KR100419555B1 - 비형간염바이러스의 에스-표면항원을 인식하는단일클론항체의 가변영역 및 이를 코딩하는 유전자 - Google Patents

비형간염바이러스의 에스-표면항원을 인식하는단일클론항체의 가변영역 및 이를 코딩하는 유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 B형간염바이러스의 S-표면항원을 인식하는 단일클론항체의 가변영역 및 이를 코딩하는 유전자, 이 유전자가 삽입된 재조합벡터, 및 이 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

Description

비형간염바이러스의 에스-표면항원을 인식하는 단일클론항체의 가변영역 및 이를 코딩하는 유전자{A VARIABLE REGION OF THE MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST A S-SURFACE ANTIGEN OF HEPATITIS B VIRUS AND A GENE ENCODING THE SAME}
본 발명은 B형간염바이러스의 S-표면항원을 인식하는 단일클론항체의 가변영역 및 이를 코딩하는 유전자, 이 유전자가 삽입된 재조합벡터, 및 이 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.
B형간염바이러스(Hepatitis B virus, 이하 "HBV"라 한다)는 데인 입자(Dane particle)로 알려진 약 42nm의 구형입자로서, 외피(outer envelope)는 다량의 B형간염 표면항원(Hepatitis B surface antigens)을 포함하고 있고 약 180개의 B형간염 코어 단백질(Hepatitis B core proteins)로 구성된 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid)를 둘러싸고 있다. 이 뉴클레오캡시드는 HBV 유전자, 중합효소 등을 포함하고 있다.(Summers et al., Proc. Nat. Acad. Sci, 72, 4579, 1975; Pierre Tiollais et al., Science, 213, 406-411, 1981).
HBV 유전자내에서, B형간염 표면항원을 코딩하는 HBV 유전자부위는 3개의 프레임상(in-frame) 개시부위를 함유하고 있으며, 이들은 모두 S-도메인(S-domain)으로 알려진 종료코돈을 가지고 있다. 따라서, HBV 표면항원은 (1) S-도메인만을 포함하는 소 HBV 표면항원(Small Hepatitis B Virus Surface Antigen, 이하 "S-표면항원"이라 한다), (2) S-도메인 및 Pre-S2로 알려진 55개의 아미노산을 포함하는 중 HBV 표면항원(Middle Hepatitis B Virus Surface Antigen, 이하 "M-표면항원"이라 한다), 및 (3) S-도메인, Pre-S2 및 Pre-S1을 포함하는 대 HBV 표면항원(Large Hepatitis B Virus Surface Antigen, 이하 "L-표면항원"이라 한다)으로 나누어진다. 이들 표면항원중 S-표면항원은 발현되는 전체 표면항원중 약 80%이상을 차지한다.
S-표면항원의 서브타입은 항원인식(antibody recognition)에 의해 분류된다. 즉, 모든 표면항원에서 존재하는 항원부위를 "a" 결정기, 다른 4개의 서브타입 항원부위를 "d" / "y" 및 "w" / "r" 결정기로서 분류한다. "d" 결정기는 122번째 잔기가 라이신(lysine)인 반면 "y" 결정기는 아르기닌(arginine)이고, "w" 결정기는 160번째 잔기가 라이신인 반면, "r" 결정기는 아르기닌이다 (Kennedy R. C. et al., J. Immunol. 130, 385, 1983). 따라서, 혈청형은 adr, adw, ayr 및 ayw 와 같은 서브타입으로 분류하고 있는데(Peterson et al., J. Biol. Chem. 257, 10414, 1982; Lars O. Marnius et al., Intervirology, 38, 24-34, 1995), 한국에서는 주로 "adr"형이 검출되고 있다.
상기 S-표면항원은 간 세포에 특이적으로 결합할 수 있으며(Leenders et al., Hepatology, 12, 141, 1990; Irina Ionescu-Matiu et al., J. Med. Virology, 6, 175-178, 1980; Swan N. T. et al., Gastroenterology 80, 260-264, 1981; SwanN. T. et al., Gastroenterology, 85, 466-468, 1983; Marie, L. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 7708-7712, 1984), 인간의 간 혈장막 상에는 S-표면항원 특이 결합단백질로서 아포리포단백질 H(Apolipoprotein H), 엔도넥신 II(endonexin II) 등이 확인된 바 있다 (Mehdi H. et al., J. Virol., 68, 2415, 1994. ; Hertogs K. et al., Virology, 197, 265, 1993).
