructura o función de la proteína. Si tales diferencias en secuencia se contemplan, deberá recordarse que habrá áreas críticas en la proteína que determinarán su actividad.

Así, la invención además incluye variaciones del polipéptido Neutroquina-\alpha que muestran actividad sustancial del polipéptido Neutroquina-\alpha, o que incluyen regiones de la proteína Neutroquina-\alpha, tales como las partes discutidas más adelante. Tales mutantes incluyen delecciones, inserciones, inversiones, repeticiones y tipos de sustituciones seleccionadas según las reglas generales conocidas en la técnica, de tal forma que tienen un efecto pequeño sobre la actividad. Por ejemplo, se proporcionan guías concernientes a como hacer sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silentes en Bowie, J.U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247:1306-1310 (1990), donde los autores indican que hay dos formas principales de aproximación al estudio de la tolerancia de una secuencia de aminoácidos a cambiar. El primer método tiene su base en el proceso de la evolución, en el que las mutaciones son tanto aceptadas como rechazadas mediante selección natural. La segunda aproximación utiliza la ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado, y selecciona o criba para identificar secuencias que mantienen la funcionalidad.

Como establecen los autores, estos estudios han revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a las sustituciones de aminoácidos. Los autores además indican qué tipo de cambios de aminoácidos son probablemente permisivos en determinadas posiciones de la proteína. Por ejemplo, la mayoría de los residuos de aminoácidos ocultos requieren cadenas laterales no polares, mientras que pocos hechos de las cadenas laterales de superficie están generalmente conservados. Otras de dichas sustituciones fenotípicamente silentes están descritas en Bowie, J.U. et al., arriba, y en las referencias allí citadas. Típicamente vistas como sustituciones conservadoras son los reemplazos, uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Ile; el intercambio de los residuos de Ser y Thr, el intercambio de los residuos ácidos de Asp y Glu. La sustitución entre los residuos amida de Asn y Gln, el intercambio de los residuos básicos de Lys y Arg, y el reemplazo entre los residuos aromáticos de Phe, Tyr.

Así, el fragmento, derivado o análogo del polipéptido que tiene actividad de Neutroquina-\alpha de la Figura 1 (SEQ ID NO:2), o el codificado por el cDNA depositado, puede ser (i) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácido conservado), y tal residuo de aminoácido sustituido puede ser o puede no ser uno codificado por el código genético, o (ii) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácidos incluyen un grupo sustituto, o (iii) uno en el que el dominio extracelular del polipéptido está fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (por ejemplo polietilén-glicol), o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales están fusionados al dominio extracelular del polipéptido, tal como un péptido de región de fusión IgG Fc, o una secuencia líder o secretora, o una secuencia que se emplea para la purificación del dominio extracelular del polipéptido, o una secuencia de pro-proteína. Tales fragmentos, derivados o análogos están completamente incluidos dentro del alcance de todos los expertos en la técnica, a partir de las enseñanzas aquí incluidas.

Así, la Neutroquina-\alpha de la presente invención puede incluir una o más sustituciones, delecciones o inserciones de aminoácidos, procedentes tanto de mutaciones naturales como de manipulación humana. Como se ha indicado, los cambios son preferiblemente de naturaleza menor, tal como sustituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente al plegamiento o la actividad de la proteína (véase Tabla 1).

TABLA 1 Sustituciones de aminoácidos conservadoras

Aromáticos	Fenilalanina
	Triptófano
	Tirosina
Hidrófobos	Leucina
	Isoleucina
	Valina
Polares	Glutamina
	Asparagina
Básicos	Arginina
	Lisina
	Histidina
Ácidos	Ácido Aspártico
	Ácido Glutámico
Pequeños	Alanina
	Serina
	Treonina
	Metionina
	Glicina

Los aminoácidos de la proteína Neutroquina-\alpha de la presente invención que son esenciales para la función, pueden identificarse por métodos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida a un lugar o la mutagénesis mediante escanéo de alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)). El último procedimiento introduce mutaciones de alanina únicas en cada residuo en la molécula. Las moléculas mutantes resultantes son después ensayadas para alguna actividad biológica, tal como la unión a receptor o la actividad proliferativa in vivo o in vitro.

De especial interés son las sustituciones de aminoácidos cargados por otros aminoácidos cargados o neutros, que pueden producir proteínas con características mejoradas altamente deseables, tales como menor agregación. La agregación puede no solo reducir la actividad, sino también ser problemática cuando se preparan formulaciones farmacéuticas, porque los agregados pueden ser inmunogenéticos (Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36:838-845 (1987); Cleland et al., Crit Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993).

El reemplazo de aminoácidos también puede cambiar la selectividad de la unión de un ligando a los receptores de la superficie celular. Por ejemplo, Ostade et al., Nature 361:266-268 (1993) describen ciertas mutaciones que dan como resultado la unión selectiva del TNF-\alpha a solamente uno de los dos tipos de receptores de TNF conocidos. Como la Neutroquina-\alpha es un miembro de la familia de polipéptidos de TNF, es probable que las mutaciones similares a las de TNF-\alpha tengan efectos similares sobre la Neutroquina-\alpha.

Lugares que son críticos para la unión ligando-receptor pueden determinarse también mediante análisis estructural tal como cristalización, resonancia magnética nuclear o marcaje de fotoafinidad (Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992), y de Vos et al., Science 255:306-312 (1992)). Como la Neutroquina-\alpha es un miembro de la familia de proteínas relacionada con el TNF, para modular, más que para eliminar completamente las actividades biológicas de la Neutroquina-\alpha, preferiblemente las mutaciones se hacen en secuencias que codifican aminoácidos en el dominio conservado de TNF, es decir, en las posiciones 191-284 de la Figura 1 (SEQ ID NO:2), más preferiblemente en residuos dentro de esta región que no están conservados en todos los miembros de la familia del TGF. Haciendo mutaciones específicas en la Neutroquina-\alpha en la posición en las que un determinado aminoácido conservado se encuentra típicamente en las proteínas relacionadas con TNF, la Neutroquina-\alpha actuará como un antagonista, poseyendo así actividad angiogénica. Según esto, los polipéptidos de la presente invención incluyen mutantes de la Neutroquina-\alpha. Tales mutantes de la Neutroquina-\alpha están comprendidos en la secuencia de longitud completa, o preferiblemente en el dominio extracelular de la secuencia de aminoácidos de la Neutroquina-\alpha mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:2). También forman parte de la presente invención, los polinucleótidos aislados que comprender secuencias de ácidos nucleicos que codifican los mutantes de la Neutroquina-\alpha anteriores.

Los polipéptidos de la presente invención se proporcionan preferiblemente de forma aislada, y preferiblemente están sustancialmente purificados. Una versión producida de forma recombinante del polipéptido Neutroquina-\alpha, pueden estar sustancialmente purificados mediante el método de una etapa descrita en Smith y Jonson, Gene 67:31-40 (1988).

Los polipéptidos de la presente invención incluyen el polipéptido completo codificado por el cDNA depositado, incluyendo los dominios intracelular, transmembrana y extracelular del polipéptido codificado por el cDNA depositado, el dominio extracelular menos los dominios intracelular y trasmembrana de la proteína, el polipéptido completo de la Figura 1 (SEQ ID NO:2), el dominio extracelular de la Figura 1 (SEQ ID NO:2) menos los dominios intracelular y trasmembrana, así como polipéptidos que tienen una similitud de al menos el 95% y todavía más preferiblemente una similitud de al menos el 96%, 97%, 98% ó 99% de los descritos anteriormente.

Por "% de similitud" para dos polipéptidos, se entiende una puntuación de similitud producida por comparación de las secuencias de aminoácidos de los dos polipéptidos, utilizando el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Análisis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711), y ls establecimientos por defecto para determinar la similitud. El programa Bestfit utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2:482-489, 1981), para encontrar el mejor segmento de similitud entre dos secuencias.

Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos "idéntica" al menos en, por ejemplo, un 95% a una secuencia de aminoácidos de referencia de un polipéptido Neutroquina-\alpha, se entiende que dicha secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia, excepto en que la secuencia del polipéptido puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 110 aminoácidos de los aminoácidos de referencia del polipéptido Neutroquina-\alpha. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 95% a la secuencia de aminoácidos de referencia, hasta el 5% de los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia pueden deleccionarse o sustituirse con otro aminoácido, o un número de aminoácidos de hasta el 5% del total de los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia, pueden insertarse en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones amino o carboxilo terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia, o en cualquier lugar entre estas dos posiciones terminales, intercaladas tanto individualmente entre residuos en la secuencia de referencia, como en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

De forma práctica, si cualquier polipéptido particular es idéntico al menos en un 90%. 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:2), o a la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA depositado, puede determinarse convencionalmente utilizando programas informáticos conocidos, tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Análisis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Cuando se utiliza el programa Bestfit, o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, idéntica en un 95% a la secuencia de referencia según la presente invención, se establecen los parámetros, por supuesto, de tal forma, que el porcentaje de identidad se calcule sobre la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia, y se permiten fallos de homología hasta en un 5% del número total de residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia.

El polipéptido de la presente invención podría ser utilizado como marcador de peso molecular en geles de SDS-PAGE o en columnas de filtración en gel de cribado, utilizando métodos bien conocidos en la técnica.

Como se describirá en detalle más adelante, los polipéptidos de la presente invención también pueden utilizarse para producir anticuerpos policlonales y monoclonales, que son útiles en experimentos para detectar la expresión de la proteína Neutroquina-\alpha, como se describe más adelante, o como agonistas y antagonistas capaces de estimular o inhibir la función de la Neutroquina-\alpha. Además, tales polipéptidos pueden utilizarse en el sistema de dos híbridos de levadura, para "capturar" las proteínas de unión a la proteína Neutroquina-\alpha, que son también agonistas y antagonistas candidatos, según la presente invención. El sistema de dos híbridos de levadura está descrito en Fields y Song, Nature 340:245-246 (1989).

Partes portadoras del epítopo

En otro aspecto, se describe un péptido o polipéptido que comprende una parte portadora del epítopo de un polipéptido de la invención. El epítopo de esta parte del polipéptido, es un epítopo inmunogénico o antigénico de un polipéptido de la invención. Un "epítopo inmunogénico" se define como una parte de una proteína que induce una respuesta de anticuerpos, cuando la proteína completa es el inmunógeno. Por otra parte, una región de una molécula de proteína a la cual puede unirse un anticuerpo, se define como "epítopo antigénico". El número de epítopos inmunogénicos de una proteína, generalmente es menor que el número de epítopos antigénicos. Véase, por ejemplo, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983).

En cuanto a la selección de péptidos o polipéptidos que portan un epítopo antigénico (es decir, que contiene una región de una molécula de proteína a la cual puede unirse un anticuerpo), es bien conocido en la técnica que los péptidos sintéticos relativamente cortos, que simulan parte de una secuencia de la proteína, son capaces de forma rutinaria de inducit la producción de un antisuero que reacciona con la proteína parcialmente simulada. Véase, por ejemplo, Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Green, N. y Learner, R.A. (1983) "Antibodies that react with predetermined sites and proteins", Science, 219:660-666. Los péptidos capaces de inducir un suero que reacciona contra la proteína, están frecuentemente representados en la secuencia primaria de la proteína, pueden caracterizarse por un conjunto de reglas químicas simples, y no están confinados a las regiones inmunodominantes de las proteínas intactas (es decir, epítopos inmunogénicos), ni a las amino y carboxilo terminales. Los péptidos y polipéptidos de la invención que portan epítopos antigénicos, son de esta forma útiles para estimular la producción de anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que se unen específicamente al polipéptido de la invención. Véase, por ejemplo, Wilson et al., Cell 37:767-778 (1984) en la 777.

