BR112013012396A2 - anticorpos anti-ccl20 de neutralização - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ANTI-CCL20 DE NEUTRALIZAÇÃO. A presente invenção refere-se a novos anticorpos humanizados, quiméricos e de murino que têm especificidade de ligação pelo ligante de receptor de quimiocinas CC humano (CCL20). A presente invenção refere-se também a cadeias pesadas e leves dos referidos anticorpos. A invenção refere-se também a ácidos nucleicos isolados, vetores recombinantes e células hospedeiras que compreendem uma sequência que codifica uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve dos referidos anticorpos e a um método de preparo dos referidos anticorpos. Os anticorpos anti-CCl-20 da invenção podem ser usados em aplicações terapêuticas para o tratamento, por exemplo, de doenças inflamatórias e autoimunes e câncer.

Description

r' \ 1/146 kd

Relatório Descritivo da Patente de lnvenção para "ANTICOR- POS ANTI-CCL20 DE NEUTRALIZAÇÃO". O presente Pedido reivindica a prioridade ao Pedido de Patente Provisório U.S.

N° 61/415.614 depositado em 19 de Novembro de 2010. A

5 descrição deste Pedido é aqui incorporada por referência na Íntegra.

Campo da lnvenção A presente invenção refere-se a novos anticorpos humanizados, quiméricos e de murino especificamente dirigidos contra o Iigante 20 de qui- miocina CC (CCL20) humana.

Os anticorpos humanizados da invenção são

10 particularmente bem adequados como agentes terapêuticos para o trata- mento de doenças inflamatórias e autoimunes.

An,tec,ed,e,n,tes_d,a Invenção O sistema imune é um biocircuito altamente sofisticado usado pelo corpo para discriminar "não próprios" (por exemplo, organismos ou

15 substâncias estranhas) de "próprios". A detecção de "não próprios" no corpo pode resuttar em inflamação, na qual vários componentes celulares e mole- culares são orquestrados para responder a eventos potencialmente nocivos causados pelo organismo ou substância "não própria". Embora o processo inflamatório ajude a proteger o organismo contra o ataque extemo, desregu-

20 lação do sistema imune pode Ievar a consequências negativas, tat como au- toataque, por exemplo, doença autoimune.

Alterando a fúnção de moléculas inflamatórias, tais como quimiocinas, pode ser possÍvel reduzir o início e progressão de doenças relacionadas à respostas imuneMnflamatórias- Quimioclnas são uma família de pequenas proteinas (8-10 kDa)

25 que desempenham um papel central em inflamação.

Durante o processo inflamatóTio, quimiocinas são produzidas Iocaimente no local do estimulo nocivo e funcionam como protagonistas centrais para recrutar células do sis- tema imune que expressam seus receptores cognatos, sete receptores aco- plados à proteína G transmembrana (G Protein Coupled Receptors - GP-

30 CRS). CCL20, alternativamente designado quimiocina regulada por ativação e fígado (Liver and Activation Regulated Chemokine - LARC), proteína-3 alfa inflamatória de macrófagos (MlP-3a), ou Exodus-l, é uma quimiocina solúvel b \ í 2/146

Y que é expressa por células epiteliais. Queratinócitos epiteliais e células do revestimento sinovial são conhecidos por produzir grandes quantidades de CCL20 durante condições homeostáticas, bem como inflamatórias e patoló- gicas, tais como câncer, psoríase e artrite reumatoide. O receptor cognato 5 para CCL20 é o receptor 6 de quimiocina CC (CCR6); CCL20 é a única qui- miocina conhecida por interagir com CCR6. Em resposta aos sinais de C- CL20, células imunes possuindo CCR6, tais como células dendríticas (Den- dritic Cells - DCs) imaturas, células T de memória/efetuadoras e células-8, migram e se infiltrar nos tecidos circundantes, assim, ativando a cascata in- lO flamatória. Em viítude do fato de que expressão de CCL20 é significativa- mente aumentada na inflamação induzida por citocinas inflamatórias, tais como interleucina 1j3 (lL-1j3) e fator de necrose de tumor cl (Tumor Necrosis Factor cl - TNF-a), acred ita-se que a interação CCL20-CCR6 desempenhe 15 um papel em processos inflamatórios patológicos. A artrite reumatoide (Rheumatoid Arthritis - RA) é uma das do- enças autoimunes mais comuns. O primeiro sinal de RA é, muitas vezes si- novite, a qual se manifesta como uma articulação dolorida, inchada. Embora os fatores específicos que iniciam a sinovite permaneçam desconhecidas, 20 células epiteliais do revestimento sinovial e fibroblastos sinoviais são consi- derados indutores primários da reação inflamatória. Fluido sinovial de paci- entes com RA quimioatrai eficazmente monócitos humanos e células T auxi- liares 17 (Th17) pró-inflamatórias as quais, então, induzem e exacerbam o processo de RA inflamatória. Em virtude do fato de que céíulas sinoviais rea- 25 tivas são capazes de produzir grandes quantidades de CCL20 (particular- mente sob a influência de lL-1j3 e TNF-cx), embora CCR6 seja o principal re- ceptor de céluias Th17, acredita-se que a interação CCL20-CCR6 desempe- nhe um papel-chave no processo inflamatório. A interação CCL20-CCR6 também pode desempenhar um papel 30 importante em determinados tipos de dermatite. Psoríase, por exemplo, ini- cia com um evento psoriático nocivo na pele (induzido por fatores ambientais e/ou genéticos), seguido por infiltração de células Th17. Em virtude do fato

» ,.

'\ 4 3/146 a de que CCR6 é expresso sobre a superfície de células Th17, células B, célu- las dendríticas e células T efetuadoras que danificam tecidos, CCL20 pode representar um quimioatraente principal para estes tipos de células em pso- ríase. Outra evidência da importância da interação CCL20-CCR6 pode ser 5 encontrada em estudos que usam um modelo de psoríase com camundon- gos induzida por intedeucina 23 (1L-23 (Hedrick et al., J. C/in. Invest. 119: 2317-2329 (2009)). Neste modelo, injeção de IL-23 causa inflamação psoriá- tica dependente de interleucina 22 (IL-22). No entanto, camundongos Ccr6'" não exibem sintomas semelhantes à psoríase quando injetados com IL-23, 10 indicando que CCR6 é necessário para o desenvolvimento de psoríase. Queratinócitos humanos podem produzir grandes quantidades de CCL20, principalmente sob a influência das citocinas intedeucina 17 (IL- 17), IL-22 e TNF-ct derivadas de Th17. Embora CCL20 e CCR6 raramente sejam detectados na pele normal, ambos exibem altos níveis de expressão 15 em dermatite atópica e psoríase pustular. lndução forte de CCL20 e acúmulo de células CCR6" pode ser obseNado em análise imuno-histoqulmica mi- croscópica de lesões por dermatite humana. Estas observações fornecem evidência adicional para o papel de CCL20 e CCR6 no processo inflamatório de dermatite. 20 Produtos biológicos de MAb atualmente disponiveis para trata- mento de distúrbios imunes podem ser grosseiramente classificados em três grupos: inibidores de citocinas imunoestimulatórias (por exemplo, MAbs anti- TNF-a), eliminadores de células imunes (por exemplo, anticorpos monoclo- y nais anti-CD20) e bloqueadores de moléculas acessórias (por exemplo, Aba- 25 tacept). Estes agentes biológicos podem ser úteis no tratamento de doenças inflamatórias; no entanto, em virtude da não responsividade primária ou um declinio gradual da taxa de resposta a estes tratamentos, há uma necessi- dade urgente por produtos biológicos altemativos com novos mecanismos de ação para satisfazer as necessidades médicas de pacientes, por exem- 30 plo, com distúrbios mediados por CCL20/CCR6. Os anticorpos da presente invenção representam tais produtos biológicos altemativos. Sumário da inven£ão aí 4/146

J A presente invenção refere-se a anticorpos anti-CCl-20 de neu- tralização ou porções de ligação a antígeno dos mesmos. Em determinadas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 é um anticorpo anti-CCL20 humano humanizado, o qual pode compreender as regiões de determinação de com- 5 plementaridade (Complementary Determining Regions - CDRs) de anticor- pos anti-CCL20 humano de camundongo. Em algumas modalidades, o anti- corpo anti-CCl-20 é um anticorpo anti-CCl20 humano de camundongo Olj quimérico ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCL20 ou porção de 10 ligação a antígeno do mesmo se liga ao CCL20 humano. Em algumas moda- lidades, o anticorpo ou porção não se liga ao CCL16 humano. Os anticorpos da invenção se ligam especificamente ao CCL20. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou porção de ligação a antígeno do mesmo se liga ao CCL20 de macaco Cynomo/gus e/ou Rhesus, 15 bem como CCL20 humano. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- CCL20 ou porção de figação a antígeno do mesmo não se liga ao CCL20 de camundongo e/ou rato. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CCl-20 ou por- ção de ligação a antígeno se liga ao CCL20 humano, de macaco Cynomo/- gus e Rhesus, mas não ao CCL20 de camundongo e rato. 20 Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 Olj porção de ligação a antígeno do mesmo tem uma afinidade de Iigação (Kd) pelo CCL20 humano de menos de: - 1 nM, 500 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM ou 50 pM usando um ensaio de ressonância de plasmon em superficie monovalente, 25 ou -1 nM, 500 pM, 100 pM, 75 PM, 50 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 14pM,13pM,12pM,11pM,1OpM,9pM,8pM,7pM,6pMou5pMusan- do um ensaio de ressonância de plasmon em superfície bivalente. Em determinadas modalidades, o anticorpo ou porção tem uma 30 afinidade de ligação pelo CCL20 humano maior do que aquela de CCR6 humano. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCL20 ou porção de

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h » 5/146 4 ligação a antígeno do mesmo tem uma k, pelo CCL20 humano de menos de 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 ou 30 (xlO' M"' seg"'), conforme determinado por meio de ressonância de plasmon em superfície bivalente.

Em algumas mo- dalidades, o anticorpo anti-CCL20 ou porção de ligação a antígeno do mes- 5 mo tem uma Kd pelo CCL20 humano de menos de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 ou 3 (X10"5 s"1), conforme determinado por meio de ressonância de plasmon em superfície bivalente. ' Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCL20 ou porção de ligação a antígeno do mesmo tem um k, por CCL20 de macaco Rhesus de 10 menos de 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 ou 30 (X105 M"' seg"'), conforme de- terminado por meio de ressonância de plasmon em superficie bivalente.

Em algumas moclalidades, o anticorpo anti-CCl20 ou porção de ligação a anti- geno do mesmo tem uma Kd por CCL20 de macaco Rhesus de menos de 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 (xlO"' S"'), conforme determinado

15 por meio de ressonância de plasmon em superfície bivalente.

Em aigumas modalidades, o anticorpo anti-CCt20 ou porção de ligação a antlgeno do mesmo tem uma Kd por CCL20 de macac» Rhesus de menos de 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 ou 10 pM, conforme determinado por meio de res- sonância de plasmon em superfície bivalente. 20 Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou porção de ligação a antígeno do mesmo tem um k, por CCL20 de macaco Cynomo/gus de menos de 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 ou 30 (xlO' M"' seg"), conforme determinado por meio de ressonância de plasmon em su- . perfície bivalente.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou por- 25 ção de ligação a antigeno do mesmo tem uma Kd por CCL20 de macaco Cynomo/gus de menos de 50, 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou (x10"5 S"'), conforme determinado por meio de ressonância de plasmon em superfície bivalente.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCL20 ou porção de ligação a antígeno do mesmo tem uma K(j por C- 30 CL20 de maçaco Cynomo/gus de menos de 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16 ou 15 pM, conforme deteminado por meio de ressonância de plasmon em superflcie bivalente.

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Em algumas modaíidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou porção de ligação a antígeno do mesmo se liga ao CCL20 humano com uma ECso de menos de 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 39, 38, 37, 36, 35 ou 34 pM.

Em algu- mas modalidades, o anticorpo anti-CCL20 ou porção de ligação a antígeno

5 do mesmo se liga ao CCL20 de macaco Rhesus com uma EC® de menos de 500, 400, 300, 200, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70 , 65, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 ou 50 pM.

Em algumas modalidades, o anticor- po anti-CCl-20 ou porção de ligação a antígeno do mesmo se liga ao CCL20 de macaco Cynomolgus com uma ECso de menos de 500, 400, 350, 300,

10 250, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130 , 120, 110, 109, 108, 107, 106, 105, 104, 103ou 102 pM.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou porção de Iigação a antígeno do mesmo tem uma seletividade pelo CCL20 humano em relação à outras quimiocinas humanas incluindo, porém sem limitações,

15 CX3CL1, CXCLl, CXCL2, CXCL4, CXCL8, CXCL9, CXCLlO, CXCL12, CX- CL13, CXCL16, CCLl, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL11, CCL13, CCL16, CCL17, CCL19, CCL21, ,CCL22, CCL24, CCL25, CCL27, CCL28 e/ou XCLl.

Em determinadas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou por- ção de ligação a antlgeno tem uma seletividade pelo CCL20 humano em

20 relação a todas as referidas quimiocinas.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou porção de ligação a antígeno do mesmo reduz a quimiotaxia induzida por CCL20 hu- mano de células CCR6" humanas ou de camundongo com uma lCso de me- nos de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11,10, 9, 8,7, 6, 5,4, 3, 2, 1,7, 1,6,

25 1,5, 1,4, 1,3, 1,2 ou 1,1 nM.

Em determinadas modalidades, o anticorpo anti- CCL20 ou porção de Iigação a antígeno reduz a quimiotaxia induzida por CCL20 humano de células CCR6" humanas ou de camundongo com uma |C50 de menos de 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2 ou 1,1 nM.

Em algumas modali- dades, o anticorpo anti-CCl-20 ou porção de ligação a antígeno do mesmo

30 reduz a quimiotaxia induzida por CCL20 humano de células CCR6" humanas ou de camundongo com uma |C90 de menos de 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17,16, 15,14, 13, 12, 11,10, 9, 8,7,6,5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1,4,9, 4,8,

« 'K K

C 7/146 .m 4,7 ou 4,6 nM. Em determinadas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou porção de Iigação a antígeno do mesmo reduz a quimiotaxia induzida por CCL20 humano de células CCR6" humanas ou de camundongo com uma IC® de menos de 6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 4,9, 4,8, 4,7 ou 4,6 nM. Em al- 5 gumas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou porção de ligação a antíge- no do mesmo reduz a quimiotaxia induzida por CCL20 humano de células CCR6" humanas ou de camundongo com uma |C95 de menos de 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8 ou 7 nM. Em determinadas moda- Iidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou porção de Iigação a antigeno do mesmo 10 reduz a quimiotaxia induzida por CCL20 humano de células CCR6" humanas ou de camundongo com uma |C95 de menos de 10, 9,9, 9,8, 9,7, 9,6, 9,5, 9,4,9,3,9,2,9,1 ou9nM. Em algumas modalidades, o anticorpo antí-CCl.20 ou porção de ligação a antígeno reduz a quimiotaxia induzida por CCL20 humano de célu- 15 las CCR6" humanas ou de camundongo in vltm- Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou porção de ligação a antígeno reduz a quimiotaxia induzida por CCL20 humano de céiu- las CCR6" humanas ou de camundongo in vivo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCL20 ou porção de 20 Iigação a antígeno do mesmo reduz a progressão de sintomas de artrite (tais como lesões articulares das extremidades distais para o cotovelo ou joelho e · grau de eritema e edema) em um individuo, por exemplo, em um modelo de artrite induzida por colàgeno (Collagen Induced Arthritis - CIA) e/ou artrite induzida por isomerase de glicose-6-fosfato (GIucose-6-Phosphate lsomera- 25 se - G6Pl). Em algumas modalidades, o anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo reduz lesões ósseas em um indivíduo, incluindo osteo- porose, erosão óssea e/ou formação de novo osso, por exemplo, em um modelo de CIA. Em algumas modalidades, o anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo reduz os níveis séricos de proteína da matriz oligomé- 30 rica de cartilagem (Cartilage Oligomeric Matrix Protein - COMP) em um indi- vÍduo, por exemplo, em um modelo de CIA. Em algumas modalidades, o an- ticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo reduz os níveis de mRNA

8/146 .

do ativador de receptor para o ligante de fator nuclear íc8 (Receptor Activator for Nuclear Factor ic8 Ligand - RANKL), ativador de receptor para fator nu- clear kB (Receptor Activator for Nuclear Factor kB - RANK), fosfatase ácida resistente a tartrato (Tartrate Resistant Acid Phosphatase - TRAP) e/ou ca- tepsina K em um indivíduo, por exemplo, em um modelo de CIA em patas de camundongo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou porção de Iigação a antígeno do mesmo reduz os sintomas de dermatite atópica (por exemplo, secura, formação de escaras, eritema, inchaço/crostas e/ou escoriação) em um indivíduo, por exemplo, sintomas de dermatite atópica induzida por oxa- lO zolona em camundongos do gênero NC/Nga. Em algumas modalidades, o anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo reduz os sintomas de dermatite alérgica por contato em um indivíduo, por exemplo, sintomas de dermatite alérgica por contato induzida por dinitrofluorobenzeno (DNFB) em um modelo com camundongos. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCL20 ou porção de ligação a antigeno do mesmo compreende uma cadeia pesada cuja CDR3 (H-CDR3) compreende a sequência de SEQ ID NO: 67 ou 68. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou porção de Iigação a antígeno do mesmo compreende uma porção de cadeia leve cuja CDR3 (L-CDR3) compreende a sequência de SEQ ID NO 75. Em deteminadas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou por- ção de ligação a antlgeno do mesmo compreende uma H-CDR3 cuja se- quência compreende SEQ ID NO: 67 e uma L-CDR3 cuja sequência com- preende SEQ ID NO: 75 ou uma H-CDR3 cuja sequência compreende SEQ ID NO: 68 e uma L-CDR3 cuja sequência compreende SEQ ID NO: 75. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou porção de Iigação a antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada cuja cdri (H-CDRI), CDR2 (H-CDR2) e CDR3 (H-CDR3) compreendem, respectiva- mente, as sequências de: -SEQ ID NO: 60, 63 e 67; - SEQ ID NOS: 60, 64 e 67; - SEQ ID NO: 61, 65 e 68;

- SEQ ID NO: 77, 79 e 67; ou -SEQ ID NOS: 78, 80 e 68. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCL20 ou porção de ligação a antígeno do mesmo compreende uma porção de cadeia leve cuja

5 CDRI (L-CDRI), CDR2 (L-CDR2) e CDR3 (L-CDR3) compreendem, respec- tivamente, as sequências de: . - SEQ ÍD NO: 70, 73 e 75; ou -SEQ ID NO: 71, 73 e 75. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou porção de

10 ligação a antígeno do mesmo compreende: - Uma H-CDRI compreendendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 60-62, 77 e 78; - Uma H-CDR2 compreendendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 63-66 e 79-81;

15 - Uma H-CDR3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 67 ou 68; - Uma L-CDRI compreendendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 70-72; - Uma L-CDR2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73

20 ou 74; ou - Uma L-CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 75; ou qualquer combinação das mesmas.

Em determinadas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou por- . . ção de iigação a antígeno do mesmo compreende uma H-CDRI, H-CDR2,

25 H-CDR3, L-CDRI, L-CDR2 e L-CDR3 compreendendo, respectivamente, as sequências de: - SEQ ID NO: 60, 63, 67, 70, 73 e 75: - SEQ ID NO: 60, 64, 67, 70, 73 e 75; -SEQ ID NO: 61, 65, 68, 70, 73 e 75; 30 - SEQ ID NO: 77, 79, 67, 70, 73 e 75; - SEQ ID NO: 78, 80, 68, 70, 73 e 75; - SEQ ID NO: 60, 63, 67, 71, 73 e 75;

- SEQ ID NO: 60, 64, 67, 71, 73 e 75; - SEQ ID NO: 61, 65, 68, 71, 73 e 75; - SEQ ID NOS: 77, 79, 67, 71, 73 e 75; ou - SEQ ID NO: 78, 80, 68, 71, 73 e 75. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCl20 ou porção de figação a antígeno do mesmo compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 9-14. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCL20 ou porção de ligação a antígeno do mesmo compreende um dominio variá- lO vel de cadeia pesada que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 39, 41 e 43. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou porção de Íigação a antigeno do mesmo compreende um domínio variável de cadeia Ieve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 15 ou 16. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou porçâo de ligação a antígeno do mesmo compreende um dominio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 40, 42 e 44. Em determinadas moclalidades, o anticorpo anti-CCL20 ou por- ção de ligação a antígeno do mesmo compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve compreendendo, res- pectivamente, as sequências de: -SEQIDNO:9eSEQIDNO:15; -SEQID NO: 1OeSEQ1D NO:15: -SEQIDNO:11eSEQIDNO:15; -SEQIDNO:12eSEQ1DNO:15; -SEQID NO:13eSEQIDNO:15; -SEQID NO:14eSEQID NO: 15: -SEQ ID NO: 9e SEQ ID NO: 16; -SEQ IDNO: lOe SEQ ÍD NO:16: -SEQIDNO:11eSEQIDNO:16; -SEQID NO: 12eSEQID NO: 16;

-SEQID NO: 13 e SEQ ID NO: 16;ou -SEQID NO:14eSEQID NO: 16. Em determinadas modalidades, o anticorpo anti-CCL20 ou por- ção de ligação a antígeno do mesmo compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve compreendendo, res- pectivamente, as sequências de: - SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 40; - SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 42; - SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 44; -SEQID NO:41 e SEQ ÍD NO: 40; -SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 42; -SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 44; - SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 40; - SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 42; ou - SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 44. Em algumas modaíidades, o anticorpo anti-CCL20 ou porção de ligação a antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada tendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1-6 e 108 sem a sequência sinalizadora (se presente) e opcionalmente sem a lisina C-

terminal.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCl_20 ou porção de ligação a antígeno do mesmo compreende uma cadeia leve tendo uma se- quência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 7, 8, 110 e 112 sem a sequência sinalizadora (se presente)- Em determinadas modalidades, o anticorpo anti-CCl_20 compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve tendo, respectivamente, as sequências de: -SEQIDNO:1eSEQ1DNO:7; -SEQlDNO:2eSEQIDNO:7: -SEQIDNO:3eSEQIDNO:7; -SEQIDNO:4eSEQIDNO:7; -SEQIDNO:5eSEQIDNO:7; -SEQIDNO:6eSEQIDNO:7; -SEQIDNO:1eSEQIDNO:8;

-SEQIDNO:2eSEQÍDNO:8; -SEQIDNO:3eSEQIDNO:8; -SEQIDNO:4eSEQIDNO:8; -SEQIDNO:5eSEQIDNO:8; 5 -SEQIDNO:6eSEQIDNO:8; -SEQID NO: 108 e SEQ ID NO: 110; ou -SEQIDNO:108e112; ambas as referidas sequências sem a sequência sinalizadora SEQ ID NOS: 1-6 108 e opcionalmente sem a lisina C-terminal.

10 A presente invenção também proporciona um anticorpo anti- CCL20 ou uma porção de ligação a antlgeno do mesmo que compreende um dominio variável de cadeia pesada codificado por uma sequência sele- cionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 25-30. Em algumas moda- lidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou porção de ligação a antígeno do mesmo 15 compreende um domínio variável de cadeia pesada cocjMcado por uma se- quência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 51, 53 e 55. Ainda, a presente invenção proporciona um anticorpo anti- CCL20 ou uma porção de ligação a antlgeno do mesmo que compreende um domínio variável de cadeia leve codificado pela sequência de SEQ ID 20 NO: 31 ou 32. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCt-20 ou porção de ligação a antígeno do mesmo compreende um dominio variável de cadeia · leve codificado por uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 52, 54e 56. Em determinadas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou por- 25 ção de ligação a antígeno do mesmo compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, respectivamente, codi- ficados pelas sequências de: - SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 31; -SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 31; 30 -SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 31; -SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 31; - SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 31;

-SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31; - SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 32; -SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 32; - SEQ ÍD NO: 27 e SEQ ID NO: 32; 5 - SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 32; - SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 32; ou - SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 32. Em determinadas modalidades, o anticorpo anti-CCL20 ou por- ção de ligação a antígeno do mesmo compreende um domínio variável de

10 cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, respectivamente, codi- ficados pelas sequências de: - SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52: -SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 54; - SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 56; 15 - SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 52; - SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 54; - SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 56; - SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 52; - SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 54; ou 20 - SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 56. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou porção de iigação a antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada codificada por uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 17- 4 22 e 109, a referida sequência carecendo da sequência que codifica uma 25 sequência sinaíizadora (se presente) e opcionalmente sem a sequência que codifica a lisina C-terminal.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti- CCL20 ou porção de ligação a antígeno do mesmo compreende uma cadeia Ieve codificada por uma sequência selecionada do gmpo que consiste em SEQ ID NOS: 23, 24, 111 e 113, a referida sequência carecendo da sequên- 30 cia que codifica uma sequência sinalizadora (se presente). Em determinadas modalidades, o anticorpo anti-CCL20 compreende uma cadeia pesada e uma cadeia Ieve, respectivamente, codificadas pelas sequências de:

-SEQID NO:17eSEQID NO:23; -SEQID NO: 18eSEQID NO:23; -SEQID NO:19e SEQID NO:23; -SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 23; 5 - SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 23; -SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23; -SEQID NO:17eSEQID NO:24; -SEQID NO:18eSEQID NO:24; -SEQlDNO:19eSEQIDNO:24; 10 - SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 24; - SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 24; - SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24; -SEQIDNO:109eSEQIDNO:111;ou -SEQIDNO:109eSEQ1D NO:113: 15 ambas as referidas sequências que não tendo a sequência que codifica uma sequência sinalizadora (se presente), SEQ ID NOs: 17-22 e 109, opcionalmente sem a sequência que codifica a lisina C-terminal.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCli20 ou porção de ligação a antígeno do mesmo é humanizado ou quimérico.

Em algumas mo- 20 dalidades, as regiões de framewoik da cadeia pesada do anticorpo anti- CCL20 humanizado ou porção do mesmo utilizam um gene de linhagem

. germinativa humana IGHV1-46*03 (Vide, por exemplo, Altschul et al., "Gap- ped BLAST e PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search ' Programs", Nuc/eic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). Em determinadas 25 modalidades, as regiões de hamework da cadeia pesada têm pelo menos 50% de homologia com as regiões de hamework do gene da Iinhagem ger- minativa humana IGHV1-46*03. Por exempb, as regiões de hamework de cadeia pesada podem ter pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95°6, pelo menos 30 98°6, peb menos 99°6 ou mesmo 100% de identidade com as regiões de framework do gene da linhagem germinativa humana IGHV1-46*03. Em al- gumas modalidades, as regiões de framework da cadeia leve do anticorpo humanizado anti-CCl-20 ou porção do mesmo utilizam o gene da linhagem germinativa humana IGKV1D-39*01 (vide Altschul et al., Supra). Em deter- minadas modalidades, as regiões de framework de cadeia leve têm pelo menos 50% de homologia com as regiões de framework do gene da linha-

5 gem germinativa humana IGKV1D-39*01. Por exemplo, as regiões de fm- mework de cadeia leve podem ter de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80°6, pelo menos 90%, pelo menos 95°/o, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mesmo 100% de identidade com as regi- ões de hamework do gene da linhagem germinativa humana IGKV1D- 1O 39*01. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 ou porção de ligação a antigeno do mesmo (contanto em que a referida porção compre- enda pelo menos parte de uma região constante de cadeia pesada) é uma molécula de lgG, lgM, IgE, lgA ou lgO.

Em determinadas modaiidades, o 15 anticorpo anti-CCl.20 ou porção de ligação a antigeno do mesmo é do subti- po IgGl, lgG2, lgG3 ou lgG4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCL20 é um anticor- po monoclonal.

A presente invenção também proporciona um anticorpo anti- 20 CCL20 ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga a um epitopo de CCL20 humano localizado no N-loop e/ou reglão de hairpina j32-

. j33 da molécula.

Em algumas modalidades, o referido anticorpo anti-CCl-20 ou porção do mesmo se Iiga ao mesmo epitopo sobre CCL20 humano que q um anticorpo ou porção do mesmo conforme descrito aqui.

Ainda, a presente 25 invenção proporciona um anticorpo anti-CCl-20 ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo que compete ou inter-compete pela ligação ao CCL20 humano com um anticorpo ou porção do mesmo descrita aqui.

Em algumas modalidades, o epitopo de CCL20 humano ligado pelo anticorpo ou porção de ligação a antígeno da invenção compreende 30 uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consis- te em: - Resíduos 7-9 de SEQ ID NO: 84;

- Resíduos 10-19 de SEQ ID NO: 84; - Residuos 20-21 de SEQ ID NO: 84; e - Resíduos 20-22 de SEQ ID NO: 84, ou os residuos de CCL20 humano do tipo silvestre que corres-

5 pondem aos referidos resíduos de SEQ ÍD NO: 84. Em algumas modalidades, o referido epitopo de CCL20 humano compreende ainda uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: - Resíduos 39-55 de SEQ 1D NO: 84; 10 - Resíduos 39-57 de SEQ ID NO: 84; - Resíduos 56-67 de SEQ ID NO: 84; e - Resíduos 61-70 de SEQ ID NO: 84, ou os resíduos de CCL20 humano do tipo silvestre que corres- pondem aos referidos resíduos de SEQ ID NO: 84. 15 Em determinadas modalidades, o referido epitopo de CCL20 humano compreende quaiquer combinação das sequências de aminoácidos que consistem nos resíduos 7-9, 10-19, 20-22, 39-55, 56-57 e 61-70 de SEQ ID NO: 84 ou os resíduos de CCL20 humano do tipo siívestre que corres- pondem aos referidos resíduos de SEQ ID NO: 84. 20 Em determinadas modalidades, o referido epitopo de CCL20 humano compreende os residuos 7-9, 10-19 e 20-22 de SEQ ID NO: 84 ou

· os reslduos de CCL20 humano do tipo silvestre que correspondem aos refe- ridos resíduos de SEQ ID NO: 84. Em determinadas modalidades, o referido q epitopo de CCL20 humano compreende os resíduos 7-9, 10-19, 20-22, 39-

25 55, 56-57 e 61-70 de SEQ ID NO: 84 ou os resíduos do tipo silvestre huma- no CCL20 que correspondem aos referidos resíduos de SEQ ID NO: 84. Em determinadas modalidades, o referido epitopo de CCL20 humano compre- ende os resíduos 7-9, 10-19, 20-22, 39-57 e 61-70 de SEQ ID NO: 84 ou os resíduos de CCL20 humano do tipo silvestre que correspondem aos referi-

30 dos resíduos de SEQ ID NO: 84. Em determinadas modalidades, o referido epitopo de CÇL20 humano compreende os resíduos 7-9, 10-19 e 20-21 de SEQ ID NO: 84 ou os resíduos de CCL20 humano do tipo silvestre que correspondem aos refe- ridos resíduos de SEQ ID NO: 84. Em determinadas modalidades, o referido epitopo de CCL20 humano compreende os resíduos 7-9, 10-19, 20-21, 39- 55, 56-67 e 61-70 de SEQ ID NO: 84 ou os resíduos do tipo silvestre huma-

5 no CCL20 que correspondem aos referidos resíduos de SEQ ID NO: 84. Em determinadas modalidades, o referido epitopo de CCL20 humano compre- ende os resíduos 7-9, 10-19, 20-21, 39-57 e 61-70 de SEQ ID NO: 84 ou os resíduos de CCL20 humano do tipo silvestre que correspondem aos referi- dos resíduos de SEQ ID NO: 84. 10 Em algumas modalidades, o epitopo de CCL20 humano Iigado pelo anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo compreende um ou mais resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO: 84 (ou os resíduos de C- CL20 humano do tipo silvestre que correspondem aos referidos resíduos de SEQ ID NO: 84) selecionados dos resíduos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,

15 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 e 70 ou qualquer combinação dos mesmos.

A presente invenção proporciona também uma porção de liga- ção a antigeno de qualquer um dos anticorpos anti-CCl-20 descritos aqui.

A

20 referida porção de ligação a antígeno pode ser, por exemplo, um anticorpo com uma única cadeia, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, molécula Fv de cadeia única (SCFV), dímero de Fv com uma única cadeia biespecífico, multlmero de Fv com uma única cadeia polivalente, diacorpos, anticorpo com dominio de- è Ietado ou anticorpo com um único domínio (dAb). 25 A presente invenção também proporciona uma variante de um anticorpo ou porção de ligação a antígeno conforme descrito aqui, em que a referida variante difere do anticorpo ou porção por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições de aminoácidos.

Em um aspecto, a presente invenção fomece um anticorpo diri- 30 gido contra CCL20 humano, em que o domínio variável de cadeia pesada e o dominio variável de cadeia Ieve do referido anticorpo compreendem, res- pectivamente, as sequências de:

-SEQIDNO:9e15; -SEQ ÍD NOS: 9e 16; -SEQID NO: 1Oe16: -SEQIDNO:11e15; 5 -SEQIDNO:11e16; -SEQID NO:12e16: -SEQID NOS: 13e16;ou -SEQID NOS: 14e16. Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo 10 cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 1 e cuja cadeia leve compre- ende SEQ ID NO: 7, em que as referidas sequências de aminoácidos care- cem de sequências sinalizadoras. Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticor- po cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 1 sem a lisina C-terminal e 15 cuja cadeia leve compreende SEQ ÍD NO: 7, em que as referidas sequên- cias de aminoácidos carecem de sequências sinalizadoras. Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 1 e cuja cadeia leve compre- ende SEQ ID NO: 8, em que as referidas sequências de aminoácidos care- 20 cem de sequências sinalizadoras. Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticor- po cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 1 sem a Iisina C-terminal e cuja cadeia leve compreende SEQ ID NO: 8, em que as referidas sequên- . cias de aminoácidos carecem de sequências sinalizadoras.

25 Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 2 e cuja cadeia Ieve compre- ende SEQ ID NO: 8, em que as referidas sequências de aminoácidos care- cem de sequências sinalizadoras. Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um artticor- 30 po cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 2, sem a lisina C-terminal e cuja cadeia leve compreende SEQ ID NO: 8, em que as referidas sequên- cias de aminoácidos carecem de sequências sinalizadoras.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 3 e cuja cadeia Ieve compre- ende SEQ ID NO: 7, em que as referidas sequências de aminoácidos care- cem de sequências sinalizadoras. 5 Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticor- po cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 3, sem a Iisina C-terminal e cuja cadeia leve compreende SEQ ID NO: 7, em que as referidas sequên- cias de aminoácidos carecem de sequências sinalizadoras.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo

10 cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 3 e cuja cadeia leve compre- ende SEQ ID NO: 8, em que as referidas sequências de aminoácidos care- cem de sequências sinalizadoras.

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticor- po cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 3, sem a lisina C-terminal e 15 cuja cadeia leve compreende SEQ ID NO: 8, em que as referidas sequên- cias de aminoácidos carecem de sequências sinalizadoras.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 4 e cuja cadeia leve compre- ende SEQ ID NO: 8, em que as referidas sequências de aminoácidos care- 20 cem de sequências sinalizadoras.

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticor- po cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 4, sem a lisina C-terminal e cuja cadeia leve compreende SEQ ID NO: 8, em que as referidas sequên- , cias de aminoácidos carecem de sequências sinalizadoras. 25 Em um aspedo, a presente invenção proporciona um anticorpo cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 5 e cuja cadeia leve compre- ende SEQ ID NO: 8, em que as referidas sequências de aminoácidos care- cem de sequênclas sinalizadoras.

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticor- 30 po cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 5, sem a lisina C-terminal e cuja cadeia leve compreende SEQ ID NO: 8, em que as referidas sequên- cias de aminoácidos carecem de sequências sinalizadoras.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 6 e cuja cadeia leve compre- ende SEQ ID NO: 8, em que as referidas sequências de aminoácidos care- cem de sequências sinalizadoras. 5 Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticor- po cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 6, sem a lisina C-terminal e cuja cadeia leve compreende SEQ ID NO: 8, em que as referidas sequên- cias de aminoácidos carecem de sequências sinalizadoras. ¥

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo 10 cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 108 e cuja cadeia leve com- preende SEQ ID NO: 110. Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticor- po cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 108, sem a Iisina C-terminal e cuja cadeia leve compreende SEQ ID NO: 110. 15 Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 108 e cuja cadeia Ieve com- preende SEQ ID NO: 112. Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticor- po cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 108, sem a lisina C-terminal 20 e cuja cadeia leve compreende SEQ ID NO: 112. Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma ou mais moléculas de ácido nucleico, por exemplo, moléculas de ácido nucleico isoladas, que codificam uma cadeia pesada ou uma porção de ligação a an- ' tígeno da mesma ou uma cadeia Ieve ou uma porção de ligação a antlgeno 25 da mesma, em que as referidas cadeia pesada e cadeia Ieve ou porções de ligação a antigeno das mesmas podem se associar para formar um anticor- po anti-CCL20 ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo.

Em algu- mas modaiidades, a molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia pesa- da ou uma porção de ligação a antígeno da mesma compreende uma se- 30 quência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 17-22, 25-30 e 109 ou a referida sequência de nucleotídeos sem a sequência que codifica uma sequência sinalizadora, se presente.

As se-

quências de nucleotídeos de SEQ ID NOs: 17-22 e 109 também podem, op- cionalmente, carecer da sequência que codifica a lisina C-terminal, se pre- sente. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou uma porção de ligação a antígeno da mesma compreende 5 uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 23, 24, 31, 32, 111 e 113 ou a referida sequência de nucleotídeos sem a sequência que codifica uma sequência sinalizadora, se presente. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico codíficam a cadeia pesada ou uma porção de ligação a antígeno da mesma e a cadeia 10 leve ou uma porção de ligação a antígeno da mesma de um anticorpo ou porção, conforme descrito aqui. Em determinadas modalidades, uma molé- cula de ácido nucleico codifica a referida cadeia pesada ou uma porção de ligação a antígeno da mesma e a referida cadeia Ieve ou ijma porção de li- gação a antígeno da mesma. 15 Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada ou uma porção de Iigação a antígeno da mesma, a molécu- la de ácido nucleico que codifica a cadeia Ieve ou uma porção de ligação a antígeno da mesma ou molécula(s) de ácido nucleico que codifica(m) a ca- deia pesada e a cadeia leve ou porções de ligação a antígeno das mesmas 20 são usadas para o tratamento de um indivíduo que precisa do mesmo. Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um vetor compreendendo a(s) sequência(s) de ácido nucleico que codifica(m) a ca- deia pesada ou uma porção de ligaçáo a antigeno da mesma, a cadeia leve ¶ ou uma porção de iigação a antígeno da mesma ou ambas de um anticorpo 25 ou porção, conforme descrito aqui. Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma célula que expressa a cadeia pesada ou uma porção de ligação a antígeno da mesma, a cadeia leve ou uma porção de ligação a antígeno da mesma ou ambas de um anticorpo ou porção, conforme descrito aqui.

30 Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para produção de um anticorpo ou porção conforme descrito aqui que com- preende manutenção de uma célula conforme descrito aqui sob condições adequadas para expressão do anticorpo ou porção.

Em algumas modalida- des, o método compreende a etapa de isolamento do anticorpo ou porção.

A presente invenção também proporciona um método de produ- ção de um hibridoma que secreta um anticorpo anti-CCl-20. Em determina-

das modalidades, o hibridoma produz um anticorpo que se liga ao CCL20 humano do tipo silvestre.

A invenção proporciona também um hibridoma produzido por meio dos métodos da invenção.

Opcionalmente, o anticorpo monoclonal secretado pelo hibridoma é coletado e pode ainda ser purificado (por exemplo, substancialmente purificado, isolado)- Em outras modalidades,

o método compreende ainda determinação da sequência de nucleotídeos do anticorpo monoclonal secretado pelo hibridoma.

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma com- posição compreendendo um anticorpo ou porção conforme descrito aqui e um veiculo ou carreador farmaceuticamente aceitável.

Em um aspecto, o anticorpo ou porção conforme descrito aqui é usada como um medicamento.

Em determinadas modalidades, o anticorpo ou porção conforme descrito aqui é usada para o tratamento de um indivíduo que precisa do mesmo.

Em modalidades particulares, o anticorpo ou porção é usada para tratar uma condição associada ao CCR6, uma condição asso-

ciada ao CCL20 ou ambas.

Tais condições incluem, porém sem limitações, doenças inHamatórias e autoimunes, em especial artrite, especialmente artri- te reumatoide, dermatite atópica ou alérgica e psoríase.

Em uma outra mo- dalidade particular, o anticorpo ou porção é usada para tratar câncer.