한편, 마우스로부터 제조한 단일클론항체는 인간에게 적용하였을 경우, 면역반응을 유발할 수 있으므로, 마우스로부터 제조한 단일클론항체중 항원과 직접 결합하는 CDRs(Complementarity Determining Regions) 영역을 인간의 항체유전자에 재조합시킴으로써 인간화된 항체를 얻을 수 있다는 것이 공지된 바 있다(대한민국 특허공개 제1999-8650호).
예를들어, 대한민국 특허공개 제1999-8650호에서는 HBV 감염 예방 및 치료를 위한 항체를 개발하기 위한 시도로서, HBV의 3가지 표면항원(즉, S-표면항원, M-표면항원 L-표면항원)중 L-표면항원에만 존재하는 Pre-S1 에피토프를 인식하는 단일클론항체의 가변영역 및 그의 염기서열이 개시된 바 있으며, 이를 이용하여 인간화된 항체를 얻을 수 있음을 제시하고 있다 (대한민국 특허공개 제1999-8650호).
그러나, L-표면항원은 발현되는 전체 표면항원의 1∼2%에 불과하기 때문에, 항-HBV 항체의 표적(target)으로는 적합하지 아니한 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 연구를 거듭한 결과, HBV 전체 표면항원이 공통적으로 가지고 있는 S-표면항원의 "a" 결정기를 특이적으로 인식할 수 있을 뿐 아니라 그 결합력도 매우 우수한 단일클론항체를 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 S-표면항원의 "a" 결정기를 특이적으로 인식할 수 있는 단일클론항체의 가변영역(variable site)을 코딩하는 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자가 삽입된 재조합벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론항체의 가변영역을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 B형간염바이러스의 S-표면항원을 특이적으로 인식할 수 있는 단일클론항체의 가변영역을 코딩하는 유전자를 포함한다.
본 발명자들은 한국인에게 가장 많은 빈도로 발견되는 "adr" 결정기 타입의 S-표면항원(인터네셔널 엔자임사, 미국)을 마우스에 면역시키고, 이들로부터 분리한 비장세포를 혈구암세포(SP2O-Ag14, ATCC CRL-1581)와 접합(fusion)시켜 다수의 혼성화 세포(hybridized cells)를 제조한 후, 이들을 배양하여 다수의 단일클론항체를 얻었다. 본 발명자들은 얻어진 단일클론항체들 중 "a" 결정기에 특이적으로결합하는 단일클론항체를 선별하여, "a" 결정기에 특이적으로 결합할 뿐 아니라, 그 결합력이 매우 우수한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(A9-11-5)를 얻었다.
본 발명자들은 상기 하이브리도마 세포주로부터 RNA 를 추출하여 경쇄 및 중쇄 유전자의 cDNA를 합성한 후, 이를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 약 440 bp 의 경쇄 cDNA 유전자 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 약 460 bp 의 중쇄 cDNA 유전자를 분리하였다.
상기 단일클론항체의 경쇄 및 중쇄의 가변영역중 항원을 인식하는 CDR(complementarity determining region) 잔기를 분석한 결과, 경쇄의 경우 23-36, 52-58, 및 91-98 위치로서 각각의 서열은 서열번호 9, 10, 및 11의 폴리펩타이드이었으며, 중쇄의 경우 31-35, 50-65, 및 98-103 위치로서 각각의 서열은 서열번호 12, 13, 및 14의 폴리펩타이드이었다.
따라서, 본 발명은 B형간염 바이러스 S-표면항원에 대한 단일클론항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 cDNA 유전자로서, 경쇄 가변영역이 서열번호 9, 10, 및 11의 폴리펩타이드를 포함하는 cDNA 유전자를 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 경쇄 가변영역의 아미노산 서열이 서열번호 7인 cDNA 유전자를 포함하며 특히, 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 cDNA 유전자를 포함한다.
또한, 본 발명은 B형간염 바이러스 S-표면항원에 대한 단일클론항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 cDNA 유전자로서, 중쇄 가변영역이 서열번호 12, 13, 및 14의폴리펩타이드를 포함하는 cDNA 유전자를 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 중쇄 가변영역의 아미노산 서열이 서열번호 8인 cDNA 유전자를 포함하며 특히, 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 cDNA 유전자를 포함한다.
상기 단일클론항체의 가변영역을 코딩하는 경쇄 또는 중쇄의 cDNA 유전자는 예를들어, 플라스미드 벡터 pCRII(인비트로젠사, 미국) 등의 플라스미드 벡터에 삽입하여 재조합벡터를 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 경쇄의 가변영역을 코딩하는 cDNA 유전자가 삽입된 재조합벡터 pCRA9Lv 및 상기 중쇄의 가변영역을 코딩하는 cDNA 유전자가 삽입된 재조합벡터 pCRA9Hv 를 포함한다.