Los péptidos y polipéptidos que portan epítopos antigénicos, preferiblemente contienen una secuencia de al menos siete, más preferiblemente al menos nueve y más preferiblemente entre desde alrededor de 15 hasta alrededor de 30 aminoácidos, contenidos dentro de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención. Ejemplos no limitantes de polipéptidos o péptidos antigénicos, que pueden utilizarse para generar anticuerpos específicos para Neutroquina-\alpha incluyen: un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos entre alrededor de Phe-115 hasta alrededor de Leu-147 en la Figura 1 (SEQ ID NO:2); un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos entre alrededor de Ile-150 hasta alrededor de Tyr-163 en la Figura 1 (SEQ ID NO:2); un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos entre alrededor de Ser-171 hasta alrededor de Phe-194 en la Figura 1 (SEQ ID NO:2); un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos desde alrededor de Glu-223 hasta alrededor de Tyr-247 en la Figura 1 (SEQ ID NO:2); un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido desde alrededor de Ser-271 hasta alrededor de Phe-278 en la Figura 1 (SEQ ID NO:2); Se ha determinado que estos fragmentos de polipéptido portan epítopos antigénicos de la proteína Neutroquina-\alpha, mediante el análisis del índice antigénico de Jameson-Wolf, como se muestra en la Figura 3, anteriormente.

Los péptidos y polipéptidos que portan epítopos pueden producirse por cualquier medio convencional. Véase, por ejemplo, Houghten, R.A. (1985) General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135; este proceso de "Síntesis de Péptidos Múltiples Simultánea (SMPS)" está mejor descrito en la Patente de EE. UU. Nº 4.631.211 de Houghten et al. 1986).

Los péptidos y polipéptidos que portan epítopos, se utilizan para inducir anticuerpos según métodos bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sutcliffe et al., arriba; Wilson et al., arriba; Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910-914; y Bittle, F.J., et al., J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985). Los péptidos que portan epítopos inmunogénicos, es decir, aquellas partes de una proteína que inducen una respuesta de anticuerpos cuando la proteína completa es el inmunógeno, se identifican según métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Geysen et al., arriba. Todavía además, la Patente de EE. UU. Nº 5.194.392 de Geysen (1990), describe un método general para detectar o determinar la secuencia de monómeros (aminoácidos u otros componentes), que es un equivalente topológico del epítopo (es decir, un "mimotopo"), que es complementario con un particular paratopo (lugar de unión al antígeno), de un anticuerpo de interés. Más generalmente, la Patente de EE. UU. Nº 4.433.092 de Geysen (1989) describe un método ara detectar o determinar una secuencia de monómeros que es un equivalente topográfica de un ligando, que es complementario al lugar de unión al ligando de un receptor particular de interés. Similarmente, la Patente de EE. UU. Nº 5.480.971, de Houghten, R.A. et al (1996) sobre Mezclas de Oligopéptidos Prealquilados, describe oligopéptidos prealquilados lineales C1-C7-alquilados, y conjuntos y bibliotecas de dichos pétidos, así como métodos para utilizar tales conjuntos y bibliotecas de dichos oligopéptidos para determinar la secuencia de un oligopéptido prealquilado que preferentemente se une a una molécula receptora de interés. Así, análogos no péptidos de los péptidos que portan epítopos de la invención, también pueden fabricarse rutinariamente con estos métodos.

Proteínas de fusión

Como cualquier experto en la técnica apreciará, los polipéptidos Neutroquina-\alpha de la presente invención y sus fragmentos que portan epítopos descritos anteriormente, pueden combinarse con partes del dominio constante de las inmunoglobulinas (IgG), dando como resultado polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y muestran una vida media aumentada in vivo. Esto ha sido demostrado, por ejemplo, para proteínas quiméricas que consisten en los dos primeros dominios del polipéptido CD4 humano, y varios dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de las inmunoglobulinas de mamíferos (Documento EP A 394.827; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)). Las proteínas de fusión que tienen una estructura dimérica ligada por puentes disulfuro debido a la parte IgG, también pueden ser más eficientes en la unión y neutralización de otras moléculas que la proteína Neutroquina-\alpha monomérica, o que solo un fragmento de la proteína (Fountoulakis et al., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)).

Diagnóstico de las enfermedades relacionadas con el sistema inmune

Los presentes inventores han descubierto que la Neutroquina-\alpha se expresa en varios tejidos, y particularmente en neutrófilos. Para un número de enfermedades relacionadas con el sistema inmune, pueden detectarse niveles de expresión sustancialmente alterada (aumentada o disminuida) en los tejidos del sistema inmune u otras células o líquidos orgánicos corporales (por ejemplo suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo espinal), extraídos de un individuo que tiene una de dichas enfermedades, en relación con un nivel de expresión de Neutroquina-\alpha "estándar", es decir, el nivel de expresión de Nuetroquina-\alpha en los tejidos del sistema inmune o en los líquidos orgánicos corporales de un individuo que no tiene la enfermedad del sistema inmune. Así, la invención proporciona un método diagnóstico útil durante el diagnóstico de una enfermedad del sistema inmune, que incluye medir el nivel de expresión del gen que codifica la proteína Neutroquina-\alpha en tejidos del sistema inmune o en otras células o líquidos orgánicos de un individuo, y comparar el nivel medido de expresión génica con un nivel estándar de expresión del de la Neutroquina-\alpha, donde un aumento o una disminución en el nivel de expresión del gen, comparado con el estándar, es indicativo de una enfermedad del sistema inmune.

En particular, se cree que ciertos tejidos en mamíferos con cáncer del sistema inmune, expresan niveles significativamente aumentados o reducidos de la proteína Neutroquina-\alpha y del mRNA que codifica la proteína Neutroquina-\alpha, cuando se comparan con los niveles "estándar" correspondientes. Además, se cree que pueden detectarse niveles aumentados o disminuidos de la proteína Neutroquina-\alpha, en ciertos líquidos orgánicos corporales (por ejemplo suero, plasma, orina, y líquido cefalorraquídeo espinal), de mamíferos con dichos tipos de cáncer, cuando se comparan con suero de mamíferos de la misma especie que no tienen cáncer.

Así, aquí descrito está un método diagnóstico útil durante el diagnóstico de una enfermedad del sistema inmune, incluyendo cánceres de este sistema, que implica medir el nivel de expresión del gen que codifica la proteína Neutroquina-\alpha en el tejido del sistema inmune, o en otras células o líquidos orgánicos corporales de un individuo, y comparar el nivel medido de expresión génica con un nivel de expresión estándar de Neutroquina-\alpha, donde un aumento o disminución en el nivel de expresión génica comparado con el estándar, es indicativo de una enfermedad del sistema inmune.

Cuando el diagnóstico de una enfermedad en el sistema inmune, incluyendo el diagnóstico de un tumor, ha sido ya realizado según métodos convencionales, la presente invención es útil como indicador pronóstico, donde los pacientes que exhiben expresión aumentada o disminuida del gen de la Neutroquina-\alpha, experimentarán un peor curso clínico, en relación con pacientes que expresan el gen a nivel cercano al nivel estándar.

Por "analizar el nivel de expresión del gen que codifica la proteína Neutroquina-\alpha", se entiende medir o estimar cualitativamente o cuantitativamente el nivel de la proteína Neutroquina-\alpha o el nivel del mRNA que codifica la proteína Neutroquina-\alpha, en una primera muestra biológica directamente (por ejemplo, mediante determinación o estimación del nivel absoluto de proteína o del nivel de mRNA) o relativamente (por ejemplo, mediante comparación del nivel de proteína Nuetroquina-\alpha o del nivel de mRNA en una segunda muestra). Preferiblemente, el nivel de proteína Neutroquina-\alpha o el nivel de mRNA en la primera muestra biológica, se mide o se estima y se compara a un nivel estándar de proteína Neutroquina-\alpha, o a un nivel estándar de mRNA, siendo el estándar tomado de una segunda muestra biológica, obtenida de un individuo que no tiene la enfermedad, o siendo determinado mediante los niveles medios de una población de individuos que no tienen una enfermedad del sistema inmune. Como será apreciado en la técnica, una vez que se conoce el nivel estándar de proteína Neutroquina-\alpha o el nivel estándar de mRNA, puede utilizarse repetidamente como estándar para comparación.

Por "muestra biológica" se entiende cualquier muestra biológica obtenida de un individuo, líquido orgánico corporal, línea celular, cultivo celular, u otra fuente que contiene proteína o mRNA de Neutroquina-\alpha. Como se ha indicado, las muestras biológicas incluyen líquidos orgánicos corporales (tales como suero, plasma, orina, líquido sinovial y líquido cefalorraquídeo espinal), que contienen dominios extracelulares libres de la proteína Neutroquina-\alpha, tejido del sistema inmune, y otros tejidos en los que se ha encontrado expresión del dominio extracelular completo o libre de la Neutroquina-\alpha, o de un receptor de Neutroquina-\alpha. Los métodos para obtener biopsias tisulares y líquidos orgánicos corporales de mamíferos son bien conocidos en la técnica. Cuando la muestra biológica es para incluir mRNA, la fuente preferida es una biopsia de tejido.

La presente invención es útil para el diagnóstico o el tratamiento de varias enfermedades relacionadas con el sistema inmune en mamíferos, preferiblemente seres humanos. Tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a tumores y metástasis de tumores, infecciones por bacterias, virus y otros parásitos, inmunodeficiencias, enfermedades inflamatorias, linfadenopatía, enfermedades autoinmunes, y enfermedad injerto contra huésped.

El RNA celular total puede aislarse de una muestra biológica utilizando cualquier técnica adecuada, tal como el método de etapa única de guanidin-tiocianato-fenol-cloroformo, descrito en Chomczynski y Sacchi, Anal. Biochem. 162:156-159 (1987). Los niveles del mRNA que codifica la proteína Neutroquina-\alpha son después analizados utilizando cualquier método apropiado. Éstos incluyen análisis de Northern blot, mapeo de nucleasa S1, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), trascripción inversa en combinación con reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), y trascripción inversa en combinación con reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR).

El análisis de los niveles de proteína Neutroquina-\alpha en una muestra biológica puede realizarse utilizando técnicas basadas en anticuerpos. Por ejemplo, la expresión de proteína Neutroquina-\alpha en tejidos, puede estudiarse con métodos inmunohistológicos clásicos (Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión génica de la proteína Neutroquina-\alpha incluyen inmunoanálisis, tales como como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) y el radioinmunanálisis (RIA). Los marcadores de anticuerpos adecuados para los análisis son bien conocidos en la técnica, e incluyen marcadores enzimáticos, tales como glucosa oxidasa, y radioisótiopos, tales como yodo (^{125}I, ^{121}I), carbono (^{14}C), azufre (^{35}S), tritio (^{3}H), indio (^{112}In), y tecnecio (^{99m}Tc), y marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, y biotina.

Además de analizar los niveles de proteína Neutroquina-\alpha en una muestra biológica obtenida de un individuo, la Neutroquina-\alpha puede también detectarse in vivo mediante técnicas de imagen. Los marcadores o etiquetas de anticuerpos para técnicas de imagen in vivo de la proteína Neutroquina-\alpha, incluyen los detectables mediante rayos X, NMR o ESR. Para rayos X, los marcadores adecuados incluyen radioisótopos tales como bario o cesio, que emiten radiación detectable, pero nos son abiertamente peligrosos para el sujeto. Los marcadores adecuados para NMR y ESR incluyen aquellos con un giro característico detectable, tales como deuterio, que puede incorporarse al anticuerpo mediante marcaje de los nutrientes del hibridoma relevante.