O anti- corpo ou porção pode ser usada para tratar, por exemplo, doença de Grave,

vitiligo, hipertiroidismo, artrite reumatoide, psoríase, dermatite atópica, der- matite de contato, doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, doen- ças malignas de células B, adenocarcinoma da mama, hepatite crônica, dermatite de contato, glioblastoma, carcinoma hepatocelular, infecção por papiloma vírus humano do cérvix, micose fungoide, adenocarcinoma de pâncreas, doença periodontal, carcinoma papilar da tireoide, pustulose pal- mar e plantar, condições associadas ao exantema maculopapular, epidermó- lise bolhosa, alopecia areata, esclerose múltipla, polimiosite, dermatomiosite,

doença de Behçet, pustulose exantemática aguda generalizada, vasculites, artrite juvenil idiopática, sarcoidose, asma brônquica, rinite alérgica, rejeição a aloenxerto renal, doença enxerto-versus-hospedeiro, rejeição a aloenxer- tos de fígado, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cística, glomeru- 5 lonefrite, infecção pelo vÍrus sincicial respiratório, mieloma múltiplo e/ou his- tiocitose de células de Langerhans. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 Olj porção é usada para reduzir a quimiotaxia de células CCR6" mediada por CCL20 em um indivíduo que precisa do mesmo. 10 Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona:

1. Um anticorpo anti-CCL20 humano monoclonal ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, em que o referido anticorpo compreende uma cadeia pesada cuja região de determinação de complementaridade 3 (CDR3) compreende SEQ ID NO: 67 ou 68. 15 2. O anticorpo monoclonal ou porção de ligação antígeno do mesmo de acordo com a modalidade 1, em que a região de determinação de compiementaridade 1 (CDRI), região de determinação de complementarida- de 2 (CDR2) e região de determinação de complementaridade 3 (CDR3) da referida cadeia pesada compreendem, respectivamente, as sequências de 20 aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: a) SEQ ID NOS: 60, 64 e 67; b) SEQ ID NO: 60, 63 e 67; C) SEQ ID NO: 61, 65 e 68; y d) a SEQ ID NOS: 77, 79 e 67; e 25 e) SEQ ID NOS: 78, 80 e 68.

3. Um anticorpo anti-CCl-20 humano monoclonal ou uma porção de ligação a antlgeno do mesmo, em que o referido anticorpo compreende uma cadeia leve cuja região de determinação de complementaridade 3 (C- DR3) compreende SEQ ID NO: 75. 30 4. O anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antígeno de acordo com a modalidade 3, em que a região de determinação de comple- mentaridade 1 (CDRI), região de determinação de complementaridade 2

(CDR2) e região de determinação de compiementaridade 3 (CDR3) da refe- rida cadeia leve compreendem, respectivamente, as sequências de aminoá- cidos selecionadas do grupo que consiste em: a) SEQ ID NOS: 70, 73 e 75; e b) SEQ ID NOS: 71, 73 e 75.

5. O anticorpo ou porção de ligação a antígeno de acordo com a modalidade 1 ou 3, em que a cadeia pesada do referido anticorpo compre- ende uma CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 67 ou 68 e a cadeia leve do referido anticorpo compreende uma CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 75.

6. O anticorpo ou porção de ligação a antigeno de acordo com a modalidade 2 ou 4, em que as referidas CDRI, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e as referidas CDRI, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, respectivamen- te, compreendem as sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: a) SEQ ID NOS: 60, 64, 67, 70, 73 e 75: b) SEQ ID NOS: 60, 64, 67, 71, 73 e 75; C) SEQ ID NO: 60, 63, 67, 70, 73 e 75; d) SEQ ID NO: 60, 63, 67, 71, 73 e 75; e) SEQ ID NOS: 61, 65, 68, 70, 73 e 75; f) a SEQ ID NOS: 61,65, 68, 71, 73 e75; g) a SEQ ID NOS: 77, 79, 67, 70, 73 e 75; h) SEQ ID NOS: 77, 79, 67, 71, 73 e 75; i) SEQ ID NO: 78, 80, 68, 70, 73 e 75; e j) SEQ ID NOS: 78, 80, 68, 71, 73 e 75.

7. Um anticorpo anti-CCL20 humano monoclonal ou uma porção de iigação a antígeno do mesmo, em que o referido anticorpo c'ompreende uma cadeia pesada cujo domínio variável compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 9-14.

8. Um anticorpo anti-CCl-20 humano monoclonal ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, em que o referido anticorpo compreende uma cadeia leve cujo dominio variável compreende SEQ ID NO: 15 ou 16.

9. O anticorpo ou porção de ligação a antígeno de acordo com a modalidade de 7 ou 8, em que o referido domínio variável de cadeia pesada e o referido domlnio variável de cadeia leve compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: a)SEQIDNOS:9e15; 5 b)SEQIDNOS:9e16; C) SEQlD NOS: 1Oe16; d)SEQIDNO:11e15; e)SEQIDNOS:11e16; f)SEQIDNOS:12e16; g)aSEQIDNOS:13e16;e h)SEQIDNOS:14e16.

10. Um anticorpo anti-CCl-20 humano monoclonal cuja cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1-6 sem a sequência sinalizadora e SEQ ID NO: 108.

11. Um anticorpo anti-CCL20 humano monoclonal cuja cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que Consiste em SEQ ID NOS: 1-6 sem a sequência sinalizadora e SEQ ID NO: 108, em que a referida sequência de aminoácidos carece da lisina C- terminal

12. Um anticorpo antl-CCL20 humano monoclonal cuja cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 7 e 8 sem a sequência sinalizadora e SEQ ID NOS:11Oe112.

13. O anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades 10-12, em que a referida cadeia pesada e a referida cadeia leve compreen- dem, respectivamente, as sequências de aminoácidos selecionadas do gru- po que consiste em: a)SEQIDNOS:1e7; b)SEQIDNOS:1e8; c)SEQIDNOS:2e8; d)SEQIDNOS:3e7;

e)SEQIDNOS:3e8: f)SEQIDNOS:4e8; g)SEQIDNOS:5e8; h)SEQIDNOS:6e8; 5 i)SEQIDNOS:108e110;e j)sEQID NOS:108e112; em que as referidas sequências de aminoácidos não têm se- quências sinalizadoras, se presentes, e em que SEQ ID NOS: 1-6 carecem opcionalmente da lisina C-terminal. 10 14. Um anticorpo monoclonal cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 108 e cuja cadeia Ieve compreende SEQ ID NO: 110.

15. Um anticorpo monoclonal cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 108 sem a lisina C-terminal e cuja cadeia leve compreende SEQIDNO:11O. 15 16. Um anticorpo monoclonal cuja cadeia pesada compreende seq id no: 108 e cuja cadeia Ieve compreende SEQ ID NO: 112.

17. Um anticorpo monoclonal cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 108 sem a lisina C-terminal e cuja cadeia leve compreende SEQIDNO:112. 20 18. Um anticorpo monoclonal anti-CCl-20 humano ou uma por- ção de Iigação a antígeno do mesmo que se liga ao mesmo epitopo de C- CL20 humano que o anticorpo monocbnal ou porção de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades 1-17. . 19. Um anticorpo monoclonal anti-CCl-20 humano ou uma por- 25 ção de Iigação a antígeno do mesmo que compete pela Iigação ao CCL20 humano com o anticorpo monoclonal ou porção de Iigação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades 1-17.

20. Um anticorpo anti-CCl-20 humano monoclonal ou uma por- ção de ligação a antígeno do mesmo que inter-compete pela Iigação ao C- 30 CL20 humano com o anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades 1-17.

21. O anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades 1-12, em que o anticorpo é um anticorpo humanizado.

22. O anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antlgeno de acordo com qualquer uma das modalidades 1-6, em que as regiões de fra- 5 mework da referida cadeia pesada utilizam um gene de linhagem germinati- va humana IGHV140*03 e em que as regiões de hamework da referida ca- deia leve utüizam um gene de Iinhagem germinativa humana IGKVI D-39*01.

23. O anticorpo monoclonal de qualquer uma das modalidades 1-9 e 18-22, em que o referido anticorpo compreende um domínio constante de igGl, lgG2, IgG3 ou lgG4 humana.

24. Um anticorpo m,onoclonal anti-CCl-20 humano ou uma por- ção de ligação a antígeno do mesmo cuja cadeia pesada compreende um domlnio variáve! compreendendo uma sequência de aminoácidos seleciona- da do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 39, 41 e 43.

25. Um anticorpo monoclonal anti-CCl_20 humano ou uma por- ção de ligação a antigeno do mesmo cuja cadeia leve compreende um do- mínio variável compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada "do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 40, 42 e 44.

26. O anticorpo ou porção de Iigação a antígeno de acordo com a modaiidade de 24 ou 25, em que a referida cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 39, 41 e 43 e em que a referida cadeia leve compreende uma se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 40, 42 e 44. ,

27. O anticorpo de modalidade 26, em que a referida cadeia pe- sada e a referida cadeia Ieve compreendem, respectivamente, as sequên- cias de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: a) SEQ ID NOS: 39 e 40; b)SEQIDNOS:41e42;e c)SEQIDNOS:43e44.

28. Um anticorpo anti-CCl-20 humano monoclonal ou uma por- ção de Iigação a antígeno do mesmo, em que o referido anticorpo compre-

ende uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 39 e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 40.

29. O anticorpo monoclonal ou porção de Iigação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades 24-28, em que o referido anti- 5 corpo é um anticorpo quimérico.

30. A porção de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades 1-9, 18-22 e 24-28, em que a referida porção é um anticor- po com uma única cadeia, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, molécufa Fv com uma Única cadeia (SCFv), dlmero de Fv com uma única cadeia biespecifico, dia- lO corpos, anticorpo com domínio deletado ou anticorpo com um único domínio (dAb)-

31. O anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades 1-30, em que o referido anticor- po ou porção de Iigação a antigeno tem uma ou mais propriedades selecio- nadas do grupo que consiste em: a) nâo se liga ao CCL16 humano; b) se liga ao CCL20 de macaco Cynomo/gus ou Rhesus, mas não ao CCL20 de camundongo ou rato; C) tem uma afinidade de ligação pelo CCL20 humano de 70 pM ou menos usando um ensaio de ressonância de plasmon em superfície mo- novalente; d) tem uma afinidade de ligação pelo CCL20 humano de 12 pM ou menos usando um ensaio de ressonãncia de pIasmon em superfície biva- Iente; e) tem uma afinidade de ligação pelo CCL20 humano maior do que aquela pelo CCR6 humano; f) tem uma seletividade pelo CCL20 humano em relação ao CX3CL1, CXCLl, CXCL2, CXCL4, CXCL8, CXCL9, CXCLlO, CXCL12, CX- CL13, CXCL16, CCLl, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL11, CCL13, CCL16, CCL17, CCL19, CCL21, CCL22, CCL24, CCL25, CCL27, CCL28 ou XCLI humano; g) reduz a quimiotaxia induzida por CCL20 humano de células

CCR6" com uma |C50 de 1,7 nM ou menos; h) reduz a quimiotaxia induzida por CCL20 humano de células CCR6' in vivo; i) reduz a quimiotaxia induzida por CCL20 humano de células 5 CCR6" Ln vitro; j) reduz a progressão de sintomas de artrite em um indivíduo; k) reduz a osteoporose, erosão óssea ou formação de novo osso em um indivlduo; I) reduz os níveis séricos de proteína da matriz oligomérica de cartilagem (COMP) em um individuo; m) reduz os níveis de mRNA de RANKL, RANK, TRAP ou ca- tepsina K em um indivíduo; n) reduz a progressão de dermatite atópica em um indivíduo; e O) reduz a progressão de dermatite de contato alérgica em um indivlduo.

32. Um anticorpo monoclonal anti-CCl-20 humano ou uma por- ção de ligação a antígeno do mesmo que se liga a um epitopo de CCL20 humano compreendendo uma ou mais sequências de aminoácidos selecio- nadas do grupo que consiste em: a) resíduos 7-9 de SEQ ID NO: 84; b) resíduos 10-19 de SEQ ID NO: 84; e C) resíduos 20-22 de SEQ ID NO: 84.

33. O anticorpo monoclonal ou uma porção de ligação a antige- no de acordo com a modalidade 32, em que o referido epitopo compreende os residuos 7-9, 10-19 e 20-22 de SEQ ID NO: 84.

34. O anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antígeno de acordo com a modalidade 32, em que o referido epitopo compreende ainda uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consis- te em: a) resíduos 39-55 de SEQ ID NO: 84; b) resíduos 56-67 de SEQ ID NO: 84; e C) reslduos 61-70 de SEQ ID NO: 84.

35. O anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antígeno de acordo com a modalidade 34, em que o referido epitopo compreende os re- sÍduos 7-9, 10-19, 20-22, 39-55, 56-67 e 61-70 de SEQ ID NO: 84.

36. Uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a ca- 5 deia pesada ou uma porção de ligação a antigeno da mesma de um anticor- po ou porção de acordo com qualquer uma das modalidades 1-35.

37. Uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a ca- deia leve ou uma porção de ligação a antlgeno da mesma de um anticorpo ou porção de acordo com qualquer uma das modalidades 1-35.

38. Uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a ca- deia pesada ou uma porção de ligação a antígeno da mesma e a cadeia leve ou uma porção de ligação a antlgeno da mesma de um anticorpo ou porção de acordo com qualquer uma das modalidades 1-35.

39. Uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a ca- deia pesada Olj uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo anti- CCL20 humano monoclonal, em que a referida molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que con- siste em SEQ ID NOS: 17-22, 25 - 30 e 109 ou a referida sequência de nu- cIeotideos sem a sequência que codifica uma sequência sinalizadora, se presente.

40. Uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a ca- deia leve ou uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo anti-CCl-20 humano monoclonal, em que a referida molécula de ácido nucleico compre- ende uma sequência de nucleotídeos selecionada do gmpo que consiste em SEQ ID NOS: 23, 24, 31, 32, 111 e 113 ou a refehda sequência de nucleotl- deos sem a sequência que codifica uma sequência sinalizadora, se presen- te.

41. A molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a moda- lidade 39 ou 40, em que a referida molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 17-22, 25-30 e 109 ou a referida sequência de nucleotídeos sem a sequência que codifica uma sequência sinalizadora, se presente e em que a referida molécula de ácido nucleico compreende adicionalmente uma se- quência de nucleotídeos selecionada do gmpo que consiste em SEQ ID NOS: 23, 24, 31, 32, 111 e 113 ou a referida sequência de nucleotídeos sem a sequência que codifica uma sequência sinalizadora, se presente. 5 42. Uso de (1) uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada ou de uma porção de ligação a antígeno da mesma, (2) uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou uma porção de ligação a antígeno da mesma ou (3) ambas de um anticorpo ou porção de acordo com qualquer uma das modalidades 1-35 como um medicamento.

43. Um vetor recombinante que compreende (1) uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligaçâo a antígeno da mesma, (2) uma sequência de ácido nucleico que codifica a ca- deia leve ou uma porção de ligação a antigeno da mesma ou (3) ambas de um anticorpo ou porção de acordo com qualquer uma das modalidades 1-35.

44. Uma célula hospedeira compreendendo uma primeira se- quência de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação a antigeno da mesma de um anticorpo ou porção de acordo com qualquer uma das modalidades 1-35, a referida primeira sequência de ácido nucleico operativamente ligada a um elemento de controle de expressão e um segunda sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou uma porção de ligação a antígeno do referido anticorpo do mesmo ou porção, a referida segunda sequência de ácido nucleico operativamente Iigada a um elemento de controle de expressão.

45. Um método de produção de um anticorpo anti-CCL20 huma- no ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que compreende manu- tenção da célula hospedeira de acordo com a modalidade 44 sob condições adequadas para expressão do anticorpo ou porção.

46. O método de acordo com a modalidade 45, que compreende ainda o isolamento do anticorpo ou porção.

47. Uma composição compreendendo o anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades 1-35 e um veículo ou carreador farmaceuticamente aceitável.

48. Um método para tratamento de um indivíduo que precisa do mesmo compreendendo administração, ao indivíduo, de uma quantidade eficaz do anticorpo ou porção de ligação a antigeno de acordo com qualquer uma das modalidades 1-35 ou da composição de acordo com a modalidade 5 47.

49. Um método para tratamento de uma condição em um indivi- duo que precisa do mesmo incluindo administração, ao indivlduo, de uma quantidade eficaz do anticorpo ou porção de Iigação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades 1-35 ou da composição de acordo com a modalidade 47.

50. O método de acordo com a modalidade 49, em que a referi- da condição é uma condição associada ao CCR6.

51. O método de acordo com a modalidade 49, em que a referi- da condição é uma condição autoimune ou inflamatória.

52. O método de acordo com a modalidade 49, em que a referi- da condição é artrite reumatoide, psorlase, dermatite atópica, dermatite de contato, doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, doença de Gra- ve, vitiligo, hipertiroidismo, hepatite crônica, infecção por papiloma vÍrus humano do cérvix, micose Nngoide, osteoporose ou doença periodontal.

53. Um método para o tratamento de câncer compreendendo administração, a um indivíduo, de uma quantidade eficaz do anticorpo ou porção de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades 1-35 ou da composiçâo de acordo com a modalidade 47.

54. O método de acordo com a modalidade 53, em que o referi- do câncer é uma doença maligna de células B, adenocarcinoma de mama, glioblastoma, carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma do pâncreas ou carcinoma papilar da tiroide.

55. Um método para reduzir a quimiotaxia mediada por CCL2 em células CCR6" em um indivíduo que precisa do mesmo incluindo admi- nistração, ao indivíduo, do anticorpo ou porção de ligação a antígeno de a- cordo com qualquer uma das modalidades 1-35 ou da composição de acor- do com a modalidade 47.

56. Um método para reduzir a quimiotaxia mediada por CCL20 células CCR6" in vitio usando o anticorpo ou porção de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades 1-35 ou a composição de acordo com a modalidade 47. 5 57. Um método para tratamento de uma condição em um indiví- duo compreendendo administração, ao indivíduo, do anticorpo ou porção de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades 1-35 ou da composição de acordo com a modalidade 47, em que a referida condição é selecionada do grupo que consiste em: a) lesões articulares das extremidades distais ao cotovelo ou do joelho; b) eritema; C) edema; d) aumento dos níveis séricos de proteína da matriz oligomérica de cartilagem (COMP): e) aumento dos nlveis de mRNA do ligante de ativador de recep- tor de fator nuclear kB (RANKL), ativador de receptor de fator nuclear kB (RANK), fosfatase ácida resistente a tartrato (TRAP) ou catepsina K; f) dermatite atópica; e g) dermatite de contato alérgica.

58. O uso do anticorpo ou porção de ligação a antígeno de acor- do com qualquer uma das modalidades 1-35 ou da composição de acordo com a modalidade 47 para a fabricação de um medicamento.

59. O uso do anticorpo ou porção de ligação a antígeno de acor- do com qualquer uma das modalidades 1-35 ou da composição de acordo com a modalidade 47 como um medicamento. Br'eve Descrição dos Desenhos A FlG. 1 é um gráfico que mostra que camundongos deficientes de CCR6 são menos sensíveis à artrite induzida por coIágeno do que ca- mundongos do tipo silvestre. Tipo silvestre, camundongos CCR6"/"; Het, ca- mundongos CCR6"'"; Khockout, camundongos CCR6"". Vide Exemplo 1.

A FIG. 2 é um gráfico que mostra que camundongos deficientes de CCR6 exibem infiltração prejudicada das células T (conforme indicado pelos níveis de CD3) em Iesões artríticas induzidas por coIágeno em compa- ração com camundongos do tipo silvestre. Os dados apresentados são mé- dias ± SEM de um experimento (n = 7 camundongos por gmpo). * P "0,05, 5 ** p <0,01. Vide Exemplo 1. A FiG. 3 é um gráfico que mostra que camundongos deficientes de CCR6 exibem infiltração prejudicada de macrófagos (conforme indicado peíos níveis de F4/80) em lesões artríticas induzidas por colágeno em com- paração com camundongos do tipo silvestre. Os dados apresentados são médias ± SEM de um experimento (n = 7 camundongos por grupo). ** P <0,01. Vide Exemplo 1. A FlG. 4 é um gráfico que mostra que, em comparação com ca- mundongos do tipo silvestre, camundongos deficientes de CCR6 são resis- tentes a um aumento de espessura da orelha no modelo de dermathe de contato alérgica induzida por dinitroHuorobenzeno (DNFB). WT, camundon- gos do tipo silvestre; KO, camundongos deficientes de CCR6. Vide Exemplo

1. A FlG. 5 é um gráfico que mostra que o MAb 2F5-5 inibe a qui- miotaxia induzida por CCL20. Vide Exemplo 2. As FlGs. 6A-C representam afinhamentos de sequências de domínios variáveis de anticorpos da invenção (SEQ ID NOS: 9-16) com a- queles de anticorpos de camundongo anti-humanos 36F7C1O (VH: SEQ ID NO: 39: VL: SEQ ID NO: 40) e 42G5B1O (VH: SEQ ID NO: 43) e com se- quências de linhagem germinativa IGHV1-46*03 (SEQ ID NO: 57), JH4 (SEQ ID NO: 58) e IGKV1D-39*01 (SEQ ID NO: 59). Definições de Kabat e Cho- thia de cada CDR estão indicadas. ABM67212 (SEQ ID NO: 82) e BAH04867.1 (SEQ ÍD NO: 83) são anticorpos humanos a partir dos quais foram derivadas as regiões de framewotk das cadeias de anticorpos huma- nizados mostrados. Vide Exempb 3. As FlGs. 7A-C são tabelas que representam a inibição de quimi- otaxia in vitro por em diferentes combinações de cadeias de anticorpo anti- CCL20 humano humanizados. Os dados representam três experimentos,

exceto onde indicado.

Vide Exemplo 4. As FlGs. 8A-C representam três experimentos independentes realizados para avaliar o efeito inibitório do anticorpo anti-CCl-20 humano HC2/LK3 humanizado.

É mostrado que o anticorpo HC2/LK3 inibe a quimio- 5 taxia induzida por CCL20. Os valores de |C50, lC90 e [C95 são mostrados para cada experimento.

Vide Exemplo 4. As FlGs. 9A-C mostram uma série de gráficos que mostram que anticorpos humanizados B) HC2/LK3) e C) HC2/LC3 demonstram inibição dependente da dose de migração celular comparável àqueta de A) anticorpo 36F7C1O de camundongo em um ensaio de migração transendotelial.

Vide Exemplo 4. As FlGs.

IOA-B representam sensogramas por Biacore" de- monstrando que os anticorpos humanizados A) HC2/LC3) e B) HC2/LK3 se ligam ao CCL20 humano de um modo dependente da concentração.

Vide Exemplo 5. As FiGS. 11A-D mostram que anticorpos anti-CCl-20 humano se Iigam especificamente ao CCL20 humano.

Um ensaio ELISA com CCL20 ligado à placa e outras quimiocinas (a 1 µg/ml) foi usado para detectar a li- gação de anticorpos quiméricos A) 36F7C1O e anticorpos humanizados B) HC2/LK3 e HC2/LC3. C) Um ensaio ELISA com CCL20 ancorado em His-tag foi usado para detectar a Iigação.

D) Experimentos Biacore" confirmam que anticorpos anti-CCl-20 humano se ligam ao CCL20 humano e exibem liga- ção negligenciável ao CXCL4. vide Exemplo 6. A FIG. 12 mostra um alinhamento de sequências de aminoáci- dos entre uma porção de sobreposição de 56 resíduos de CCL20 (SEQ ID NO: 114) e CCL16 (SEQ ID NO: 115). Vide Exemplo 6. As FlGs. 13A-B são uma série de gráficos que mostram que an- ticorpos anti-CCL20 humano quiméricos A) e humanizados B) reagem espe- cificamente com CCL20 e não reagem com CCL16. Vide Exemplo 6. A FlG. 14 mostra alinhamentos de sequências de aminoácidos entre ortólogos de CCL20 humano (SEQ ID NO: 85), de macaco Rhesus (SEQ ID NO: 86), de macaco Cynomo/gus (SEQ ÍD NO: 87) e de camun-

dongo (SEQ ID NO: 88). Vide Exemplo 7. A FlG. 15 é uma representação esquemática de detecção de an- ticorpos anti-CCL20 humano em ensaios ELISA.

Vide Exemplo 7. As FlGs. 16A-C mostram uma série de gráficos que demonstram 5 que anticorpos anti-CCL20 humano A) quiméricos e B), C) humanizados se Iigam eficazmente ao CCL20 humano, de macaco Rhesus e de macaco Cy- nomo/gus, mas não ao CCL20 de camundongo.

Vide Exemplo 7. As FIGS. 17A-B mostram gráficos que demonstram que anticor- pos anti-CCL20 humano quiméricos e humanizados se ligam eficazmente ao 10 CCL20 humano, de macaco Rhesus e de macaco Cynomo/gus, mas não ao CCL20 de rato ou camundongo.

Os anticorpos humanizados B) e quiméricos A) conservam a especificidade de ligação de A) anticorpo de camundongo 36F7C1 a partir do qual eles são derivados.

Vide Exemplo 7. As FlGs. 18A-B mostram os resultados de mapeamento de epi- 15 topo de CCL20 humano por troca de hidrogênio/deutério.

Este experimento usou uma variante de CCL20 humano (SEQ ID NO: 84) da R&D Systems, na qual o penúltimo residuo é D em vez de N mostrado na sequência do tipo sifvestre.

A) O nivel de deuteração de cada residuo de CCL20 é indicado em quatro pontos de tempo (a partir de cima: 150 s, 500 s, 1500 s e 5000 $). B) 20 Estrutura de CCL20 humano, indicando um epitopo ligado por anticorpos da invenção.

Vide Exemplo 9. A FlG. 19 é um par de gráficos que demonstram que células B300 CCR6-transduzidas de camundongo migram para CCL20 de camun- dongo e humano.

Vide Exemplo 10. ' 25 A FIG. 20 é um gráfico que mostra que anticorpos anti-CCL20 humano de camundongo, quiméricos e humanizados inibem a migração de células T de camundongo para CCL20 humano in vivo de uma forma dose- dependente.

Vide Exemplo 10. A FIG. 21 é um gráfico que mostra que o MAb de hâmster 2F5-5 30 antl-CCl-20 de camundongo reduz os sintomas de artrite induzida por colá- geno em camundongos.

Vide Exemplo 11. A FlG. 22 é uma tabela de escores clínicos individuais de ani-

mais que demonstram que o MAb 2F5-5 reduz a progressão dos sintomas de artrite induzida por colágeno.

Vide Exemplo 11. A FlG. 23 é um gráfico que mostra a classificação de patas de camundongo por meio de classificação por raios X.

É mostrado que o MAb 5 2F5-5 Mab reduz a patologia óssea em ratos com artrite induzida por colá- geno.

Cont: lgG de controle.

Vide Exemplo 11. A FlG. 24 representa exemplos de raios X marcados que indi- cam patologia óssea nas patas de camundongo com artrite induzida por co- lágeno.

O: osteoporose, E: erosão óssea, N: nova formação óssea.

Vide E- lO xemplo 11. As FIGS. 25A-C mostram medições de um marcador de destrui- ção de cartilagem, proteína de matriz oIigomérica de cartilagem (COMP) no soro em um modelo de artrite induzida por colágeno com camundongos.

A) Dados do Calibrador com um padrão de COMP.

Eixo X, unidades/litro; eixo Y, densidade óptica a 450 nm.

B) Modeb de placa e dados bmtos para ca- mundongos tratados com uma IgG de controle de hâmster ou MAb 2F5-5. C) Dados de animais individuais demonstram níveis reduzidos de COMP em animais tratados com o MAb 2F5-5 em comparação com animais tratados com lgG de controle.

Vide Exemplo 11. A FfG. 26 é um gráfico que mostra que o MAb 2F5-5 diminui os niveis séricos de COMP em camundongos.

Ctd IgG: anticorpos de isotipo correspondente; mAb CCL20: MAb 2F5-5. Vide Exemplo 11. As FIGS. 27A-B são gráficos que mostram que o MAb 2F5-5 re- duz a expressão de mRNA de marcadores de osteoclasto A) RANKL e RANK e B) TRAP e catepsina K.

Ctrl lgG: anticorpos de isotipo correspon- dente; mAb CCL20: MAb 2F5-5; eixo Y: unidades quantitativas de PCR.

Vide Exemplo 11. A FlG. 28 é um gráfico que mostra que o MAb 2F5-5 tem um e- feito profüático sobre a artrite induzida por isomerase de glicose-6-fosfato em camundongos.

Vide Exemplo 12. A FlG. 29 é um gráfico que mostra que o MAb 2F5-5 inibe a pro- gressão de dermatite atópica induzida por oxazolona em camundongos.

Vide

Exemplo 13. A FlG. 30 é um gráfico que mostra que o MAb 2F5-5 inibe a dermatite alérgica de contato induzida por dinitrofluorobenzeno (conforme medido pela espessura da orelha) em camundongos.

Vide Exemplo 14. 5 Descri£ão Detalhada da [nven£ão A presente invenção é dirigida a anticorpos que se ligam especi- ficamente ao CCL20 ou uma porção do mesmo (por exemplo, uma porção antigênica do mesmo). A invenção é também dirigida à porções de figação a antígeno dos referidos anticorpos.

Em uma modalidade, os anticorpos neu- lO tralizam uma ou mais atividades do CCL20. Um anticorpo é referido como se ligando especificamente ao CCL20 se ele não se liga substancialmente à moléculas que não são CCL20. Ligação substancial é, por exemplo, ligação com uma & de s 100 nM, de preferência g 10 nM, 1 nM, 100 pM, 50 pM, 40 pM ou 35 pM, conforme determinado pelo Biacore" (em formato bivalente)- Em uma modalidade, os anticorpos ou porções se ligam especificamente ao CCL20 humano ou uma porção do mesmo, para algumas variantes da se- quência de CCL20 humano, tais como variantes alélicas e também podem reagir de forma cruzada com outras espécies de CCL20. Em uma modalida- de, os anticorpos ou porções têm especificidade de Iigação por um CCL20 humano do tipo silvestre (também referido como de ocorrência natural ou endógeno). Salvo indicação em contrário, "CCL20 humano" refere-se ao CCL20 humano do tipo silvestre.

A sequência de aminoácidos de um CCL20 humano do tipo silvestre com a sequência sinalizadora é mostrada na FlG- 14 (SEQ ID NO: 85). A sequência de aminoácidos de um CCL20 humano do tipo silvestre sem a sequência sinalizadora (resíduos 1-26 de SEQ ID NO: 85) é mostrada em SEQ ID NO: 99 (vide Tabela 18). A FlG. 18 representa uma variante de CCL20 humano sem a sequência sinalizadora (SEQ ID NO: 84), em que o penúltimo resíduo é D em vez de N, conforme na sequência do tipo silvestre (SEQ ID NO: 85). Em algumas modalidades, os anticorpos ou porções se ligam ao CCL20 humano do tipo silvestre ou CCL20 humano em que o penúltimo resíduo é D em vez de N mostrado na sequência do tipo silvestre ou sequência com ou sem a sequência sinalizadora (por exemplo,

SEQ ID NOS: 84, 85 ou 99). Em uma modalidade particular, os anticorpos ou porções se figam especificamente ao CCL20 humano, de macaco Rhesus e de macaco Cynomo/gus, mas não se ligam ao CCL20 de camundongo ou rato. 5 Os anticorpos e porções de ligação a antlgeno dos mesmos descritos aqui podem ser purificados e/ou isolados por meio de técnicas co- nhecidas.

Os anticorpos ou porções que são "purificadas" ou "isoladas" fo- ram separados de moléculas (por exemplo, peptídeos) de sua fonte de ori- gem (por exemplo, o sobrenadante de células em uma mistura, tal como 10 uma mistura de anticorpos de uma biblioteca; etc.) e incluem anticorpos ob- tidos por meio de métodos descritos aqui ou outros métodos adequados.

Anticorpos isolados podem incluir antlcorpos substancialmente puros (por exemplo, essencialmente puros), bem como anticorpos produzidos por meio de síntese química, técnicas recombinantes e uma combinação dos mes- 15 mos.

Mais especificamente, a invenção refere-se a anticorpos anti- CCL20 humano, porções de ligação a antígeno (isto é, porções) dos anticor- pos, as cadeias Ieves dos anticorpos, as cadeias pesadas dos anticorpos e porções destas cadeias leves ou cadeias pesadas.

A invenção refere-se 20 também a anticorpos que carecem das sequências sinalizadoras de cadeia pesada e/ou cadeia leve e anticorpos glicosilados.

A invenção refere-se também a anticorpos precursores, anticorpos não glicosilados e anticorpos cuja cadeia pesada e/ou cadeia leve compreendem sequências sinalizado- . ras.

A invenção refere-se também à moléculas de ácido nucleico que codifi- 25 cam qualquer uma das cadeias pesadas e/ou cadeias leves de anticorpo ou porções das mesmas descritas aqui, vetores e células hospedeiras que compreendem tais ácidos nucleicos, métodos de produção de qualquer uma cadeias pesados e/ou cadeias leves dos anticorpos ou porções das mesmas descritas aqui e a métodos de uso dos anticorpos, cadeias de anticorpos ou 30 porções.

Os anticorpos e porções de ligação a antígeno dos mesmos da presente invenção podem ser usados para tratar um indivíduo que precisa do mesmo (por exemplo, um paciente humano) para reduzir a ligação de CCL20 ao CCR6, inflamação mediada por CCL20 e/ou quimiotaxia mediada por CCL20 de célutas CCR6", conforme necessário.

Os anticorpos da invenção incluem anticorpos tradicionais com- 5 preendendo duas cadeias pesadas e duas cadeias leves.

Em algumas mo- dalidades, uma ou mais das cadeias pesada e/ou feve compreendem um domínio variável (também referido aqui como uma "região variável") e um domínio constante (também referido aqui como uma "região constante"). Domínios variáveis completos, quando presentes, compreendem quatro re- lO giões de framework (FR) e três regiões de determinação de complementari- dade (CDRS) dispostas, a partir do amino término, na ordem FRI, CDRI, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Verificação visual e análise da sequência po- dem ser realizadas para identificar os limites das CDR.

Para a presente in- venção, as sequências de CDR são definidas usando o sistema de Kabat (Kabat, EA et al., Sequences of Ptoteins of /mmuno/ogica/ lnterest, Quinta Edição, U.S.

Department of Health and Human Services, U.S.

Government Printing OMce (1991)) e/ou o sistema de Chothia (Chothia & Lesk, Canonical Structures for the Hypervanab/e Regions of /mmunog/obu/ins, j.

Mol.

Biol. 196: 901-917 (1987)) conforme indicado, por exemplo, na FIG. 6. Modalidades da presente invenção que compreendem uma regl- ão constante de cadeia pesada humana podem compreender uma região constante humana de qualquer isotipo, incluindo lgG, lgM, lgA, lgD e lgE, nas quais as cadeias pesadas são do tipo gama (y) mu ( µ), alfa (cl), delta (6) ou épsilon (e), respectivamente e quaisquer subclasses incluem IgGl, lgG2, lgG3, IgG4, lgA1 e lgA2, nas quais as cadeias pesadas são do tipo Yi, y2, y3, y4, a1 e a2, respectivamente.

Modalidades compreendendo cadeias le- ves humanas podem compreender uma cadeia Ieve kappa (K)humana ou Iambda (A) humana.

Conforme usado aqui, o termo "anticorpo" refere-se a um anti- corpo completo (que compreende duas cadeias pesadas de comprimento total e duas cadeias leves de comprimento total). O termo "fragmento de li- gação a antígeno" é usado aqui alternadamente com o termo "porção de

Iigação a antlgeno", Salvo indicação em contrário.

Porções de ligação a an- tígeno de anticorpos podem estar no formato, por exemplo, de anticorpos com uma única cadeia, fragmentos Fv, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, molécutas Fv com uma única cadeia 5 (SCFV), dímeros de Fv com uma única cadeia biespecíficos (documento PCT/US92/09665), diacorpos, anticorpos com domínio deletado e anticor- pos com um único dominio (dAbs). Vide, por exemplo, Jespers et al., Nature Biotechno/ogy 22 (9): 1161-1165 (2004)). Também no âmbito da invenção estão moléculas de Iigação a antígeno compreendendo uma Vh e/ou uma Vl.

No caso de uma Vh, a molécula pode também compreender uma ou mais de uma região Ch1, de dobradiça, Ch2 e Ch3. Porções de anticorpo podem ser produzidas por meio de cliva- gem enzimática ou através de técnicas recombinantes.

Por exemplo, cliva- gem com papaína ou pepsina pode ser usada para gerar Fab ou F(ab')2, respectivamente.

Os anticorpos também podem ser produzidos em uma va- riedade de formas truncadas usando genes de anticorpos nos quais um ou mais códons terminais foram introduzidos a montante do sÍtio de término natural.

Por exemplo, um construto recombinante que codifica a cadeia pe- sada de um fmgmento F(ab')2 pode ser concebido para incluir sequências de DNA que codificam o domínio Ch1 e a região de dobradiça da cadeia pesa- da.

Em outra modalidade, pode ser feito um anticorpo de fusão ou imunoadesina que compreende todo ou uma porção de um anticorpo anti- CCL20 da invenção Iigado a outro polipeptídeo.

Em uma modalidade, ape- nas os domlnios variáveis do anticorpo anti-CCl-20 são iigados ao polipeptí- deo.

Em outra modalidade, o domínio Vh de um anticorpo anti-CCl20 é liga- do a um primeiro potipeptideo, enquanto que o domínio Vl de um anticorpo anti-CCl-20 é Iigado a um segundo polipeptídeo que se associa ao primeiro polipeptídeo de modo tal que os domínios Vh e Vl podem interagir um com o outro para formar um sÍtio de ligação a antígeno.

Em ainda outra modalida- de, o domínio Vh está separado do dominio Vl por um figante, de modo que os domlnios Vh e Vf. podem interagir um com o outro (vide abaixo em Anti-

corpos com uma Única Cadeia). O anticorpo VH-ligante-VL é, então, ligado ao poIipeptídeo de interesse.

Além disso, podem ser criados anticorpos de fusão em que dois (ou mais) anticorpos com uma única cadeia são Iigados um ao outro para criar um anticorpo divalente ou polivalente sobre uma úni- 5 ca cadeia polipeptídica ou criar um anticorpo biespecífico.

Para criar um anticorpo com uma única cadeia da invenção, os fragmentos de DNA que codificam Vh e Vl são operativamente Iigados a ou- tro fragmento que codifica um ligante flexível, por exemplo, que codifica a sequência de aminoácidos (G|y4-Ser)3, de modo que as sequências de Vh e Vl possam ser expressas como uma protelna com uma única cadeia contí- gua, com os dominios Vj. e Vh unidos pelo ligante flexivel.

Vide, por exemplo, Bird et al., Sc/ence 242: 423-426 (1988), Huston et al., Pk)c.

Natl.

Acad.

Scl.

USA 85: 5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature 348: 552- 554 (1990), etc.

Em algumas modalidades, o anticorpo com uma única ca- deia é monovalente (apenas uma única Vh e Vl é usada), bivalentes (duas Vh e V(, são usadas) ou polivalente (mais de duas Vh e Vl são usados). A invenção considera também anticorpos biespecíficos ou poIivalentes os quais se ligam especificamente ao CCL20 humano e outra molécula.

Em outras modalidades, outros anticorpos modificados podem ser preparados usando moléculas de ácido nucleico que codificam anticor- pos anti-CCL20. Por exemplo, "Kappa corpos" (Ill et al., Protein Eng. 10: 949-57 (1997)), "Minicorpos" (Martin et al., EMBO J. 13: 5303-9 (1994)), "di- acorpos" (Holliger et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 90: 6444-6448 (1993)) ou "janusinas" (Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655-3659 (1991) e Trau- necker et al., lnt.

J.

Cancer (Supl.) 7: 51-52 (1992)) podem ser preparados usando técnicas de biobgia moiecular convencionais seguindo os ensina- mentos do relatório descritivo.

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma variante de um anticorpo exemplificada aqui ou uma porção de Iigação a antígeno da referi- da variante de anticorpo, em que a referida variante de anticorpo se Iiga es- pecificamente ao CCL20 humano, mas dífere, quanto à sequência, do anti- corpo exemplificado por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, em uma região CDR, uma região FR e/ou um domínio constante). De acordo com a invenção, a variante de anticorpo pode ser pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo 5 menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica ao anticorpo de referência quanto à cadeia pesada, o domínio variável de cadeia pesada, a cadeia leve, o domínio variável de cadeia Ieve, as seis Cdr ou as oito FRs.

Conforme usado aqui, similaridade de sequência de potipeptí- 1O deos, a qual é também referida como identidade de sequência é, tipicamen- te, medida usando um software de análise de sequência, o qual corresponde sequências similares usando medidas de similaridade atribuídas à várias substituições, deleções e outras modificações conseNatNas, incluindo subs- tituições de aminoácido.

Por exemplo, o Sequence Analysis Package do Ge- netics Computer Group (GCG) contém programas tais como "Gap" e "Best- fit" os quais podem ser usados com os parâmetros de defautt para determi- nar a identidade ou homologia de sequência entre sequèncias de polipepti- deos intimamente relacionadas, tais como polipeptideos homólogos de dife- rentes espécies de organismos ou entre uma proteína do tipo silvestre e uma muteina da mesma.