상기 재조합벡터 pCRA9Lv 또는 pCRA9Hv는 예를들어,E.coli등의 대장균을 형질전환시켜 형질전환체를 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 pCRA9Lv 또는 pCRA9Hv 로 각각 형질전환된 대장균 형질전환체E. coliDH5α/YRC-pCRA9Lv (수탁번호 : KCTC 18021P) 또는E. coliDH5α/YRC-pCRA9Hv (수탁번호 : KCTC 18020P) 를 포함한다.
상기 형질전환체로부터 재조합벡터를 회수하는 방법으로는 공지의 방법을 사용할 수 있으며, 예를들어 알칼리를 이용한 회수방법(J. Sambrook et al., Molecular cloning, Vol. 1, 1.25-1.28)을 사용할 수 있다. 즉, 용액1 (50mM 글루코오즈, 25mM 트리스·염산, 10mM .E.D.T.A)을 넣어 형질전환체의 세포막을 약화시킨 다음, 용액2 (0.2N NaOH, 1% SDS)를 넣어 세포막을 파괴하고 세포의 구성성분인 단백질 및 염색체를 변성시킨 후, 용액3 (5M 포타슘 아세테이트, 아세트산)을 넣어 재조합벡터를 제외한 다른 성분을 응집시킨 다음, 원심분리하여 재조합벡터층을 분리한 후, 에탄올을 가하여 재조합벡터만을 침전시킴으로써 재조합벡터를 회수할 수 있다.
본 발명은 서열번호 9, 10, 및 11의 폴리펩타이드를 포함하는 경쇄 및 서열번호 12, 13, 및 14의 폴리펩타이드를 포함하는 중쇄로 이루어진 단일클론항체의 가변영역을 포함하며, 더욱 바람직하게는 상기 경쇄의 가변영역이 서열번호 7의 서열을 갖고, 중쇄의 가변영역이 서열번호 8의 서열을 갖는 단일클론항체의 가변영역을 포함한다.
상기한 본 발명에 따른 단일클론항체의 가변영역을 코딩하는 cDNA 유전자로부터 항원 즉 S-표면항원에 직접 결합하는 CDR 영역, 즉 경쇄의 경우 서열번호 9, 10, 및 11의 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자, 중쇄의 경우 서열번호 12, 13, 14의 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 인간의 항체 유전자에 융합시키거나, 본 발명에 따른 단일클론항체의 가변영역을 코딩하는 유전자를 인간 항체의 가변영역과 치환시킴으로써 면역반응 유발의 문제점이 없는 HBV에 대한 단일클론항체를 얻을 수 있다.
상기한 바와 같이 본 발명에 따른 HBV에 대한 단일클론항체의 가변영역을 코딩하는 유전자는 HBV 표면항원중 발현비율이 가장 높은 S-표면항원, 특히 S-표면항원의 서브타입중 "a" 결정기에 특이적으로 작용하므로 adr,adw,ayr, 및 ayw 등 여러 타입의 항원에 광범위하게 적용될 수 있는 단일클론항체를 제조할 수 있으므로 효과적으로 HBV 를 중화 및 제거할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이것이 본발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예 1. 세포주(A9-11-5)로부터 RNA의 분리 및 그의 cDNA의 합성
1X108개의 세포주(A9-11-5)를 구아니디니움 티오시아네이트 용액 (4M guanidinium thiocyanate) 10ml에 넣어 세포를 파쇄한 후, 산성 페놀(acid phenol) 용액 8ml을 가하여 혼합한 뒤, 원심분리(10,000rpm, 10분)하여 전체 핵산으로부터 RNA를 분리하였다. 추출한 RNA 5㎍을 주형으로 하여, 올리고 d(T) 0.5ng 및 RNA 분해효소 억제제 0.5unit를 넣은 뒤, 뮤라인-류케미아 바이러스 역전사 효소(M-MLV, Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase) 100unit를 넣고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
합성된 1차 cDNA 2㎍을 주형으로 하여, 경쇄의 경우 서열번호 1 및 2의 DNA 올리고머를 프라이머로 사용하고 중쇄의 경우 서열번호 3 및 4의 DNA 올리고머를 프라이머로 사용하여 중합반응을 수행하였다. PCR(polymerase chain reaction)은 AmpliTaq 중합효소(퍼킨엘머 바이오 시스템사, 미국)를 이용하여 수행하였으며, 첫번째 단계에서는 94℃에서 1분 30초, 55℃에서 2분, 72℃에서 3분의 반응조건으로 30회 반복하여 수행하였고, 두 번째 단계에는 94℃에서 1분 30초, 55℃에서 2분, 72℃에서 10분의 반응조건으로 1회 수행하였다.