Un anticuerpo específico contra la proteína Neutroquina-\alpha o un fragmento del anticuerpo que se ha marcado con un resto de imagen detectable adecuado, tal como un radioisótopo (por ejemplo, ^{131}I, ^{112}In, ^{99m}Tc), una sustancia radio-opaca, o un material detectable mediante resonancia magnética nuclear, se introduce (por ejemplo, parenteralmente, subcutáneamente o intraperitonealmente), en un mamífero que va a ser examinado para una enfermedad del sistema inmune. Se entenderá que el tamaño del sujeto y del sistema de imagen utilizado, determinará la cantidad de resto de imagen necesario para producir imágenes diagnósticas. En el caso de un resto radioisotópico, para un sujeto humano, la cantidad de radiactividad inyectada estará normalmente en el intervalo de desde alrededor de 5 hasta 20 milicurios de ^{99m}Tc. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcado, se acumulará entonces preferiblemente en la localización de las células que contienen la proteína Neutroquina-\alpha. La técnica de imagen tumoral in vivo está descrita en S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments" (Capítulo 13 en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel y B.A. Rhodes, eds. Masson Publishing Inc. (1982)).

Anticuerpos

Los anticuerpos específicos contra la proteína Neutroquina-\alpha para utilizar en la presente invención, pueden producirse contra la proteína Neutroquina-\alpha intacta o contra uno de sus fragmentos de polipéptido antigénicos, que pueden presentarse junto con un trasportador proteico adecuado, tal como una albúmina, a un sistema animal (tal como conejo o ratón), o, si es suficientemente largo (al menos alrededor de 25 aminoácidos), sin un trasportador.

Como aquí se utiliza, el término "anticuerpo" (Ab), o "anticuerpo monoclonal" (Mab), pretende incluir moléculas intactas así como fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2), que son capaces de unirse específicamente a la proteína Neutroquina-\alpha. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se aclaran más rápidamente de la circulación, y pueden tener menos unión no-específica al anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). Por eso, estos fragmentos son preferidos.

Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse por cualquiera de una diversidad de métodos. Por ejemplo, las células que expresan la proteína Neutroquina-\alpha, o uno de sus fragmentos antigénicos, pueden ser administradas a un animal, con objeto de inducir la producción de suero que contiene anticuerpos policlonales. En un método preferido, se prepara una preparación de proteína Neutroquina-\alpha y se purifica para dejarla sustancialmente libre de contaminantes naturales. Dicha preparación es después introducida en un animal, con el objetivo de producir antisuero policlonal de mayor actividad específica.

En el método más preferido, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos monoclonales (o sus fragmentos de unión a la proteína Neutroquina-\alpha). Dichos anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando la tecnología de hibridoma (Köhler et al., Nature 256:495 (1975); Köhler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Köhler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al., en Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., (1981), pags. 563-681). En general, dicho procedimiento implica inmunizar a un animal (preferiblemente un ratón), con un antígeno de la proteína Neutroquina-\alpha o, más preferiblemente, con una célula que expresa una proteína Neutroquina-\alpha. Las células adecuadas pueden reconocerse por su capacidad para unirse a un anticuerpo contra la proteína Neutroquina-\alpha. Dichas células pueden cultivarse en cualquier medio de cultivo tisular adecuado; sin embargo, es preferible cultivar las células en medio de Eagle modificado por Earle, suplementado con suero bovino fetal al 10% (inactivado a alrededor de 56ºC), y suplementado con alrededor de 10 g/l de aminoácidos no esenciales, alrededor de 1000 U/ml de penicilina, y alrededor de 100 \mug/ml de estreptomicina. Los esplenocitos de dichos ratones se extraen y se fusionan con una línea celular de mieloma adecuada. Cualquier línea celular de mieloma adecuada puede emplearse según la presente invención; sin embargo es preferible emplear la línea celular de mieloma parental (SP2O), disponible del American Type Cultura Collection, Rockville, Maryland. Después de la fusión, las células de hibridoma resultantes son mantenidas selectivamente en medio HAT, y después se clonan mediante dilución limitante como describieron Wands et al. (Gastroenterology 80:225-232 (1981)). Las células de hibridoma obtenidas a través de dicha selección se analizan después, para identificar clones que secretan anticuerpos capaces de unirse al antígeno de la proteína Neutroquina-\alpha.

Alternativamente, pueden producirse anticuerpos adicionales capaces de unirse al antígeno de la proteína Neutroquina-\alpha, en un procedimiento de dos etapas, a través de la utilización de anticuerpos anti-idiotípicos. Dicho método hace uso del hecho de que los anticuerpos son antígenos en si mismos, y que, por eso, es posible obtener un anticuerpo que se une a un segundo anticuerpo. Según este método, los anticuerpos específicos contra la proteína Neutroquina-\alpha se utilizan para inmunizar a un animal, preferiblemente a un ratón. Los esplenocitos de dichos animales se utilizan después para producir células de hibridoma, y las células de hibridoma se criban para identificar clones que producen un anticuerpo, cuya capacidad para unirse al anticuerpo específico contra la proteína Neutroquina-\alpha puede bloquearse por el antígeno de la proteína Neutroquina-\alpha. Dichos anticuerpos comprenden anticuerpos anti-idiotípicos contra los anticuerpos específicos contra la proteína Neutroquina-\alpha, y pueden utilizarse para inmunizar a un animal, para inducir la formación de más anticuerpos específicos contra la proteína Neutroquina-\alpha.

Será apreciado que los fragmentos Fab y F(ab')2 y otros fragmentos de anticuerpos de la presente invención, pueden utilizarse según los métodos aquí descritos. Tales fragmentos son producidos típicamente mediante escisión proteolítica, utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Alternativamente, los fragmentos de unión a la proteína Neutroquina-\alpha, pueden producirse a través de la aplicación de la tecnología de DNA recombinante, o a través de la química sintética.

Cuando se utilizan técnicas de imagen in vivo para detectar niveles aumentados de proteína Neutroquina-\alpha para el diagnóstico en seres humanos, puede ser preferible utilizar anticuerpos monoclonales quiméricos "humanizados". Dichos anticuerpos pueden producirse utilizando construcciones genómicas derivadas de células de hibridoma, que producen los anticuerpos monoclonales descritos previamente. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Véase, como revisión, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly et al., Patente de EE. UU. Nº 4.816.567; Taniguchi et al., Documento EP 171496; Morrison et al., Documento EP 173494; Neuberger et al., Documento WO 8601533; Robinson et al., Documento WO 8702671; Boulianne et al., Nature 312:643 (1984); Neuberger et al., Nature 314:268 (1985)

Tratamiento de las enfermedades relacionadas con el sistema inmune

Como se ha especificado previamente, los polinucleótidos y polipéptidos Neutroquina-\alpha, son útiles para el diagnóstico de enfermedades que implican expresión anormalmente alta o baja de las actividades de la Neutroquina-\alpha. Dadas las células y los tejidos en los que se expresa la Neutroquina-\alpha, así como las actividades moduladas por la Neutroquina-\alpha, es fácilmente aparente que un nivel de expresión sustancialmente alterado (aumentado o disminuido) de la Neutroquina-\alpha en un individuo, comparado con el nivel estándar o "normal", produce enfermedades patológicas relacionadas con sistemas del organismo en los que la Neutroquina-\alpha se expresa y/o es activa.

También será apreciado por cualquier experto en la técnica que, como la proteína Neutroquina-\alpha de la invención es un miembro de la familia del TNF, el dominio extracelular de la proteína puede liberarse en forma soluble de las células que expresan Neutroquina-\alpha, mediante escisión proteólitica y por lo tanto, cuando la proteína Neutroquina-\alpha (particularmente una forma soluble del dominio extracelular) se añade desde una fuente exógena a células, tejidos, o el organismo de un individuo, la proteína ejercerá sus actividades moduladoras sobre cualquiera de sus células diana en ese indivisuo. También, las células que expresan este tipo II de proteína transmembrana pueden añadirse a células, tejidos o al organismo de un individuo, donde las células añadidas se unirán a las células que expresan el receptor para la Neutroquina-\alpha, donde las células que expresan la Neutroquina-\alpha pueden producir acciones (por ejemplo citotoxicidad) en las células diana portadoras del receptor.

De este modo, será apreciado que el uso de una proteína Neutroquina-\alpha (en forma de un dominio extracelular soluble o células que expresan la proteína completa), para la preparación de una composición farmacéutica, es adecuado para tratar enfermedades ocasionadas por una disminución en el nivel estándar o normal de la actividad de Neutroquina-\alpha en un individuo, particularmente pueden tratarse enfermedades del sistema inmune. Así la invención también proporciona un uso de un polipéptido Neutroquina-\alpha de la invención, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un individuo con necesidad de un nivel aumentado de actividad de Neutroquina-\alpha.

Como la Neutroquina-\alpha pertenece a la superfamilia del TNF, también podría modular la angiogénesis. Además, como la Neutroquina-\alpha inhibe las funciones celulares inmunes, tendrá un amplio rango de actividades anti-inflamatorias. La Neutroquina-\alpha puede ser adecuada para emplearse como un agente anti-neovascularizante, para tratar tumores sólidos mediante el estímulo de la invasión y la activación de las defensas de la célula hospedante, por ejemplo células T citotóxicas y macrófagos, y mediante inhibición de la angiogénesis de tumores. Los expertos en la técnica reconocerán otras indicaciones no cancerosas, en las que no se quiere tener una proliferación de vasos sanguíneos. También pueden ser adecuados para emplearse en la estimulación de las defensas del hospedante contra infecciones crónicas y agudas resistentes, por ejemplo, infecciones por micobacterias, a través de la atracción y la activación de los leucocitos microbicidas. La Neutroquina-\alpha también puede ser adecuada para emplearse en la estimulación de la cicatrización de heridas, tanto a través del reclutamiento del aclaramiento de restos y de células inflamatorias estimuladoras del tejido conectivo. De esta misma forma, la Neutroquina-\alpha puede también ser adecuada para emplearse para tratar otras enfermedades fibróticas, incluyendo la cirrosis hepática, la artrosis y la fibrosis pulmonar. La Neutroquina-\alpha también aumenta la presencia de eosinófilos, que tienen la función particular de matar las larvas de los parásitos que invaden los tejidos, como en la esquistosomiasis, la triquinosis y la ascariasis. También puede ser adecuada para emplearse para regular la hematopoyesis, mediante la regulación de la activación y diferenciación de varias células progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, para liberar leucocitos maduros de la médula ósea después de la quimioterapia, es decir, en la movilización de células progenitoras. La Neutroquina-\alpha también puede emplearse para tratar la sepsis.

Formulaciones

La composición del polipéptido Neutroquina-\alpha (que contiene preferiblemente un polipéptido del domino extracelular que está en forma soluble), será formulada y dosificada de una forma consistente con la buena práctica médica, teniendo en cuenta la condición clínica del paciente individual (especialmente los efectos secundarios del tratamiento con el polipéptido Neutroquina-\alpha solo), el lugar de liberación de la composición del polipéptido Neutroquina-\alpha, el método de administración, la agenda de administración, y otros factores conocidos para los expertos. La "cantidad efectiva" del polipéptido Neutroquina-\alpha para el propósito actual se determina así, mediante dichas consideraciones.

Como proposición general, la cantidad farmacéuticamente efectiva total del polipéptido Neutroquina-\alpha administrada parenteralmente por dosis, estará en el intervalo de alrededor de 1 \mug/kg/día a 10 mg/kg/día por peso corporal del paciente, aunque, como se ha especificado previamente, ésto estará sujeto a la discreción terapéutica. Más preferiblemente, esta dosis es al menos 0,01 mg/kg/día, y más preferiblemente para seres humanos, entre alrededor de 0,01 y 1 mg/kg/día para la hormona. Si se administra continuamente, el polipéptido Neutroquina-\alpha se administra típicamente a una tasa de dosis de desde alrededor de 1 \mug/kg/hora hasta alrededor de 50 \mug/kg/hora, bien mediante 1-4 inyecciones por día, o mediante infusión subcutánea continua, por ejemplo, utilizando una mini-bomba. También puede emplearse una bolsa de solución intravenosa. La duración del tratamiento necesitada para observar cambios, y el intervalo después de los tratamientos para que ocurran las respuestas, parecen variar dependiendo del efecto deseado.