Vide, por exemplo, GCG Versão 6.1. Sequências poli- peptídicas podem também ser comparadas com o FASTA, um programa no GCG Versão 6.1 usando os parâmetros de default ou recomendados.

O FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e identida- de percentual de sequência nas regiões de sobreposição entre as sequên- cias de consufta e de pesquisa (Pearson, Methods Enzymol 183: 63-98 (1990), Pearson, Methods Mol Biol 132: 185-219 (2000)). Outro algoritmo usado quando de comparação de uma sequência da invenção com um ban- co de dados contendo um grande número de sequências de diferentes orga- nismos é o programa de computador BLAST, especialmente blastp ou t- blastn, usando os parâmetros de default.

Vide, por exemplo, Altschul et al., J.

Mol.

Biol. 215: 403-410 (1990), Altschul et al., Nuc/eic Acids Res. 25: 3389-402 (1997), aqui incorporado por referência.

De acordo com a invenção, uma ou mais cisteínas no anticorpo, as quais podem ser quimicamente reativas, podem ser trocadas por outro resíduo tal como, sem limitação, alanina ou serina.

Em uma modalidade, uma cisteína não canônica é substituída.

A substituição pode ser feita em 5 uma região de CDR ou hamework de um dominio variável ou no domínio constante de um anticorpo- Em algumas modalidades, a cisteina é canônica.

Em algumas modalidades, sÍtios proteolíticos potenciais no anticorpo são removidos.

Tais sÍtios podem ocorrer em uma região de um domínio variável de CDR ou de framework ou no domínio constante de um anticorpo.

Substi- lO tuição dos resíduos de cisteína e remoção de sÍtios proteolíticos pode dimi- nuir o risco de heterogeneidade no produto de anticorpo e, assim, aumentar sua homogeneidade.

Em algumas modalidades, pares de asparagina-glicina, os quais fonnam sÍtios de desamidação potenciais, são eliminados alterando um ou ambos os resíduos.

Em algumas modalidades, o anticorpo é desimu- 15 nizado para reduzir sua imunogenicidade.

Métodos para redução da imuno- genicidade de um anticorpo são bem conhecidos na técnica.

Vide, por e- xemplo, Publicações PCT N°'WO 98/52976 e WO 00/34317. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma ou mais substi- tuições conservativas de aminoácidos quando comparado com um anticorpo 20 exemplifdivo da invenção.

Uma "substituição conservativa de aminoácidos " é aquela na qual um resíduo de aminoácido é substituido por outro residuo de aminoácido com um grupo de cadeia lateral R) com propriedades quími- cas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substi- . tuição de conservativa de aminoácidos não alterará substancialmente as 25 propriedades funcionais de uma proteína.

Nos casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem umas das outras por substituições con- servativas, a identidade percentual de sequência ou grau de similaridade pode ser ajustado para corrigir a natureza conservativa da substituição.

Mei- os para fazer este ajuste são bem conhecidos por aqueles versados na téc- 30 nica.

Vide, por exemplo, Pearson, Methods Mol.

Biol. 243: 307-31 (1994). Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias Iaterais com propriedades químicas similares incluem 1) cadeias laterais alifáticas:

glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina: 2) cadeias laterais alifáticas de hidroxila: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano: 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadeias laterais á- 5 cidas: ácido aspártico e ácido glutâmico; e 7); cadeias laterais contendo en- xofre: cisteína e metionina.

Grupos de substituição conservativa de aminoá- cidos preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina- arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina.

Alter- nativamente, uma substituição conservativa, é qualquer alteração tendo um 10 vaior positivo na matriz de Iog-probabilidade PAM250 descrita em Gonnet et al., Science 256: 1443-45 (1992). Uma substituição "moderadamente con- servativa" é qualquer alteração com um valor não negativo na matriz de log- probabilidade PAM250. Em determinadas modalidades, substituições de aminoácidos 15 para um anticorpo ou porção de ligação a antígeno da invenção são aquelas que: (1) reduzem a susceptibilidade à proteóiise; (2) reduzem a susceptibili- dade à oxidação; (3) alteram a afinidade de ligação para formaçâo de com- plexos de proteínas, por exemplo, para aumentar a atividade de ADCC e CDC do anticorpo; (4) conferem ou modificam outras propriedades fisico- 20 químicas ou funcionais de tais análogos, mas ainda retêm a ligação específi- ca ao CCL20 humano: (5) removem a lisina C-terminal; e (6) adicionar ou removem sÍtios de glicosilação.

Em um aspecto, a invenção proporciona um poIipeptídeo novo e inovador que é a cadeia pesada ou leve de um anticorpo da presente inven- 25 ção ou que é uma porção contendo o domínio variável da cadeia pesada ou leve.

Tal poIipeptÍdeo é útil porque pode emparelhar com uma cadeia leve ou pesada de anticorpo, respectivamente, para formar um anticorpo antl- CCL20. São descritos aqui novos anticorpos anti-CCl-20 de neutraliza- ' 30 ção humanizados compreendendo as CDRS de novos anticorpos anti-CCt20 -. humano de camundongo e porções de ligação a antígeno dos referidos anti-

corpos humanizados.

O termo "anticorpo anti-CCl-20 humanizado", confor-

me usado aqui, refere-se a um anticorpo que compreende uma ou mais C- DRS (CDRI, CDR2 e CDR3) de um anticorpo anti-CCl-20 de origem não humana, também referido aqui como o anticorpo doador (por exemplo, um anticorpo anti-CCL20 de camundongo) e pelo menos uma porção de uma 5 sequência de humana. A porção de anticorpo humano pode ser uma ou mais regiões de framework (por exemplo, todas as regiões de hamework ) e/ou toda ou parte de uma região constante. Em algumas modalidades, a se- quência de região de framework humana compreende uma sequência de linhagem germinativa, mas pode incluir mutações que não são na linhagem 10 germinativa. Um anticorpo anti-CCL20 com CDR enxertada no qual as seis CDRS de um anticorpo anti-CCL20 não humano são enxertadas em uma framework humana é um exemplo de um anticorpo anti-CCl-20 humanizado da invenção. Vide, por exemplo, Cabilfy et al., Patente U.S. 4.816.567; Cabil- ly et al., Patente Europeia N° 0.125.023 Bl; Boss et al., Patente U.S. N" 15 4.816.397; Boss et al., Patente Europeia N° 0.120.694 Bl; Neubeiger, M.S. et al., documento WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., Patente Europeia N°

0.194.276 Bl; Winter, Patente U.S. N° 5.225.539; Winter, Patente Europeia N° 0.239.400 Bl; Padlan, E.A. et al., Pedido de Patente Europeia N° 0519596 Al. Vide também, Ladner et al., Patente U.S. N° 4.946.778; Hus- 20 ton, Patente U.S. N° 5.476.786; e Bird et al., Science 242: 423-426 (1988)). Em algumas modalidades, os anticorpos humanizados são anticorpos desi- munizados. Vide, por exemplo, Carr et al., Patente U.S. N° 7.264.806 com relação a anticorpo desimunizados que foram modificados para reduzir o . número de epitopos potenciais de células T, deste modo, reduzindo a pro- 25 pensão de que o anticorpo induza a uma resposta imune quando de admi- nistração a um ser humano. Em modalidades particulares, o anticorpo humanizado compre- ende uma ou mais CDRS de cadeia Ieve e/ou uma ou mais CDRs de cadeia pesada de um ou mais dos seguintes anticorpos monoclonais anti-CCl-20 30 humano de murino: 36F7C1O, 42G5B1O e 40-1C1OB9, em que as CDRS são identificadas de acordo com o sistema de Kabat, o sistema de Chothia ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o anticorpo humanizado compreende todas as três CDR de cadeia pesada e todas as três CDRS de cadeia leve dos anticorpos 36F7C1O 42G5B1O ou 40 1C1OB9. Em outra modalidade, os anticorpos humanizados têm a especi- ficidade de Iigação de um anticorpo anti-CCL20 humano de murino da inven- 5 ção (por exemplo, especificidade pelo CCL20 humano, a mesma ou especi- ficidade epitópica similar) e/ou têm uma atividade de neutralização.

Os anti- corpos humanizados podem ter a especificidade de ligação, especificidade epitópica e/ou atividade de neutralização de um anticorpo anti-CCl-20 huma- no de murino, quimérico ou humanizado descritos aqui.

Por exemplo, um 10 anticorpo humanizado da presente invenção pode competir com um anticor- po anti-CCl-20 humano de murino, quimérico ou humanizado pela Iigação ao CCL20 humano e/ou pode ter a função de neutralização dos anticorpos anti- CCL20 humano de murino, quiméricos ou humanizados.

Em uma modalida- de particular, o anticorpo humanizado tem a especificidade de ligação, espe- 15 cificidade epitópica e/ou atividade de neutralização de qualquer um dos anti- corpos 36F7C1O 42G5B1O e 40-1C1OB9 de camundongo.

A porção de sequência humana do anticorpo humanizado (por exemplo, região de ftamework, região constante) pode ser de qualquer anti- corpo humano adequado.

Por exemplo, uma região constante humana ou 20 porção de um anticorpo humanizado ou quimérico pode ser codificada por um gene de cadeia leve k ou À e/ou por um gene de cadeia pesada y, ô ou e humana (por exemplo, Yj, y2, y3, y4) ou µ, cl (por exemplo, a1, a2), incluin- do variantes alélicas.

Um isotipo de região constante humana em particular . (por exemplo, lgGl, lgG2), variante ou porção da mesma pode ser selecio- 25 nada para configurar a fúnção,efetuadora.

Por exemplo, uma região constan- te com mutação (isto é, uma variante) pode ser incorporada no anticorpo para reduzir a ligação a um receptor Fc e/ou capacidade de fixar comple- mento (vide, por exemplo, Winter et al., documento GB 2.209.757 B; Morri- son et al., documento WO 89/07142; Morgan et al., documento WO 30 94/29351). Conforme usado aqui, o termo "linhagem germinativa" refere-se à sequências de nucleotídeos e sequências de aminoácidos dos genes de anticorpo e segmentos gênicos que são passados de pais para filhos via as células germinativas.

Esta sequência de linhagem germinativa se distingue das sequências de nucleotideos que codificam um anticorpo específico em uma célula B a qual tenha sido modificada por eventos de recombinação e 5 hipermutação durante o curso de maturação por afinidade.

Um anticorpo que "utiliza" uma linhagem germinativa em particular tem uma sequência de nu- cleotídeos ou de aminoácidos que se aiinha mais estreitamente com a se- quência de nucleotldeos da Iinhagem germinal ou com a sequência de ami- noácidos que ele especifica em relação à outras sequências de Iinhagem 10 germinativa.

Tais anticorpos podem ser codificados por ou compreender uma sequência que sofreu mutação comparado com a sequência de linha- gem germinativa.

Em algumas modalidades, a fmmework humana tem variação mlnima com relação à sequência de linhagem germinativa, por exemplo, 15 menos de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos da hamework aceitadora foram substituldos para melhorar uma ou mais propriedades do anticorpo.

Em al- gumas modalidades, os resíduos da framewoík aceitadora são substituidos por resíduos da framewoík doadora, por exemplo, para melhorar a afinidade de ligação (vide, por exemplo, Queen et al., Patente U.S.

N° 5.530.101). Em 20 uma modalidade particular, um número limitado de aminoácidos na hame- work de uma cadeia de anticorpo humanizado (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos) são escolhidos para serem os mesmos conforme os aminoácidos nestas posições na sequência doadora (isto é, "re- - mutação"), em vez de na sequência aceitadora, para aumentar a afinidade 25 de um anticorpo compreendendo a cadeia de anticorpo humanizada pelo CCL20 humano.

Regiões de framework humana (por exemplo, das regiões vari- áveis de cadeias pesada e/ou leve) são, de preferência, obtidas ou deriva- das de uma sequência de linhagem germinativa humana tendo similaridade 30 de sequência com a região análoga ou equivalente (por exemplo, regiões variáveis de cadeias leve ou pesada) da região de ligação a antígeno do an- ticorpo doador (por exemplo, anticorpo anti-CCl-20 de murino). Outras fontes de regiões de fmmework para porções de sequência humana de um anticor- po humanizado incluem sequências de consenso de região variável humana (vide, por exemplo, Kettleborough et al., Protein Engineeiing 4: 773-783 (1991): Caher et al., documento WO 94/04679; Carter, Patente U.S.

N° 5 6.407.213)). Por exemplo, a região da sequência doadora do anticorpo (por exemplo, a sequência da região variável) usada para obter a porção não humana pode ser comparada com sequências humanas, conforme descrito em Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of /mmuno/ogica/ lntemst, Quin- ta Edição, U.S.

Department of Health and Human Services, U.S.

Govern- lO ment Printing Office (1991) para selecionar uma fonte particular das porções humanas do anticorpo humanizado, por exemplo, uma fonte de regiões de framework.

Em uma modalidade, as regiões de framewotk das cadeias de anticorpos humanizados são obtidas ou derivadas de uma região variávet de 15 lg humana tendo pelo menos cerca de 50°6, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65 °/0, pelo menos cerca de 70°6, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85°6, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência global com a região variável do doador não humano.

Em uma 20 modalidade particular, as regiões de hamework das cadeias de anticorpos humanizados são obtidas ou derivadas de regiões de hamewotk de regiões

. variáveis humanas tendo pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cer- . ca de 70%, pelo menos cerca de 75°6, pelo menos cerca de 80%, pelo me- 25 nos cerca de 85°6, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95°/o de identidade global de sequência com as regiões de hamework da região variável do anticorpo doador não humano.

Em uma modalidade, pelo menos uma das regiões de hamework (FR) do anticorpo humanizado é obtida ou derivada de uma ou mais cadeias 30 de uma sequência humana.

Assim, a FR pode incluir uma FRI e/ou FR2 e/ou FR3 e/ou FR4 obtida ou derivada de uma ou mais sequências de anti- corpos humanos (por exemplo, de uma cadeia de anticorpo humano, de uma sequência de consenso humana). Será apreciado por aqueles versados na técnica que, em alguns casos, os resíduos que flanqueiam uma ou mais CDRS de anticorpos anti- CCL20 de murino podem contribuir, e, em alguns casos, podem ser essenci- 5 ais, direta ou indiretamente, para a função (por exemplo, ligação). Conse- quentemente, em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos que flan- queiam uma ou mais CDRZ (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos de flanqueamento) da framework de murino são também incluí- dos no anticorpo humanizado. 10 Em algumas modalidades, as regiões de framework da cadeia pesada humana dos humanizados anticorpos da presente invenção utilizam o gene de linhagem germinativa humana IGHV1-40*03. Em algumas modali- dades, as regiões de framework humana da cadeia leve dos anticorpos hu- manizados da presente invenção utiiizam o gene de linhagem germinativa 15 humana IGKV1 D-39*01. Mutações (por exemplo, re-mutações) podem op- cionalmente ser feitas nestas regiões FR, por exemplo, em um ou mais dos resíduos, conforme descrito nos Exemplos abaixo, para melhorar a afinidade de Iigação ao CCL20 do anticorpo humanizado. "Afinidade" é um termo na técnica que descreve a força de uma 20 interação de ligação e, normalmente, refere-se à força total de Iigação do anticorpo ao antígeno. A afinidade do anticorpo pelo antígeno é normalmen- . te expressa como a constante de equilíbrio de Iigação de afinidade (KÒ) de uma determinada interação anticorpo-antígeno.

W Em algumas modalidades, o anticorpo se Iiga ao CCL20 humano 25 com uma afinidade (K, Kd = Kok (k)/kon (ka)) de 500 pM ou menos, 400 pM ou menos, 300 pM ou menos, 200 pM ou menos, 100 pM ou menos, 90 pM ou menos, 80 pM ou menos, 70 pM ou menos, 60 pM ou menos, 50 pM ou menos ou 45 pM ou menos, conforme determinado por ressonância de plasmon em superficie monovalente ou 12 pM ou menos, 22 pM ou menos 30 ou 20 pM ou menos, 18 pM ou menos ou 17 pM ou menos, conforme deter- minado por meio de ressonância de plasmon em superfície bivalente. Em algumas modalidades, o anticorpo se Iiga ao CCL20 humano com uma K, de

1000 x 10' M"' s"' ou menos, de 90Ox IO'M"' s"' ou menos, de 80Ox 10' M" 1 S"1 ou menos, 700 x 105 Mj sj ou menos, 600 x 105 Mj sj ou menos, 500 x105M-1s"1oumenos,400x105M-1s"1oumenos,300x105M-1s"1oume- nos, 240X 105 M"' s"' ou menos,20Ox IO'M"' s"' oumenos, 190x 10' M"' s" 5 1 ou menos, 180 x 105 Mj s-' ou menos, 170 x 105 Mj s"1 ou menos, 160 x 105 Mj sj ou menos ou 150 x 105 M-' sj ou menos, conforme determinado por ressonância de plasmon em superfície monovalente (Biacore"). Em algumas modalidades, o anticorpo se Iiga ao CCL20 humano com uma k de 1000 x io"b-' ou menos, 900 x 10"5s-1 ou menos, 800 x 10"5s"1 ou menos, 10 700 x 10"5 s"' ou menos, 600 x 10"'S"1 ou menos, 500 x 10"5 s-' ou menos, de400x10"5s"1 ou menos, 30Ox 10"5s"1 ou menos, 240X 10"5s"1 ou menos, 200 x 10"5 S"1 ou menos, 190 x j(jS e ou menos, 180 x 10"5 sj ou menos, 170 x 10"5 sj ou menos, 160 x 10"5 Sj ou menos, 150 x 10"5 s"' ou menos, 140 x 1O"'S-' ou menos, 130 x 10"' sj ou menos, 120 x 10"5 s"1 ou menos, 15 100 x 10"5s-1 ou menos, 90X 10"5s"1 ou menos, 80X 10"5s"1 ou menos, 70 x 10"5 sj ou menos ou 65 x 10"5 e ou menos, conforme determinado por meio de ressonância de plasmon em superficie monovalente (Biacore"). Conforme é evidente para aqueles versados na técnica, uma va- riedade de métodos podem ser usados para confirmar que os anticorpos e 20 porções de ligação a antígeno produzidos de acordo com os métodos fome- cidos aqui e conhecidos na técnica têm a especificidade requerida (por e- xemplo, especificidade de ligação, especificidade epitópica). Por exemplo, a . função de ligação de um anticorpo humanizado anti-CCl-20 ou pporção da

V invenção tendo especificidade de ligação pelo CCL20 humano pode ser de- 25 tectada por meio de qualquer método adequado, por exemplo, ensaios que monitoram a formação de um complexo entre o anticorpo humanizado ou porção e CCL20 humano (ou, por exemplo, um peptídeo tendo uma sequên- cia de aminoácidos de CCL20 ou um suporte sóIido que compreende CCL20 humano). 30 A capacidade de um anticorpo ou uma porção de ligação a antí- geno da invenção (por exemplo, um anticorpo humanizado ou porção da in- venção) de se ligar ao mesmo epitopo sobre CCL20 humano que um anti-

corpo monoclonal de murino, quimérico ou humanizado descrito aqui em particular ou de se ligar a um epitopo sobre CCL20 humano que se sobrepõe ao epitopo sobre CCL20 humano ao qual um anticorpo monoclonal de muri- no, quimérico ou humanizado descrito aqui se liga em particular, pode ser 5 facilmente determinada usando uma variedade de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica incfuindo, por exemplo, ensaios de ligação competitiva. Estes podem envolver o uso de uma forma marcada do referido anticorpo particular e uma medida da ligação do referido anticorpo marcado ao CCL20 humano na presença e na ausência de um anticorpo da invenção. 10 Um "epitopo", conforme usado aqui, inclui qualquer determinante de proteina capaz de se ligar especificamente a um anticorpo. Métodos para caracterizar o epitopo ao qual um anticorpo se liga são conhecidos na técni- ca. Um método para caracterizar um epitopo ligado por um anticorjpo anti- CCL20 da invenção é descrito no Exemplo 9. Uma vez que um epitopo dese- 15 jado sobre um antígeno é determinado, é possÍvel gerar anticorpos contra o este epitopo, por exemplo, usando as técnicas descritas na presente inven- ção. Alternativamente, durante o processo de descoberta, a geração e ca- racterização de anticorpos podem elucidar informações sobre epüopos dese- jáveis. A partir desta informação, então, é possÍvel realizar triagem de anti- 20 corpos que competem pela ligação ao mesmo epitopo. Por exemplo, aqueles versados na técnica podem realizar estudos de competição para descobrir

W anticorpos que se ligam competitivamente com um outro, isto é, anticorpos que competem pela ligação a antígeno. b Em uma modaiidade, para determinar se um anticorpo de teste 25 ou porção de ligação a antígeno do mesmo se liga ou se sobrepõe ao mes- mo epitopo que um anticorpo humanizado da presente invenção, pode-se permitir que um anticorpo anti-CCL20 da invenção se ligue ao CCL20 sob condições de saturação e, em seguida, medir a capacidade do anticorpo de teste de se ligar ao CCL20. Se o anticorpo de teste é capaz de se Iigar ao 30 CCL20 ao mesmo tempo que o anticorpo anti-CCl-20 de referência, então, o anticorpo de teste pode se Iigar a um epitopo diferente do anticorpo de refe- rência anti-CCl.20. No entanto, se o anticorpo de teste não é capaz de se iigar ao CCL20 ao mesmo tempo, então, o anticorpo de teste pode se Iigar ao mesmo epitopo, um epitopo de sobreposição ou um epitopo que está em estreita proximidade com o epitopo Iigado pelo anticorpo anti-CCl-20 da in- . venção. Este experimento pode ser realizado usando, por exemplo, ELISA, 5 RIA, Biacore" ou citometria de fluxo. Para testar se um anticorpo anti- CCL20 compete de forma cruzada com oijtro anticotpo anti-CCL20, pode-se usar o método de competição descrito acima em duas direções, ou seja, de- terminar se o anticorpo de referência bloqueia o anticorpo de teste e vice- versa. Em algumas modalidades, o experimento é realizado usando Biaco- lO re". "Binning" de epitopo também pode ser útil para caracterizar os anticorpos da presente invenção. O termo "binning" refere-se a um método para agrupar anticorpos com base em suas características de ligação a antí- geno. Um processo de alto rendimento para "binnlng" de anticorpos com ba- 15 se em sua competitividade cmzada é descrito no Pedido de Patente fnterna- cional WO 03/48731. O "binning de epitopo" pode ser investigado ao permitir que uma forma não marcada de um anticorpo anti-CCl-20 "A" se ligue a um peptldeo sintético que corresponde à sequência de CCL20 ou células positi- vas para CCL20. Subsequentemente, um segundo anticorpo anti-CCl-20 20 marcado como "B" é adicionado e pode-se avaliar a quantidade de anticorpo marcado que pode se ligar em relação a uma amostra de controle onde as - cêlulas ou peptídeo sintêtico não tenha sido exposto previamente a um anti- corpo anti-CCl-20 "A." Altemativamente, anticorpos anti-CCl-20 "A" e "B" po-

L dem ser marcados com diferentes fluorocromos ou produtos químicos que 25 permitem a detecção e pocie-se medir as quantidades de ambos os anticor- pos marcados que podem se acoplar ao peptídeo de CCL20 ao mesmo tem- po usando um dispositivo capaz de detecção do marcador ou medir a quan- tidade de ambos os anticorpos que se acoplam simultaneamente à células CCL20 positivas por meio de citometria de fluxo. Tecnologias Biacore" e 30 Octet permitem investigar a ligação competitiva de formas não marcadas de anticorpos. Este uso de formas não marcadas de anticorpos é desejado, uma vez que modificação química de alguns anticorpos pode comprometer a atividade de ligação.

Vide também a tecnologia descrita em Jia et al., j. /m- muno/. Methods 288: 91-98 (2004), a qual é útil na realização de "binning" de epitopo também.

Também fomecidas aqui são porções dos anticorpos anti-CCL20 5 da invenção, tais como cadeias leves, cadeias pesadas e porções de cadei- as leves e pesadas.

Estas porções de anticorpo podem ser obtidas ou deri- vadas de anticorpos (por exemplo, por meio de redução e/ou clivagem) ou produzidas ou expressas por ácidos nucleicos que codificam uma porção de um anticorpo ou cadeia do mesmo tendo a propriedade desejada (por exem- lO plo, ligação ao CCL20 humano, similaridade de sequência). Elas também podem ser preparadas, por exemplo, através de sintese de novo da porção retevante.

Anticorpos humanizados compreendendo as porções desejadas (por exemplo, região de ligação a antígeno, CDR, FR, região C) de origem humana e não humana podem ser produzidos usando ácidos nucleicos sin- 15 téticos e/ou recombinantes para preparar construtos (por exempío, CDNA) que codificam a cadeia humanizada desejada.

Por exemplo, para preparar uma porção de um anticorpo (por exemplo, uma porção de uma cadeia), um ou mais códons terminais podem ser introduzidos na posição desejada na sequência de ácido nucleico.

Sequências de ácido nucleico (por exemplo, 20 DNA) que codificam regiões variáveis humanizadas podem ser construídas usando métodos de mutagênese por PCR para alterar as sequências de · DNA existentes (vide, por exemplo, Kamman et al., Nucl.

Acids Res. 17: 5404 (1989))- Iniciadores de PCR que codificam as novas CDRs podem ser %

hibridizados com um temp/ate de DNA de uma região variável previamente 25 humanizada com base na mesma ou uma região variáve! humana muito si- milar (Sato et al., Cancer Research 53: 851-856 (1993))- Se uma sequência de DNA similar não está disponível para uso como temp/ate, um ácido nucle- ico compreendendo uma sequência que codifica uma sequência de região variável pode ser construído a partir de oIigonucleotÍdeos sintéticos (vide, 30 por exemplo, Kolbinger, Protein Engineehng 8: 971-980 (1993)). Uma se- quência que codifica um peptídeo sinalizador ("sequência sinalizadora") também pode ser incorporada no ácido nucleico (por exemplo, quando de sÍntese, quando de inserção em um vetor). Se uma sequência peptldica si- nalizadora não está disponlvel (por exemplo, normalmente não presente), uma sequência peptídica sinalizadora de outro anticorpo pode ser usada (vide, por exemplo, Kettleborough, Protein Engineering 4: 773-783 (1991)). " 5 Usando estes métodos, métodos descritos aqui ou outros métodos adequa- dos, variantes podem ser facilmente produzidas.

Conforme usado aqui, o acrônimo "mAb" (ou "MAb") refere-se a um anticorpo monoclonal o qual pode ser, por exemplo, um anticorpo sinteti- zado por uma população clonal de células ou um anticorpo humanizado. 10 Uma população clonal que produz um anticorpo monoclonal pode ser uma população clonal de células imortalizadas.

Em algumas modalidades, as cé- lulas imohalizadas da população clonal são células hlbridas - hibridomas - tipicamente produzidas por meio de fusão de Iinfócitos B individuais de um animal imunizado com células individuais de um tumor linfoide. 15 A invenção refere-se, em parte, a um anticorpo humanizado ou porção de Iigação a antígeno do mesmo que tem especificidade de ligação pelo CCL20 humano e compreende uma cadeia leve humanizada e uma ca- deia pesada humanizada e/ou partes das mesmas.

Em uma modalidade, o anticorpo humanizado compreende uma cadeia leve que compreende uma 20 Olj mais CDRS (por exemplo, todas as três CDRS) de SEQ ID NO: 7 e uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais CDR (por exemplo, todas as três CDRS) de SEQ ID NO: 1, uma cadeia leve que compreende uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRS) de SEQ ID NO: 7 e uma ca- ü deia pesada compreendendo uma ou mais CDR (por exemplo, todas as trés 25 CDRs) de SEQ ID NO: 2, uma cadeia Ieve que compreende uma ou mais CDR (por exemplo, todas as três CDRS) de SEQ ID NO: 7 e uma cadeia pe- sada compreendendo uma ou mais CDR (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 3, uma cadeia leve que compreende uma ou mais CDRS (p. ex, todas as três CDRS) de SEQ ID NO: 7 e uma cadeia pesada compreen- 30 dendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRS) de SEQ ID NO: 4; uma cadeia leve que compreende uma ou mais CDRS (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 7 e uma cadeia pesada compreenden-

do uma ou mais CDRS (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 5, uma cadeia leve que compreende uma ou mais CDRS (por exemplo, todas as três CDRS) de SEQ ID NO: 7 e uma cadeia pesada que compreende uma ou mais CDRS (por exemplo, todas as três CDRS) de SEQ ID NO: 6; uma 5 cadeia leve que compreende uma ou mais CDRS (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 8 e uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais CDRS (por exemplo, todas as três CDRS) de SEQ ID NO: 1; uma ca- deia leve que compreende uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRS) de SEQ ID NO: 8 e uma cadeia pesada compreendendo uma ou 10 mais CDR (por exemplo, todos três) CDRS de SEQ ID NO: 2, uma cadeia leve que compreende uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRS) de SEQ ID NO: 8 e uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais CDR (por exempto, todas as três CDRS) de SEQ ID NO: 3, uma cadeia Ieve que compreende uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRS) de SEQ 15 ID NO: 8 e uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais CDR (por e- xemplo, todas as três CDRS) de SEQ ID NO: 4; uma luz cadeia compreen- dendo uma ou mais CDR (por exemplo, todas as três CDRS) de SEQ ID NO: 8 e uma cadeia pesada compreendendo uma OLl mais CDR (por exemplo, todas as três CDRS) de SEQ ID NO: 5 ou uma cadeia leve que compreende 20 um ou mais As CDR (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 8 e uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais CDRS (por exemplo, to- · das as três CDRs) de SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado da invençào ~ compreende (H)-CDR1, H-CDR2 e H-CDR3 de cadeia pesada e (L)-CDR1, 25 L-CDR2 e L-CDR3 de cadeia leve cujas sequências de aminoácidos são: a) SEQ ID NOs: 60, 64, 67, 70, 73 e 75, respectivamente; b) SEQ ID NOS: 60, 64, 67, 71, 73 e 75, respectivamente; C) SEQ ID NOS: 60, 63, 67, 70, 73 e 75, respectivamente; d) SEQ ID NOS: 60, 63, 67, 71, 73 e 75, respectivamente; 30 e) SEQ ID NOs: 61, 65, 68, 70, 73 e 75, respectivarnente; f) a SEQ ID NOS: 61, 65, 68, 71, 73 e 75, respectivamente; g) a SEQ ID NOS: 77, 79, 67, 70, 73 e 75, respectivamente:

h) SEQ ID NOS: 77, 79, 67, 71, 73 e 75, respectivamente; i) SEQ ID NOs: 78, 80, 68, 70, 73 e 75, respectivamente, e j) SEQ ID NOS: 78, 80, 68, 71, 73 e 75, respectivamente.

Em outra modalidade, um anticorpo humanizado da presente in-

venção compreende uma H-CDR3 cuja sequência é SEQ ID NO: 67 ou 68. Em determinadas modalidades, um anticorpo humanizado da presente in- venção compreende H-CDR3 e L-CDR3 cujas sequências são SEQ ID NOS: 67 e 75, respectivamente ou SEQ ID NOS: 68 e 75, respectivamente.

Em outra modaiidade, o anticorpo humanizado tem especificida- lO ' de de ligação pelo CCL20 humano e compreende uma cadeia leve que compreende uma ou mais CDRS selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 70 ou 71, 73 e 75 ou uma combinação das mesmas; e uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais CDRs selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 60, 61, 77 ou 78, 63, 64, 65, 79 ou 80 e 67 ou 68 ou uma combinação das mesmas.

Em outra modalidade, o anticorpo humanizado que tem uma es- pecificidade de ligação pelo CCL20 humano compreende uma cadeia leve que compreende uma ou mais CDRS (por exemplo, todas as três CDRS) de SEQ ID NO: 7, 8, 110 ou 112 e uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais CDRS (por exemplo, todas as três CDRS) de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 108. A invenção refere-se também a uma cadeia leve de anticorpo humanizada do anticorpo humanizado descrito aqui.

Em uma modalidade, a cadeia Ieve do anticorpo humanizado compreende uma ou mais CDRs sele- cionadas do grupo que consiste em 70 ou 71, 73 e 75 ou uma combinação das mesmas.

Por exemplo, o anticorpo humanizado tem L-CDRI, L-CDR2 e L-CDR3, cujas sequências de aminoácidos são 70, 73 e 75, respectivamente ou 71, 73 e 75, respectivamente.

A invenção refere-se também a uma cadeia pesada de anticorpo humanizada do anticorpo humanizado descrito aqui.

Em uma modalidade, a cadeia pesada do anticorpo humanizado compreende uma ou mais CDRS selecionadas do grupo que consiste em 60, 61, 77 ou 78, 63, 64, 65, 79 ou

80 e 67 ou 68 ou uma combinação das mesmas.

Por exemplo, o anticorpo humanizado tem H-CDRI, H-CDR2 e H-CDR3, cujas sequências de amino- ácidos são: a) SEQ ID NOS: 60, 63 e 67; b) SEQ ID NOS: 60, 64 e 67; C) SEQID NO: 61,65 e 68; d) a SEQ ID NOS: 77, 79 e 67, ou e) SEQ ID NOS: 78, 80 e 68. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado da presente in- lO venção compreende uma cadeia leve que compreende uma sequência de domlnio variável Nl) de SEQ ID NO: 15 ou 16. Em uma modalidade relacio- nada, o anticorpo humanizado compreende uma cadeia leve, cuja sequência de aminoácidos compreende ou consiste em uma de SEQ ID NOS: 7, 8, 110 e 112. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado compreende uma ca- deia leve, cuja sequência de aminoácidos compreende ou consiste em SEQ ID NO: 7 ou 8 sem a sequência sinalizadora.

Em uma modalidade, um anticorpo humanizado da presente ln- venção compreende uma cadeia pesada que compreende uma sequência de domlnio variável (Vh) de SEQ ID NOS: 9-14. Em uma modalidade rela- cionada, o anticorpo humanizado compreende uma cadeia pesada cuja se- quência de aminoácidos compreende ou consiste em uma de SEQ ID NOS: 1-6 e 108. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado compreende uma cadeia pesada cuja sequência de aminoácidos compreende ou consiste em uma de SEQ ID NOS: 1-6 sem a sequência sinalizadora e opcionalmente sem a lisina C-terminal.

Em uma modalidade, o anticorpo humanizado com- preende uma cadeia pesada cuja sequência de aminoácidos compreende ou consiste em SEQ ID NO: 108 sem a lisina C-terminal.

Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado da presen- te invenção compreende uma Vh e uma Vl cujas sequências de aminoácidos compreendem ou consistem em: a) SEQID NO: 9e SEQ ID NO: 15; b)SEQID NO:1OeSEQID NO:15;

c)SEQIDNO:11eSEQIDNO:15; d)a SEQID NO:12eSEQID NO:15; e)SEQID NO:13eSEQIDNO:15; f)aSEQIDNO:14eSEQIDNO:15; g)aSEQIDNO:9eSEQIDNO:16; h)SEQID NO: 1OeSEQID NO: 16: i)SEQIDNO:11eSEQIDNO:16; j)sEQ1D NO: 12eSEQ ID NO: 16; k) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 16; ou 1)SEQID NO:14eSEQID NO:16. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado da presente in- venção compreende uma cadeia leve (LC) e cadeia pesada (HC), cujas se- quências de aminoácidos compreendem ou consistem em: a)SEQIDNO:1eSEQIDNO:7; b)SEQIDNO:2eSEQIDNO:7; c)SEQIDNO:3eSEQIDNO:7; d)aSEQIDNO:4eSEQIDNO:7; e)SEQIDNO:5eSEQIDNO:7; f)aSEQIDNO:6eSEQIDNO:7; g)aSEQIDNO:1eSEQIDNO:8; h)SEQIDNO:2eSEQIDNO:8: i)SEQIDNO:3eSEQIDNO:8; j)sEQIDNO:4esEQIDNO:8; k)SEQIDNO:5eSEQIDNO:8; I)SEQIDNO:6eSEQlDNO:8: m)SEQID NO:108eSEQIDNO:11O;e n) SEQ ID NO: 108e SEQ ID NO: 112; em que as sequências de aminoácidos têm a sequência sinali- zadora, se presente, e em que SEQ ID NOS: 1-6 e SEQ ID NO: 108 opcio- nalmente carecem da lisina C-terminal.

A presente invenção proporciona uma combinação compreen- dendo uma cadeia pesada humanizada exemplificada ou uma porção de ligação a antígeno da mesma e uma cadeia Ieve humanizada exemplificada ou uma porção de ligação a antígeno da mesma da presente invenção, em outras palavras, as cadeias pesadas e Ieves podem ser "misturadas e com- binadas". Deverá ser entendido que tal combinação é susceptível de reter a

Iigação ao CCL20 humano, bem como a atividade de neutralização de qui- miotaxia.

Estas propriedades füncionais podem ser facilmente testadas u- sando os métodos descritos aqui.

Na realidade, a FlG. 7 demonstra a ativi- dade de neutralização de várias combinações de cadeias pesada e Ieve hu- manizadas exemplificativas da invenção.

A presente invenção também proporciona anticorpos anti-CCl-20 humano ou porções de Iigação a antígeno dos mesmos que se Iigam ao mesmo epitopo que e/ou competem ou competem de forma cruzada com um anticorpo exemplificado aqui.

Estes anticorpos podem ser, por exemplo, an- ticorpos humanizados, quiméricos ou de camundongo.

Por exemplo, a in-

venção proporciona anticorpos anti-CCl_20 humano e porções que se Iigam ao mesmo epitopo que e/ou competem ou competem de forma cruzada com um dos anticorpos anti-CCl-20 36F7C1O, 40-1C1OB9 e 42G5B1O de camun- dongo ou anticorpos humanizados ou versões quiméricas destes anticorpos de camundongo.

A capacidade de um anticorpo de se ligar ao mesmo epíto-

po que ou competir ou competir de forma cruzada com um anticorpo de refe- rência pode ser determinada conforme descrito aqui.

A título de exemplo não limitativo, espera-se que qualquer anticorpo ou porção que compreende as três CDRS de cadeias pesada e as três CDRS de cadeias leve do anticorpo de camundongo 36F7C1O venha a se Íigar ao mesmo epitopo que, competir com e competir de forma cruzada com o anticorpo de camundongo 36F7C1O.

Tais anticorpos podem incluir, por exemplo, anticorpos cuja cadeia pesada compreende qualquer uma de SEQ ID NOS: 9-11 e cuja cadeia leve compreende SEQ ID NO: 15 ou 16. Em algumas modalidades, tais anticor- pos podem ainda incluir, por exemplo, anticorpos cuja cadeia pesada com- preende qualquer uma de SEQ ID NOS: 12-14 e cuja cadeia leve compreen- deSEQ ID NO: 15ou16. Se desejado, por exemplo, para fins diagnósticos ou de ensaio

(por exemplo, imagiologia latente para permitir, por exemplo, monitoramento de terapias), o anticorpo humanizado (ou uma porção de Iigação a antígeno do mesmo) pode compreender um marcador detectável.

Marcadores detec- táveis adequados e métodos para marcação de um anticorpo humanizado 5 ou porção de ligação a antígeno do mesmo são bem conhecidos na técnica.

Marcadores detectáveis apropriados incluem, por exemplo, um radioisótopo (por exemplo, tais como Índio-111, Tecnécio-99m ou iodo-131), tags (por exemplo, emissores de positrons, Flúor-19), Íons paramagnéticos (por e- xemplo, Gadolínio (lll), manganês (ll)), uma tag de epitopo (tag), um marca- IO dor de afinidade (por exemplo, biotina, avidina), uma marcador de valência, uma enzima, um grupo fluorescente ou um grupo quimioluminescente.

Quando marcadores não são empregados, a formação de complexos (por exemplo, entre um anticorpo humanizado e CCL20 humano) pode ser de- terminada por meio de ressonância de pIasmon em superfície, ELISA, FACS ou outros métodos adequados.

Os anticorpos anti-CCL20 ou porções de Iigação a antígeno dos mesmos usados na invenção também podem ser conjugados, por exemplo, por meio de reações químicas ou modificações genéticas, à outras porções (por exemplo, porções de PEGuilação) que aprimoram a farmacocinética dos anticorpos, tal como meia-vida.

Em algumas modalidades, os anticorpos an- ti-CCL20 usados na presente invenção podem ser ligados a uma citocina apropriada, por exemplo, através de conjugação química ou modificações genéticas (por exemplo, acrescentando a sequência de codificação de cHo- cina ih-frame com uma sequência de codificação de anticorpo, deste modo, . criando uma proteína de füsão de anticorpo:citocina). A invenção refere-se também a imunoconjugados nos quais o anticorpo humanizado (ou uma porção de ligação a antigeno do mesmo) da invenção está acoplado a outro agente terapêutico, por exemplo, um com- posto bioativo (por exemplo, uma citocina, um superantígeno, um agente citotóxico ou uma toxina). Por exemplo, o anticorpo humanizado que tem especificidade de ligação pelo CCL20 humano (ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo) pode ser acoplado a uma proteína biológica, uma mo-

lécula de origem vegetal ou bacteriana (ou derivado da mesma), um anticor- po à interleucina-2 ou anticorpos à toxina da difteria.