증폭된 PCR 산물에 대하여 1.5% 아가로스 젤 전기영동을 수행하였으며, 0.5㎍/ml 농도의 에티듐 브로마이드(ethidium bromide) 용액 100ml에서 20분간 염색한다음, 100bp 표준 DNA(라이프테크놀로지사, 미국)를 기준으로 중쇄의 경우 460bp, 경쇄의 경우 440bp 의 위치에 증폭된 유전자 단편의 존재를 확인하였다.
실시예 2. cDNA 유전자의 클로닝
실시예 1에서 1.5% 아가로스 젤 전기 영동을 수행한 후 투석막(스펙트럼사, 미국)을 이용하여 회수한 440bp 유전자 단편(경쇄유전자 단편)에 페놀 200㎕ 및 클로로포름 200㎕을 가하여 불순물을 제거하고, 에탄올 2.5ml를 가하여 정제하였다. 정제된 유전자 단편을 pCRII벡터(인비트로젠사, 미국)에 서브클로닝한 후, 대장균 DH5α (E.coliDH5α, 라이프테크놀로지사, 미국)를 형질전환시켜(Cohen, S. N. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 2110, 1972) 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 100㎍/ml의 암피실린이 함유된 LB 배지에서 하룻밤 배양한 뒤 플라스미드를 회수한 다음, 제한효소 EcoRI (바이오렙사, 미국)으로 절단하여 상기 440bp 크기의 유전자 단편이 삽입된 클론 Lv-1, Lv-4, 및 Lv-7 을 얻었다.
실시예 1에서 얻어진 460bp 유전자 단편(중쇄유전자 단편)에 대하여도 상기와 동일한 과정을 수행하여 재조합벡터를 얻었으며, 재조합벡터로 대장균 DH5α (E.coliDH5α, 라이프테크놀로지사, 미국)를 형질전환시켜 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 100㎍/ml의 암피실린이 함유된 LB 배지에서 하룻밤 배양한 뒤 플라스미드를 회수한 다음, 제한효소 EcoRI (바이오렙사, 미국)으로 절단하여 상기 460bp 크기의 유전자 단편이 삽입된 클론 Hv-1, Hv-2, 및 Hv-5 을 얻었다.
상기 각 클론들로부터 회수한 플라스미드 용액 100ug/ml에 폴리에틸렌글라이콜 (20% polyethylene glycol, 2.5M NaCl) 60㎕를 넣고 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 증류수 100㎕를 넣어 침전물을 용해시킨 뒤, 페놀용액 50㎕를 가하여 2회 추출하였다. 다시 원심분리하여 회수한 상층액에 200㎕의 에탄올을 가하여 플라스미드를 정제하였다.
2㎍의 정제된 플라스미드 용액 50㎕에 2N 수산화나트륨 5㎕ 및 10mM 이디티에이(E.D.T.A) 10㎕를 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다. M13 프라이머 및 T7 프라이머를 각각 1 pmol 씩 첨가하여 65℃에서 2분 동안 반응시킨 다음, 상온까지 온도가 떨어지도록 방치한 뒤, DNA 시쿼네이즈 버전 II 키트(DNA sequenase version II kit, United States Biochemical사, 미국)를 이용하여 각 클론들의 염기서열을 분석하였다.
분석 결과, 경쇄의 3가지 클론들(Lv-1, Lv-4, 및 Lv-7)의 염기 서열이 모두 같았으며, 이 클론에서 분리한 플라스미드 벡터를 pCRA9Lv라 명명하였다. 또한 이 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 형질전환체를E. coliDH5α/YRC-pCRA9Lv라 명명하였으며, 2000년 5월 16일 생명공학연구소 유전자원센터 유전자은행에 기탁을 완료하였다. (기탁번호 : KCTC 18021P).
중쇄도 동일한 방법으로 염기서열을 분석한 결과, 3가지 클론들(Hv-1, Hv-2, 및 Hv-5)의 염기 서열이 모두 같았으며, 이 클론에서 분리한 플라스미드 벡터를 pCRA9Hv라 명명하였고, 이 재조합벡터로 형질전환된 대장균 형질전환체를E. coliDH5α/YRC-pCRA9Hv라 명명하였으며, 2000년 5월 16일 생명공학연구소 유전자원센터 유전자은행에 기탁을 완료하였다. (기탁번호 : KCTC 18020P).