Las composiciones farmacéuticas que contienen la Neutroquina-\alpha de la invención, pueden administrarse oralmente, rectalmente, parenteralmente, intracisternalmente, intravaginalmente, intraperitonealmente, tópicamente (como polvos, ungüentos, gotas o parches trasdérmicos), bucalmente, o como un inhalador oral o nasal. Por "excipiente farmacéuticamente aceptable", quiere decirse un material de relleno, diluyente o encapsulante sólido, semisólido o líquido o una formulación auxiliar de cualquier tipo. El término "parenteral" como aquí se utiliza, se refiere a modos de administración que incluyen la inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intracisternal, subcutánea e intra-articular.

El polipéptido Neutroquina-\alpha es también adecuado para administrarse mediante sistemas de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de composiciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímeros semi-permeables en forma de artículos con forma, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen polilactidos (Patente de EE. UU. Nº 3.773.919, Documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman, U. et al., Biopolymers 22:547-556 (1983)), poli (2-hidroxietil metacritlato) (R. Langer et al., Id), o ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (Documento EP 133.988). Las composiciones de polipéptido Neutroquina-\alpha de liberación sostenida, pueden incluir polipéptido Neutroquina-\alpha atrapado en liposomas. Los lipsomas que contienen el polipéptido Neutroquina-\alpha se preparan por métodos conocidos por sí mismos: Documento DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034 (1980); Documento EP 52.322; Documento 36.676; Documento 88.046; Documento 143.949; Documento 142.641; Solicitud de Patente Japonesa 83-118008; Patentes de EE. UU.Nº 4.485.045 y Nº 4.544.545; y Documento EP 102.324. Generalmente, los liposomas son de los pequeños (alrededor de 200-800 Angstroms), de tipo unilaminar, en los que el contenido lípido es mayor que alrededor de 30 mol. por ciento de colesterol, siendo las proporciones seleccionadas ajustadas para la terapia óptima con un polipéptido Neutroquina-\alpha.

Para administración parenteral, en una realización, el polipéptido Neutroquina-\alpha se formula generalmente mezclándolo en el grado deseado de pureza, en una forma inyectable de dosis unitaria (solución, suspensión o emulsión), con un excipiente farmacéuticamente aceptable, es decir, uno que no es tóxico para los recipientes, a las dosis y concentraciones empleadas, y que es compatible con otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, la formulación preferiblemente no incluye agentes oxidantes y otros componentes que son conocidos por ser perjudiciales para los polipéptidos.

Generalmente, las formulaciones se preparan poniendo en contacto el polipéptido Neutroquina-\alpha uniformemente e íntimamente, con excipientes líquidos o excipientes sólidos finamente divididos, o ambos. Después, si es necesario, el producto se pone en la forma de la formulación deseada. Preferiblemente, el excipiente es un excipiente parenteral, más preferiblemente una solución que es isotónica con la sangre del recipiente. Ejemplos de tales excipientes incluyen agua, solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. Los vehículos no acuosos, tales como aceites fijos y etil-oleato son también útiles aquí, así como los liposomas.

El excipiente adecuado contiene cantidades menores de aditivos tales como sustancias que aumentan la isotonicidad y la estabilidad química. Tales materiales son no tóxicos para los recipientes a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen soluciones de tampón tales como fosfato, citrato, succinato, ácido acético, y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de diez residuos), por ejemplo, poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico, o arginina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos, tales como polisorbatos, poloxámeros, o PEG.

El polipéptido Neutroquina-\alpha está formulado típicamente en dichos vehículos, a concentración de desde alrededor de 0,1 mg/ml hasta 100 mg/ml, preferiblemente 1-10 mg/ml, a un pH de alrededor de 3 a 8. Se entenderá que el uso de determinados de los excipientes, trasportadores o estabilizantes anteriores, dará como resultado la formación de sales de Neutroquina-\alpha.

El polipéptido Neutroquina-\alpha para utilizarse en la preparación de una composición farmacéutica para la administración terapéutica debe ser estéril. La esterilidad se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles (por ejemplo membranas de 0,2 micras). Las composicones terapéuticas de polipéptido Neutroquina-\alpha, generalmente están localizadas en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón que puede ser atravesado por una aguja de inyección hipodérmi-
ca.

El polipéptido Neutroquina-\alpha generalmente se almacenará en contenedores de una o múltiples dosis, por ejemplo, ampollas o viales sellados, o una solución acuosa, o como una formulación liofilizada para reconstitución. Como ejemplo de una formulación liofilizada, viales de 10 ml se rellenan con 5 ml de solución acuosa de polipéptido Neutroquina-\alpha al 1% (peso/volumen) estéril por filtración, y la mezcla resultante se liofiliza. La solución de infusión se prepara mediante reconstitución del polipéptido Neutroquina-\alpha utilizando agua para inyección bacteriostética.

La invención también proporciona un paquete o kit farmacéutico que contiene uno o más contenedores, rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Asociados con tal(es) contenedor(es) puede haber una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental regulando la fabricación, utilización o venta de productos farmacéuticos o biológicos, donde dicha nota refleja la aprobación por la agencia de la fabricación, utilización o venta para administración humana. Además, los polipéptidos de la presente invención pueden emplearse en conjunción con otros compuestos terapéuticos.

Agonistas y Antagonistas - Ensayos y Moléculas

La invención también describe un método de cribar compuestos, para identificar aquellos que aumentan o bloquean la acción de la Neutroquina-\alpha sobre las células, tal como su interacción con moléculas de unión a Neutroquina-\alpha, tales como las moléculas receptoras. Un agonista es un compuesto que aumenta las funciones biológicas naturales de la Neutroquina-\alpha, que funciona de una manera similar a la Neutroquina-\alpha, mientras que los antagonistas disminuyen o eliminan tales funciones.

En otro aspecto de esta realización, la invención describe un método para identificar una proteína receptor u otras proteínas de unión al ligando, que se unen específicamente al polipéptido Neutroquina-\alpha. Por ejemplo, un compartimiento celular, tal como una membrana o una de sus preparaciones, puede prepararse a partir de células que expresan una molécula que se une a la Neutroquina-\alpha. La preparación se incuba con Neutroquina-\alpha marcada, y se aislan complejos de Neutroquina-\alpha unida al receptor o a otras proteínas de unión, y se caracterizan según métodos de rutina conocidos en la técnica. Alternativamente, el polipéptido Neutroquina-\alpha puede unirse a un soporte sólido, de tal forma que las moléculas de unión solubilizadas de las células se unen a la columna, y después se eluyen y se caracterizan según métodos de rutina.

En el experimento de la invención para agonsitas o antagonistas, un compartimiento celular, tal como una membrana o una de sus preparaciones, puede prepararse a partir de una célula que expresa una molécula que se une a la Neutroquina-\alpha, tal como una molécula de una vía de señalización o regulación modulada por la Neutroquina-\alpha. La preparación se incuba con la Neutroquina-\alpha marcada, en ausencia o presencia de una molécula candidata, que puede ser un agonista o un antagonista de la Neutroquina-\alpha. La capacidad de la molécula candidata para unirse a la molécula de unión, se refleja en la disminución de la unión al ligando marcado. Las moléculas que se unen gratuitamente, es decir, sin inducir los efectos de la Neutroquina-\alpha en la unión de la molécula de unión a la Neutroquina-\alpha, es más probable que sean buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien, e inducen efectos que son los mismos, o muy cercanos a los que produce la Neutroquina-\alpha, son agonistas.

Los efectos similares a los de la Neutroquina-\alpha de los agonistas y antagonistas potenciales pueden medirse, por ejemplo, determinando la actividad de un sistema de segundo mensajero, después de la interacción de la molécula candidata con una célula o una preparación celular apropiada, y comparando el efecto con el de la Neutroquina-\alpha, o con moléculas que inducen los mismos efectos que la Neutroquina-\alpha. Sistemas de segundo mensajero que pueden ser útiles en este aspecto incluyen, pero no se limitan a, sistemas de segundo mensajero de AMP guanilato ciclasa, canal iónico, o hidrólisis de fosfoinositido.

Otro ejemplo de un ensayo para antagonistas de Neutroquina-\alpha es un ensayo competitivo que combina la Neutroquina-\alpha y un antagonista potencial, con moléculas de receptor unidas a membrana, o moléculas de receptor de Neutroquina-\alpha recombinantes, bajo condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. La Neutroquina-\alpha puede marcarse, tal como mediante radiactividad, de tal forma que pueda determinarse exactamente el número de moléculas de Neutroquina-\alpha unidas a una molécula de receptor, para determinar la efectividad del antagonista potencial.

Antagonistas potenciales incluyen moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polipéptido de la invención, y que inhiben o extinguen su actividad. Antagonistas potenciales también pueden ser moléculas orgánicas pequeñas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína cercanamente relacionada o un anticuerpo que se une a los mismos lugares en una molécula de unión, tal como una molécula de receptor, sin inducir actividades inducidas por Neutroquina-\alpha, previniendo así la acción de la Neutroquina-\alpha, mediante la exclusión de la unión de la Neutroquina-\alpha.

Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas anti-sentido. La tecnología anti-sentido puede utilizarse para controlar la expresión génica a través de DNA o RNA anti-sentido, o a través de la formación de triple hélice. Las técnicas anti-sentido se discuten, por ejemplo, en Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); "Oligodeoxinucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression", CRC Press, Boca Raton, FL (1988). La formación de triple hélice se discute, por ejemplo en Lee et al., Nucleic Acid Research 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); y Dervan et al., Science 251:1360 (1991). Los métodos están basados en la unión de un polinucleótido a la DNA o RNA complementario. Por ejemplo, la parte de codificación 5' de un polinucleótido que codifica el dominio extracelular del polipéptido de la presente invención, puede utilizarse para diseñar oligonulceótidos de RNA anti-sentido, de desde alrededor de 10 a 40 pares de bases de longitud. Un oligonucleótido de DNA se diseña para ser complementario a una región del gen implicado en la trascripción, previniendo así la trascripción y la producción de Neutroquina-\alpha. El oligonucleótido de RNA anti-sentido se hibrida al mRNA in vivo y bloquea la tradución de la molécula de mRNA en el polipéptido Neutroquina-\alpha. Los oligonucleótidos descritos previamente pueden también liberarse a las células, de tal forma que el RNA o DNA anti-sentido puede expresarse in vivo para inhibir la producción de Neutroquina-\alpha.

Los antagonistas que son anticuerpos de la presente invención, o una construcción anti-sentido como la descrita aquí anteriormente, pueden emplearse en una composición con un excipiente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, como los descritos previamente.