Confome descrito aqui, anticorpos monoclonais de camundongo com especificidade de ligação pelo CCL20 humano foram produzidos.

Os anticorpos humanizados e quiméricos da presente invenção podem ser deri- vados dos anticorpos monoclonais de camundongo da presente invenção. lsto é, em algumas modalidades, os anticorpos anti-CCl-20 humanizados e quiméricos da invenção compreendem sequências feitas a partir de um anti- corpo monoclonal de camundongo da presente invenção, tal como uma ou mais sequências de CDR (por exemplo, todas as seis sequências de CDR) ou um ou mais domlnios variáveis (por exemplo, o domínio variável de ca- deia pesada e o domínio variável de cadeia leve). Conforme usado aqui, o termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que contém as CDRS de cadeia leve (L-CDRI, L-CDR2 e L- CDR3) e as CDRS de cadeia pesada (H-CDRI, H-CDR2 e H- CDR3) de um anticorpo de murino e regiões de framewotk e constantes provenientes de murino.

A invenção refere-se a anticorpos monoclonais de camundongo descritos aqui, bem como porções de ligação a antigeno dos anticorpos mo- noclonais de camundongo, cadeias leves dos anticorpos monoclonais de camundongo, cadeias pesadas dos anticorpos monocbnais de camundongo e porções destas cadeias pesada e Ieve.

Em uma modalidade particular, o anticorpo monoclonal de camundongo é 36F7C1O, 40-1C1OB9 ou 42G5B1O.

A invenção refere-se a anticorpos monoclonais de camundongo que care- cem das sequências sinalizadoras de cadeias pesada e Ieve e anticorpos monoclonais de camundongo que sáo glicosilados.

A invenção refere-se também a anticorpos, anticorpos precursores não glicosilados e anticorpos cuja cadeia pesada e/ou cadeia ieve compreendem sequências sinalizado- ras.

A invenção refere-se também à moléculas de ácido nucleico que codifi- cam qualquer uma das cadeias pesadas, cadeias leves de anticorpos de camundongo ou porções das mesmas, vetores e células hospedeiras que compreendem tais ácidos nucleicos, métodos de produção de qualquer uma das cadeias pesada ou leve de camundongo acima ou porções das mesmas e métodos de uso dos anticorpos de camundongo ou porções de ligação a antígeno dos mesmos.

A função de ligação de um anticorpo monoclonal de camundon- go ou uma porção de Iigação a antigeno do mesmo tendo especificidade de ligação pelo CCL20 humano pode ser detectada por meio de qualquer mé- todo adequado, por exemplo, usando ensaios que monitoram a formação de um complexo entre um anticorpo monoclonal de camundongo ou porção do mesmo e CCL20 (ou, por exemplo, um"peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos de CCL20 ou um suporte sólido que compreende CCL20 hu- mano). Também fornecidas aqui são porções dos anticorpos de murino que incluem cadeias leves, cadeias pesadas e porções de cadeias Ieve e pesada.

Estas porções de anticorpo podem ser obtidas ou derivadas, por exemplo, por meio dos métodos descritos aqui para porções de anticorpos humanizados.

Em uma modalidade, um anticorpo monoclonal de camundongo da presente invenção compreende uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 40, 42 ou 44 e compreende ainda uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 39, 41 Olj 43. Em uma determinada modalidade, o anticorpo monoclonal de camundongo compreende uma cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 40 e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 39, uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 42 e uma cadeia pesada compre- endendo SEQ ID NO: 41; ou uma cadeia Ieve compreendendo SEQ ID NO: 44 e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 43. Em outra modafidade, a invenção refere-se também a um anti- corpo monoclonal de camundongo que tem especificidade de Iigação pelo CCL20 humano compreendendo a região variável da cadeia leve tendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 40, 42 e 44: e uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 39, 41 e 43. A invenção refere-se também a um anticorpo monoclonal de camundongo cuja cadeia leve compreende a região variável de SEQ ID NO: 40, 42 ou 44. A invenção refere-se também a um anticorpo monoclonal de camundongo cuja cadeia pesada compreende a região variável de SEQ ID NO: 39, 41 ou 43. Se desejado, por exemplo, para fins diagnósticos ou de ensaio (por exemplo, imagiologia Iatente), o anticorpo monoclonal de camundongo ou porção de Iigação de antígeno do mesmo pode compreender um marca- dor detectável, por exempfo, conforme descrito aqui para os anticorpos hu- lO manizados.

Todos os métodos e técnicas descritos aqui adequados para detecção de anticorpos humanizados da presente invenção também podem ser usados para os antlcorpos monoclonais de camundongo da invenção.

Conforme descrito aqui, anticorpos quiméricos que têm especifi- cidade de ligação pelo CCL20 humano foram produzidos.

Conforme usado aqui, o termo "anticorpo quimérico" refere-se a uma proteína recombinante que contém os domínios variáveis de um anticorpo derivado de uma espé- cie, enquanto que os domínios constantes do anticorpo são derivados de uma espécie diferente.

Em uma modalidade, o anticorpo quimérico com es- pecificidade de Iigação peio CCL20 humano compreende os domlnios variá- veis de um anticorpo monoclonal de camundongo anti-CCl-20 humano.

Em uma modalidade, o anticorpo quimérico com especificidade de ligação pelo CCL20 humano compreende os domínios constantes de um anticorpo hu- mano.

Em uma modalidade particular, o anticorpo quimérico compreende os domínios variáveis de um anticorpo monoclonal de camundongo anti-CCL20 humano e os domínios constantes de um anticorpo humano.

A invenção refere-se a anticorpos quiméricos descritos aqui, bem como porções de ligação a antigeno dos anticorpos quiméricos, cadeias leves e cadeias pesadas dos anticorpos quiméricos e porções destas cadei- as leve e pesada.

A invenção refere-se a anticorpos quiméricos que carecem das sequências sinalizadoras de cadeias pesada e leve e anticorpos quimé- ricos que são glicosilados.

A invenção refere-se também a anticorpos, anti- corpos precursores não glicosilados e anticorpos cuja cadeia pesada e/ou cadeia leve compreendem sequências sinalizadoras.

A invenção refere-se também à moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das ca- deias pesadas, cadeias leves dos anticorpos quiméricos acima ou porções das mesmas, vetores e células hospedeiras que compreendem tais ácidos 5 nucleicos, métodos de produção de qualquer um dos anticorpos acima ou cadeias leves ou cadeias leves dos anticorpos acima ou porções das mes- mas e métodos de uso dos anticorpos quiméricos.

A função de ligação de um anticorpo quimérico tendo especifici- dade de ligação pelo CCL20 humano pode ser detectada por meio de qual- lO quer método adequado, por exemplo, usando ensaios que monitoram a for- mação de um complexo entre um anticorpo quimérico e CCL20 humano (ou, por exemplo, um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos de CCL20 ou um suporte sóIido que compreende CCL20 humano). Também fornecidas aqui são porções dos anticorpos quiméricos que incluem cadeias leves, cadeias pesadas e porções de cadeias Ieves e pesadas.

Estas porções de anticorpo podem ser obtidas ou derivadas, por exemplo, por meio dos métodos descritos aquí para as porções de anticor- pos humanizados.

Em uma modalidade, um anticorpo quimérico da presente inven- ção compreende a região variável de cadeia leve de SEQ ÍD NO: 40 e a re- gião variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 39, a região variável de ca- deia leve de SEQ ID NO: 42 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 41 ou a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 44 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 43. A invenção refere-se também a um anticorpo quimérico que tem especificidade de ligação pelo CCL20 humano compreendendo uma se- quência de região variável de cadeia leve selecionada do gmpo que consiste em: a região variável de cadeia Ieve em SEQ ID NO: 40, 42 Olj 44; e com- preendendo ainda uma sequência de região variável de cadeia pesada sele- cionada do gmpo que consiste em: região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 39, 41 ou 43. A invenção refere-se também a uma cadeia Ieve quimérica que compreende a região variável de SEQ ID NO: 40, 42 ou 44. A invenção refere-se também a uma cadeia pesada quimérica que compreende a região variável de SEQ ID NO: 39, 41 ou 43. Se desejado, por exemplo, para fins diagnósticos ou de ensaio 5 (por exemplo, imagiologia latente), o anticorpo quimérico ou uma porção de Iigação a antígeno do mesmo pode compreender um marcador detectável, por exemplo, confome descrito aqui para os anticorpos humanizados.

Todos os métodos e técnicas descritos aqui adequados para detecção de anticor- pos humanizados da presente invenção podem também ser usados para detecção de anticorpos quiméricos da invenção.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CCl-20 da invenção é um anticorpo totalmente humano.

Conforme usado aqui, o termo "anticorpo humano" deverá ser entendido como qualquer anticorpo no qual as sequên- cias dos dominios variável e constante são sequências humanas.

O termo abrange anticorpos com sequências derivadas de genes humanos mas que foram atteradas, por exemplo, possivelmente para diminuir a imunogenicida- de, aumentar a afinidade, eiiminar cisteínas que possam causar dobramento indesejável, etc.

O termo também abrange aqueles anticorpos produzidos de forma recombinante em células não humanas, os quais poderiam conferir glicosilação não típica de células humanas.

Métodos para preparo de anti- corpos totalmente humanos são conhecidos na técnica.

Por exemplo, anti- corpos anti-CCl-20 humano podem ser identificados por meio de métodos in vitro, tais como phage display, visualização de ribossomo (CAT), visualiza- ção de Ievedura e similares ou podem ser produzidos a partir de uma célula B humana ou uma célula de hibridoma humano.

Altemativamente, anticorpos humanos podem ser produzidos por meio de imunização com um antígeno CCL20 de qualquer um de uma série de animais não humanos transgênicos compreendendo, em seus genomas, alguns ou todos os loci de cadeias pe- sadas e cadeias leves de imunoglobulina humana.

Em algumas modafida- des, o animal não humano que compreende os genes de imunoglobulina humana é um animal que tem um "minilocus" de imunoglobulina humana (por exemplo, Genpharm International, lnc.). Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CCl-20 humano são produzidos usando um XENOMOUSE® (Abgenix, lnc., Fremont, CA), um AcMHu-Mouse® (Medarex, lnc.), um ca- mundongo Veloclmmune® (Regeneron Phamaceuticals, lnc.) um camun- dongo AlivaMab (Ablexis, LLC), um camundongo KM" (Kirin Pharma USA,

lnc.) ou similar.

A presente invenção refere-se também a ácidos nucleicos isola- dos e/ou recombinantes compreendendo sequências que codificam um anti- corpo humanizado ou uma cadeia leve ou cadeia pesada do mesmo, um anticorpo monoclonal de camundongo ou uma cadeia Ieve ou cadeia pesada do mesmo ou um anticorpo quimérico ou cadeia leve ou e cadeia pesada do mesmo ou porções de ligação a antígeno de qualquer um dos acima da pre- sente invenção.

Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQIDNOS:17-32,51-56,109,111e113. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico da in- venção incluem sequências de ácido nucleico que hibridizam, sob condições aftamente estringentes ou que são pelo menos 70%, 75°6, 80%, 85°6, 90%, 95°/o, 97%, 98% ou 99% idênticas, a uma ou mais das sequências de ácido nucleico mencionadas aqui ou uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de Vh ou Vl fornecidas.

Ácidos nucleicos referidos aqui como "isolados" ou "purificados" são ácidos nucleicos que foram separados de ácidos nucleicos do DNA ge- nômico ou RNA celular de suas fontes de origem (por exemplo, conforme existente em células ou em uma mistura de ácidos nucleicos, tal como uma biblioteca) e incluem ácidos nucleicos obtidos por meio de métodos descri- tos, métodos adequados descritos aqui ou outros.

Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são ácidos nucleicos isolados essencialmente puros, ácidos nucleicos produzidos por meio de sÍntese química, ácidos nucleicos produzidos através de combinações de métodos biológicos e químicos e á- cidos nucleicos recombinantes que são isolados (vide, por exemplo, Dau- gherty et al., Nuc/eic Acids Res. 19 (9): 2471-2476 (1991); Lewis e Crowe,

Gene, 101: 297-302 (1991)). Uma referência a uma seqüência de nucleotídeos abrange o complemento da mesma, a menos que especificado em contrário.

Desta forma, uma referência a um ácido nucleico com uma sequência em particular deve ser entendida como abrangendo sua cadeia complementar com sua sequência complementar.

O temo "poIinucleotÍdeo", conforme referido aqui, significa um poíímero, possivelmente isoiado, sob forma de nucleotídeos de pelo menos 10 bases de comprimento, quer ribonucleotídeos ou desoxinu- cIeotldeos, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo.

O termo inclui formas fita simples e dupta.

Ácidos nucleicos referidos aqui como "recombinantes" são áci- dos nuclelcos que foram produzidos por meio da metodologia de DNA re- combinante, incluindo aqueles ácidos nucleicos que são gerados através de procedimentos que dependem de um método de recombinação artificial, tal como reação em cadeia de poIlmerase (PCR) e/ou de clonagem em um ve- tor usando enzimas de restrição.

Em algumas modalidades, os ácidos nucle- icos recombinantes resultam de eventos de recombinação que ocorrem atra- vés de mecanismos naturais de células, mas são selecionados após introdu- ção, nas células, de ácidos nucleicos concebidos para permitir e tomar pos- sÍvel um evento de recombinação desejado.

A presente invenção refere-se também, mais especificamente, a ácidos nucleicos isolados e/ou recombinantes compreendendo uma sequên- cia de nucleotídeos que codifica um anticorpo humanizado, anticorpo de ca- mundongo ou anticorpo quimérico ou uma porção de ligaçâo a antígeno do referido anticorpo que tem especificidade de íigação pelo CCL20 humano.

Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo de camundongo da presente invenção, um anticorpo humanizado da presente invenção no qual a(s) porção(ões) não humana(s) é/SãO derivada(s) de um anticorpo mono- cIonal anti-CCt-20 de murino ou um anticorpo quimérico da presente inven- ção no qual a(s) porção(ões) não humana(s) é/são derivada(s) de um anti- corpo monoclonal anti-CCl20 de murino.

Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos da invenção são usados para produzir anticorpos humanizados com especificidade de ligação pelo CCL20 humano, anticorpos de camundongo com especificidade de li- gação pelo CCL20 humano e anticorpos quiméricos que têm especificidade de ligação pelo CCL20 humano.

Por exemplo, um ácido nucleico (por exem- plo, DNA (tal como CDNA) ou RNA) ou um ou mais ácidos nucleicos que co- dificam um anticorpo humanizado, anticorpo de camundongo ou anticorpo quimérico da presente invenção pode ser incorporado em um construto ade- quado (por exemplo, um vetor recombinante) para manipulação adicional de sequências ou produção dos anticorpos codificados em células hospedeiras adequadas.

Construtos ou vetores adequados para expressão de um anti- corpo humanizado tendo especificidade de Iigação pelo CCL20 humano, an- ticorpo de camundongo com especificidade de ligação pelo CCL20 humano ou anticorpo quimérico tendo especificidade de ligação pelo CCL20 humano são também fornecidos.

Uma variedade de vetores está disponível, incíuindo vetores que são mantidos em uma única cópia ou em múltlplas cópias de uma célula hospedeira ou que se integram no(s) cromossomo(s) de uma célula hospedeira.

Construtos ou vetores podem ser introduzidos em uma célula hospedeira adequada e células que expressam um anticorpo humani- zado, anticorpo de camundongo ou anticorpo quimérico da presente inven- ção podem ser produzidas e mantidas em cultura.

Um único vetor ou múlti- plos vetores podem ser usados para expressão de um anticorpo humaniza- do, anticorpo de camundongo ou anticorpo quimérico tendo especificidade de ligação pelo CCL20 humano.

Vetores de expressão adequados, por exemplo, vetores de ex- pressão de células de mamlferos, podem também conter uma série de com- ponentes incluindo, porém sem limitações, um ou mais dos seguintes: uma origem de replicaçâo, um gene marcador selecionável, um ou mais elemen- tos de controle de expressão, tal como um elemento de controle de transcri- ção (por exemplo, um promotor, um facilitador, um terminador), um ou mais sinais de tradução e/ou uma sequência sinalizadora ou sequência lider (que codifica um "peptídeo sinalizador") para objetivação à membrana ou secre-

ção.

Em um construto ou vetor, uma sequência sinalizadora pode ser pro- porcionada pelo construto ou vetor ou outra fonte.

Por exemplo, sinais de transcrição e/ou tradução podem ser usados para dirigir a expressão.

Em algumas modalidades, é proporcionado um promotor para 5 expressão de um anticorpo ou cadeia de anticorpo da invenção em uma cé- Iula hospedeira adequada.

Em algumas modalidades, o promotor é constitu- tivo.

Em algumas modalidades, o promotor é induzível.

O promotor pode ser operativamente ligado a um ácido nucleico que codifica uma cadeia de anti- corpo ou um anticorpo ou uma porção de Iigação a antígeno do referido anti- lO corpo ou cadeia, de modo a dirigir a expressão do polipeptídeo codificado.

Uma variedade de promotores adequados para hospedeiros procariotas (por exemplo, lac, tac, T3, T7 promotores para E. coh) e eucariotas (por exemplo, desidrogenase de álcool de levedura (ADHI), SV40, CMV) estão disponí- veis.

Aqueles versados na técnica serão capazes de selecionar o promotor apropriado para expressão de um anticorpo anti-CCl-20 ou porção de Iiga- ção a antígeno do mesmo da invenção.

Em algumas modalidades, o vetor que codifica um anticorpo ou cadeia de anticorpo da invenção compreende um marcador selecionável pa- ra seleção de oélulas hospedeiras portadoras do vetor.

Em algumas modali- dades, o marcador de seleção é um gene que codifica um produto que con- fere resistência a antibiótico ou fármaco, o qua) pode ser usado em oélulas procariotas (por exemplo, o gene de P-iactamase (resistência à ampicilina), gene Tet (resistência à tetraciclina), etc.) e células eucariotas (por exemplo, os genes de resistência à neomicina (G418 ou geneticina), gpt (ácido mico- fenólico), ampicilina ou higromicina). Em algumas modalidades, o marcador selecionável é redutase de di-hidrofolato, o qual permite seleção com meto- trexato em uma variedade de hospedeiros.

Em algumas modalidades, o marcador selecionável é um gene que codifica um marcador auxotrófico do hospedeiro (por exemplo, LEU2, URA3, H/S3), por exemplo, para uso em Ieveduras.

Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral (por exemplo, baculovírus) ou fago.

Em uma modalidade, o vetor é capaz de se integrar no genoma da célula hospedeira (por exemplo, vetor retroviral). Em algumas modalidades, o vetor é um vetor repiicável e compreende uma origem de replicação.

A invenção, portanto, refere-se a moléculas de ácido nucleico i- soladas que codificam o anticorpo humanizado, cadeia leve humanizada, 5 cadeia pesada humanizada, anticorpo de camundongo, cadeia leve de anti- corpo de camundongo, cadeia pesada de anticorpo de camundongo, anti- corpo quimérico, cadeia leve quimérica ou cadeia pesada quimérica da pre- sente invenção.

A invenção refere-se também a moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam uma porção de ligação a antlgeno de qualquer um destes anticorpos ou cadeias dos mesmos.

Sequências polipeptídicas codifi- cadas pelos ácidos nucleicos da presente invenção são descritas acima e nos Exemplos a seguir.

Em algumas modalidades, um ácido nucleico ou vetor da pre- sente invenção codifica uma cadeia pesada (ou uma porção de ligação a antígeno da mesma) ou uma cadeia leve (ou uma porção de ligação a antí- geno da mesma) da invenção.

Uma célula hospedeira contendo a sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada e sequência de ácido nuclei- co que codifica a cadeia leve ou ácidos nucleicos que codificam as porções de Iigação a antígeno da referida cadeia pesada e da referida cadeia leve podem ser usados para produzir um anticorpo compreendendo uma pesada e uma cadeia leve (ou uma porção de ligação a antigeno do anticorpo). O ácido nucleico que codifica a cadeia pesada e o ácido nucieico que codifica a cadeia Ieve podem estar colocados em vetores de expressão distintos.

Eles também podem estar colocados em um único vetor de expressão sob o mesmo ou diferente controle de expressão.

Vide, por exemplo, Patentes U.S.

N" 6.331.415 e 7.662.623. Outro aspecto da invenção refere-se a um método de preparo de um anticorpo anti-CCl-20 humano ou uma porção de ligação a antígeno da invenção.

O anticorpo ou porção pode ser produzida, por exemplo, mediante expressão de um ou mais ácidos nucleicos recombinantes que codificam o anticorpo ou porção em uma célula hospedeira adequada.

A célula hospe- deira pode ser produzida usando qualquer método adequado.

Por exemplo,

um ou mais construtos de expressão descritos aqui podem ser introduzidos em uma célula hospedeira adequada e as células resultantes podem ser mantidas sob condições adequadas para expressão do(s) construto(s) ou vetor(es). Em algumas modalidades, a célula resultante é mantida em cultu- 5 ra, em um animal ou em uma pIanta.

Células hospedeiras adequadas podem ser procariotas, incluindo células bacterianas, tais çomo E. co/i (por exem- plo, a cepa DH5a" (lnvitrogen, Carlsbad, CA)), B. subti/is e/ou outras bacté- rias adequadas, células eucariotas, tais como células fúngicas ou de levedu- ra (por exemplo, P/chia pastoris, Aspergi//us sp., Sacchammyces cemvisiae, Schizosacchammyces pombe, Neumspora cmssa) ou outras células eucari- otas inferiores e células eucariotas superiores, tais como aquelas de insetos (por exemplo, céfulas S2 de Drosophi/a Schneider, células de inseto Sf9 (do- cumento WO 94/26087 (O'Connor), células de inseto TN5B1-4 (HIGH 5) (ln- vitrogen), de mamlferos (por exemplo, células COS, tais como células COS- 1 (ATCC N° CRL-1650) e células COS-7 (ATCC N° CRL-1651), CHO (por exemplo, ATCC N° CRL-9096), CHO DG44 (Urlaub e Chasln.

Pioc.

Natl.

Acac.

Sci.

USA 77 (7): 4216-4220 (1980)), 293 (ATCC N° CRL-1573), HeLa (ATCC N° CCL-2), CVl (ATCC N" CCL-70), WOP (Dailey et al., ViÍo/. 54: 739-749 (1985)), 3T3, 293T (Pear et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 90: 8392-8396 (1993)), células NSO, células SP2/0, células HuT 78 e similares)) ou células de pIanta (por exemplo, tabaco, Lemna (Ientilha) e algas). (Vide, por exemplo, Ausubel et al. eds., Cunent Protoco/s in Mo/ecu/ar Bio/ogy, Greene Publishing Associates and john Wiley & Sons Inc. (1993))- Em al- gumas modalidades, a célula hospedeira não é parte de um organismo mul- ticelular (por exemplo, planta ou animal). Em determinadas modalidades, a célula hospedeira é uma célula hospedeira isolada ou parte de uma cultura de células.

A presente invenção refere-se também a células contendo um ácido nucleico ou um vetor da invenção.

Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão.

Em algumas modalidades, um ou mais ácidos nucle- icos que codificam as cadeias pesada e leve de um anticorpo humanizado ou porção de ligação a antígeno das mesmas, cadeias pesada e leve de um anticorpo de camundongo ou uma porção de ligação a antígeno das mes- mas ou as cadeias pesada e leve de um anticorpo quimérico ou porção de (igação a antígeno das mesmas, o referido anticorpo ou porção tendo espe- cificidade de Iigação pelo CCL20 humano ou um ou mais construtos com- 5 preendendo tal(is) ácido(s) nucleico(s) podem ser introduzidos em uma célu- la hospedeira apropriada por meio de um método adequado na célula hos- pedeira selecionada.

Em algumas modaiidades, o método de introdução é, por exemplo, transfomação, transfecção, eletroporação ou infecção.

Em algumas modalidades, O(S) ácido(s) nucleico(s) é/SãO operativamente Iiga- IO do(s) a um ou mais elementos de controle de expressão.

Em determinadas modalidades, O(S) ácido(s) nucleico(s) está/estão em um vetor, em um cons- truto criado por processos celulares ou integrado no genoma da célula hos- pedeira.

As células hospedeiras podem ser mantidas sob condições ade- quadas para expressão.

Em algumas modalidades, estas condições incluem a presença de um indutor ou meios adequados (suplementado, por exemplo, com sais, fatores de crescimento, antibiótico, suplementos nutritivos apropri- ados, etc.), através das quais O(S) po1ipeptÍdeo(s) codiflcado(s) é/São produ- zido(s). Estes processos abrangem expressão em uma célula hospedeira (por exemplo, uma céiula de glândula mamária), um anima! ou planta trans- gênica (por exemplo, tabaco) (vide, por exemplo, documento WO 92/03918). Em algumas modalidades, os anticorpos ou porções são isolados das célu- Ias hospedeiras, do meio de cultura ou do Ieite.

A invenção refere-se também a proteínas de fijsão nas quais um anticorpo ou porção da invenção (por exemplo, um anticorpo humanizado ou porção) está ligado à outra porção (por exemplo, uma porção que não ocorre naturalmente em anticorpos, confome na natureza) em um sitio N-temiinal, sítio C-terminal ou interna à proteína de fusão.

Em algumas modalidades, a proteína de fusão pode ser produzida mediante inserção de um ácido nuclei- co que codifica uma sequência de anticorpo em um vetor de expressão ade- quado, tal como um vetor pET (por exemplo, pET-15b, Novagen), um vetor de fago (por exemplo, pCANTAB 5 E, Pharmacia) ou outro vetor (por exem- plo, vetor de fusão de Proteína A pRIT2T, Pharmacia). O construto resuftan-

te pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para expres- são.

Em algumas modalidades, as proteínas de fusão expressas são isola- das ou purificadas de um ligante celular por meio de uma matriz de afinidade adequada (vide, por exemplo, Cunent Protoco/s in Mo/ecu/ar Bio/ogy (Au- 5 subel et al.

Eds., Vol. 2, Supl. 26, páginas 16.4.1-16.7.8 (1991)))- A invenção refere-se a uma célula hospedeira recombinante que compreende um ácido nucleico que codifica um anticorpo ou porção ou as cadeias pesada e/ou leve do mesmo fornecidas aqui (por exemplo, um anti- corpo humanizado, uma cadeia Ieve humanizada ou cadeia pesada humani- IO zada, um anticorpo de camundongo, uma cadeia Ieve de camundongo ou uma cadeia pesada de camundongo, um anticorpo quimérico ou uma cadeia pesada quimérica ou uma cadeia leve quimérica da invenção). A invenção refere-se também a uma célula hospedeira recombinante que compreende um ácido nucleico que codifica uma porção de ligação a antígeno do anticor- po ou suas cadeias.

Em algumas modalidades, a célula hospedeira compre- ende um vetor recombinante da invenção, confonne referido aqui.

Em algu- mas modalidades, o referido vetor recombinante é um vetor de expressão.

Em determinadas modalidades, o referido vetor recombinante é um vetor de expressão de céiula de mamlfero.

A invenção refere-se também a um método de preparo de um anticorpo ou porção ou uma cadeia pesada ou leve do mesmo da presente invenção.

Em uma modalidade, o método compreende manutenção de uma célula hospedeira da invenção, conforme descrito aqui, sob condições ade- quadas para expressão do anticorpo ou porção ou cadeias pesada e/ou leve do mesmo.

Em algumas modaiidades, a célula hospedeira contém um ou mais ácidos nucleicos isolados que codificam o anticorpo ou porção ou ca- deias pesada e/ou leve do mesmo da invenção.

Em algumas modalidades, a célula hospedeira é cultivada em um substrato ou em suspensão.

Em algu- mas modalidades, o método compreende ainda a etapa de purificação ou isolamento do anticorpo ou cadeia de anticorpo.

A invenção refere-se também a um método de preparo de anti- corpos ou de porções de ligação a antlgeno dos mesmos através de phage disp/ay.

Em algumas modalidades, uma biblioteca de phage disp/ay de anti- corpos não expostos ao antígeno CCL20 sofre "panning". Em algumas mo- dalidades, um método de preparo de anticorpos por meio de seleção objeti- vada é usado (vide, por exemplo, Publicação de Patente US N° 2006- 5 0251658 Al). Em determinadas modalidades, uma biblioteca comum cons- truída, por exemplo, com base em uma região CDR3 de cadeia pesada fixa (e/ou cadeia Ieve) de um anticorpo anti-CCl-20 conhecido é gerada.

Regiões CDRI e CDR2 de cadeias pesada e Ieve podem ser derivadas de um reper- tório não exposto (Osburn et al., Methods 36: 61-68 (2005)). Em uma moda- lO lidade, scFVS anti-CCL20 são gerados a partir de bibliotecas de anticorpos scFv não expostos, as quais são usadas para obtenção de anticorpos qui- méricos de camundongo-humano com as propriedades de ligação deseja- das.

Estas bibliotecas podem ser pesquisadas quanto a anticorpos com as propriedades de Iigação desejadas.

Em algumas modalidades, são usadas bibliotecas de fagos de scfv.

Em determinadas modalidades, scFV'S que reconhecem CCL20 humano são isolados de bibliotecas de SCFV por meio de seleção objetivada após uma série de ciclos repetidos de seleção de C- CL20 humano recombinante, essencialmente conforme descrito em Vau- ghan et al., Nature Biotech. 14: 309-314 (1996). Em resumo, após incubação com a biblioteca, o antlgeno imobilizado, o qual é pré-acoplado a glóbulos paramagnéticos, e os fagos ligados podem ser recuperados por meio de se- paração magnética, enquanto que o fago não Iigado é Iavado.

Fago iigado pode, entào, ser recuperado, conforme descrito por Vaughan et al. (1996, supra) e o processo de seleção repetido.

Em uma modalidade particular, é construída uma biblioteca que consiste em todo o domínio variável da cadeia pesada de um anticorpo anti- CCL20 de camundongo fundido, em um formato de cadeia simples, a um repertório de regiões variáveis de cadeias leve humanas não expostas.

Após seleção, regiões variáveis de cadeia Ieve humanas que complementam as regiões variáveis de cadeia pesada de camundongo são identificadas.

Uma biblioteca é, então, construída, a qual consiste no repertório de regiões vari- áveis de cadeias leve humanas selecionadas conforme descrito acima fundi-

das, em um formato de cadeia simples, a uma região variável da cadeia pe- sada quimérica que consiste nas regiões de CDRI e CDR2 humanas não expostas e uma região de CDR3 fixa do domínio variável de cadeia pesada do anticorpo anti-CCL20 de camundongo.

Após seleção por Iigantes de C- 5 CL20, os melhores cIones de ligação são selecionados.

Cinco das seis regi- ões de CDR podem ser de origem humana, enquanto que a CDR3 da região variável de cadeia pesada pode ser idêntica à CDR3 original do domínio va- riável de cadeia pesada de camundongo.

Em algumas modalldades, as seleções são realizadas usando CCL20 acoplado a DYNABEADS M-270 Amine (Dynal), de acordo com as recomendações do fabricante.

Em algumas modalidades, seleções usando CCL20 biotinilado podem ser preparadas usando o reagente específico para amina primária, succinimidil-6-(biotinamido)hexanoato, seguindo as instru- ções do fabricante (EZ Link NHS LC Biotin, Pierce). Em algumas modalidades, resuttados de seleções são testados como preparados periplasmáticos em triagens de alto rendimento com base em ensaios de competição que medem a capacidade dos scFv presentes no preparado periplasmático de competir pela Iigação ao CCL20. Amostras que são capazes de competir na triagem de alto ren- dimento podem ser submetidas a sequenciamento de DNA, conforrne descri- to em Vaugban et al. (1996, supra) e Osburn et al. (2005, supra). CIones po- dem, então, ser expressos e purificados como SCFV ou lgG e avaliados quanto à sua capacidade de se Iigar ao CCL20, neutralizar o CCL20 ou uma combinação dos mesmos, por exemplo, usando ensaios tais como o ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e ensaio de cito- toxicidade dependente de complemento (CDC). Preparados purificados de scFv podem, então, ser feitos conforme descrito no Exemplo 3 do documen- to WO 01/66754. As concentrações de proteína em preparados de scFv puri- ficados foram determinadas usando o método BCA (Pierce). Abordagens similares podem ser usadas para triagem de um parceiro ideal (a cadeia o- posta) de um domlnio variável de cadeias pesada ou Ieve ou cadeias pesada ou Ieve de anticorpo de comprimento total.

Em uma outra modalidade, um anticorpo anti-CCL20 humano ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, conforme descrito aqui, é u- sado primeiro para selecionar sequências de cadeias pesada e leve que têm atividade de ligação simiiar pelo CCL20 usando métodos de impressão de 5 epitopos descritos na Publicação PCT N° WO 93/06213, aqui incorporada por referência.

Em determinadas modaiidades, bibliotecas de anticorpos u- sadas neste método são bibliotecas de scFv preparadas e testadas confor- me descrito na Publicação PCT N° WO 92/01047; McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990); Griffiths, E. et al., EMBO j. 12: 725-734 (1993), todos aqui incorporados por referência.

Em determinadas modalidades, as biblio- tecas de anticorpo SCFv sofrem triagem usando CCL20 humano como antí- geno.

Uma vez que os domínios Vl e Vh iniciais são selecionados, ex- perimentos de "misturar e combinar" podem ser realizados, nos quais dife- rentes pares de segmentos Vh e Vl que sofreram triagem inicial são selecio- nados pela ligação ao CCL20 para selecionar combinações de pares de VlNh prekridos.

Além disso, para melhorar ainda mais a qualidade do anti- corpo, os segmentos de pares VlNh preferidos podem sofrer mutação ao acaso, em um processo análogo ao processo de mutação somática in vivo responsável pela maturação por afinidade dos anticorpos durante uma res- posta imune natural.

Em algumas modalidades, mutações aleatórias ocor- rem dentro da região de CDR3 de Vh e/ou Vl.

Em determinadas modalida- des, esta maturação por afinidade in V/tfO é reafízada, por exemplo, através de amplificação de domínios Vp, e VL usando iniciadores de PCR comple- mentares à CDR3 de Vh ou CDR3 de Vl, respectivamente, em que os inicia- dores foram "salpicados" com uma mistura ao acaso das quatro bases de nucleotideo em determinadas posições, de modo que os produtos de PCR resultantes codificam segmentos Vh e Vl nos quais as mutações aleatórias foram introduzidas na região de CDR3 de Vh e/ou Vl.

Estes segmentos Vh e Vl com mutação ao acaso podem sofrer nova triagem quanto à ligação ao CCL20. Após triagem e isolamento de um anticorpo anti-CCl20 da in-

venção de uma biblioteca de visualização de anticorpos recombinantes, áci- dos nucleicos que codificam o anticorpo selecionado podem ser recuperados do pacote de visuatização (por exemplo, do genoma do fago) e subclonados em outros vetores de expressão por meio de técnicas de DNA recombinante 5 convencionais.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico é ainda manipu- lado para criar outras formas de anticorpo da invenção, conforme descrito aqui.

Em determinadas modalidades, para expressar um anticorpo humano recombinante isolado através de triagem de uma biblioteca combinatorial, o DNA que codifica o anticorpo é clonado em um vetor de expressão recombi- lO nante e introduzido em células hospedeiras de mamifero, conforme descrito aqui.

Em uma modalidade particular, a invenção proporciona um mé- todo de produção de um hibridoma que secreta um anticorpo monoclonal que tem especificidade de ligação pelo CCL20 humano compreendendo ad- ministração de Iinfócitos de um camundongo transgênico para CCL20 a um camundongo transgênico não tendo a mesma característica (por exemplo, CDl) que o camundongo transgênico para CCL20 humano, deste modo, produzlndo um camundongo não transgênico imunizado.

Esplenócitos do camundongo não transgênico imunizado são contatados com células imorta- lizadas, assim, produzindo célufas fundidas e as células fúndidas são man- tidas sob condições pelas quais hibridomas que secretam um anticorpo mo- noclonal com especificidade de ligação pelo CCL20 humano são produzidos, deste modo, produzindo um hibridoma que secreta um anticorpo monoclonal que tem especificidade de ligação pelo CCL20 humano.

A presente invenção também proporciona métodos de preparo de formas mutantes dos anticorpos anti-CCl-20 e porções de ligação a antí- geno dos mesmos da presente invenção- Em algumas modalidades, os anti- corpos ou porções sofrem mutação nos domínios variáveis das cadeias pe- sada e/ou leve.

Em determinadas modalidades, a referida mutação altera uma ou mais propriedades de ligação do anticorpo ou porção.

Em modalida- des particulares, uma mutação é feita em uma ou mais das regiões de CDR para aumentar ou diminuir a Kd do anticorpo anti-CCl-20 ou porção, aumen-

tar ou diminuir a km ou alterar a especificidade de ligação do anticorpo ou porção.

Métodos de mutagênese sÍtio-dirigida são bem conhecidos na técni- ca.

Vide, por exemplo, Sambrook et al. e Ausubel et al., supra.

Em uma ou- tra modalidade, uma ou mais mutações são feitas em um resíduo de amino- 5 ácido que se sabe estar alterado, quando comparado com a linhagem ger- minativa, em um anticorpo monoclonal da invenção.

Em determinadas mo- dalidades, as mutações são feitas em uma região de CDR ou região de fra- mework de um dominio variável ou um domlnio constante.

Em uma modali- dade particular, as mutações são feitas em um domlnio variável.

Em algu- lO mas modalidades, uma ou mais mutações são feitas em um resíduo de ami- noácido que se sabe estar alterado, quando comparado com a linhagem germinativa, em uma região de CDR ou região de framework de um domínio variável de um anticorpo ou porção da invenção.

Em uma outra modalidade, a região de framework sofre muta- ção de modo que a(s) região(ões) de hamework resultante(s) tenha(m) a sequência de aminoácidos do gene de Íinhagem germinativa corresponden- te.

Em determinadas modalidades, uma ou mais mutações são feitas em uma região de hamework ou dominio constante para aumentar a meia-vida do anticorpo anti-CCL20 ou porção.

Vide, por exemplo, Publicação PCT WO 00/09560. Em deteminadas modalidades, uma mutação em uma região de framewotk ou domínio constante é feita para alterar a imunogenicidade do anticorpo ou proporcionar um sÍtio para ligação covalente ou não covalente à outra molécula.

De acordo com a invençào, um Único anticorpo ou porção pode ter mutações em qualquer uma ou mais das CDRS ou regiões de fra- mework do domínio variável ou domínio constante.

Os anticorpos anti-CCl-20 ou porções de Iigação a antígeno do mesmo da invenção também podem ser produzidos transgenicamente por meio da geração de um mamífero ou planta que é transgênico para as se- quências de cadeias pesada e Ieve de anticorpo de interesse e produção do anticorpo de uma forma recuperável dos mesmos.

Em algumas modalida- des, os anticorpos anti-CC!-20 ou porções são produzidas em e recuperadas do leite de cabras, vacas ou outros mamiferos.

Vide, por exemplo, Patentes

US N°' 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172 e 5.741.957. Em algumas modali- dades, animais transgênicos não humanos que compreendem loci de anti- corpos humanos são imunizados com CCL20 humano ou uma porção imu- nogênica do mesmo, conforme descrito acima. Métodos para produção de 5 anticorpos em pIantas são descritos, por exemplo, nas Patentes US N°'

6.046.037 e 5.959.177. Em algumas modalidades, animais não humanos ou plantas transgênicas são produzidas mediante introdução de uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam um anticorpo anti-CCl-20 ou porção da in- lO venção no animal ou planta por meio de técnicas transgênicas padrões. Vide Hogan e Patente US N° 6.417.429, supra. Em determinadas modalidades, as células transgênicas usadas para produzir o animal transgênico podem ser células estaminais embrionárias ou células somáticas ou de um ovo ferti- lizado. Em algumas modalidades, os animais transgênicos não humanos ou plantas são quimêricos, heterozigotos não quiméricos e homozigotos não quiméricos. Vide, por exemplo, Hogan et al., Manlku/ating the Mouse Em- biyo: A Laboratoiy Manual, 2" ed, CoId Spring Harbor Press (1999); jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Ractical Appioach, Oxford Uni- versity Press (2000); e Pinkert, Ttansgenic Animal Techno/ogy: A Laboratoiy Handbook, Academic Press (1999). Em algumas modalidades, os animais transgênicos não humanos ou plantas têm uma ruptura objetivada e substitu- ição por um constmto de objetivação que codifica uma cadeia pesada e/ou uma cadeia Ieve de interesse. Em determinadas modalidades, os animais Olj plantas transgênicas compreendem e expressam moléculas de ácido nuclei- co que codificam as cadeias pesada e Ieve que se ligam especificamente ao CCL20 humano. Os anticorpos anti-CCl-20 ou porções podem ser feitos em qualquer animal não humano ou planta transgênica. Em modalidades parti- culares, os animais não humanos são camundongos, ratos, ovelhas, porcos, cabras, gado ou cavalos. O animat transgênico não humano pode expressar os polipeptideos codificados no sangue, leite, urina, saliva, lágrimas, muco e outros fluidos corporais. Os anticorpos e porções de ligação a antígeno do mesmo da in-

venção são úteis em neutralização de quimiotaxia induzida por CCL20, por exemplo, em células CCR6", tais como células dendrlticas (DCS imaturas), células T efetuadoras/memória e càulas-8. Os anticorpos e porções podem, assim, ser úteis no tratamento de uma variedade de doenças e condições, 5 tais como inflamação, doenças autoimunes e câncer.