실시예 3. cDNA 의 염기 서열 분석
세포주(A9-11-5)로부터 얻은 단일클론항체의 가변영역에 대한 아미노산 서열 분석( Harris. L. et al., Protein Sci. 4, 306-310, 1995. ; Kabat. E. A. et al., Sequence of proteins of immunological interest.5th Ed., 1991. ; Williams A. F. et al., Annu. Rev. Immunol. 6, 381-406, 1988) 결과, 중쇄의 경우 I(B)서브그룹에 속하였고, 경쇄의 경우 람다 1 계열(λ1)로 밝혀졌다.
가변영역 중에서 항원을 인식하는 CDR잔기로는 중쇄의 경우 CDR1은 31-35, CDR2는 50-65, CDR3는 98-103에 해당하였으며, 경쇄의 경우 CDR1 은 23-36, CDR2는 52-58, CDR3는 91-98에 해당하였다.
실시예 4. 하이브리도마 세포주(A9-11-5)로부터 얻어진 단일클론항체의 결합친화도
B형간염바이러스의 S-표면항원(인터네셔널 엔자임사, 미국)을 다양한 농도(1.0X10-6∼ 1.0X10-12M)로 준비하고, 세포주(A9-11-5)로부터 얻어진 2.0X10-11M의 단일클론항체를 각각 가하여 실온에서 3시간동안 반응시켰다. 각각의 혼합액을 상기 S-표면항원이 0.1㎍씩 결합된 이뮤론(immulon) 플레이트(다이나텍크사, 미국)에 100㎕씩 첨가하고 37℃에서 2시간동안 반응시킨후 상층액을 제거하였다. 0.5% 카제인-PBS(casein-phosphate buffered saline)용액 200㎕를 넣고 37℃에서 1시간동안 방치한 다음, 서양 고추냉이 과산화분해효소(horseradish peroxidase)가 결합된 산양 항 마우스 폴리클론항체(goat anti-mouse polyclonal antibody) (시그마사, 미국)를 1,000배 희석하여 100㎕씩 가하여 반응시킨 다음 ELISA reader(다이나텍사, 미국)을 이용하여 광학밀도(optical density)를 측정하였다.
세포주(A9-11-5)로부터 얻어진 단일클론항체의 결합친화도는 1.84X10-9M-1로서 매우 높은 결합친화도를 나타냈다. 여기서, 결합친화도는 단일클론항체의 결합을 50% 저해하는 항원농도의 역수(Friguet B. et al., J. of Immunological Method, 77, 305-319, 1985)를 말한다.

Claims (12)

  1. B형간염 바이러스 S-표면항원에 대한 단일클론항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 cDNA 유전자로서, 상기 경쇄 가변영역이 서열번호 9, 10, 및 11의 폴리펩타이드를 포함하는 cDNA 유전자.
  2. 제1항에 있어서, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열이 서열번호 7인 cDNA 유전자.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 cDNA 유전자.
  4. B형간염 바이러스 S-표면항원에 대한 단일클론항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 cDNA 유전자로서, 상기 중쇄 가변영역이 서열번호 12, 13, 및 14의 폴리펩타이드를 포함하는 cDNA 유전자.
  5. 제4항에 있어서, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열이 서열번호 8인 cDNA 유전자.
  6. 제5항에 있어서, 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 cDNA 유전자.
  7. 제1항에 따른 cDNA 유전자가 삽입된 재조합벡터 pCRA9Lv.
  8. 제4항에 따른 cDNA 유전자가 삽입된 재조합벡터 pCRA9Hv.
  9. 재조합벡터 pCRA9Lv로 형질전환된 형질전환체E. coliDH5α/YRC-pCRA9Lv (수탁번호 : KCTC 18021P).
  10. 재조합벡터 pCRA9Hv로 형질전환된 형질전환체E. coliDH5α/YRC-pCRA9Hv (수탁번호 : KCTC 18020P).
  11. 서열번호 9, 10, 및 11의 폴리펩타이드를 포함하는 경쇄 및 서열번호 12, 13, 및 14의 폴리펩타이드를 포함하는 중쇄로 이루어진 단일클론항체의 가변영역.
  12. 제11항에 있어서, 경쇄의 가변영역이 서열번호 7의 서열을 갖고, 중쇄의 가변영역이 서열번호 8의 서열을 갖는 단일클론항체의 가변영역.
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