Los antagonistas pueden utilizarse, por ejemplo, para inhibir la quimiotaxis y la activación de los macrófagos y sus precursores, y de los neutrófilos, basófilos, linfocitos B y algunos subgrupos de células T, por ejemplo células T activadas y células T citotóxicas CD8, y células asesinas naturales, producida por la Neutroquina-\alpha en ciertas enfermedades autoinmunes e inflamatorias crónicas e infecciosas. Ejemplos de enfermedades autoinmunes incluyen la esclerosis múltiple y la diabetes insulín-dependiente. Los antagonistas también pueden ser adecuados para emplearse para tratar enfermedades infecciosas inluyendo silicosis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, mediante la prevención del reclutamiento y la activación de los fagocitos mononucleares. También pueden ser adecuados para emplearse para tratar el síndrome hiper-eosinofílico idiopático, mediante la prevención de la producción y la migración de los eosinófilos. El shock endotóxico también puede ser tratado con los antagonistas mediante la prevención de la migración de los macrófagos y su producción de los polipéptidos quimioquinas humanos de la presente invención. Los antagonistas también pueden ser adecuados para emplearse para tratar las reacciones alérgicas mediadas por histamina y las alteraciones inmunológicas, incluyendo las reacciones alérgicas de fase tardía, la urticaria crónica y la dermatitis atópica, mediante la inhibición de la degranulación de las células cebadas y los basófilos inducida por quimioquinas, y la liberación de histamina. Las reacciones alérgicas mediadas por IgE tales como el asma alérgica, la rinitis y el ezcema, también pueden tratarse. Los antagonistas también pueden ser adecuados para emplearse para tratar la inflamación aguda y crónica, mediante la prevención de la atracción de los monocitos a un área inflamada. También pueden ser adecuados para emplearse para regular las poblaciones de macrófagos pulmonares normales, ya que las enfermedades pulmonares inflamatorias crónicas y agudas, se asocian con el secuestro de los fagocitos mononucleares en el pulmón. Los antagonistas también pueden ser adecuados para emplearlos para tratar la artritis reumatoide, mediante la prevención de la atracción de los monocitos al líquido sinovial en las articulaciones de los pacientes. El influjo de monocitos y la activación juegan un papel significativo en la patogénesis de las artropatías tanto degenerativas como inflamatorias. Los antagonistas pueden ser adecuados para emplearse para interferir con las cascadas perjudiciales atribuidas primariamente a IL-1 y TNF, que previenen la biosíntesis de otras citoquinas inflamatorias. En este sentido, los antagonistas pueden ser adecuados para emplearse para prevenir la inflamación. Los antagonistas también pueden ser adecuados para emplearse para tratar casos de fracaso de médula ósea, por ejemplo anemia aplásica y síndrome mielodisplásico. Los antagonistas también pueden ser adecuados para emplearse para tratar el asma y la alergia, mediante la prevención de la acumulación de eosinófilos en el pulmón. Los antagonistas también pueden ser adecuados para emplearse para tratar la fibrosis de la membrana basal subepitelial, que es un hecho prominente del pulmón
asmático.

Los anticuerpos contra la Neutroquina-\alpha pueden ser adecuados para emplearse para unirse e inhibir la actividad de la Neutroquina-\alpha, para tratar el ARDS, mediante la prevención de la infiltración de los neutrófllos en el pulmón después de una injuria. Los antagonistas pueden ser adecuados para emplearse en una composición con un excipiente farmacéuticamente adecuado, por ejemplo, los descritos aquí previamente.

Ensayos de cromosomas

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también son valiosas para la identificación cromosómica. La secuencia es alcanzada específicamente, y puede hibridarse con una localización particular en un cromosoma humano individual. Además, existe una necesidad actual de identificar lugares particulares en el cromosoma. Pocos reactivos marcadores de cromosomas basados en datos de secuencia real (polimorfismos repetidos), están disponibles actualmente para localización por marcaje de cromosomas. El mapeo de DNA a cromosomas según la presente invención, es una primera etapa importante para correlacionar aquellas secuencias con los genes asociados con la enfermedad.

En ciertas realizaciones preferidas en este aspecto, el cDNA aquí descrito se utiliza para clonar el DNA genómico del gen de la proteína Neutroquina-\alpha. Esto puede conseguirse utilizando una variedad de técnicas y bibliotecas bien conocidas, que están generalmente disponibles comercialmente. El DNA genómico es después utilizado para mapeo de cromosomas in situ utilizando técnicas bien conocidas para este propósito.

Además, en algunos casos, pueden mapearse secuencias en cromosomas preparando cebadores de PCR (preferiblemente de 15-25 pares de bases), a partir del cDNA. El análisis informático de la región 3' del gen no traducida, se utiliza para seleccionar rápidamente cebadores que no abarcan más de un exón en el DNA genómico, lo que complicaría el proceso de amplificación. Estos cebadores son después utilizados para cribado mediante PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. La hibridación in situ con fluorescencia ("FISH") de un clon de cDNA con una extensión de cromosomas en metafase, puede utilizarse para proporcionar una localización cromosómica precisa en una etapa. Esta técnica puede utilizarse con sondas del cDNA tan cortas como de 50 ó 60 pares de bases. Para una revisión de esta técnica, véase Verma et al., Human Chromososmes: A Manual Of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).

Una vez que la secuencia se ha mapeado en la localización cromosómica precisa, la posición física de la secuencia en el cromosoma puede correlacionarse con datos de mapas genéticos. Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance In Man, disponible en línea a través de la John Hopkins University, Welch Medical Library. La relación entre enfermedades y genes que han sido mapeados en la misma región cromosómica se identifican después mediante análisis de ligamiento (co-herencia de genes físicamente adyacentes).

A continuación, es necesario determinar las diferencias en el cDNA o la secuencia genómica entre los individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o en todos los individuos afectados, pero no en los individuos normales, entonces la mutación es presumiblemente el agente causal de la enfermedad.

Habiendo descrito generalmente la invención, la misma será más fácilmente inteligible mediante referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan como vía de ilustración, y se entiende que no son limitantes.

Ejemplos Ejemplo 1a Expresión y Purificación de la Neutroquina-\alpha "marcada con His" en E. coli

El vector de expresión bacteriano pQE9 (pD10) se utiliza para expresión bacteriana en este ejemplo. (QIAGEN, Inc., arriba). El pQE9 codifica la resistencia antibiótica a ampicilina ("Ampr"), y contiene un origen de replicación bacteriano ("ori"), un promotor inducible por IPTG, un lugar de unión a ribosoma ("RBS"), seis codones que codifican residuos de histidina que permiten la purificación por afinidad, utilizando resina de afinidad de ácido de níquel-nitrilo-tri-acético ("Ni-NTA"), disponible de QIAGEN, Inc., arriba, y lugares de escisión únicos para enzimas de restricción adecuados. Estos elementos están colocados de tal manera que un fragmento de DNA insertado, que codifica un polipéptido, expresa el polipéptido con los seis residuos de His (es decir, un "marcador 6 X His"), unidos covalentemente al extremo amino del polipéptido.

La secuencia de DNA que codifica la parte deseada de la proteína Neutroquina-\alpha que contiene la secuencia del dominio extracelular, se amplifica a partir del clon de cDNA depositado, utilizando cebadores de oligonucleótidos para PCR, que se unen a las secuencias amino-terminales de la parte deseada de la proteína Neutroquina-\alpha, y a las secuencias 3' de la secuencia de codificación de cDNA en la construcción depositada. Se añaden nucleótidos adicionales que contienen lugares de restricción, para facilitar la clonación en el vector pQE9, a las secuencias de los cebadores 3' y 5', respectivamente.

Para clonar el dominio extracelular de la proteína, el cebador 5' tiene la secuencia 5' CTGGGATCCAGCCTCCGG
GCAGAGCTG 3' (SEQ ID NO:10), que contiene subrayado el lugar de restricción de BamH I, seguido de 18 nucleótidos del extremo amino de la secuencia de codificación del dominio extracelular de la secuencia de la Neutroquina-\alpha en la Figura 1. Cualquier experto en la técnica apreciará, por supuesto, que el punto en la secuencia de codificación de la proteína en el que comienza el cebador 5', puede variar para amplificar un segmento de DNA que codifica cualquier parte deseada de la proteína Neutroquina-\alpha completa, más largo o más corto que el dominio extracelular de la forma. El cebador 3' tiene la secuencia 5' GTGAAGCTTTTATTACAGCAGTTTCAATGCACC 3'(SEQ ID NO:11), que contiene subrayado el lugar de restricción de Hind III, seguido de dos codones de parada, y 18 nucleótidos complementarios al extremo 3' de la secuencia de codificación de la secuencia de DNA de codificación de la Neutroquina-\alpha en la Figura 1.

El fragmento de DNA de la Neutroquina-\alpha amplificado y el vector pQE9 se digieren con BamH I y Hind III, y los DNA digeridos se ligan después juntos. La inserción del DNA de la Neutroquina-\alpha en los lugares de restricción del vector pQE9, coloca a la región de codificación de la proteína Neutroquina-\alpha aguas abajo del promotor inducible por IPTG, y en marco con un AUG de inicio y los seis codones de histidina.

La mezcla de ligación se trasforma en células E. coli competentes, utilizando procedimientos estándar, tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Se utiliza la cepa de E. coli M15/rep4, que contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lac y confiere resistencia a la kanamicina ("Kan^{r}"), para llevar a cabo los ejemplos ilustrativos aquí descritos. Esta cepa, que es solamente una de las muchas que son adecuadas para la expresión de la proteína Neutroquina-\alpha, está disponible comercialmente de QIAGEN, Inc., arriba. Se identifican las células trasformadas por su capacidad para crecer en placas de LB en presencia de ampicilina y kanamicina. El plásmido de DNA se aísla de las colonias resistentes y la identidad del DNA clonado se confirma mediante análisis de restricción, PCR y secuenciación de DNA. Los clones que contienen las construcciones deseadas se cultivan durante la noche ("O/N") en cultivo líquido de medio LB suplementado tanto con ampicilina (100 \mug/ml) como con kanamicina (25 \mug/ml). El cultivo O/N se utiliza para inocular un cultivo mayor, a una dilución de aproximadamente 1:25 a 1:250. Las células se cultivan hasta una densidad óptica a 600 nm ("OD600") de entre 0,4 y 0,6. Después se añade Isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido ("IPTG"), a una concentración final de 1 mM, para inducir la trascripción desde el promotor sensible al represor lac, mediante la inactivación del represor lacI. Las células posteriormente se incuban durante otras 3 ó 4 horas. Las células después se recolectan mediante centrifugación.

Las células son después agitadas durante 3-4 horas a 4ºC en guanidina-HCl pH 8, 6 M. Los restos celulares se eliminan mediante centrifugación, y el sobrenadante que contiene la Neutroquina-\alpha se carga en una columna de resina de afinidad de ácido níquel-nitrilo-tri-acético ("Ni-NTA") (disponible de QIAGEN, Inc., arriba). Las proteínas con un marcador 6 x His se unen a la resina Ni-NTA con alta afinidad, y pueden purificarse con un procedimiento sencillo de una etapa (para detalles véase: The QIAexpresionist, 1995, QIAGEN, Inc., arriba). Brevemente, el sobrenadante se carga en la columna en guanidina-HCl, pH 8, 6 M, la columna primero se lava con 10 volúmenes de guanidina-HCl, pH 8, 6 M, y después se lava con 10 volúmenes de guanidina-HCl, pH 6, 6 M, y finalmente la Neutroquina-\alpha se eluye con guanidina-HCl, pH 5, 6 M.

La proteína purificada es después renaturalizada mediante diálisis contra solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución de tampon de acetato sódico, pH 6, 50 mM más NaCl 200 mM. Alternativamente, la proteína puede ser replegada exitosamente mientras está inmovilizada en la columna Ni-NTA. Las condiciones recomendadas son las siguientes: renaturalizar utilizando un gradiente lineal de urea 6 M-1 M en NaCl 500 mM, glicerol al 20%, Tris/HCl pH 7,4, 20 mM, que contiene inhibidores de proteasa. La renaturalización debería realizarse durante un periodo de 1,5 horas o más. Después de la renaturalización, las proteínas pueden eluirse mediante la adición de imidazol 250 mM. El imidazol se elimina mediante una etapa final de diálisis contra PBS o solución de tampón de acetato sódico pH 6, 50 mM más NaCl 200 mM. La proteína purificada se guarda a 4ºC o se congela a -80ºC.