Exemplos de doenças e condições que podem ser tratadas com os anticorpos ou ,porções de liga- ção a antígeno da presente invenção incluem, sem limitação, doença de Grave, vitiligo, hipertiroidismo, artrite reumatoide, psoriase, dermatite atópi- ca, dermatite de contato, doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, neoplasias de células B, adenocarcinoma de mama, hepatite crônica, derma- tite de contato, glioblastoma, carcinoma hepatocelular, infecção por papiloma vÍrus humano do céNix, micose fungoide, adenocarcinoma de pâncreas, doença periodontal, carcinoma papilar da tireoide, pustulose palmar e plan- tar, condições associadas ao exantema maculopapular, epidermólise bolho- sa, alopecia areata, esclerose múltipla, poIimiosite, dermatomiosite, doença de Behçet, pustulose exantemática generalizada aguda, vasculite, artrite ju- venil idiopática, sarcoidose, asma brônquica, rinite alérgica, rejeição a aloen- xerto renal, doença enxerto-versus-hospedeiro, rejeição a enxerto de figado, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cÍstica, glomerulonefrite, infec- ção por virus sincicial respiratório, mieloma múttiplo e células de Lange- rhans.

Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para o tratamento de qualquer condição associada ao CCR6. Consequentemente, a invenção proporciona métodos para o tra- tamento de inflamação, doença autoimune ou câncer mediante administra- ção de uma quantidade eficaz de um anticorpo ou porção da invenção a um indivíduo que precisa do mesmo.

Em algumas modalidades, o indivíduo é um paciente humano tendo ou em risco de sofrer de uma doença autoimune, um câncer e/ou inflamaçâo.

Em algumas modalidades, o anticorpo ou por- ção é administrada profilaticamente para prevenir o aparecimento ou a reca- Ída de inflamação, doença autoimune ou câncer.

Os anticorpos e porções de ligação a antígeno dos mesmos da presente invenção podem ser administrados a um indivíduo (por exemplo,

um ser humano) isoladamente ou em conjunto com outro agente em uma terapia combinada.

Os anticorpos ou porções podem ser administrados an- tes, como uma mistura com, separadamente, simultaneamente com ou após a administração do agente adicional.

Em algumas modalidades, o agente 5 adicional é selecionado do grupo incluindo, porém sem limitações: inibidores de citocinas imunoestimulatórias (por exemplo, MAb anti-TNF-a), eliminado- res de células imunes (por exemplo, anticorpos monoclonais anti-C020), bloqueadores de moléculas acessórias (por exemplo, Abatacept), agentes para doenças reumáticas (por exemplo, fármacos anti-inflamatórios não es- lO teroidais (NSAIDs), metotrexato, ácidos retinoicos e análogos de vitamina D3), imunossupressores (por exemplo, inibidores de calcineurina) e modifi- cadores de doença.

Em algumas modalidades, o agente adicíonal é selecio- nado do grupo incluindo, porém sem limitações: agentes esteroidais, agen- tes imunomoduladores, agentes somatostáticos, agentes imunoterapêuticos convencionais, citocinas ou antagonistas de citocinas e/ou fatores de cres- cimento ou antagonistas de fator de crescimento.

Em algumas modalidades, a terapia com anticorpo anti-CCL20 pode ser usada em conjunto com trata- mento de cuidados padrões para câncer, tais como cirurgia, quimioterapia ou radiação ou com outra terapia de objetivação, tal como a terapia com anti- corpo anti-VEGF.

Em algumas modalidades, a terapia com anticorpo anti- CCL20 pode ser usada em conjunto com um regime profilático.

Em uma mo- dalidade, um mimético de peptídeo sintético pode ser administrado em con- junto com um anticorpo da presente invenção.

Em uma outra modalidade, terapia hormonal pode ser administrada em conjunto com um anticorpo ou porção da presente invençâo.

Em uma modafidade, os anticorpos ou porções de Ilgação a an- tígeno da invenção são administrados isoladamènte ou em combinação com um agente anti-inflamatório.

Agentes anti-inhamatórios os quais podem ser administrados com os anticorpos da invenção incluem, porém sem Iimita- ções, corticosteroides (por exemplo, betametasona, budesonida, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona e triancinolona), fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (por exemplo,

balsalazida, celecoxib, diclofenac, diflunisal, etodolac, fenoprofeno, floctafe- nina, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, meclofenamato, ácido mefenâmico, meloxicam, nabumetona, naproxeno, olsalazina, oxapro- zina, fenilbutazona, piroxicam, salsalato, sulindac, tenoxicam, ácido tiaprofê- 5 nico e tolmetina), bem como acetaminofeno, anti-histamínicos, derivados de ácido aminoaril carboxílico, derivados de ácido arilacético, derivados de áci- do arilbutírico, ácidos arilcarboxílicos, derivados de ácido arilpropiônico, pira- zolas, pirazolonas, derivados de ácido salicílico (por exemplo, sulfasalazona e mesalazina), tiazinacarboxamidas e ácido acetamidocaproico, S- lO adenosiímetionina, ácido 3-amino-4-hidróxibutírico, amixetrina, bendazac, benzidamina, bucolome, difenpiramida, ditazol, emorfazona, guaiazuleno, nabumetona, nimesulida, orgoteina, oxaceprol, paranilina, perisoxal, pifoxi- me, procazona, proxazola e tenidap.

Agentes imunossupressores convencionais não específicos que podem ser administrados em combinação com os anticorpos da presente invenção incluem, porém sem limitações, corticosteroides, ciclosporina, ci- clofosfam ida, análogos de ciclosporina, metilprednisolona, prednisona, aza- tioprina, FK-506, 15-desoxiespergualina, natalizumab e outros agentes imu- nossupressores os quais atuam mediante supressão da função de resposta de células T.

Em algumas modalidades, os anticorpos ou porções de ligação a antígeno da invenção são administrados em combinação com agentes imu- nossupressores.

Preparados de imunossupressores que podem ser adminis- trados com os anticorpos da invenção incluem, porém sem iimitações, OR- THOCLONE" (OKT3), SANDIMMUNE'm/NEORAL"m/SANGDYA" (ciclospo- rina), PROGRAF" (tacrolimus), CELLCEPT" (mofetil), Azatioprina, glucodi- costeroides, Avonex" (interferon beta-la) e RAPAMUNE" (sirolimus). Em uma modalidade, os imunossupressores podem ser usados para prevenir rejeição a transplante de órgãos ou medula óssea.

Em algumas modalidades, os anticorpos ou porções de ligação a antígeno da invenção são administrados em combinação com um agente quimioterapêutico.

Agentes quimioterapêuticos que podem ser administrados com os anticorpos da invenção incluem, porém sem limitações, derivados de antibióticos (por exemplo, doxorrubicina, bleomicina, daunorubicina e dacti- nomicina); anti-estrogênios (por exemplo, tamoxifeno), anti-metabólitos (por exemplo, fluorouracila, 5-FU, fluoxuridina, interferon alfa-2b, ácido glutâmico, 5 pIicamicina, mercaptopurina e 6-tioguanina); agentes citotóxicos (por exem- pIo, carmustina, BCNU, lomustina, CCNU, citosina-arabinosídeo, ciclofosfa- mida, estramustina, hidróxiureia, procarbazina, mitomicina, busulfan, cispfa- tina, vincristina e sulfato), hormônios (por exemplo, medróxiprogesterona, fosfato de sódio de estramustina, etinilestradiol, estradiol, epinefrina, acetato de megestrol, metiltestosterona, difosfato de d ietilestübestrol, cIorotrianiseno e testolactona), derivados de mostarda de nitrogênio (por exemplo, mepha- Ian, clorambucila, mecloretamina (mostarda de nitrogênio) e tiotepa): este- roides e combinações (por exemplo, fosfato de sódio de betametasona) e outros (por exemplo, dicarbazina, mitotano, asparaginase, sulfato de vincris- tina, sulfato de vinblastina, rituximab e etoposídeo). Em algumas modalidades, os anticorpos ou porções de ligação a antigeno da invenção são administrados em combinação com um antagonis- ta de TNF.

Antagonistas do TNF que podem ser administrados com os anti- corpos ou porções de ligação a antígeno da invenção incluem, porém sem limitações, infliximab (REMICADE"), adalimumab (HUMIRA"), certolizu- mab pegol (CIMZIA"), Golimumab (SIMPONI"), etanercept (Enbrel"), derivados de xantina (por exemplo, pentoxifilina) e bupropiona (VVELLBUR- TIN ", Zyban"). Em algumas modalidades, os anticorpos ou porções de ligação a antígeno da invenção são administrados isoladamente ou em combinação com um ou mais preparados intravenosos de imunoglobulina.

Preparados intravenosos de imunoglobulina que podem ser administrados com os anti- corpos ou porções da invenção incluem, porém sem lim itações, GAMMAR", IVEEGAM"'1 sANDogLoBUL!N"'j GAMMAGARD S/D" e GAMIMUNEM Em algumas modalidades, os anticorpos ou porções de ligação a antígeno da invenção são administrados em combinação com preparados intraveno- sos de imunoglobulina em terapia de transplante (por exemplo, transplante de medula óssea). Em algumas modalidades, os anticorpos ou porções de Iigação a antígeno da invenção são administrados em combinação com citocinas ou antagonistas de citocinas.

Em algumas modalidades, os anticorpos ou por- 5 ções de ligação a antígeno da invenção podem ser administrados com qual- quer citocina ou um antagonista de citocina incluindo, porém sem fimitações, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, ILIO, IL12, IL13, IL15, anti-C040, CD40L, IFN-<x e TNF-a ou qualquer antagonista dos mesmos.

Em algumas modalidades, os anticorpos ou porções de ligação a antígeno da invenção podem ser admi- lO nistrados com qualquer interleucina ou antagonista de interleucina incluindo, porém sem limitações, 1L-1alfa, 1L-1beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, lL-9,IL-10,IL-11,IL-12, |L-13,1L-14,lL-15,|L-16,|L-17,|L-18,|L-19,lL-20e IL-21 ou antagonistas de qualquer um dos mesmos.

Em algumas modalidades, os anticorpos ou porções de Iigação a antígeno da invenção são administrados em combinação com uma ou mais quimiocinas ou antagonistas de quimiocina.

Em modalidades específicas, os anticorpos ou porções de Iigação a antlgeno da invenção são administrados em combinação com uma quimiocina a(CxC) selecionada do grupo que con- siste em proteína-lO induzida por interferon-gama (ylP-lO), interleucina-8 (IL- 8), fator-4 de plaquetas (PF4), proteína de ativação de neutrófilos (NAP- 2), GRO-a, gro-p, gro-õ, peptideo de ativação de neutrófilos (ENA-78), proteína quimiotática 2 de granulócitos (GCP- 2) e fator-l derivado de célu- las estromais (SDF-I ou pré-fator de estimulação de células B (PBSF)) e/ou quimiocina B(cc) selecionada do grupo que consiste em: RANTES (regulado quando de ativação, normal T expresso e secretado), proteína inflamatória de macrófagos l-alfa (MlP-la), proteína inflamatória de macrófagos lbeta (MlP-1|3), proteína-l quimiotática de monócitos (MCP-l), proteína-2 quimio- tática de monócitos (MCP-2), proteína-3 quimiotática de monócitos (MCP-3), proteína-4 quimiotática de monócitos (MCPA), proteína-l gama inflamatória de macrófagos (MlP-ly), proteína-3 alfa inflamatória de macrófagos (MlP- 3cl), proteína-3 beta inflamatória de macrófagos (MlP-3f3), proteína-4 infla- matória de macrófagos (MIPA/DC-CK-I/PARC), eotaxina, Exodus e 1-309 e/ou a quimiocina y(C) , Iinfotactina ou antagonistas de qualquer um dos mesmos.

Em afgumas modalidades, os anticorpos ou porções de ligação a antígeno da invenção são administrados com quimiocina beta-8, quimiocina 5 beta-l e/ou proteína-4 inflamatória de macrófagos ou qualquer antagonista dos mesmos.

Em uma modalidade preferida, os anticorpos ou porções de ligação a antígeno da invenção são administrados com quimiocina beta-8 ou um antagonista da mesma.

Em algumas modalidades, os anticorpos ou porções de Iigação a antígeno da invenção são administrados em combinação com um antagonis- ta de IL-4. Antagonistas de IL-4 que podem ser administrados com as com- posições de anticorpo e o anticorpo da invenção incluem, porém sem limita- ções: polipeptídeos soiúveis do receptor de IL-4, formas multiméricas de po- lipeptldeos soIúveis de receptores de IL-4, anticorpos antirreceptores de IL-4 que se ligam ao receptor de IL-4 sem transdução do sinal biológico induzida por IL-4, anticorpos anti-lL4 que bloqueiam a ligação de IL-4 a um ou mais receptores de IL-4 e muteínas de IL-4 que se Iigam ao receptor de IL-4, mas não realizam transdução do sinal bioíógico induzida por IL-4. De preferência, os anticorpos anti-lL4 empregados de acordo com este método são anticor- pos monoclonais: porções de Iigação a antigeno dos mesmos podem tam- bém ser empregadas.

Em algumas modalidades, os anticorpos ou porções de iigação a antigeno da invenção são administrados em combinação com membros da família TNF ou antagonistas dos mesmos.

Em algumas modalidades, os an- ticorpos ou porções de iigação a antigeno da invenção são administrados em combinação com agentes que incluem, porém sem limitações, formas solúveis de TNF-cz, linfotoxina-alfa (LT-alfà, também conhecida como TNF- beta), LT-beta (encontrada no heterotrímero complexo de LT-alfa2-beta), OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-1 BBL, DCR3, OX40L, TNF-gama (Publicação lnternacional N° WO 96/14328), AIM-I (Publicação lnternacional N" WO 97/33899), endocina-alfa (Publicação lntemacional N° WO 98/07880), OPG, neutrocina-alfa (Publicação Intemacional N° WO

98/18921), OX40, fator de crescimento do nervo (NGF), formas solúveis de Fas, CD30, CD27, CD40, 4-IBB, TR2 (Publicação lntemacional N° WO 96/34095), DR3 (Publicação lntemacional N" WO 97/33904), DR4 (Publica- ção Internacional N° WO 98/32856) e TR5 (Publicação Internacional N° WO 5 98/30693), TR6 (Publicação lnternacional N° WO 98/30694), TR7 (Publica- ção lnternaciona! N" WO 98/41629), TRANK, TR9 (Publicação lnternacional N° WO 98/56892), TRIO (Publicação lnternacional N° WO 98/54202), 312C2 (Publicação lntemacional N° WO 98/06842), TR12 e formas solúveis de CD70, CD154 e CD153 ou antagonistas de qualquer um dos mesmos.

Conforme usado aqui, o termo "quantidade terapeuticamente efi- caz" refere-se a uma quantidade do agente terapêutico administrada que aliviará ou prevenirá, até certo ponto, um ou mais dos sintomas da doença a ser tratada.

Uma quantidade eficaz de anticorpo anti-CCl-20 ou porção de ligação a antígeno do mesmo para o tratamento de uma doença é uma quantidade que ajuda o indivíduo tratado a atingir um ou mais endpoints cfí- nicos desejados.

Em algumas modalidades, para minimizar a imunogenicidade, um anticorpo humanizado ou porção é usada para tratar um paciente huma- no, em métodos terapêuticos e composições da presente invenção.

Em ca- sos onde administração repetida não é necessária, em algumas modalida- des, pode também ser apropriado administrar um anticorpo quimérico ou de camundongo ou uma porção da presente invenção a um paciente humano.

Em algumas modalidades, os anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos da invenção podem ser usados para tratar um indiví- duo que tenha sido previamente tratado, por exemplo, com inibidores de ci- tocinas imunoestimulatórias (por exemplo, MAbs antj-TNF-cL), eliminadores de células imunes (por exemplo, anticorpos monoclonais anti-CD20) e/ou bloqueadores de moléculas acessórias (por exempio, Abatacept). Em algu- mas modalidades, os anticorpos ou porções são usados para tratar um paci- ente que desenvolveu não responsividade primária ou um declínio gradual na taxa de resposta a estes tratamentos.

O anticorpo ou a porção de iigação a antígeno do mesmo da presente invenção pode ser administrada em uma única dose unitária ou múltiplas doses, em qualquer ponto de tempo considerado adequado por um profissional de saúde.

A dosagem pode ser determinada por meio de méto- dos conhecidos na técnica e pode depender, por exemplo, da idade, sensibi- 5 Iidade, tolerância e bem-estar geraf do individuo.

Qualquer método de admi- nistração aceito na técnica pode ser empregado adequadamente para os anticorpos e porções da invenção incluindo, mas não necessariamente limi- tado a, pàrenteral (por exemplo, injeção intravenosa, intra-arterial, intramus- cular, intratecal, intraperitoneal, subcutânea), oral (por exemplo, dietética), (ocal, tópica, por inalação (por exemplo, inalação intrabrônquica, intranasal ou oral, gotas intranasais) ou retal, dependendo da doença ou condição a ser tratada.

Em uma modalidade, o anticorpo ou a porção é administrada por via parenteral.

A formulação variará de acordo com a via de administração se- Iecionada (por exemplo, soIução, emulsão). Uma composição apropriada compreendendo o anticorpo ou porção a ser administrada pode ser prepara- da em um veículo ou carreador fisiologicamente aceitável.

A composição pode compreender múltiplas doses ou ser uma composição de dose unitária única.

Para soluções ou emulsões, veículos adequados incluem, por exem- plo, soluções, emulsões ou suspensões aquosas ou alcoólicas/aquosas, in- cluindo solução salina e meios tamponados.

Veículos parenterais podem incluir solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cIoreto de sódio, lactato de Ringer ou óleos fixos.

Veiculos irttravenosos podem incluir vários aditivos, conservantes ou fluidos, nutrientes ou repositores de eletróli- tos (vide, em geral, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17' Edição, Mack Publishing Co., PA, 1985). Para inalação, o composto pode ser solubilizado e carregado em um distribuidor adequado para administração (por exemplo, um atomizador, nebulizador ou distribuidor de aerossol pressurizado). Os regimes de dosagem podem ser ajustados para conferir a resposta ótima desejada.

Em determinadas modalidades, um único bolo po- de ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao lon- go do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica.

É especialmen- te vantajoso formular composições parenterais na forma de dosagem unitá- ria para facilidade de administração e uniformidade de dosagem.

Forma de dosagem unitária, conforme usado aqui, refere-se a unidades fisicamente 5 distintas adequadas como dosagens unitárias para os pacientes/indivíduos a serem tratados: cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em as- sociação com o veículo farmacêutico requerido.

A especificação para formas de dosagem unitárias de acordo com a invenção é, em geral, orientada e diretamente dependente (a) das características únicas do agente terapêutico e do efeito terapêutico ou profilático a ser obtido em particular; e (b) as Iimi- tações inerentes na técnica de composição de tal composto ativo para tra- tamento de sensibilidade nos individuos.

Assim, aqueles versados na técnica apreciarão, com base na descrição fornecida aqui, que a dose e regime de dosagem são ajustados de acordo com métodos bem conhecidos na técnica terapêutica. lsto é, a dose máxima tolerável pode ser facilmente estabelecida e a quantidade eficaz para conferir um benefício terapêutico detectável para um paciente podem também ser determinadas, bem como os requisitos temporais para a admi- nistração de cada agente para proporcionar um beneficio terapêutico detec- tável para o paciente.

Por conseguinte, embora determinada dose e regimes de administração são aqui exemplificados, estes exemplos de nenhum modo limitar a dose e regime de administração que pode ser fornecido a um paci- ente na prática da presente invenção.

Deverá ser notado que os valores de dosagem podem variar com o tipo e gravidade da condição a ser aliviada e podem incluir doses úni- cas ou múltiplas.

Deverá ser ainda entendido que, para qualquer ind ivíduo particular, regimes de dosagem específicos deverão ser ajustados com o tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições e que as faixas de dosagem estabelecidas aqui são exemplificativas apenas e não se destinam a limitar o âmbito ou a prática da composição reivindica-

da.

Ainda, o regime de dosagem com as composições da presente invenção pode se basear em uma variedade de fatores, incluindo o tipo de doença, a idade, peso, sexo, condição médica do paciente, gravidade da condição, via de administração e o anticorpo usado em particular.

Assim, o regime de do- 5 sagem pode variar amplamente, mas pode ser determinado rotineiramente usando métodos padrões.

Por exemplo, as doses podem ser ajustadas com base em parâmetros farmacocinéticos ou farmacodinâmicos, os quais po- dem incluir efeitos clinicos, tais como efeitos tóxicos e/ou valores laboratori- ais.

A presente invenção, assim, abrange escalonamento de dose in- lO trapaciente, çonforme determinado por aqueies versados na técnica.

Méto- dos para determinação de dosagens e regimes adequados são bem conhe- cidos na técnica relevante e serão entendidos como abrangidos por aqueles versados na técnica, uma vez equipados com os ensinamentos descritos aqui.

Em algumas modalidades, para administração a seres humanos, a dose mensal total dos anticorpos ou porção de anticorpo da invenção está na faixa de 0,5-1200 mg por paciente dependendo, é claro, do modo de ad- ministração.

Em determinadas modalidades, uma dose mensal intravenosa requer cerca de 1-1000 mg/paciente.

A dose total mensal pode ser adminis- trada em uma dose única ou dividida e pode, a critério do médiço, estar fora da faixa típica fornecida aqui.

Em determinadas modalidades, uma faixa para uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um anticorpo ou porção de anticor- po da invenção é de 1-1000 mg/kg/paciente/mês.

Em uma modalidade, o anticorpo ou porção do mesmo da invenção pode ser administrada em cerca de 1-200 ou 1-150 mg/paciente/mês.

Em determinadas modalidades, o anti- corpo ou porção do mesmo é administrada em uma quantidade de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mg/kg/paciente a cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes por mês.

Em uma modalidade particular, o anticorpo ou Porção do mesmo é administrada de 1 a 5 mg/kg/paciente cerca de 1 ou 2 vezes por mês.

Os anticorpos e as porções de ligação a antlgeno dos mesmos da presente invenção são também úteis em uma variedade de processos com aplicação em investigação e diagnóstico.

Em algumas modalidades, os anticorpos e porções são usados para detedar, isolar e/ou purificar CCL20 humano ou suas variantes (por exemplo, mediante purificação por afinidade 5 ou outros métodos adequados, tais como citometria de fluxo, por exemplo, para células em suspensão, tais como linfócitos) e para estudar a estmtura (por exemplo, conformação) e função de CCL20 humano.

Para aplicações in v/tro, nas quais a imunogenicidade do anticorpo não é uma preocupação, os anticorpos quiméricos e de camundongo e porções de ligação a antígeno dos mesmos da presente invenção serão úteis, além de anticorpos humani- zados.

Os anticorpos ou as porções de ligação a antígeno dos mesmos da presente invenção podem ser usados em aplicações diagnósticas (por exemplo, in vitro, ex vivo). Em algumas modalidades, os anticorpos humani- zados ou porções da presente invenção são usados para detectar e/ou me- dir o nível de CCL20 humano em uma amostra.

Em determinadas modalida- des, a amostra inciui, por exempio, céfutas ou tecidos que expressam CCL20 humano e/ou fluidos oorporais, tais como um exsudado inflamatório, sangue, soro e/ou fluido intestinal tendo CCL20 humano.

Uma amostra pode ser ob- tida de um indivíduo, um anticorpo ou porção do mesmo descrita aqui pode ser usada em um método imunológico adequado para detectar e/ou medir a expressão de CCL20 humano, incluindo métodos tais como citometria de fiuxo (por exemplo, para células em suspensão, tais como linfóchos), ensai- os de imunoabsorção ligados à enzima (ELISA), incluindo ensaios de quimi- luminescência, radioimunoensaio e imuno-histologia.

Em uma modalidade, um método de detecção de CCL20 huma- no em uma amostra compreende contato da amostra com um anticorpo ou porção da presente invenção sob condições adequadas para Iigação especí- fica do anticorpo ou porção de CCL20 humano e detecção de complexos de anticorpo-CCL20 que são formados.

Em .uma modaiidade, os anticorpos ou t porções descritas aqui podem ser usadas para analisar tecidos normais ver- sus tecidos inflamados (por exemplo, de um ser humano) quanto à reativida-

de e/ou expressão de CCL20 humano (por exemplo, imuno- histologicamente) para detectar associações entre um aumento da expres- são de CCL20 humano (por exemplo, em tecidos afetados) e um ou mais distúrbios selecionados de, porém sem limitações, doença de Grave, vitiligo, 5 hipertiroidismo, artrite reumatoide, psoríase, dermatite atópica, dermatite de contato, doença de Crohn, doença do intestino, doenças inflamatórias de células B, adenocarcinoma de mama, hepatite crônica, dermatite de contato, glioblastoma, carcinoma hepatocelular, infecção por papiloma vÍrus humano do cérvix, micose fungoide, adenocarcinoma de pâncreas, doença periodon- lO tal, carcinoma papilar da tireoide, pustulose palmar e plantar, condições as- sociadas ao exantema maculopapular, epidermólise bolhosa, alopecia area- ta, múltipla esclerose, polimiosite, dermatomiosite, doença de Behçet, pustu- lose exantemática generalizada aguda, vasculite, artrite juvenil idiopática, sarcoidose, asma brônquica, rinite alérgica, rejeição de aloenxerto renal, do- ença enxerto-versus-hospedeiro, rejeição a aloenxertos de fígado, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cística, glomerulonefrite, infecção por vÍrus sincicial respiratório, mieloma múltiplo, células de Langerhans ou ou- tras condições.

Assim, os anticorpos da presente invenção permitem méto- dos de avaliação imunológica quanto à presença de CCL20 humano em te- cidos normais e inflamados através dos quais a presença de uma doença, progressão de uma doença e/ou eficácia da terapia anti-CCl-20 humano no tratamento de uma doença, por exemplo, doenças inflamatórias e/ou doen- ças imunes, podem ser avaliados.

Os métodos e técnicas da presente invenção são geralmente re- alizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e conforme descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo do presente relatório descritivo, Salvo indica- ção em contrário.

Vide, por exemplo, Sambrook, j. & Russell D., Mo/ecu/ar C/oning: A Laboratoiy Manual, 3' ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York (2000); Ausubel et al., Short Protoco/s ih Mo- /ecu/ar Bio/ogy: A Compendium of Methods from Cunent Pmtoco/s in Mo/ec- u/ar Bio/ogy, Wiley, john & Sons, lnc. (2002); Harlow e Lane, Antibodies:

Using Antibodies: A Laboiatory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York (1998); e CoIigan et al., Short Proto- co/S in Protein Science, Wiley, John & Sons, lnc. (2003). Reações enzimáti- cas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especifica- . 5 ções do fabricante, conforme comumente realizado na técnica ou conforme descrito aqui.

A nomenclatura usada em relação aos procedimentos e técni- cas de laboratório, qulmica analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica descritos aqui são aqueles bem conhecidos e co- mumente usados na técnica. 10 A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente en- tendido por aqueles versados na técnica à qual a presente invenção perten- ce.

Exemplos de métodos e materiais são descritos abaixo, embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam tam- 15 bém ser usados na prática ou testagem da presente invenção.

Todas as pu- blicações e outras referências mencionadas aqui são incorporadas por refe- rência na Íntegra.

Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, inclu- indo definições, prevalecerá.

Embora uma série de documentos sejam cita- dos aqui, esta citação não constitui uma admissão de que qualquer um des- 20 tes documentos faz parte do conhecimento geral comum na técnica.

Ao lon- go do presente relatório descritivo e reivindicações, a palavra "compreende" ou variações, tais como "compreende" ou "compreendendo", deverá ser en- tendida como implicando na inclusão de um inteiro ou gmpo de inteiros indi- cado, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de in- 25 teiros . Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitativos.

De forma que a presente invenção possa ser melhor compreen- dida, os éxemplos a seguir são apresentados.

Estes exemplos são apenas para fins de ilustração e não devem ser interpretados como limitando o âmbi- 30 to da invenção de qualquer maneira.

Exempjo 1: Envolvimento de CCL20 em Doenças Autoimu- nes/lnflamatórias

Para obter evidências quanto ao envolvimento de CCL20 em doenças autoimunes e inflamatórias, foram estudados os efeitos de knocking do receptor CCR6'de CCL20 em um modelo de artrite reumatoide (Rheuma- toid Arthritis - RA) induzida por colágeno do tipo ll (CIA) em camundongos. 5 Camundongos com CCR6 do tipo silvestre, camundongos CCR6"'" (heterozi- gotos) e camundongos com knockout de CCR6"'" (homozigotos) (cada n = 10) foram imunizados na base da cauda com colágeno bovino do tipo ll (150 µg/camundongo) emulsificado em adjuvante completo de Freund (Chondrex, #7001). Três semanas depois, uma injeção de reforço com a mesma quanti- lO dade de emulsão de colágeno bovino do tipo || em adjuvante incompleto foi administrada na base da cauda. NÓs atribuímos escores à gravidade dos sintomas de artrite na pata de cada rato, conforme descrito em Griswold et al., Arthritis & Rheumatism 31 (11): 1406-1412 (1988). Resumidamente, nós atribuímos escores às lesões articulares das extremidades distais para o cotovelo ou o joelho em uma escala de 0 a 4, com base no número de articu- lações envolvidas e o grau de eritema e edema. Escores de artrite foram calculados como a soma dos escores das quatro patas de cada animal. A- nimais com CCR6 do tipo silvestre desenvolveram artrite, enquanto que a- nimais CCR6'" mostraram uma forte resistência à doença (FlG. 1). De modo interessante, animais CCR6"'" também apresentaram alguns níveis de resis- tência, o que indica que supressão totaf de função de CCL20 não é necessá- ria para neutralizar o fenótipo artrltico- .

Além disso, foram analisadas, por meio de imuno-histoquímica, as patas traseiras dos camundongos quanto à presença de células T CD3- positivas ou macrófagos F4/80-positivos. No dia 43, os camundongos foram recolhidos e suas patas traseiras foram fixadas em formalina. As patas fo- ram, então, seccionadas e colocadas sobre lâminas. Após descalcificação das amostras das patas, as lâminas foram coradas imuno- histoquimicamente com antioorpos anti-CD3 (#N1580, DAKO) e anticorpos F4/80 (CIone CI:A3-1, AbD Serotec). Um escore de intensidade de coloração foi atribuído por dois observadores independentes, realizando varredura das amostras com um instmmento Aperio (Aperio Technologies). A escala de escores foi a seguinte: 0, normal; 1, leve coloração em toda a pata ou CoIo- ração intensa em um dedo; 2, coloração moderada em múltiplos dedos; 3, coloração intensa em múltiplos dedos ou moderada em geral; 4, coloração intensa ao longo de todos os dedos e da pata.

O número de células T (FlG. . 5 2) e macrófagos (FlG. 3) que infiltraram nas lesões induzidas por CIA era fortemente reduzido em camundongos CCR6"'" e CCR6"". Foram também estudados os efeitos de knocking de CCR6 em um modelo de dermatite de contato alérgica induzida por dinitrofluorobenze- no (DNFB) em camundongos.

Dois grupos de seis camundongos cada (um 10 grupo de camundongos do tipo silvestre para CCR6 e um grupo deficiente em CCR6) foram sensibilizados escovando 25 µ1 de solução de DNFB a 0,4% (em cetona:óleo de oIiva a 4:1) no abdome rapado durante dois suces- sivos dias (dias 0 e 1). No dia 5, os camundongos foram novamente estimu- lados mediante aplicação de 20 µ1 de DNFB a 0,1% (em acetona:óleo de 15 oliva a 4:1) em um Iado de uma orelha.

Como um indicador de edema, a es- pessura da orelha foi medida antes e após estimulação com DNFB e a 24 horas após a úhima estimulação no dia 5 usando um medidor de espessura.

Camundongos deficientes de CCR6 não demonstraram quase nenhum au- mento de espessura da orelha após tratamento com DNFB, indicando a re- 20 sistência contra hipersensibilidade de contato induzida por DNFB (FlG. 4). Estes dados suportam um papel para CCR6 e CCL20 em doen- ças autoimunes/inflamatórias.

Exemplo 2: Inibição de Quimiotaxia lnduzida por CCL20 pelo MAb 2F5-5 de Hâmster Anti-CCL20 de Camundongo

. 25 Para explorar adicionalmente o papel de CCL20 como um alvo terapêutico potencial, foram realizados experimentos usando um, anticorpo " de hâmster anti-CCL20 de camundongo (2F5-5). Primeiro, nós caractehza- mos a capacidade do MAb 2F5-5 de se ligar ao CCL20 de camundongo, humano e macaco Rhesus.

Antígenos de fosfatase alcalina que secretavam 30 CCL20 solúvel (SEAP) preparados como segue.

Os cDNAs que codificam os CCL20S humano, de macaco Cynomo/gus, macaco Rhesus, rato e camun- dongo foram ampfificados e subclonados em um vetor pcDNA3.1 (+) dSall

SEAP, o qual contém CDNA de SEAP e tem seu sÍtio Sall deletado (pcDNA

3.1 (+) adquirido da lnvitrogen; CDNA de SEAP derivado de um vetor pSE- - AP-Enhancer, Clontech). Os vetores de expressão foram transfectados nas linhagens de células de rim de embrião humano HEK293EBNA (HEK293E, . 5 fnvitrogen). As célutas HEK293E foram inoculadas com DMEM (lnvitrogen) suplementado com soro bovino fetat a 10% um dia antes de transfecção. No dia da transfecção, o meio de cultura foi substituído por meio OPTI-MEM Il sem soro (lnvitrogen). Os vetores de expressão foram transfectados usando TranslT LTI (Takara Bio lnc., Shiga, japão) de acordo com o protocolo do 10 fabricante. Após 3 dias de incubação em 5°6 de CÕ2 e 37 °C, os sobrena- dantes de cultura foram coletados. A concentração de CCL20-SEAP em ca- da cultura foi medida usando o kit Great EscAPe SEAP Chemiluminescence

2.0 (Clontech). Então, foram realizados estudos de Iigação por ressonância de 15 plasmon em superfície (Biacore") para medir a ligação do MAb 2F5-5 aos antígenos CCL20-SEAP de camundongo, humano, macaco Rhesus e maca- co Cynomo/gus. Anti-SEAP (anticorpo monoclonal antifosfatase alcalina de pIacenta de camundongo, Thermo Scientific, Cat. #MAI-19354, Lote #KL12748M) foi imobilizado em sobre um Sensor Chip CM5 (GE Healthcare) 20 usando um procedimento de acoplamento padrão de amina NHS/EDC. C- CL20 de conforme marcado com SEAP (100 nM em sobrenadante, ID735, Lote #091130) foi diluido para 5 nM com TBS-P contendo Tween-20 a 0,05°6 e capturado sobre o Sensor Chip CM5. Diluições de 0,2 nM a 80 nM de anti- corpo de hâmster anti-CCL20 de camundongo (2F5-5, Lote #060215, 2 . 25 mg/ml) em TBS-P foram injetados sobre o Sensor Chip em uma taxa de flu- xo de 30 µI/min. Associação e dissociação de anticorpo de hâmster anti- CCL20 de camundongo com CCL20 de camundongo foram monitoradas du- rante 4 min e 16 min, respectivamente. A superfície do chip foi regenerada entre as injeções usando glicina a 10 mM, pH de 2,25. Sensogramas foram 30 duplamente marcados subtraindo as injeções de anticorpo de hâmster anti- CCL20 de camundongo em uma célula de referência sem CCL20 de camun- dongo capturado e uma injeção de TBS-P sobre CCL20 de camundongo capturado. Os sensogramas foram anaiisados usando um modelo de ligação de Langmuir a 1:1 em um software BlAevaluation (GE Healthcare, versão . 3.2). Neste ensaio, o MAb 2F5-5 se Iiga ao CCL20 de camundongo com uma afinidade de 32 PM, mas não se liga ao CCL20 humano, de macaco Rhesus

E 5 ou macaco Cynomo/gus (Tabela 1).

(?|):l!|':':)!'i)?j:'|)))Íj:)jy)W)")!):|Í:,i)'):))'")')))',' l Camundongo ! 9,63 i 0,474 ) 0,492 Í Ser humano ) Não detectávef ) Não detectável i Não detectável ) i Rhesus ) Não detectável : Não detectável i Não detectável Í | Cynomo/gus ! Não detectável i Nâo detectável ! Não detectável | Para testar o efeito do MAb 2F5 5 sobre a função de CCL20, nós avaliamos sua atividade de neutralização contra CCL20 de camundongo u- sando um ensaio de quimiotaxia in vitfO. Células B300.10 transduzidas com 10 CCR6 e CCL20 recombinante de camundongo (1 nM) foram adicionadas à pIacas de cultura Transwell. Quatro horas mais tarde, as células que migra- ram para a câmara inferior foram contadas por meio de Separação de Célu- las Ativada por Fluorescência (Fluorescence Activated Cell Sorting - FACS).

O MAb 2F5-5 inibiu completamente a quimiotaxia a 1 µg/ml com um valor de 15 iC50 estimado de 0,04 µg/ml (0,27 nM) (FlG. 5). Em contraste, um anticorpo de hâmster de controle (10 µg/ml) não inibiu a quimiotaxia (dados para con- trole de 100% não mostrados).

Exemplo 3: Humanização de MAbs Anti-CCL20 de Camundongo Para obter anticorpos monoclonais contra CCL20 humano, nós 20 geramos um painel de anticorpos anti-CCL20 humano de camundongo. C- CL20 humano recombinante (R&D, #360-MP-025/CF, 17,5 µg/cabeça) e- mulsificado com adjuvante completo de Freund (Mitsubishi Kagaku-Yatron, RM606-1) foi injetado por via subcutânea nas almofadas das patas de ca- mundongos. Duas injeções consecutivas foram, então, administradas a cada 25 três dias. Três dias após a imunização final, os animais foram sacrificados e as células do nóduio linfático inguinal foram fündidas com células de mielo-

ma P3U1 em uma proporção de 2:1 a 10:1 na presença de polietileno glicol a 50°6. As células foram, então, cultivadas em placas de plástico com 96 - cavidades. ELISA em sanduíche foi usado para triagem primária. Uma placa

P 5 com 96 cavidades foi revestida com um anticorpo IgG anti-humano poIiclonal (Jackson #709-005-149, 2 µg/ml em PBS (-)). Após incubação durante a noi- te a 4 °C, as cavidades foram bloqueadas com 1 x 81oc-Ace (Dainippon Su- mitomo Pharma, UK-B80) durante 1 hora em temperatura ambiente. As ca- vidades foram, então, lavadas com Tween 20 a 0,02%/PBS (-), após o que, 10 proteína químérica de Fc de CCL20 humano-higG a 1 nM em Tween 20 a 0,02%/PBS (-) foi adicionada às cavidades (50 µl/cavidade). Após uma hora de incubação em temperatura ambiente, três lavagens adicionais foram rea- lizadas conforme descrito acima. Os sobrenadantes de cultura de cada hibri- doma foram, então, diluídos duas vezes com FBS a 20°/o e 200 µg/ml de lgG 15 humana (Mitsubishi Welpharma) em Tween 20 a 0,02%/PBS (-) adicionados às cavidades e incubados durante uma hora em temperatura ambiente. Após mais três lavagens, as cavidades foram incubadas com anticorpo anti-lgG de camundongo conjugado com peroxidase de rábano (jackson #715-035-150, diluição de 5000 vezes com Tween 20 a 0,02%/PBS (-)) durante uma hora 20 em temperatura ambiente. As cavidades foram, então, lavadas três vezes e incubadas em uma soIução de TMBZ (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) durante 15-30 minutos. Um voIume igual de H2SO4 a 2 M foi, então, adicionado para cessar a reação e a densidade óptica foi lida a 450 nm pelo ARVO (Perki- nElmer). O ELISA em sanduíche identificou 24 cavidades positivas.