Ejemplo 1b Expresión y Purificación de la Neutroquina-\alpha en E. coli

El vector de expresión bacteriano pQE60 se utiliza para expresión bacteriana en este ejemplo. (QIAGEN; Inv., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). El pQE60 codifica la resistencia antibiótica a ampicilina ("Ampr"), y contiene un origen de replicación bacteriano ("ori"), un promotor inducible por IPTG, un lugar de unión a ribosoma ("RBS"), seis codones que codifican residuos de histidina que permiten la purificación por afinidad, utilizando resina de afinidad de ácido de níquel-nitrilo-tri-acético ("Ni-NTA"), disponible de QIAGEN, Inc., arriba, y lugares de escisión únicos para enzimas de restricción adecuados. Estos elementos están colocados de tal manera que un fragmento de DNA que codifica un polipéptido, puede ser insertado de tal forma que produce ese polipéptido con los seis residuos de His (es decir, un "marcador 6 X His"), unidos covalentemente al extremo carboxilo del polipéptido. Sin embargo, en este ejemplo, la secuencia de codificación del polipéptido se inserta de tal forma que la tradución de los seis codones de His se previene y, por lo tanto, el polipéptido se produce sin el marcador 6 X His.

La secuencia de codificación de DNA de la parte deseada de la proteína Neutroquina-\alpha, que comprende la secuencia del dominio extracelular, se amplifica a partir del clon de cDNA depositado, utilizando cebadores de oligonucleótidos para PCR, que se unen a las secuencias amino terminales de la parte deseada de la proteína Neutroquina-\alpha y a las secuencias en la construcción depositada 3' a la secuencia cDNA de codificación. Se añaden nucleótidos adicionales que contienen lugares de restricción para facilitar la clonación en el vector pQE60, a las secuencias 5' y 3', respectivamente.

Para clonar el dominio extracelular de la proteína, el cebador 5' tiene la secuencia 5' GTGTCATGAGCCTCCGGG
CAGAGCTG 3' (SEQ ID NO:12) que contiene subrayado el lugar de restricción de BspH seguido por 17 nucleótidos de la secuencia amino terminal de codificación del dominio extracelular de la secuencia de la Neutroquina-\alpha en la Figura 1. Cualquier experto en la técnica apreciará, por supuesto, que el punto en la secuencia de codificación de la proteína en el que comienza el cebador 5' puede variar para ampliar la parte deseada de la proteína completa, más corta o más larga que el dominio extracelular de la forma. El cebador 3' tiene la secuencia 5' GTGAAGCTTTTATTACAGCAGTTTCAATGCACC 3' (SEQ ID NO:13), que contiene subrayado el lugar de restricción Hind III, seguido de dos codones de parada y 18 nucleótidos complementarios al extremo 3' de la secuencia de codificación de la secuencia de DNA de la Neutroquina-\alpha en la Figura 1.

Los fragmentos amplificados del DNA de la Neutroquina-\alpha y el vector pQE60 se digieren con BspH I y Hind III, y los DNA digeridos, se ligan juntos después. La inserción del DNA de la Neutroquina-\alpha en los lugares de restricción del vector pQE9, coloca a la región de codificación de la proteína Neutroquina-\alpha, incluyendo su codón de parada asociado, aguas abajo del promotor inducible por IPTG y en marco con un AUG de inicio. El codón de parada asociado previene la tradución de los seis codones de histidina aguas abajo del punto de inserción.

La mezcla de ligación se transforma en células E. coli competentes, utilizando procedimientos estándar, tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Se utiliza la cepa de E. coli M15/rep4, que contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lac y confiere resistencia a la kanamicina ("Kanr"), para llevar a cabo los ejemplos ilustrativos aquí descritos. Esta cepa, que es solamente una de las muchas que son adecuadas para la expresión de la proteína Neutroquina-\alpha, está disponible comercialmente de QIAGEN, Inc., arriba. Se identifican las células trasformadas por su capacidad para crecer en placas de LB en presencia de ampicilina y kanamicina. El plásmido de DNA se aísla de las colonias resistentes y la identidad del DNA clonado se confirma mediante análisis de restricción, PCR y secuenciación de DNA.

Los clones que contienen las construcciones deseadas, se cultivan durante la noche ("O/N") en cultivo líquido de medio LB suplementado tanto con ampicilina (100 \mug/ml) como con kanamicina (25 \mug/ml). El cultivo O/N se utiliza para inocular un cultivo mayor, a una dilución de aproximadamente 1:25 a 1:250. Las células se cultivan hasta una densidad óptica a 600 nm ("OD600") de entre 0,4 y 0,6. Después se añade Isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido ("IPTG"), a una concentración final de 1 mM, para inducir la trascripción desde el promotor sensible al represor lac, mediante la inactivación del represor lacI. Las células posteriormente se incuban durante otras 3 ó 4 horas. Las células después se recolectan mediante centrifugación.

Las células son después agitadas durante 3-4 horas a 4ºC en guanidina-HCl pH 8, 6 M. Los restos celulares se eliminan mediante centrifugación, y el sobrenadante que contiene la Neutroquina-\alpha se dializa contra solución de tampón de acetato sódico pH 6, 50 mM, suplementado con NaCl 200 mM. Alternativamente, la proteína puede ser replegada con éxito mediante díálisis contra NaCl 500 mM, glicerol al 20%, Tris/HCl pH 7,4, 25 mM, que contiene inhibidores de proteasa. Después de la renaturalización, la proteína puede purificarse mediante cromatografía de intercambio iónico, interacción hidrófoba y exclusión de tamaño. Alternativamente, puede llevarse a cabo una etapa de cromatografía de afinidad, tal como una columna de anticuerpo, para obtener proteína Neutroquina-\alpha pura. La proteína purificada se guarda a 4ºC o se congela a -80ºC.

Ejemplo 2 Clonación y Expresión de la Proteína Neutroquina-\alpha en un Sistema de Expresión de Báculovirus

En este ejemplo ilustrativo, el vector plásmido lanzadera pA2 GP se utiliza para insertar el DNA clonado que codifica el dominio extracelular de la proteína, que carece de sus secuencias intracelular y transmembrana naturalmente asociadas, en un báculovirus, para expresar el dominio extracelular de la proteína Neutroquina-\alpha, utilizando un líder báculovirus y método estándar como los descritos en Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Nº 1555 (1987). El vector de expresión contiene el potente promotor polihedrina del virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica (AcMNPV), seguido por el péptido de señal secretora (líder) de la proteína gp67 del báculovirus, y lugares de restricción convenientes tales como BamHI, Xba I y Asp718. El lugar de poliadenilación del virus de simio 40 ("SV40"), se utiliza para poliadenilación eficiente. Para la selección fácil de los virus recombinantes, el plásmido contiene el gen de la beta-galactosidasa de E. coli, bajo el control de un débil promotor de Drosophila en la misma orientación, seguido de la señal de poliadenilación del gen de polihedrina. Los genes insertados están flanqueados a ambos lados por secuencias virales para recombinación homóloga mediada por células, con DNA viral de tipo natural, para generar virus viables que expresen el polinucleótido clonado.

Muchos otros vectores báculovirus podrían utilizarse en lugar del vector anterior, tales como pAc373, pVL941 y pAcIM1, como cualquier experto en la técnica apreciará fácilmente, siempre que la construcción proporcione señales para la trascripción, la tradución, la secreción y similares, colocadas apropiadamente, incluyendo un péptido de señal y un AUG en marco, como se requiere. Tales vectores están descritos, por ejemplo, en Luckow et al., Virology 170:31-39 (1989).

La secuencia de cDNA que codifica el dominio extracelular de la proteína Neutroquina-\alpha en el clon depositado, que carece del codón de iniciación AUG, y de las secuencias de los dominios intracelular y transmembrana asociados naturalmente, mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:2), se amplifica utilizando cebadores de oligonucleótidos para PCR, correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen. El cebador 5' tiene la secuencia 5' GTGGGATCCCCGGGCAGAGC
TGCAGGGC 3' (SEQ ID NO:14), que contiene subrayado el lugar de restricción de BamH I, seguido de 18 nucleótidos de la secuencia del dominio extracelular de la proteína Neutroquina-\alpha mostrada en la Figura 1, comenzando con el extremo N indicado del dominio extracelular de la proteína. El cebador 3' tiene la secuencia 5' GTGGGATCCTTATTA
CAGCAGTTTCAATGCACC 3' (SEQ ID NO:15), que contiene subrayado el lugar de restricción de Bam HI, seguido por dos codones de parada y 18 nucleótidos complementarios a la secuencia de codificación 3' en la Figura 1.

El fragmento amplificado se aísla de un gel de agarosa al 1%, utilizando el kit disponible comercialmente ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca). El fragmento después se digiere con BamH I y de nuevo se purifica en un gel de agarosa al 1%. Este fragmento se denomina aquí F1.

El plásmido se digiere con la enzima de restricción Bam HI y opcionalmente, puede desfosforilarse utilizando fosfatasa intestinal de ternera, utilizando procedimientos de rutina conocidos en la técnica. El DNA se aísla después de un gel de agarosa al 1%, utilizando un kit disponible comercialmente ("Geneclean" BIO 101, La Jolla, Ca). Este vector se denomina aquí "V1".

El fragmento F1 y el plásmido V1 desfosforilado se ligan juntos con ligasa T4 de DNA. Células E. coli HB101 u otros hospedantes E. coli adecuados, tales como las células XL-1 Blue (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), se trasforman con la mezcla de ligación, y se siembran sobre placas de cultivo. Las bacterias que contienen el plásmido se identifican con el gen humano de la Neutroquina-\alpha, digiriendo el DNA de colonias individuales utilizando Bam HI, y después analizando el producto de la digestión mediante electroforesis en gel. La secuencia del fragmento clonado se confirma mediante secuenciación de DNA. El plásmido se denomina aquí pA2GP Neutroquina-\alpha.

Cinco \mug del plásmido pA2GP Neutroquina-\alpha se co-transfectan con 1,0 \mug de un DNA de baculovirus hecho lineal, disponible comercialmente ("BaculoGold™ baculovirus DNA", Pharmingen, San Diego, CA), utilizando el método de lipofección descrito por Felgner et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417 (1987). Un \mug de DNA de báculovirus BaculoGold™ y 5 \mug del plásmido pA2GP Neutroquina-\alpha se mezclan en un pocillo estéril de una placa de microtitulación que contiene 50 \mul de medio de Grace (Life Technologies Inc., Gaithesburg, MD) libre de suero. Después, se añaden 10 \mul de Lipofectina más 90 \mul de medio de Grace, se mezclan y se incuban durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después, la mezcla de transfección se añade gota a gota a células de insecto Sf9 (ATCC CRL 1711), plantadas en una placa de cultivo celular de 35 mm, con 1 ml de medio de Grace sin suero. La placa se incuba después durante 5 horas a 27ºC. La solución de transfección se elimina después de la placa, y se añade 1 ml de medio de insectos de Grace suplementado con suero de ternera fetal al 10%. Después se continúa el cultivo a 27ºC durante cuatro días.

Después de cuatro días se recolecta el sobrenadante, y se lleva a cabo un ensayo de placas, como describieron Summers y Smith, arriba. Se utiliza un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg), para permitir la fácil identificación y aislamiento de los clones que expresan gal, que producen placas teñidas de azul. (Una descripción detallada de un "ensayo de placas" de este tipo puede encontrarse en la guía del usuario para cultivo de células de insecto y baculovirología distribuido por Life Technologies Inc., Gaithersburg, páginas 9-10). Después de la incubación apropiada, las placas teñidas de azul se cogen con la punta de una micropipeta de un micropipettor (por ejemplo, Eppendorf). El agar que contiene los virus recombinantes se resuspende después en un tubo de microcentrífuga que contiene 200 \mul de medio de Grace, y la suspensión que contiene los baculovirus recombinantes se utiliza para infectar células Sf9 sembradas en placas de 35 mm. Cuatro días más tarde, los sobrenadantes de estas placas de cultivo se receolectan y después se guardan a 4ºC. El virus recombinante se denomina V-Neutroquina-\alpha.

Para verificar la expresión del gen de la Neutroquina-\alpha, se cultivan células Sf9 en medio de Grace suplementado con FBS inactivado por calor al 10%. Las células se infectan con el báculovirus recombinante V-Neutroquina-\alpha, a una multiplicidad de infección ("MOI") de alrededor de 2. Si se desean proteínas radio-marcadas, 6 horas más tarde el medio se elimina y se reemplaza con medio SF900 menos metionina y cisteína (disponible de Life Technologies Inc., Rockville, MD). Después de 42 horas, se añaden 5 \muCi de ^{35}S-metionina y 5 \muCi de ^{35}S-cisteína (disponibles de Amersham). Las células se incuban durante 16 horas más, y después se recolectan mediante centrifugación. Las proteínas en el sobrenadante así como las proteínas intracelulares se analizan mediante SDS-PAGE, seguida de autorradiografía (si están radio-marcadas).

Puede utilizarse la microsecuenciación de la secuencia de aminoácidos del extremo amino de la proteína purificada, para determinar la secuencia amino terminal del dominio extracelular de la proteína, y de esta forma el punto de escisión y la longitud del péptido de señal secretora.

Ejemplo 3 Clonación y Expresión de la Neutroquina-\alpha en Células de Mamífero

Un vector de expresión típico de mamífero contiene el elemento promotor, que media la iniciación de la trascripción del mRNA, la secuencia de codificación de la proteína, y las señales requeridas para la terminación de la trascripción y la poliadenilación del trascripto. Elementos adicionales incluyen estimuladores, secuencias Kozak y secuencias de intervención flanqueadas por lugares aceptores y donantes para el ensamblaje del RNA. Puede alcanzarse una trascripción altamente eficiente con los promotores precoz y tardío del SV40, las repeticiones terminales largas (LTR) de retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLV1, HIV1 y el promotor precoz del citomegalovirus (CMV). Sin embargo, también pueden utilizarse elementos celulares (por ejemplo, el promotor de la actina humana). Vectores de expresión adecuados para utilizar en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, vectores tales como pSVL y pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12MI (ATCC 67109). Las células hospedante de mamífero que pueden utilizarse incluyen células humanas HeLa, 293, H9 y Jurkat, células de ratón NIH3T3 y C127, células Cos 1, Cos 7 y CV1, células de perdiz QC1-3, células L de ratón, y células de ovario de hamster chino (CHO).

Alternativamente, el gen puede expresarse en líneas celulares estables, que contienen el gen integrado en un cromosoma. La co-transfección con un marcador de selección tal como dhfr, gpt, neomicina, higromicina, permite la identificación y el aislamiento de las células transfectadas.

El gen transfectado puede también amplificarse para expresar grandes cantidades de la proteína codificada. El marcador DHFR (dihidrofolato reductasa), es útil para desarrollar líneas celulares que portan varios cientos o incluso varios miles de copias del gen de interés. Otro marcador de selección útil es la enzima glutamina sintetasa (GS) (Murphy et al., Biochem J. 227:277-279 (1991); Bebbington et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992)). Utilizando estos marcadores, las células de mamífero se cultivan en medio selectivo, y se seleccionan las células con la resistencia más alta. Estas líneas celulares contienen el (los) gen(es) amplificado(s) integrados en un cromosoma. Las células de ovario de hamster chino (CHO) y NSO se utilizan frecuentemente para la producción de proteí-
nas.

Los vectores de expresión pC1 y pC4 contienen el potente promotor (LTR) del virus del sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (Marzo, 1985)), más un fragmento del estimulador de CMV (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)). Múltiples lugares de clonación, por ejemplo, con los lugares de escisión de las enzimas de restricción BamHI, XbaI y Asp718, facilitan la clonación de los genes de interés. Los vectores contienen además el intrón 3', y la señal de poliadenilación y de terminación del gen de la preproinsulina de rata.

Ejemplo (a) Clonación y Expresión en Células COS

El plásmido de expresión pNeutrokine-\alpha HA, se construye mediante clonación de una parte del cDNA depositado que codifica el dominio extracelular de la proteína Neutroquina-\alpha, en el vector de expresión pcDNAI/Amp o pcDNAIII (que pueden obtenerse de Invitrogen, Inc.). Para producir una forma soluble, secretada del polipéptido, el dominio extracelular se fusiona con la secuencia secretora líder del gen de la IL-6 humana.

El vector de expresión pcDNAI/amp contiene: (1) un origen de replicación de E. coli efectivo para la propagación en E. coli y en otras células procarióticas; (2) un gen de resistencia a la ampicilina para seleccionar las células procarióticas que contienen el plásmido; (3) un origen de replicación de SV40, para la propagación en células eucarióticas; (4) un promotor de CMV, un poli-ligador, un intrón de SV40; (5) varios codones que codifican un fragmento de la hemaglutinina (es decir, un marcador "HA" para facilitar la purificación), seguido de un codón de terminación y una señal de poliadenilación, colocados de tal manera que un cDNA puede colocarse convenientemente bajo el control de expresión del promotor del CMV, y ligado operativamente al intrón del SV40 y la señal de poliadenilación, por medio de los lugares de restricción del poli-ligador. El marcador HA corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de influenza descrito por Wilson et al., Cell 37:767 (1984). La fusión del marcador HA con la proteína diana permite la detección fácil y la recuperación de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconoce el epítopo HA. El pcDNAIII contiene, además, el marcador de selección de neomicina.

Un fragmento de DNA que codifica el dominio extracelular del polipéptido Neutroquina-\alpha, se clona en la región del poli-ligador del vector, de tal forma que la expresión de la proteína recombinante es dirigida por el promotor del CMV. La estrategia de construcción del plásmido es la siguiente. El cDNA de la Neutroquina-\alpha del clon depositado, se amplifica utilizando cebadores que contienen lugares de restricción convenientes, de forma similar a la descrita previamente para la construcción de vectores para expresión de la Neutroquina-\alpha en E. coli. Los cebadores adecuados incluyen los siguientes, que se utilizan en este ejemplo. El cebador 5', que contiene subrayado el lugar Bam HI, una secuencia Kozak, un codón de iniciación AUG, una secuencia que codifica el péptido líder secretor del gen de la IL-6 humana, y 18 nucleótidos de la región de codificación 5' del dominio extracelular de la proteína Neutroquina-\alpha, tiene la siguiente secuencia:

5' GCGGGATCCGCCACCATGAACTCCTTCTCCACAAGCGCCTTCGGTCCAGTTGCCTTCTCCCTGGGG
CTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTCCCTGCCCCAGTTGTGAGACAAGGGGACCTGGCCAGC 3'

(SEQ ID NO:16). El cebador 3', que contiene subrayado el lugar de restricción de Bam HI y 18 nucelótidos complementarios a la secuencia de codificación 3', inmediatamente antes del codón de terminación, tiene la siguiente secuencia:

5' GTGGGATCCTTACAGCAGTTTCAATGCACC 3' (SEQ ID NO:17).

El fragmento de DNA amplificado y el vector pcDNAI/Amp se digieren con Bam HI y después se ligan. La mezcla de ligación se transforma en la cepa de E. coli SURE (disponible de Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037), y el cultivo transformado se siembra en placas con medio de ampicilina, que después se incuban para permitir el crecimiento de colonias resistentes a la ampicilina. El DNA del plásmido se aísla de las colonias resistentes y se examina mediante análisis de restricción u otros métodos, para la presencia del fragmento que codifica el dominio extracelular de la Neutroquina-\alpha.

Para la expresión de la Neutroquina-\alpha recombinante, las células COS se transfectan con un vector de expresión, como se ha descrito previamente, utilizando DEAE-DEXTRANO, como está descrito, por ejemplo en Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). Las células se incuban bajo condiciones para la expresión de la Neutroquina-\alpha por el vector.

La expresión de la proteína de fusión Neutroquina-\alpha HA se detecta mediante marcaje radiactivo e inmunoprecipitación, utilizando métodos descritos en, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988). Para este objetivo, dos días después de la transfección, las células se marcan mediante incubación en medio que contiene ^{35}S-cisteína durante 8 horas. Las células y el medio se recolectan, y las células se lavan y después se lisan con solución de tampón RIPA que contiene detergente: NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, NP-40 al 1%, DOC al 0,5%, TRIS pH 7,5, 50 mM, como describieron Wilson et al., citados previamente. Las proteínas se precipitan del lisado celular y del medio de cultivo, utilizando un anticuerpo monoclonal específico para HA. Las proteínas precipitadas se analizan después mediante SDS-PAGE y autorradiografía. Un producto de expresión del tamaño esperado se ve en el lisado celular, y no se ve en los testigos negativos.

Ejemplo 3(b) Clonación y Expresión en Células CHO

El vector pC4 se utiliza para la expresión de la proteína Neutroquina-\alpha. El plásmido pC4 es un derivado del plásmido pSV2-dhfr (ATCC Nº de Acceso 37146). Para producir una forma soluble, secretada del polipéptido Neutroquina-\alpha, la parte del cDNA depositado que codifica el dominio extracelular, se fusiona a la secuencia líder secretora del gen de la IL-6 humana. El vector plásmido contiene el gen de la DHFR bajo el control del promotor precoz del SV40. Las células de ovario de hamster chino, u otras células que carecen de actividad de hidrofolato, que se transfectan con estos plásmidos, pueden seleccionarse cultivando las células en un medio selectivo (alpha menos MEM. Life Technologies), suplementado con el agente quimioterapéutico metotrexate. La amplificación de los genes de DHFR en células resistentes a metotrexate (MTX) ha sido bien documentado (véase, por ejemplo, Alt, F.W., Kellems, R.M., Bertino, J.R., y Schimke, R.T., 1978, J. Biol. Chem. 235:1357-1370, Hamlin, J.L. y Ma, C. 1990, Biochem. et Biophys. Acta 1097:107-143, Page, M.J. y Sydenham, M.A. 1991, Biotechnology 9:64-68). Las células cultivadas en concentraciones crecientes de MTX desarrollan resistencias a la droga, mediante superproducción de la enzima diana, DHFR, como resultado de la amplificación del gen de la DHFR. Si un segundo gen está ligado al gen de la DHFR, éste es generalmente co-amplificado y super-expresado. Se conoce en la técnica que esta aproximación puede utilizarse para desarrollar líneas celulares que portan más de 1000 copias del (los) gen(es) amplificado(s). Posteriormente, cuando se retira el metotrexate, se obtienen líneas celulares que contienen el gen amplificado integrado en uno o más cromoso-
ma(s) de la célula hospedante.

El plásmido pC4 contiene, para expresar el gen de interés, el potente promotor de la repetición terminal larga (LTR) del Virus del Sarcoma de Rous (Cullen, et al., Molecular and Cellular Biology, Marzo, 1985:438-447) más un fragmento aislado del estimulador del gen inmediatamente precoz del citomegalovirus (CMV) humano (Boshart et al., 41:521-530 (1985)). Aguas abajo del promotor están los siguientes lugares de escisión únicos de enzimas de restricción, que permiten la integración de los genes: BamHI, Xba I y Asp718. Detrás de estos lugares de clonación, el plásmido contiene el intrón 3' y el lugar de poliadenilación del gen de la preproinsulina de rata. También pueden utilizarse para la expresión otros promotores altamente efectivos, por ejemplo el promotor de la \beta-actina humana, los promotores precoz y tardío del SV40, o las repeticiones terminales largas de otros retrovirus, por ejemplo HIV y HTLV1. Pueden utilizarse los sistemas de expresión génica Tet-Off y Tet-On de Clontech, y otros sistemas similares, para expresar la Neutroquina-\alpha de una forma regulada en células de mamíferos (Gossen, M., y Bujard, H. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551). Para la poliadenilación del mRNA, pueden utilizarse también otras señales, por ejemplo, los genes de la hormona de crecimiento humana o de la globina. Las líneas celulares estables que portan un gen de interés integrado en el cromosoma, pueden también seleccionarse después de la co-transfección, con un marcador de selección tal como gpt, G418 o higromicina. Es ventajoso utilizar más de un marcador de selección al comienzo, por ejemplo G418 más metotrexate.