- 25 Então, foi reallzado um ensaio de quimiotaxia como uma triagem secundária. O ensaio de quimiotaxia foi realizado em placas de cuitura Transwell (MultiScreen, poro de 5 µm, Millipore, #MAMIC 5S1O). Primeiro, 50 µl/cavidade de CCL20 humano recombinante a 300 ng/ml (R&D, #360-MP- 025/CF) em tampão de quimiotaxia (BSA a 0,5%, FBS a 0,5%, HEPES a 20 30 mM (pH de 7,4), 2-mercaptoetanol a 50 µM em RPM!1640 (lnvitrogen)) fo- ram pré-incubados com 100 µUcavidade de sobrenadantes de cultura dos hibridomas em temperatura ambiente durante 30 minutos (para uma concen-

tração final de CCL20 de 100 ng/ml) nas cavidades inferiores das pIacas. Após 30 minutos, células B300.19 transfectadas com CCR6 humano (SEQ ID NO: 104) (2 x 10' células/75 µ1) foram aplicadas às cavidades superiores e incubadas em uma incubadora de CO2 a 5%, a 37 °C durante 4 horas. A- 5 pós a incubação, 150 µ1 das cavidades inferiores foram coIetados e fixados com 50 µ1 de PFNPBS a 4% (-). 30 µ1 de cada amostra foram apiicados ao analisador de células FACSCantoll (BD Biosciences) para contar as células que migraram. Atividade de neutralização foi encontrada em quatro cavidades. Então, foi usada diluição limitativa padrão para obter clones de hibridoma a partir das quatro cavidades positivas. NÓs confirmamos a ativi- dade de neutralização de sobrenadante de cada clone usando o ensaio de quimiotaxia in vitro. Três dos anticorpos monoclonais de camundongo anti- CCL20 humano produzidos por estes cIones (anticorpos 36F7C1O (Tabela 2), 42G5B1O (Tabela 3) e 40-1C1OB9 (Tabela 4)) demonstraram atividade de neutralização contra CCL20 humano. jabela 2: Seq,uências de AminoácidosRe Nucleotfdeos de 36F7C1O )!ÕÊ"$±R':Q*;?'f""" .FàuEN.$gè í'4m'~ "i I Sequéncia Sinalizadora de Cadeia Pe- i l sada (aminoácido) ) MRWSCIILFLVATATGVNS I (seq id no: 33) I Sequência Sinalizadora de Cadeia Leve i l (aminoácido) ! MGVPTQLLLLWLTWVVRC ! (seq id no: 34) Sequência de Aminoácido de Domínio QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFT Variável de Cadeia Pesada NYV\/MH\/V\/KQRPGQGLEWlGVlDPSDSYTTY

NQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDS (SEQ ID NO: 39) A\/YYCTRGNYGVDYAMDYWGQGTSVWSS Sequência de Aminoácido de Domínio DJQMTQSPASLSASVGETVTITCGASENIYGA Variável de Cadeia Leve LNWYQRKQGKSPQLLIYGATNLADGMSSRF

SGSGSGRQYSLKISSLHPDDVATYYCQNVLI (SEQ ID NO: 40)

TPYTFGGGTKLEIK Sequência Sinalizadora de Cadeia Pe- sada (nucleotídeo) ATgAgATggAgcTgTATcATccTcTTcng (SEQ ID NO: 45) GTAGCAACAGCTACAGGTGTCAACTCC Sequência Sinalizadora de Cadeia Leve (nucleotideo) ATGGGTGTACCCACTCAGCTCCTGTTGCTG (SEQ ID NO: 46) TggcTTAcAgTcgTAgngTcAgATgT Sequência de Nucleotídeos de Dominio cAggTccmcTgcAgcAgccTggggcTgA Variável de Cadeia Pesada GCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGA

ÈÊàÜÊNc|Às #:ezwj'^"ma (SEQID NO: 51) ""m~'-'- m

TGTCCTGCMGGCTTÓTGGCTACACCTTCA CCAACTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAG AGGCCTGGACMGGCCTTGAGTGGATCGG AGTGATTGATCCTTCTGATAGTTATACTACC TACAATCAMAGTTCAAGGGCAAGGCCACA TTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCC TACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGA GGACTCTGCGGTCTATTACTGTACMGAGG TMCTACGGAGTAGACTATGCTATGGACTA CTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCT CCTCG

GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCTTCA CTGTCTGCATCTGTGGGAG~CTGTCACC ATcAcATgTggAgcmgTgAgMTAmAc GGTGCTTT~TTGGTATCAGCGGAAACAG Sequência de Nucleotídeos de Dominio GGAAAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATGGT Variável de Cadeia Leve GCAACCMCTTGGCAGATGGCATGTCATC (SEQ ID NO: 52) GAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTAGAC

AGTATTCTCTCMGATCAGTAGCCTGCATC

CTGACGATGTTGCMCGTATTACTGTCAM ATgTgnAATTAcTccgTAcAcgncggAg

GGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA Tabela 3: Seguências de Am,i,noácidos e Nucleotídeos de 42G5B1O gEÊ^^:37'i '~m= Sequéncia Sinalizadora de Cadeia Pe- sada (aminoácido) MRWSCIILFLVATATGVNS (SEQ ID NO: 37) ' Sequência Sinalizadora de Cadeia Leve (aminoácido) MGVPTQLLLLWLTVVVVRC (SEQ ID NO: 38) Sequência de Aminoácido de Dominio QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFT Variável de Cadeia Pesada SYWMHWVKQRPGQGLEWIGLÍDPSDKYTNY

NQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDS (SEQ ID NO: 43)

AVYYCTRGNYGVDYGMDYWGQGTSVTVSS Sequência de Aminoácido de Domlnio DIQMTQSPASLSASVGETVTITCGASENIYGA Variável de Cadeia Leve LNWYQRKQGKSPQLLIYGATNLADGMSSRF

SGSGSGRQYSLKISSLHPDDVATYYCQNVLS (SEQ ID NO: 44)

TPYTFGGGTKLEIK Sequência Sinafizadora de Cadeia Pe- sada (nudeotídeo) ATGAGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTG (SEQ ID NO: 49) GTAGCAACAGCTACAGGTGTCAACTCC Sequência Sinalizadora de Cadeia Leve (nucleotídeo) ATgggTgTAcccAcTcAgcTccTgngcTg (SEQ ID NO: 50) TGGCTTACAGTCGTAGTTGTCAGATGT Sequência de NucleotÍdeos de Domínio CAGGTCCMCTGCAGCAGCCTGGGGCTGA

{§QÁ> NEàíiíÊNCÍÀ ," "t . r~~T.=' Variável de Cadeia Pesada GCTGGTGMGCCTGGGGCTTCAGTGMGA (SEQ ID NO: 55) TGTCCTGCMGGCTTCTGGCTACACCTTCA

CCAGCTACTGGATGCACTGGGTGMGCAG AGGCCTGGACMGGCCTTGAGTGGATCGG ACTGATTGATCCTTCTGATMGTATACTMC TACAATCAAAAGTTCAAGGGCMGGCCACA TTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCC TACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGA GGACTCTGCGGTCTATTACTGTACMGAGG TAACTACGGAGTAGACTATGGTATGGACTA CTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCT CCTCA GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCTTCA CTGTCTGCATCTGTGGGAGMACTGTCACC ATCACATGTGGAGCMGTGAGMTATTTAC

GGTGCTTTMATTGGTATCAGCGGAMCAG Sequência de Nucleotldeos de Domínio GGAAAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATGGT Variávef de Cadeia Leve GCAACCAACTTGGCAGATGGCATGTCATC (SEQ ID NO: 56) GAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTAGAC

AGTATTCTCTCMGATCAGTAGCCTGCATC CTGACGATGTTGCAACGTATTACTGTC |

ATGTGTTAAGTACTCCGTACACGTTCGGAG

GGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA Tabela 4: Sequências de Aminoácidos e Nu,cleotídeos de 40-1C1OB9 ré'Ê_w®is*p&LwáHÊ'" Sequência Sinalizadora de Cadeia Pesada I (aminoácido) I MEWSWVFLFLLSVIAGVQS (SEQ ID NO: 35) Sequência Sinalizadora de Cadeia Leve I (aminoácido) l MGVPTQLLLLWLTVWVRC (SEQ ID NO: 36)

QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYT Sequência de Aminoácido de Domínio Va- FTDYEMHWVKQTPVHGLEWIGAIDPETTS riável de Cadeia Pesada TAYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSL (SEQ ID NO: 41) TSEDSAVYYCTKCYYGSADYAMDYWGQ

GTSVTVSS Sequência de Aminoácido de Domin io Va- DJQMTQSPASLSASVGETVTITCGASENIY riável de Cadeia Leve GALNWYQRKQGKSPQLLIYGATNLADGM

SSRFSGSGSGRQYSLKISSLHPDDVATYY (SEQ ID NO: 42)

CQNVLSTPWTFGGGTKLEIK Sequência Sinalizadora de Cadeia Pesada ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCC (nucleotldeo) TCCTGTCAGTAATTGCAGGTGTCCAATC (SEQ ÍD NO: 47) C Sequência Sinalizadora de Cadeia Leve ATgggTgTAcccAcTcAgcTccTgng

CTGTGGCTTACAGTCGTAGTTGTCAGAT (nucleotldeo)

GT mlESeRFÃò , =.7^.=rsÊ:aÜ€N'g%7"*«; ü (SEQ ID NO: 48)

CAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCT GAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTG ACGCTGTCCTGCMGGCTTCGGGCTAC ACATTTACTGACTATGAAATGCACTGGG

TGMGCAGACACCTGTGCATGGCCTGG Sequência de NUc]eotídeQs de Domínio MTGGATTGGAGCTATTGATCCTGAMC Variável de Cadeia Pesada TAcTAgTAcTgccTAcMTcAgMgnc

AAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGAC (SEQ ID NO: 53)

AAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAG CTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCT GCCGTCTATTACTGTACCAAATGTTACT ACGGTAGCGCGGACTATGCTATGGACT ACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCG TCTCCTCA GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCTT CACTGTCTGCATCTGTGGGAGMACTGT CACCATCACATGTGGAGCAAGTGAGAA

TATTTACGGTGCTTTMATTGGTATCAG Sequência de Nucleotldeos de Domínio CGGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTC Variável de Cadeia Leve CTGATCTATGGTGCAACCMCTTGGCAG

ATGGCATGTCATCGAGGTTCAGTGGCA (SEQ ID NO: 54)

GTGGATCTGGTAGACAGTATTCTCTCAA GATCAGTAGCCTGCATCCTGACGATGTT GCAACGTATTACTGTCAAAATGTGTTAA GTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCA

CCAAGCTGGAAATCAAA O anticorpos 36F7C1O, 42G5B1O e 40-1C1OB9 de camundon- go foram, então, usados para produzir cadeias pesada e leve de anticorpo humanizadas. O método de humanização envolveu enxertia de regiões de determinação de complementaridade (CDRS) de camundongo, conforme 5 identificado por meio dos métodos de definição de Kabat e/ou Chothia de acordo com a numeração de Kabat, nas sequências de Iinhagem germinati- . va de cadeias pesada e leve humanas que representam as melhores combi- . nações de framework com as sequências originais de camundongo das quais as CDRS foram obtidas (FlGs. 6A-C; negrito denota resíduos que dife- lO rem entre o anticorpo de camundongo e a sequência de linhagem germinati- va humana; sublinhado e negrito denota CDRS de camundongo enxertadas: , resíduos cor- itálico e negrito denota reslduos de framewoik substituídos por respondentes de anticorpos de camundongo; e sublinhado, itálico e negrito denota residuos de CDR substituídos por resíduos correspondentes de li- nhagens germinativas humanas). Combinações de framewoík foram identifi- cadas usando o banco de dados lg8last, de acordo com os métodos descri- tos em Altschul et al., Nucl.

Acids Res. 25: 3389-3402 (1997). Para derivar 5 versões de cadeia humanizada alternativas, nós usamos dois métodos: 1) técnicas de modelamento 3D para prever residuos de murino críticas dentro da framewotk que interagem com os resíduos de CDR; e 2) alinhamentos de sequência para identificar residuos de murino imediatamente adjacentes às sequências de CDR canônicas. 10 As sequências humanizadas foram construídas em vetores de expressão e transfectadas para linhagens de células de mamlfero (por e- xemplo, células HEK293E (Invitrogen)) para produção de anticorpos.

Anti- corpos obtidos por meio deste processo foram, então, caracterizados em ensaios funcionais e fisico-quhnicos. 15 Exemplo 4: Ensaios de Quimiotaxia m Vitm que Demons- tram a Atividade de Neutralização de Abs Humanizados Anti-CCL20 Humano Foram identificados anticorpos humanizados que neutralizam a- tivamente o ligante CCL20 humano realizando ensaios de quimiotaxia in vitro 20 usando células B300.19 transduzidas com CCL20. Quando de determinação dos valores de |C50, |C90 e |C95 (FlGs. 7A-C), anticorpos que demonstram um valor reduzido na tabela de |C95 foram considerados como tendo atividade de neutralização significativa (FIG. 7C). Das 14 cadeias pesadas humaniza- das e 26 cadeias leves humanizadas produzidas, nós testamos 41 combina-

. 25 ções.

Foi mostrado que oito destas combinações neutralizam signihcativa- mente a quimiotaxia.

Estes oito anticorpos humanizados são listados abaixo: · 36LK3/36HKK3 · 36LK3/42HKK1 · 36LK3/42HKK2 30 · 36LK3/42HKK3 · 36LK3/36HC2 · 36LK3/36HC3

· 36LC3/36HKK3 · 36LC3/36HC2 As sequências de aminoácidos e nucleotídeos das cadeias pe- sada humanizadas HC2, HC3, 36HKK3, 42HKK1, 42HKK2 e 42HKK3 e das cadeias leves humanizadas LC3 e LK3 são mostradas nas Tabelas 5-12. As sequências de aminoácidos codificadas pelos genes de linhagem germinati- va humanas usadas por estas cadeias leves e pesadas são mostradas na Tabela 13. Tabela 5: Sequências de Aminoácidos e Nucleotldeos da Cadeia Pesada de Anticorpo Anti-CCL20 Human? Humanizado '° T?'.(3"':' .m'TÈ'·g|t"ee"^Í.7è"ííb=Km.?aU Ç'L, Í:?:ié w u~ . vgv^ <i· Tt ã mG,,':> " _ g]=Yw?&m ,.w¶uència sinai ." f Mada,}{ído!gÍi kn(okvGF ei uj: rito) . " "u:: . . r~ , ç, MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAE l

VKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWV I RQAPGQGLEWMGVIDPSDSYTWAQKF ! QGRVTMTVDTSTSWYMELSSLRSEDTA l

VYYCARGNYGVDYAMDYWGQGTLVTVS I SASTKGPSVFP4PSSKSTSGGTMLGCL I VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV ! Sequência de aminoácido de cadeia pesa- LQssgLYsLssvvTvpsssLgTQmcNv I da com a sequència sinalizadora NHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCP j (SEQIDNO:I) APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT !

CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK I TKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNG I

KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP I QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS ! DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS i

FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA I

LHNHYTQKSLSLSPGK QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY ) TFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGVIDPS l

DSYTTYAQKFQGRVTMTVDTSTSTVYME I LSSLRSEDTAVYYCARGNYGVDYAMDY |

WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS I Sequência de aminoácido de cadeia pesa- TSGGTAALGCL~YFPEPVTVSWNSGA ! da sem a sequência sinalizadora LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS I (SEQ ID NO: 108) SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC i

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD I TLMISRTPEVTC\NVDVSHEDPEVKFNWY ! VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVL i TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT | ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV i

':!V' - """""=""'m'"'7%:L©3)'Ê#iÜK"~~~ '?E¢ki)¢tiifR""4':re¥4f:'j.4H'iF-" jy' irqyiiàaêsiRa|iiádora,,sublin,íMáµdóàr .- . ... . -. Pà!*ri,m=L:!-¥t:j: "'"):""g* * "Y'i,).L-')'::..,,.,):"') i@eÊ'),:"gks'-'i"íÈy+.:z-m

I SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY I KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ

I GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK l QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY Sequência de aminoácido de dominio vari- i TFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGWDPS ável de cadeia pesada i D$YTTYAQKFQGRVTMTV- (SEQ ID NO: 9) I DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGN

I YGVDYAMDYWGQGTLVTVSS ATGGGCTGGTCCTGCATCATTCTGTTCC TGGTGGCCACTGCTACCGGAGTGCACA GCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGG GCTGAGGTGAAGAAACCCGGTGCAAG TGTGAAGGTGTCATGTAAAGCATCCGG CTATACATTCACTAACTACTGGATGCAT TGGGTGAGGCAGGCTCCAGGACAGGG ACTGGAATGGATGGGCGTGATCGACC CTTCAGATTCCTACACCACATATGCCC AGAAGTTTCAGGGCAGGGTGACCATG ACAGTGGACACTAGCACCTCTACAGTG TACATGGAGCTGTCCAGCCTGAGAAGT GAAGATACAGCAGTGTACTATTGCGCC

CGCGGCAATTACGGAGTGGACTATGCC ATggAnAcTgggggcAgggTAcTcTg

GTGACCGTGTCTAGTGCTTCTACCAAG

GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCC Sequência de mcleotídeos de cadeia pe- TCCTCCMGAGCACCTCTGGGGGCACA sada com a sequência sinalizadora GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGA (SEQ ID NO: 17) CTACTTCCCCGMCCGGTGACGGTGTC

GTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACA GTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAG CGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTT GGGCACCCAGACCTACATCTGCMCGT GAATCACAAGCCCAGCAACACCMGGT GGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTG TGACAAAACTCACACATGCCCACCGTG CCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACC GTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCC AAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGAC GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG TTCMCTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGG GAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCAC

..

. .Z'.:. '"·'S-' ' " j'KÁÊi,):j'|i'àj))j'):!)'h·FÁF .7 .C A?.., .: 7 ' cµo :" " .r · ." · } , #&' =. " " , & ,« , : ;í= , :á. ' -

CAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC AAGTGCAAGGTCTCCMCAAAGCCCTC CCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC AAAGCCMAGGGCAGCCCCGAGAACCA CAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGG GAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGC CTGACCTGCCTGGTCAAA- GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTG GAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGA GAACAACTACMGACCACGCCTCCCGT GCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAG CAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTC ATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCA CAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC CCTGTCTCCCGGGAAATGA CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGC TGAGGTGAAGAAACCCGGTGCAAGTG TGAAGGTGTCATGTAAAGCATCCGGCT ATACATTCACTAACTACTGGATGCATTG GGTGAGGCAGGCTCCAGGACAGGGAC TGGAATGGATGGGCGTGATCGACCCTT CAGATTCCTACACCACATATGCCCAGA AGTTTCAGGGCAGGGTGACCATGACA GTGGACACTAGCACCTCTACAGTGTAC ATGGAGCTGTCCAGCCTGAGAAGTGAA GATACAGCAGTGTACTATTGCGCCCGC GGCAATTACGGAGTGGACTATGCCATG GATTACTGGGGGCAGGGTACTCTGGTG

ACCGTGTCTAGTGCTTCTACCAAGGGC Sequéncia de nudeotídeos de cadeia pe- CCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCC sada sem a sequência sinalizadora

TCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCG (SEQ ID NO: 109) GCCCTGGGCTGCCTGGTCMGGACTAC

TTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG MCTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTG CACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCT CAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGG

TGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCA cccAgAccTAcATcTgcAAcgTgmTcA

CAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAA GAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAA ACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCA CCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTC TTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACA CCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG TCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC

:óÈsjÁi"(Ád')4':zí""))),'::":j1':"jj'íj'))':T"à2yitK·,!':j,' ;...'.* -· ,· ·' "c"K -'"1·" í0A-7",í"':"" I .' ., j-à'" ;..:7'-·'3:%Z.· e#""" : ,-'jS-. -· ".."t -,'"""j?í:"" "),j.'::- ,. µ. ' ""' |.ni9,¥ariáYél.:€q,9¥%n-t¢) '"" ' .;,j;' -' -.f§ l ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACT

I GGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATA

I ATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC i AGTACMCAGCACGTACCGTGTGGTCA

I GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACT | GGCTGAATGGCAAGGAGTACMGTGCA l AGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCC I ccatcgagaaaaccatctccaaagccaa I agggcagccccgagaaccacaggtgta ! caccctgcccccatcccgggaggagat I gaccaagaaccaggtcagcctgacctg I cctggtcaaaggcttctatcccagcga ) catcgccgtggagtgggagagcaatgg i gcagccggagaacaactacaagaccac I gcctcccgtgctggactccgacggctc I cttcttcctctatagcaagctcaccgtg ! gacaagagcaggtggcagcaggggaa l cgtcttctcatgctccgt- l gatgcatgaggctctgcacmccacta I cacgcagaa- l gagcctctccctgtctcccgggaaat- l ga

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGC TGAGGTGAAGAAACCCGGTGCAAGTG

TGAAGGTGTCATGTAAAGCATCCGGCT ATAcAncAcTAAcTAcTggATgcATTg

GGTGAGGCAGGCTCCAGGACAGGGAC Sequência de nucleotldeos de domínio TGGMTGGATGGGCGTGATCGACCCTT variável de cadeia pesada cAgAnccTAcAccAcATATgcccAgA

AGTTTCAGGGCAGGGTGACCATGACA (SEQ ID NO: 25)

GTGGACACTAGCACCTCTACAGTGTAC ATGGAGCTGTCCAGCCTGAGAAGTGAA GATACAGCAGTGTACTATTGCGCCCGC GGCAATTACGGAGTGGACTATGCCATG GATTACTGGGGGCAGGGTACTCTGGTG

ACCGTGTCTAGT Tabela 6: Sequências de Aminoácidos e Nucleotideos da Cadeia Pesada 36HC3 ("HC3") de Anticorpo Anti-CCl-20 Humano Humanizado "s'-y- ""'";'*Ê"µ" ji- - SEQÜÊNC"IÊ"' "Ê" :"'""' '-y4""i · 7'. " :,.., ¥ tw- »"".'jTt! '. ' " "=. J 4 ' ' . . ,.. m.

."DESCRIçÃO '" ,, À " -J:@zj" :zí ($eqúèÁàá si=ra subIinKàda, do"àli1 :i á Uí)ijÁ:±í" ~2=4-k n'ó \i6)i$QgeS"i%i"í) àgí'á@. 'àt,t·:-i Sequência de aminoácido de cadeia pesa- MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAE | da vKKpgAsvKyscKAsgYTFTNYwMHwv ! (SEQ ID NO: 2) KQAPGQGLEWGVIDPSDSYTTYNQKFK |

[J!êr|t:j"|Í)"=))jfi,)),|ljFj)=ig4¢ |gkatmtrdtststvymelsslrsedtav Iyyctrgnygvdyamdywgqgtsvtvss |astkgpsvfplapsskstsggtmlgclv ) kdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavl jQssgLYsLssvvTvpsssLgTQTYIcNvN |hkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpa ] pellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtc |\/vvdvshedpevkfnwyvdgvevhnakt |kpreeqynstyrwsvltvlhqdwlngk lEYKcKvsNKALpAp|EKT|sKAKgQpREp |qvytlppsreemtknqvsltclvkgfyps ! diavewesngqpennykttppvldsdgs i fflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhea I lhnhytqkslslspgk |qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgy SeqUènciadeaminoácidodedQmÍniovaR-!TFTNYWMQApgQGL4gVlDpS áveldecadeiapesada I DSYTTYNQKFKGKATMTR- (seqidno:1o) |dtststvymelsslrsedtavyyctrgn jYGVDYAMDYWGQGTSVTVSS )atgggctggtcctgcatçattctgttcc

|tggtggcaactgccaccggagtgçaca |gccaggtgcagctggtgcagtctggg I gctgaggtgaagaaacccggtgcaag tgtgaaagtgtcatgcaaggcatccgg ctatacattcactaactactggatgcat tgggtgaagcaggcaccaggacaggg actggaatggatcggcgtgatcgaccc ttcagattcctacaccacatataatcag aagtttaaaggcaaggctaccatgaca agggacactagcacctctacagtgtac

Sequência de nuclmtídeos de cadeia. pe- atggagctgtccagcctgaggtccgaa sada GATACAGCCGTGTACTATTGCACTCGG ggcaactacggagtggactatgctatg (seqidno:18) gattactgggggcagggtactagtgtg accgtgtctagtgcatctaccaagggc ccatcggtcttccccctggcaccctcc tccmgagcacctctgggggcacagcg gcccTgggcTgccTggTcmggAcTAc ttccccgaaccggtgacggtgtcgtgg mctcaggcgccctgaccagcggcgtg cacaccttcccggctgtcctacagtcct caGgactctactccctcagcagcgtgg tgaccgtgccctccagcagcttgggca cccagacctacatctgca- acgtgmtcacaagcccagcmcacca j?+ " _' : t$EQÚÊNejA. ' :'. ;" y ? )iwZLiµÀ"g"' )'Íe'·' :· i'.L""|?g'?::":,:.-j#Ê U) Y Á'")):2tgi%":á:-:'g¢'|"|h?"KE:'ú·""' '¶"'"i" ' 4lm i: .- ' Du·;, -.-

AGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAAT CTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACC GTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGG ACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAA CCCMGGACACCCTCATGATCTCCCGG ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTG GACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCATAATGCCMGACAMGCCG CGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG CACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAG TACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCC CTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATC TCCAMGCCMAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC CGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAAC TACMGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTC- CTCTATAGCMGCTCACCGTGGACMG AGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTG CACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCCCGGGAAATGA CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGC TGAGGTGAAGAAACCCGGTGCMGTG TGAAAGTGTCATGCAAGGCATCCGGCT ATACATTCACTAACTACTGGATGCATTG GGTGAAGCAGGCACCAGGACAGGGAC

TGGMTGGATCGGCGTGATCGACCCTT Sequência de nucleotideos de domínio

CAGATTCCTACACCACATATAATCAGA variável de cadeia pesada

AGTTTAAAGGCAAGGCTACCATGACAA (SEQ JD NO: 26) GGGACACTAGCACCTCTACAGTGTACA

TGGAGCTGTCCAGCCTGAGGTCCGAA GATACAGCCGTGTACTATTGCACTCGG GGCAACTACGGAGTGGACTATGCTATG GATTACTGGGGGCAGGGTACTAGTGTG ACCGTGTCTAGT

Tabela 7: Sequências de Aminoácidos e Nucleotídeos da Ca- deia Pesada 36HKK3 de Anticorpo Anti-CCL20 Humano Humanizado . ' k ' ' '"-· " - ') êSÊ®U"ÊNc|A" ' ' '-- r· * ' ' ' ""' '""I ""'I F íDESCR|ÇÃ0 . " " i&Míà3áIi=doraisublinhada, domínÍo,van%( """ "' "' · + : , "'::k ¥'" iiá=egmój "'""' """ %"'i ' 3 .r..^—— ~-. " í ':í'M MDmwRILFLvAAATgAHsQvQLvQsgAEvKK I pgAsvKvscKAsgYTnNYwMHwvRQApgQ I

GLEWNIGVIDPSDSYTTYNQKFKGKATLWDTS I TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRGNYGVDYAM ) DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS )

GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH I Sequência de aminoácido de cadeia TFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQWICNV ) pesada NHKPSNTWDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL I (SEQ ID NO: 3) GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH I

EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY I RWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE I KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT I CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD I SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA )

LHNHYTQKSLSLSPGK QVQLVQSGAEVKKPGASV- Sequência de aminoácido de domí- KVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWM ) nio variável de cadeia pesada GVIDPSDSYTTYNQKFKG- (SEQID NO: 11) KATLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRG I

NYGVDYAMDYWGQGTLVTVSS ATGGAÇTGGACATGGAGAATCCTGTTCCTGGT GGCCGCTGCAACCGGAGCACACAGCCAGGT GCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAA GAMCCCGGTGCTAGTGTGAAAGTGTCATGC AAGGCCTCCGGGTATACTTTCACCAACTACT GGATGCATTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGAC AGGGACTGGAATGGATGGGCGTGATTGACC CTTCAGATTCCTACACCACATATAATCAGAA GTTTAAAGGAAAGGCAACACTGACTGTGGAC

ACCAGCACATCTACTGCCTACATGGAGCTGT Sequência de nucleotÍdeos d" "" CCAGCCTGAGGTCCGMGATACTGCCGTGTA deia pesada

CTATTGTACCCGGGGCAACTACGGAGTGGAC (SEQ ID NO: 19)

TATGCAATGGATTACTGGGGGCAGGGTACCC

TGGTGACAGTGTCTAGTGCTAGCACCAAGGG cccATcggTci"rcccccTggcAcccTccTcc

AAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTG GGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGMC CGGTGACGGTGTCGTGGMCTCAGGCGCCCT GACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAG CGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGC ACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACM

1|));S))j)),))))f,'a)j)'ji)'11i:j'j'4ij?)j)-|,)g")|,)l)):í')

I GCCCAGCAACACCMGGTGGACAAGAGAGTT I l GAGCCCAAATCTTGTGACCTCACACATG ! i CCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGG ! i GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCCC ! | CMGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCT I

I GAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC I I ACGMGACCCTGAGGTCMGTTCAACTGGTA I I CGTGGACGGCGTGGAGGTGCATMTGCCMG I I ACAMGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA I I CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCT I

I GCACCAGGACTGGCTGMTGGCMGGAGTAC I I mgTgcMggTcTccAAc~gcccTcccAg : I CCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAMGCCAM i , I GGGCAGCCCCGAGMCCACAGGTGTACACCC l I TGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAA l I CCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC l I TTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGG i

I AGAGCAATGGGCAGCCGGAGMCAACTACAA I I GACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGC |

I TCCTTCTTCCTCTATAGCMGCTCACCGTGGA I CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC I TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAA CCACTACACGCAGMGAGCCTCTCCCTGTCT CCGGGTAAATGA CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAG

GTGMGAAACCCGGTGCTAGTGTGAMGTGT cATgcAAggccTccgggTATAcnTcAccAA

CTACTGGATGCATTGGGTGAGGCAGGCTCCA Sequência de nucleotídeos de dom'" . GGACAGGGACTGGAATGGATGGGCGTGATT

GACCCTTCAGATTCCTACACCACATATMTC nio variável de cadeia pesada AgAAgnTAMggAAAggcAAcAcTgAcTgT (SEQ ID NO: 27) GGACACCAGCACATCTACTGCCTACATGGAG

CTGTCCAGCCTGAGGTCCGAAGATACTGCCG TGTACTATTGTACCCGGGGCAACTACGGAGT GGACTATGCMTGGATTACTGGGGGCAGGG

TACCCTGGTGACAGTGTCTAGT Tabela 8: Sequências de Aminoácidos e Nucleotídeos da Ca- deia Pesada 42HKK1 de Anticorpo Anti-CCL20 Humano Humanizado l|)l)') )-)))")'j)'l")"l|))íjZ'(':j¶:))j)|))h)¢')1j)))í Sequência de aminoácido de cadeia I MDmwR|LFLvAAATgAHsQvQLvQsgAEvKK pesada I PGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQG (SEQ ID NO: 4) I LEWMGLIDPSDKYTNYNQKFKGRVTMTRDTSTS t iá:m:"'L. '"l.":Í'·'" "SÈáÚÊNc|A" j"" "":"'" '"'-"3r^*" aZ·á ""1",a' '72%'!Y;.'!rK!4L'íg'4"-.s?|%",E-'t""j":qi')A!i ='"""'1ti=in- 'lvi" wymelSSlrSedtavyycargnygvdyÓMDy wgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggt mlgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpa vlqssglyslsspssslgtqtyicnvnhkp sntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggps vflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpev kfn\mndgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvl tvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskak gqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfy psdiavewesngqpennykttppvldsdgsffl yskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytq kslslspgk qvqlvqsgaevkkpgasv- Sequència de aminoácido de domí- kvsckasgytftsyvvmhwvrqapgqglewmg nio variável de cadeia pesada lidpsdkytnynqkfkgrvtmtrdtstswyme (SEQ ID NO: 12) lsslrsedtavyycargnygvdygmdywgqg- nvwss ATGGACTGGACCTGGC~TCCTGTTCCTGGT

GGÇÇGÇTGÇAAÇAGGAGCACACTCACAGGTG CAGCTGGTGCAGTCCGGGGCAGAGGTGAAGA AACCCGGTGCCAGCGTGMGGTGTCTTGCAA AGCTAGTGGCTATACCTTCACAAGCTACTGGA TGCATTGGGTGCGGCAGGCACCAGGACAGGG ACTGGMTGGATGGGCCTGATTGACCCTTCTG ATMGTACACTMCTACMCCAGAAGTTTAAA GGAAGGGTGACTATGACCCGGGACACATCAA CTTCCACCGTGTACATGGAGCTGTCCAGCCTG AGATCCGAAGATACCGCCGTGTACTATTGTGC

TCGCGGCAACTACGGAGTGGACTATGGCATG d, m, GATTACTGGGGGCAGGGTACACTGGTGACCG Sequência de nucleotídeos

TGTCCAGTGCTAGCACCMGGGCCCATCGGTC deia pesada

TTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTC (SEQ ID NO: 20)

TGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTC AAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTC GTGGMCTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTG CACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGG ACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGC

CCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATC TgcAAcgTgAATcAcMgcccAgcAAcAccm

GGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTG ACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCA CCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCT CTTCCCCCCMAACCCMGGACACCCTCATGA

TCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTG gTggAcgTgAgccAcgmgAcccTgAggTcA

)?i'(@iáÁ)íji'"ig.ÍÁy:'jíAàj)j":,j),'gj,)")z):)-',j:3'k9jYÁ:",:'?)')'i'i'á'á":jÊ;'jj:::i) )"jom",:iov.Áá-.

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I GCATAATGCCMGACMAGCCGCGGGAGGAG I CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGT ! CCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGMTG ] GCMGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCMCAAA

I GCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAMACCATCTC I C~GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG

I GTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGAT l GACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGG ) TC~GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTG

I GAGTGGGAGAGCMTGGGCAGCCGGAGAACA I ACTACMGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC

I GACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCMGCTCAC ! CGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGMC ) GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT i GCACMCCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC

I TGTCTCCGGGTAMTGA I CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGGGCAGAG I GTGMGAAACCCGGTGCCAGCGTGAAGGTGT I CTTGCMAGCTAGTGGCTATACCTTCACAAGC

I TACTGGATGCATTGGGTGCGGCAGGCACCAG I Sequência de nucleotideos de domi- GACAGGGACTGGAATGGATGGGCCTGATTGA

CCCTTCTGATAAGTACACTAACTACMCCAGA nio variável de cadeia pesad" AgnTAAAggAAgggTgAcTATgAcccgggA (SEQ ID NO: 28) CACATCAACTTCCACCGTGTACATGGAGCTGT

CCAGCCTGAGATCCGAAGATACCGCCGTGTA CTATTGTGCTCGCGGCAACTACGGAGTGGAC TATGGCATGGATTACTGGGGGCAGGGTACAC

TGGTGACCGTGTCCAGT Tabela 9: Sequências de Aminoácidos e Nucleotídeos da Ca- deia Pesada 42HKK2 de Anticorpo Antí-CCl-20 Humano Humanizado "'pjjç :'""" """ ,)'"""'")))())))))jjmÂ7;:#i")"-""',)È' m')lf!Á)'i'n')a:a. do-ínbj i MD\NT\NRILFLVAAATGAHSQVQLVQSGAEVK l

I KPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPG I

I QGLEWMGLIDPSDKYTNYNQKFKGRVTLTVD I Sequência de aminoácido de cadeia ! TSTSWYMELSSLRSEDTAVYYCTRGNYGVDY I i GMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK ! pesada ') STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS l (SEQ ID NO: 5) i GVHTFPAVLQSSGLYSLSSWMPSSSLGTQTY I

I ICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCP I I APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCW ] I VDVSHEDPEVKFNWWDGVEVHNAKTKPREE I

)|>,]ji:'níi'j'í):)':7)daj)[]:,') )):íÁnj 1qynstyrwsvlwlhqdwlngkeykckvsnk"

)alpapektiskakgqprepqvytlppsreemt l knqvsltclvkgfypsdiavewesngqpenny |kttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvf |scsvmhealhnhytqkslslspgk jQvQLvQsgAEvKKpgAsv-

Sequência de aminoácido de domi- iKvscKAsgYTFTsYwMHwvRQApgQgL~ nio variável de cadeia pesada |glidp$dkytnynqkfkg-

(SEQ ID NO: 13) |rvtlwdtststvymelsslrsedtavyyctr |gnygvdygmdywgqgtlvtvss )atggactggacttggaggatcctgttcctgg

|tggccgctgcaaccggagctcactcacagg |tgcagctggtgcagtccggagcagaggtga |agaaacccggtgcctccgtgaaggtgtctt |gcaaagcaagtggctataccttcacaagct jAcTggATgcATTgggTgAgAcAggcAccAg |gacagggactggaatggatgggcctgattg |acccttctgataagtacaccaactacaacca |gaagtttaaaggacgcgtgactctgaccgt Iggacacatcaacttccaccgtgtacatgga gctgtccagcctgaggtccgaagataccgc agtgtactattgtacacggggcaactacgg agtggactatggcatggattactgggggca gggtacactggtgaccgtgtccagtgctag caccmgggcccatcggtcttccccctggca ccctcctccaagagcacctctgggggcaca Sequência de mcleotldeos de ca- gcggccctgggctgcctggtcmggactac deia pesada ttccccgaaccggtgacggtgtcgtggmct

(SEQ ID NO: 21) caggcgccctgaccagcggcgtgcacacct tcccggctgtcctacagtcctcaggactcta ctccctcagcagcgtggtgaccgtgccctc cagcagcttgggcacccagacctacatctgc aacgtgmtcacaagcccagcmcaccaagg tggacaagagagttgagcccaaatcttgtga cctcacacatgcccaccgtgcccagca cctgaactcctggggggaccgtcagtcttcc tcttcccccccccmggacaccctcat gatctcccggacccctgaggtcacatgcgtg gtggtggacgtgagccacgmgaccctgag gtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgg aggtgcatmtgccaagacaaagccgcggg aggagcagtacmcagcacgtaccgtgtggt cagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactg gcTgAATggcmggAgTAcAAgTgcAAggTc tccaacaaagccctcccagcccccatcgaga

)jl(4tí)'Fjt)))))j)'j)))))),))j:-E"v'.)í)'?6¢i-')j'"|)!Í)n)')Ê)":4j4)

I MACCATCTCCAAAGCCMAGGGCAGCCCCG ! AGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC

I CGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGC I CTGACCTGCCTGGTC~GGCTTCTATCCCA

I GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG

I GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGC ) CTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT l CCTCTATAGCMGCTCACCGTGGACMGAGC

I AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCT I CCGTGATGCATGAGGCTCTGCACMCCACTA I CACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT I AAATGA CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCAGAG GTGAAGAAACCCGGTGCCTCCGTGAAGGTG TCTTGCAAAGCAAGTGGCTATACCTTCACAA

GCTACTGGATGCATTGGGTGAGACAGGCAC do- CAGGACAGGGACTGGAATGGATGGGCCTGA Sequência de nucleotideos de minio variáàei de cadeia pesada TTGACCCTTCTGATAAGTACACCAACTACAA

CCAGAAGTTTAAAGGACGCGTGACTCTGAC (SEQ ID NO: 29)

CGTGGACACATCAACTTCCACCGTGTACATG GAGCTGTCCAGCCTGAGGTCCGAAGATACC GCAGTGTACTATTGTACACGGGGCAACTAC GGAGTGGACTATGGCATGGATTACTGGGGG

CAGGGTACACTGGTGACCGTGTCCAGT Tabela 10: Sequências de Aminoácidos e Nudeotídeos da Ca- deia Pesada 42HKK3 de Antico o Anti-CCL20 Humano Humanizado I' ' ""' ' 5: ·· SEQUÊNÜA' "J ·'M "m· ·'"""" :""=á4 ' " ' . '¥ """ "zá;jj ·.' '1 "'" -· · ·'""ax · '=W ' í"jQ i" ' ('équência sinalizadora sU9!hh,?d" tomjnQ]y& ' 'gi ·: .: ável em n®rito) -' Ái .iii '"iW:'.- yQ

MDILFLVAAATGAHSQVQLVQSGAEVKK PGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQ GLEWMGLIDPSDKYTNYNQKFKGKATLWDTS TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRGNYGVDYGM DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS

GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH I Sequência de aminoácido de ca- TFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNV ! deia pesada NHKPSNTMDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL ) (SEQ ID NO: 6) GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSH

EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSW RWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA

LHNHYTQKSLSLSPGK rÊáÜÊNg'rÀ. '" "" g fi (=Uênciasina|izadorasubljnhada, dominioYan,:)' qE'#"u' 2|AyT"|¥=neg-©.pj&..,:'Fi-h " :' ""' " " ".r'- jQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSY Sequência de aminoácido de do- |wmhwvrqapgqglewmgl- minio variável de cadeia pesada |idpsdkytnynqkfkgkatlwdtststaymel (SEQ ID NO: 14) jssLRsEDTAvYYcTRgNYgvDYgMDYwgQg- |tlvtvss |atggactggacttggagmtcctgttcctggt Iggccgctgcaaccggagctcactcacaggtg jcAgcTggTgcAgTccggAgcAgAggTgAAg |amcccggtgcctccgtgaaagtgtcttgca |aggctagtggctataccttcacaagctactg |gatgcattgggtgaggcaggcaccaggaca Igggactggaatggatgggcctgattgaccct |tctgataagtacaccaactacaaccagaagt |ttaaaggaaaggcaactctgaccgtggacac !atcaacttccaccgcctacatggagctgtcc )agcctgaggtccgaagataccgccgtgtact jATTgTAcAcggggcAAcTAcggAgTggAcTA |tggcatggattactgggggcagggtacact ggtgaccgtgtccagtgctagcaccaagggc ccatcggtcttccccctggcaccctcctcca agagcacctctgggggcacagcggccctgg gctgcctggtcmggactacttccccgmcc ggtgacggtgtcgtggmctcaggcgccctg accagcggcgtgcacaccttcccggctgtcc Sequência de nucleotÍdeos de ca- tacagtcctcaggactctactccctcagcagc deia pesada gtggtgaccgtgccctccagcagcttgggca (SEQ ID NO: 22) cccagacctacatctgcaacgtgaatcacaag cccagcaacaccaaggtggacaagagagttg agcccaaatcttgtgacctcacacatgc ccaccgtgcccagcacctgmctcctggggg gaccgtcagtcttcctcttccccccaamccc mggacaccctcatgatctcccggacccctg aggtcacatgcgtggtggtggacgtgagcca cgaagaccctgaggtcmgttcmctggtac gtggacggcgtggaggtgcataatgccmga caaagccgcgggaggagcagtacaacagcac gtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctg cAccAggAcTggcTgMTggcmggAgTAcA agtgcaaggtctccmcaaagccctcccagc ccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaag ggcagccccgagaaccacaggtgtacaccct gcccccatcccgggaggagatgaccaagaac caggtcagcctgacctgcctggtcmaggct tctatcccagcgacatcgccgtggagtggga gagcaatgggcagccggagaacaactacaag

" %;:G7r2"¥:T7.'tlíµt¢L'""'""" ÍsÈQ.U€Ne!6:È:;2z)'"'"---·" z=j!,à.;µ>:'-:}j""Y|fi','± :Q¢SÇR,!ÇÃr2,,. )""' """'""" "':" " |'(*ú"'ênÈí%sia16L"j""díUbÁn,bgd=a@?MsnóNA"nF [j")')).!Ê4"á.sÈ"?g.#ít:i):;:'4"#*#':j'i'7-l:'-ày*ê)|"',é'm!n%MQ) .·FT L, , =,_, . .. ,,..-. 'i. , ,--- | ACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCT i CCTTCTTCCTCTATAGCMGCTCACCGTGGAC

I MGAGCAGGTGGCAGCAGGGGMCGTCTTCT I CATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACM I CCACTACACGCAGMGAGCCTCTCCCTGTCT I CCGGGTAAATGA CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCAGAG

GTGMGAMCCCGGTGCCTCCGTGAAAGTGT cTTgcMggcTAgTggcTATAccncAcAAg

CTACTGGATGCATTGGGTGAGGCAGGCACC

AGGACAGGGACTGGMTGGATGGGCCTGAT Sequência de nucleotideos de do-

TGACCCTTCTGATAAGTACACCAACTACAAC mínio variável de cadeia pesada

CAGAAGTTTAAAGGAAAGGCAACTCTGACCG (SEQ ID NO: 30)

TGGACACATCAACTTCCACCGCCTACATGGA GCTGTCCAGCCTGAGGTCCGAAGATACCGC CGTGTACTATTGTACACGGGGCAACTACGGA GTGGACTATGGCATGGATTACTGGGGGCAG

GGTACACTGGTGACCGTGTCCAGT Tabela 11: Sequências de Aminoácidos e Nucleotídeos da Ca- cjeia Leve LC3 de Anticorpo AntijCCL20 Humano Hum,aniza,do '"a '""í'"""-·'"'".';i')))i)))))!t:!"éh"j[±,=.jÚ,idi,|, ,,d, , ável'em rpgrjto) ,.'-, ,>1:' i,'m .:±" ·-w mm= .:à I ,M,GWSC.l.l.L,F.LVATATGV,H.SDIQMTQSPSSLSASV

I GDRVTITCRASENJYGALNWYQQKPGKAPKLLI | Sequência de aminoácidos de ca- ) YGATNLADGVPSRFSGSGSGRQYSLTISSLQP I deia leve com a sequència sinali- ! EDFATYYCQNVLWPYTFGGGTKLEIKRTVMPS I zadora l VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ I (SEQ ID NO: 7) l WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL

I TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG I EC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASENIYGAL

NWYQQKPGKAPKLLIYGATNLADGVPSRFSGS Sequência de aminoácidos de ca-

GSGRQYSLTISSLQPEDFATYYCQNVLFTPYTF deia leve sem a sequência sinali-

GGGTKLEIKRWAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV zadora

VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT (SEQID NO:llO)

EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHWYACEVT

HQGLSSPVTKSFNRGEC DÍQMTQSPSSLSASVGDR- Sequência de aminoácidos de do- WITCRASENWGALNWYQQKPGKAPKLLIYGA mínio variável de cadeia leve TNLADGVPSRFSGSGSGR- (SEQ ID NO: 15) QYSLTISSLQPEDFATWCQNWITPYTFGGGT-

KLEIK Sequència de nucleotideos de ca- i ATGGGCTGGTCCTGCATCATTCTGTTCCTGGT

- - "'""~"-"m:. ..-, · Ê$±UENekF'"""Ê7, ,í ? ,· ."F""#Wr+'N4 :+ - b~ ::-S é,gcRí'çÃóá±'"""""'^"j" I (E%uêndasjnafwdoà-suWh|"aâjF'jÉá"Í'4B"4iáM . . 4 "·= :'?rw"r«:

~=, . ".4" """" 2íh " ' "zu i|4'ét£#'""h"&!' '"% "'"'""'":&"'= " 'ü , )W¢caaccgccÃcaggagtgcacagcgacatc' deia leve com a sequência sinali- zadora jcAgATgAcccAgTcTccATccAgccTgAgTg (SEQ ID NO: 23) |cctcagtgggcgatagggtgactatcacctg |tcgggccagcgagaacatctacggcgctct |gaattggtatcagcagmgccaggaaaagc |tcccaagctgctgatctacggggctacaaac |ctggcagacggtgtgcccagtcgattctccg |gtagcggctctggacgacagtattcactgac |tatctctagtctgcagcctgaagatttcgcc jAcTTAcTATTgccAgAATgTgcTgATTAcTcc |atatacctttggcggagggacaaaactggag )atcaagagaactgtggccgctcccagtgtgt |tcatttttcccccttcagacgmcagctgaaa |tcagggaccgcttccgtggtgtgtctgctga |acaatttctaccctcgcgaggcgtgcag |tggaaggtggataacgccctgcagagtggca |attcacaggagtccgtgaccgaacaggacag c~gattctacatatagtctgtcatccaccc TgAcAcTgAgcmggcTgATTAcgA~gcA camgtgtatgcatgcgaagtgactcatcagg ggctgagctctcccgtgaccaagtcmc cggggtgaatgttga gacatccagatgacccagtctccatccagcc tgagtgcctcagtgggcgatagggtgactat cacctgtcgggccagcgagaacatctacgg cgctctgmttggtatcagcagaagccagga aaagctcccaagctgctgatctacggggcta cAAAccTggcAgAcggTgTgcccAgTcgAn ctccggtagcggctctggacgacagtattca ctgactatctctagtctgcagcctgaagattt cgccacttactattgccagaatgtgctgatt Sequência de nucleotÍdeos de ca- actccatatacctttggcggagggacc deia leve sem a sequéncia sinali- tggagatcaagagaactgtggccgctcccag zadora TgTgTTcATTnTcccccTTcAgAcgMcAgc (SEQIDNO:111) tgaaatcagggaccgcttccgtggtgtgtct gctgaacaatttctaccctcgcgaggcamag tgcagtggmggtggataacgccctgcagag tggcaattcacaggagtccgtgaccgaacag gacagc~gattctacatatagtctgtcatc caccctgacactgagcaaggctgattacgag mgcacmagtgtatgcatgcgmgtgactca tcaggggctgagctctcccgtgaccaagtct tttaaccggggtgaatgttga Sequência de nucleotideos de do- gacatccagatgacccagtctccatccagcc mínio variável de cadeia leve tgagtgcctcagtgggcgatagggtgactat

=" . . .':'·.2'"| : ", ,, ?,77==' · i>, .,. ... . ' ' <1 í 't" X' ' ""' !tpÊc'-7'.y!y:):,,),'))t):,):):")·':-:,4L,:7h'$b" )'":!'U"ê!:,:::À:4,âj'j;í'u',í:::,':'"Áái))í'::'.) -. r,?*,4':'- - ' "': "'.f7 'á© éh4ze&:)..:.' :.:J"' 'Av%"":," -.d " "Jft:;-{% È' ' ,. , -- 'j;; '.' ": .- , Cacctgtcgggccagcgagaacatctacgg (SEQ ID NO: 31) cgctctgaattggtatcagcagaagccagga aaagctcccaagctgctgatctacggggcta caaacctggcagacggtgtgcccagtcgatt ctccggtagcggctctggacgacagtattca ctgactatctctagtctgcagcctgaagattt cgccacttactattgccagmtgtgctgatt actccatatacctttggcggagggacc tggagatcaag Tabela 12: Sequências de Aminoácidos e Nucleotideos da Ca- d,eia Leve LK3 de Anticorpo Anti-?CL20 Humano Humanizado z111t@{,))))""='))'j."))))j3jjLFigÍ'r':')d4")",'))£l"'.:)·)|liÍ) I MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARÇDIQMTQSPSS ) I LSASVGDRVTITCGASENIYGALNWYQRKPGK i Sequência de aminoácidos de cadei, : APKLLIYGATNLADGVPSRFSGSGSGRDYTLTI I leve com a *qUência sinalizadora I SSLQPEDFATWCQNVLITPYTFGQGTKLEIKRT I | VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE l (SEQ ID NO: 8) i AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL I

I SSTLTLSKADYEKHKWACEVTHQGLSSPVTKS I I FNRGEC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGAL

NWYQRKPGKAPKLLIYGATNLADGVPSRFSGS Sequência de aminoácidos de cadeia gsgRDYTLTIssLQpEDFAycQNvLITpYTFg leve sem a sequência sinalizadora QGTKLEIKRWAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASW (SEQID NO: 112) CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE

QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH

QGLSSPVTKSFNRGEC Sequència de aminoácidos de domí_ DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENJYGAL nio variável de cadeia Ieve QRKPGKAPKLLIYGA-

TNLADGVPSRFSGSGSGRDYTLTISSLQPEDFA (SEQ ID NO: 16) TYYCQNVLITPYTFGQGTKLEIK

ATGGACATGAGGGTGCCTGCTCAGCTGCTGG GACTGCTGCTGCTGTGGCTGAGGGGAGCACG ATGCGACATCCAGATGACTCAGAGCCCATCC

AGCCTGTCAGCCTCCGTGGGCGACAGGGTG Sequência de nucleotídeos d" w" ACCATCACATGTGGAGCATCCGAGAACATCT deia Ieve com a sequência sinaliza- dora ACGGGGCCCTGAATTGGTATCAGAGGAAGC

CCGGCAAAGCTCCTAAGCTGCTGATCTACGG (SEQ ID NO: 24)

TGCCACAAACCTGGCTGATGGCGTGCCCTCC AGATTCAGCGGCTCTGGAAGTGGGCGCGAC TATACTCTGACCATTTCTAGTCTGCAGCCAGA GGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGAATGTG

#qg'§'"k-'" '" ""'"-"i::;'"T:,7 L$EQUbÊNQ"A"""?"A47·:4a'":'í:À"4^ideI'·-«:':.,.Tm:::::à i:S:f:é.'¢Áq,)Lí:)dt-j',:t:'::'""Í3¢" 4(AuêhÈia sfiâi' bZG"s'á*a%ai'd'bMínIS"van""" " "' ' '~ ' Y . ' IY4 .A 'ãVâ-èm nS!gr7to) ""z§â3'j'"=!'"L4h'gsK4ZT.:='±k'" .'Ê#t8G' ciTgATcAcAccCTAcAc I I I IGGTCAGGGCA

CAAAACTGGAMTTMGCGTACGGTGGCTGC

ACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG AGCAGTTG~TCTGGMCTGCCTCTGTTGTG

TGCCTGCTGMTMCTTCTATCCCAGAGAGGC CMAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTC CAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAG AGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCT

CAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGAC TACGAG~CACAAAGTCTACGCCTGCGAAGT

CACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACA AAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA GACATCCAGATGACTCAGAGCCCATCCAGCC TGTCAGCCTCCGTGGGCGACAGGGTGACCA

TCACATGTGGAGCATCCGAGAACATCTACGG ggcccTgAAnggTATcAgAggAAgcccgg

CAAAGCTCCTMGCTGCTGATCTACGGTGCC ACAAACCTGGCTGATGGCGTGCCCTCCAGAT TCAGCGGCTCTGGAAGTGGGCGCGACTATA CTCTGACCATTTCTAGTCTGCAGCCAGAGGA

TTTCGCCACCTACTATTGCCAGAATGTGCTG Sequência de nucleotW®$ de ca" ATCACACCCTACACGGTCAGGGCACAA deia leve sem a sequência sinali'"" AACTGGAAATTAAGCGTACGGTGGCTGCACC d°'" ATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGC (SEQIDNO:113) AGTTGMATCTGGMCTGCCTCTGTTGTGTGC

CTGCTGMTMCTTCTATCCCAGAGAGGCCM AGTACAGTGGMGGTGGATMCGCCCTCCM TCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGC AGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAG CAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTAC GAGMACACAAAGTCTACGCCTGCGMGTCA CCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAA GAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA

GACATCCAGATGACTCAGAGCCCATCCAGCC | TGTCAGCCTCCGTGGGCGACAGGGTGACCA I

TCACATGTGGAGCATCCGAGAACATCTACGG

GGCCCTGAATTGGTATCAGAGGMGCCCGG Sequência de nucleotideos de domí- CAAAGCTCCTAAGCTGCTGATCTACGGTGCC nio variável de cadeia Ieve ACAAACCTGGCTGATGGCGTGCCCTCCAGAT (SEQ ID NO: 32) TCAGCGGCTCTGGAAGTGGGCGCGACTATA

CTCTGACCATTTCTAGTCTGCAGCCAGAGGA TTTCGCCACCTACTATTGCCAGAATGTGCTG ATCACACCCTACACTTTTGGTCAGGGCACAA

AACTGGAAATTAAG Tabela 13: Sequências de Aminoácidos Codificadas por Genes de Linhagem

Germinativa Humana !PFS.ÇS!ǵ '@*aK%NgÁ=µk-2%j. j; I QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS- IGHV1-46*03 Í YTFTSYYMH\NVRQAPGQGLE\NMGII- (SEQ ID NO: 57) I PSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTS- l VYMELSSLRSEDTAVYYCAR JH4

WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 58)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSÍSSYLNWYQQKPGKAP IGKV1D-39"01

KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAWYCQ (SEQ ID NO: 59)

QSYSTPP Com base nos resultados da avaliação, foram selecionados 36LK3/36HC2 ("HC2/LK3") e 36LC3/36HC2 ("HC2/LC3") para outros estu- dos. Para estes dois anticorpos, ensaios de quimiotaxia in vitro foram rea(i- 5 zados em paratelo com o clone 36F7C1O parental de camundongo e sua forma quimérica (compreendendo uma porção Fc humana)- Neste ensaio, nós empregamos placas de cultura Transwell com células B300.19 CCR6" cultivadas na camada superior e ligante CCL20 humano recombinante na camada inferior. CCL20 humano recombinante (10 nM fina!, R&D Systems) . 10 foi pré-incubado com os anticorpos anti-CCl-20 humanizados em temperatu- ra ambiente. Após 30 min, células pré-B de murino transduzidas com CCR6 humano (B300.19, fomecidas pelo Dr. H. Kawasaki da Tokyo University) fo- ram aplicadas à camada superior e quimiotaxia foi desenvolvida a 37 "C du- rante 4 horas. No final da incubação, FACS foi usado para medir as células 15 que migraram. Concentrações inibitórias de 50%, 90% e 95% (ICso, lC90 e lC95, respectivamente) para HC2/LK3 e HC2/LC3 foram, então, calculadas (Tabela 14). Nenhum dos anticorpos humanizados perdeu a atividade de · neutralização em comparação com o mAb parental de camundongo e os valores de lCm foram caiculados em tomo de 1 nM.

20 Tabela 14: Atividade de Neutralização de HC2/LK3 e HC2/LC3 Contra C- CL20 Humano em um Ensaio de Quimiotaxia fem nM) :J1Á _ .l4'%1;® .,: S; :áài 1,697 ± 0,464 1,438 ± 0,216

·'""""!""m7"':"' · -"íh[è '"t:$"'?wµ'©' íl)fúgz!"Áii}'à,"")¢i',à;):')""Tji 3,944 ± 0,593 3,510 + 0,601 .d' ··;1' :n'.jii ·" ·'· , .&. ."j-,; "·"' '.L ilÇ?s. #:4Á C'i=1,íg 7,680 ± 2,966 5,480 ± 1,179 lH4wb)jÁ'64í'jk?'d'¶£-4::)",":í')F,i,.),'--')í"'""'(r)ííj'"""ji)k)'ii'""'"ji""';*±^3 'Ê:, ,ÁJ · . .*" ""- '""··' [ Ensai±j . ", j.-2 . , -3 . ,. Média ' ·"'?t. "'E,:',,'i. , 'f.· --· .IL .'A P· - /-:· í àc%|i) 0¶65 !1.09 1,30 1,014 ±0,330 })lÇ%.Ly..} .l., - · j 3,55 ! 3,35 6,79 4,564 + 1,928 i!(Ck*igíj7i¥l 7,59 )5,41 13,91 8,972 +4,417 l'4hÚÀ'?ÁZ'bE$Lê'?""?mk*'b""q'F:~x*,q"¥1'K"|,'2tq,?!*t."3-,S¥>"-±"%wt'}'b"t"7'"'" "' '"i j'"'"""j! j·"a. ;" i,,....'4Á iii43íÊ4iíkL") çqi"' )""'":""))g m' >/r '"' - q 0,90 ) 1,26 |1,2D :1,117±0,193 j;Ç t i, , .,,,, 4,64 i 5,82 ! 5,30 )5,251±0,591 |"jC95 " '"'! 11,77 I >66,77 I 10,33 I- As respostas à dose para um experimento representativo com o . anticorpo HC2/LK3 são mostrados nas FlGS. 8A-C. Três experimentos inde- pendentes são representados.

5 Foi confirmada ainda a atividade de neutralização de HC2/LK3 e HC2/LC3 usando um ensaio de migração transendotelial (MET) no qual célu- las mononucleares de sangue periférico humano recentemente isoladas fo- ram usadas em vez de células artificiais transduzidas com CCR6. Em virtude do fato de que células T de memória CD3" CD4" CD45RO" e céluias B 10 CD19" são bem conhecidas por serem enriquecidas com células CCR6- - positivas, nós medimos os números destas populações de células que mi- graram na presença ou ausência dos anticorpos HC2/LK3 e HC2/LC3, bem ¥ como o anticorpo parental 36F7C1O de camundongo. Ambos os anticorpos humanizados (FlGs. 9B e C) demonstraram inibiçào dependente de dose da 15 migração celular comparável àquela do 36F7C1O (FlG. 9A), fomecendo mais evidências quanto à sua atividade de neutralização.

Exemplo 5: Ligação de MAbs Anti-CCL20 Humano Humani- zados ao CCL20 Humano

Para medir a afinidade de ligação de anticorpos humanizados HC2/LC3 e HC2/LK3 por meio de ressonância de pIasmon em superfície (Biacore'"), nós expressamos e purificamos os anticorpos a partir de meio condicionado de células HEK293F transitoriamente transfectadas e captu- 5 ramos os anticorpos sobre um Chip CM5 revestido com anticorpos monoclo- nais anti-Fc humano usando HBS-EP como tampão de operaçãa. Em segui- da, nós injetamos várias diluições (100, 20, 4, 0,8, 0,16 e 0 nM) da proteína humana CCL20 (R&D Systems) sobre a superficie do Chip revestido e ob- seNamos a dissocíação de CCL20 Iigado durante até 20 minutos (FlGs. IOA 10 e B). Nós adaptamos os dados de ligação globalmente a um modelo de Langmuir a 1:1. Os resultados são mostrados na Tabela 15 e representam a média de dois experimentos independentes. A afinidade entre CCL20 e seu receptor, CCR6, foi reportada como 500 pM em células humanas primárias (Liao et al., j. /mmuno/ 168 (10): 48714880 (2002)). Estes dados demons- 15 tram que as afinidades dos anticorpos HC2/LC3 e HC2/LK3 pelo CCL20 são " aproximadamente 10 vezes maiores do que a afinidade de CCR6 pelo C- , CL20. Tabela 15: Resultados de SPR de Anticorpos Anti-CCl20 Humanizados da lnvenção , |ái;:.,..-:iSFiE· ' " . - '"" "" "'L ' 4 'á'dí.',j'!'"""' "ji.,.,,. ,,gí ,*?·'¥ ,,,,,,,,,=.i L':a:" '.Í'),? -:: .;mà""""é"))))j')'))"Í'")" " 'á: '-" '· "·""""|"p?€'y!9'j" j""" .. : " """' I (xlO' M"' '"') i f1O"SS'. p """"'" padÀõ' '" jji ,: .ja .eye'" ' i ' -1" - ' " e" Èq 'íj i - +¥" ""' :Êi. a I HC2/LC3 p45 I 61 I 44 !15 i HC2/LK3 |166 |117 ! 70 |7 . 20 Exemplo 6: Reatividade Cruzada de Anticorpos Monoclonais Anti-CCL20 Humano Humanizados com Parálogos de Quimiocina

Y Nós examinamos HC2/LK3 e HC2/LC3 quanto à sua especifici- dade pelo CCL20 humano analisando sua reatividade cruzada contra um painel de quimiocinas (Tabela 16) usando um ensaio imunoenzimático (ELI- 25 SA).

Tabeja 16: Quimiocinas Humanas Recombinantes Usadas no Ensaio ELISA "P " """' € &' "" " """"" "' "" = ©Umío,cln4 "" . .· - --,,,."'. ,,ç., :èi":·í.h "" '" m=T"~"""_ r ' |i~àt' "'.'"µ:g ' ' r, n -: . S' . .: =¶ " ··'" · í.-·.

CCL20 ) MlP-3a/LARC I R&D I #360-MP-025/CF XCLl I Ltn : R&D ) #695-LT-025/CF CCL28 i ! R&D I #717-VC-025/CF CCL27 I CTACK I R&D i #376-CT-025/CF CCL25 )TECK l GT l #2234X I Eotaxina- CCL24 ! ! GT )#2343X | 2/MPIF-2 CCL22 I MDC ) R&D ! #336-MD-025/CF CCL21 i 6Ckine/SLC ! R&D I #366-6C-025/CF CCL19 ) MlP-3b i R&D i #361-MI-025/CF t CCL17 | TARC ) GT )#2364 CCL16 i HCC-4 ! R&D I #802-HC-025/CF . CCL13 ! MCP-4 i GT i #2327X CCL11 Eotaxina R&D #320 EO 020/CF · CCL7 MARC R&D #282-P3-01O/CF CCL5 Rantes CHEMICON #GF020 ccl4 Mlp-1j3 r&d #271-bme-o1o/cf CCL3 MlP-la GT #2270X MCP- PEPRO CCL2 #300-04 I/MCAF/JE TECH CCLl TCA3/I-309 GT #2272 CXCL16 CXCL16 GT #2976X CXCL13 BCA-I/BLC R&D #801-CX-025/CF . CXCL12 SDF-I/PBSF R&D #350-NS-O1O/CF

PEPRO CXCLlO lP-lO #300-12

TECH CXCL9 MlG GT #2392X

PEPRO CXCL8 IL-8 #200-08M

TECH

- :'4"' , : °&"" & :'"" '4 .. i.#N , b" "" ':-·..·j]=-:mDn=.e3 " . .t^ò'"""' ,.,,è'j.; '" ...xSEÁ CXCL4 i PF4 i R&D #795-P4-025/CF CXCL2 i GROf l R&D #276-GB-O1O/CF CXCLl ) GROa l R&D #275-GR-O1O/CF CX3CL1 (Dominio de | FKN l R&D #362-CX-025/CF Quimiocina) ! CX3CL1 (Domínio I FKN Í R&D #365-FR-025/CF Extracelular) i As cavidades de uma placa com 96 cavidades foram revestidas com 1 µg/ml das quimiocinas humanas recombinantes em PBS (-). Após in- cubação durante a noite a 4 "C, as cavidades foram bloqueadas com 1 x 81oc-Ace (Dainippon Sumitomo Pharma, UK-B80) durante 1 hora em tempe- 5 ratura ambiente. Após Iavagem duas vezes com Tween 20 a 0,02%/PBS (-), foram adicionados 50 µ1 de 36F7C1O purificado a 10 µlg/ml, 36F710 quiméri- . co, HC2/LK3 ou HC2/LC3 em Tween 20 a 0,02%/PBS (-) a cada cavidade . As cavidades foram incubadas durante 1 hora em temperatura ambiente e lavadas três vezes, conforme descrito no Exemplo 3. Anticorpo anti-lgG de 10 camundongo conjugado à peroxidase de rábano (HRP) (jackson #715-035- 150 para 36F7C1O) ou fragmento Fcy anti-lgG humana conjugado à HRP (Jackson #109-035-098, para mAbs quiméricos e humanizados ) foi, então, adicionado (em uma diluição de 5000 vezes com Tween 20 a 0,02°6/PBS (-)) e as cavidades foram incubadas durante 1 hora em temperatura ambiente.

· 15 Após lavagem cinco vezes, solução de TMBZ (bis-(3,3',5,5'- tetrametilbenzidina)) (1% em N,N-dimetilformamida) foi adicionada às cavi- . dades e incubada durante 15-30 minutos. A reação foi cessada mediante a adição de um volume igual de uma solução de interrupção de H2SO4 a 2 M e a densidade óptica foi lida a 450 nm no ARVO (PerkinEImer). Conforme de- 20 monstrado na FIG. 118, HC2/LK3 e HC2/LC3 se Iigam especificamente ao CCL20 humano com relação a outras quimiocinas no painel. Nestes ensaios, embora HC2/LK3 fosse reativo contra CCL20 humano ligado à placa, ele parecia menos potente do que os anticorpos 36F7C1O de camundongo ou 36F7C1O-hFc quiméricos (FlG. 11a). No entan- to, o HC2/LK3 mostrou uma Iigação forte e clara contra CCL20 ancorado via uma His-tag em ensaios ELISA (FlG. 11C), o qual permitiu exposição de to- 5 das as porções do CCL20 ao solvente.

Isto pode indicar que O(S) epitopo(s) de CCL20 para HC2/LK3 estão enterrados ou ocultos no procedimento usa- do para ligar CCL20 à superfície da pIaca no primeiro formato de ensaio.

Para evitar este possÍvel defeito, nós empregamos análise Biacore", na qual CCL20 livre foi aplicado sobre os MAbs capturados sobre um Sensor 10 Chip.

Nos ensaios Biacore", HC2/LK3 e HC2/LC3 mostraram forte ligação ao CCL20, comparável àquela do anticorpo quimérico 36F7C1O-hFc (FlG. 11D). Ainda, foi mostrado que a pequena reação contra CXCL4 observada na FlG. 118 era negligenciável nos ensaios Biacore" (FIG. 11D). A análise filogenética por Dereeper et al. (Nuc/eic Acids Res. 15 36 (1): W465-469 (2008)) indica que CCL16 é a quimiocina mais próxima, " quanto à sequência, aa CCL20, embora a percentagem de identidade entre

. ccl20 e ccl16 seja de menos de 37,5% (homologia em apenas 56 dos 70 aminoácidos que compreende o peptideo maduro de CCL20 (SIM - Align- ment Tool for Protein Sequences, Swiss Institute of Bioinformatics)) (FlG. 20 12). NÓs usamos análise Biacore" para testar se HC2/LK3 e HC2/LC3 rea- gem de forma cruzada com CCL16. Anticorpo anti-Fc humana Monoclonal de camundongo foi imobilizado em todas as quatro células de fluxo de um Chip CM5 em uma taxa de Huxo de 25 mljmin com tampão HBS-EP conten- do 0,2 mg/mL de BSA.

Subsequentemente, 50 µ1 de uma solução a 1 µg/ml

. 25 de anticorpo quimérico, HC2/LC3 ou HC2/LK3 em tampão HBS-EP com 0,2 mg/ml de BSA foram injetados sobre células de fluxo 2, 3 e 4, respectiva- . mente. 150 µ1 de uma solução a 100 nM de CCL20 ou CCL16 em tampão HBS-EP (ou apenas tampão) com 0,2 mg/ml de BSA foram, então, injetados sobre todas as quatro células de fluxo em uma taxa de fkixo de 40 µI/min.

A 30 dissociação prosseguiu durante 20 min.

A célula de Huxo 1 (anticorpo anti-Fc humano apenas) foi usada como referência para todas as células de fluxo.

Sob estas condições, CCL20 humano se ligou aos anticorpos quimérico (FlG. 13A), HC2/LC3 (FlG. 13B) e HC2/LK3 (FlG. 13B) capturados sobre o Chip com intensidade similar.

Em contraste, não foi detedada liga- ção significativa quando CCL16 humano foi passado através do Chip, indi- cando que, apesar de CCL16 ser a quimiocina mais próxima, quanto à se- 5 quência, ao CCL20, CCL20 e CCL16 não possuem homologia suficiente (<37°6, conforme discutido acima) para permitir que os anticorpos anti- CCL20 humanizados reajam de forma cruzada com CCL16. Estes dados indicam que HC2/LK3 e HC2/LC3 são específicos para CCL20 humano em relação a outras quimiocinas. 10 Exemplo 7: Reatividade Cruzada de Mabs Anti-CCL20 Hu- mano Humanizados Contra Ortólogos de Espécies Então, foi determinada a reatividade cruzada dos MAbs HC2/LC3 e HC2/LK3 com CCL20 de outras espécies.

Alinhamentos de se- quência de aminoácidos entre ortólogos de CCL20 (obtidos usando SIM - 15 Alignment TOOI for Protein Sequences (Swiss lnstitute of Bioinformatics)) in- " dicam que a identidade entre CCL20 de macaco Cynomo/gu!hesus e C-

. CL20 humano é de 86%, enquanto que a homologia entre CCL20 de ca- mundongo e CCL20 humano é de 64% (FlG. 14; CCL20 humano - SEQ ID NO: 85; CCL20 de macaco Rhesus - SEQ ID NO: 86: CCL20 de macaco 20 Cynomo/gus - SEQ ID NO: 87; CCL20 parcial de camundongo - SEQ ID NO: 88 (a sequência de aminoácidos de CCL20 de camundongo inteira pode ser encontrada em SEQ ID NO: 102; residuos 1-27 constituem a sequência sina- lizadora; vide Tabela 18))- Para testar se os anticorpos quiméricos e humanizados podem

, 25 se Iigar a ortólogos de CCL20 de camundongo, macaco Cynomo/gus ou ma- caco Rhesus, nós usamos ensaios ELISA, conforme ilustrado na FIG. 15. " Proteínas de fusão de quimiocina-fosfatase alcalina secretada recombinante (SEAP) foram geneticamente produzidas, conforme descrito no Exemplo 2, expressas e purificadas para todos os ortólogos de CCL20 testados.

Placas 30 pretas de fundo plano Maxisorb da Nunc foram revestidas com 1 µg/ml de anticorpo antifosfatase alcafina de placenta de camundongo (Pierce, cat #MA1-19354) em bicarbonato de sódio a 50 mM, pH de 9,4, durante a noite a 4 °C.

As pfacas foram, então, bloqueadas usando lX soIução salina tam- ponada com fosfato com Tween-20 (PBST) com albumina de soro bovino (BSA) a 5°/0 durante 2 horas em temperatura ambiente.

Proteínas de fusão SEAP-CCL20 a 20 nM foram diluídas em série 5 vezes em Opti-MEM (lnvi- 5 trogen). Anticorpos quiméricos e humanizados (HC2/LC3 e HC2/LK3) foram diluídos para 1 µg/ml em lX PBST com BSA a 5%, adicionados às placas e incubados durante 1 hora em temperatura ambiente.

As pIacas foram, então, lavadas lX com PBST com BSA a 5% três vezes.

Anticorpo de cabra anti- IgG + IgM (H+L) humana conjugado com HRP (Jackson lmmunoResearch 10 cat #109-035-127) foi diluldo para 80 ng/mL, adicionado à placa e incubado durante 1 hora em temperatura ambiente.

Substrato fluorescente de HRP Quanta8lu (Pierce cat #15169) foi adicionado para detecção do anticorpo ligado medindo-se a fluorescência em uma Plate Reader M5 da Molecular Devices (excitação a 325 nm/emissão a 420 nm). 15 Enquanto que o anticorpo de hâmster anti-CCL20 de camun- " dongo, MAb 2F5-5, se ligou ao CCL20 de camundongo com uma dose 50%

, eficaz (EC50) de 64 horas (dados não mostrados), nenhum dos anticorpos quiméricos ou humanizados anti-CCl-20 humano se ligou de forma detectá- vel ao CCL20 de camundongo ou CCL20 de rato sob as condições descritas 20 acima.

Por outro lado, ambos os anticorpos quiméricos e humanizados se ligaram eficazmente ao CCL20 humano, de macaco Rhesus e macaco Cy- nomo/gus (FlGs. 16A-C, 17A e B). Enquanto que a EC50 para CCL20 hu- mano e de macaco Rhesus parecia similar (por exemplo, 62 e 101 pM para HC2/LC3), a EC50 para CCL20 de macaco Cynomo/gus foi de 340 pM para

. 25 HC2/LC3, uma diferença de 5,4 vezes em relação ao CCL20 humano.

Re- sultados similares foram observados para HC2/LK3. Isto sugere que uma * concentração muito maior de anticorpos era necessária para atingir a mes- ' ma quantidade de ligação ao CCL20 de macaco Cynomo/gus que o CCL20 humano ou de macaco Rhesus. 30 Exemplo 8: Ensaios de Ressonância de PIasmon em Super- fície Quanto à Reatividade Cruzada de Mabs Anti-CCL20 Humanizados com Ortólogos de Espécies de CCL20

Nós também usamos análise por ressonância de pIasmon em superficie (Biacore") para testar se HC2/LC3 e HC2/LK3 poderiam se ligar a ortólogos de CCL20 de camundongo, macaco Cynomo/gus ou macaco Rhesus. Anticorpo monoclonal de camundongo anti-fosfatase alcalina de 5 placenta humana foi imobitizado em todas as quatro células de fluxo de um Chip CM5 em uma taxa de fluxo de 25 µl/min. 25 µ1 de uma soIução a 2 nM de SEAP-CCL20 humano, de macaco Rhesus, macaco Cynomo/gus ou ca- mundongo em tampão HBS-EP foram injetados sobre as células de fluxo 2, 3 ou 4. Para Iigação de anticorpo, 240 µ1 de diluições a 0-80 nM de MAb 10 HC2/LC3, HC2/LK3 ou 2F5-5 em tampão HBS-EP (ou tampão apenas) fo- ram injetados sobre todas as quatro células de fluxo em uma taxa de fluxo de 50 µl/min. Dissociação prosseguiu durante 45 min. A célula de fluxo 1 (anti-SEAP apenas) foi usada como referência para todas as células de flu- xo. Regeneração das células de fluxo foi realizada com glicina a 10 mM em 15 um pH de 2,25. Em virtude dos efeitos de regeneração sobre a capacidade " de captura dos Chips, injeções de anticorpo foram realizadas sequencial- . mente de uma bakça concentração para alta concentração. Adaptação de dados foi realizada usando um modelo de Langmuir a 1:1. Sob as condições acima, anticorpo de hâmster anti-CCl-20 de 20 camundongo 2F5-5 se figou ao CCL20 de camundongo com uma Kd (biva- lente) de 4,9 pM, mas não se ligou significativamente ao CCL20 humano, de macaco Rhesus ou macaco Cynomo/gus. Em contraste, anticorpos quiméri- cos HC2/LC3 e HC2/LK3 se ligaram eficazmente ao CCL20 humano, de ma- caco Rhesus e macaco Cynomo/gus (Tabela 17).

. 25 Os valores de afinidade aparente medidos foram superiores nes- te teste do que anteriormente detectado no Exemplo 5 (por exemplo, 4,7 pM » para HC2/LC3 no presente ensaio vs 44 pM na Tabela 3) em virtude da na- tureza bivalente (maior afinidade) do formato de ensaio usado (versus o for- mato monovalente usado para os dados mostrados na Tabela 15). Os vato- 30 res de % para CCL20 de macaco Rhesus e macaco Cynomo/gus foram ge- ralmente maiores (3 vezes) do que para CCL20 humano, indicando que os anticorpos se ligaram mais específicamente ao CCL20 humano. Em contras-

te com os dados de ELISA do Exemplo 7, no entanto, nós não observamos nenhuma diferença significativa entre a afinidade de ligação para CCL20 de macaco Rhesus e macaco Cynomo/gus.

Tabela 17: Avaliação de Ligação de Anticorpo Monoclonal Anti-CCL20 Hu- 5 ,T?nizado a Ortólogos CCL20 por Biacore" í : Wj· "·'=" ' " ' ' jÉQ, ' " '7 ·. : 'r"" ·' ·G. ,] ·. '" " ,. "· ¥Anü' ,". , "gè'!é£ ' àÜg"""'hg)'?" '"'*!lhà£ái@)&. -') ,:. (¢m)" 4 , .

I CIone ! hCCl-20 I 29 ) 2,08 ) 7,16 I 36F7C1O' i rCCL20 ) 29,4 |1,78 ! 6,05 l quimérico ! CCCL20 I 38,3 | 5,04 : 13,2 i hCCl-20 i 56,9 I 2,68 I 4,71 ) HC2/LC3 ) rCCL20 ) 41,3 i 7,51 i 18,2 | CCCL20 I 86,4 ) 13,4 |15,5 ) hCCL20 ) 28,8 I 3,39 j11,8 ) HC2/LK3 I rCCL20 l 26,3 ) 8,21 I 31,2 l CCCL20 : 52,8 ! 14,9 j28,3 hâmster an- ! hCCL20 Sem ligaçao i Sem |igaçao ! Sem ligaçao ticamundong i rCCL20 Sem Iigação I Sem ligação I Sem ligação o 2F5-5' ) CCCL20 Sem ligação i Sem Iigação i Sem ligação ! mCCL20 9,63 | 0,474 j4,92 "' anteriormente mostrado sem ligar mCCL20 b' dados de hâmster anticamundongo do chip anterior Exemplo 9: Mapeamento de Epitopo para o Clone 36F7C1O de Camundongo Anti-CCL20 Humano " 10 Para determinar O(S) epitopo(s) de CCL20 humano ao(s) qual(is) o anticorpo monoclonal 36F7C1O de camundongo anti-CCl-20 humano se b liga, nós usamos um método de troca de hidrogênio/deutério no qual ligação de anticorpo protege e, assim, impede deuteração do epitopo. Conforme mostrado na FlG. 18A, nós observamos alterações muito próximo do N- 15 término de CCL20 humano nos resíduos 7-9, 10-19 e 20-22, possivelmente representando O(S) epitopo(s). Proteção marginal também foi observada per- to do C-término nos resíduos 39-55, 56-67 e 61-70. Estes segmentos podem ser periféricos ao epitopo ou seus movimentos de amplitude podem estar conjugados ao epitopo.

O nível de deuteração de cada aminoácido indicado é mostrado em quatro pontos de tempo: de cima para baixo, 150, 500, 1500 e500Os. 5 As regiões identificadas como o epitopo para 36F7C1O caem dentro das regiões N-terminal e de alça do CCL20, as quais são conhecidas por serem críticas para ligação e sinalização ao CCR6 (Malik et al., Acta Ciyst.

F62: 631-634 (2006)) (FlG. 18B). Espera-se que anticorpos quiméri- cos e humanizados derivados de 36F7C1O, especialmente anticorpos com 10 as mesmas sequências de aminoácidos de CDRI, CDR2 e CDR3 de cadei- as pesada e leve que o 36F7C1O ou sequências de aminoácidos de CDRI, CDR2 e CDR3 de cadeias pesada e leve que o 36F7C1O (por exemplo, com menos de 3, 2 ou 1 substituições de aminoácidos quando comparado com as CDCs de 36F7C1O) se liguem ao mesmo epitopo.