El plásmido pC4 se digiere con la enzima de restricción Bam HI, y después se desfosforila utilizando fosfatasa intestinal de ternera, mediante procedimientos conocidos en la técnica. El vector después se aísla de un gel de agarosa al 1%.

La secuencia de DNA que codifica el dominio extracelular de la proteína Neutroquina-\alpha, se amplifica utilizando cebadores de oligonucleótios para PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen. El cebador 5', que contiene subrayado el lugar de restricción de Bam HI, una secuencia Kozak, un codón de iniciación AUG, una secuencia que codifica el péptido líder secretor del gen de la IL-6 humana, y 18 nucleótidos de la región de codificación 5' del dominio extracelular de la proteína Neutroquina-\alpha, tiene la siguiente secuencia:

5' GCGGGATCCGCCACCATGAACTCCTTCTCCACAAGCGCCTTCGGTCCAGTTGCCTTCTCCCTGGGG
CTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTCCCTGCCCCAGTTGTGAGACAAGGGGACCTGGCCAGC 3'

(SEQ ID NO:16). El cebador 3', que contiene subrayado el lugar de restricción de Bam HI y 18 nucleótidos complementarios a la región de codificación 3' inmediatamente anterior al codón de parada, tiene la siguiente secuencia:

5' GTGGGATCCTTACAGCAGTTTCAATGCACC 3' (SEQ ID NO:17).

El fragmento amplificado se digiere con la endonucleasa Bam HI y después se purifica de nuevo en un gel de agarosa al 1%. El fragmento aislado y el vector desfosforilado se ligan después con ligasa T4 de DNA. Las células E. coli HB101 o XL-1 Blue se trasforman después, y las bacterias que contienen el fragmento insertado en el plásmido pC4 se identifican utilizando, por ejemplo, análisis de enzimas de restricción.

Las células de ovario de hamster chino que carecen de un gen DHFR activo se utilizan para transfección. Cinco \mug del plásmido de expresión pC4 se co-transfectan con 0,5 \mug del plásmido pSVneo, utilizando lipofectina (Felgner et al., arriba). El plásmido pSVneo contiene un marcador de selección dominante, el gen neo del Tn5, que codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibióticos, incluyendo el G418. Las células se siembran en medio alpha menos MEM, suplementado con 1 mg/ml de G418. Después de 2 días, las células se tripsinizan y se siembran en placas de clonación de hibridoma (Greiner, Alemania), en medio alpha menos MEMM, suplementado con 10, 25 ó 50 ng/ml de metotrexate, más 1 mg/ml de G418. Después de alrededor de 10-14 días, los clones únicos se tripsinizan y después se siembran en placas de petri de 6 pocillos o en frascos de 10 ml, utilizando diferentes concentraciones de metotrexate (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Los clones que crecen a las concentraciones más altas de metotrexate se trasfieren entonces a placas de 6 pocillos nuevas, que contienen concentraciones incluso más altas de metotrexate (1 \muM, 2 \muM, 5 \muM, 10 mM, 20 mM). El mismo procedimiento se repite hasta que se obtienen clones que crecen a una concentración de 100-200 \muM. La expresión del producto del gen deseado se analiza, por ejemplo, mediante SDS-PAGE y Western blot, o mediante análisis HPLC de fase inversa.

Ejemplo 4 Distribución Tisular de la expresión del mRNA de la Neutroquina-\alpha

Se lleva a cabo un análisis de Northern blot para examinar la expresión del gen de la Neutroquina-\alpha en tejidos humanos, utilizando métodos descritos por, entre otros, Sambrook et al., citado anteriormente. Una sonda de cDNA que contiene la secuencia de nucleótidos entera de la proteína Neutroquina-\alpha (SEQ ID NO:1), se marca con ^{32}P, utilizando el sistema de marcaje de DNA rediprime™ (Amersham Life Science), según las instrucciones del fabricante. Después del marcaje, la sonda se purifica utilizando una columna CHROMA SPIN-100™ (Clontech Laboratories, Inc.), según el protocolo del fabricante número PT1200-1. La sonda marcada purificada se utiliza entonces para examinar varios tejidos humanos para mRNA de la Neutroquina-\alpha.

Northern blots de Múltiples Tejidos (MTN) que contienen varios tejidos humanos (H) o tejidos del sistema inmune humano (IM), obtenidos de Clontech, se examinan con la sonda marcada utilizando la solución de hibridación ExpressHyb™ (Clontech), según el protocolo del fabricante número PT1190-1. Después de la hibridación y el lavado, los blots se montan y se exponen a una película a -70ºC durante la noche, y las películas se desarrollan según procedimientos estándar.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: YU, GUO-LIANG

\hskip3.9cm

EBNER, REINHARD

\hskip3.9cm

NI, JIAN

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NEUTROQUINA ALFA

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 17

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: HUMAN GENOME SCIENCES, INC

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 9410 KEY WEST AVENUE

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: ROCKVILLE

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(D)

ESTADO: MD

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(E)

PAÍS: EE UU

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 20850

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: DISQUETE

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

PROGRAMA: PatentIn Release #1,0, Versión #1,30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS ACTUALES DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: BENSON, ROBERT H

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 30.446

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/DOCUMENTO: PF343

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (301) 309-8504

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: (301) 309-8512

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1100 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HECHO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 147..1001

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

HECHO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sig..peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 285..381

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

HECHO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat..peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 147..1001

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA. SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

(3) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 285 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

3

\vskip1.000000\baselineskip

(4) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 233 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

(5) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 205 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

(6) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 244 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

7

\vskip1.000000\baselineskip

(7) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 281 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

9

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(8) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 338 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

(9) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 509 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

11

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(10) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 497 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

(11) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGGATCCA GCCTCCGGGC AGAGCTG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(12) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGAAGCTTT TATTACAGCA GTTTCAATGC ACC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(13) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGTCATGAG CCTCCGGGCA GAGCTG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(14) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGAAGCTTT TATTACAGCA GTTTCAATGC ACC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(15) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGGATCCC CGGGCAGAGC TGCAGGGC

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(16) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGGATCCT TATTACAGCA GTTTCAATGC ACC

\hfill

33

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(17) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 129 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

(18) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SEQ: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGGATCCT TACAGCAGTT TCAATGCACC

\hfill

30

Claims (27)

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido Neutroquina-\alpha, donde dicha secuencia de polinucleótido se selecciona de un grupo que consiste en:

(a)

una secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido Neutroquina-\alpha de longitud completa, que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 al 285 de la SEQ ID NO:2;

(b)

una secuencia de polinucleótido que codifica el dominio extracelular del polipéptido Neutroquina-\alpha, que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 73 al 285 de la SEQ ID NO:2;

(c)

una secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de los residuos n al 285 de la SEQ ID NO:2, donde n es un número entero en el intervalo de 2-190, 1 al m de la SEQ ID NO:2, donde m es un número entero en el intervalo de 274-284, o n al m de la SEQ ID NO:2, donde n es un número entero en el intervalo de 2-190 y m es un número entero en el intervalo de 274-284, en las que la secuencia de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de Neutroquina-\alpha;

(d)

una secuencia de polinucleótido que es idéntica en al menos un 90% a la secuencia de polinucleótido definida en (a) o (b), y que codifica un polipéptido que tiene actividad de Neutroquina-\alpha;

(e)

una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90% a la secuencia de aminoácidos definida en (a), (b) o (c), en la que dicho polipéptido tiene actividad de Neutroquina-\alpha; y

(f)

una secuencia de polinucleótido que es el complemento de la secuencia de longitud completa de una secuencia de polinucleótido definida en (a) hasta (c).

2. Una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido Neutroquina-\alpha de longitud completa, es la que está codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito de ATCC Nº 97768.

3. Una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la secuencia de aminoácidos de dicho dominio extracelular del polipéptido Neutroquina-\alpha es la codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito de ATCC Nº 97768.

4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la actividad de Neutroquina-\alpha es la modulación de la proliferación, la diferenciación o la supervivencia de los linfocitos.

5. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que es idéntico, en al menos un 95%, a un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 134 al 285 de la SEQ ID NO:2.

6. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5 que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica los residuos de aminoácidos 134 al 285 de la SEQ ID NO:2.

7. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5 que consiste en la secuencia de polinucleótido que codifica los residuos de aminoácidos 134 al 285 de la SEQ ID NO:2

8. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que es DNA o RNA.

9. Un método de construir un vector recombinante que comprende insertar la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en un vector.

10. Un vector recombinante que contiene la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

11. El vector de la reivindicación 10 en la que la molécula de ácido nucleico está ligada operativamente a secuencias de control de la expresión, que permiten la expresión de dicho polinucleótido en células hospedantes procarióticas o eucarióticas.

12. Un método para construir una célula hospedante recombinante que comprende introducir el vector de las reivindicaciones 11 ó 12 en una célula hospedante.

13. Una célula hospedante manipulada genéticamente con la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

\newpage

14. Un proceso para producir un polipéptido Neutroquina-\alpha que tiene actividad de Neutroquina-\alpha, que comprende: cultivar la célula hospedante de la reivindicación 13 y recuperar el polipéptido Neutroquina-\alpha codificado por dicha molécula de ácido nucleico.

15. Un polipéptido Neutroquina-\alpha que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o que se obtiene mediante el proceso de la reivindicación 14.

16. El polipéptido Neutroquina-\alpha de la reivindicación 15, que es escindido proteolíticamente de la célula hospedante de la reivindicación 13.

17. El polipéptido de las reivindicaciones 15 ó 16 que está marcado.

18. El polipéptido de la reivindicación 17 que está marcado radiactivamente.

19. El polipéptido de la reivindicación 18, en el que el polipéptido está marcado radiactivamente con un radioisótopo seleccionado del grupo que consiste en:

(a) ^{131}I;

(b) ^{125}I;

(c) ^{121}I;

(d) ^{112}In; y

(e) ^{99m}Tc.

20. Un anticuerpo o una de sus partes, que se une específicamente a la parte de la Neutroquina-\alpha de un polipéptido Neutroquina-\alpha que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1(a) hasta 1(f), o la 7, o la parte de la Neutroquina-\alpha de un polipéptido Neutroquina-\alpha de las reivindicaciones 15 ó 16.

21. El anticuerpo o una de sus partes de la reivindicación 20, que es un antagonista del polipéptido de las reivindicaciones 15 ó 16.

22. El anticuerpo o una de sus partes de las reivindicaciones 20 ó 21, que se selecciona de un grupo que consiste en:

(a) un anticuerpo monoclonal;

(b) un anticuerpo policlonal;

(c) un anticuerpo quimérico;

(d) un fragmento Fab; y

(e) un fragmento F(ab')

23. El anticuerpo o una de sus partes de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a la 22 que está marcado.

24. El anticuerpo o una de sus partes de la reivindicación 23, que está marcado con un marcador seleccionado de un grupo que consiste en:

(a) un marcador enzimático;

(b) un radioisótopo;

(c) un marcador fluorescente; y

(d) biotina.

25. El anticuerpo o una de sus partes de la reivindicación 24, en el que el marcador es un radioisótopo seleccionado de un grupo que consiste en:

(a) ^{125}I;

(b) ^{121}I;

(c) ^{131}I;

(d) ^{112}In; y

(e) ^{99m}Tc.

26. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, o el anticuerpo o una de sus partes, de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25 y opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

27. Una composición diagnóstica que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, o el anticuerpo o una de sus partes, de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25.