A identificação deste 15 epitopo pode, assim, explicar a capacidade do MAb 36F7C1O e anticorpos " quiméricos e humanizados derivados do mesmo de neutralizar a atividade

. de CCL20. Exemplo 10: Ensaio de Quimiotaxia ln Wvo para Anticorpos Humanizados Anti-CCL20 Humano 20 Para testar se HC2/LC3 e HC2/LK3 pode inibir a quimiotaxia in- duzida por CCL20 in vivo, nós tiramos vantagem do fato de que CCL20 hu- mano pode interagir com CCR6 de camundongo (SEQ ID NO: 106) para in- duzir à quimiotaxia de células T de camundongo (FlG. 19). Nós usamos um sistema híbrido in vivo que mede a migração de células T em direção ao

, 25 CCL20 humano intrademicamente injetado (FlG. 20). CCL20 humano recombinante (10 ng/cabeça) e velculo foram in- . jetados por via intradérmica na pele raspada nos lados direito e esquerdo, respectivamente, das costas dos camundongos de teste (grupos de n = 3). Células T esplênicas de camundongo marcadas com Calceína-AM (5 x 106 30 células/camundongo) foram, então, transferidas intravenosamente para a veia da cauda, com injeção simultânea dos anticorpos indicados na veia da cauda nas dosagens descritas na FIG. 20. Após uma hora, as células fluo-

rescentes positivas foram contadas usando um microscópio estereoscópico no local das injeções intradémicas. HC2/LK3 e HC2/LC3 inibiram significativamente a migração ce- lular para os locais injetados com CCL20 em um nível comparável àquele do 5 anticorpo de camundongo 36F7C1O parental e sua forma quimérica. Em virtude do fato de que a quimiotaxia de células T é uma etapa fundamental no processo inflamatório, prevenção desta migração tem implicações cIíni- cas para o tratamento de doenças autoimunes e inflamatórias. Exemplo 11: Efeito de 1WAb 2F5-5 Sobre a Artrite lnduzida 10 por Colágeno do Tipo Para avaliar adicionalmente o uso de anticorpos anti-CCl-20 pa- ra indicações terapêuticas, nós realizamos mais estudos in vivo em camun- dongos usando o MAb 2F5-5 de hãmster anti-camundongo. Primeiro, nós avaliamos a capacidade do 2F5-5 de neutralizar a quimiotaxia mediada por 15 CCL20 em camundongos com CIA (um modelo animal de adrite reumatoi- ' de). CIA foi induzida essencialmente conforme descrito no Exemplo 1. Após o desenvolvimento de adrite (escore de artrite de 1-3), os camundongos fo- . ram distribuídos aleatoriamente e tratados com 500 µg/camundongo de mAb 2F5-5 ou um anticorpo IgG de controle. Em ambos os casos, o anticorpo foi 20 administrado por vla intravenosa em dias alternados. Em comparação com a IgG de controle, o MAb 2F5-5 inibiu o desenvolvimento de sintomas de artri- te (FlGs. 21, 22). Foram também usados raios X para determinar os efeitos de MAb 2F5-5 sobre Iesões ósseas, as quais são frequentemente obseNadas è 25 em artrite reumatoide. A atrlbuição de escore foi realizada conforme descrito em lnoue et al., Agents Actions 39: 187-194 (1993). Resumidamente, um

G escore foi atribuído a cada pata de um camundongo com CIA em uma esca- Ia de 0 a 3 com base na gravidade da osteoporose (O), erosão óssea (E) e formação de novo osso (N), de acordo com imagens de raios X. A escala 30 usada foi: 0, sem alterações; 1, ligeira alteração; 2, alteração moderada; e 3, alteração grave. Os escores para cada fator foram adicionados para desen- volver um escore cumulativo por raios X para lesões ósseas. Camundongos tratados com o MAb 2F5-5 demonstraram escores notavelmente menos gra- ves por raios X no dia 39 quando comparado com os camundongos tratados com a lgG de controle (FIGS. 23, 24). Foi confirmado o efeito de tratamento com MAb 2F5-5 em pato- 5 togia óssea analisando vários biomarcadores usando ELISA.

Camundongos com CIA foram imunizados e tratados com 500 µg de anticorpo 2F5-5 ou [gG de controle, conforme descrito acima.

Amostras de pIasma foram preparadas a partir dos camundongos nos dias 11 ou 12 após a segunda imunização.

Um marcador de destruição de cartilagem, proteína da matriz oligomérica de 10 cartilagem (COMP) no soro, foi quantificado usando o kit Animal COMP ELI- SA Enzyme lmmunoassay (AnaMar Medical) de acordo com as instruções do fabricante (aqui incorporado por referência), exceto que amostras de pIasma dos animais foram diluldas a 1:20. Em virtude do fato de que COMP é pré-revestida sobre a placa, este é um ELISA competitivo, pelo que a adi- 15 ção do padrão COMP ou plasma contendo COMP resulta em uma diminui- " ção na OD450 (FlG. 25A). Os dados bruto de um ensaio de amostra são mos-

. trados nas FIGS. 25B e 25C.

Níveis de COMP no soro em camundongo com CIA foram reduzidos para quase os niveis normais mediante tratamento com MAb 2F5-5 (FlG. 26), o que demonstra a capacidade do 2F5-5 de inibir a 20 destruição de cartilagem.

Uma vez que a fomação e diferenciação de osteoclastos são responsáveis pela osteoporose e erosão relacionadas a RA, nós medimos os níveis de ativador de receptor de molécula de indução de osteoclastos para o Iigante fator nuclear ic8 (RANKL) e marcadores de osteoclastos, tais 25 como o ativador de receptor de fator nuclear íc8 (RANK), fosfatase ácida re- » sistente a tartrato (TRAP) e catepsina K como indicadores para terapia de " doenças artriticas.

NÓs avaliamos os níveis de expressão de mRNA destes marcadores por meio de PCR quantitativa usando RNA total isolado de pa- tas de camundongo homogeneizadas.

As patas foram primeiro homogenei- 30 zadas com um homogeneizador após imersão em um tampão de lise de te- cido contendo reagente Trizol (lnvitrogen, CA, EUA). Após adição de cIoro- fórmio, as amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm durante 15 minutos a

4 °C para separar a solução em fases aquosa e orgânica. A fase aquosa foi removida e isopropanol adicionado à mesma, seguido por centrifugação a

14.000 rpm durante 15 minutos a 4 °C para obter pelotas de RNA. Pelotas de RNA dissolvidas com água sem RNase foram usadas em um mini-kit 5 RNAeasy (Qiagen, Valencia, CA, EUA) para isolar o RNA e tratadas com DNAse para remover qualquer DNA. DNA complementar (CDNA) foi gerado a partir de RNA com um kit de reação RT (RNA PCR Kit, Takara Bio Inc. Shiga, japão) de acordo com o protocolo do fabricante. PCR quantitativa em tempo real para cada uma das espécies de CDNA foi realizada e comparada 10 com o nível de um gene "housekeeping", fosforibosil transferase de hipoxan- tina-guanina (HPRT). Os conjuntos de iniciadores direto e reverso a seguir foram usados nas reações de PCR: RANKL, 5'-CATTTGCACACCTCACCATC-3 '(SEQ ID NO: 89) e 5'-TCCGTTGCTTAACGTCATGT-3 '(SEQ ID NO: 90); 15 RANK, 5'-CGGCGTTTACTACAGGAAGG-3 '(SEQ ID NO: 91) e " 5"TTCTTGCTGACTGGAGGTTG-3 '(SEQ ID NO: 92); TRAP, 5'-GCTGGAAACCATGATCACCT-3 '(SEQ ID NO: 93) e 5'-GGTAGTAAGGGCTGGGGAAG-3 '(SEQ ID NO: 94); Catepsina K, 5'-CAGTGTTGGTGGTGGGCTAT-3 '(SEQ ID NO: 95) e 20 5'-CCGAGCCAAGAGAGCATATC-3 '(SEQ ID NO: 96); e HPRT, 5'-CAGGCCAGACTTTGTTGGAT-3 '(SEQ ID NO: 97) e 5"TTGCGCTCATCTTAGGCTTT-3 '(SEQ ID NO: 98). Todos os iniciadores foram concebidos usando o software Pri- mer 3 on-line (Whitehead Ínstitute for Biomedical Research, Cambridge, MA, 25 EUA) para evitar amplificação não especlfica de RNA. Misturas de reação i com cDNA, temp/ate, iniciadores, gliÒsilase de DNA uracila (lnvitrogen, CA,

F EUA) e QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN, Valencia, CA, EUA) foram usadas na reação de ampkficação em um ABI Prism 7700 Se- quence Detection System (Applied Biosystems, Foster, CA, EUA). Os níveis 30 de expressão foram automaticamente quantificados pelo Software ABI PRISM 7700 Sequence Detector. Após tratamento com MAb 2F5-5, os níveis de mRNA foram su-

primidos para todos os marcadores no tecido articular (FlGs. 27A e B mos- tram vezes de alteração no nível de expressão comparado com os gene "housekeeping", HPRT), fomecendo mais evidências de que o 2F5-5 inibe patologia óssea in vivo. 5 Exemplo 12: Efeitos do MAb 2F5-5 Sobre a Artrite (nduzida por Isomerase de GIicose-6-Fosfato Foram testados os efeitos anti-artríticos de tratamento com MAb 2F5-5 em camundongo com artrite induzida por isomerase de glicose-6- fosfato (G6Pl), um outro modelo de RA com camundongos.

Artrite foi induzi- lO da mediante sensibilização intradérmica com GST-G6Pl recombinante (300 µg/camundongo) emulsificada em adjuvante completo de Freund e injetada na base da cauda de camundongo DBNI.

Seis dias após a imunização com G6PI e imediatamente antes de início do inchaço das articulações, os ca- mundongos foram distribuidos aleatoriamente e tratados com 500 15 µg/camundongo de anticorpo de isotipo correspondente ou MAb 2F5-5. Foi " atribuído um escore de gravidade aos sintomas de artrite nas patas de cada camundongo conforme descrito anteriormente no Exemplo 1. Camundongos tratados com o MAb 2F5-5 exibiram escores para artrite significativamente mais baixos do que camundongos tratados com anticorpos de isotipo cor- 20 respondente, mostrando que 2F5-5 suprime fortemente o desenvolvimento de artrite comparado com o controle (FIG. 28)- Estes dados demonstram a eficácia de tratamento com o anti- corpo anti-CCL20 em modelos de artrite in vivo e sugerem que o uso de an- ticorpos anti-CCl-20 pode ser benéfico no tratamento de artrite reumatoide. 25 Exempjo 13: Efêito do MAb 2F5-5 Sobre a Dermatite Atópica Induzida por Oxazolona Então, foi avaliado o efeito de tratamento com MAb 2F5-5 em modelos de dermatite com camundongos.

Em um modelo, oxazolona foi u- sada para induzir à dermatite atópica em camundongos propensos à doença 30 (gênero NC/Nga). A pele abdominal dos camundongos foi raspada e exposta à oxazolona nos dias 0, 5 e 8. No dia 13, camundongos mostrando sinais de dermatite (escore 2) foram selecionados e imunizados novamente com oxa-

zolona.

Os camundongos foram, após o que, aleatoriamente distribuídos em grupos de seis para tratamento com MAb 2F5-5 ou um anticorpo lgG de con- trole de isotipo correspondente (500 µg/camundongo, administrado por via intravenosa em dias altemados). NÓs analisamos os escores de dermatite 5 em um estudo às cegas como segue: a cada sintoma de dermatite, tais co- mo secura, escaras, eritema, inchaço/crostas e escoriação, foi atribuído um escore em uma escala de 0 a 3 (0 = nenhum, 1 = leve, 2 = moderada, 3 = grave); estes escores foram, então, adicionados a um escore cumulativo de dermatite (conforme descrito em Leung et al., J.

A//eigy C/in /mmuno/ 85(5): 10 927-933 (1990)). Nós comparamos a magnitude de supressão da doença entre os dois grupos quantificando a área sob a curva ("AUC") do dia 13 ao dia 18. Neste modelo de dermatite, o MAb 2F5-5 induziu a uma supressão estatisticamente significativa (p "0,05) de progressão da doença comparado ' com a IgG de controle (FlG. 29). 15 Exemplo 14: Efeito do MAb 2F5-5 Sobm a Dermatite de Con- " tato Alérgica Induzida por DNFB Foi testado o efeito de tratamento com o MAb 2F5-5 sobre a dermatite de contato alérgica induzida por din itrofluorobenzeno (DNFB), um segundo modelo de dermatite com camundongos.

Os camundongos foram 20 divididos em grupos de 6 e sensibilizados escovando 25 µ1 de solução de DNFB (DNFB a 0,4%, em uma solução em acetona:óleo de oliva a 4:1) no abdome raspado durante dois dias consecutivos (dias 0 e 1). Um gmpo foi tratado com o MAb 2F5-5, enquanto que o outro grupo foi tratado com um anticorpo de controle de isotipo correspondente (500 µg/camundongo por via 25 intravenosa nos dias 0, 2 e 5). No dia 5, os camundongos foram novamente estimulados aplicando 20 µ1 de solução de DNFB a 0,2% (em acetona:óleo de oliva a 4:1) em um lado de uma orelha.

A espessura da orelha foi medida como um indicador de edema no dia 6 usando um medidor de espessura.

Tratamento com MAb 2F5-5 reduziu a espessura da orelha, o que indica 30 prevenção com sucesso do desenvolvimento de dermatite (FlG. 30). Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados no presente relatório descritivo são aqui incorporados por referência.

Embora a invenção precedente tenha sido descrita com algum detalhe por meio de ilustração e exemplo para fins de cIareza de entendimento, será prontamen- te evidente para aqueles versados na técnica à Iuz dos ensinamentos da presente invenção que determinadas alterações e modificações poderão ser introduzidas na mesma sem sair do espírito ou âmbito das reivindicações anexas.

Tabela 18: Sequências de Aminoácidos e NucleotÍdeos para CCL20 e CCR6 Humano e de Camundon, o là. ·· : ·='1= =í::"' E- T :· r ' e ..' .,. = çj"Ê|""| Zãámia ' .' " :'· . d'n(j"' "'==·T=4":

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CCL20 hu- I caqtqctqctactccacctctqcqqcqa- 6 mano com I tcaqaaqcaqcaagcaadügactgc- sequéncia ! gtcttggatac=agaccgtaÜ=atQctaaaWa -

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agagcccatcacgtggaagctgctgggt- tgggactggagctgttctttgggttcttcagc - gtttatggtgttdgcmtdgttcauatcaaga= - gtgcagggaactccaagaggcaca- agcaatQcgagtcgtgatcgctgtgguctcgtgRm - gcttgtçagatccctcacaacatggtcctet%gad - cggtcaacacgggcaaagtgggcoggag- tgcagcaccgagaaagtcctcgcctaca- caggaacgtggccgaggtcdggcW- ctgcattgctgcctcaaccccgtgttgtatgcgWatt - gacagaaattcagaaadacKcatgaa- atcatgaaggatgtgtggtgtatgagaa- gaagaataagatgcctggcttcctctg- gcccgggtttactcggaaagctacatc- =ggcagaccagtgagaccgtcgaaa- tgataatgcatcgtccmccatg

7abe|a 19: Núm,eros de ldentificaçã,o de Sequência j$E¶ . .'" " , '" """ "' "" " "ã¥7%%m?*=T"'gj " |S"ÜNoj¶' ' èSc,ri" ão · . "-,.., f,.i ·.·-b. -·'· " --'. " " :" ·' "a: m=="t='j ':&) " i " " 5 k "yT,mr: "k' "' " - % ,d

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5 42HKK2

6 42HKK3

7 LC3 Cadeia leve de compri- l ! mento total I8 | LK3 j (LC)

9 HC2 Domlnío variável de ca-

N=)ÍVe: pesada

I 14 I 42HKK3 I 15 | LC3 l Domínio variável de ca- i l deia leve |16 I LK3 i (VL)

|17 ! HC2

) 18 ) HC3 I 19 I 36HKK3 I Cadeia pesada de com- j

20 ' 42HKK1 ' primento total (HC) 21 42HKK2

22 42HKK3

23 LC3 Cadeia leve de compri- I I Sequência de nu- mento total 24 LK3 (LC) ) cleotídeos

25 HC2

26 HC3

27 36HKK3 Domínio variável de ca- I deia pesada 28 42HKK1 (VH)

29 42HKK2

30 42HKK3

@EÊÍ" '" à : . >. 4. "" rmn; - , Á ,'"· · b" Á;J "P.es" " "' G 7-. '"' '. .. .,'·'@;:S' "' , . , .Ut{ "lD.!9= .,.. =9·· :Y- ·" , ·' " ':-s-->X .. ' '·-í '·":t~ " i : . ' e- t. ·*mm=. - ;yc 'f

31 LC3 Domínio variável de ca- I i deia leve 32 ) LK3 I (VL)

33 I ) Sequência sinalizadora I I de cadeia pesada l 36F7C1O

34 I I Sequência sinalizadora i de cadeia leve

35 Sequência sinalizadora l [ de cadeia pesada )40-1C1OB9

36 I l Sequência sinalizadora I I de cadeia leve

37 l I Sequência sinalizadora I Sequência de ami- l de cadeia pesada ) · 42G5B1O í i noacidos

38 ) I Sequência sinalizadora I i de cadeia leve

39 _J I VH l 36F7C1O 40 I | VL

::—j 40-1C1OB9 ) :: 43 ! I VH I 42G5B1O 44 VL

45 I Sequência sinalizadora de cadeia pesada I 36F7C1O

46 l ) Sequência sinaiizadora I de cadeia Ieve

47 Sequência | de sinalízadora cadeia pesada |40-1C1OB9

48 : i Sequência sinalizadora ! Sequência de nu- I i de cadeia leve i cleotideos

49 I I Sequência sinalizadora I | de cadeia pesada | 42G5B1O

50 ! i Sequência sinalizadora Í de cadeia leve

T)=ojj)T""_""

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l 53 I 40-1C1OB9 |VH 54 VL 57 Sequência de linhagem germinativa IGHV1-46*03 I 58 I Sequência de linhagem germinativa JH4 I 59 | Sequência de linhagem germinativa IGKVI D-39*01 I Camundongo I 36F7C1O 60 HC2 NYWMH I HC3 i 36HKK3 I Camundongo ! H-CDRI I 42G5B1O ) (Kabat) I 61 I 42HKK1 I ) SYWMH . ! 42HKK2 ) 42HKK3 ) IGHV1-46*03/ ) ) 62 i ABM67212 l | SYYMH Camundongo ) 63 ) 36F7C1O | I VIDPSDSYTTYNQK í HC3 ! I FKG ( 36HKK3 64 HC2 VIDPSDSYTT-

YAQKFQG H-CDR2 Camundongo 42G5B1O (Kabat) 65 42HKK1

LIDPSDKYTNYNQK

FKG 42HKK2 42HKK3 IGHV1-46*03/ IINPSGGSTS- 66 ABM67212 YAQKFQG

Tè«p;¥ ii)'j :.y : 4 ' ' ':"j .Í "= ' es, ríção '""s'. - .-4..j - . a, y :')):%t) ., , ,%, , . ,. ... a': , . " 'i..,. 3 ' " , ,.- : :- .,-.. : '. . ,j' t

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I Camundongo i 36F7C1O

67 ! HC2 I GNYGVDYAMDY i HC3 i 36HKK3 H-CDR3 | Camundongo (Kabat ou Chothia)

i 42G5B1O

68 ! 42HKK1 I GNYGVDYGMDY i 42HKK2 i 42HKK3

69 ) ABM67212 i EGDGYIQAFDY ! Camundongo

70 i 36F7C1O I GASENIYGALN

LK3 L-CDRI I 71 ! LC3 I i RASENIYGALN l (Kabat ou Chothia) i IGK\J1D- | 72 i 39*01/ l I RASQSISSYLN l BAH04867.1 I Camundongo I ) 36F7C1O | 73 i LC3 ! L-CDR2 : GATNLAD

I LK3 | (Kabat ou Chothia) I IGKV1D- | 74 i 39*01/ ! l AASSLQS ) BAH04867.1 l Camundongo I | 36F7C1O ! 75 i LC3 I L-CDR3 | QNVLITPYT

L K3 (Kabat ou Chothia) µT7ê=ií7 QQSYSTPYT I Camundongo I i 36F7C1O I 77 ) HC2 I H-CDRI I GYTFTNY I HC3 ) (Chothia) i 36HKK3

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G I 42HKK3 81 ) IGHV1-46*03/ I IINPSGGSTS I ABM67212 82 i ABM67212 I VH 83 BAH04867.1 VL 84 Sequência de aminoácidos de variante de CCL20 humano (sem I sequência sinalizadora) 85 I Sequência de aminoácidos de CCL20 humano (com sequência i sinalizadora) 86 ) Sequência de aminoácidos de CCL20 de macaco Rhesus 87 : Sequência de aminoácidos de CCL20 de macaco Cynomo/gus 88 I Sequência de aminoácidos de CCL20 de camundongo (parcial) 89 | 5'-CATTTGCACACCTCACCATC-3' MNKL I 90 I 5'-TCCGTTGCTTAACGTCATGT-3' 91 l 5'-CGGCGTTTACTACAGGAAGG-3' 92 I 5"TTCTTGCTGACTGGAGGTTG-37 MNK ) lniciadores 93 I 5'-GCTGGAAACCATGATCACCT-3' TR^r 94 I 5'-GGTAGTAAGGGCTGGGGAAG-3' 95 I 5'-CAGTGTTGGTGGTGGGCTAT-3' Catep- I

« ÊStÈ% ' ") wn '" , à' 4 ?m:z""'m&Y'"'". " i· " -" " "% |1*éh7)|??sg-U,Ê,°" j")))" Á.'-k 7-F2.:'.:íu"a" éz; .,.;. ..-:A*-.,;^ '":d ' k -- ·'5:- Y n=B , " " ' L' 96 I 5'-CCGAGCCAAGAGAGCATATC-3' sina K 97 I 5'-CAGGCCAGACTTTGTTGGAT-3'

HPRT 98 i 5"TTGCGCTCATCTTAGGCTTT-3' 99 ! Sequência de aminoácidos de CCL20 humano (sem sequência l sinalizadora) 100 I Sequência de nucleotídeos de CCL20 humano (sem sequência I sinalizadora) 101 i Sequência de nucleotídeos de ccl20 humanojcom sequência I sinaíizadora) 102 ) Sequência de aminoácidos de CCL20 de camundongo (com se- l quência sinalizadora) 103 I Sequência de nucleotideos de CCL20 de camundongo (com se- l quência sinalizadora) 104 : Sequência de aminoácidos de CCR6 humano 105 I Sequência de nucleotídeos de CCR6 humano 106 i Sequência de aminoácidos de CCR6 de camundongo 107 ! Sequência de nucleotídeos de CCR6 de camundongo 108 ) Sequência de aminoácidos de HC2 de comprimento total (sem I sequência sinalizadora) 109 I Sequência de nucleotídeos de HC2 de comprimento total (sem i sequência sinalizadora) 110 I Sequência de aminoácidos de LC3 de comprimento tota! (sem I ] sequência sinalizadora) 111 ) Sequência de nucleotideos de LC3 de comprimento total (sem I ) sequência sinalizadora) 112 i Sequência de aminoácidos de LK3 de comprimento total (sem I l sequência sinalizadora) 113 i Sequência de nucleotideos de LK3 de comprimento total (sem I I sequência sinalizadora) 114 i Sequência de aminoácidos de CCL20 parcial 115 l Sequência de aminoácidos de CCL16 parcial

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Claims (7)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo anti-CCL20 humano monoclonal ou porção de Iiga- ção a antígeno do mesmo, em que o referido anticorpo compreende uma cadeia pesada cuja região de determinação de complementaridade 3 (C- 5 DR3) compreende SEQ ID NO: 67 ou 68.

2. Anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antígeno de a- cordo com a reivindicação 1, em que a região de determinação de comple- mentaridade 1 (CDRI), região de determinação de complementaridade 2 (CDR2) e região de determinação de complementaridade 3 (CDR3) da refe- lO rida cadeia pesada compreendem, respectivamente, as sequências de ami- noácidos selecionadas do grupo que consiste em: a) SEQ ID NOS: 60, 64 e 67; b) SEQ ID NO: 60, 63 e 67; C) SEQ ID NO: 61, 65e68; d) a SEQ ID NOS: 77, 79 e 67, e e) SEQ ID NOS: 78, 80 e68.

3. Anticorpo anti-CCl.20 humano monoclonal ou porção de tiga- ção a antlgeno do mesmo, em que o referido anticorpo compreende uma cadeia leve cuja região de determinação de complementaridade 3 (CDR3) compreende SEQ ID NO: 75.

4. Anticorpo monoclonal ou porção de Iigação a antígeno de a- cordo com a reivindicação 3, em que a região de determinação de comple- mentaridade 1 (CDRI), região de determinação de complementaridade 2 (CDR2) e região de determinação de complementaridade 3 (CDR3) da refe- rida cadeia leve compreendem, respectivamente, as sequências de aminoá- cidos selecionadas do gmpo que consiste em: a) SEQ ID NOS: 70,73 e 75, e b) SEQID NOS:71,73 e 75.

5. Anticorpo ou porção de ligação a antigeno de acordo com a reivindicação 1 ou 3, em que a cadeia pesada do referido anticorpo compre- ende uma CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 67 ou 68 e a cadeia Ieve do referido anticorpo compreende uma CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 75.

6. Anticorpo ou porção de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 2 ou 4, em que as referidas CDRI, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e as referidas CDRI, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, respectivamen- te, compreendem as sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que 5 consiste em: a) SEQ ID NOS: 60, 64, 67, 70, 73 e 75; b) SEQ ID NOS: 60, 64, 67, 71, 73 e 75; C) SEQ ID NO: 60, 63, 67, 70, 73 e 75; d) SEQ ID NO: 60, 63, 67, 71, 73 e 75; e) SEQ ID NOS: 61, 65, 68, 70, 73 e 75; f) a SEQ ID NOS:61,65,68, 71,73e 75; g) a SEQ ID NOS: 77, 79, 67, 70, 73 e 75; h) SEQ ID NOS: 77, 79, 67, 71, 73 e 75; i) SEQ ID NO: 78, 80, 68, 70, 73 e 75, e j) SEQ ID NOS: 78, 80, 68, 71, 73 e 75.

7. Anticorpo anti-CCl-20 humano monoclonal ou porção de Iiga- ção a antígeno do mesmo, em que o referido anticorpo compreende uma cadeia pesada cUjo domínio variável compreende uma sequência de amino- ácidos selecionada de SEQ ID NOS: 9-14.

8. Anticorpo anti-CCL20 humano monoclonal ou porção de liga- ção a antígeno do mesmo, em que o referido anticorpo compreende uma cadeia Ieve cujo domínio variável compreende SEQ ID NO: 15 ou 16.

9. Anticorpo ou porção de Iigação a antígeno de acordo com a reivindicação 7 ou 8, em que o referido domínio variável de cadeia pesada e o referido domínio variável de cadeia leve compreendem, respectivamente, as sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: a)SEQIDNOS:9e15; b)SEQIDNOS:9e16; C)SEQID NOS: 1Oe16; d)SEQIDNO:11e15; e)SEQIDNOS:11e16; f)SEQIDNOS:12e16;

g)aSEQIDNOS:13e16;e h)SEQIDNOS:14e16.

10. Anticorpo anti-CCL20 humano monoclonal, cuja cadeia pe- sada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que 5 consiste em SEQ ID NOS: 1-6 sem a sequência sinalizadora e SEQ ID NO:

108.

11. Anticorpo anti-CCl-20 humano monoclonal, cuja cadeia pe- sada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1-6 sem a sequência sinalizadora e SEQ ID NO: 108, em que a referida sequência de aminoácidos carece da lisina C- terminal .

12. Anticorpo anti-CCl20 humano monoclonal, cuja cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que con- siste em SEQ ID NOS: 7 e 8 sem a sequência sinalizadora e SEQ ID NOS: 11Oe112.

13. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, em que a referida cadeia pesada e a referida cadeia leve compre- endem, respectivamente, as sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: a)SEQIDNOS:1e7; b)SEQIDNOS:1e8: c)SEQIDNOS:2e8; d)SEQIDNOS:3e7; e)SEQIDNOS:3e8; f)SEQIDNOS:4e8; g)SEQIDNOS:5e8; h)SEQIDNOS:6e8; i)SEQIDNOS:108e11O,e j)sEQID NOS: 108e112; em que as referidas sequências de aminoácidos carecem de se- quências sinalizadoras, se presente e em que SEQ ID NOS: 1-6 carecem opcionalmente da lisina C-terminal.

14. Anticorpo monoclonal, cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 108 e cuja cadeia Ieve compreende SEQ ID NO: 110.

15. Anticorpo monocional, cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 108 sem a Iisina C-terminal e cuja cadeia feve compreende SEQ ID 5 NO: 110.

16. Anticorpo monoclonal, cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 108 e cuja cadeia Ieve compreende SEQ ID NO: 112.

17. Anticorpo monoclonal, cuja cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 108 sem a Iisina C-terminal e cuja cadeia Ieve compreende SEQ ID 10 NO: 112.

18. Anticorpo monoclonal anti-CCL20 humano ou porção de li- gação a antígeno do mesmo que se liga ao mesmo epitopo de CCL20 hu- mano que o anticorpo monoclonal ou porção de Iigação a antigeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.

. 15 19. Anticorpo monoclonal anti-CCl-20 humano ou porção de Ii- " gação a antígeno do mesmo que compete pela ligação ao CCL20 humano . com o anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antígeno como definido em qualquer das reivindicações 1 a 17.

20. Anticorpo anti-CCL20 humano monoclonal ou porção de li- 20 gação a antígeno do mesmo que intercompete peia ligação ao CCL20 hu- mano com o anticorpo monoclonal ou porção de Iigação a antigeno como definido em qualquer das reivindicações 1 a 17.

21. Anticorpo monoclonal ou porção de Iigação a antigeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o anticorpo é 25 um anticorpo humanizado.

22. Anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antígeno de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, em que as regiões de frame- work da referida cadeia pesada utilizam um gene de linhagem germinativa humana IGHV1-40*03 e em que as regiões de hamework da referida cadeia 30 leve utilizam um gene de linhagem germinativa humana IGKV1D-39*01.

23. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 9 e 18 a 22, em que o referido anticorpo compreende um domínio constante de lgGl, lgG2, lgG3 ou lgG4 humana.

24. Anticorpo monoclonal anti-CCL20 humano ou porção de Ii- gação a antígeno do mesmo, cuja cadeia pesada compreende um domínio variável compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do 5 grupo que consiste em SEQ ID NOS: 39, 41 e 43.

25. Anticorpo monoclonal anti-CCl-20 humano ou porção de li- gação a antlgeno do mesmo, cuja cadeia Ieve compreende um domínio vari- ável compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do gmpo que consiste em SEQ ID NOS: 40, 42 e 44. 10 26. Anticorpo ou porção de Iigação a antígeno de acordo com a reivindicação 24 ou 25, em que a referida cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 39, 41 e 43 e em que a referida cadeia leve compreende uma sequên- cia de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 40, 15 42 e44. . 27. Anticorpo de acordo com a reivindicação 26, em que a refe- rida cadeia pesada e a referida cadeia leve compreendem, respectivamente, . as sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: a) SEQ ID NOS: 39 e 40; 20 b)SEQIDNOS:41e42;e c)SEQIDNOS:43e44.

28. Anticorpo anti-CCl-20 humano monoclonal ou porção de li- gação a antígeno do mesmo, em que o referido anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 39 e uma cadeia Ieve compre- 25 endendo SEQ ID NO: 40.

29. Anticorpo monoclonal ou porção de Iigação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, em que o referido an- ticorpo é um anticorpo quimérico.

30. Porção de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma 30 das reivindicações 1 a 9, 18 a 22 e 24 a 28, em que a referida porção é um anticorpo com uma única cadeia, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, molécula Fv com uma única cadeia (SCFV), dímero de Fv com uma única cadeia biespecífico,

diacorpos, anticorpo com domínio deletado ou anticorpo com um único do- mínio (dAb).

31. Anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, em que o referido anti- 5 corpo ou porção de Iigação a antígeno tem uma ou mais propriedades sele- cionadas do grupo que consiste em: a) não se iiga ao CCL16 humano; b) se liga ao CCL20 de macaco Cynomo/gus ou Rhesus, mas não ao CCL20 de camundongo ou rato: 10 C) tem uma afinidade de ligação pelo CCL20 humano de 70 pM ou menos usando um ensaio de ressonância de plasmon em superflcie mo- novalente; d) tem uma afinidade de ligação pelo CCL20 humano de 12 pM ou menos usando um ensaio de ressonância de pIasmon em superfície biva- 15 lente; e) tem uma afinidade de Iigação pelo CCL20 humano maior do . que aquela pelo CCR6 humano; f) tem uma seletividade pelo CCL20 humano em relação ao CX3CL1, CXCLl, CXCL2, CXCL4, CXCL8, CXCL9, CXCLlO, CXCL12, CX- 20 CL13, CXCL16, CCLl, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL11, CCL13, CCL16, CCL17, CCL19, CCL21, CCL22, CCL24, CCL25, CCL27, CCL28 ou XCLl humano; g) reduz a quimiotaxia induzida por CCL20 humano de células CCR6" com uma lC50 de 1,7 nM ou menos; 25 h) reduz a quimiotaxia induzida por CCL20 humano de células CCR6" in vivo; i) reduz a quimiotaxia induzida por CCL20 humano de células CCR6" in vitro; j) reduz a progressão de sintomas de artrite em um indivlduo; 30 k) reduz a osteoporose, erosão óssea ou formação de novo osso em um indivíduo; I) reduz os niveis séricos de proteína da matriz oIigomérica de cartilagem (COMP) em um indivíduo; m) reduz os níveis de mRNA de RANKL, RANK, TRAP ou ca- tepsina K em um indivíduo; n) reduz a progressão de dermatite atópica em um individuo; e 5 o) reduz a progressão de dermatite de contato alérgica em um indivíduo.

32. Anticorpo monoclonal anti-CCL20 humano Olj porção de Íi- gação a antígeno do mesmo que se Iiga a um epitopo de CCL20 humano compreendendo uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas do 10 grupo que consiste em: a) os resíduos 7-9 de SEQ ID NO: 84; b) resíduos 10-19 de SEQ ID NO: 84; e C) resíduos 20-22 de SEQ ID NO: 84.

33. Anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antígeno de . " 15 acordo residuoscom 7-9,a10-19 reivindicação e20-22 de32, SEQemID que o referido NO: 84. epitopo compreende os

34. Anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 32, em que o referido epitopo compreende ainda uma ou mais sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consis- 20 te em: a) residuos 39-55 de SEQ ID NO: 84; b) resíduos 56-67 de SEQ ID NO: 84; e C) resíduos 61-70 de SEQ ID NO: 84.

35. Anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antlgeno de 25 acordo com a reivindicação 34, em que o referido epitopo compreende os resíduos 7-9, 10-19, 20-22, 39-55, 56-67 e 61-70 de SEQ ID NO: 84.

36. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia pe- sada ou uma porção de Iigação a antígeno da mesma de um anticorpo ou porção como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 35. 30 37. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia leve ou uma porção de iigação a antígeno da mesma de um anticorpo ou porção como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 35.

38. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia pe- sada ou uma porção de ligação a antígeno da mesma e a cadeia leve ou uma porção de ligação a antígeno da mesma de um anticorpo ou porção como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 35. 5 39. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia pe- sada ou uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo anti-CCl-20 hu- mano monoclonal, em que a referida molécula de ácido nucleico compreen- de uma sequência de nucteotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 17-22, 25 - 30 e 109 ou a referida sequência de nucleotídeos 10 sem a sequência que codifica uma sequência sinaiizadora, se presente.

40. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia Ieve ou uma porção de ligação a antígeno da mesma de um anticorpo anti-CCL20 humano monoclonal, em que a referida molécula de ácido nucleico compre- ende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em . " 15 SEQ ID deos NOS: sem 23, 24, 31, a sequência que32, 111 e 113 codifica umaou a referidasinalizadora, sequência sequência desenucleotí- presen- te.

41. Molécuia de ácido nucleico isofada de acordo com a reivindi- cação 39 ou 40, em que a referida molécula de ácido nucleico compreende 20 uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 17-22, 25-30 e 109 ou a referida sequência de nucleotídeos sem a sequência que codifica uma sequência sinalizadora, se presente, e em que a referida molécula de ácido nucleico compreende adicionalmente uma se- quência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID 25 NOS: 23, 24, 31, 32, 111 e 113 ou a referida sequência de nucleotídeos sem a sequência que codifica uma sequência sinalizadora, se presente.

42. Uso de (1) uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada ou de uma porção de ligação a antígeno da mesma, (2) uma sequência de ácido nucleico que cociifica a cadeia leve ou uma porção de 30 ligação a antígeno da mesma ou (3) ambos de um anticorpo ou porção como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 35, como um medicamen- to.

r / 9/11

43. Vetor recombinante que compreende (1) uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação a an- tígeno da mesma, (2) uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou uma porção de ligação a antígeno da mesma ou (3) ambas dentre 5 um anticorpo ou uma porção como definido em qualquer uma das reivindica- ções1a35.

44. Célula hospedeira compreendendo uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada ou uma porção de Iigação a antlgeno da mesma de um anticorpo ou porção como definido em qualquer 10 uma das reivindicações 1 a 35, em que a referida primeira sequência de áci- do nucleico está operativamente Iigada a um elemento de controle de ex- pressão e uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou uma porção de ligação a antígeno do referido anticorpo ou porção do mesmo, a referida segunda sequência de ácido nucleico operativamente li- 15 gada a um elemento de controle de expressão.

45. Método de produção de um anticorpo anti-CCl-20 humano Olj uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que compreende manutenção da célula hospedeira como definida ría reivindicação 44, sob condições ade- quadas para expressão do anticorpo ou da porção. 20 46. Método de acordo com a reivindicação 45, que compreende ainda o isolamento do anticorpo ou da porção.

47. Composição compreendendo o anticorpo monoclonal ou porção de Iigação a antigeno como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 35, e um velculo ou carreador farmaceuticamente aceitável. 25 48. Método para tratamento de um indivíduo que precisa do mesmo compreendendo administração, ao indivíduo, de uma quantidade eficaz do anticorpo ou porção de ligação a antigeno como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 35, Olj composição como definida na reivin- dicação 47. 30 49. Método para tratamento de uma condição em um indivíduo que precisa do mesmo incluindo administração, ao indivlduo, de uma quanti- dade eficaz do anticorpo ou porção de ligação a antigeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 35, ou da composição como definida na reivindicação 47.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, em que a referida condição é uma condição associada ao CCR6. 5 51. Método de acordo com a reivindicação 49, em que a referida condição é uma condição autoimune ou inflamatória.

52. Método de acordo com a reivindicação 49, em que a referida condição é artrite reumatoide, psoríase, dermatite atópica, dermatite de con- tato, doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, doença de Grave, 10 vitiligo, hipertiroidismo, hepatite crônica, infecção por papiloma vÍrus humano do cérvix, micose fungoide, osteoporose ou doença periodontal.

53. Método para o tratamento de câncer compreendendo admi- nistração, a um indivíduo, de uma quantidade eficaz do anticorpo ou porção de ligação a antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 . 15 a 35, ou composição como definida na reivindicação 47.

54. Método de acordo com a reivindicação 53, em que o referido câncer é uma doença maligna de células B, adenocarcinoma de mama, glio- blastoma, carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma do pâncreas ou carci- noma papilar da tiroide. 20 55. Método para reduzir a quimiotaxia mediada por CCL2 em cé- lulas CCR6" em um indivíduo que precisa do mesmo compreendendo admi- nistração, ao indivíduo, do anticorpo ou da porção de ligação a antígeno co- mo definido em qualquer das reivindicações 1 a 35, ou composição como definida na reivindicação 47. 25 56. Método para reduzir a quimiotaxia mediada por CCL20 célu- las CCR6" in v/tro usando o anticorpo ou porção de ligação a antlgeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 35, ou composição como definida na reivindicação 47.

57. Método para tratamento de uma condição em um indivíduo 30 compreendendo administração, ao indivíduo, do anticorpo ou porção de liga- ção a antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 35, ou composição como definida na reivindicação 47, em que a referida condi-

ção é selecionada do grupo que consiste em: a) lesões articulares das extremidades distais ao cotovelo ou do joelho; b) eritema; 5 C) edema; d) aumento dos niveis séricos de proteína da matriz oligomérica de cartilagem (COMP); e) aumento dos niveis de mRNA do ligante de ativador de recep- tor de fator nuclear ic8 (RANKL), ativador de receptor de fator nuclear kB 10 (RANK), fosfatase ácida resistente a tartrato (TRAP) ou catepsina K; f), dermatite atópica; e g) dermatite de contato alérgica.

58. Uso do anticorpo ou porção de ligação a antlgeno como de- finido em qualquer uma das reivindicações 1 a 35, ou composição como de- . 15 finida na reivindicação 47, para a fabricação de um medicamento.

59. Uso do anticorpo ou porção de ligação a antlgeno como de- . finido em qualquer uma das reivindicações 1 a 35, ou composição como de- finida na reivindicação 47, como um medicamento.

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